KR101235375B1 - 리그난 생합성을 촉매하는 효소-암호화 유전자 및 이의용도 - Google Patents

리그난 생합성을 촉매하는 효소-암호화 유전자 및 이의용도 Download PDF

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산토리 홀딩스 가부시키가이샤
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Abstract

본 발명은 피노레시놀로부터 피페리톨을 생성하는 반응 및 피페리톨로부터 세사민을 생성하는 반응을 촉매하는 효소를 제공한다. 본 발명은 또한 상기 효소를 암호화하는 유전자를 제공한다. 또한, 본 발명은 상기 효소를 암호화하는 유전자를 포함하는 벡터와 형질전환체, 및 상기 형질전환체를 사용하여 단백질을 생산하는 방법을 제공한다.
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피노레시놀, 피페리톨, 세사민, 효소, 형질전환체

Description

리그난 생합성을 촉매하는 효소-암호화 유전자 및 이의 용도{A GENE ENCODING AN ENZYME FOR CATALYZING BIOSYNTHESIS OF LIGNAN, AND USE THEREOF}
본 발명은 호마(胡麻, sesame)에서 피페리톨(piperitol)과 세사민(sesamin)의 생합성을 촉매하는 효소, 및 상기 효소를 암호화하는 유전자에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 상기 효소 및 유전자의 용도에 관한 것이다.
일반적으로 호마(세사뭄 인디쿰, Sesamum indium)로 알려져 있는 호마 식물은 호마과(Pedaliaceae), 참깨속(Sesamum)에 속하는 식물이다. 호마는 중앙 아프리카가 원산지이며, 6000년 이상의 역사가 깊은 가장 오래전부터 재배되어온 유지(油脂) 식물이다. 호마는 세계 도처에서 재배되어 왔다.
호마 종자는 약 50%의 지질과 약 20%의 단백질, 그 외에 비타민 B1, B2 및 E를 포함한 각종 비타민류를 함유하고 있다. 호마 종자의 주된 지질 성분은 주성분이 올레인산과 리놀렌산인 트리글리세라이드이다. 호마는 또한 호마 식물의 특징적인 성분인, 세사민, 세사몰린(sesamolin) 및 리그난으로 일반적으로 알려져 있는 2차 대사 산물도 함유하고 있다.
선행 연구에 의하여 세사민의 다양한 생리 활성이 밝혀졌는데, 이에 따르면 세사민은 콜레스테롤 대사와, 간 기능 및 면역 기능의 향상에 효과적인 것으로 나 타났다(예를 들면, 간행물 1 참조). 호마 종자 또는 호마 종자의 착유 잔류물로부터 세사민을 분리 및 정제하는 방법이 이미 실용화 단계에 있다(예를 들면, 특허 공보 1 및 2 참조). 세사민은 또한 알코올 대사를 촉진시킴으로써 간 기능 등을 증진시키는 의약으로도 시판되고 있다. 세사민 외에, 호마 리그난(세사미놀, 세사몰린 등) 역시도 다양한 생리 활성을 지니고 있는 것으로 보고되었다(예를 들면, 간행물 2 참조).
리그난의 생합성에 관하여 일부 연구되어 있다(예를 들면, 간행물 3 참조). 도 1은 리그난의 공통적인 생합성 경로의 개략도이다. 리그난은 출발물질로 사용된 페닐 프로파노이드 화합물로부터 합성된다. 식물의 경우, 리그난은 방어 기전에서 역할을 담당하는 것으로 생각되고 있다. 도 1에 도해된 바와 같이, 코니페릴(conipheryl) 알코올이 중합되면 생합성 경로에서 "제 1" 리그난으로서 피노레시놀이 생성된다. 피노레시놀로부터, 광범위의 다양한 리그난이 상이한 식물 종의 개별적인 생합성 경로를 통해 합성된다.
세사민 생합성의 경우, 도 1에 도시된 바와 같이, 피페리톨은 (+)-피노레시놀을 촉매하여 메틸렌 디옥시브리지(도 1에 원으로 표시)를 형성하는 피페리톨 신테타제(synthetase)의 효소 작용에 의해 합성된다. 세사민은 피페리톨에 또 다른 메틸렌 디옥시브리지를 형성하는 세사민 신테타제에 의해 합성된다. 호마 종자의 막 분획을 이용한 실험에 따르면 이들 반응을 촉매하는 효소는 상이한 두 종류의 사이토크롬 P450인 것으로 나타났다(예를 들면, 간행물 4 참조).
메틸렌 디옥시브리지의 형성은 알칼로이드 또는 플라보노이드의 생합성에서 종종 나타난다. 예를 들면, 금영화(캘리포니아 양귀비) (Eschscholtzia calfornica)의 배양 세포로부터 얻은 막 분획은 (S)-스쿨레린(scoulerine)으로부터 (S)-케일란티폴린(cheilanthifoline), 및 (S)-케일란티폴린으로부터 (S)-스틸로핀(stylopine)의 생합성을, 이들 화합물에 메틸렌 디옥시브리지를 형성함으로써 촉매하는 사이토크롬 P450을 포함하고 있는 것으로 알려졌다.
또한, 병아리콩(Cicer arietinum) 배양 세포로부터의 막 분획이 칼리코신 및 프라텐세인에서 각각 메틸렌 디옥시브리지의 형성에 의해 생성되는 슈도뱁티제닌 및 5´-하이드록시 슈도뱁티제닌의 합성을 촉매하는 효소를 함유하고 있음이 보고되었다. 이들 효소는 사이토크롬 P450으로서 동정 되었다(예를 들면, 간행물 6 참조).
다른 연구에 의하면 리눔 플라붐(Linum flavum)의 배양 세포내 데옥시포도필로톡신 6-하이드록실라제가 사이토크롬 P450일 수도 있다는 가능성을 보고하고 있다(예를 들면, 간행물 7 참조).
사이토크롬 P450은 또한, (S)-테트라하이드로콜림바민에서 메틸렌 디옥시브리지를 형성함으로써 (S)-테트라하이드로버버린이 합성되는, 벤질이소퀴놀린 알칼로이드의 일종인 베버린의 생합성에 관여하는 효소인 것으로 밝혀졌다. 이러한 효소를 암호화하는 유전자가 일본 황련(Coptis japonica)으로부터 클로닝되었다(예를 들면, 간행물 8 참조).
전술한 바와 같은 다양한 유형의 반응을 촉매하는 사이토크롬 P450은 아미노산 서열의 상동성에 기초하여 분류되는 다양한 분자 종의 상과(superfamily)를 포 함한다. 사이토크롬 P450의 상이한 분자 종은 이들의 동일성이 40% 이상이면 동일한 과에, 이들의 동일성이 55% 이상이면 동일한 아과(subfamily)에 속한다. 이러한 분류에 사용된 표기법에서, 번호는 과를, 알파벳은 아과를 의미한다(예를 들면, 간행물 9 참조). 도 3에 도시된 수형도(樹形圖)는 과 및 이들의 상관관계를 나타낸다. 예를 들면, 버버린의 생합성에 관여하는 사이토크롬 P450은 "CYP719"로 분류되었다.
단일 식물 종은 수백 분자 종의 사이토크롬 P450을 포함한다. 그러나, 도 4에 도시된 바와 같이, 이들 중 소수만이 생화학적 및 생리학적 기능에 근거하여 동정 되었다.
호마-유래 사이토크롬 P450으로서, p-쿠마레이트 3-하이드록실라제를 암호화하는 유전자(AY065995)가 클로닝되었지만, 본 발명과 관련되는 세사민 또는 피페리톨의 합성과 직접적인 관계가 있는 것은 아니다.
사이토크롬 P450 유전자의 클로닝 및 이들의 기능 분석 또한 후술되는 바와 같이 다른 유기체의 다양한 종에 대해 보고되었다.
예를 들면, 클로닝된 유전자의 일부는 다음의 것들을 포함한다;
페튜니아-유래 플라보노이드 3',5' 하이드록실라제(F3',5'H)를 암호화하는 유전자(예를 들면, 간행물 10 참조);
플라보노이드 3'-하이드록실라제(F3'H: CYP75B)를 암호화하는 유전자(예를 들면, 간행물 11 참조);
스위트루트(sweetroot)-유래 (2S)-플라바논 2-하이드록실라제(F2H: CYP93B1) 를 암호화하는 유전자(예를 들면, 간행물 12 참조);
2-하이드록시-이소플라바논 신테타제(IFS: CYP93C2)를 암호화하는 유전자(예를 들면, 간행물 13 참조); 및
이소플라본 2´-하이드록실라제(I2'H:CYP81E1)를 암호화하는 유전자(예를 들면, 간행물 14 참조).
또한, 플라본 신테타제 II(FNSII: CYP93B3)를 암호화하는 유전자 또한 I2'H를 사용하여 금어초(Antirrhinum majus)로부터 클로닝 되었다.
CYP81 과에 속하는 각종 사이토크롬 P450의 아미노산 서열이 웹사이트 Http://drnelson.utmem.edu/CytochromeP450.html에 실려 있다. 이러한 사이토크롬 P450의 상이한 기능 가운데, 돼지감자(Helianthus tuberosus)-유래 CYP81 B1은 지방산의 수소화를 촉매하는 것으로 알려져 있다(예를 들면, 간행물 16 참조). 효소 I2'H가 CPY81E에 속함이 또한 알려져 있다.
그러나, 이들 사이토크롬 P450 중 어느 것도 메틸렌 디옥시브리지의 형성에 관여하지 않는다.
리그난의 생합성에 수반되는 효소를 암호화하는 유전자로서, 미국개나리(Forsythia intermedia)에서 피노레시놀의 합성에 관여하는 디리전트 단백질(dirigent protein)을 암호화하는 유전자가 보고되었다(예를 들면, 간행물 17 및 특허 공보 3 참조). 또한, 미국개나리의 피노레시놀-라리시레시놀 리덕타제(Pinoresinol-Lariciresinol reductase)를 암호화하는 유전자(예를 들면, 간행물 18 및 특허 공보 3 참조), 및 서부 적삼목(Thuja plicata)의 피노레시놀-라리시레 시놀 리덕타제를 암호화하는 유전자(예를 들면, 간행물 19 참조)에 대해서도 보고된 바 있다. 다른 보고에서는, 재조합 세코이소(secoiso) 라리시레시놀 데하이드로게나제 및 이의 용도가 논의되어 있다(예를 들면, 간행물 20 참조).
특허 공보 1: 일본 공개공보 No. 139579/2001(2001. 5. 22 공개)
특허 공보 2: 일본 공개공보 No. 7676/1998 (1998. 1. 13 공개)
특허 공보 3: 일본 PCT 공개공보 No. 507931/2001(2001. 6. 19 공개)
특허 공보 4: 일본 PCT 공개공보 No. 512790/2002(2002. 5. 8 공개)
간행물 1: Mitsuo, Namiki, "Sesame, science and its functions," Maruzen Planet 刊
간행물 2: Publication of Japan Society for Bioscience, Biotechnology, and Agrochemistry, 76 805-813 2002
간행물 3: Lignans: biosynthesis and function, Comprehensive natural products chemistry vol. 1. 640-713, 1999
간행물 4: Phytochemistry, 49, 387, 1998
간행물 5: Phytochemistry, 30, 2953, 1991
간행물 6: Phytochemistry, 41, 457, 1996
간행물 7: Planta, 214, 288, 2001
간행물 8: J Biol Chem. 2003, May 5 [Epub ahead of print]
간행물 9: Nelson et al. Pharmacogenetics 6, 1-42, 1996
간행물 10: Nature 366 276-279, 1993
간행물 11: Plant J. 19, 441-451, 1999
간행물 12: FEBS Letters, 431, 287, 1998
간행물 13: Plant Physiology, 121, 821, 1999
간행물 14: Biochemical and Biophysical Research Communications, 251, 67, 1998
간행물 15: Plant and Cell Physiology, 40, 1182, 1999
간행물 16: J. Biol. Chem. 273, 7260, 1998
간행물 17: Plant Physiol. 123, 453, 2000
간행물 18: J. Biol. Chem. 271, 29473, 1996
간행물 19: J. Biol. Chem. 271, 618, 1999
간행물 20: J. Biol. Chem. 2001 Apr 20;276 16):12614-23, Epub 2001 Jan 18
전술한 바와 같이, 세사민은 각종 결핍증을 향상시키는 데 효과적인 것으로 알려져 있는 각종 생리 활성을 지니고 있다. 그러나, 기존의 세사민 생산은 호마 종자만을 사용하는 방법에 전적으로 의존하였다. 환언하면, 세사민 생산은 호마 종자에 전적으로 의존한다. 결과적으로, 생산성을 향상시키거나 세사민 생산비를 감소시키기가 곤란하였다.
이러한 과제는 유전공학 기술에 의해 효과적으로 해결될 수 있다. 그러나, 현재까지는, 호마 종자의 세사민 생합성에 관여하는 것으로 알려져 있는 사이토크롬 P450의 두 종류에 대해서는 어떠한 효소도 정제되지 않았으며, 이들 효소를 암 호화하는 어떠한 유전자도 클로닝되지 않았다. 다른 유기체의 상이한 종에서 메틸렌 디옥시브리지를 형성하는 사이토크롬 P450, 또는 사이토크롬 P450의 다른 종류에 대해서도 마찬가지 상황이다. 다른 유기체의 상이한 종에서 리그난의 생합성에 관여하는 효소를 암호화하는 유전자가 클로닝되었다. 그러나, 이들 중 어느 것도 세사민 및/또는 피페리톨의 합성에 참여하지 않는다.
호마 종자로부터 유래한 유전자 중 일부가 클로닝되었으며, 이의 예로는 저장 단백질(deposit protein)로서 글로불린을 암호화하는 AF240004, AF240005 및 AF240006가 포함된다. 다른 예로는 올레오신(J. Biochem. 122: 819-24, 1997), 아실 운반체 단백질 데새튜라제(desaturase)(Plant Cell Physiol. 1996, 37, 201-5), 스테롤레오신(Plant Physiol. 2002, 128: 1200-11), 및 지방산 언새튜라제(unsaturase)(Plant Sci. 161 935-941 (2001))를 포함하여, 지질의 합성 또는 저장에 관여하는 유전자 또는 효소를 포함한다. 그러나, 이들 유전자 또는 효소 중 어느 것도 리그난의 합성에 참여하지 않는다.
환언하면, 리그난의 합성에 관여하는 효소를 암호화하는 유전자는 발견되지 않았다. 따라서, 이러한 효소 및 이들 효소를 암호화하는 효소의 동정이 절실한 실정이다.
본 발명은 전술한 문제점의 견지에서 안출되었으며, 본 발명의 목적은 예를 들면, 재조합 유기체를 사용하여, 호마-유래 효소를 암호화하는 유전자로 세사민 및/또는 피페리톨의 생산 방법을 제공하는 것이다. 이러한 목적은 리그난의 하이드록실 그룹과 메틸 그룹 간의 메틸렌 디옥시브리지 형성을 촉매하는 효소를 암호 화하는 유전자, 더욱 바람직하게는 피노레시놀로부터 피페리톨을 형성하는 반응, 및/또는 피페리톨로부터 세사민을 형성하는 반응을 촉매하는 효소를 암호화하는 효소를 동정함으로써 달성된다.
본 발명의 발명자는 전술한 문제점을 해결하고자 부단한 노력을 기울였다. 목적을 성취함에 있어서, 일군의 호마-유래 사이토크롬 P450 유전자(이하, "SiP 유전자")를 호마 종자의 cDNA 라이브러리로부터 수득하여 이들 유전자를 효소에서 발현시켰다. 마이크로솜 분획을 재조합 효모로부터 수집하여 피노레시놀 또는 피페리톨과 반응시켰다. 반응시킨 후 HPLC 분석에 의해 피노레시놀로부터 피페리톨, 또는 피페리톨로부터 세사민의 존재 유무를 검사하였다. HPLC 분석 결과로부터, 피노레시놀로부터 피페리톨, 및 피페리톨로부터 세사민을 생성하는 반응을 촉매하는 단백질, 또는 이를 암호화하는 유전자를 동정하였다.
구체적으로는, 본 발명은 하기 (1) 내지 (21)에 기재한 바와 같이, 공업적으로 유용한 물질 및 방법을 제공한다.
(1) 피페리톨 및/또는 세사민의 생합성을 촉매하는 단백질을 암호화하는 유전자. (피노레시놀로부터 피페리톨, 및/또는 피페리톨로부터 세사민의 생합성을 촉매하는 단백질을 암호화하는 유전자)
(2) 피노레시놀 및/또는 피페리톨에 메틸렌 디옥시브리지를 형성하는 반응을 촉매하는 단백질을 암호화하는 유전자.
(3) 피페리톨 및/또는 세사민의 생합성을 촉매하고, (a) 서열번호 1, 64 또는 78의 아미노산 서열, 또는 (b) 서열번호 1, 64 또는 78의 하나 이상의 아미노산의 치환, 결실, 삽입, 및/또는 첨가에 의해 변형된 아미노산 서열로 이루어지는 단백질을 암호화하는 유전자.
(4) 피페리톨 및/또는 세사민의 생합성을 촉매하고, 서열번호 1, 64 또는 78의 아미노산 서열과 적어도 50% 상동성인 아미노산 서열로 이루어지는 단백질을 암호화하는 유전자.
(5) 개방 판독 프레임 영역으로서 서열번호 2, 65 또는 79의 염기 서열을 포함하는 유전자.
(6) 피페리톨 및/또는 세사민의 생합성을 촉매하는 단백질을 암호화하고, (a) 서열번호 2, 65 또는 79의 염기 서열로 이루어지는 폴리뉴클레오타이드, (b) 서열번호 1, 64 또는 78의 아미노산 서열로 이루어지는 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드, 또는 (c) 폴리뉴클레오타이드 (a) 또는 (b)의 단편과 엄격한 조건하에서 하이브리드화하는 유전자.
(7) 호마로부터 유래되는 상기 (1) 내지 (6) 중 어느 하나에 기재된 바와 같은 유전자.
(8) 상기 (1) 내지 (7) 중 어느 하나에 기재된 바와 같은 유전자에 의해 암호화되는 단백질.
(9) 피페리톨 및/또는 세사민의 생합성을 촉매하고, (a) 서열번호 1, 64 또는 78의 아미노산 서열, 또는 (b) 서열번호 1, 64 또는 78의 하나 이상의 아미노산의 치환, 결실, 삽입, 및/또는 첨가에 의해 변형된 아미노산 서열로 이루어지는 단백질.
(10) 상기 (8) 또는 (9)에 기재된 바와 같은 단백질을 인식하는 항체.
(11) 상기 (1) 내지 (7) 중 어느 하나의 유전자를 포함하는 재조합 발현 벡터.
(12) 상기 (1) 내지 (7) 중 어느 하나의 유전자를 포함하는 재조합 발현 벡터를 포함하는 형질전환체.
(13) 상기 (12)의 형질전환체를 배양하거나 증식시킨 다음;
형질전환체로부터 피페리톨 및/또는 세사민의 생합성을 촉매하는 단백질을 수득하는 단계를 포함하는, 단백질의 생산 방법.
(14) 상기 (1) 내지 (7) 중 어느 하나의 유전자가 도입된 식물, 이의 후대, 및 이러한 식물 및 후대의 조직.
(15) 상기 (1) 내지 (7) 중 어느 하나의 유전자 또는 상기 (8) 또는 (9)의 단백질을 사용하는 단계를 포함하는, 피페리톨 및/또는 세사민의 생산 방법.
(16) 상기 (1) 내지 (7) 중 어느 하나의 유전자를 사용하는 단계를 포함하는, 다량의 리그난을 함유하는 형질전환체의 생산 방법.
(17) 상기 (1) 내지 (7) 중 어느 하나의 유전자를 사용하는 단계를 포함하는, 다량의 피페리톨 및/또는 세사민을 함유하는 식물의 생산 방법.
(18) 상기 (1) 내지 (7) 중 어느 하나의 유전자를 사용하는 단계를 포함하는, 소량의 리그난을 함유하는 형질전환체의 생산 방법.
(19) 상기 (1) 내지 (7) 중 어느 하나의 유전자를 사용하는 단계를 포함하는, 소량의 피페리톨 및/또는 리그난을 함유하는 식물의 생산 방법.
(20) 상기 (1) 내지 (7) 중 어느 하나의 유전자를 사용하는 단계를 포함하는, 호마의 재배 방법.
(21) 염기 서열이 상기 (1) 내지 (7) 중 어느 하나에 기재된 유전자의 염기 서열의 적어도 일부분인 폴리뉴클레오타이드 탐침을 포함하는 유전자 검출 장치.
도 1은 호마 리그난의 전형적인 합성 경로를 보여주는 개략도로서, 1은 코니페릴 알코올, 2는 피노레시놀, 3은 피페리톨 신테타제, 4는 피페리톨, 5는 세사민 신테타제, 및 6은 세사민이다.
도 2a 내지 2f는 SiP189 유전자에 의해 암호화되는 효소의 활성을 측정하는 HPLC의 결과를 보여주는 다이아그램이다.
도 3은 사이토크롬 P450에 의해 암호화된 아미노산의 1차 구조 분석으로부터 수득된 수형도이다.
도 4는 SiP189 유전자에 의해 암호화된 단백질과의 상동성 조사 결과를 보여주는 다이아그램이다.
도 5는 SiP189 유전자에 대한 서던 분석 결과를 보여주는 다이아그램이다.
도 6a 내지 6d는 SrSiP189 유전자에 의해 암호화된 단백질의 활성을 측정하는 HPLC 분석의 결과를 보여주는 다이아그램이다.
도 7은 형질전환체 담배에서 SiP 유전자에 대한 발현 분석의 결과를 보여주는 다이아그램이다.
도 8a 내지 8d는 식물 세포에서 SiP 단백질에 대한 기능 분석 결과를 보여주는 다이아그램이다.
도 9A 내지 9H는 발현 조절 요소에 대한 조사에 있어서 SiP189 유전자의 프로모터 영역에 대한 분석 결과를 보여주는 다이아그램이다.
도 10은 SiP189 유전자의 프로모터 영역에 존재하는 발현 조절 요소를 보여주는 다이아그램이다.
도 11A 내지 11H는 발현 조절 요소에 대한 조사에 있어서 SrSiP189 유전자의 프로모터 영역에 대한 분석 결과를 보여주는 다이아그램이다.
도 12A 내지 12C는 SiP189 유전자와 SrSiP189 유전자간의 상동성을 보여주는 다이아그램이다.
발명의 실시를 위한 최선의 형태
이하, 본 발명의 양태를 설명한다. 본 발명은 하기 설명에 의해 어떠한 식으로도 제한되지 않음을 이해하여야 한다.
(1) 본 발명에 따른 유전자, 및 이들 유전자에 의해 암호화된 단백질의 구조
본 발명에 따른 유전자는 피페리톨 및/또는 세사민의 생합성을 촉매하는 단백질을 암호화한다. 본원에서 사용되는 어구 "피페리톨 및/또는 세사민의 생합성"이란 피노레시놀로부터 피페리톨의 생합성, 및/또는 피페리톨로부터 세사민의 생합성을 의미한다. 좀더 구체적으로는, 피노레시놀 및/또는 피페리톨에 메틸렌 디옥 시브리지를 형성하는 반응을 의미한다. 일 양태에서, 본 발명은 피페리톨 및 세사민의 생합성을 촉매하는 종자-유래 단백질을 암호화하는 유전자 SiP189(서열번호 2의 염기 서열을 가짐)를 통해 설명될 것이다. 본 발명에서, 개방 판독 프레임은 출발 코돈에서부터 말단 코돈에 이르는 영역(말단 코돈 제외)이다.
(1-1) 본 발명에 따른 유전자
본원에서 사용되는 용어 "유전자"는 "폴리뉴클레오타이드", "핵산", 또는 "핵산 분자"와 상호 교환적으로 사용된다. 즉, "유전자"의 의미는 뉴클레오타이드의 중합체를 포함한다. 또한, 본원에서 사용되는 용어 "염기 서열"은 "핵산 서열" 또는 "뉴클레오타이드 서열"과 상호 교환적으로 사용되며, (A, G, C 및 T로 표시되는) 데옥시리보뉴클레오타이드의 서열로 나타낸다.
본 발명의 유전자는 예를 들면, 서열번호 1, 64 또는 78의 아미노산 서열을 암호화할 수 있다. 여기에서, 단백질은 일반적으로 이의 아미노산 서열이 수개의 아미노산의 첨가, 결실, 및/또는 치환에 의해 변형되더라도 자체의 효소 활성을 보유하는 것으로 알려져 있음을 주지하여야 한다. 이와 관련하여, 피페리톨 및 세사민의 생합성을 촉매하는 단백질을 암호화하는 본 발명의 유전자는 (a) 서열번호 1, 64 또는 78의 아미노산 서열로 이루어지는 단백질, 또는 (b) 서열번호 1, 64 또는 78의 적어도 하나의 아미노산의 치환, 결실, 삽입, 및/또는 첨가에 의해 변형되는 아미노산 서열로 이루어지되, 피페리톨 및/또는 세사민의 생합성에 있어서 촉매 작용을 여전히 보유하는 단백질을 암호화할 수 있다. 예를 들면, 본 발명은 서열번 호 2, 65 또는 79의 염기 서열을 갖는 개방 판독 프레임(ORF)을 지닌 유전자를 포함한다. 실시예에서 후술되는 바와 같이, 본 발명에 따른 유전자는 사이토크롬 P450 단백질도 암호화할 수 있다.
본원에서 사용되는 어구 "하나 이상의 아미노산의 치환, 결실, 삽입, 및/또는 첨가"란 통상의 돌연변이체 단백질 생산 방법(예를 들면, 부위-지향성 돌연변이 유발 방법, Hashimoto-Gotoh, Gene 152, 271-275 (1995))에 의해 수행될 수 있는 바와 같이, 바람직하게는 10개 이하, 더욱 바람직하게는 7개 이하, 한층 더 바람직하게는 5개 이하의 아미노산의 치환, 결실, 삽입, 및/또는 첨가를 의미한다. 따라서, 단백질 (b)는 단백질 (a)의 돌연변이체를 암호화하는 유전자에 의해 암호화된다고 할 수 있다. 본원에서 사용되는 용어 "돌연변이체 단백질"이란 일반적으로 통상의 돌연변이체 단백질 생산 방법에 의해 인위적으로 제조되는 돌연변이체 단백질을 말한다. 그러나, 돌연변이체 단백질은 또한 천연의 공급원으로부터 분리 및 정제될 수도 있다.
본 발명의 유전자는 이본쇄 DNA에 국한되지 않으며, 이본쇄 DNA 또는 RNA의 센스 본쇄 또는 안티-센스 본쇄일 수도 있다. 안티-센스 본쇄는 탐침 또는 안티-센스 의약으로서 사용될 수 있다. DNA의 경우, 클로닝 기술, 화학적 합성 기술, 또는 이들 상이한 기술의 조합에 의해 수득된 cDNA 또는 게놈 DNA가 사용될 수 있다. 또한, 본 발명에 따른 유전자는 단백질 (a)와 (b)의 아미노산을 암호화하는 서열 외에도, 비-해독 영역(UTR)의 서열, 또는 벡터 서열(발현 벡터 서열 포함)을 포함할 수 있다.
또한, 본 발명의 유전자는 서열번호 1, 64 또는 78의 아미노산 서열과 20% 이상, 바람직하게는 50% 이상, 더욱 바람직하게는 60% 또는 70% 이상의 상동성을 갖고, 피페리톨 및/또는 세사민의 생합성을 촉매하는 단백질을 암호화할 수 있다. 유전자는 리그난 수준을 조절하거나 식물을 재배하는 데 사용될 수 있다. 본원에서 사용되는 용어 "상동성"이란 매치되는 아미노산 서열의 비율을 의미한다. 상동성이 높다는 것은 비교 대상 아미노산 서열 간에 더 밀접한 관계가 있음을 의미한다.
또한, 본 발명의 유전자는 서열번호 2, 65 또는 79의 염기 서열로 이루어지는 폴리뉴클레오타이드, 서열번호 1, 64 또는 78의 아미노산 서열로 이루어지는 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드, 또는 이들 폴리뉴클레오타이드의 단편을 포함할 수 있다. 예를 들면, 본 발명의 유전자는 엄격한 조건하에서 6개 이상(즉, 18 염기)의 아미노산을 암호화하는 염기 서열을 갖는 폴리뉴클레오타이드와 하이브리드화할 수 있고, 피페리톨 및/또는 세사민의 생합성을 촉매하는 단백질을 암호화할 수 있다. 본원에서 사용되는 어구 "엄격한 조건하에서"란 적어도 80% 동일성, 바람직하게는 적어도 95% 동일성, 더욱 바람직하게는 적어도 97% 동일성이 존재할 때에만 하이브리드화가 일어남을 의미한다. 구체적으로는, 하이브리드화는 예를 들면, 50℃에서 5 x SSC 하에서 일어날 수 있다.
하이브리드화는 예를 들면, J. Sambrook et al. Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2nd Ed., Cold Spring Harbor Laboratory (1989)에 기재된 바와 같이, 통상의 방법에 의해 수행될 수 있다. 일반적으로, 엄격성의 수준은 온도 의 증가 및/또는 염 농도의 감소에 따라 증가한다(즉, 하이브리드화가 더 어려워진다). 적합한 하이브리드화 온도는 염기 서열 또는 염기 서열의 길이에 좌우된다. 예를 들면, 6개의 아미노산을 암호화하는 18개의 염기로 이루어진 DNA 단편이 사용될 경우, 50℃ 이하의 온도가 바람직하다.
하이브리드화는 예를 들면, 선태식물과(Bryophyta)에 속하는 식물과 같은 천연 공급원으로부터 유래한 유전자를 선별할 수 있다. 기타 천연 공급원으로부터 유래한 유전자 역시도 사용될 수 있다. 또한, 하이브리드화에 의해 선별되는 유전자는 cDNA 또는 게놈 DNA일 수 있다.
(1-2) 본 발명에 따른 단백질
본 발명에 따른 단백질은 상기 섹션 (1-1)에서 설명한 본 발명의 유전자에 의해 암호화된다. 본 발명의 유전자에 의해 암호화된 단백질은 피노레시놀로부터 피페리톨, 또는 피페리톨로부터 세사민의 생합성을 촉매한다. 본 발명은 또한 피노레시놀 또는 피페리톨에 메틸렌 디옥시브리지를 형성하는 반응을 촉매하는 단백질을 포함한다. 예를 들면, 본 발명의 단백질은 (a) 서열번호 1, 64 또는 78의 아미노산 서열, 또는 (b) 서열번호 1, 64 또는 78의 하나 이상의 아미노산의 치환, 결실, 삽입, 및/또는 첨가에 의해 변형되었으되, 피페리톨 및/또는 세사민의 생합성에 있어서 촉매 작용을 여전히 보유하는 아미노산 서열을 포함할 수 있다.
상기 섹션 (1-1)에서 설명한 본 발명의 유전자를 사용하여, 본 발명에 따른 단백질은 유전자를 숙주 세포에 도입한 다음 그 안에서 유전자를 발현시킴으로써 수득될 수 있다. 이와 달리, 단백질은 세포 또는 조직으로부터 분리 및 정제하여 수득될 수 있다. 또한, 본 발명에 따른 단백질은 다른 단백질과의 융합 단백질일 수 있다. 또한, 본 발명에 따른 단백질은 화학적으로 합성될 수도 있다.
본 발명에 따른 단백질은 펩타이드 결합을 형성하는 아미노산의 쇄로서 폴리펩타이드에만 국한되지 않음을 주지하여야 한다. 단백질은 폴리펩타이드가 아닌 구조의 복합 단백질, 또는 부가적인 폴리펩타이드가 달린 단백질일 수 있다. 부가적인 폴리펩타이드의 예로는 본 발명의 단백질에 첨부되는(tagged) His, Myc 및 Flag 같은 다양한 에피토프를 포함한다.
(2) 본 발명의 유전자 및 단백질의 수득 방법
본 발명의 유전자 및 단백질의 수득(생산) 방법은 특별히 제한되지는 않는다. 일부 대표적인 방법을 이하에서 설명한다.
(2-1) 유전자의 수득 방법
천연 염기 서열을 갖는 유전자의 경우, 본 발명에 따른 유전자는 예를 들면, 실시예에서 추후 상세히 설명하게 되는 바와 같이, cDNA 라이브러리의 스크리닝에 의해 수득될 수 있다.
이와 달리, 본 발명에 따른 유전자는 PCR과 같은 증폭 수단을 이용하여 수득될 수도 있다. 예를 들면, PCR은 주형으로서 예를 들면 게놈 DNA (또는 cDNA)를 사용하여, 본 발명에 따른 유전자의 cDNA 서열 (또는 이의 상보 서열)의 5´말단과 3´ 말단에서의 서열에 따라 디자인된 프라이머로 수행될 수 있다. PCR은 프라이머에 의해 플랭킹된 DNA의 영역을 증폭하여, 본 발명의 유전자를 함유하는 다량의 DNA 단편을 수득한다.
또 다른 방법에서는, 목적하는 서열을 갖는 폴리뉴클레오타이드는 유전자 서열 정보에 기초하여, 통상적인 화학적 합성 절차에 의해 합성된다.
아미노산의 변형된 서열을 갖는 효소를 암호화하는 DNA는 천연 염기 서열을 갖는 DNA를 사용하여, PCR 또는 통상의 부위-지향성 돌연변이 유발에 의해 합성될 수 있다. 예를 들면, 해당 변형 DNA 단편을 수득하기 위하여, 천연 cDNA 또는 게놈 DNA를 제한 효소로 처리하여 DNA 단편을 수득한다. DNA 단편을 주형으로 사용하여, 목적 서열로 돌연변이시킨 프라이머를 가지고 PCR 또는 부위-지향성 돌연변이 유발을 수행한다. 이어서, 돌연변이된 DNA 단편을 해당 효소를 암호화하고 상응하는 DNA 단편 영역이 제거된 폴리뉴클레오타이드(DNA)와 연결한다. 예를 들면, 좀더 짧은 아미노산 서열을 갖는 효소를 암호화하는 DNA는 해당 아미노산 서열보다 긴 아미노산 서열(예를 들면, 전장 아미노산 서열)을 암호화하는 DNA를 절단하는 특정 제한 효소를 사용하여 수득될 수 있다. 생성되는 DNA 단편이 해당 효소의 전 아미노산 서열을 암호화하지 않을 경우, 결손 서열을 벌충하는 DNA 단편이 합성되고 연결될 수 있다.
생성되는 유전자를 이.콜라이 또는 효모의 유전자 발현 시스템에서 발현시켜 유전자가 암호화하는 단백질을 수득한다. 단백질의 효소 활성을 평가하여 유전자가 피노레시놀로부터 피페리톨의 생합성, 또는 피페리톨로부터 세사민의 생합성을 촉매하는 단백질을 암호화하였는지 여부를 확인할 수 있다. 또한, 세포 중으로 도입된 유전자를 가지고, 피노레시놀로부터 피페리톨의 생합성, 또는 피페리톨로부터 세사민의 생합성을 촉매하는 단백질을 수득할 수 있다.
또한, 서열번호 1, 64 또는 78의 아미노산 서열로 이루어지는 단백질에 대한 항체를 가지고, 피페리톨 및 세사민의 합성을 촉매하는 효소를 암호화하는 유전자는 또한 다른 유기체로부터도 클로닝될 수 있다.
(2-2) 단백질의 수득 방법
본 발명의 단백질을 수득(생산)하는 방법은 특별히 제한되지 않는다. 예를 들면, 단백질을 발현하는 세포 또는 조직으로부터의 간단한 정제 방법이 이용될 수 있다. 본 발명의 단백질을 발현하는 세포 또는 조직은 자가-생성성(self-generating)일 수 있다. 예를 들면, 재조합 배큘로바이러스로 감염된 세포 또는 조직이 사용될 수 있다. 정제는 특정 방법에 국한되지 않으며, 다음과 같이 수행될 수 있다. 본 발명의 유전자를 포함하는 발현 벡터에 의해 형질전환된 숙주를 배양, 또는 번식시킨 후, 해당 단백질은 예를 들면, 여과, 원심분리, 세포-파괴(세포 용해), 겔 크로마토그래피, 및 이온 교환 크로마토그래피를 포함한 통상의 절차에 따라 배양액으로부터 수집 및/또는 정제될 수 있다.
본 발명의 단백질을 수득하는 또 다른 방법은 재조합 기술을 이용하는 것이다. 일례로서, 본 발명에 따른 유전자를 벡터와 같은 운반체에 삽입하여 통상의 방법에 의해 숙주 세포 중으로 도입한 다음 그 안에서 발현시킨다. 해독된 단백질 을 정제한다. 유전자 전달(형질전환) 및 유전자 발현의 구체적 방법은 이하에서 후술하기로 한다.
피페리톨 및 세사민의 합성을 촉매하는 단백질은 또한 서열번호 1, 64 또는 78의 아미노산 서열로 이루어지는 단백질에 대한 항체를 사용하여 수득될 수도 있다. 또한, 이러한 항체를 가지고, 피페리톨 및 세사민의 합성을 촉매하는 효소 및 이러한 효소를 암호화하는 유전자를 타 유기체로부터 클로닝할 수 있다.
숙주 중으로 이종 유전자의 도입시, 다양한 유형의 숙주 및 발현 벡터가 사용될 수 있음을 주지하여야 한다. 여기에서, 발현 벡터는 숙주에서 유전자를 발현하도록 기능하는 프로모터와 통합되었다. 사용되는 숙주 또는 발현 벡터의 유형은 의도하는 용도에 따라 적절히 선택된다. 사용되는 숙주의 유형과 해당 단백질의 특징에 따라, 단백질 산물에 대해 상이한 정제 방법이 이용 가능하다. 사용되는 정제 방법의 유형과 관계없이, 태그(tag) 등의 사용은 해당 단백질의 정제를 비교적 용이하게 하는 데 도움을 준다.
돌연변이체 단백질의 제조 방법 역시 특별한 제한은 없다. 예를 들면, 돌연변이체 단백질은 부위-지향성 돌연변이 유발(예를 들면, Hashimoto-Gotoh, Gene 152, 271-275 (1995) 참조) 또는 PCR을 포함한 통상의 돌연변이체 단백질 유도 방법을 사용하여 염기 서열에 점 돌연변이를 도입시킴으로써 생성될 수 있다. 이와 달리, 돌연변이체 단백질은 트랜스포손의 삽입에 의해 돌연변이체 균주가 생성되는 방법에 의해 생성될 수 있다. 임의의 이들 방법을 이용하여, 단백질 (a)를 암호화하는 cDNA의 염기 서열을 하나 이상의 염기의 치환, 결실, 삽입, 및/또는 첨가에 의해 변형시켜 돌연변이체 단백질을 생산할 수 있다. 돌연변이체 단백질의 제조를 위해, 시판 키트 또한 사용될 수 있다.
전술한 방법 이외에도, 본 발명에 따른 단백질은 예를 들면, 시판 펩타이드 합성기를 사용하여 화학적 합성에 의해 수득될 수 있다. 이와 달리, 본 발명에 따른 단백질은 문헌: Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 78, 5598-5602 (1981), J. Biol. Chem., 253, 3753-3756 (1978)에 기재된 바와 같이 무-세포 단백질 합성 용액을 사용하여, 본 발명에 따른 유전자로부터 합성될 수 있다.
(3) 본 발명에 따른 항체
본 발명에 따른 항체(폴리클로날 항체 또는 모노클로날 항체)는 항원으로서 상기 섹션 (1-2)에서 설명한 본 발명의 단백질(예를 들면, 단백질 (a), (b), 또는 이들 단백질의 단편)을 사용하여, 통상적인 방법에 따라 수득된다. 통상적인 방법의 예로는 문헌: Harlow et al.; Antibodies: A laboratory manual (Cold Spring Harbor Laboratory, New York (1988), 및 Iwasaki et al.; Monoclonal antibody, hybridoma and ELIZA, Kodansha (1991)의 방법이 포함된다. 항체는 본 발명에 따른 단백질의 검출 및/또는 측정에 사용될 수 있다.
(4) 본 발명에 따른 재조합 벡터
본 발명에 따른 재조합 발현 벡터는 상기 섹션 (1-1)에서 설명한 본 발명의 유전자(예를 들면, 단백질 (a) 또는 (b)를 암호화하는 유전자)를 포함한다. cDNA 가 혼입된 재조합 발현 벡터는 본 발명의 재조합 발현 벡터의 일례이다. 재조합 발현 벡터는 비-제한적인 예로서 플라스미드, 파지, 또는 코스미드를 사용하여 생성될 수 있다. 또한, 재조합 발현 벡터는 통상의 방법에 의해 생성될 수 있다.
벡터의 유형은 숙주 세포에서 발현되는 한 특별한 제한은 없다. 구체적으로는, 그러한 벡터는 본 발명의 유전자를 유전자 발현을 보장하도록 적당히 선택된 프로모터 서열과 함께 플라스미드에 혼입시킴으로써 제조된다. 프로모터 서열은 숙주 세포의 유형에 따라 좌우된다.
다양한 마커를 사용하여 본 발명의 유전자가 숙주 세포에 도입되었는지 여부, 또는 상기 유전자에 의해 암호화된 단백질이 숙주 세포에서 성공적으로 발현되었는지 여부를 확인할 수 있다. 마커(예를 들면, 숙주 세포에서 결여되어 있는 유전자)는 본 발명의 유전자와 함께, 플라스미드와 같은 운반체와 통합되고, 발현 벡터로서 숙주 세포 중으로 도입된다. 본 발명의 유전자의 성공적인 흡수는 발현 벡터가 혼입된 숙주 세포에서 마커의 발현을 체크함으로써 확인될 수 있다. 이와 달리, 본 발명에 따른 단백질은 숙주 세포에 융합 단백질의 형태로 발현될 수 있다. 예를 들면, 본 발명에 따른 단백질은 아쿠오레아 백토리아(Aequorea victoria)로부터 유래한 녹색 형광 단백질(GFP)과의 융합 단백질로서 발현될 수 있다. 이 경우에, GFP는 마커로서 사용된다.
숙주 세포는 특별히 제한되지 않으며, 다양한 통상적으로 이용 가능한 세포가 사용될 수 있다. 구체적으로는, 원핵세포 숙주로서, 에스케리키아 속에 속하는 박테리아(예를 들면, 이.콜라이), 또는 바실러스 속에 속하는 박테리아(예를 들면, 바실러스 서브틸리스)가 사용될 수 있다. 진핵세포 숙주로는, 하등 진핵세포(예를 들면, 진균류를 포함하는 진핵 박테리아)(예를 들면, 효모, 사상균)이 사용될 수 있다. 효모는 사카로마이시즈 속에 속하는 미생물(예를 들면, 사카로마이시즈 세레비지애)일 수 있다. 곰팡이(사상균)의 예로는 아스퍼질러스 속에 속하는 미생물(예를 들면, 아스퍼질러스 오리재, 아스퍼질러스 니거), 또는 페니실럼 속에 속하는 미생물이 포함된다. 또한, 숙주 세포는 동물 세포 또는 식물 세포일 수 있다. 식물 세포는 호마과(Pedaliaceae) 또는 벼과(Poaceae)에 속하는 것들을 포함한 다양한 식물로부터 수득될 수 있다. 동물 세포로는, 예를 들면, 마우스, 햄스터, 원숭이 또는 인간으로부터 수득된 동물 세포주가 사용될 수 있다. 곤충 세포(예를 들면, 누에 세포 또는 누에 성충 자체) 역시도 사용될 수 있다.
본 발명에 따른 재조합 발현 벡터는 표적 숙주 세포의 유형에 따라 다양한 발현 조절 영역(예를 들면, 프로모터, 터미네이터, 및/또는 복제 개시점)을 포함한다. 박테리아 발현 벡터의 경우, 예를 들면 trc 프로모터, tac 프로모터, 또는 lac 프로모터와 같은 통상의 프로모터가 사용된다. 효모 프로모터로는, 예를 들면 글리세르알데하이드 트리포스페이트 데하이드로게나제(GAPDH) 프로모터, 또는 PH05 프로모터가 사용된다. 예를 들면 사상균 프로모터로는 아밀라제 프로모터 또는 trpC 프로모터가 사용될 수 있다. 동물 세포 숙주의 경우, 바이러스 프로모터(예를 들면, SV40 초기 프로모터, SV40 후기 프로모터)가 사용된다. 발현 벡터는 예를 들면, 제한 효소 및/또는 리가제를 사용하여 통상의 방법에 따라 제조될 수 있다. 발현 벡터에 의한 숙주의 형질전환 또한 통상의 방법에 따라 수행될 수 있다.
숙주 세포 중으로 발현 벡터를 도입하는 방법(형질전환 방법)은 특별한 제한이 따르지 않으며, 예를 들면 전기천공법, 인산칼슘법, 리포솜법, DEAE 덱스트란법, 및 미세주사법을 포함하여 다양한 통상의 방법이 사용될 수 있다.
(5) 본 발명에 따른 형질전환체
본 발명에 따른 형질전환체는 상기 섹션 (1-1)에서 설명한 본 발명의 유전자(예를 들면, 단백질(a) 또는 (b)를 암호화하는 유전자)가 혼입되어 있다. 본원에서 사용되는 어구 "유전자의 혼입"이란 통상적인 유전공학 기술에 의해 표적 세포(숙주 세포) 중으로의 유전자 전달을 의미한다. 또한, 본원에서 사용되는 용어 "형질전환체"란 세포, 조직, 장기뿐만 아니라 살아있는 유기체 자체도 의미한다.
본 발명에 따른 형질전환체는 상기 섹션 (4)에서 설명한 본 발명의 재조합 벡터를 사용하여 제조(생산)될 수 있다. 형질전환될 유기체는 특별히 제한되지 않으며, 상기에서 예시한 바와 같이 미생물 또는 식물일 수 있다. 적당한 프로모터 또는 벡터를 가지고, 동물 및 곤충 또한 형질전환시킬 수 있다.
바람직한 양태에서, 호마를 사용하여 본 발명에 따른 형질전환체를 생성한다. 호마 형질전환체를 생성하는 방법은 예를 들면, 문헌: T. Asamizu: Transformation of sesame plants using MAT vector system: introduction of fatty acid desaturase genes. Sesame Newsletter 16: 22-25 (2002)에 기재된 공지의 방법을 포함한다.
또한, 본원에서 사용되는 용어 "형질전환체"란 본 발명의 유전자가 전달된 식물, 및 동일한 특성을 지닌 그들의 후대도 포함한다. 이들 식물의 조직 또한 "형질전환체"의 의미 안에 포함된다.
(6) 본 발명에 따른 유전자 검출 장치
본 발명에 따른 유전자 검출 장치는 본 발명에 따른 유전자의 적어도 일부인, 염기 서열 또는 이의 상보 서열로 이루어지는 탐침으로서 폴리뉴클레오타이드를 포함하여 구성된다. 본 발명의 유전자 검출 장치는 본 발명의 유전자의 검출 및/또는 발현 패턴의 측정을 위한 다양한 조건 하에서 사용될 수 있다.
본 발명에 따른 유전자 검출 장치의 일례는 본 발명의 유전자와 특이적으로 하이브리드화하는 탐침을 기질(운반체) 상에 부동화시킨 DNA 칩이다. 본원에서 사용되는 용어 "DNA 칩"이란 일반적으로 탐침으로서 합성 올리고뉴클레오타이드를 사용하는 합성 DNA 칩을 의미한다. 그러나, 예를 들면, PCR에 의해 생성된 탐침으로서 cDNA를 사용하는 접착 DNA 마이크로어레이도 포함한다.
본원에서 사용되는 용어 "올리고뉴클레오타이드"란 함께 연결되는 수개 내지 수십 개의 뉴클레오타이드의 쇄를 의미하며, "폴리뉴클레오타이드"와 상호 교환적으로 사용된다. 올리고뉴클레오타이드는 비교적 긴 폴리뉴클레오타이드의 단편으로서 생성되거나 화학적으로 합성될 수 있다.
탐침으로서 사용되는 폴리뉴클레오타이드의 염기 서열은 cDNA 서열의 특징적인 서열을 특정하는 통상의 방법에 의해 결정될 수 있다. (예를 들면, 문헌: Science 276:1268, 1997 ; Cell 88: 243, 1997; Science 270: 484, 1995; Nature 389: 300, 1997; US 특허 No. 5,695,937에 기재된 바와 같이 SAGE(Serial Analysis of Gene Expression)법이 이용될 수 있다).
DNA 칩은 통상의 방법에 의해 제작될 수 있다. 예를 들면, 합성 올리고뉴클레오타이드가 사용될 경우, 사진석판술과 고체상 DNA 합성 기술을 조합하여 기질 상에 합성될 수 있다. 한편, 올리고뉴클레오타이드가 cDNA일 경우, 어레이 장치를 이용하여 기질 상에 부착된다.
또한, 통상의 DNA 칩에서와 같이, 완벽하게 매치되는 탐침(올리고뉴클레오타이드)을 이의 단일 염기를 치환함으로써 제조된 미스매치 탐침과 배치함으로써 유전자 검출의 정확도를 향상시킬 수 있다. 또한, 상이한 유전자를 동시에 검출하기 위하여, 상이한 유형의 올리고뉴클레오타이드가 단일 기질 상에 부동화되는 DNA 칩을 제조할 수 있다.
(7) 본 발명에 따른 유전자 및 단백질의 용도(효율)
전술한 설명은 호마에서 피페리톨 및/또는 세사민의 생합성을 촉매하는 효소에 대해 주로 논의하였다. 그러나, 본 발명은 호마-유래 유전자에만 국한되는 것이 아니라, 피페리톨 및/또는 세사민의 생합성을 촉매하는 효소의 용도에도 관련된다. 피페리톨 및/또는 세사민의 생합성을 촉매하는 효소는 식물, 동물 또는 미생물로부터 유래할 수 있다. 효소가 어디에서 유래하든 이를 불문하고, 피페리톨 및/또는 세사민의 생합성에서 효소 활성을 나타내는 한 그러한 효소는 리그난 수준을 조절하는 데 사용될 수 있다. 또한, 본 발명은 피페리톨 및/또는 세사민의 생합성 을 촉매하는 효소를 암호화하는 유전자를 전달함으로써 수득된, 리그난 수준이 조절된 식물, 및 이의 후대 및 조직에 관한 것이다. 식물은 절화(cut flower) 형태일 수 있다. 피페리톨 및/또는 세사민의 생합성을 촉매하는 효소를 암호화하는 본 발명의 유전자는 피페리톨 또는 세사민의 생성, 또는 피페리톨 또는 세사민 형성의 억제에 사용될 수 있다. 현행 기술로는, 완벽하게 유전자를 식물에 전달하여 이를 구성적으로(constitutively) 또는 조직-특이적으로 발현시킬 수 있다. 안티-센스법, 공-억제법(co-suppression), RNAi법 등을 이용하여 해당 유전자의 발현을 억제하는 것도 가능하다. 형질전환될 수 있는 식물의 비-제한적인 예는: 호마, 벼, 포르시티아 서스펜타(Forsythia suspenta), 담배, 아라비돕시스 탈리아나(Arabidopsis thaliana), 버즈풋 트레포일(bird's-foot trefoil), 보리, 밀, 평지, 감자, 토마토, 포플라, 바나나, 유캅립투스, 고구마, 대두, 알팔파, 루핀, 옥수수, 콜리플라워, 장미, 국화, 카네이션, 금어초, 시클라멘, 난초, 유스톰 러셀리아눔(Eustome russellianum), 프리지아, 거베라, 글라디올러스, 베이비스 브레쓰(Baby's Breath)(Grypsophila elegans), 칼란코(kalanchoe), 백합, 펠라고니움 그래베오렌(Pelargonium graveolen), 제라늄, 페튜니아, 토레니아, 튤립 등을 포함한다.
본 발명은 상기 섹션(5)에서 설명한 형질전환체를 배양 또는 번식시키는 단계, 및 피페리톨 및/또는 세사민의 생합성을 촉매하는 단백질을 형질전환체로부터 수득하는 단계를 포함하는 단백질 생산 방법을 제공한다. 상기 방법은 피페리톨 및/또는 세사민의 생합성을 촉매하는 단백질의 용이한 대량 생산을 가능하게 한다. 본 발명의 방법은 상기 단계만을 요할 뿐이며, 기타 조건은 특별히 제한되지 않으며 적절히 설정될 수 있다(예를 들면, 숙주의 유형, 사용되는 물질 및 세팅).
본 발명에 따른 유전자 및 단백질은 피페리톨 및/또는 세사민이 생합성되는 피페리톨 및/또는 세사민의 생산 방법에 사용될 수 있다. 상기 방법은 피페리톨 및/또는 세사민의 용이한 대량 생산을 가능하게 하며, 따라서 피페리톨 및/또는 세사민을 함유하는 식품(특히 건강 식품) 및 약제의 제조에 사용될 수 있다. 본원에서 사용되는 어구 "유전자 또는 단백질을 사용하여"란 생체내, 시험관내, 및 생체외를 포함하여 다양한 조건하에서 유전자 또는 단백질의 사용을 의미함을 주지하여야 한다. 피페리톨 및/또는 세사민의 생산 방법의 일례에서는, 유전자가 식물 세포 중으로 전달되고, 피페리톨 및/또는 세사민이 생체내 형질전환체 식물에서 생합성된다. 또 다른 예에서는, 본 발명의 단백질을 피페리톨 및/또는 세사민의 생합성을 위해 생체외에서 피페리톨 및/또는 세사민의 전구체와 반응시킨다. 또한, 피페리톨 및/또는 세사민은 예를 들면, 생물반응기를 사용하여 생산될 수 있다. 여기에서, 유전자 자체는 생합성을 위한 효소 활성을 보유하지 않음을 주지하여야 한다. 따라서, 유전자는 유전자가 암호화하는 단백질의 형태로 사용되는 것이 바람직하다.
본 발명은 또한 본 발명의 유전자를 사용하여, 고-함량 리그난 또는 저-함량 리그난 형질전환체의 생산 방법을 제공한다. 방법은 리그난 수준이 조절된 형질전환체를 용이하고 편리하게 생산하는 데 사용될 수 있다. 리그난은 추출될 수 있거나, 형질전환체 자체를 식품이나 약제로서, 또는 이들 제품의 전구체로서 사용할 수 있다.
본원에서 사용되는 어구 "고-피페리톨 및/또는 세사민 함량의 식물"이란 다량의 피페리톨 및/또는 세사민을 함유하는 식물을 의미한다. 본원에서 사용되는 어구 "저-피페리톨 및/또는 세사민 함량의 식물"이란 소량의 피페리톨 및/또는 세사민을 함유하는 식물을 의미한다.
본 발명에 따른 유전자는 호마 재배 방법에 이용될 수 있다. 예를 들면, 상기 방법은 본 발명의 유전자를 호마 중으로 전달하고 다량의 피페리톨 및/또는 세사민을 함유하는 식물을 재배하는 데 사용될 수 있다. 형질전환체 호마는 고-피페리톨 및/또는 세사민 수준의 지질을 함유하는 종자를 생산하며, 이어서 이를 채종할 수 있다.
본 발명은 다양한 수정 및 대안의 형태가 가능하지만, 이의 특정 양태는 첨부 도면을 참조로 실시예에 의해 좀더 상세히 후술하기로 한다. 그러나, 본 발명을 개시되는 특정 형태로 제한하고자 함이 아니며, 그 반대로 본 발명은 첨부 특허청구범위에서 정의되는 바와 같이 본 발명의 범주내에 들어오는 모든 수정, 등가물 및 대안물을 포함시키고자 함을 이해하여야 한다.
이하, 본 발명을 하기 실시예를 토대로 상세히 설명한다. 달리 언급하지 않는 한, 이들 실시예에 사용되는 분자생물학적 기술은 문헌: Molecular Cloning (Sambrook et al.)을 토대로 한다.
실시예 1: 미국개나리( Forsythia intermedia )로부터 리그난의 제조
60 g의 건조시킨 미국개나리 잎을 3 L의 물에서 30분간 비등시킨 다음, 추출물을 필터(원: 300 mm; Tokyo roshi Kaisha)로 여과하였다. 분배된 여액의 용매 용적을 증발기로 감소시킨 후, 샘플을 동결건조시키고(30/N), 추출된 동결건조 샘플을 수득하였다(21.6837 g).
7 g의 추출된 동결건조 샘플을 100 ml의 물에 재용해시키고 초음파로 균질화하였다. 이어서, 400 ml Diaion HP-20 수지(Mitsubishi Chemical Corporation)로 충진한 칼럼을 800 ml의 50% 아세톤으로 세척하고 2 L의 물로 평형시켰다. 칼럼을 사용하여, 균질화 샘플을 조(crudely) 정제하였다. 구체적으로는, 샘플로 로딩한 후, 칼럼을 80 ml의 물로 세척한 다음, 800 ml의 50% 메탄올로 1 차 용출, 800 ml의 100% 메탄올로 2차 용출을 하였다.
1차 용출 및 2차 용출로부터 수득한 각각의 샘플을 하기 조건하에서 HPLC 분석하여 리그난의 존재 유무를 측정하였다. 이동상으로는, 용액 A(0.1% 트리플루오로아세트산(TFA)) 및 용액 B(0.1% TFA, 90% 아세토니트릴)를 사용하였다. 칼럼으로는 Develosil C30-UG-5(Nomura Chemical Co., Ltd., 4.6 mm x 150 mm)를 사용하였다. 칼럼을 60% 용액 A와 40% 용액 B의 혼합물로 평형시킨 후(20분), 샘플을 60% 용액 A와 40% 용액 B 내지 10% 용액 A와 90% 용액 B의 직선 구배를 통해 0.6 ml/분의 유속으로 15분간 용출시켰다. 샘플을 다시 10분간 10% 용액 A와 90% 용액 B로 추가 용출시켰다. 단백질이 287 nm의 흡수 파장에서 검출되었으며 매 분마다 분별하였다(조(粗) 분별 분석). SPD-10AV(Shimazu Corporation)를 사용하여, 각각 의 분획을 220 nm 내지 400 nm의 스펙트럼 범위에서 측정하여 리그난의 특징적인 흡수 패턴(230 nm 및 280 nm)인, 두 개의 흡수 최대를 갖는 물질을 검색하였다. 측정 결과는 리그난의 특징적인 흡수 최대를 갖는 물질이 주로 2차 용출물에 함유되어 있음을 보여주었다.
리그난을 분리하기 위하여, 하기 조건하에서 분별을 수행하였다(주 분별). 2차 용출물을 증발기로 농축하고, 동결건조 하였다(건량 1.0325 g). 1 g의 추출된 동결건조 샘플을 1 ml의 디메틸 설폭사이드(DMSO)에 먼저 용해시킨 다음, 6 ml의 30% 용액 B에 용해시켰다. 두 경우 모두 초음파 처리를 이용하였다. 용출물을 15000 rpm에서 원심분리에 의해 분리하고, 약 6 ml의 상등액을 칼럼(Develosil ODS-UG-15/30; C-18(Nomura Chemical Co., Ltd., 50 mm x 500 mm)) 상에 로딩하였다. 이동상으로는, 용액 A(0.05% TFA) 및 용액 B(0.05% TFA, 90% 아세토니트릴)를 사용하였다. 70% 용액 A 및 30% 용액 B를 가지고 32 ml/분의 유속으로 20분간 칼럼을 평형시킨 후, 샘플을 칼럼 상에 로딩시킨 다음 70% 용액 A 및 30% 용액 B 내지 10% 용액 A 및 90% 용액 B의 직선 구배로 60분간 용출시켰다. 샘플을 10% 용액 A 및 90% 용액 B로 30분간 추가 용출하였다. 280 nm의 흡수 파장에서 검출한 다음 용출물을 매분마다 분별하였다(32 ml)(검출기: 115UV 검출기, Gilson 제품). 절차의 말미에, 280 nm에서 흡수 피크를 갖는 8개의 분획을 수득하였다. 이들 분획을 증발기로 농축한 다음 동결건조하였다. 각각의 분획을 조 분별 분석에서와 동일한 조건하에서 HPLC로 분석하였다. 리그난의 특징적인 스펙트럼을 갖는 이들 분획 가 운데, 순수한 리그난으로 추정되는 분획을 1H NMR 분석으로 분석하여 피노레시놀을 동정하였다. 그 결과, 49.7 g의 피노레시놀이 수득되었다.
실시예 2: 호마 종자에서 리그난의 분석
재배된 호마의 엽초(sheath)에서 미성숙 호마 종자를 채종하고, 동결건조시켜 리그난을 아세톤으로 추출하였다. 아세톤 추출물의 제조 방법을 이하에서 설명한다.
분쇄한 호마 종자의 동결건조 샘플 약 100 mg을 1 ml의 아세톤에 용해시켜 아세톤 추출물을 수득하였다. 100 ㎕의 아세톤 추출물을 건조시킨 다음 20 ㎕의 DMSO에 재용해시키고, 이어서 0.1% TFA를 함유하는 50% 아세토니트릴 80 ㎕를 첨가하였다. 용액을 Millex-LH 필터(Millipore Corporation, 0.45 ㎛/4 mm)로 여과하여 HPLC 분석용 샘플을 준비하였다. HPLC 분석 결과 리그난의 존재가 확인되었고, 이들의 체류시간은 피페리톨(표준 호마 리그난(대조군))(체류시간: 약 12분), 세사민(체류시간: 약 16분), 및 세사몰린(체류시간: 약 18분)과 부합하였다.
호마 종자를 성장 단계별로 4 단계로 나누었다.
단계 1: 1.5 cm 이하의 종자 엽초
단계 2: 1.5 cm 내지 2 cm인 종자 엽초
단계 3: 2 cm 이상이고 황록색 엽초를 갖는 종자 엽초
단계 4: 2 cm 이상이고 암록색 엽초를 갖는 종자 엽초
이들 조건하에서 HPLC 분석의 결과는 단계 3과 4에서 피페리톨, 세사민, 및 세사몰린이 축적되었음을 확인시켜 주었다.
즉, 결과는 본 실시예에서 사용된 호마에서 피페리톨과 세사민의 생성에 관여된 효소 및 이를 암호화하는 유전자의 존재를 나타낸다.
실시예 3: 호마 cDNA 라이브러리의 제조
실시예 2에서 사용된 호마 종자로부터, 제조업자가 권장한 방법에 따라 RNeasy Plant Mini Kit(QIAGEN)로 전 RNA를 추출하였다. 추출된 RNA로부터 5 ㎍의 폴리 A(+) RNA를 oligotex-MAG mRNA 정제 키트(TaKaRa)를 사용하여 수득하였다. 폴리 A(+) RNA를 주형으로 사용하여, 제조업자가 권장한 방법에 따라 ZAP Express cDNA Synthesis Kit 및 ZAP Express cDNA Gigapack3 Gold Cloning Kit(Stratagene)으로 cDNA 라이브러리를 작제하였다. cDNA 라이브러리를 1 x 107 pfu/ml의 양으로 수득하였다.
실시예 4: 호마-유래 리그난 생합성 유전자의 클로닝
약 300,000 pfu의 cDNA 라이브러리를 스크리닝하였다. 탐침으로서, 게놈 서열을 알고 있는 아라비돕시스 탈리아나(Arabidopsis thaliana)의 사이토크롬 P450 유전자의 서열을 사용하였다.
구체적으로는, 아라비돕시스 탈리아나의 사이토크롬 P450 유전자의 상과를 1 차 서열에 기초하여 계통발생학적으로 분류하고(도 3 참조), 13 종의 아라비돕시스 탈리아나 사이토크롬 P450 유전자(CYP90A, CYP72B, CYP71B, CYP84A, CYP96A, CYP710A, CYP86A, CYP74, CYP75B, CYP79F, CYP81D, CYP705A, 및 CYP83A)가 호마 종자 라이브러리를 스크리닝하기 위한 탐침으로 사용되었다. DNA를 서열번호 5 내지 30의 프라이머로 증폭시켜 DIG-표지물을 탐침에 도입하였다. 다음과 같이 PCR을 수행하였다. RNeasy Plant Mini Kit(QIAGEN)으로 아라비돕시스 탈리아나로부터 전체 RNA를 추출한 후, 주형으로서 1 ㎍의 전체 RNA를 사용하여 역전사에 의해 cDNA를 수득하였다. 제조업자가 권장하는 조건하에서 RT-PCR용 SuperscriptTM First-Strand Synthesis System(Invitrogen)으로 cDNA 합성을 수행하였다. PCR의 반응 혼합물(50 ㎕)은 1 ㎕의 아라비돕시스 게놈 DNA, 1 x Taq 버퍼(TaKaRa), 0.2 mM dNTPs, 프라이머(서열번호 5 내지 30, 각각 0.4 pmol/㎕), 및 2.5 U rTaq 폴리머라제를 함유하였다. 반응은 94℃에서 5분간 수행한 다음, 이어서 94℃에서 1분, 53℃에서 1분 및 72℃에서 2분간 28 사이클로 수행하였다. 탐침을 동일한 PCR 조건하에서 DIG-표지하였다. 양성 클론의 스크리닝 및 검출을 DIG-DNA 표지 및 검출 키트(Roche)로 수행하였다.
양성 클론의 검출은 주로 제조업자가 권장하는 방법을 토대로, 환원된 엄격 하이브리드화 조건하에서 수행하였다. 구체적으로, 5 X SSC를 함유하는 하이브리드화 버퍼를 사용하여 37℃에서 막을 2시간 예비 하이브리드화한 후, 30% 포름알데하이드, 50 mM 인산나트륨 버퍼(pH 7.0), 1% SDS, 2% 차단 시약(Roche), 0.1% 라우 로일 사코신, 및 연어의 80 ㎍/ml 정자 DNA, DIG-표지 믹스 탐침을 버퍼에 가하고 막을 밤새 배양하였다. 막을 1% SDS를 함유하는 5 X SSC 세척 용액 중 58℃에서 1시간 동안 세척하였다.
2차 스크리닝 후, 96개의 독립적인 양성 클론을 수득하였다. 96 클론을 제조업자가 권장하는 방법에 따라 pBK-CMV 플라스미드(Stratagene)에 삽입시키고, 삽입 영역의 5' 말단 및 3' 말단의 뉴클레오타이드 서열을 M13RV 프라이머 및 M13M4(-20) 프라이머로 각각 결정하였다. 그 결과, 46개의 클론이 사이토크롬 P450의 서열과 유사한 서열을 가졌다. 삽입 영역의 전 뉴클레오타이드 서열을 결정하였다. 생성되는 클론을 5종의 독립적인 P450 상동체(Sesamum indicum P450; SiP) SiP168, SiP189, SiP236, SiP249 및 SiP288로 분류하였다. 이어서, 이들 5종의 SiP 유전자에 특이적인 프라이머(서열번호 31 내지 40)를 사용하여 RT-PCR을 수행하였다. 주형으로는, 호마 잎과 종자로부터 제조된 RNA를 역전사하여 수득한 cDNA를 사용하였다. 결과는 5종의 SiP 유전자가 종자에서 발현되었음을 보여주었다. RT-PCR에 사용된 PCR의 반응 혼합물(25 ㎕)은 각각의 cDNA 1 ㎕, 1 x Ex-Taq 버퍼(TaKaRa), 0.2 mM dNTPs, 프라이머(각각 0.2 pmol/㎕), 및 1.25 U Ex-Taq 폴리머라제를 함유하였다. 반응은 94℃에서 3분간 수행한 다음, 이어서 94℃에서 1분, 53℃에서 1분 및 72℃에서 2분간 26 사이클로 수행하였다. 리보솜 18SRNA(AJ236041)를 호마 내부 대조군 유전자로 사용하여 발현 수준을 비교하였다. 서열번호 3과 4의 프라이머를 증폭용으로 사용하였다.
실시예 5: Sip 유전자용 발현 벡터를 포함하는 형질전환체의 생성
5종의 SiP 유전자 중에서, SiP249(pSPB2031) 및 SiP288(pSPB2034)는 완전한 개방 판독 프레임(서열번호 53 내지 56)을 암호화하는 것으로 추측된다. pSPB2031을 BamHI 및 XhoI로 소화시켜 수득한 SiP249 ORF를 함유하는 1.8 kb cDNA 단편을 효모 발현 벡터 pYE22m(Holton, T.A et al., Nature 366, 276-279, 1993)의 BamHI 및 SalI 부위에 삽입시켰다. 결과적으로, pSPB2046이 수득되었다. 효모 발현 벡터 pYE22m의 다중 클로닝 부위는 글리세르알데하이드-3-포스페이트 데하이드로게나제 유전자(GAPDH) 프로모터 및 GAPDH 터미네이터에 의해 플랭킹되어 있으며, 다중 클로닝 부위에 삽입된 삽입체는 GAPDH 프로모터의 조절하에 효모에서 구성적으로 발현된다. 벡터용 선별 마커는 트립토판이다. 한편, pSPB2034를 BamHI 및 XhoI로 소화시켜 수득한 SiP288을 함유하는 1.8 kb cDNA를 효모 발현 벡터 pYE22m의 BamHI 및 SalI 부위에 삽입하였다. 결과적으로, pSPB2047이 수득되었다. 두 종류의 효모 발현 벡터를 사용하여 통상의 방법에 따라 효모 INVsc 균주(Invitrogen)를 형질전환시켜, INVsc/pYE22m/SiP249 및 INVsc/pYE22m/SiP288을 수득하였다.
SiP168, SiP189, 및 SiP236의 유전자는 불완전한 개방 판독 프레임을 가졌다. 완전한 개방 판독 프레임을 갖는 서열(서열번호 1 및 2, 및 57 내지 60)을 수득하기 위하여, 각 유전자의 5' 말단을 제조업자가 권장하는 방법에 따라 GeneRacer 키트(Invitrogen)로 증폭하였다. 서열번호 41 내지 46의 프라이머를 증폭에 사용하였다. 각각의 SiP 유전자의 5' 말단을 증폭한 서열을 결정하였다.
이들 3종의 SiP 유전자의 전장 개방 판독 프레임을 증폭하기 위하여, 유전자 를 PCR 증폭하였다. 주형으로는, 호마 종자로부터 유래한 cDNA를 사용하였다. PCR에 사용된 프라이머는 후술되는 바와같은 제한 효소 부위를 지녔다. 다음과 같이 PCR을 수행하였다. PCR의 반응 혼합물(50 ㎕)은 호마 종자로부터 유래한 주형 cDNA 1 ㎕, 1 x KOD 플러스 버퍼(TOYOBO), 0.2 mM dNTPs, 프라이머(서열번호 47 내지 52, 각각 0.4 pmol/㎕), 1 mM MgS04, 및 1 U KOD 플러스 DNA 폴리머라제를 함유하였다. 반응은 94℃에서 5분간 수행한 다음, 이어서 94℃에서 1분간, 55℃에서 1분간, 및 72℃에서 2분간 30 사이클로 수행하였다. 전장 SiP를 함유하는 증폭 단편을 pCR-blunt II TOPO 벡터(Invitrogen)의 다중 클로닝 부위에 삽입시켜 TOPO-SiP168 (pSPB2064), TOPO-SiP189(pSPB2055), 및 TOPO-SiP236(pSPB2048)을 수득하였다.
pSPB2064, pSPB2055 및 pSPB2048의 증폭에 사용된 프라이머의 제한 효소 부위를 소화시켜 수득한 약 1.5 kb의 cDNA를 함유하는 DNA 단편을 효모 발현 벡터 pYE22m의 BamHI 및 SalI 부위에 삽입하였다. 그 결과, pYE22m/SiP168(pSPB2052), pYE22m/SiP189(pSPB2053), 및 pYE22m/SiP236(pSPB2049)가 수득되었다.
3종의 효모 발현 벡터를 사용하여 효모 INVsc 균주(Invitrogen)를 형질전환시켜 INVsc/pYE22m/SiP168, INVsc/pYE22m/SiP189, 및 INVsc/pYE22m/SiP236을 수득하였다.
실시예 6: 형질전환체에서 호마 리그난의 생합성
INVsc/pYE22m/SiP249 및 INVsc/pYE22m/SiP288 외에, 3종의 형질전환체 INVsc/pYE22m/SiP168, INVsc/pYE22m/SiP189, 및 INVsc/pYE22m/SiP236를 400 mL YNBDglc 배지(0.67% 효모 질소 염기, 2% 글루코스, 및 트립토판을 제외한 20 mg/L의 각종 아미노산)중 30℃에서 36시간 동안 배양하였다. 효모 형질전환체의 배양 용액으로부터, 마이크로솜 분획을 공지의 초원심분리법으로 수집하였다(Holton, T. A et al., Nature 366, 276-279, 1993).
마이크로솜 침전물을 1 ml의 현탁 버퍼(0.1M 인산칼륨 버퍼, pH 7.4, 20% 글리세롤, 0.3 ㎕/ml 머캅토에탄올)에 현탁시켜 마이크로솜 용액을 수득하였다. 240 ㎕의 마이크로솜 용액에 30 ㎕의 1M 인산칼륨 버퍼(pH 7.4), 6 ㎕의 50mM NADPH, 및 24 ㎕의 267 μM 피노레시놀 또는 피페리톨을 첨가하였다. 혼합물을 30℃에서 1시간 동안 반응시켰다. 효소의 반응 혼합물에 0.1% TFA를 함유하는 동량의 100% 아세토니트릴을 가하였다(50% 최종 농도). 혼합물을 15000 rpm, 4℃에서 3분간 원심분리하고, 150 ㎕의 상등액을 Millex-LH 필터(Millipore Corporation, 0.45 ㎛/4 mm)로 정제하였다. 이어서, 정제 샘플을 실시예 1의 조 분별 분석에서와 동일 조건하에서 HPLC 분석하였다.
INVsc/pYE22m/SiP189에 대한 HPLC 분석의 결과를 도 2(a) 내지 도 2(e)를 참조하여 후술한다. INVsc/pYE22m/SiP189에서, 피노레시놀(도 2(a), 체류 시간: 약 8분)은 각각 체류 시간이 약 12분 및 약 16분인 리그난-유사 흡수 스펙트럼을 갖는 두 종류의 산물로 전환되었다(도 2(b)). 또한, INVsc/pYE22m/SiP189에서, 피페리톨(도 2(d), 체류 시간: 약 12분)은 체류 시간이 약 16분인 리그난-유사 흡수 스펙 트럼을 갖는 산물로 전환되었다(도 2(e)). 이러한 체류 시간으로부터, 이들이 각각 피페리톨(체류 시간: 약 12분) 및 세사민(체류 시간: 약 16분)인 것으로 생각된다.
LC-MS/MS 분석(LC: Waters 2790, Waters 제품; MS: QUATRO micro, Micromass 제품)에 의해, 두 종류의 피크(체류 시간: 약 12분 및 16분)를 이들의 분자량 및 단편 패턴에 기초하여 표준과 비교하였다. 결과는 이들의 분자량이 표준의 분자량과 매치됨을 보여주어, 두 SiP189 산물이 피페리톨과 세사민으로 동정되었다. LC-MS/MS 분석을 다음과 같은 조건하에서 수행하였다. LC를 위해, Develosil C30-UG-5(Nomura Chemical Co., Ltd., 2.0 x 50 mm)를 사용하였다. 이동상으로는, 용액 A(H20), 용액 B(메탄올), 및 용액 C(10 mM CH3COONH4)를 사용하였다. 유량은 10% 용액 C로 0.25 ml/min이었다. 이러한 조건하에서, 피페리톨과 세사민이 8.4분 및 10.1분 후에 검출되었다. MS는 POSITIVE 측정 모드로 수행되었다. 그 결과, SiP189가 피페리톨을 통해 피노레시놀로부터 세사민을 합성하는 효소를 암호화함이 밝혀졌다. 초기에는, 피노레시놀로부터의 피페리톨 합성 및 피페리톨로부터의 세사민 합성에 상이한 효소들이 관여하는 것으로 추측되었다. 본 발명은 본 발명의 유전자에 의해 암호화된 단일 효소가 두 반응 모두에 관여함을 보임으로써 그 반대임을 증명하였다.
효소의 반응 혼합물에 NADPH를 함유하지 않은 반응 시스템을 이용하여 분석한 결과, 피페리톨을 생성하기 위한 INVsc/pYE22m/SiP189의 활성이 NADPH 의존성임 이 밝혀졌다(도 2(b) 및 2(c)). 이러한 사실은 세사민에 대해서도 마찬가지이다(도 2(e) 및 2(f)). NADPH의 부재하에서, 피페리톨 및 세사민 생성을 위한 활성은 NADPH 존재하에서의 수준으로부터 각각 약 14% 및 약 18% 떨어졌다.
이어서, INVsc/pYE22m/SiP189의 마이크로솜 분획을 CO로 환원시키고, 이의 흡수 스펙트럼을 분광광도계(Hitachi 제품 U-3000P Spectrophotometer)로 측정하였다. 결과는 마이크로솜 분획이 450 nm에서 흡수가 일어남을 보여주며, 이를 대조군으로 사용된 형질전환체 효모 INVsc/pYE22m과 비교하였다. 따라서, 결과는 INVsc/pYE22m/SiPl89의 마이크로솜 분획에 사이토크롬 P450 단백질이 생성되었음을 확인시켜 주었다.
실시예 2에 기재된 방법에 따라, 실시예 2에서 생장에 따라 4 단계로 분리한 호마 종자로부터 RNA를 추출하였다. SiP189 증폭용 프라이머 세트(서열번호 49 및 50) 및 Sil8SrRNA 증폭용 프라이머 세트(서열번호 3 및 4)를 사용하여 RT-PCR을 수행하였다. PCR의 반응 혼합물(25 ㎕)은 각각의 cDNA l ㎕, 1 x Ex-Taq 버퍼 (TaKaRa), 0.2 mM dNTPs, 프라이머(각각 0.2 pmol/㎕), 및 1.25 U Ex-Taq 폴리머라제를 함유하였다. 반응은 94℃에서 5분간 수행한 다음, 94℃에서 1분간, 53℃에서 1분간, 및 72℃에서 2분간 26 사이클로 수행하였다. 결과는 종자내 세사민의 축적이 현저해지는 단계 4에서 SiP189의 강력한 발현을 확인시켜 주었다. 성장-단계 의존성 리그난 축적이 SiP189 유전자 발현의 시기와 일치하는 사실로부터, SiP189 유전자가 호마 종자에서 피페리톨 및 세사민 생성 효소를 암호화하는 것으로 밝혀졌다.
상기 결과는 SiP189 유전자가 피노레시놀로부터 피페리톨을 생성하는 반응, 및 피페리톨로부터 세사민을 생성하는 반응을 촉매하는 사이토크롬 P450을 암호화함을 보여준다. 도 3에서, SiP189는 화살표로 표시되었다. 도 3으로부터 SiP189가 사이토크롬 P450 상과의 CYP81 과에 속함을 알 수 있다.
유전자는 호마 및 기타 식물을 포함하는 다양한 유기체, 또는 생물반응기와 같은 시스템을 사용하여 세사민 및 피페리톨의 합성을 가능하게 한다.
실시예 7: 재배된 호마 세사뭄 인디쿰( Sesamum indicum )에서 SiP 189 유전자의 게놈 분석
세사뭄 인디쿰 게놈내 SiP 189 유전자의 카피수를 알아보기 위하여, 게놈 써던 분석을 수행하였다.
Nucleon Phytopure for Plant Extraction Kit(Amersham)를 사용하여, 게놈 DNA를 제조업자의 권장 방법에 따라 세사뭄 인디쿰(cultivar Masekin)의 잎으로부터 추출하였다. 추출된 10 ㎍의 게놈 DNA를 3종의 제한 효소 EcoRI, NcoI 및 XbaI로 완전히 소화시킨 다음, 각각의 샘플을 아가로스 겔 상에서 전기영동에 의해 분리하였다. 아가로스 겔을 0.25 M HC1을 사용하여 15분간 가수분해하고, 1.5 M NaCl과 0.5 M NaOH를 함유하는 용액을 사용하여 30분간 변성시킨 다음, 1.5 M NaCl과 Tris-HCl(pH 7.5)를 함유하는 용액으로 중화시켰다. 이어서, 게놈 DNA를 20 x SSC 중의 막(Hybribond-N, Amersham)으로 옮긴 다음, 자외선을 조사하여 막에 결합시켰다. 막을 7% SDS, 50% 포름알데하이드, 5 x SSC, 2% 차단 시약, 0.1% 라우로 일 사코신, 및 50 mM 인산나트륨 버퍼(pH 7.0)를 함유하는 하이브리드화 버퍼(고-SDS 버퍼) 중 42℃에서 1시간 동안 예비 하이브리드화 하였다.
하이브리드화 탐침으로서, SiP189의 cDNA의 개시 메티오닌으로부터 시작하여 약 900 bp로 이루어지는 ORF 영역을 사용하였다. 서열번호 61(Bam-SST-FW2) 및 서열번호 62(SiP189-Nco-RV)의 프라이머를 사용하여, cDNA의 상기 영역을 PCR에 의해 DIG-표지하였다. PCR의 반응 혼합물은 SiP189의 cDNA를 함유하는 플라스미드(pSPB2055) 1 ng, 1 x PCR 버퍼, 1 x DIG-dNTP 혼합물(PCR DIG Labeling Mix, Roche), 각각의 프라이머 0.2 pmol/㎕, 및 1U rTaq 폴리머라제(TAKARA BIO INC.)를 함유하였다. PCR은 95℃에서 30초, 53℃에서 30초, 및 72℃에서 1분간 30 사이클로 수행하였다.
PCR 산물을 Sephadex G-50 퀵 스핀 칼럼(Boehringer)로 정제하고, 가열 변성시킨 다음, 즉시 얼음 위에 두었다. 하이브리드화 탐침으로서, 10 ㎕의 변성 산물을 예비 하이브리드화 용액에 가하고, 혼합물을 밤새 42℃에서 배양하였다.
막을 0.1% SDS를 함유하는 0.2 x SSC 용액(고-엄격 하이브리드화 조건)중 65℃에서 30분간 2회 세척하였다. DIG 적용 매뉴얼(Roche)에 따라 DIG-표지 및 검출 키트(Roche)로 하이브리드화 시그널을 수득하였다.
도 5는 검출 결과를 보여준다. 도 5에 도시된 바와 같이, SiP189 유전자는 3종의 제한 효소 처리 모두에 대해 단일 밴드로 검출되었다. 결과는 SiP189 유전자가 세사뭄 인디쿰 게놈에 단일 유전자로 존재하고, 게놈내 다른 어떤 유전자도 SiP189 유전자와 강한 상동성을 가지지 않음을 시사한다. 따라서, 호마 식물에서 피페리톨과 세사민을 합성하기 위한 촉매 활성이 SiP189 유전자에 의해 부여된다고 할 수 있다.
실시예 8: 세사뭄 라디아툼( Sesamum radiatum )으로부터 SiP189 -유사 유전자의 분리
세사뭄 라디아툼은 아프리카에서 발견되는 호마 식물이다. 세포 유전학적 분석에 따르면 이러한 특정 종의 호마 식물에서 염색체 수는 2n = 64인 것으로 드러났으며, 이는 세사뭄 인디쿰(2n = 26)과는 세포 유전학적으로 상이한 계통임을 시사한다(Mitsuo Namiki, Teisaku Kobayashi, Science of sesame, Asakura Shoten). 리그난 함량 또한 세사뭄 라디아툼의 종자에서 분석되었으며, 세사민의 축적이 보고된바 있다(Bedigian, D., et al. Biochemical Systematics and Ecology 13, 133-139, 1985). 이는 세사뭄 라디아툼이 세사뭄 인디쿰의 SiP189에 대응하는 효소를 암호화하는 유전자(SrSiP189)를 가지고 있음을 암시한다. 또한, 세사뭄 라디아툼의 SrSiP189 유전자의 서열이 SiP189의 서열과 고도로 상동성일 것으로 예상된다.
실시예 4의 절차에 따라, 세사뭄 라디아툼의 종자로부터 cDNA를 제조하였다. 1 ㎕의 cDNA를 주형으로 사용하고, 서열번호 61(Bam-SST-FW2) 및 서열번호 63(GR-SST-RV1)의 프라이머를 사용하여, 실시예 4의 방법에 따라 RT-PCR을 수행하였다. 필시 전장 ORF를 함유하게 되는 단편을 증폭하기 위하여, 프라이머를 SiP189의 서열에 따라 디자인하였다. RT-PCR에 의해 SrSiP189를 함유하는 것으로 믿어지는 약 1.5 kb의 단편을 생성하였다. 단편을 pCR-blunt II TOPO 벡터(Invitrogen)에 삽입하여, pSPB2068을 수득하였다. 삽입된 단편의 전 뉴클레오타이드 서열을 결정하였다. 결과는 세사뭄 인디쿰으로부터 유래한 SiP189과 비교시, DNA 수준에서는 96% 서열 상동성을, 아미노산 수준에서는 95% 서열 상동성을 보여주었다(서열번호 64는 SrSiP189의 아미노산 서열을 나타내고, 서열번호 65는 SrSiP189의 뉴클레오타이드 서열을 나타낸다). 실시예 4의 절차에 따라, 프라이머(서열번호 61 및 63)를 사용하여 RT-PCR을 수행하였다. 주형으로는 세사뭄 라디아툼의 종자와 잎으로부터 제조된 cDNA를 사용하였다. 종자에서는 SrSiP189가 강력하게 발현되었으나 잎에서는 거의 발현되지 않은 것으로 밝혀졌다. 따라서, RT-PCR에 의한 SrSiP189 발현 분석은 SrSiP189가 종자에서 기능을 띰을 시사하였다.
실시예 9: 세사뭄 라디아툼에서 SrSiP189 유전자의 기능 분석
SrSiP189의 생화학적 기능을 측정하기 위하여, 재조합 SrSiP189 단백질을 효모에서 발현시키고, 리그난의 생합성에 대한 재조합 SrSiP189 단백질의 활성을 검사하였다. 먼저, pSPB2068를 제한 효소 BamHI와 XhoI로 소화하고, 전장 SrSiP189를 갖는 cDNA를 함유하는 약 1.5 bp의 생성되는 단편을 효모 발현 벡터 pYE22m의 BamHI 부위와 SalI 부위에 삽입하였다. 그 결과, pSPB2069가 수득되었다. 실시예 6의 절차에 따라, 효모 형질전환체로부터 마이크로솜을 제조하고, 리그난에 대한 생합성 활성을 측정하였다. 도 6은 HPLC 분석 결과를 보여준다. 도 6에 도시된 바와 같이, 세사뭄 인디쿰으로부터 유래한 SiP189에서처럼, 재조합 SrSiP189 단백질은 피노레시놀을 피페리톨로, 피페리톨을 세사민으로 전환하는 NADPH 의존성 촉매 활성을 지녔다(도 6(a) 및 도 6(b)). NADPH를 함유하지 않는 효소 반응 혼합물에서, 피페리톨 및 세사민에 대한 촉매 활성은 각각 16.9% 및 8.4%로 떨어졌다(도 6(c) 및 도 6(d)). 따라서, 결과는 SrSiP189가 사실은 세사뭄 인디쿰내 SiP189의 카운터파트 유전자였음을 보여주었다.
전술한 결과는 SiP189-유사 서열을 갖는 유전자가 종을 가로질러 발견되며, 이 유전자가 피노레시놀을 피페리톨로, 및 피페리톨을 세사민으로 전환하는 반응을 촉매하는 효소를 암호화함을 확인시켜 주었다.
설명한 바와 같이, 본 발명은 다양한 방식으로 변화시킬 수 있음이 자명하다. 그러한 변화는 본 발명의 사상과 범주로부터 벗어나는 것으로 간주되지 않으며, 당업자에게 자명하게 되듯이 그러한 모든 수정은 첨부 특허청구의 범위내에 포함시키고자 한다.
실시예 10: 식물 세포에서 SiP189 단백질의 기능 분석
식물 세포에서 SiP189 단백질의 생물학적 기능을 확인하기 위하여, 담배((N. tabaccum)를 SiP189 유전자로 형질전환시켰다.
제한 효소 BamHI 및 XhoI를 사용하여, SiP189를 포함하는 pSPB2055를 소화하였다. SiP189의 ORF를 포함하는 약 1.5 kb의 생성되는 DNA 단편을 식물 형질전환 바이너리 벡터 pSPB176의 BamHI 부위 및 SalI 부위와 연결하여 바이너리 벡터 pSPB2057를 수득하였다. pSPB176의 다중 클로닝 부위는 CaMV35S 프로모터 및 NOS 터미네이터에 의해 플랭킹되어 있다. 이들 부위에 삽입된 삽입체는 CaMV35S 프로모터의 조절하에 식물 세포에서 과량으로 구성적으로 발현된다.
pSPB2057를 통상의 방법에 따라 아그로박테리움(균주: Aglo) 중으로 형질전환시켰다(Shimonishi et al., New Introductions to Biological and Chemical Experiments 3, Kagaku Doujin (pp. 122-124)). 아그로박테리움 형질전환체를 사용하여 담배 엽편(leaf disk)을 감염시켰다.
형질전환체 13개 라인의 잎으로부터, cDNA를 실시예 2의 방법에 따라 제조하였다. 이어서, 서열번호 49 및 50의 프라이머를 사용하여, 실시예 4의 방법에 따라 RT-PCR을 수행하였다. 서열번호 66 및 67의 뉴클레오타이드 서열로 이루어지는 프라이머(각각 NtUBQ-FW 및 NtUBQ-RW)를 사용하여, 담배의 유비퀴틴 유전자(NtUBQ 기탁번호: U66264)를 내부 대조군 유전자로서 증폭하였다. 결과는 라인 6, 7 및 12에서 고-발현 SiP189 유전자의 존재를 확인시켜 주었다(도 7).
하기 절차를 얼음 위에서 또는 4℃에서 수행하였다. 혈질전환체 잎(라인 6, 7 및 12) 및 비-형질전환체 잎의 각 샘플 약 15 g을 액체 질소 중에서 막자로 분쇄하고, 30 ml의 균질화 버퍼(0.1 M 인산칼륨 버퍼(pH 7.0), 0.5 M 만니톨, 5 mM EDTA, 42 mM 머캅토에탄올, 50 mM 아스코빈산나트륨, 0.1% BSA, 1 mM PMSF, 및 1% PVPP)에 용해시켰다.
혼합물을 20분간 10000 x g에서 원심분리하고, 상등액을 Miracloth로 여과하였다. 여액을 100000 x g로 90분간 초원심분리하여 조추출 마이크로솜 분획을 수득하였다. 마이크로솜 분획(240 ㎕)을 실시예 4의 방법에 따라 피페리톨과 효소 반응시킨 다음, 생성되는 산물을 HPLC로 분석하였다.
HPLC 분석 결과는 SiP189를 과량으로 발현하는 담배-유래 마이크로솜이 비-형질전환체에서는 관찰되지 않으며, 효소의 반응 혼합물에서 NADPH의 존재에 의존성인 피크를 가짐을 보여주었다. 피크는 세사민 표준의 체류 시간과 일치하였으며, 이는 식물 세포에서 세사민의 생합성을 위한 촉매 활성을 지닌 단백질로서 SiP189의 기능을 시사한다(도8)ㅇ.
실시예 11: SiP189 유전자에서 발현 조절 영역의 동정
SiP189 유전자의 전사 조절을 통찰하기 위하여, SiP189 유전자의 5' 비-암호화 영역을 분리, 서열결정 및 분석하였다. 호마(세사뭄 인디쿰)의 게놈 DNA로부터, λBlueSTARTM 벡터 시스템(NOVAGEN)을 사용하여 게놈 라이브러리를 작제하였다.
200 ㎍의 호마 게놈 DNA를 제한 효소 Sau3AI으로 부분 소화시켜 약 20 kb의 단편을 수득하였다. DNA 단편을 25000 rpm, 10℃에서 24시간 동안 수크로스 밀도 구배 원심분리(10% 내지 40%) 하였다(SW28 로터, Beckman). 원심분리한 샘플을 AUTOMATIC LIQUID CHARGER(Advantec), 및 Micro Tube Pump(EYELA)를 사용하여 분별하였다(각각 1 ml). 각각의 분획에 대해, 단편의 크기를 펄스-필드(pulse-field) 겔 전기영동에 의해 확인하였다. 펄스-필드 겔 전기영동은 1% 아가로스 NA(Amersham biosceience) 및 0.5 x TBE를 함유하는 겔을 사용하였으며, 6V/cm에서 120°/1초 내지 1초 동안 0.5 x TBE 버퍼에서 수행하였다(CHEF MAPPER, Invitrogen). 약 20 kb의 평균 단편 크기를 갖는 단편을 함유하는 분획을 가지고, 제조업자가 권장하는 방법에 따라 게놈 라이브러리를 작제하였다. 라이브러리는 1.5 x 106 pfu/500 ㎕의 역가를 가졌다. 게놈 라이브러리(500000 클론)를 탐침으로 스크리닝하였으며, 이를 위해 서열번호 68 및 69(각각, SiP189-bam-FW 및 SiP189-nco-RV)의 염기 서열로 이루어지는 프라이머로 증폭된 SiP189 유전자의 약 850 bp ORF 영역이 사용되었다.
제조업자가 권장하는 방법에 따라 AlkaPhos Direct Labeling and Detection system(Amersham bioscience)으로 탐침을 표지하고 검출하였다. 하기 조건하에서 하이브리드화를 수행하였다:
탐침: 5 ng/ml 하이브리드화 버퍼
예비 하이브리드화: 1시간 동안 55℃
하이브리드화: 철야로 55℃
세척: 55℃에서 30분 동안 2회
3차 스크리닝 후, 9종의 양성 클론을 분리하고, 이들로부터 약 12 kb의 삽입체 크기를 갖는 gSiP189-#6를 수득하였다.
이어서, 서열번호 68 및 69의 뉴클레오타이드 서열의 프라이머와, 파아지 아암 프라이머 STAR-LF1(서열번호 70) 및 STAR-LR1(서열번호 71)를 사용하여 PCR을 수행하여, gSiP189-#6에 삽입된 탐침의 방향과 위치를 측정하였다.
PCR 분석은 gSiP189-#6이 길이가 5kb 이상인 SiP189 유전자의 5' 비-해독 영역을 함유하고 있음을 나타내었다. 이러한 결과를 바탕으로, gSiP189-#6의 전 뉴클레오타이드 서열을 결정하였다.
주형으로 gSiP189-#6을 사용하여, 삽입체를 LA-PCR로 증폭하였다. LA-PCR의 반응 혼합물은 1 ㎕의 양성 클론 SM 버퍼 현탁액, 1 x LA 버퍼(TaKaRa), 프라이머(각각 l pmol/㎕), 0.4 mM dNTP, 2 mM MgCl2, 및 2.5 U LA-Taq 폴리머라제를 함유하였다. LA-PCR은 96℃에서 5분간 수행한 다음, 98℃에서 10초간, 55℃에서 10초간, 및 68℃에서 10분간 30 사이클로 수행하였다. 최종적으로, 생성물을 72℃에서 15분간 유지시켰다.
생성되는 단편을 물리적으로 절단하고, 약 1 내지 2 kb의 DNA 단편을 분별하였다. 단편을 말단-블런트화(end-blunted) 하여 pUC118(TaKaRa)의 HincII 부위에 삽입하여 샷 건(shot gun) 라이브러리를 작제하였다. 라이브러리는 2.8 x 106 cfu/㎕의 역가를 가졌다.
gSiP189-#6으로부터 유래한 샷 건 라이브러리를 가지고, 이.콜라이 DH10B 균주(Invitrogen)를 전기천공법에 의해 형질전환시켰다. 무작위 선택된 192개의 콜로니로부터, TempliPhi DNA 서열분석 주형 증폭 키트(Amersham bioscience)를 사용하여 DNA를 제조하였다. 이렇게 하여 제조된 DNA를 M13-47(F) 프라이머(서열번호 72) 및 RV-M(R) 프라이머(서열번호 73)를 사용하여 증폭하였다.
증폭 산물을 Clean SEQ(Agecourt)로 정제한 다음, MegaBASE4000(Amersham Bioscience)를 사용하여 서열분석 하였다. 서열 데이터를 PHRAP(CAP4)에 의해 종 합 정리하고, 및 SiP189 유전자의 개시 메티오닌 부위로부터 시작하는 약 13 kb의 5'-서열을 포함하는 CONTIG 서열을 수득하였다.
SiP189 유전자의 5'-영역에서의 조절 시스-요소를 동정하기 위하여, SiP189 유전자(서열번호 74)의 개시 메티오닌으로부터 시작하는 약 3 kb의 5'-서열을 PLACE(http://www.dna.affrc.go.jp/PLACE/)에 의해 분석하였다. PLACE 분석에 의해 특이적 시그널에 반응을 보인 다수의 조절 시스-요소와 함께, 특이적 전사 인자 훼밀리에 대한 다수의 결합 부위가 동정되었다. 이러한 결과는 SiP189 유전자의 발현에 이들이 관여됨을 시사한다(도 9 및 도 10).
이후에, 피페리톨 및 세사민의 합성을 촉매하는 세사뭄 라디아툼-유래 효소를 암호화하는 SrSiP189 유전자의 조절성 비-해독 영역을 분리하였다. 세사뭄 라디아툼의 게놈 DNA를 주형으로 사용하여, 서열번호 75 및 76(각각 gSST-FWl 및 gSST-RV2)의 프라이머로 PCR을 수행하였다. 프라이머는 서열번호 74에 기재된 SiP189의 게놈 서열을 토대로 디자인하였다.
반응 혼합물은 1 ㎕의 게놈 DNA(50 ng), 1 x Ex-Taq 버퍼(TaKaRa), 0.2 mM dNTPs, 프라이머(각각 0.2 pmol/㎕), 및 1.25 U Ex-Taq 폴리머라제를 함유하였다. PCR은 94℃에서 5분간 수행한 다음, 94℃에서 1분간, 55℃에서 1분간, 및 72℃에서 4분간 30 사이클로 수행하였다. 최종적으로, 산물을 72℃에서 4분간 유지시켰다. 생성되는 단편을 전기영동한 다음, 약 3 kb의 단편을 수득하였다. 단편을 제조업자가 권장하는 방법에 따라 pCR-TOPO-XL 벡터(Invitrogen)의 다중 클로닝 부위에 삽입하였다. 그 결과, pSPB2664가 수득되었다. pSPB2664에 삽입된 단편의 전 뉴 클레오타이드 서열을 프라이머 워킹(primer walking)법에 의해 서열분석하였다. 그 결과, SrSiP189 유전자의 조절성 시스-요소를 포함하는 가능성 있는 서열인, SrSiP189 유전자(서열번호 77)의 5'-영역에서의 약 2.8 kb의 단편을 수득하였다. 동일한 PLACE 분석을 게놈 SiP189 유전자에서와 같이 수행하였다. 결과는 특이적 시그널에 반응을 보인 다수의 요소와 함께, 특이적 전사 인자 훼밀리에 대한 다수의 결합 부위를 동정하였다(도 11).
재배된 호마(세사뭄 인디쿰)에서 유래한 SiP189 유전자 및 세사뭄 라디아툼에서 유래한 SrSiP189 유전자를 Clustal-W 분석(MacVector ver. 7.2.2, Symantech)에 따라 DNA 수준에서 그들의 서열 동일성에 대해 시험하였다. 이들 유전자는 약 3 kb의 5'-비-암호화 영역에서 서열 동일성이 78%에 불과하였지만, 유전자의 ORF 영역에서는 현저히 높은 서열 동일성(96%)을 보였다(도 12). 이러한 결과는 SiP 189와 SrSiP189가 단백질 기능면에서는 고도로 보존되어 있지만 상이한 발현 패턴을 띠고 있다는 본 출원인의 발견을 지지하다. RT-PCR 분석 외에, 이들 시스-요소 분석은 두 리그난 생합성 유전자, 즉 세사뭄 인디쿰으로부터의 SiP189 및 세사뭄 라디아툼으로부터의 SrSiP189가 동일한 전사 조절하에 있지 않음을 지지한다.
실시예 12
세사뭄 알라툼(S. alatum)은 재배된 세사뭄 인디쿰과는 현저히 상이한(또한 형태에 있어서도) 아프리카산 야생 호마 종이다(Namiki et al., Science of sesame, Asakura Shoten). 세사뭄 알라툼의 염색체 수는 세사뭄 인디쿰, 2n = 26과 동일하며, 세사뭄 알라툼은 아프리카의 나이지리아, 수단, 및 모잠비크에서 지리적 분포를 보인다.
실시예 8에서 아프리카산 호마 세사뭄 라디아툼으로부터 SrSiP189 유전자를 분리하는 동일한 방법을 사용하여, SiP189의 카운터파트 유전자(SaSiP189)를 세사뭄 알라툼으로부터 분리하였다.
세사뭄 알라툼의 단계 4의 cDNA를 PCR을 위한 주형으로 사용하였다. 서열번호 61(Bam-SST-FW2) 및 서열번호 63(GR-SST-RV1)의 프라이머로 증폭시킨 약 1.5 kb의 단편을 pCR-blunt II TOPO(Invitrogen)에 서브클로닝 하였다. 삽입된 단편의 뉴클레오타이드 서열을 프라이머 워킹법에 의해 결정하였다. 서열번호 78은 SaSiP189의 아미노산 서열을 나타내고, 서열번호 79는 SaSiP189의 뉴클레오타이드 서열을 나타낸다.
SiP189와 비교하여, 생성되는 SaSiP189는 DNA 수준에서 90%의 서열 동일성을 나타내었고, 아미노산 수준에서는 86% 서열 상동성을 나타내었다. 이러한 결과는 리그난 생합성 효소의 유전자 SiP189가 지리적 격리 또는 형태학적/세포유전학적 차이가 존재함에도 고도로 보존된 유전자임을 나타낸다.
상기 상세한 설명에서 논의된 실행의 양태 및 구체적인 실시예는 본 발명의 기술적 세부사항을 설명하기 위한 것일 뿐, 그러한 양태 및 구체적 실시예의 제한범위 내로 협소하게 해석되지 않아야 하며, 본 발명의 사상 내에서 다양하게 변형이 가능할 수 있으며, 그러한 변형은 후술되는 특허청구범위의 범주를 초과하지 않 는다.
세사민에 대한 이전의 연구는 화합물의 다양한 생리 활성을 밝혀내었고, 세사민은 현재 광범위의 다양한 회복 효과를 보유하고 있는 것으로 알려져 있다. 본 발명은 피노레시놀로부터 피페리톨, 또는 피페리톨로부터 세사민의 생합성을 촉매하는 효소를 암호화하는 유전자를 동정하였다. 호마-유래 사이토크롬 P450 유전자(SiP 유전자)는 재조합 유기체를 이용한 세사민 및 피페리톨의 생산을 가능케 하고, 따라서 세사민 수율을 증가시키고 생산비를 감소시킨다.
전술한 바와 같이, 본 발명의 호마-유래 SiP189 유전자와 SrSiP189 유전자는 피노레시놀로부터 피페리톨, 및 피페리톨로부터 세사민의 생합성을 촉매하는 사이토크롬 P450을 암호화한다. 고대 이래로 중요한 식품원인 호마는 그의 종자, 종자유 및 종자 추출물을 포함하여 이용 가능한 가장 좋은 건강 식품 중 하나로서의 입지를 고수하고 있다. 호마가 제공하는 다양한 혜택 중에서, 이의 생리 활성이 수많은 연구자의 이목을 사로잡았다. 본 발명에 의해 동정된 SiP189 유전자 및 SrSiP189 유전자는 통상적으로 호마 종자에 전적으로 의존해 온 세사민 생산에 사용될 수 있다. 따라서, 본 발명은 세사민 수율의 증대에 매우 유망하다.
본 발명의 이들 장점과 기타 장점에 따라, 본 발명은 농업, 식품 산업, 제약산업, 및 이들 분야와 관련된 기타 모든 유관 산업에 유용하다.
서열목록제출서에 첨부하여 제출

Claims (21)

  1. 피노레시놀로부터 피페리톨을 생합성하는 반응, 피페리톨로부터 세사민을 생합성하는 반응, 또는 피노레시놀로부터 피페리톨을 생합성하는 반응 및 피페리톨로부터 세사민을 생합성하는 반응을 촉매하는 단백질을 암호화하고, 또한 서열번호 1에 나타난 아미노산 서열로 이루어진 단백질을 암호화하는 유전자.
  2. 삭제
  3. 삭제
  4. 삭제
  5. 개방 판독 프레임 영역으로서 서열번호 2의 염기 서열을 포함하는 유전자.
  6. 피노레시놀로부터 피페리톨을 생합성하는 반응, 피페리톨로부터 세사민을 생합성하는 반응, 또는 피노레시놀로부터 피페리톨을 생합성하는 반응 및 피페리톨로부터 세사민을 생합성하는 반응을 촉매하는 단백질을 암호화하고, 또한 서열번호 2에 나타난 염기 서열을 구비하는 폴리뉴클레오타이드로 이루어진 유전자.
  7. 제 1 항에 있어서, 상기 유전자는 호마로부터 유래되는 유전자.
  8. 특허청구범위 제1항의 유전자에 의해 암호화되는 단백질.
  9. 서열번호 1에 나타난 아미노산 서열로 이루어진 단백질.
  10. 특허청구범위 제8항 또는 제9항 기재의 단백질을 인식하는 항체.
  11. 특허청구범위 제1항의 유전자를 포함하는 재조합 발현 벡터.
  12. 특허청구범위 제1항의 유전자를 포함하는 재조합 발현 벡터를 포함하는 형질전환체.
  13. 특허청구범위 제12항의 형질전환체를 배양 또는 생육시키는 단계 및
    피노레시놀로부터 피페리톨을 생합성하는 반응, 피페리톨로부터 세사민을 생합성하는 반응, 또는 피노레시놀로부터 피페리톨을 생합성하는 반응 및 피페리톨로부터 세사민을 생합성하는 반응을 촉매하는 단백질을 상기 형질전환체로부터 수득하는 단계를 포함하는 단백질의 생산 방법.
  14. 특허청구범위 제1항의 유전자가 도입된 식물.
  15. 삭제
  16. 특허청구범위 제1항의 유전자를 숙주 식물에 도입하는 단계를 포함하는, 리그난을 함유하는 형질전환체의 생산 방법.
  17. 특허청구범위 제1항의 유전자를 숙주 식물에 도입하는 단계를 포함하는, 피페리톨, 세사민, 또는 피페리톨 및 세사민을 함유하는 식물의 생산 방법.
  18. 삭제
  19. 삭제
  20. 특허청구범위 제1항의 유전자를 숙주 식물에 도입하는 단계를 포함하는, 호마의 재배 방법.
  21. 삭제
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