JP2007506403A - 生物学的試料を試剤でパルスし、こうしてパルスされた試料を安定化するための装置、キット及び方法 - Google Patents
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Abstract
を有する。
【選択図】 なし
Description
核酸濃度、例えばmRNA濃度を監視することは、生物学的系での試剤の効果を直接的に確認する上で有用である。例えば、ある試剤をある生物学的系に所定の長さの時間にわたって導入した場合、その系のその試剤に対する反応は、mRNA濃度を測定することによって決定できる。このことは免疫性の監視にあたり有用であって、こういった場合、例えば、その試剤は抗原であり、かつ監視されるmRNAはサイトカインmRNA、例えばインターロイキンmRNAである。
本発明の目的は、生物学的試料を試剤に曝露し、このように曝露された試料中の核酸を安定化するための装置、キット及び方法を提供することである。
本発明の一実施態様は、液状の生物学的試料を収容し、その試料を第一の物質に曝露し、引き続き核酸安定化剤に曝露するのに適した容槽であって、
a)前記容槽内部に存在する第一の物質、
b)前記安定化剤が存在する容器、
c)前記容槽内部と前記容器内部との間の接続部、
d)前記接続部を一時的に遮断する物的障壁
を有する容槽である。
a)前記の個体から採取された血液試料をその容槽に導入する工程、
b)場合により前記容槽を撹拌する工程、
c)所定時間後に、前記の核酸安定化剤を該容槽中に導入する工程、及び
d)mRNA濃度を試験する工程
を含む方法である。
e)核酸を含む沈殿物を形成する工程、
f)工程(e)の前記の沈殿物を上清から分離する工程、
g)工程(f)の前記の沈殿物をバッファーを用いて溶解させて、懸濁液を形成させる工程、
h)工程(g)の前記の懸濁液から自動装置を用いて核酸を単離する工程、
i)自動装置を用いてRT−PCR用の試薬混合物を分散/分配する工程、
j)工程(h)で単離された核酸を自動装置を用いて工程(i)の分散された試薬混合物中に分散/分配する工程、及び
k)自動化された機構で工程(j)の核酸/RT−PCR試薬混合物を用いてインビボでの転写物濃度を測定する工程
を含む方法である。
a)前記の第一の物質が存在する容槽、及び
b)前記の試剤が存在する容器
を有するキットである。
本発明の一態様は、生物学的試料を収容するために適した容槽であって、所定量のパルス試剤を収容している容槽に関する。
i)前記の容槽中に生物学的試料を導入する工程、
ii)場合により前記容槽を撹拌する工程、
iii)所定の時間後に前記容槽中に安定化剤を導入する工程、及び
iv)その中の核酸濃度を試験する工程
を含む。
a)前記の個体から採取された血液試料をその容槽に導入する工程、
b)場合により前記容槽を撹拌する工程、
c)予定された時間後に、前記の核酸安定化剤を該容槽中に導入する工程、
d)サイトカインmRNA濃度を試験する工程
を含む方法である。
e)前記の個体から採取された血液試料をその容槽に導入する工程、
f)場合により前記容槽を撹拌する工程、
g)予定された時間後に、前記の核酸安定化剤を該容槽中に導入する工程、
h)IL−4 mRNA濃度を試験する工程
を含む方法である。
i)前記の個体から採取された血液試料をその容槽に導入する工程、
j)場合により前記容槽を撹拌する工程、
k)予定された時間後に、前記の核酸安定化剤を該容槽中に導入する工程、
l)IL−2 mRNA濃度を試験する工程
を含む方法である。
A)前記のキット、装置及び/又は方法を用いて、前記生物学的試料をパルス試剤でパルスし、そしてそこにinhibitingRNA分解及び/又は遺伝子誘導を阻害する化合物を添加する工程、
B)核酸を含有する沈殿物を形成する工程、
C)工程(B)の前記沈殿物を上清から分離する工程、
D)工程(C)の前記沈殿物をバッファーを用いて溶解させて、懸濁液を形成する工程、
E)工程(D)の前記懸濁液から自動化装置を用いて核酸を単離する工程、
F)自動装置を用いてRT−PCR用の試薬混合物を計量分配/分配する工程、
G)工程(E)で単離された核酸を自動装置を用いて工程(F)の計量分配された試薬混合物中に計量分配/分配する工程、及び
H)自動化された機構で工程(G)の核酸/RT−PCR試薬混合物を用いてインビボでの転写物濃度を測定する工程
を含む方法に関する。
− 自動化されたRNA単離のための試薬、
− 自動化された計量配分が可能な、RT反応とリアルタイムPCR反応の同時の反応のための試薬混合物又前記混合物の別個の化合物、
− 場合により、前記RT−PCR反応を実施するための特異的なオリゴヌクレオチド、及び
− 自動化されたRNA単離のための方法、試薬混合物とRT−リアルタイムPCRのための単離された核酸の自動化された計量配分のための方法並びに自動化されたRNA分析のための方法を説明する解説マニュアルを含んでよい。
(a)免疫調節剤を被検体に適用する工程、
(b)前記被検体から全血を採取する工程、
(c)工程(b)の全血試料中に存在する血液細胞を前記の装置を用いて、工程(a)で適用されたのと同一の/類似の及び/又は異なる免疫調節剤でパルスする工程、
(d)工程(c)のパルスされた血液細胞又は工程(b)のパルスされていない血液細胞を、RNA分解及び/又は遺伝子誘導を阻害する化合物を含有する管中に採集する工程又はパルスされた細胞/パルスされていない細胞に前記化合物を添加する工程、
(e)核酸を含有する沈殿物を形成させる工程、
(f)工程(e)の前記沈殿物を上清から分離する工程、
(g)工程(f)の前記沈殿物をバッファーを用いて溶解させて、懸濁液を形成させる工程、
(h)工程(g)からの前記懸濁液から自動化された装置を用いて核酸を単離する工程、
(i)RT−PCR用の試薬混合物を自動化された装置を用いて計量分配/分配する工程、
(j)工程(h)で単離された工程(i)の計量分配された試薬中の核酸を自動化された装置を用いて計量分配/分配する工程、
(k)エピトープ特異的なCTL関連転写物のインビボでの濃度を工程(j)の分配された溶液中で自動化された機構において検出/監視/分析する工程、及び
(l)前記被検体の免疫学的状態を調節できる試剤を同定する工程
を含み、工程(a)の試剤が既に被検体中に存在する場合には工程(a)を省く方法を説明している。また本発明は、少なくとも前記の工程(c)の実施を可能にする成分を含むキットに関する。該キットは、実施されるべき他の一工程以上を可能にする追加的な試薬及び解説書を含んでよい。本願になされる開示は、所望のキットを構成するのに必要な成分を熟練者に指示するものである。
(a)免疫調節剤を被検体に適用する工程、
(b)前記被検体から全血を採取する工程、
(c)工程(b)の全血試料中に存在する血液細胞を前記の装置又はキットを用いて、工程(a)で適用されたのと同一の/類似の及び/又は異なる免疫調節剤でパルスする工程、
(d)工程(c)のパルスされた血液細胞又は工程(b)のパルスされていない血液細胞を、RNA分解及び/又は遺伝子誘導を阻害する化合物を含有する管中に採集する工程又はパルスされた細胞/パルスされていない細胞に前記化合物を添加する工程、
(e)核酸を含有する沈殿物を形成させる工程、
(f)工程(e)の前記沈殿物を上清から分離する工程、
(g)工程(f)の前記沈殿物をバッファーを用いて溶解させて、懸濁液を形成させる工程、
(h)工程(g)からの前記懸濁液から自動化された装置を用いて核酸を単離する工程、
(i)RT−PCR用の試薬混合物を自動化された装置を用いて計量分配/分配する工程、
(j)工程(h)で単離された工程(i)の計量分配された試薬中の核酸を自動化された装置を用いて計量分配/分配する工程、
(k)免疫関連転写物のインビボでの濃度を工程(j)の分配された溶液中で自動化された機構において検出/監視/分析する工程、及び
(l)前記被検体の免疫学的状態を調節できる試剤を同定する工程
を含み、工程(a)の試剤が既に被検体中に存在する場合には工程(a)を省く方法に関する。
(a)前記被検体から全血を採取する工程、
(b)工程(a)の全血試料中に存在する血液細胞を前記の装置又はキットを用いて、被検体中に存在するのと同一の/類似の及び/又は異なる免疫調節剤でパルスする工程、
(c)工程(b)のパルスされた血液細胞を、RNA分解及び/又は遺伝子誘導を阻害する化合物を含有する管中に採集する工程又はパルスされた細胞に前記化合物を添加する工程、
(d)核酸を含有する沈殿物を形成させる工程、
(e)工程(d)の前記沈殿物を上清から分離する工程、
(f)工程(e)の前記沈殿物をバッファーを用いて溶解させて、懸濁液を形成させる工程、
(g)工程(f)からの前記懸濁液から自動化された装置を用いて核酸を単離する工程、
(h)RT−PCR用の試薬混合物を自動化された装置を用いて計量分配/分配する工程、
(i)工程(g)で単離された工程(h)の計量分配された試薬中の核酸を自動化された装置を用いて計量分配/分配する工程、
(j)免疫関連転写物のインビボでの濃度を工程(i)の分配された溶液中で自動化された機構において検出/監視/分析する工程、
(k)免疫関連転写物のインビボでの濃度の変化を検出/監視する工程、及び
(l)免疫系に影響を及ぼす疾病を診断/予知/監視する工程
を含む方法を提供する。
図1aから1dは本発明による容槽と方法の一例を表す。図1aは、抗原粒子2が存在する容槽1を示している。容槽は、注射針用の入口3の再封手段を備えている。容器4は容槽1の一部でもあり、その際、安定化剤5は該容器中に存在し、かつ容槽1の内側と容器4の内側との接続は一時的に物的障壁、この場合には栓25によって遮断されている。栓を外す物理力を伝える手段はプランジャー28の形で提供される。この実施例では、プランジャーは蓋23で覆われている。図1bでは、生物学的試料は容槽中に注射針6によって入口3の再封手段を通じて導入され、そしてその生物学的試料8は抗原2に曝露されうる。図1cでは、プランジャーの蓋23は取り除かれる26。図1dでは、シャフト7を導入し、そこに圧力が印加され27、こうしてプランジャー28を押して、栓25が容器4から押し出されている。栓25が取り除かれた後に、安定化剤5は容槽1中に放出され、そして生物学的試料8と抗原2とが混合されうる。
末梢血細胞によって合成されるサイトカインmRNAを定量すれば、"末梢免疫規則"を推測することができる筈である。しかしながら、正確な定量は、mRNAがヌクレアーゼ消化に対して保護され、かつ遺伝子転写が阻害されている新鮮な全血試料からのみ実施できる。この注記で論じられるように、このことは、シュウ酸テトラデシルトリメチルアンモニウムのような界面活性試薬の使用によって可能となった。末梢血中で自然産生されるIL−10とIFN−γのmRNAの定量のためのRT−PCRを実施した。その結果から、全血中のIFN−γ転写物濃度が、同じ個体からの末梢血単核細胞(PBMC)と比較して顕著に高い一方で、IL−10 mRNAについては大きな差は見られないことが判った。IFN−γ mRNAの量は血液中に観察される方が多いことの原因は、少なくともmRNA分解にあるとすることができる。リアルタイムPCR技術を用いて、血中IFN−γ mRNAが実際にインビトロで迅速に分解され、その際、t1/2は室温でほぼ1時間に相当することを実証できた。
"PAXgene(商標)Blood RNAシステム"とは、"PAXgene(商標)Blood RNA採血管"と"PAXgene(商標)Blood RNAキット"との組み合わせを意味する。"キアゲン法"とは、"PAXgene(商標)Blood RNAキット"を意味する。
全ての実験は、PAXgene(商標)Blood RNA採血管中にPAXgene(商標)Blood RNAシステム(キアゲン社)によって推奨されるように直接的に採集された(すなわち2.5mlの血液を、6.9mlの未知の試薬を含む管内に真空で採集した)末梢静脈血から実施した。溶解が完了した後に、管の内容物を他の2つの管に移した:4.7mlをPAXgene Blood RNAキットに使用し、そして0.4mlをMagNA Pure抽出に使用した。残りの溶解物は廃棄した。これらの2つの管を2000gで1分間遠心分離し、そして上清を棄てた。
次いで:
a)PAXgene(商標)Blood RNA採血管+PAXgene(商標)Blood RNAキット
核酸ペレットを、全RNA抽出のためのBR1バッファー中に溶解する前に対応する解説マニュアルで推奨されるように水中で洗浄した。PAXgene(商標)Blood RNAシステムの手順は以下のとおりである:血液試料(2.5ml)をPAXgene Blood RNA採血管中に採集し、そして所望であれば室温で貯蔵又は輸送してもよい。RNA単離は、PAXgene Blood RNA採血管中で遠心分離をして、核酸をペレットにすることから始まる。そのペレットを洗浄し、そしてプロテイナーゼKを添加して、タンパク質消化を引き起こす。アルコールを添加して、結合条件を調整し、そして試料をPAXgene(商標)Blood RNAキットにより提供されるスピンカラムにかける。簡単な遠心分離の間に、RNAはPAXgene(商標)Blood RNAキットによって提供されるシリカゲルメンブレンに選択的に結合して、夾雑物は通過する。洗浄工程に引き続き、RNAを最適化されたバッファーで溶出させる。逆転写とリアルタイムPCRをIFN−γとβ−アクチンのmRNAについて、Stordeur他によって記載されるように("Cytokine mRNA Quantification by Real Time PCR" J Immunol Methods, 259 (1-2): 55-64, 2002)実施した。
b)PAXgene (商標) Blood RNA採血管++MagNA Pure LC mRNA単離キットI
核酸ペレットをMagNA Pure mRNA単離キットからの溶解バッファー300μl中に溶解させた。次いで、最終溶出容量100μl中のmRNAの抽出及び精製を、MagNA Pure LCインストルメントにおいてロシュ・ダイアグノスティクス,モレキュラーバイオケミカルズ社による解説に従って実施した。
キアゲン社によって推奨される抽出法に、PAXgene(商標)Blood RNA採血管を組み合わせたもの(PAXgene(商標)Blood RNAシステム)と、MagNA Pure LCインストルメント抽出法にまたPAXgene(商標)Blood RNA採血管を組み合わせたものとの比較を実施した。両方の方法で、PAXgene(商標)Blood RNA採血管の使用は、血液細胞由来のRNAの安定化を可能にする。結果を表1.1と表1.2に列記する。この試験結果は、MagNA Pure LC技術について再現性がより良好であることを示している(β−アクチンに対して補正されたIFN−γ mRNAコピー数についての変動係数はキアゲンとMagNA Pure LCそれぞれについて26%と16%である)。
実施例2は、PAXgene(商標)Blood RNA採血管にMagNA Pure LC mRNA単離キットIを組み合わせて使用できること、又はより厳密には、PAXgene(商標)Blood RNA採血管からの沈殿物を前記キットに含まれ、必要に応じて該キットの他の成分と一緒に使用されるべきである溶解バッファー中に溶解させることができることを説明している。
実施例3では、血液を、血液ドナーが免疫化されたと推測(それというのも7年前に種痘を受けたため)される抗原(すなわち破傷風毒素)によりエクスビボで刺激する。RT−PCRは方法(図12.1)に従って実施する。サイトカインmRNAは、ボランティアの免疫系が抗原に対して反応する能力の読出値として測定する。IL−2、IL−4、IL−13及びIFN−γのmRNAを優先的に分析するが、全ての潜在的に反応性のタンパク質はそれらに対応するmRNAの定量を介して分析することができる。実施例3の結果を図15に示す。一般に、この実施例で以下に挙げる手法は図12.2に示されるように図示することができる。
数年来、癌免疫療法での基礎的な手法は種痘として発展した。事実、遺伝学と免疫学での進歩は、腫瘍細胞表面に発現される腫瘍抗原を数多く同定することを可能にした。これらの抗原は、主要組織適合複合体(HLA)に会合するペプチドの形として腫瘍細胞表面に提示される。腫瘍抗原として考慮される抗原の例は、FongとEngleman(Annu. Rev. Immunol. 2000. 18:245-273)によって記載されている。抗癌ワクチン接種の原理は、最も免疫原性の様式で患者の免疫系に免疫を提示することからなる。これは、抗原又は相応のペプチドを添加剤の存在で注射して、ペプチドを自己抗原提示細胞(例えば樹状細胞)上に提示させることとなる。ワクチン接種、つまり抗癌ワクチン接種の最終的な目標は腫瘍の退縮にあるが、抗癌ワクチン接種の効率の決定は、限られた治療窓からしか恩恵を受けることができない疾病の進行した段階の患者の場合には特に困難なままである。抗癌ワクチン接種がアジュバント療法として又は予防の枠組みにおいて関心が持たれているのは、そういった理由からである。従って、高感度で正確な監視技術を開発して、実験的な抗癌ワクチン接種の免疫学的効果を評価し、これらのワクチンの投与方法を規定し、かつ将来の治療法の規定により良い支援をなしうる暗黙の生物学的機構を見いだすことが極めて重要である。これらのワクチンの免疫学的効率を測定する困難性は、事実上、インビボでの細胞性免疫応答を感知するのに十分なアッセイが存在しないことにある。今までに、使用された技術は、患者のPBMCの激しいインビトロでの培養を長時間にわたり抗原の存在で、かつリンパ球の本来の機能的特性の変更が誘発されやすい同時刺激の存在で行うことを包含していた。こうして、腫瘍抗原に対するリンパ球前駆体のアネルギー状態又は寛容状態の分析は極めて困難であり、抗原の存在においてインビトロで延長してインキュベートした後にそれらの機能的状態の可逆的性質が与えられる。他方で、低頻度のエピトープ特異的CTL前駆体を検出するために使用されるMHCペプチド複合体の四量体を基礎とした手法は通常、腫瘍特異的リンパ球の検出についての感度に欠いている。更にこれらの技術はこれらのリンパ球の機能的反応性についての情報を何ら提供しない。
実施例4では、ドナー由来の器官(例えば肝臓、腎臓、骨髄など)をレシピエントに移植する。レシピエントの全血を、RNA分解及び/又は遺伝子誘導を阻害する本発明による化合物を含有する管中に採集する。RT−PCRはその方法に従って実施する。サイトカインmRNAは、ドナーの組織適合抗原によるレシピエントの免疫系の活性化の読出値として測定する(図12.3)。
実施例5では、ドナー由来の器官(例えば肝臓、腎臓、骨髄など)をレシピエントに移植する。レシピエントの全血を管に採集し、そしてエクスビボでドナーの組織適合抗原と一緒にインキュベートする。その血液にRNA分解及び/又は遺伝子誘導を阻害する本発明による化合物を添加する。RT−PCRはその方法に従って実施する。サイトカインmRNAは、ドナーの組織適合抗原によるレシピエントの免疫系の応答の読出値として測定する(図12.4)。
移植片の拒否の監視は、事実上、患者の尿又は血液中に測定されるマーカーの検出(腎臓移植片の場合には血中尿素窒素(BIN)又はクレアチニン)に基づくか、又は移植された器官の生検の時点である。これらの指標はしかしながら、拒否機構が既に十分に進行している場合にのみ検出される。事実、移植片拒否は、移植された器官の変質に先行する免疫学的機構の結果である。これらの免疫学的機構を移植された器官が損傷される前に検出することで、より早い段階で免疫抑制的治療を適応させることによって移植された器官の損失をかなり低減することができる。他方でまた、拒否の非顕性エピソード(臨床兆候を誘発せずに)はしばしば移植後に発生することも認められている。これらのエピソード、つまり非顕性の拒否エピソードは慢性拒否の原因となりえる。数人の著者は、器官拒否の早発性の免疫学的マーカーの検出と、特にドナーのアロ抗原に対するレシピエントのアロ反応性Tリンパ球の血行における検出を調査している。これらの方法では、混合培養し、被移植者のリンパ球の増殖の連続的な測定又はサイトカインの産生の測定を種々の方法(ELISA、ELISPOT、フローサイトメトリーなど)によって行うことが本質的に含む。より最近では、他の著者が、早発的な拒否機構のトリガリングを明白に示すために、リンパ球活性化マーカーのパターンのキャラクタリゼーションに注目した。細胞毒性活性化Tリンパ球、つまり活性化Tによって発現される遺伝子のmRNA(グランザイムB、パーフォリン、種々のサイトカイン)を定量的PCRの高感度な方法によって検出することが、拒絶のトリガリングの測定に優れたツールであることが示された。このために、本発明によれば、様々な種類のサイトカインをコードするメッセンジャーが研究され、有利なターゲットはIL−2、IFN−γ、IL−4、IL−5、グランザイム、パーフォリン及びFasFasリガンドであってよい。
実施例6では、全血法が記載され、これによりmRNA濃度におけるサイトカイン合成の誘導を測定することが可能となる。この方法の独自性は、採血用のmRNA安定化剤を含有するPAXgene(商標)採血管と、mRNA抽出並びにRT−PCR試薬混合物調製のための自動化された装置としてのMagNA Pure(商標)インストルメントと、転写物濃度の正確かつ再現可能な定量のためのLightcycler(商標)でのリアルタイムPCR方法論との組み合わせにある。この実施例でまず実証されることは、細菌性リポ多糖類(LPS)を全血に添加するとIL(インターロイキン)−1β及びIL−1受容体アンタゴニスト(IL−1 RA)のmRNAが誘導されることを測定するのには本方法が適していることである。更にまたこの実施例では、破傷風毒素と一緒にインキュベートした全血中にT細胞由来のサイトカインをコードするmRNAが産生することを、想起抗原に対するインビトロでの免疫応答のモデルとして検出するのに、このアプローチが適していることが実証される。最後に、本実施例は、この方法が炎症性並びにインビボでのT細胞応答を評価するのに効果的に使用できることを実証しており、それは健康なボランティアにおけるLPSの注射後にIL−1β及びIL−1 RAの誘導を検出でき、また破傷風ワクチンによる想起免疫化後にIL−2の誘導も検出できたからである。
インビボでの研究のための採血。末梢血mRNA濃度の正確な定量のために、2.5mlの血液試料を、迅速な細胞溶解と核酸沈殿のためにPAXgene(商標)採血管中に採取した。そのmRNAは前記血液溶解物中で5日まで安定であり、その際、該管はmRNA抽出までは室温に保たれる。
最後の破傷風毒素ワクチン接種が少なくとも5年前である健康なボランティア(2人の男性、4人の女性、27〜53歳)に筋内ワクチン想起(Tevax、スミスクライン・ビーチャム・バイオロジカルズ社、Rixensart,ベルギー)を行った。ヘパリン処理された血液を投与日の14日前、そして投与日の3日後、7日後、14日後、21日後、90日後に採取した。200μlの血液を37℃で5%のCO2雰囲気において10μg/mlの破傷風毒素(フランス、リオンのアベンティスパスツールのE.Trannoy博士からの寄贈)と一緒に又はそれを含まずに20時間にわたりインキュベートした。
全血に細菌性LPSを添加した後のIL−1βとIL−1 RAのmRNAの測定
図16で実証されるように、全血にLPS(10ng/ml)を添加することにより、IL−1βとIL−1 RAのmRNAの迅速な誘導がもたらされる。この誘導はLPS添加の30〜60分後に既に明らかであり、6時間後にはIL−1βとIL−1 RAのそれぞれについてmRNA濃度は44倍と22倍に増大した。この曲線型は、両方のサイトカインmRAN量の迅速かつ持続性の増大を示唆している。mRNA定量化のための系の精度を評価するために、mRNAを、20〜200μlの種々の容量のLPS刺激された全血からβ−アクチンとIL−1βについて定量した。図17に示されるように、β−アクチンとIL−1βの両方のmRNAコピー数は実際に、開始血液量と直接的に相関を示した。
リアルタイムPCRがそう呼ばれるのは、増幅産物の蓄積をPCR過程の間に、PCR産物に結合する発光源分子を用いて追跡できるからである。これにより、各試料についての蛍光曲線が作成され、そこから試料の(c)DNAコピー数を、較正された標準で得られた蛍光曲線と比較することによって測定することができる。特異性を高めるために、その発光原分子は2つのプライマー間に位置するPCR産物の配列と相補性のオリゴヌクレオチドであってよい。本明細書に記載される新規の方法は、先行技術の方法を用いては不可能であった生物学的試料中の核酸を高感度かつ正確に定量する方法を提供する。本明細書は、これを、インビボでの状況を表す精製された細胞又は組織からサイトカインmRNAを定量することによって説明している。
この実施例で採用される手法を図21にまとめる。該系の精度を説明するために、出発細胞数に対するmRNAコピー数の線形回帰を計算した(図22)。mRNAを、様々な数の末梢血単核細胞(PBMC)(100000〜600000細胞の範囲、X軸)から抽出し、そしてβ−アクチンmRNAについて一工程のRT−リアルタイムPCRを本実施例6の"材料と方法"部で記載されるように実施した。この試験をPBMCからβ−アクチンとTNF−αのmRNAについて繰り返し(図23、パネルBとD)、そして全血から(図23、パネルA)、そしてCD4+の精製T細胞から(図23、パネルC)β−アクチンmRNAについて繰り返した。
この実施例で採用される手法を図21にまとめる。その方法を、癌ワクチンによって誘発される免疫応答の監視に適用した。図24、25及び26は、この現場で黒色腫患者に関して得られた結果を示している。
この実施例で採用される手法を図21にまとめる。次いでその方法をアレルギーに適用した。アレルギーがある被検体の全血を関連のアレルゲンと一緒にインビトロでインキュベートすることによって誘発された応答を、リアルタイムPCRを用いたIL−4 mRNA定量化によって分析した。図27、28、29及び30はこの現場で得られた結果を示す。
この実施例で採用される手法を図21にまとめる。次いでその方法を自己免疫性に適用した。この全血系を用いたIL−2 mRNA定量化を適用して、グルタミン酸デカルボキシラーゼ65(GAD65)、つまり自己免疫性1型糖尿病における自己反応性T細胞の標的である自己抗原に対するT細胞応答を評価した。図31及び32はこの現場で得られた結果を示す。
この実施例で採用される手法を図21にまとめる。次いでその方法を移植に適用した。アロ反応性の非T細胞と一緒に全血をインキュベートした後にリアルタイムPCRを行うことによるIL−2 mRNA定量化によって、アロ反応性のT細胞応答を監視する古典的な混合リンパ球反応(MLR)の代替がもたらされる。図33及び34はこの現場で得られた結果を示す。
Claims (61)
- 液状の生物学的試料を収容し、その試料を第一の物質に曝露し、引き続き核酸安定化剤に曝露するのに適した容槽であって、
a)前記容槽内部に存在する第一の物質、
b)前記安定化剤が存在する容器、
c)前記容槽内部と前記容器内部との間の接続部、
d)前記接続部を一時的に遮断する物的障壁
を有する容槽。 - 第一の物質がその容槽の内表面上の一部又は全てに固定化されている、請求項1記載の容槽。
- 前記の第一の物質が固体担体上に固定化されている、請求項1記載の容槽。
- 前記の第一の物質が液体である、請求項1記載の容槽。
- 前記の第一の物質が固体である、請求項1記載の容槽。
- 注射針による穿刺に適した1つ又はそれ以上の領域を有する、請求項1から5までのいずれか1項記載の容槽。
- 前記の領域が再封可能な隔壁である、請求項1から6までのいずれか1項記載の容槽。
- 注射器を収容し、かつその内容物を前記容槽の内部に送出するのに適した取付具を有する、請求項1から7までのいずれか1項記載の容槽。
- 注射針を収容するのに適した取付具を有する、請求項1から8までのいずれか1項記載の容槽。
- 体液を採取するのに適したカニューレを有する、請求項1から9までのいずれか1項記載の容槽。
- 容槽からの気体/液体の流出を最小限にすることができ、かつ容槽中への液状の生物学的試料の流入を可能にする弁を有する、請求項1から10までのいずれか1項記載の容槽。
- 排気を通過させて放出できる手段を有する、請求項1から11までのいずれか1項記載の容槽。
- 容槽が負圧下に保持されている、請求項1から12までのいずれか1項記載の容槽。
- 項目d)の物的障壁が、容槽に物理力をかけることによって開放される、請求項1から13までのいずれか1項記載の容槽。
- 前記の力が開放手段を前記物的障壁に送る、請求項14記載の容槽。
- 前記の力が不可逆的に前記物的障壁を開放する、請求項14又は15記載の容槽。
- 容槽中の安定化剤の既知の容量を計量分配するための標示を有する、請求項1から16までのいずれか1項記載の容槽。
- 前記の第一の物質が1種又はそれ以上の免疫系抗原を含む、請求項1から17までのいずれか1項記載の容槽。
- 前記の免疫系抗原がワクチン成分である、請求項18記載の容槽。
- 前記の免疫系抗原が過剰アレルゲン性応答を誘発する抗原である、請求項18記載の容槽。
- 前記の免疫系抗原が、組織適合抗原、細菌性LPS、破傷風毒素、癌免疫療法抗原、MAGE−3、ネコアレルゲン、Feld1、器官ドナー由来の抗原提示細胞、自己抗原、GAD65から選択される1種又はそれ以上である、請求項18記載の容槽。
- 前記の安定化剤が細胞性RNA分解及び/又は遺伝子誘導の阻害剤である、請求項1から21までのいずれか1項記載の容槽。
- 前記の細胞性RNA分解及び/又は遺伝子誘導の阻害剤がPAXgene(商標)Blood RNA採血管中に存在する、請求項22記載の容槽。
- 血液試料を抗原でパルスし、引き続き該試料中での細胞性RNA分解及び/又は遺伝子誘導を阻害し、その後にこのようにパルスされ安定化された血液試料中のRNA成分を試験する方法であって、請求項1から23までのいずれか1項記載の容槽を使用することを特徴として含む方法。
- 抗原に対する個体の免疫応答を試験するにあたり、請求項1から23までのいずれか1項記載の容槽を使用し、第一の物質を調査対象の抗原とする方法であって、以下の工程
a)前記の個体から採取された血液試料をその容槽に導入する工程、
b)任意に前記容槽を撹拌する工程、
c)所定時間後に、前記の核酸安定化剤を該容槽中に導入する工程、及び
d)mRNA濃度を試験する工程
を含む方法。 - 工程d)が更に、以下の工程、
e)核酸を含む沈殿物を形成する工程、
f)工程(e)の前記沈殿物を上清から分離する工程、
g)工程(f)の前記沈殿物をバッファーを用いて溶解し、懸濁液を形成させる工程、
h)工程(g)の前記懸濁液から自動装置を用いて核酸を単離する工程、
i)自動装置を用いてRT−PCR用の試薬混合物を分散/分配する工程、
j)工程(h)で単離された核酸を自動装置を用いて工程(i)の分散された試薬混合物中に分散/分配する工程、及び
k)自動化された機構で工程(j)の核酸/RT−PCR試薬混合物を用いて転写物のインビボ濃度を測定する工程
を含む、請求項25記載の方法。 - 個体を予備免疫した抗原に対する個体の免疫応答を試験するにあたり、第一の物質が調査対象の抗原であり、かつサイトカインmRNAの濃度を試験する、請求項25及び26記載の方法。
- サイトカインがIL−2、IL−4、IL−13、IFN−γの1種又はそれ以上である、請求項27記載の方法。
- 個体の抗原に対する過剰アレルゲン性を試験するにあたり、第一の物質が調査対象の抗原であり、かつIL−4 mRNAの濃度を試験する、請求項25及び26記載の方法。
- 個体の器官移植片の抗原に対する拒絶反応を試験するにあたり、第一の物質がドナーの組織適合抗原であり、そしてIL−2 mRNAの濃度を試験する、請求項25及び26記載の方法。
- 血液試料を抗原でパルスし、引き続き該試料中での細胞性RNA分解及び/又は遺伝子誘導を阻害し、その後にこのようにパルスされ安定化された血液試料中のRNA成分を試験するための、請求項1から23までのいずれか1項記載の容槽の使用。
- 所定容量の血液試料を個体から前記の針又はカニューレを用いて抜き取り、前記試料を抗原でパルスし、引き続き該試料中での細胞性RNA分解及び/又は遺伝子誘導を阻害し、その後にこのようにパルスされた安定化された血液試料中のRNA成分を試験するための、請求項13から23までのいずれか1項記載の容槽の使用。
- 液状の生物学的試料を第一の物質でパルスし、引き続いてそこに細胞性RNA分解及び/又は遺伝子誘導を阻害する試剤を導入し、そしてこのようにパルスされ安定化された血液試料中のmRNA成分を試験するのに適したキットであって、ここで、該キットは、
a)前記の第一の物質が存在する容槽、及び
b)前記の試剤が存在する容器
を有する。 - 前記の容槽内部と前記の容器内部とが接続されており、かつ物的障壁が一時的に前記接続部を遮断する、請求項33記載のキット。
- 前記の第一の物質がその容槽の内表面上の一部又は全てに固定化されている、請求項33及び34記載のキット。
- 前記の第一の物質が固体担体上に固定化されている、請求項33から35までのいずれか1項記載のキット。
- 前記の第一の物質が液体である、請求項33及び34のいずれかに記載のキット。
- 前記の第一の物質が固体である、請求項33及び34のいずれかに記載のキット。
- 前記の容槽が1つ又はそれ以上の開口部を有する、請求項33から38までのいずれか1項記載のキット。
- 前記容槽が注射針による穿刺に適した1つ又はそれ以上の領域を有する、請求項33から39までのいずれかに記載のキット。
- 前記の領域が再封可能な隔壁である、請求項40のいずれかに記載のキット。
- 前記容槽が、注射器を収容し、かつその内容物を容槽内部に送出するために適した1つ又はそれ以上の取付具を有する、請求項33から41までのいずれか1項記載のキット。
- 前記の容槽が皮下注射針を収容するのに適した1つ又はそれ以上の取付具を有する、請求項33から42までのいずれか1項記載のキット。
- 前記の容槽が体液を採取するのに適した1つ又はそれ以上のカニューレを有する、請求項33から43までのいずれかに記載のキット。
- 前記の容槽が、容槽からの液体の流出を最小限にすることができ、容槽からの又は容槽中への気体の流出又は流入を最小限にすることができ、かつ/又は容槽中への液状の生物学的試料の流入を可能にする1つ又はそれ以上の弁を有する、請求項33から44までのいずれかに記載のキット。
- 前記の容槽が排気を通過させて放出できる1つ又はそれ以上の手段を有する、請求項33から45までのいずれかに記載のキット。
- 前記の容槽が負圧下に保持されている、請求項33から46までのいずれか1項記載のキット。
- 項目d)の物的障壁が、前記の容槽に物理力をかけることによって開放される、請求項33から47までのいずれかに記載のキット。
- 前記の力が開放手段を前記物的障壁に送る、請求項48記載のキット。
- 前記の力が不可逆的に前記物的障壁を開放する、請求項48及び49記載の容槽。
- 前記の容槽及び/又は容器が容槽中の安定化剤の既知の容量を計量分配するための標示を有する、請求項33から50までのいずれかに記載のキット。
- 前記の第一の物質が1種又はそれ以上の免疫系抗原を含む、請求項33から51までのいずれかに記載のキット。
- 前記の免疫系抗原がワクチン成分である、請求項52記載のキット。
- 前記の免疫系抗原が過剰アレルゲン性応答を誘発する抗原である、請求項52記載のキット。
- 前記の免疫系抗原が、組織適合抗原、細菌性LPS、破傷風毒素、癌免疫療法抗原、MAGE−3、ネコアレルゲン、Feld1、器官ドナー由来の抗原提示細胞、自己抗原、GAD65から選択される1種又はそれ以上のものである、請求項52記載のキット。
- 前記の細胞性RNA分解及び/又は遺伝子誘導の阻害剤がPAXgene(商標)Blood RNA採血管中に存在する、請求項55から55までのいずれかに記載のキット。
- 個体が予備免疫される抗原に対する個体の免疫応答を試験するためのキットであって、第一の物質が調査対象の抗原であり、かつ試験されるmRNAがサイトカインmRNAである請求項33から56までのいずれかに記載のキット。
- サイトカインがIL−2、IL−4、IL−13、IFN−γの1種又はそれ以上である、請求項57記載のキット。
- 個体を抗原に対する過剰アレルゲン性について試験するためのキットであって、第一の物質が調査対象の抗原であり、かつ試験されるmRNAがIL−4 mRNAである請求項33から56までのいずれかに記載のキット。
- 個体を器官移植片の拒絶反応について試験するためのキットであって、第一の物質がドナーの組織適合抗原であり、かつ試験されるmRNAがIL−2 mRNAである請求項33から56までのいずれかに記載のキット。
- 更に前記のmRNAを試験するのに適した1種又はそれ以上のオリゴヌクレオチドを含む、請求項33から60までのいずれかに記載のキット。
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