JP2007507201A - リグナンの生合成を触媒する酵素をコードする遺伝子、およびその利用 - Google Patents
リグナンの生合成を触媒する酵素をコードする遺伝子、およびその利用 Download PDFInfo
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Abstract
本発明は、ピノレジノールからピペリトールへの反応、およびピペリトールからセサミンへの反応を触媒する酵素、ならびに当該酵素をコードする遺伝子を提供する。本発明はさらに、上記酵素をコードする遺伝子を含むベクターおよび形質転換体、ならびに当該形質転換体を用いるタンパク質生産方法を提供する。
Description
〔技術分野〕
本発明は、ゴマのピペリトールおよびセサミンの生合成を触媒する酵素、当該酵素をコードする遺伝子、並びに当該タンパク質および当該遺伝子の利用に関するものである。
本発明は、ゴマのピペリトールおよびセサミンの生合成を触媒する酵素、当該酵素をコードする遺伝子、並びに当該タンパク質および当該遺伝子の利用に関するものである。
〔背景技術〕
一般的にゴマ（Sesamum indicum）として知られている植物は、ゴマ科ゴマ属(Sesamum)に属している。ゴマの原産地は中央アフリカで、６０００年ほどの歴史をもつ最古の栽培油糧植物であり、ゴマは世界中で栽培されてきた。
一般的にゴマ（Sesamum indicum）として知られている植物は、ゴマ科ゴマ属(Sesamum)に属している。ゴマの原産地は中央アフリカで、６０００年ほどの歴史をもつ最古の栽培油糧植物であり、ゴマは世界中で栽培されてきた。
ゴマ種子は、約５０％の脂質と、約２０％のタンパク質をその成分として含む。ゴマ種子はさらに、ビタミンＢ１、Ｂ２、およびＥなども含む。ゴマ種子は、オレイン酸とリノール酸とを主な構成要素とするトリグリセリドを脂質の主成分として含み、さらなる特徴的な成分としてセサミン、セサモリンなどのリグナンと総称される植物の二次代謝物を含む。
このセサミンは、多様な生理活性を有することが明らかにされており、コレステロール代謝、肝機能および免疫機能の改善に有効であることが知られている（例えば、非特許文献１参照）。セサミンをゴマ種子あるいはゴマ種子の絞り粕から分離精製する方法はすでに実用化されており（例えば、特許文献１、２参照）、セサミンを主成分とする、アルコール分解促進作用などを有する肝機能活性増強剤が市販されている。また、セサミン以外のゴマリグナン（セサミノール、セサモリンなど）もまた、生理活性作用を有することが報告されている（例えば、非特許文献２参照）。
リグナンの生合成について、当該分野において若干の知見がある（例えば、非特許文献３参照）。図１に、一般的に知られているリグナンの生合成経路の模式図を示す。リグナンは、フェニルプロパノイド化合物を出発物質として合成され、植物においては植物の生体防御機構に寄与していると考えられている。図１に示すように、コニフェリルアルコールが重合して合成されるピノレジノールが、生合成における最初のリグナンであり、ピノレジノールから各植物種に特有の生合成経路を経て、多様なリグナンが合成される。
また、セサミンの生合成に関しては、図１に示すように、ピペリトール合成酵素が（＋）−ピノレジノールを触媒し、メチレンジオキシブリッジ（図中、円で囲んだ領域）が一箇所形成する酵素学的作用によって、ピペリトールが合成される。次いで、セサミン合成酵素がこのピペリトールにメチレンジオキシブリッジをさらにもう一箇所形成することによって、セサミンが合成される。さらに、上記両者の反応を触媒する酵素がそれぞれ異なる２種類のチトクロームＰ４５０であるということが、ゴマ種子の膜画分を用いた実験で示されている（例えば、非特許文献４参照）。
上記メチレンジオキシブリッジの形成は、アルカロイドやフラボノイドの生合成においてしばしば見られる。例えばEschscholtzia californica培養細胞の膜画分には、(S)-scoulerineおよび(S)-cheilanthifolineにメチレンジオキシブリッジを形成することによって、それぞれ(S)-cheilanthifolineおよび(S)-stylopineを生成する反応を触媒するチトクロームＰ４５０が存在することが知られている（例えば、非特許文献５参照）。
また、ヒヨコマメ(Cicer arietinum)の培養細胞の膜画分には、カリコシン(calycosin)およびプラテンセイン(pratensein)にメチレンジオキシブリッジを形成することによって、それぞれシュードパプティゲニンおよび５’−ヒドキシシュードパプティゲニンを生成する反応を触媒する酵素が存在し、その酵素がチトクロームＰ４５０であるということが報告されている（例えば、非特許文献６参照）。
また、Linum flavumの培養細胞におけるデオキシポドフィロトキシン(deoxypodophyllotoxin)6-水酸化酵素がチトクロームＰ４５０であるということが示唆されている（例えば、非特許文献７参照）。
また、(S)-tetrahydrocolimbamineにメチレンジオキシブリッジを形成することによって(S)-tetrahydroberberineを合成する、ベンジルイソキノリンアルカロイドであるベルベリンの生合成に関与する酵素は、やはりチトクロームＰ４５０であり、これをコードする遺伝子がCoptis japonicaからクローニングされている（例えば、非特許文献８参照）。
上述のような種々の反応を触媒するチトクロームＰ４５０は、多様な分子種からなるスーパーファミリーを形成しており、そのアミノ酸配列の相同性によって分類される。概ね同一性が４０％以上であるものをファミリー、５５％以上であるものをサブファミリーとして分類し、ファミリーは数字で、サブファミリーはアルファベットで示される（例えば、非特許文献９参照）。各ファミリーおよびその相互関係については、図３に系統樹として示す。例えば、上述したベルベリンの生合成に関わるチトクロームＰ４５０は「ＣＹＰ７１９」に属するとみなされている。
チトクロームＰ４５０は、１つの植物種において数百分子種存在する。しかし、図４に示すように、これらのうち生化学的な機能または生理的な機能が同定されているチトクロームＰ４５０分子種は少数である。
ゴマ由来のチトクロームＰ４５０としては、本発明に関係するセサミンやピペリトールの合成反応とは直接的には関係しないが、p-coumarate 3-hydroxylaseをコードする遺伝子 (AY065995) がクローニングされている。
他の生物種におけるチトクロームＰ４５０遺伝子のクローニングとその機能解析は、以下のようにいくつかの報告がある。
例えば、
・ペチュニア由来のフラボノイド３’，５’水酸化酵素（Ｆ３’，５’Ｈ）遺伝子（例えば、非特許文献１０参照）；
・フラボノイド３’−水酸化酵素（Ｆ３’Ｈ：ＣＹＰ７５Ｂ）遺伝子（例えば、非特許文献１１参照）；
・カンゾウ由来の(２Ｓ)−フラバノン ２−水酸化酵素(Ｆ２Ｈ：ＣＹＰ９３Ｂ１)（例えば、非特許文献１２参照）；
・２−ヒドロキシ−イソフラバノン合成酵素（ＩＦＳ：ＣＹＰ９３Ｃ２）（例えば、非特許文献１３参照）；
・イソフラボン ２’−水酸化酵素（Ｉ２’Ｈ：ＣＹＰ８１Ｅ１）（例えば、非特許文献１４参照）
をコードする遺伝子がクローニングされている。
・ペチュニア由来のフラボノイド３’，５’水酸化酵素（Ｆ３’，５’Ｈ）遺伝子（例えば、非特許文献１０参照）；
・フラボノイド３’−水酸化酵素（Ｆ３’Ｈ：ＣＹＰ７５Ｂ）遺伝子（例えば、非特許文献１１参照）；
・カンゾウ由来の(２Ｓ)−フラバノン ２−水酸化酵素(Ｆ２Ｈ：ＣＹＰ９３Ｂ１)（例えば、非特許文献１２参照）；
・２−ヒドロキシ−イソフラバノン合成酵素（ＩＦＳ：ＣＹＰ９３Ｃ２）（例えば、非特許文献１３参照）；
・イソフラボン ２’−水酸化酵素（Ｉ２’Ｈ：ＣＹＰ８１Ｅ１）（例えば、非特許文献１４参照）
をコードする遺伝子がクローニングされている。
また、フラボン合成酵素ＩＩ（ＦＮＳＩＩ，ＣＹＰ９３Ｂ３）（例えば、非特許文献１５参照）をコードする遺伝子が、Ｉ２’Ｈを用いてキンギョソウからクローニングされている。
また、ＣＹＰ８１ファミリーに属するチトクロームＰ４５０のアミノ酸配列は、「http://drnelson.utmem.edu/CytochromeP450.html」に数多く記載されている。それらの機能としては、Helianthus tuberosus由来のＣＹＰ８１Ｂ１が脂肪酸の水酸化反応を触媒すること（非特許文献１６）、前述のＩ２’ＨがＣＰＹ８１Ｅに属することが知られている。
しかし、これら列挙したチトクロームＰ４５０は、メチレンジオキシブリッジ形成には関与しない。
リグナンの生合成に関わる酵素の遺伝子としては、レンギョウ（Forsythia intermedia）などにおけるピノレジノールの合成に関与するdirigent proteinが、報告されている（例えば、非特許文献１７、特許文献３参照）。また、レンギョウのピノレジノール−ラリシレジノール還元酵素の遺伝子（非特許文献１８、特許文献３）、およびThuja plicataのピノレジノール−ラリシレジノール還元酵素の遺伝子（非特許文献１９）が報告されている。組換えセコイソラリシレシノールデヒドロゲナーゼおよびその使用方法についても報告されている（特許文献４、非特許文献２０）。
〔特許文献１〕
特開２００１−１３９５７９公報（公開日：２００１年５月２２日）
〔特許文献２〕
特開平１０−７６７６号公報（公開日：平成１０（１９９８）年１月１３日）
〔特許文献３〕
特表２００１−５０７９３１公報（公表日：２００１年６月１９日）
〔特許文献４〕
特表２００２−５１２７９０公報（公表日：２００２年５月８日）
〔非特許文献１〕
並木満夫著 「ゴマ その科学と機能性」丸善プラネット社出版
〔非特許文献２〕
日本農芸化学会誌 76 805-813 2002
〔非特許文献３〕
Lignans: biosynthesis and function, Comprehensive natural products chemistry vol 1. 640-713, 1999
〔非特許文献４〕
Phytochemisity, 49, 387, 1998
〔非特許文献５〕
Phytochemisity, 30, 2953, 1991
〔非特許文献６〕
Phytochemisity, 41, 457, 1996
〔非特許文献７〕
Planta, 214, 288, 2001
〔非特許文献８〕
J Biol Chem. 2003, May 5 [Epub ahead of print].
〔非特許文献９〕
Nelson et al. Pharmacogenetics 6, 1-42, 1996
〔非特許文献１０〕
Nature 366 276-279, 1993
〔非特許文献１１〕
Plant J. 19, 441-451, 1999
〔非特許文献１２〕
FEBS Letters, 431,287, 1998
〔非特許文献１３〕
Plant Physiology, 121, 821, 1999
〔非特許文献１４〕
Biochemical and Biophysical Research Communications, 251, 67, 1998
〔非特許文献１５〕
Plant and Cell Physiology, 40, 1182, 1999
〔非特許文献１６〕
J. Biol. Chem. 273, 7260, 1998
〔非特許文献１７〕
Plant Physiol. 123, 453, 2000
〔非特許文献１８〕
J. Biol. Chem. 271, 29473, 1996
〔非特許文献１９〕
J. Biol. Chem. 271, 618, 1999
〔非特許文献２０〕
J. Biol. Chem. 2001 Apr 20;276(16):12614-23, Epub 2001 Jan 18。
〔特許文献１〕
特開２００１−１３９５７９公報（公開日：２００１年５月２２日）
〔特許文献２〕
特開平１０−７６７６号公報（公開日：平成１０（１９９８）年１月１３日）
〔特許文献３〕
特表２００１−５０７９３１公報（公表日：２００１年６月１９日）
〔特許文献４〕
特表２００２−５１２７９０公報（公表日：２００２年５月８日）
〔非特許文献１〕
並木満夫著 「ゴマ その科学と機能性」丸善プラネット社出版
〔非特許文献２〕
日本農芸化学会誌 76 805-813 2002
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Lignans: biosynthesis and function, Comprehensive natural products chemistry vol 1. 640-713, 1999
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〔非特許文献６〕
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Planta, 214, 288, 2001
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J Biol Chem. 2003, May 5 [Epub ahead of print].
〔非特許文献９〕
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〔非特許文献１０〕
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〔非特許文献１２〕
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Plant and Cell Physiology, 40, 1182, 1999
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J. Biol. Chem. 273, 7260, 1998
〔非特許文献１７〕
Plant Physiol. 123, 453, 2000
〔非特許文献１８〕
J. Biol. Chem. 271, 29473, 1996
〔非特許文献１９〕
J. Biol. Chem. 271, 618, 1999
〔非特許文献２０〕
J. Biol. Chem. 2001 Apr 20;276(16):12614-23, Epub 2001 Jan 18。
上述したように、セサミンは多様な生理活性を有し、様々の改善効果を有する物質であることが明らかにされている。しかしながら、従来のセサミンの生産方法は、上述したようなゴマ種子から得る方法しか存在しない。従って、セサミンの生産はゴマ種子に依存し、その結果、セサミンの生産量の拡大および／または生産コストの削減は困難である。
このような課題を解決するためには、遺伝子工学手法を用いることが好ましい。しかし、ゴマ種子においてセサミンの生合成に関与することが明らかとなった上記２種のチトクロームＰ４５０について、これらの酵素は未だ精製されておらず、これらをコードする遺伝子も未だクローニングされていない。さらに、他の生物種においてメチレンジオキシブリッジを形成する上記チトクロームＰ４５０についても、これらの酵素は未だ精製されておらず、これらをコードする遺伝子も未だクローニングされていない。また、上述したような他のチトクロームＰ４５０に関しても、これらの酵素は未だ精製されておらず、これらをコードする遺伝子も未だクローニングされていない。さらに、クローニングされた他の生物種におけるリグナンの生合成酵素は、セサミンおよび／またはピペリトールの合成に関与する酵素ではなかった。
ゴマ種子由来の遺伝子としてクローニングされた遺伝子がいくつか存在する。例えば、種子の貯蔵タンパク質であるグロブリンとしてAF240004、AF240005、AF240006など、脂質の合成や貯蔵に関わる遺伝子としてはオレオシン（J Biochem. 122:819-24. 1997）、アシルキャリアータンパク質不飽和化酵素（Plant Cell Physiol. 1996 37,201-5）、ステロレオシン（Plant Physiol. 2002 128:1200-11）、脂肪酸不飽和化酵素（Plant Sci. 161 935-941 (2001)）など。しかし、これらはリグナン合成に関与する遺伝子ではない。
このように、リグナン合成に関与する酵素をコードする遺伝子は、未だ明らかになっていない。従って、このような酵素および当該酵素をコードする遺伝子の同定が強く望まれていた。
本発明は、上記の問題点に鑑みなされたものであり、その目的は、リグナンの水酸基とメチル基からメチレンジオキシブリッジを形成する反応を触媒する酵素、好ましくはピノレジノールからピペリトールへの反応および／またはピペリトールからセサミンへの反応を触媒する酵素の遺伝子を同定し、得られたゴマ由来酵素の遺伝子を用いて、組換え生物などからセサミンおよび／またはピペリトールを生産する方法を実現することである。
〔発明の開示〕
本発明者等は、上記課題を解決すべく鋭意検討を行った結果、ゴマ種子ｃＤＮＡライブラリーからゴマ種子チトクロームＰ４５０遺伝子群（以下、ＳｉＰ遺伝子）を取得し、これらを酵母において発現させた。そして、その組換え酵母からミクロソーム画分を回収し、ピノレジノールまたはピペリトールと反応させ、それぞれからピペリトールまたはセサミンが生成されるかどうかをＨＰＬＣ分析によって調べた。その結果、ピノレジノールからピペリトールへの反応、およびピペリトールからセサミンへの反応を触媒するタンパク質およびその遺伝子を同定し、本発明を完成させるに至った。
本発明者等は、上記課題を解決すべく鋭意検討を行った結果、ゴマ種子ｃＤＮＡライブラリーからゴマ種子チトクロームＰ４５０遺伝子群（以下、ＳｉＰ遺伝子）を取得し、これらを酵母において発現させた。そして、その組換え酵母からミクロソーム画分を回収し、ピノレジノールまたはピペリトールと反応させ、それぞれからピペリトールまたはセサミンが生成されるかどうかをＨＰＬＣ分析によって調べた。その結果、ピノレジノールからピペリトールへの反応、およびピペリトールからセサミンへの反応を触媒するタンパク質およびその遺伝子を同定し、本発明を完成させるに至った。
すなわち、本発明は産業上有用な物質または方法として、下記１）〜２１）の発明を含むものである。
１）ピペリトールおよび／またはセサミンの生合成を触媒するタンパク質をコードする遺伝子（ピノレジノールからピペリトール、および／またはピペリトールからセサミンの生合成を触媒するタンパク質をコードする遺伝子）。
２）ピノレジノールおよび／またはピペリトールにメチレンジオキシブリッジを形成する反応を触媒するタンパク質をコードする遺伝子。
３）ピペリトールおよび／もしくはセサミンの生合成を触媒するタンパク質をコードし、かつ以下（ａ）もしくは（ｂ）からなる遺伝子：
（ａ）配列番号１、６４もしくは７８に示されるアミノ酸配列；または
（ｂ）配列番号１、６４もしくは７８に示されるアミノ酸配列の１個またはそれ以上のアミノ酸が、置換、欠失、挿入、および／もしくは付加によって改変されているアミノ酸配列。
（ａ）配列番号１、６４もしくは７８に示されるアミノ酸配列；または
（ｂ）配列番号１、６４もしくは７８に示されるアミノ酸配列の１個またはそれ以上のアミノ酸が、置換、欠失、挿入、および／もしくは付加によって改変されているアミノ酸配列。
４）ピペリトールおよび／またはセサミンの生合成を触媒するタンパク質をコードし、かつ配列番号１、６４または７８に示されるアミノ酸配列に対して５０％以上の相同性を有するアミノ酸からなる遺伝子。
５）配列番号２、６５または７９に示される塩基配列をオープンリーディングフレーム領域として有する遺伝子。
６）ピペリトールおよび／またはセサミンの生合成を触媒するタンパク質をコードし、かつ以下の（ａ）〜（ｃ）のいずれか１つにストリンジェントな条件下でハイブリダイズする遺伝子：
（ａ）配列番号２、６５もしくは７９に示される塩基配列からなるポリヌクレオチド；
（ｂ）配列番号１、６４もしくは７８に示されたアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするポリヌクレオチド；あるいは
（ｃ）（ａ）または（ｂ）に示されるポリヌクレオチドの断片。
（ａ）配列番号２、６５もしくは７９に示される塩基配列からなるポリヌクレオチド；
（ｂ）配列番号１、６４もしくは７８に示されたアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするポリヌクレオチド；あるいは
（ｃ）（ａ）または（ｂ）に示されるポリヌクレオチドの断片。
７）ゴマ由来である、上記１）〜６）のいずれか１つに記載の遺伝子。
８）上記１）〜７）のいずれか１つに記載の遺伝子によりコードされるタンパク質。
９）ピペリトールおよび／もしくはセサミンの生合成を触媒し、かつ以下（ａ）または（ｂ）からなるタンパク質：
（ａ）配列番号１、６４もしくは７８に示されるアミノ酸配列；または
（ｂ）配列番号１、６４もしくは７８に示されるアミノ酸配列の１個またはそれ以上のアミノ酸が、置換、欠失、挿入、および／もしくは付加によって改変されているアミノ酸配列。
（ａ）配列番号１、６４もしくは７８に示されるアミノ酸配列；または
（ｂ）配列番号１、６４もしくは７８に示されるアミノ酸配列の１個またはそれ以上のアミノ酸が、置換、欠失、挿入、および／もしくは付加によって改変されているアミノ酸配列。
１０）上記８）または９）に記載のタンパク質を認識する抗体。
１１）上記１）〜７）のいずれか１つに記載の遺伝子を含有する組換え発現ベクター。
１２）上記１）〜７）のいずれか１つに記載の遺伝子を含有する組換え発現ベクターを含む形質転換体。
１３）上記１２）に記載の形質転換体を培養または生育させる工程、ならびに該形質転換体からピペリトールおよび／またはセサミンの生合成を触媒するタンパク質を得る工程を包含するタンパク質の生産方法。
１４）上記１）〜７）のいずれか１つに記載の遺伝子が導入された植物もしくは該植物の子孫またはこれらの組織。
１５）上記１）〜７）のいずれか１つに記載の遺伝子、あるいは８）または９）に記載のタンパク質を用いる工程を包含する、ピペリトールおよび／またはセサミンの生産方法。
１６）上記１）〜７）のいずれかに記載の遺伝子を用いる工程を包含する、リグナン高含有の形質転換体を生産する方法。
１７）上記１）〜７）のいずれかに記載の遺伝子を用いる工程を包含する、ピペリトールおよび／またはセサミン高含有の植物体を生産する方法。
１８）上記１）〜７）のいずれかに記載の遺伝子を用いる工程を包含する、リグナン低含有の形質転換体を生産する方法。
１９）上記１）〜７）のいずれかに記載の遺伝子を用いる工程を包含する、ピペリトールおよび／またはセサミン低含有の植物体を生産する方法。
２０）上記１）〜７）のいずれかに記載の遺伝子を用いる工程を包含する、ゴマを育種する方法。
２１）ポリヌクレオチドプローブを備えている遺伝子検出器具であって、該プローブの塩基配列が、上記１）〜７）のいずれか１つに記載の遺伝子における少なくとも一部分の塩基配列またはその相補配列からなる、遺伝子検出器具。
〔図面の簡単な説明〕
図１は、ゴマリグナンの一般的な合成経路を模式的に示す図である。１：コニフェリルアルコール；２：ピノレジノール；３：ピペリトール合成酵素；４：ピペリトール；５：セサミン合成酵素；６：セサミン。
図１は、ゴマリグナンの一般的な合成経路を模式的に示す図である。１：コニフェリルアルコール；２：ピノレジノール；３：ピペリトール合成酵素；４：ピペリトール；５：セサミン合成酵素；６：セサミン。
図２ａ〜図２ｆは、ＳｉＰ１８９遺伝子がコードする酵素の活性を測定したＨＰＬＣの結果を示す図である。
図３は、チトクロームＰ４５０のコードするアミノ酸の一次構造解析から得られる樹系図である。
図４は、ＳｉＰ１８９遺伝子がコードするタンパク質との相同性検索の結果を示す図である。
図５は、ＳｉＰ１８９遺伝子のサザン解析の結果を示す図である。
図６ａ〜図６ｄは、ＳｒＳｉＰ１８９遺伝子がコードするタンパク質の活性を測定したＨＰＬＣ分析の結果を示す図である。
図７は、形質転換タバコにおけるＳｉＰ遺伝子の発現解析の結果を示す図である。
図８ａ〜図８ｄは、植物細胞内におけるＳｉＰタンパク質の機能解析の結果を示す図である。
図９Ａ〜図９Ｈは、発現調節エレメントについてＳｉＰ１８９遺伝子のプロモーター領域を解析した結果を示す図である。
図１０は、ＳｉＰ１８９遺伝子のプロモーター領域に存在する発現調節エレメントを示す図である。
図１１Ａ〜図１１Ｈは、発現調節エレメントについてＳｒＳｉＰ１８９遺伝子のプロモーター領域を解析した結果を示す図である。
図１２Ａ〜図１２Ｃは、ＳｉＰ１８９遺伝子とＳｒＳｉＰ遺伝子との間での相同性の比較を示す図である。
〔発明を実施するための最良の形態〕
本発明の実施の形態について以下に説明するが、本発明は以下の記載に限定されるものではない。
本発明の実施の形態について以下に説明するが、本発明は以下の記載に限定されるものではない。
（１）本発明に係る遺伝子および該遺伝子がコードするタンパク質の構造
本発明に係る遺伝子は、ピペリトールおよび／またはセサミンの生合成を触媒するタンパク質をコードする。ここでいう「ピペリトールおよび／またはセサミンの生合成」とは、ピノレジノールからピペリトール、および／またはピペリトールからセサミンの生合成をいい、より詳細には、ピノレジノールおよび／またはピペリトールに対してメチレンジオキシブリッジを形成する反応いう。本実施の形態では、本発明に係る遺伝子として、ゴマ種子由来のピペリトールおよびセサミンの生合成を触媒するタンパク質をコードする遺伝子ＳｉＰ１８９（配列番号２に示す塩基配列）を挙げて説明する。なお本願では、オープンリーディングフレーム領域を、開始コドンから終止コドン直前までの領域とする。
本発明に係る遺伝子は、ピペリトールおよび／またはセサミンの生合成を触媒するタンパク質をコードする。ここでいう「ピペリトールおよび／またはセサミンの生合成」とは、ピノレジノールからピペリトール、および／またはピペリトールからセサミンの生合成をいい、より詳細には、ピノレジノールおよび／またはピペリトールに対してメチレンジオキシブリッジを形成する反応いう。本実施の形態では、本発明に係る遺伝子として、ゴマ種子由来のピペリトールおよびセサミンの生合成を触媒するタンパク質をコードする遺伝子ＳｉＰ１８９（配列番号２に示す塩基配列）を挙げて説明する。なお本願では、オープンリーディングフレーム領域を、開始コドンから終止コドン直前までの領域とする。
（１−１）本発明に係る遺伝子
本明細書中で使用される場合、用語「遺伝子」は、「ポリヌクレオチド」、「核酸」または「核酸分子」と交換可能に使用され、ヌクレオチドの重合体が意図される。本明細書中で使用される場合、用語「塩基配列」は、「核酸配列」または「ヌクレオチド配列」と交換可能に使用され、デオキシリボヌクレオチド（Ａ、Ｇ、ＣおよびＴと省略される）の配列として示される。
本明細書中で使用される場合、用語「遺伝子」は、「ポリヌクレオチド」、「核酸」または「核酸分子」と交換可能に使用され、ヌクレオチドの重合体が意図される。本明細書中で使用される場合、用語「塩基配列」は、「核酸配列」または「ヌクレオチド配列」と交換可能に使用され、デオキシリボヌクレオチド（Ａ、Ｇ、ＣおよびＴと省略される）の配列として示される。
本発明の遺伝子としては、例えば、配列番号１、６４または７８に示されるアミノ酸配列をコードするものが挙げられる。しかしながら、複数個のアミノ酸の付加、欠失および／または他のアミノ酸との置換によって修飾されたアミノ酸配列を有するタンパク質も、もとのタンパク質と同様の酵素活性を維持し得ることが知られている。すなわち本発明には、ピペリトールおよびセサミンの生合成を触媒するタンパク質をコードする遺伝子である限り、（ａ）配列番号１、６４または７８に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする遺伝子、（ｂ）上記アミノ酸配列において、１個またはそれ以上のアミノ酸が置換、欠失、挿入、および／または付加されたアミノ酸配列からなり、かつピペリトールおよび／またはセサミンの生合成を触媒する作用を有するタンパク質をコードする遺伝子も含まれる。このような遺伝子として、例えば、配列番号２、６５または７９に示される塩基配列をオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）として有する遺伝子が挙げられる。なお、後述する実施例でも説明するが、本発明に係る遺伝子は、チトクロームＰ４５０タンパク質をコードする遺伝子とも換言することができる。
ここで、「１個またはそれ以上のアミノ酸が置換、欠失、挿入、および／または付加された」とは、部位特異的変異誘発法（Hashimoto-Gotoh,Gene 152,271-275(1995)他）等の公知の変異タンパク質作製法を用いて、置換、欠失、挿入、および／または付加できる程度の数（好ましくは１０個以下、より好ましくは７個以下、さらに好ましくは５個以下）のアミノ酸が置換、欠失、挿入、および／または付加されることを意味する。したがって、上記（ｂ）のタンパク質をコードする遺伝子は、上記（ａ）のタンパク質の変異タンパク質をコードする遺伝子である。また、本明細書中で使用される場合、「変異タンパク質」は、主として公知の変異タンパク質作製法により人為的に導入された変異タンパク質を意味するが、天然から単離精製された同様の変異タンパク質であってもよい。
なお、本発明に係る遺伝子は、２本鎖ＤＮＡのみならず、それを構成するセンス鎖およびアンチセンス鎖といった各１本鎖のＤＮＡまたはＲＮＡであり得る。アンチセンス鎖は、プローブとしてまたはアンチセンス薬剤として利用することができる。ＤＮＡには、クローニング技術もしくは化学合成技術、またはこれらの組み合わせを用いて得られるｃＤＮＡまたはゲノムＤＮＡなどが含まれる。さらに、本発明に係る遺伝子は、上記（ａ）または（ｂ）のアミノ酸をコードする配列以外に、非翻訳領域（ＵＴＲ）の配列やベクター配列（発現ベクター配列を含む）などの配列を含んでもよい。
さらに、本発明に係る遺伝子は、配列番号１、６４または７８に示されるアミノ酸配列に対して、２０％以上、好ましくは５０％以上、さらに好ましくは６０％または７０％以上の相同性を有するタンパク質であって、かつピペリトールおよび／またはセサミンの生合成を触媒するタンパク質をコードする遺伝子も含み、かかる遺伝子もリグナン量の制御または植物育種に利用することができる。なお、本明細書中で使用される場合、「相同性」とは、アミノ酸配列中に占める同じ配列の割合であり、この値が高いほど両者は近縁な関係であるといえる。
さらに、本発明に係る遺伝子は、配列番号２、６５または７９に示される塩基配列からなるポリヌクレオチド、配列番号１、６４または７８に示されたアミノ酸配列をコードする塩基配列からなるポリヌクレオチド、あるいはこれらのポリヌクレオチドの断片であり得、例えば、６個以上のアミノ酸をコードする塩基配列（すなわち、１８個の塩基）からなるポリヌクレオチドに対して、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつピペリトールおよび／またはセサミンの生合成を触媒するタンパク質をコードする遺伝子も含まれる。なお、上記「ストリンジェントな条件」とは、少なくとも８０％の同一性、好ましくは少なくとも９５％の同一性、最も好ましくは少なくとも９７％の同一性が配列間に存在するときにのみハイブリダイゼーションが起こることを意味する。具体的には、例えば、５×ＳＳＣ、５０℃の条件下でハイブリダイズし得る条件を挙げることができる。
上記ハイブリダイゼーションは、J.Sambrook et al. Molecular Cloning, A Laboratory Manual,2d Ed., Cold Spring Harbor Laboratory（1989）などに記載されている公知の方法で行うことができる。通常、温度が高いほど、および／または塩濃度が低いほど、ストリンジェンシーは高くなる（ハイブリダイズし難くなる）。なお、適切なハイブリダイゼーション温度は、塩基配列やその塩基配列の長さによって異なり、例えば、アミノ酸６個をコードする１８塩基からなるＤＮＡフラグメントをプローブとした場合には５０℃以下の温度が好ましい。
上記のハイブリダイゼーションによって選択される遺伝子としては、天然由来の遺伝子（例えば、植物由来の遺伝子（例えば、コケ科植物由来の遺伝子））が挙げられるが、植物以外由来の遺伝子であってもよい。また、上記のハイブリダイゼーションによって選択される遺伝子はｃＤＮＡであってもよく、ゲノムＤＮＡであってもよい。
（１−２）本発明に係るタンパク質
本発明に係るタンパク質は、上記（１−１）欄に記載した本発明に係る遺伝子にコードされるタンパク質であればよい。このようなタンパク質であれば、ピノレジノールからピペリトール、またはピペリトールからセサミンの生合成を触媒する。なお、本発明には、ピノレジノールまたはピペリトールに対してメチレンジオキシブリッジを形成する反応を触媒するタンパク質も含まれる。かかるタンパク質として、例えば、上述の（ａ）配列番号１、６４または７８に示されるアミノ酸配列を有するタンパク質、または（ｂ）上記アミノ酸配列において、１個またはそれ以上のアミノ酸が置換、欠失、挿入、および／または付加されたアミノ酸配列からなり、かつピペリトールおよび／またはセサミンの生合成を触媒する作用を有するタンパク質を挙げられる。
本発明に係るタンパク質は、上記（１−１）欄に記載した本発明に係る遺伝子にコードされるタンパク質であればよい。このようなタンパク質であれば、ピノレジノールからピペリトール、またはピペリトールからセサミンの生合成を触媒する。なお、本発明には、ピノレジノールまたはピペリトールに対してメチレンジオキシブリッジを形成する反応を触媒するタンパク質も含まれる。かかるタンパク質として、例えば、上述の（ａ）配列番号１、６４または７８に示されるアミノ酸配列を有するタンパク質、または（ｂ）上記アミノ酸配列において、１個またはそれ以上のアミノ酸が置換、欠失、挿入、および／または付加されたアミノ酸配列からなり、かつピペリトールおよび／またはセサミンの生合成を触媒する作用を有するタンパク質を挙げられる。
本発明に係るタンパク質は、上記（１−１）欄に記載した本発明に係る遺伝子を宿主細胞に導入して、そのタンパク質を細胞内で発現させた状態であってもよいし、細胞または組織などから単離精製された状態であってもよい。また、本発明に係るタンパク質は、他のタンパク質との融合タンパク質であってもよい。さらに本発明に係るタンパク質は、化学合成されたものであってもよい。
なお、本発明に係るタンパク質は、アミノ酸がペプチド結合してなるポリペプチドであればよいが、これに限定されず、ポリペプチド以外の構造を含む複合タンパク質であってもよく、付加的なポリペプチドを含むものであってもよい。ポリペプチドが付加される場合としては、例えば、ＨｉｓやＭｙｃ、Ｆｌａｇ等の種々のエピトープトープが本発明に係るタンパク質にタグ化されるような場合が挙げられる。
（２）本発明に係る遺伝子およびタンパク質の取得方法
本発明に係る遺伝子およびタンパク質の取得方法（生産方法）は特に限定されるものではないが、代表的な方法として次に示す各方法を挙げることができる。
本発明に係る遺伝子およびタンパク質の取得方法（生産方法）は特に限定されるものではないが、代表的な方法として次に示す各方法を挙げることができる。
（２−１）遺伝子の取得方法
天然の塩基配列を有する遺伝子について、本発明に係る遺伝子は、後述する実施例に具体的に示すように、例えば、ｃＤＮＡライブラリーのスクリーニングによって取得され得る。
天然の塩基配列を有する遺伝子について、本発明に係る遺伝子は、後述する実施例に具体的に示すように、例えば、ｃＤＮＡライブラリーのスクリーニングによって取得され得る。
あるいは、本発明に係る遺伝子は、ＰＣＲ等の増幅手段を取得され得る。例えば、本発明に係る遺伝子のｃＤＮＡ配列のうち、５’側および３’側の配列（またはその相補配列）に基づいてプライマーを設計し、これらのプライマーを用いてゲノムＤＮＡ（またはｃＤＮＡ）等を鋳型にしてＰＣＲを行い、両プライマー間に挟まれるＤＮＡ領域を増幅することで、本発明に係る遺伝子を含むＤＮＡ断片を大量に取得し得る。
また、所望の配列を有するポリヌクレオチドは、遺伝子配列情報に基づいて、公知の化学合成を用いて合成されてもよい。
修飾されたアミノ酸配列を有する酵素をコードするＤＮＡについては、生来の塩基配列を有するＤＮＡに対して、常用の部位特異的変異誘発法またはＰＣＲ法を適用して合成することができる。例えば、修飾を導入すべきＤＮＡ断片を生来のｃＤＮＡまたはゲノムＤＮＡの制限酵素処理によって得て、これを鋳型にして、所望の変異を導入したプライマーを用いて部位特異的変異誘発またはＰＣＲ法を実施し、所望の修飾を導入したＤＮＡ断片を得る。その後、この変異を導入したＤＮＡ断片のＤＮＡ断片を、目的酵素をコードするポリヌクレオチド（ＤＮＡ）から、このＤＮＡ断片と対応する領域を除いたポリヌクレオチドと連結すればよい。あるいは、短縮されたアミノ酸配列からなる酵素をコードするＤＮＡを得るには、例えば、目的とするアミノ酸配列より長いアミノ酸配列（例えば、全長アミノ酸配列）をコードするＤＮＡを所望の制限酵素により切断することによって得ることができる。得られたＤＮＡ断片が目的とするアミノ酸配列の全体をコードしていない場合は、不足部分の配列からなるＤＮＡ断片を合成して連結すればよい。
また、得られた遺伝子を大腸菌または酵母での遺伝子発現系を用いてコードされるタンパク質を発現させる。このタンパク質の酵素活性を測定することによって、得られた遺伝子がピノレジノールからピペリトール、またはピペリトールからセサミンの生合成を触媒するタンパク質をコードする遺伝子であることを確認することができる。さらに、当該遺伝子を細胞内に導入することによって、当該遺伝子の産物である、ピノレジノールからピペリトールの生合成またはピペリトールからセサミンの生合成を触媒するタンパク質を得ることができる。
あるいは、配列番号１、６４または７８に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質に対する抗体を用いて他の生物のピペリトールおよびセサミン合成酵素遺伝子をクローン化することもできる。
（２−２）タンパク質の取得方法
本発明に係るタンパク質を取得する方法（生産方法）としては、本発明に係るタンパク質を発現する細胞、組織などから単純精製する方法が挙げられるが、これに限定されない。なお、本発明に係るタンパク質を発現する細胞または組織は、自然発生型のものでもよく、例えば、組換えバキュロウイルスに感染した細胞、組織であってもよい。精製方法は、限定されないが、上述したように本発明に係る遺伝子を含む発現ベクターによって形質転換された宿主を、培養、栽培または飼育した後、常法に従って、例えば、濾過、遠心分離、細胞の破砕（細胞融解）、ゲル濾過クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー等によって、培養物から目的とするタンパク質を回収および／または精製すればよい。
本発明に係るタンパク質を取得する方法（生産方法）としては、本発明に係るタンパク質を発現する細胞、組織などから単純精製する方法が挙げられるが、これに限定されない。なお、本発明に係るタンパク質を発現する細胞または組織は、自然発生型のものでもよく、例えば、組換えバキュロウイルスに感染した細胞、組織であってもよい。精製方法は、限定されないが、上述したように本発明に係る遺伝子を含む発現ベクターによって形質転換された宿主を、培養、栽培または飼育した後、常法に従って、例えば、濾過、遠心分離、細胞の破砕（細胞融解）、ゲル濾過クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー等によって、培養物から目的とするタンパク質を回収および／または精製すればよい。
また、本発明に係るタンパク質を取得する方法としては、遺伝子組換え技術等を用いる方法が挙げられる。この場合、例えば、本発明に係る遺伝子をベクターなどに組み込んだ後、公知の方法を用いて発現可能に宿主細胞に導入し、細胞内で翻訳されて得られる上記タンパク質を精製する方法などを用いることができる。遺伝子の導入（形質転換）または遺伝子の発現等の具体的な方法については後述する。
あるいは、配列番号１、６４または７８に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質に対する抗体を用いても、ピペリトールおよびセサミン合成酵素のタンパク質を得ることができる。さらにこの抗体を用いて、他の生物のピペリトールおよびセサミンの生合成を触媒するタンパク質および当該タンパク質をコードする遺伝子をクローニングすることもできる。
なお、このように宿主に外来遺伝子を導入する場合、宿主、および外来遺伝子を発現させるために宿主内で機能するプロモーターを組み入れた発現ベクターとしては様々なものが存在するが、目的に応じたものを適宜選択すればよい。産生されたタンパク質を精製する方法は、用いた宿主または目的のタンパク質の性質によって異なるが、タグ等の利用することによって比較的容易に目的のタンパク質を精製することができる。
変異タンパク質を作製する方法についても、特に限定されない。例えば、部位特異的変異誘発法（Hashimoto-Gotoh,Gene 152,271-275(1995)他）またはＰＣＲ法を利用して塩基配列に点変異を導入し変異タンパク質を作製する方法、あるいはトランスポゾンの挿入による突然変異株作製法などの周知の変異タンパク質作製法を用いることができる。これら方法を用いることによって、上記（ａ）のタンパク質をコードするｃＤＮＡの塩基配列において、１またはそれ以上の塩基が置換、欠失、挿入、および／または付加されるように改変を加えることによって作製することができる。また、変異タンパク質の作製には、市販のキットを利用してもよい。
また、本発明に係るタンパク質は、取得方法が上述に限定されることなく、例えば、市販されているペプチド合成器等を用いて化学合成されてもよい。またその他の例としては、無細胞系のタンパク質合成液（Proc.Natl.Acad.Sci.USA, 78, 5598―5602 (1981)、J.Biol.Chem.、253, 3753―3756 (1978)など）を利用して、本発明に係る遺伝子から本発明に係るタンパク質を合成してもよい。
（３）本発明に係る抗体
本発明に係る抗体は、上記（１−２）欄に記載した本発明に係るタンパク質（例えば、上記（ａ）もしくは（ｂ）のタンパク質、またはこれらのフラグメント）を抗原として、公知の方法によって得られる抗体（ポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体）である。公知の方法としては、例えば、文献（Harlowらの「Antibodies : A laboratory manual(Cold Spring Harbor Laboratory, New York(1988))、岩崎らの「単クローン抗体 ハイブリドーマとＥＬＩＳＡ、講談社(1991)」」に記載されている方法が挙げられる。得られた抗体は、本発明に係るタンパク質の検出および／または測定などに利用できる。
本発明に係る抗体は、上記（１−２）欄に記載した本発明に係るタンパク質（例えば、上記（ａ）もしくは（ｂ）のタンパク質、またはこれらのフラグメント）を抗原として、公知の方法によって得られる抗体（ポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体）である。公知の方法としては、例えば、文献（Harlowらの「Antibodies : A laboratory manual(Cold Spring Harbor Laboratory, New York(1988))、岩崎らの「単クローン抗体 ハイブリドーマとＥＬＩＳＡ、講談社(1991)」」に記載されている方法が挙げられる。得られた抗体は、本発明に係るタンパク質の検出および／または測定などに利用できる。
（４）本発明に係る組換えベクター
本発明に係る組換え発現ベクターは、上記（１−１）欄に記載した本発明に係る遺伝子（例えば、上記（ａ）または（ｂ）のタンパク質をコードする遺伝子）を含有する。本発明に係る組換え発現ベクターとしては、例えば、ｃＤＮＡが挿入された組換え発現ベクターが挙げられる。組換え発現ベクターの作製において、プラスミド、ファージ、またはコスミドなどが使用可能であるがこれらに限定されない。また、組換え発現ベクターの作製方法は、公知の方法を用いればよい。
本発明に係る組換え発現ベクターは、上記（１−１）欄に記載した本発明に係る遺伝子（例えば、上記（ａ）または（ｂ）のタンパク質をコードする遺伝子）を含有する。本発明に係る組換え発現ベクターとしては、例えば、ｃＤＮＡが挿入された組換え発現ベクターが挙げられる。組換え発現ベクターの作製において、プラスミド、ファージ、またはコスミドなどが使用可能であるがこれらに限定されない。また、組換え発現ベクターの作製方法は、公知の方法を用いればよい。
ベクターとしては、限定されず、宿主細胞中で発現可能なベクターが挙げられる。すなわち、宿主細胞の種類に応じて、確実に遺伝子を発現させるためのプロモーター配列を適宜選択し、このプロモーター配列と本発明に係る遺伝子とをプラスミド等に組み込んだ発現ベクターを用いればよい。
本発明に係る遺伝子が宿主細胞に導入されたか否か、さらにはコードされるタンパク質が宿主細胞中で確実に発現しているか否かを確認するためには、種々のマーカーが使用され得る。マーカー（例えば、用いる宿主細胞中で欠失している遺伝子）と本発明に係る遺伝子とを含むプラスミド等を発現ベクターとして宿主細胞に導入する。この発現ベクターを導入した宿主細胞において、マーカーが発現しているか否かによって、本発明に係る遺伝子の導入を確認することができる。あるいは、本発明に係るタンパク質を融合タンパク質として宿主細胞中に発現させてもよい。例えば、本発明に係るタンパク質をオワンクラゲ由来の緑色蛍光タンパク質ＧＦＰ（Green Fluorescent Protein）との融合タンパク質として発現させて、ＧＦＰをマーカーとして用いてもよい。
上記宿主細胞は、特に限定されるものではなく、従来公知の各種細胞を用いることができる。具体的には、原核生物宿主としては、細菌（例えばエシェリヒア（Escherichia）属に属する細菌（例えば、大腸菌（Escherichia coli））またはバシルス（Bacillus）属微生物（例えばバシルス.スブシルス（Bacillus subtilis）））などを用いることができる。真核生物宿主としては、下等真核生物（例えば、真核性微生物（例えば、真菌である酵母または糸状菌））を用いることができる。酵母としては、例えば、サッカロミセス（Saccharomyces）属微生物（例えば、サッカロミセス.セレビシエ(Saccharomyces cerevisiae)）等が挙げられ、また糸状菌としてはアスペルギルス（Aspergillus）属微生物（例えば、アスペルギルス.オリゼ（Aspergillus oryzae）、アスペルギルス.ニガー（Aspergillus niger））およびペニシリウム（Penicillium）属微生物が挙げられる。さらに、動物細胞または植物細胞を宿主細胞として使用することができる。植物細胞としては、ゴマ科植物、イネ科植物など種々の植物細胞が宿主細胞として利用可能であり、また動物細胞としては、マウス、ハムスター、サル、ヒト等の細胞系が宿主細胞として利用可能である。さらに昆虫細胞（例えば、カイコ細胞、またはカイコの成虫それ自体）も利用可能である。
本発明に係る組換え発現ベクターは、目的の宿主細胞の種類に依存して、発現制御領域（例えば、プロモーター、ターミネーター、および／または複製起点等）を含有する。細菌用発現ベクターのプロモーターとしては、常用のプロモーター（例えば、trcプロモーター、tacプロモーター、lacプロモーター等）が使用され、酵母用プロモーターとしては、例えば、グリセルアルデヒド３リン酸デヒドロゲナーゼ（ＧＡＰＤＨ）プロモーター、PH05プロモーター等が使用され、糸状菌用プロモーターとしては、例えば、アミラーゼプロモーター、trpCプロモーター等が使用される。また動物細胞宿主用プロモーターとしては、ウイルス性プロモーター（例えば、SV40初期プロモーター、SV40後期プロモーター等）が使用される。発現ベクターの作製は、制限酵素および／またはリガーゼ等を用いて常法に従って行うことができる。また、発現ベクターによる宿主の形質転換もまた、常法に従って行うことができる。
上記発現ベクターを宿主細胞に導入する方法、すなわち形質転換方法は、特に限定されるものではなく、電気穿孔法、リン酸カルシウム法、リポソーム法、ＤＥＡＥデキストラン法、マイクロインジェクション法等の公知の方法を用いて行なうことができる。
（５）本発明に係る形質転換体
本発明に係る形質転換体は、上記（１−１）欄に記載した本発明に係る遺伝子（例えば、上記（ａ）または（ｂ）のタンパク質をコードする遺伝子）が導入された形質転換体である。ここで、「遺伝子が導入された」とは、公知の遺伝子操作技術によって、目的の細胞（宿主細胞）内に導入されることを意味する。また、本明細書中で使用される場合、用語「形質転換体」は、細胞、組織または器官のみならず、生物個体を包含することが意図される。
本発明に係る形質転換体は、上記（１−１）欄に記載した本発明に係る遺伝子（例えば、上記（ａ）または（ｂ）のタンパク質をコードする遺伝子）が導入された形質転換体である。ここで、「遺伝子が導入された」とは、公知の遺伝子操作技術によって、目的の細胞（宿主細胞）内に導入されることを意味する。また、本明細書中で使用される場合、用語「形質転換体」は、細胞、組織または器官のみならず、生物個体を包含することが意図される。
本発明に係る形質転換体は、上述の（４）欄に記載した本発明に係る組換え発現ベクターを用いて作製（生産）され得る。また、形質転換の対象となる生物もまた、特に限定されるものではなく、上記で例示した各種微生物や植物を用いることができる。また、プロモーターやベクターを適宜選択すれば、動物または昆虫も形質転換の対象とすることが可能である。
好ましい実施形態において、ゴマを使用して、本発明に係る形質転換体を作製することができる。ゴマの形質転換体の作製方法としては、例えば、Ｔ．Ａｓａｍｉｚｕ：Ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｏｆ ｓｅｓａｍｅ ｐｌａｎｔｓ ｕｓｉｎｇ ＭＡＴ ｖｅｃｔｏｒ ｓｙｓｔｅｍ：ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ｆａｔｔｙ ａｃｉｄ ｄｅｓａｔｕｒａｓｅ ｇｅｎｅｓ．Ｓｅｓａｍｅ Ｎｅｗｓｌｅｔｔｅｒ １６：２２〜２５（２００２）に記載されるような公知の方法が挙げられる。
また、本明細書中で使用される場合、用語「形質転換体」は、本発明に係る遺伝子が導入された植物もしくはこれと同じ性質を有する該植物の子孫またはそれらの組織も含まれることが意図される。
（６）本発明に係る遺伝子検出器具
本発明に係る遺伝子検出器具は、本発明に係る遺伝子における少なくとも一部分の塩基配列またはその相補配列からなるポリヌクレオチドをプローブとして備える。本発明に係る遺伝子検出器具は、種々の条件下において、本発明に係る遺伝子の発現パターンの検出および／または測定などに利用することができる。
本発明に係る遺伝子検出器具は、本発明に係る遺伝子における少なくとも一部分の塩基配列またはその相補配列からなるポリヌクレオチドをプローブとして備える。本発明に係る遺伝子検出器具は、種々の条件下において、本発明に係る遺伝子の発現パターンの検出および／または測定などに利用することができる。
本発明に係る遺伝子検出器具としては、例えば、本発明の遺伝子と特異的にハイブリダイズする上記プローブを基板（担体）上に固定化したＤＮＡチップが挙げられる。本明細書中で使用される場合、「ＤＮＡチップ」は、主として、合成したオリゴヌクレオチドをプローブに用いる合成型ＤＮＡチップが意図されるが、ＰＣＲ産物などのｃＤＮＡをプローブとして用いる貼り付け型ＤＮＡマイクロアレイもまた「ＤＮＡチップ」に包含される。
本明細書中で使用される場合、用語「オリゴヌクレオチド」は、ヌクレオチドが数個ないし数十個結合したものが意図され、「ポリヌクレオチド」と交換可能に使用される。オリゴヌクレオチドは、より長いポリヌクレオチドのフラグメントとして生成されても、化学合成されてもよい。
プローブとして用いるポリヌクレオチドの塩基配列は、ｃＤＮＡ配列の中から特徴的な配列を特定する公知の方法（例えば、ＳＡＧＥ（Serial Analysis of Gene Expression）法（Science 276:1268, 1997; Cell 88:243, 1997; Science 270:484, 1995; Nature 389:300, 1997; 米国特許第5,695,937 号）等）によって決定することができる。
なお、ＤＮＡチップの製造には、公知の方法を採用すればよい。例えば、合成オリゴヌクレオチドを使用する場合には、フォトリソグラフィー技術と固相法ＤＮＡ合成技術との組み合わせによって、基板上で該オリゴヌクレオチドを合成すればよい。一方、オリゴヌクレオチドとしてｃＤＮＡを用いる場合には、アレイ機を用いて基板上に貼り付ければよい。
また、一般的なＤＮＡチップと同様、パーフェクトマッチプローブ（オリゴヌクレオチド）と、該パーフェクトマッチプローブにおいて一塩基置換されたミスマッチプローブとを配置することによって、遺伝子の検出精度をより向上させてもよい。さらに、異なる遺伝子を同時に検出するために、複数種のオリゴヌクレオチドを同一の基板上に固定したＤＮＡチップを構成してもよい。
（７）本発明に係る遺伝子およびタンパク質等の利用方法（有用性）
本明細書において、主にゴマのピペリトールおよび／またはセサミンを生合成する酵素について述べてきたが、本発明は、ゴマ由来遺伝子のみに限定されるものではなく、ピペリトールおよび／またはセサミンを生合成する酵素の利用に関するものでもある。ピペリトールおよび／またはセサミンを生合成する酵素の起源としては、植物でも動物でも微生物であってもよく、ピペリトールおよび／またはセサミンを生合成する酵素活性を有していれば同様にリグナン量の制御へ利用できる。さらに本発明は、ピペリトールおよび／またはセサミンを生合成する酵素をコードする遺伝子を導入することによって得られる、リグナン量が調節された植物もしくはその子孫またはこれらの組織に関するものであり、その形態は切り花であってもよい。本発明で得たピペリトールおよび／またはセサミンを生合成する酵素をコードする遺伝子を用いると、ピペリトールまたはセサミンを生成したり、ピペリトールまたはセサミンの生成を抑制したりできる。現在の技術水準をもってすれば、植物に遺伝子を導入し、その遺伝子を構成的あるいは組織特異的に発現させることは可能であるし、またアンチセンス法、コサプレッション法およびＲＮＡｉ法などによって目的の遺伝子の発現を抑制することも可能である。形質転換可能な植物の例としては、ゴマ、イネ、レンギョウ、タバコ、シロイヌナズナ、ミヤコグサ、オオムギ、小麦、ナタネ、ポテト、トマト、ポプラ、バナナ、ユーカリ、サツマイモ、ダイズ、アルファルファ、ルーピン、トウモロコシ、カリフラワー、バラ、キク、カーネーション、金魚草、シクラメン、ラン、トルコギキョウ、フリージア、ガーベラ、グラジオラス、カスミソウ、カランコエ、ユリ、ペラルゴニウム、ゼラニウム、ペチュニア、トレニア、チューリップ、などが挙げられるがこれらに限定されない。
本明細書において、主にゴマのピペリトールおよび／またはセサミンを生合成する酵素について述べてきたが、本発明は、ゴマ由来遺伝子のみに限定されるものではなく、ピペリトールおよび／またはセサミンを生合成する酵素の利用に関するものでもある。ピペリトールおよび／またはセサミンを生合成する酵素の起源としては、植物でも動物でも微生物であってもよく、ピペリトールおよび／またはセサミンを生合成する酵素活性を有していれば同様にリグナン量の制御へ利用できる。さらに本発明は、ピペリトールおよび／またはセサミンを生合成する酵素をコードする遺伝子を導入することによって得られる、リグナン量が調節された植物もしくはその子孫またはこれらの組織に関するものであり、その形態は切り花であってもよい。本発明で得たピペリトールおよび／またはセサミンを生合成する酵素をコードする遺伝子を用いると、ピペリトールまたはセサミンを生成したり、ピペリトールまたはセサミンの生成を抑制したりできる。現在の技術水準をもってすれば、植物に遺伝子を導入し、その遺伝子を構成的あるいは組織特異的に発現させることは可能であるし、またアンチセンス法、コサプレッション法およびＲＮＡｉ法などによって目的の遺伝子の発現を抑制することも可能である。形質転換可能な植物の例としては、ゴマ、イネ、レンギョウ、タバコ、シロイヌナズナ、ミヤコグサ、オオムギ、小麦、ナタネ、ポテト、トマト、ポプラ、バナナ、ユーカリ、サツマイモ、ダイズ、アルファルファ、ルーピン、トウモロコシ、カリフラワー、バラ、キク、カーネーション、金魚草、シクラメン、ラン、トルコギキョウ、フリージア、ガーベラ、グラジオラス、カスミソウ、カランコエ、ユリ、ペラルゴニウム、ゼラニウム、ペチュニア、トレニア、チューリップ、などが挙げられるがこれらに限定されない。
また、本発明は、上記（５）に記載の形質転換体を培養または生育させ、該形質転換体からピペリトールおよび／またはセサミンの生合成を触媒するタンパク質を取得する工程を包含するタンパク質の生産方法を提供する。上記の方法に従えば、ピペリトールまたはセサミンを生合成する反応を触媒する活性を有するタンパク質を簡便かつ大量に生産することができる。なお、本方法は、上記の工程を包含すればよく、その他の具体的な条件（例えば、宿主の種類、使用する材料、条件など）は特に限定されるものではなく、適宜設定可能である。
また、本発明に係る遺伝子または本発明に係るタンパク質は、ピペリトールおよび／またはセサミンを生合成する、ピペリトールおよび／またはセサミンの生産方法にも利用することができる。上記の方法に従えば、ピペリトールおよび／またはセサミンを簡便かつ大量に生産することができ、ピペリトールおよび／またはセサミンを含有する食品（特に健康食品）または医薬品などの製造に利用することができる。なお、「遺伝子またはタンパク質を用いて」とは、in vivo、in vitro、ex vivoなど種々の条件下で遺伝子またはタンパク質を用いることが意図される。ピペリトールおよび／またはセサミンの生産方法としては、例えば、上記遺伝子を植物細胞に導入し、得られた形質転換植物の生体内でピペリトールおよび／またはセサミンを生合成させる方法、生体外において本発明に係るタンパク質とピペリトールまたはセサミンの前駆体とを反応させて、ピペリトールおよび／またはセサミンを生合成する方法、またはバイオリアクターなどを用いてピペリトールおよび／またはセサミンを生産する方法などが挙げられる。なお、遺伝子はそのまま使用しても生合成酵素活性を有しないため、一旦、当該遺伝子によってコードされるタンパク質が発現された状態で使用することが好ましい。
また、本発明に係る遺伝子を用いることによって、リグナン高含有の形質転換体またはリグナン低含有の形質転換体を生産する方法も本発明に含まれる。これらの方法に従えば、簡便かつ容易にリグナンの含有量を調節した形質転換体を生産することができ、形質転換体からリグナンを取り出したり、形質転換体自体を食品、医薬品またはこれらの前駆物質として利用することができる。
また、本明細書中で使用される場合、「ピペリトールおよび／またはセサミン高含有の植物体」とは、ピペリトールおよび／またはセサミンの含有量が多い植物体のことをいい、「ピペリトールおよび／またはセサミン低含有の植物体」とは、ピペリトールおよび／またはセサミンの含有量が少ない植物体のことをいう。
また、本発明に係る遺伝子は、ゴマを育種する方法にも利用可能である。この方法に従えば、例えば、本発明に係る遺伝子をゴマに導入して、ピペリトールおよび／またはセサミンの含有量が多いゴマを育種することができる。したがって、かかる形質転換ゴマの種子から、ピペリトールまたはセサミンを多く含む脂質を採取することができる。
以下添付した図面に沿って実施例を示し、本発明の実施の形態についてさらに詳しく説明する。もちろん、本発明は以下の実施例に限定されるものではなく、細部については様々な態様が可能であることはいうまでもない。さらに、本発明は上述した実施形態に限定されるものではなく、特許請求の範囲に示した範囲で種々の変更が可能であり、それぞれ開示された技術的手段を適宜組み合わせて得られる実施形態についても本発明の技術的範囲に含まれる。
〔実施例〕
以下実施例に従って、発明の詳細を述べる。分子生物学的手法はとくに断らない限り、Molecular Cloning (Sambrookら)に従った。
以下実施例に従って、発明の詳細を述べる。分子生物学的手法はとくに断らない限り、Molecular Cloning (Sambrookら)に従った。
〔実施例１：レンギョウからリグナンの調製〕
乾燥したレンギョウの葉６０ｇを３Ｌの水中で３０分間煮沸した後、抽出液をろ紙(circle; 300mm 東京ろし会社)を用いて濾過した。エバポレーターを用いて分注した濾液の溶媒の体積を減らした後に凍結乾燥（３０／Ｎ）し、抽出物凍結乾燥サンプル（21.6837ｇ）を得た。
乾燥したレンギョウの葉６０ｇを３Ｌの水中で３０分間煮沸した後、抽出液をろ紙(circle; 300mm 東京ろし会社)を用いて濾過した。エバポレーターを用いて分注した濾液の溶媒の体積を減らした後に凍結乾燥（３０／Ｎ）し、抽出物凍結乾燥サンプル（21.6837ｇ）を得た。
この抽出物凍結乾燥サンプル７ｇを１００ｍｌの水に再溶解させ、超音波を用いて均一化した。ダイアイオンＨＰ−２０樹脂（三菱化学）４００ｍｌを充填したカラムを、５０％アセトン８００ｍｌで洗浄した後、２Ｌの水で平衡化した。上記の均一化したサンプルを、このカラムを用いて粗精製した。具体的には、カラムに上記サンプルをロードした後、８００ｍｌの水で洗浄し、次に５０％メタノール８００ｍｌで一次溶出、引き続き１００％メタノール８００ｍｌで二次溶出した。
上記一次溶出サンプルおよび二次溶出サンプルについて、以下の条件を用いてＨＰＬＣ解析を行い、リグナンの存在を確認した。移動相には、Ａ液（０．１％トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ））と、Ｂ液（０．１％ＴＦＡ、９０％アセトニトリル）を用い、カラムにはDevelosil C30-UG-5（野村化学、４．６ｍｍ×１５０ｍｍ）を用いた。Ａ６０％、Ｂ４０％の混合液でカラムを平衡化（２０分間）した後、Ａ６０％、Ｂ４０％→Ａ１０％、Ｂ９０％の直線濃度勾配を用いて、流速０．６ｍｌ／分にて１５分間にわたって溶出し、Ａ１０％、Ｂ９０％で１０分間溶出した。吸収波長２８７ｎｍにてタンパク質を検出し、１分間毎に分画した（粗分画分析）。ＳＰＤ−１０ＡＶ（島津製作所）を用いて、各画分について２２０ｎｍから４００ｎｍまでスペクトルを測定し、リグナン特有の２つの吸収極大(２３０ｎｍおよび２８０ｎｍ)を持つ物質を探索した。その結果、リグナンの吸収極大を持つ物質は、主に二次溶出液内に含まれていることがわかった。
次に、リグナンを分離するために以下の条件で分画を行った（本分画）。二次溶出液をエバポレーターで濃縮した後に、凍結乾燥した（乾燥重量1.0325ｇ）。このこの抽出物凍結乾燥サンプル１ｇを、１ｍｌのジメチルスルフォキシド（ＤＭＳＯ）に超音波を用いて溶解させた後、６ｍｌのＢ３０％溶液に超音波を用いて溶解した。この溶解液を、１，５０００ｒｐｍで遠心分離した後、その上清約６ｍｌをカラム（Develosil ODS-UG-15/30; C-18（野村化学、５０ｍｍ×５００ｍｍ））にロードした。移動相には、Ａ液（０．０５％ＴＦＡ）、Ｂ液（０．０５％ＴＦＡ、９０％アセトニトリル）を用いた。流速３２ｍｌ／分にて、Ａ７０％、Ｂ３０％を用いて２０分平衡化した後にサンプルをロードし、Ａ７０％、Ｂ３０％→Ａ１０％、Ｂ９０％の直線濃度勾配を用いて６０分間にわたって溶出した後、Ａ１０％、Ｂ９０％を用いて３０分間溶出した。吸収波長２８０ｎｍにて検出を行い、１分間毎に溶出液を分画した（３２ｍｌ）（検出器：115ＵＶ detector. Gilson社）。最終的に２８０ｎｍに吸収を持つピークを有する画分を８つ得た。得られた８つの画分をエバポレーターで濃縮した後、凍結乾燥した。これらの画分について、上記粗分画分析と同様の条件でＨＰＬＣ分析した。この８種のリグナン特有の吸収スペクトルを示す画分のうち、単一のリグナンと思われる画分についての１Ｈ ＮＭＲ解析によって、ピノレジノールを同定した。最終的に４９．７ｍｇのピノレジノールが得られた。
〔実施例２：ゴマ種子のリグナン分析〕
栽培されているゴマの鞘から未熟なゴマ種子を回収し、凍結乾燥した後、アセトンを用いてリグナン成分を抽出した。アセトン抽出液の調製方法については以下の通りである。
栽培されているゴマの鞘から未熟なゴマ種子を回収し、凍結乾燥した後、アセトンを用いてリグナン成分を抽出した。アセトン抽出液の調製方法については以下の通りである。
粉砕したゴマ種子の凍結乾燥物（約１００ｍｇ）を１ｍｌのアセトンに溶解し、アセトン抽出液を得た。このアセトン抽出液１００μｌを乾燥させた後、２０μｌ ＤＭＳＯに再度溶解し、８０μｌの０．１％ＴＦＡを含む５０％アセトニトリルを加えた。次に、この溶液をMillex-LHフィルター(ミリポア社、０．４５μｍ／４ｍｍ)を用いて濾過し、ＨＰＬＣ分析用のサンプルとした。このサンプルについてＨＰＬＣ分析を行った結果、標品(control)のゴマリグナンであるピペリトール(保持時間約１２分)、セサミン（保持時間約１６分）およびセサモリン（保持時間約１８分）と保持時間が一致するリグナンの存在を確認した。
さらにゴマ種子を若い順に成長段階に沿って４ステージに分けた。
ステージ１：種子鞘が１．５ｃｍ以下
ステージ２：種子鞘が１．５〜２ｃｍ、
ステージ３：種子鞘が２ｃｍ以上で鞘色が黄緑色
ステージ４：種子鞘が２ｃｍ以上で鞘色が濃緑色。
ステージ２：種子鞘が１．５〜２ｃｍ、
ステージ３：種子鞘が２ｃｍ以上で鞘色が黄緑色
ステージ４：種子鞘が２ｃｍ以上で鞘色が濃緑色。
これらを上記の条件を用いて同様にＨＰＬＣ分析した結果、ピペリトール、セサミンおよびセサモリンの蓄積を、ステージ３およびステージ４で確認した。
以上の結果は、本実施例で用いたゴマ品種においてピペリトールおよびセサミンを生成する酵素、および当該酵素をコードする遺伝子が存在することを示した。
〔実施例３：ゴマｃＤＮＡライブラリーの作製〕
実施例２で用いたゴマの種子から製造業者が推奨する方法に従ってRNeasy Plant Mini Kit（キアゲン社）を用いてトータルＲＮＡを抽出し、引き続いてオリゴテックス−ＭＡＧ ｍＲＮＡ精製キット(TaKaRa)を用いてポリＡ(＋)ＲＮＡ５μｇを得た。このポリＡ(＋)ＲＮＡを鋳型として、製造業者が推奨する方法に従ってZAP Express cDNA Synthesis Kit and ZAP Express cDNA Gigapack3 Gold Cloning Kit（ストラタジーン社）を用いて、ｃＤＮＡライブラリーを作製した。作製したライブラリーは１×１０7ｐｆｕ／ｍｌであった。
実施例２で用いたゴマの種子から製造業者が推奨する方法に従ってRNeasy Plant Mini Kit（キアゲン社）を用いてトータルＲＮＡを抽出し、引き続いてオリゴテックス−ＭＡＧ ｍＲＮＡ精製キット(TaKaRa)を用いてポリＡ(＋)ＲＮＡ５μｇを得た。このポリＡ(＋)ＲＮＡを鋳型として、製造業者が推奨する方法に従ってZAP Express cDNA Synthesis Kit and ZAP Express cDNA Gigapack3 Gold Cloning Kit（ストラタジーン社）を用いて、ｃＤＮＡライブラリーを作製した。作製したライブラリーは１×１０7ｐｆｕ／ｍｌであった。
〔実施例４：ゴマ由来リグナン生合成酵素遺伝子のクローニング〕
ゲノム配列が明らかとなっているシロイヌナズナのチトクロームＰ４５０遺伝子の配列をプローブとして用いて、上記ｃＤＮＡライブラリー約３０万ｐｆｕをスクリーニングした。
ゲノム配列が明らかとなっているシロイヌナズナのチトクロームＰ４５０遺伝子の配列をプローブとして用いて、上記ｃＤＮＡライブラリー約３０万ｐｆｕをスクリーニングした。
具体的には、シロイヌナズナチトクロームＰ４５０遺伝子群を一次配列に基づいて系統分類し（図３を参照）、CYP90A、CYP72B、CYP71B、CYP84A、CYP96A、CYP710A、CYP86A、CYP74、CYP75B、CYP79F、CYP81D、CYP705A、およびCYP83Aからなる１３種のシロイヌナズナチトクロームＰ４５０遺伝子をゴマ種子ライブラリーをスクリーニングするためのプローブとして用いた。配列番号５〜３０のプライマーを用いて増幅することによって、プローブにＤＩＧ標識を導入した。ＰＣＲ条件は以下のとおりである。RNeasy Plant Mini Kit（キアゲン社）を用いてシロイヌナズナからｔｏｔａｌＲＮＡを抽出した後、ｔｏｔａｌＲＮＡ１μgを鋳型として逆転写反応を行い、ｃＤＮＡを得た。ｃＤＮＡ合成を、製造業者が推奨する条件に従って、SuperScriptTMFirst-Strand Synthesis System for RT-PCR（インヴィトロジェン社）を利用して行なった。ＰＣＲ反応液（５０μｌ）は、シロイヌナズナのゲノムＤＮＡ１μl、１×Taq buffer（ＴａＫａＲａ）、０．２ｍＭ dNTPs、プライマー（配列番号５〜３０を各々０．４ｐｍｏｌ／μｌ）、およびrTaq polymerase ２．５Ｕからなる。９４℃で５分間反応させた後、９４℃で１分間、５３℃で１分間、７２℃で２分間の反応を２８サイクル行った。プローブにＤＩＧ標識を導入する際にも同ＰＣＲ条件で行った。スクリーニングおよび陽性クローンの検出を、ＤＩＧ−ＤＮＡラベリング＆デテクションキット（ロシュ社）を用いて行なった。
陽性クローンの検出を、製造業者が推奨する方法を基本として、下記のような低ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で行った。すなわち、ハイブリダイゼーションバッファー（５×ＳＳＣ、３０％ホルムアミド、５０ｍＭリン酸ナトリウムバッファー（ｐＨ７．０）、１％ＳＤＳ、２％ブロッキング試薬（ロシュ社）、０．１％ラウロイルサルコシン、８０μｇ／ｍｌサケ精子ＤＮＡを含む）を用いて、３７℃で２時間プレハイブリダイゼーションを行った後、ＤＩＧ標識した混合プローブを加え、さらに一晩保持した。メンブレンを、１％ＳＤＳを含む５×ＳＳＣ洗浄液中にて、５８℃で１時間洗浄した。
二次スクリーニングの後、独立した９６個の陽性クローンが得られた。引き続いてｃＤＮＡライブラリー合成キット製造業者が推奨する方法を用いてこれらの９６個のクローンをｐＢＫ−ＣＭＶプラスミド（ストラタジーン社）に挿入し、インサート領域の５’末端および３’末端のヌクレオチド配列を、それぞれＭ１３ＲＶプライマーおよびＭ１３Ｍ４（‐２０）プライマーを用いて決定した。その結果、４６クローンがチトクロームＰ４５０様の配列を有していた。インサート領域の全ヌクレオチド配列を決定した。その結果、得られたクローンを、ＳｉＰ１６８、ＳｉＰ１８９、ＳｉＰ２３６、ＳｉＰ２４９、およびＳｉＰ２８８の独立した５種類のＰ４５０ホモログ（Ｓｅｓａｍｕｍ ｉｎｄｉｃｕｍ Ｐ４５０；ＳｉＰ）に分類した。次に、ゴマの葉および種子から調製したＲＮＡを逆転写して得たｃＤＮＡを鋳型に用いて、これら５種のＳｉＰ遺伝子に特異的なプライマー（配列番号３１〜４０）に用いるＲＴ−ＰＣＲを行った。その結果、これら５種のＳｉＰ遺伝子は、種子において発現することがわかった。なお上記のＲＴ−ＰＣＲにおいて用いたＰＣＲ反応液（２５μｌ）は、各ｃＤＮＡ １μl、１×Ex-Taq buffer（ＴａＫａＲａ）、０．２ｍＭ dNTPs、プライマー各０．２ｐｍｏｌ／μｌ、およびEx-Taq polymerase １．２５Ｕからなる 。９４℃で３分間反応させた後、９４℃で１分間、５３℃で１分間、７２℃で２分間の反応を２６サイクル行った。発現量を比較するためのゴマ内部標準遺伝子として、Ｒｉｂｏｓｏｍａｌ １８ＳＲＮＡ（ＡＪ２３６０４１）を採用した。増幅プライマーとして、配列番号３および４からなるプライマーを用いた。
〔実施例５：ＳｉＰ遺伝子発現ベクターを含む形質転換体の作製〕
上記５種のＳｉｐ遺伝子のうち、ＳｉＰ249（ｐＳＰＢ2031）およびＳｉＰ288（ｐＳＰＢ2034）は全てのオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）をコードすると考えられた（配列番号５３〜５６）。ｐＳＰＢ2031をＢａｍＨＩおよびＸｈｏＩによって消化して得たｃＤＮＡを含む約１．８ｋｂのＤＮＡ断片を、酵母発現ベクターｐＹＥ２２ｍ（Holton, T. A et al., Nature 366, 276-279. 1993）のＢａｍＨＩ部位およびＳａｌＩ部位に挿入して、ｐＳＰＢ2046を得た。酵母発現ベクターｐＹＥ２２ｍのマルチクローニングサイトはglyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase遺伝子（ＧＡＰＤＨ）プロモーターとＧＡＰＤＨターミネーターとの間に挟まれており、このマルチクローニングサイトに挿入されたインサートは、酵母内においてＧＡＰＤＨプロモーターの制御下で構成的に発現される。なお、このベクターに関する選択マーカーはトリプトファンである。一方、ｐＳＰＢ2034をＢａｍＨＩおよびＸｈｏＩによって消化して得たｃＤＮＡを含む約１．８ｋｂＤＮＡ断片を、酵母発現ベクターｐＹＥ２２ｍのＢａｍＨＩ部位およびＳａｌＩ部位に挿入して、ｐＳＰＢ2047を得た。引き続き、２種の酵母発現ベクターを用いて常法に従って酵母ＩＮＶｓｃ株（インヴィトロジェン社）を形質転換して、それぞれＩＮＶｓｃ／ｐＹＥ２２ｍ／ＳｉＰ２４９およびＩＮＶｓｃ／ｐＹＥ２２ｍ／ＳｉＰ２８８を得た。
上記５種のＳｉｐ遺伝子のうち、ＳｉＰ249（ｐＳＰＢ2031）およびＳｉＰ288（ｐＳＰＢ2034）は全てのオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）をコードすると考えられた（配列番号５３〜５６）。ｐＳＰＢ2031をＢａｍＨＩおよびＸｈｏＩによって消化して得たｃＤＮＡを含む約１．８ｋｂのＤＮＡ断片を、酵母発現ベクターｐＹＥ２２ｍ（Holton, T. A et al., Nature 366, 276-279. 1993）のＢａｍＨＩ部位およびＳａｌＩ部位に挿入して、ｐＳＰＢ2046を得た。酵母発現ベクターｐＹＥ２２ｍのマルチクローニングサイトはglyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase遺伝子（ＧＡＰＤＨ）プロモーターとＧＡＰＤＨターミネーターとの間に挟まれており、このマルチクローニングサイトに挿入されたインサートは、酵母内においてＧＡＰＤＨプロモーターの制御下で構成的に発現される。なお、このベクターに関する選択マーカーはトリプトファンである。一方、ｐＳＰＢ2034をＢａｍＨＩおよびＸｈｏＩによって消化して得たｃＤＮＡを含む約１．８ｋｂＤＮＡ断片を、酵母発現ベクターｐＹＥ２２ｍのＢａｍＨＩ部位およびＳａｌＩ部位に挿入して、ｐＳＰＢ2047を得た。引き続き、２種の酵母発現ベクターを用いて常法に従って酵母ＩＮＶｓｃ株（インヴィトロジェン社）を形質転換して、それぞれＩＮＶｓｃ／ｐＹＥ２２ｍ／ＳｉＰ２４９およびＩＮＶｓｃ／ｐＹＥ２２ｍ／ＳｉＰ２８８を得た。
一方、ＳｉＰ１６８、ＳｉＰ１８９、ＳｉＰ２３６についてはオープンリーディングフレームが不完全であったので、製造業者の推奨する方法に従ってＧｅｎｅＲａｃｅｒキット（インヴィトロジェン社）を用いて５’領域を増幅し、完全なオープンリーディングフレームを含む配列を得た（配列番号１〜２、５７〜６０）。増幅用プライマーとして、配列番号４１〜４６からなるプライマーを用いた。
次に、３種のＳｉＰ遺伝子の完全長オープンリーディングフレームをクローン化するために、以下の制限酵素サイトを付加したプライマーとして、ゴマ種子由来ｃＤＮＡを鋳型として用いてＰＣＲ増幅した。なお、ＰＣＲ条件は次のとおりである。ＰＣＲ反応液（５０μｌ）は、鋳型ゴマ種子由来ｃＤＮＡ １μｌ、１×KOD plus buffer（ＴＯＹＯＢＯ）、０．２ｍＭ dNTPs、プライマー（配列番号４７〜５２）各０．４ｐｍｏｌ／μｌ、１ｍＭ ＭｇＳＯ4、KOD plus DNA polymerase １Ｕからなる 。９４℃で５分間反応させた後、９４℃で１分間、５５℃で１分間、７２℃で２分間の反応を３０サイクル行った。完全長ＳｉＰを含むこの増幅断片を、ｐＣＲ-blunt II TOPOベクター（インヴィトロジェン社）のマルチクローニングサイトに挿入して、TOPO-SiP168(pSPB2064)、TOPO-SiP189(pSPB2055)、およびTOPO-SiP236(pSPB2048)を得た。
pSPB2064、pSPB2055、およびpSPB2048を増幅した際に用いたプライマーに付加した制限酵素サイトを消化して得た約１．５ｋｂのｃＤＮＡを含むＤＮＡ断片と、ｐＹＥ２２ｍベクターをＢａｍＨＩおよびＳａｌＩを用いて消化して得たＤＮＡ断片約８．３ｋｂとを連結することによって、ｐＹＥ２２ｍ／ＳｉＰ１６８(pSPB2052)、ｐＹＥ２２ｍ／ＳｉＰ１８９(pSPB2053)、およびｐＹＥ２２ｍ／ＳｉＰ２３６(pSPB2049)を得た。
引き続いて、これら３種の酵母発現ベクターを用いて酵母ＩＮＶｓｃ株（インヴィトロジェン社）を形質転換し、ＩＮＶｓｃ／ｐＹＥ２２ｍ／ＳｉＰ１６８、ＩＮＶｓｃ／ｐＹＥ２２ｍ／ＳｉＰ１８９、およびＩＮＶｓｃ／ｐＹＥ２２ｍ／ＳｉＰ２３６を得た。
〔実施例６：形質転換体におけるゴマリグナンの生合成〕
前述のＩＮＶｓｃ／ｐＹＥ２２ｍ／ＳｉＰ２４９、ＩＮＶｓｃ／ｐＹＥ２２ｍ／ＳｉＰ２８８に加え、ＩＮＶｓｃ／ｐＹＥ２２ｍ／ＳｉＰ１６８、ＩＮＶｓｃ／ｐＹＥ２２ｍ／ＳｉＰ１８９、およびＩＮＶｓｃ／ｐＹＥ２２ｍ／ＳｉＰ２３６を、以下に組成を有するＹＮＢＤｇｌｃ培地４００ｍＬ（0.67 ％ Yeast Nitrogen Base、2 ％Glucose、20 mg/Lのトリプトファンを除く各種アミノ酸）中にて３０℃で、３６時間培養した。公知の超遠心分離法（Holton, T. A et al., Nature 366, 276-279. 1993）に従って、これらの形質転換酵母培養液からミクロソーム画分を回収した。
前述のＩＮＶｓｃ／ｐＹＥ２２ｍ／ＳｉＰ２４９、ＩＮＶｓｃ／ｐＹＥ２２ｍ／ＳｉＰ２８８に加え、ＩＮＶｓｃ／ｐＹＥ２２ｍ／ＳｉＰ１６８、ＩＮＶｓｃ／ｐＹＥ２２ｍ／ＳｉＰ１８９、およびＩＮＶｓｃ／ｐＹＥ２２ｍ／ＳｉＰ２３６を、以下に組成を有するＹＮＢＤｇｌｃ培地４００ｍＬ（0.67 ％ Yeast Nitrogen Base、2 ％Glucose、20 mg/Lのトリプトファンを除く各種アミノ酸）中にて３０℃で、３６時間培養した。公知の超遠心分離法（Holton, T. A et al., Nature 366, 276-279. 1993）に従って、これらの形質転換酵母培養液からミクロソーム画分を回収した。
ミクロソーム沈殿を、サスペンジョン緩衝液（０．１Ｍリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．４）、２０％グリセロール、０．３μｌ／ｍｌメルカプトエタノール）１ｍｌに縣濁して、ミクロソーム溶液を得た。このミクロソーム溶液２４０μｌに、１Ｍリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．４）を３０μｌ、５０ｍＭ ＮＡＤＰＨを６μｌ、２６７μＭピノレジノールまたはピペリトールを２４μl加えて、３０℃で１時間反応させた。この酵素反応液に０．１％ ＴＦＡを含む１００％アセトニトリルを等量加えた（最終濃度５０％アセトニトリル溶液）。次に、この溶液を遠心分離（１５０００ｒｐｍ、３分、４℃）し、その上清１５０μｌをMillex-LHフィルター(ミリポア社、０．４５μｍ／４ｍｍ)を用いて精製し、実施例１の粗分画分析と同様の条件でＨＰＬＣ分析を行った。
ＩＮＶｓｃ／ｐＹＥ２２ｍ／ＳｉＰ１８９について行ったＨＰＬＣ分析の結果を、以下に示す。ピノレジノール（図２（ａ）：保持時間約８分）が、ＩＮＶｓｃ／ｐＹＥ２２ｍ／ＳｉＰ１８９において、それぞれ保持時間約１２分と約１６分の新たなリグナン様の吸収スペクトルを有する２つの生成物に変化した（図２（ｂ））。さらに、ピペリトール（図２（ｄ）：保持時間約１２分）が、ＩＮＶｓｃ／ｐＹＥ２２ｍ／ＳｉＰ１８９によって保持時間約１６分の新たなリグナン様の吸収スペクトルを有する生成物に変化した（図２（ｅ））。これらは、保持時間からそれぞれピペリトール（保持時間約１２分）とセサミン（保持時間約１６分）であると考えられた。
引き続いて、これら２つのピーク（保持時間約１２分と約１６分）について、ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ分析（ＬＣはWaters 2790，ウォーターズ社、ＭＳはQUATRO micro, マイクロマス社）によって分子量およびフラグメントパターンを比較したところ、分子量標準品と一致した。従って、ＳｉＰ１８９による２つの生成物は、ピペリトールおよびセサミンであることがわかった。ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ解析の条件は次の通りである。ＬＣには、Develosil C30-UG-5（野村化学、２．０×５０ｍｍ）を用い、移動相には、Ａ液をＨ２Ｏ、Ｂ液をメタノール、Ｃ液を１０ｍＭ ＣＨ３ＣＯＯＮＨ４として用い、溶出を、１０％Ｃ液を用いて流速０．２５ｍｌ／ｍｉｎ．にて行った。この条件下で、ピペリトールは８．４分、セサミンは１０．１分の時点で検出される。ＭＳは、測定モードＰＯＳＩＴＩＶＥで行った。これにより、ＳｉＰ１８９はピノレジノールからピペリトールを経てセサミンを合成する酵素をコードすることが明らかになった。また、ピノレジノールからピペリトール、ピペリトールからセサミンを合成する反応は別の酵素が触媒すると考えられていたが、本発明で得た遺伝子がコードする単一の酵素が両方の反応を触媒することがわかった。
また、上記酵素反応液にＮＡＤＰＨを加えない反応系を用いた解析の結果から、ＩＮＶｓｃ／ｐＹＥ２２ｍ／ＳｉＰ１８９のピペリトール生成活性はＮＡＤＰＨ依存的であることがわかった（図２（ｂ）・（ｃ））。このことは、セサミン生成活性についても同様であった（図２（ｅ）・（ｆ））。また、ＮＡＤＰＨが存在する場合と比べて、ＮＡＤＰＨが存在しない場合では、ピペリトール生成活性およびセサミン生成活性はそれぞれ約１４％と約１８％に減少した。
次に、ＩＮＶｓｃ／ｐＹＥ２２ｍ／ＳｉＰ１８９のミクロソーム画分を一酸化炭素によって還元した後、吸収スペクトルを分光光度計（日立U-3000P Spectrophotometer）を用いて測定した。その結果、このミクロソーム画分は、コントロール形質転換酵母であるＩＮＶｓｃ／ｐＹＥ２２ｍと比較して、４５０ｎｍにおける吸収を示した。このことから、ＩＮＶｓｃ／ｐＹＥ２２ｍ／ＳｉＰ１８９のミクロソーム画分内においてチトクロームＰ４５０タンパク質が生成されていることがわかった。
実施例２において示したように生長段階別に４ステージに分離したゴマ種子から、実施例２と同様の方法でＲＮＡを抽出し、ＳｉＰ１８９を増幅する配列番号４９と５０のプライマーセットおよびＳｉ１８ＳｒＲＮＡを増幅する配列番号３および４のプライマーセットを用いてＲＴ−ＰＣＲを行った。ＰＣＲ反応液（２５μｌ）は、各ｃＤＮＡ １μl、１×Ex-Taq buffer（ＴａＫａＲａ）、０．２ｍＭ dNTPs、プライマー各０．２ｐｍｏｌ／μｌ、Ex-Taq polymerase １．２５Ｕからなる 。９４℃で３分反応させた後、９４℃で１分、５３℃で１分、７２℃で２分の反応を２６サイクル行った。その結果、種子におけるセサミンの蓄積が顕著化してくる種子ステージ４においてＳｉＰ１８９が強く発現することを確認した。生長段階に依存したリグナン蓄積と、生成活性を有するＳｉＰ１８９の遺伝子発現の時期とが一致することから、ゴマ種子内でピペリトールおよびセサミンを生成する酵素遺伝子がＳｉＰ１８９であることが示された。
以上の結果から、ＳｉＰ１８９遺伝子はピノレジノールからピペリトールおよびピペリトールからセサミンを生成する反応を触媒するチトクロームＰ４５０をコードすることが明らかとなった。図３中、ＳｉＰ１８９を矢印で示す。図３より、ＳｉＰ１８９はチトクロームＰ４５０スーパーファミリーのCYP81ファミリーに属していることがわかる。
本遺伝子を利用することによって、ゴマまたは他の植物もしくは生物を用いて、あるいはバイオリアクターなどの系を用いて、セサミンおよびピペリトールを合成することが可能になった。
〔実施例７：栽培種ゴマSesamum indicumにおけるＳｉＰ１８９遺伝子のゲノミック解析〕
S. indicumゲノム内でのＳｉＰ１８９遺伝子のコピー数を明らかにするために、ゲノミックサザン解析を行った。
S. indicumゲノム内でのＳｉＰ１８９遺伝子のコピー数を明らかにするために、ゲノミックサザン解析を行った。
製造業者が推奨する方法に従って、Nucleon Phytopure for Plant Extraction Kit（アマシャム社）を用いてS. indicumの葉（真瀬金品種）からゲノミックＤＮＡを抽出した。抽出したゲノミックＤＮＡ１０μｇを、それぞれＥｃｏＲＩ、ＮｃｏＩ、およびＸｂａＩの３種の制限酵素で完全に消化し、アガロースゲル電気泳動によってゲノミックＤＮＡを分離した。０．２５Ｍ ＨＣｌを用いてアガロースゲルを１５分間加水分解し、その後１．５Ｍ ＮａＣｌと０．５Ｍ ＮａＯＨとを含む液を用いて３０分間変性させ、１．５Ｍ ＮａＣｌとＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）とを含む溶液を用いて中和した。その後、２０×ＳＳＣ中にて、ゲノミックＤＮＡをメンブレン（Hybribond-N、アマシャム社）に転写した。メンブレンに転写したゲノミックＤＮＡを、ＵＶ照射によってメンブレンに結合させた。このメンブレンを、７％ＳＤＳ、５０％ホルムアミド、５×ＳＳＣ、２％ブロッキングリージェント、０．１％ラウロイルサルコシン、および５０ｍＭリン酸ナトリウムバッファー（ｐＨ７．０）を含むハイブリダイゼーションバッファー（高ＳＤＳバッファー、ロシュ社）中にて、４２℃で１時間プレハイブリダイゼーションした。
ハイブリダイゼーションプローブには、ＳｉＰ１８９のｃＤＮＡの開始メチオニン部位から約９００ｂｐのＯＲＦ領域を用いた。この領域を、配列番号６１（Bam-SST-FW2）のプライマーおよび配列番号６２（SiP189-Nco-RV）のプライマーを用いるＰＣＲによってＤＩＧ標識を導入した。ＰＣＲ反応液は、ＳｉＰ１８９のｃＤＮＡを含むプラスミド（pSPB2055）を１ｎｇ、１×ＰＣＲバッファー、１×ＤＩＧ−ｄＮＴＰ ｍｉｘｔｕｒｅ（PCR DIG Labeling Mix、ロシュ社）、０．２ｐｍｏｌ／μｌ各プライマー、およびrTaq polymerase １Ｕ(タカラバイオ社)からなる。ＰＣＲ反応を、９５℃で３０秒、５３℃で３０秒、７２℃で１分の反応を３０サイクルの条件にて行った。
セファデックスＧ−５０クイックスピンカラム（ベーリンガー社）を用いて精製したＰＣＲ産物を熱変成した後直ちに氷上に置き、これをハイブリダイゼーションプローブとして、プレハイブリダイゼーション液に１０μｌ加え、４２℃で一晩インキュベートした。
メンブレンの洗浄を、０．１％ＳＤＳを含む０．２×ＳＳＣ溶液中にて、６５℃で３０分間、２回行った（高ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件）。ハイブリダイゼーションシグナルを、ＤＩＧアプリケーションマニュアル（ロシュ社）に従って、ＤＩＧ−ラベリング＆デテクションキット（ロシュ社）を用いて得た。
図５に検出結果を示す。図５に示すように、上記３種の制限酵素処理において、ＳｉＰ１８９遺伝子がすべて単一のバンドとして検出された。この結果から、S. indicumゲノム内にＳｉＰ１８９は単一の遺伝子として存在し、ＳｉＰ１８９と相同性の高い遺伝子が存在しないことが示された。すなわち、ゴマ植物内においてピペリトールおよびセサミンを生成する活性はＳｉＰ１８９によるものであると考えられる。
〔実施例８：アフリカゴマSesamum radiatumからのＳｉＰ１８９様遺伝子の単離〕
アフリカゴマSesamum radiatumはアフリカに現存するゴマ植物であり、細胞遺伝学解析によれば染色体数は２ｎ＝６４であり、S. indicum（２ｎ＝２６）とは細胞遺伝学的に異なる系統である（参考文献、並木満夫、小林貞作「ゴマの科学」朝倉書店）。しかし、S. radiatum種子においてもリグナン含量に関する解析が報告されており、セサミンが蓄積していることが明らかとなっている（参考文献、Bedigian, D., et al. Biochemical Systematics and Ecology 13, 133-139. 1985）。したがって、S. radiatumのゲノム中に、S. indicumのＳｉＰ１８９に対応する酵素をコードする遺伝子(ＳｒＳｉＰ１８９)が存在すると考えられる。さらに、このS. radiatumの有する遺伝子（ＳｒＳｉＰ１８９）は、ＳｉＰ１８９と配列相同性の高い遺伝子であることが期待される。
アフリカゴマSesamum radiatumはアフリカに現存するゴマ植物であり、細胞遺伝学解析によれば染色体数は２ｎ＝６４であり、S. indicum（２ｎ＝２６）とは細胞遺伝学的に異なる系統である（参考文献、並木満夫、小林貞作「ゴマの科学」朝倉書店）。しかし、S. radiatum種子においてもリグナン含量に関する解析が報告されており、セサミンが蓄積していることが明らかとなっている（参考文献、Bedigian, D., et al. Biochemical Systematics and Ecology 13, 133-139. 1985）。したがって、S. radiatumのゲノム中に、S. indicumのＳｉＰ１８９に対応する酵素をコードする遺伝子(ＳｒＳｉＰ１８９)が存在すると考えられる。さらに、このS. radiatumの有する遺伝子（ＳｒＳｉＰ１８９）は、ＳｉＰ１８９と配列相同性の高い遺伝子であることが期待される。
S. radiatumの種子から実施例４と同様にｃＤＮＡを調製した。このｃＤＮＡ１μｌを鋳型として、（配列番号６１（Bam-SST-FW2）および配列番号６３（GR-SST-RV1））をプライマーとして用いて、実施例４と同様の方法でＲＴ−ＰＣＲ反応を行った。これらのプライマーを、ＳｉＰ１８９の配列に基づいて完全長ＯＲＦを含む可能性のある断片を増幅するように設計した。ＲＴ−ＰＣＲの結果、ＳｒＳｉＰ１８９を含むと思われる約１．５ｋｂの増幅断片を得た。この断片をｐＣＲ-blunt II TOPOベクター（インヴィトロジェン社）に挿入して、pSPB2068を得た。挿入した断片のヌクレオチド配列を決定した。その結果、S. indicum由来のＳｉＰ１８９と比較して、ＤＮＡレベルで９６％の配列同一性、アミノ酸レベルで９５％の配列同一性を示した（配列番号６４にＳｒＳｉＰ１８９のアミノ酸配列を示し、配列番号６５にＳｒＳｉＰ１８９のヌクレオチド配列を示す）。実施例４に従って、前述のプライマー（配列番号６１および配列番号６３）を用い、S. radiatumの種子および葉から調製したｃＤＮＡを鋳型としてＲＴ−ＰＣＲを実施した。その結果、ＳｒＳｉＰ１８９の発現は種子で強く発現し、葉においてはほとんど発現していないことが分かった。このＲＴ−ＰＣＲによる発現解析からＳｒＳｉＰ１８９は種子において機能することが示された。
〔実施例９：アフリカゴマSesamum radiatumにおけるＳｒＳｉＰ１８９遺伝子の機能解析〕
ＳｒＳｉＰ１８９の有する生化学的機能を明らかにするために、酵母にて組換えＳｒＳｉＰ１８９タンパク質を発現させて、この組換えＳｒＳｉＰ１８９タンパク質の有するリグナン生合成活性を調べた。まず、pSPB2068を制限酵素ＢａｍＨＩおよびＸｈｏＩを用いて消化し、得られた約１．５ｋｂの完全長ＳｒＳｉＰ１８９のｃＤＮＡを含む断片を、酵母発現ベクターpYE22mのＢａｍＨＩ部位およびＳａｌＩ部位に挿入して、pSPB2069を得た。形質転換酵母からのミクロソームの調製およびリグナン生合成活性の測定を、実施例６と同様に実施した。図６はＨＰＬＣ分析による測定結果を示したものである。図６に示すように、組換えＳｒＳｉＰ１８９タンパク質は、S. indicum由来のＳｉＰ１８９と同様にＮＡＤＰＨ依存的にピノレジノールをピペリトールへ変換する活性およびピペリトールをセサミンへ変換する活性を有していた（図６（ａ）および図６（ｂ））。ＮＡＤＰＨを含まない酵素反応液中においては、ピペリトール生成活性が１６．９％、セサミン生成活性が８．４％にそれぞれ低下した（図６（ｃ）および図６（ｄ））。これらのことから、ＳｒＳｉＰ１８９はS. radiatumにおけるＳｉＰ１８９のカウンターパート遺伝子であることが明らかとなった。
ＳｒＳｉＰ１８９の有する生化学的機能を明らかにするために、酵母にて組換えＳｒＳｉＰ１８９タンパク質を発現させて、この組換えＳｒＳｉＰ１８９タンパク質の有するリグナン生合成活性を調べた。まず、pSPB2068を制限酵素ＢａｍＨＩおよびＸｈｏＩを用いて消化し、得られた約１．５ｋｂの完全長ＳｒＳｉＰ１８９のｃＤＮＡを含む断片を、酵母発現ベクターpYE22mのＢａｍＨＩ部位およびＳａｌＩ部位に挿入して、pSPB2069を得た。形質転換酵母からのミクロソームの調製およびリグナン生合成活性の測定を、実施例６と同様に実施した。図６はＨＰＬＣ分析による測定結果を示したものである。図６に示すように、組換えＳｒＳｉＰ１８９タンパク質は、S. indicum由来のＳｉＰ１８９と同様にＮＡＤＰＨ依存的にピノレジノールをピペリトールへ変換する活性およびピペリトールをセサミンへ変換する活性を有していた（図６（ａ）および図６（ｂ））。ＮＡＤＰＨを含まない酵素反応液中においては、ピペリトール生成活性が１６．９％、セサミン生成活性が８．４％にそれぞれ低下した（図６（ｃ）および図６（ｄ））。これらのことから、ＳｒＳｉＰ１８９はS. radiatumにおけるＳｉＰ１８９のカウンターパート遺伝子であることが明らかとなった。
以上の結果から、ＳｉＰ１８９様配列を保有する遺伝子が種を超えて存在し、この遺伝子がピノレジノールからピペリトールへ変換する活性およびピペリトールからセサミンへ変換する活性を有する酵素をコードすることが明らかとなった。
本発明について、多くの方法において同様に改変され得ることは明らかである。このような改変は、本発明の精神および範囲を逸脱するものとしてみなされるべきではなく、当業者にとって明らかであるこのような改変の全ては、以下の特許請求の範囲の範囲内に含まれることが意図される。
〔実施例１０：植物細胞内におけるＳｉＰ１８９タンパク質の機能解析〕
植物細胞内におけるＳｉＰ１８９タンパク質の生化学的な機能を明らかにするために、ＳｉＰ１８９遺伝子を用いてタバコ（Ｎ．ｔａｂａｃｃｕｍ）を形質転換した。
植物細胞内におけるＳｉＰ１８９タンパク質の生化学的な機能を明らかにするために、ＳｉＰ１８９遺伝子を用いてタバコ（Ｎ．ｔａｂａｃｃｕｍ）を形質転換した。
ＳｉＰ１８９を含むｐＳＰＢ２０５５をＢａｍＨＩおよびＸｈｏＩによって消化して、ＳｉＰ１８９のＯＲＦを含む約１．５ｋｂのＤＮＡ断片を得た。この断片を植物形質転換用バイナリーベクターであるｐＳＰＢ１７６のＢａｍＨＩ部位およびＳａｌＩ部位に連結して、バイナリーベクターｐＳＰＢ２０５７を得た。ｐＳＰＢ１７６のマルチクローニングサイトは、ＣａＭＶ３５ＳプロモーターとＮＯＳターミネーターとの間にあり、この部位に挿入されたインサートは、植物細胞内においてＣａＭＶ３５Ｓプロモーターの制御下で構成的に過剰発現する。
引き続いて、公知の方法（下西ら、新・生物化学実験のてびき３．化学同人（１２２〜１２４頁））に従って、ｐＳＰＢ２０５７を用いてアグロバクテリウム（菌株：Ａｇｌｏ）を形質転換し、このｐＳＰＢ２０５７を有する形質転換体アグロバクテリウムをタバコリーフディスクに感染させた。
得られた形質転換体１３系統の葉から実施例２と同様の方法を用いてｃＤＮＡを調整し、配列番号４９および配列番号５０に示される塩基配列からなるプライマーを用いて実施例４と同様の方法に従ってＲＴ−ＰＣＲを行なった。内部標準遺伝子としてのタバコのユビキチン遺伝子（ＮｔＵＢＱアクセッション番号：Ｕ６６２６４）を、配列番号６６および配列番号６７に示されるヌクレオチド配列からなるプライマー（それぞれＮｔＵＢＱ−ＦＷおよびＮｔＵＢＱ−ＲＷ）を用いて増幅した。その結果、系統６、系統７および系統１２において、高発現のＳｉＰ１８９遺伝子を確認した（図７）。
以下の操作を、氷上または４℃で操作を行った。形質転換体（系統６、系統７および系統１２）、ならびに非形質転換体の葉約１５ｇを液体窒素中にて乳鉢を用いて粉砕し、３０ｍｌのホモジナイズバッファー（０．１Ｍ リン酸カリウムバッファー，ｐＨ７．０、０．５Ｍマンニトール、５ｍＭ ＥＤＴＡ、４２ｍＭ メルカプトエタノール、５０ｍＭ アスコルビン酸ナトリウム、０．１％ ＢＳＡ、１ｍＭ ＰＭＳＦ、１％ＰＶＰＰ）に溶解させた。
粉砕溶液を１０，０００×ｇで２０分間遠心分離して得た上清を、ミラクロースでろ過した。このろ液を１００，０００×ｇで９０分間超遠心分離して、粗抽出ミクロソーム画分を得た。このミクロソーム画分（２４０μｌ）を用いて、実施例４と同様の方法に従ってピペリトールと酵素反応を行い、生成物をＨＰＬＣ分析した。
ＨＰＬＣ分析の結果、ＳｉＰ１８９を過剰発現しているタバコ由来のミクロソームにおいて、２８０ｎｍの吸収を有する保持時間約１７分のピークが観察された。このピークは非形質転換体においては観察されず、酵素反応液中のＮＡＤＰＨの存在に依存した。このピークはセサミン標品の保持時間と一致したので、ＳｉＰ１８９は植物細胞内でセサミン生合成活性を有するタンパク質として機能することが示された（図８）。
〔実施例１１：ＳｉＰ１８９遺伝子の発現調節領域の同定〕
ＳｉＰ１８９遺伝子の転写調節に関する知見を得るために、ＳｉＰ１８９遺伝子の５’−非コード領域を単離し、配列決定し、そして解析した。λＢｌｕｅＳＴＡＲＴＭ Ｖｅｃｔｏｒ ｓｙｓｔｅｍ（ＮＯＶＡＧＥＮ社）を用いて、ゴマ（Ｓ．ｉｎｄｉｃｕｍ）のゲノムＤＮＡからゲノムライブラリーを作製した。
ＳｉＰ１８９遺伝子の転写調節に関する知見を得るために、ＳｉＰ１８９遺伝子の５’−非コード領域を単離し、配列決定し、そして解析した。λＢｌｕｅＳＴＡＲＴＭ Ｖｅｃｔｏｒ ｓｙｓｔｅｍ（ＮＯＶＡＧＥＮ社）を用いて、ゴマ（Ｓ．ｉｎｄｉｃｕｍ）のゲノムＤＮＡからゲノムライブラリーを作製した。
ゴマゲノムＤＮＡ２００μｇを制限酵素Ｓａｕ３ＡＩを用いて断片サイズが約２０ｋｂになるように部分消化し、次いで、１０℃にてショ糖密度勾配遠心分離（１０％〜４０％）を２５０００ｒｐｍで２４時間行った（ＳＷ２８ローター、Ｂｅｃｋｍａｎ社）。遠心分離したサンプルをＡＵＴＯＭＡＴＩＣ ＬＩＱＵＩＤ ＣＨＡＲＧＥＲ（Ａｄｖａｎｔｅｃ社）およびＭｉｃｒｏ Ｔｕｂｅ Ｐｕｍｐ（ＥＹＥＬＡ社）を用いて１ｍｌずつ分画した。分画したサンプルについて、パルスフィールド電気泳動によって断片サイズを確認した。パルスフィールドゲル電気泳動は、１％Ａｇａｒｏｓｅ ＮＡ（Ａｍｅｒｓｈａｍ ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社）、０．５×ＴＢＥからなるゲルを用いて、０．５×ＴＢＥバッファー内にて、１２０°／１秒−１秒で６Ｖ／ｃｍの条件下で行なった（ＣＨＥＦ ＭＡＰＰＥＲ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）。この約２０ｋｂの平均断片サイズを有する断片を含む画分を用いて、製造業者の推奨する方法に従ってゲノムライブラリーを作製した。作製したライブラリーは、１．５×１０６ｐｆｕ／５００μｌの力価を有した。配列番号６８および配列番号６９に示される塩基配列からなるプライマー（それぞれ、ＳｉＰ１８９−ｂａｍ−ＦＷおよびＳｉＰ１８９−ｎｃｏ−ＲＶ）によって増幅したＳｉＰ１８９遺伝子のＯＲＦ領域約８５０ｂｐをプローブに用いて、このゲノムライブラリー（５００，０００クローン）をスクリーニングした。
ＡｌｋａＰｈｏｓ Ｄｉｒｅｃｔ Ｌａｂｅｌｉｎｇ ａｎｄ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｓｙｓｔｅｍ（Ａｍｅｒｓｈａｍ ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社）を製造業者が推奨する方法に従って用いて、プローブの標識および検出を行なった。ハイブリダイゼーションの条件は以下の通りである。
プローブ：５ｎｇ／ｍｌ ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ ｂｕｆｆｅｒ
プレハイブリダイゼーション：５５℃で１時間
ハイブリダイゼーション：５５℃で一晩
洗浄：５５℃で３０分を２回。
プローブ：５ｎｇ／ｍｌ ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ ｂｕｆｆｅｒ
プレハイブリダイゼーション：５５℃で１時間
ハイブリダイゼーション：５５℃で一晩
洗浄：５５℃で３０分を２回。
３次スクリーニング後、９種の陽性クローンを単離し、その中から挿入物サイズが約１２ｋｂのｇＳｉＰ１８９−＃６を得た。
次に、配列番号６８および配列番号６９に示されるヌクレオチド配列からなるプライマー、ファージアームプライマーであるＳＴＡＲ−ＬＦ１（配列番号７０）およびＳＴＡＲ−ＬＲ１（配列番号７１）を用いてＰＣＲを行い、ｇＳｉＰ１８９−＃６内のプローブの挿入方向および位置関係を決定した。
その結果、ＰＣＲ解析は、ｇＳｉＰ１８９−＃６が、５ｋｂ以上のＳｉＰ１８９ ５’非コード領域を含むことを示した。よって、このｇＳｉＰ１８９−＃６の全塩基について配列決定を行なった。
ｇＳｉＰ１８９−＃６をテンプレートとするＬＡ−ＰＣＲによって挿入断片を増幅した。ＬＡ−ＰＣＲの反応液は、陽性クローンＳＭバッファー懸濁液１μｌ、１×ＬＡバッファー（ＴａＫａＲａ）、各プライマー５０ｐｍｏｌ、０．４ｍＭ ｄＮＴＰ、２ｍＭ ＭｇＣｌ２、２．５ｕｎｉｔ ＬＡ−Ｔａｑ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅからなる。９６℃で５分間反応させた後、９８℃で１０秒間、５５℃で１０秒間、６８℃で１０分間の反応を３０サイクル行い、最後に７２℃で１５分間維持した。
得られた増幅断片を物理的に切断した後、約１〜２ｋｂの範囲の長さを有するＤＮＡ断片を分画し、これらの断片の末端を平滑化した。末端平滑化した断片をｐＵＣ１１８（ＴａＫａＲａ社）のＨｉｎｃＩＩ部位に挿入して、ショットガンライブラリーを作製した。このライブラリーは、２．８×１０６ｃｆｕ／μｌの力価を有した。
このｇＳｉＰ１８９−＃６由来のショットガンライブラリーを用いて、エレクトロポレーション法によって大腸菌ＤＨ１０Ｂ株（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ者）を形質転換し、１９２個のコロニーを無作為に拾い上げ、ＴｅｍｐｌｉＰｈｉ ＤＮＡ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ Ｔｅｍｐｌａｔｅ Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｋｉｔ（Ａｍｅｒｓｈａｍ ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社）を用いてＤＮＡを調製した。ＤＹＥｎａｍｉｃ ＥＴ ｄｙｅ ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ ｋｉｔ（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社）を用いて、調製したＤＮＡをＭ１３−４７（Ｆ）プライマー（配列番号７２）およびＲＶ−Ｍ（Ｒ）プライマー（配列番号７３）によって増幅した。
この増幅産物をＣｌｅａｎ ＳＥＱ（Ａｇｅｃｏｕｒｔ社）を用いて精製し、ＭｅｇａＢＡＳＥ４０００（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社）によって配列決定した。得られた配列データをＰＨＲＡＰ（ＣＡＰ４）によってアセンブリし、ＳｉＰ１８９遺伝子の開始メチオニン部位から上流約１３ｋｂの配列を含むコンティグ配列を得た。
このＳｉＰ１８９遺伝子５’領域の調節ｃｉｓ−エレメントを同定するために、ＳｉＰ１８９遺伝子の開始メチオニン部位から上流約３ｋｂの配列（配列番号７４）に対して、ＰＬＡＣＥ解析を行った（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｄｎａ．ａｆｆｒｃ．ｇｏ．ｊｐ／ＰＬＡＣＥ／）。ＰＬＡＣＥ解析の結果から、ＳｉＰ１８９遺伝子の開始メチオニン部位から上流約３ｋｂの範囲内に特定の転写因子ファミリーの結合部位および特定のシグナルに応答する調節ｃｉｓ−エレメントが多数同定され、これらがＳｉＰ１８９遺伝子の発現に影響を与えていることが示された（図９および１０）。
引き続き、ピペリトールおよびセサミンを合成するアフリカゴマ由来の酵素の遺伝子であるＳｒＳｉＰ１８９遺伝子の発現調節領域を単離した。アフリカゴマゲノムＤＮＡをテンプレートとして、配列番号７５および配列番号７６に示される塩基配列からなるプライマー（それぞれ、ｇＳＳＴ−ＦＷ１およびｇＳＳＴ−ＲＶ２）を用いてＰＣＲ増幅した。これらのプライマーを、配列番号７４に示されるＳｉＰ１８９のゲノム配列に従って設計した。
反応溶液は、ゲノムＤＮＡ １μｌ（５０ｎｇ）、１×Ｅｘ−Ｔａｑ ｂｕｆｆｅｒ（ＴａｋａＲａ）、０．２ｍＭ ｄＮＴＰｓ、プライマー各０．２ｐｍｏｌ／μｌ、Ｅｘ−Ｔａｑ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ １．２５Ｕからなる。９４℃で５分間反応させた後、９４℃で１分間、５５℃で１分間、７２℃で４分間の反応を３０サイクル行い、最後に７２℃で４分間維持した。得られた増幅断片を電気泳動して、約３ｋｂの断片を得た。得られた断片を、製造者が推奨する方法に従ってｐＣＲ−ＴＯＰＯ−ＸＬ ｖｅｃｔｏｒ（インヴィトロジェン社）のマルチクローニングサイトに挿入して、ｐＳＰＢ２６６４を得た。ｐＳＰＢ２６４４に挿入した断片の全ヌクレオチド配列をプライマーウォーキング法によって決定した。その結果、ＳｒＳｉＰ１８９遺伝子の調節ｃｉｓ−エレメントを含むと思われるゲノムＳｒＳｉＰ１８９遺伝子の５’側約２．８ｋｂの断片を取得した（配列番号７７）。ＳｉＰ１８９遺伝子と同様にＰＬＡＣＥ解析を行った結果、特定の転写因子ファミリーの結合部位および特異的シグナルに応答するエレメントを多数同定した（図１１）。
次いで、栽培ゴマ（Ｓ．ｉｎｄｉｃｕｍ）由来のＳｉＰ１８９遺伝子とアフリカゴマ（Ｓ．ｒａｄｉａｔｕｍ）由来のＳｒＳｉＰ１８９遺伝子の間で、ＤＮＡレベルの配列相一性をＣｌｕｓｔａｌ−Ｗ解析（ＭａｃＶｅｃｔｏｒ ｖｅｒ．７．２．２、Ｓｙｍａｎｔｅｃｈ社）を用いて求めた。その結果、両遺伝子は、５’−非コード領域約３ｋｂの領域において、７８％の配列同一性を示した。また、両遺伝子のＯＲＦ間における配列同一性は非常に高い（９６％）ことが分かった（図１２）。以上の結果は、ＳｉＰ１８９およびＳｒＳｉＰ１８９はタンパク質の機能は高く保存されているが、両遺伝子の発現パターンについては差異があるという知見を支持する。ＲＴ−ＰＣＲ解析に加えて、これらのｃｉｓ−エレメント解析は、２つのリグナン生合成遺伝子（S. indicum 由来のSiP189およびS. radiatum由来のSrSiP189）が同一の転写調節下ではないことを支持する。
〔実施例１２：アフリカゴマＳｅｓａｍｕｍ ａｌａｔｕｍにおけるＳｉＰ１８９様遺伝子の単離〕
Ｓ．ａｌａｔｕｍは，形態学的にも栽培種Ｓ．ｉｎｄｉｃｕｍとは大きく異なるアフリカゴマ野生種である（並木ら、ゴマの科学、朝倉書店）。染色体数はＳ．ｉｎｄｉｃｕｍと同じ２ｎ＝２６であるが、その地理的にはアフリカのナイジェリア、スーダンおよびモザンビークで確認されている。
Ｓ．ａｌａｔｕｍは，形態学的にも栽培種Ｓ．ｉｎｄｉｃｕｍとは大きく異なるアフリカゴマ野生種である（並木ら、ゴマの科学、朝倉書店）。染色体数はＳ．ｉｎｄｉｃｕｍと同じ２ｎ＝２６であるが、その地理的にはアフリカのナイジェリア、スーダンおよびモザンビークで確認されている。
実施例８においてアフリカゴマＳ．ｒａｄｉａｔｕｍからＳｒＳｉＰ１８９遺伝子を単離した方法と同様にＳ．ａｌａｔｕｍからのＳｉＰ１８９のカウンターパート遺伝子（ＳａＳｉＰ１８９）の単離を行った。
ＰＣＲの鋳型として、Ｓ．ａｌａｔｕｍの種子ステージ４のｃＤＮＡを用いた。配列番号６１および配列番号６３のプライマーを用いたＰＣＲで増幅された約１．５ｋｂの増幅断片をｐＣＲ−ｂｌｕｎｔ ＩＩ ＴＯＰＯ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）にサブクローニングし、挿入断片の塩基配列をプライマーウォーキングにより決定した。配列番号７８にＳａＳｉＰ１８９のアミノ酸配列を示し、配列番号７９にＳａＳｉＰ１８９のヌクレオチド配列を示す。
得られたＳａＳｉＰ１８９は、ＳｉＰ１８９とＤＮＡレベルで９０％配列同一性と示し、アミノ酸レベルで８６％の配列同一性を示した。これらの結果は、リグナン生合成酵素遺伝子ＳｉＰ１８９が、地理的隔離や、形態学的、細胞遺伝学的な違いを超えて、高く保存されている遺伝子であることを示す。
尚、発明を実施するための最良の形態の項においてなした具体的な実施態様または実施例は、あくまでも、本発明の技術内容を明らかにするものであって、そのような具体例にのみ限定して狭義に解釈されるべきものではなく、本発明の精神と次に記載する特許請求の範囲内で、いろいろと変更して実施することができるものである。
〔産業上の利用の可能性〕
セサミンは、多様な生理活性が明らかにされ、様々な改善効果をもつ物質であることが既に知られており、本発明によって、ピノレジノールからピペリトールを、またはピペリトールからセサミンの生合成を触媒する酵素の遺伝子が同定されたことから、この同定されたゴマ由来チトクロームＰ４５０遺伝子（ＳｉＰ遺伝子）を用いて、セサミンおよびピペリトールを組換え生物などにより生産することを実現できるため、セサミンの生産量の拡大および生産コストの削減という効果を奏する。
セサミンは、多様な生理活性が明らかにされ、様々な改善効果をもつ物質であることが既に知られており、本発明によって、ピノレジノールからピペリトールを、またはピペリトールからセサミンの生合成を触媒する酵素の遺伝子が同定されたことから、この同定されたゴマ由来チトクロームＰ４５０遺伝子（ＳｉＰ遺伝子）を用いて、セサミンおよびピペリトールを組換え生物などにより生産することを実現できるため、セサミンの生産量の拡大および生産コストの削減という効果を奏する。
以上のように、本発明に係るゴマ種子由来のＳｉＰ１８９遺伝子およびＳｒＳｉＰ１８９遺伝子はピノレジノールからピペリトールおよびピペリトールからセサミンを生成する反応を触媒するチトクロームＰ４５０をコードする遺伝子である。古来から貴重な食品であり、健康に良い食品の代表として知られているゴマの種子、または該種子から得た油、ゴマ種子からの抽出物は今後益々注目されると期待される。その中でもセサミンはその生理活性が注目されている。従って、本発明により同定されたＳｉＰ１８９遺伝子およびＳｒＳｉＰ１８９遺伝子は、これまでゴマ種子から生産する方法しかなかったセサミンの生産手段に利用することが可能であり、生産量の拡大が大いに期待できる。
したがって、本発明は、農業、食品産業、医薬品産業、およびこれらの関連産業に利用可能である。
Claims (21)
- ピペリトールおよび／またはセサミンの生合成を触媒するタンパク質をコードする遺伝子。
- ピノレジノールおよび／またはピペリトールにメチレンジオキシブリッジを形成する反応を触媒するタンパク質をコードする遺伝子。
- ピペリトールおよび／もしくはセサミンの生合成を触媒するタンパク質をコードし、かつ以下（ａ）もしくは（ｂ）からなる遺伝子：
（ａ）配列番号１、６４もしくは７８に示されるアミノ酸配列；または
（ｂ）配列番号１、６４もしくは７８に示されるアミノ酸配列の１個またはそれ以上のアミノ酸が、置換、欠失、挿入、および／もしくは付加によって改変されているアミノ酸配列。 - ピペリトールおよび／またはセサミンの生合成を触媒するタンパク質をコードし、かつ配列番号１、６４または７８に示されるアミノ酸配列に対して５０％以上の相同性を有するアミノ酸からなる遺伝子。
- 配列番号２、６５または７９に示される塩基配列をオープンリーディングフレーム領域として有する遺伝子。
- ピペリトールおよび／またはセサミンの生合成を触媒するタンパク質をコードし、かつ以下の（ａ）〜（ｃ）のいずれか１つにストリンジェントな条件下でハイブリダイズする遺伝子：
（ａ）配列番号２、６５もしくは７９に示される塩基配列からなるポリヌクレオチド；
（ｂ）配列番号１、６４もしくは７８に示されたアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするポリヌクレオチド；あるいは
（ｃ）（ａ）または（ｂ）に示されるポリヌクレオチドの断片。 - ゴマ由来である請求項１〜６のいずれか１項に記載の遺伝子。
- 請求項１〜７のいずれか１項に記載の遺伝子によりコードされるタンパク質。
- ピペリトールおよび／もしくはセサミンの生合成を触媒し、かつ以下（ａ）または（ｂ）からなるタンパク質：
（ａ）配列番号１、６４もしくは７８に示されるアミノ酸配列；または
（ｂ）配列番号１、６４もしくは７８に示されるアミノ酸配列の１個またはそれ以上のアミノ酸が、置換、欠失、挿入、および／もしくは付加によって改変されているアミノ酸配列。 - 請求項８または９に記載のタンパク質を認識する抗体。
- 請求項１〜７のいずれか１項に記載の遺伝子を含有する組換え発現ベクター。
- 請求項１〜７のいずれか１項に記載の遺伝子を含有する組換え発現ベクターを含む形質転換体。
- 請求項１２に記載の形質転換体を培養または生育させる工程、ならびに該形質転換体からピペリトールおよび／またはセサミンの生合成を触媒するタンパク質を得る工程を包含するタンパク質の生産方法。
- 請求項１〜７のいずれか１項に記載の遺伝子が導入された植物もしくは該植物の子孫またはこれらの組織。
- 請求項１〜７のいずれか１項に記載の遺伝子、あるいは請求項８または９に記載のタンパク質を用いる工程を包含する、ピペリトールおよび／またはセサミンの生産方法。
- 請求項１〜７のいずれか１項に記載の遺伝子を用いる工程を包含する、リグナン高含有の形質転換体を生産する方法。
- 請求項１〜７のいずれか１項に記載の遺伝子を用いる工程を包含する、ピペリトールおよび／またはセサミン高含有の植物体を生産する方法。
- 請求項１〜７のいずれか１項に記載の遺伝子を用いる工程を包含する、リグナン低含有の形質転換体を生産する方法。
- 請求項１〜７のいずれか１項に記載の遺伝子を用いる工程を包含する、ピペリトールおよび／またはセサミン低含有の植物体を生産する方法。
- 請求項１〜７のいずれか１項に記載の遺伝子を用いる工程を包含する、ゴマを育種する方法。
- ポリヌクレオチドプローブを備えている遺伝子検出器具であって、該プローブの塩基配列が、請求項１〜７のいずれか１項に記載の遺伝子における少なくとも一部分の塩基配列またはその相補配列からなる、遺伝子検出器具。
Applications Claiming Priority (3)
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