JP2007300926A - 短干渉核酸(siNA)を用いるアルツハイマー病のRNA干渉媒介性治療 - Google Patents
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Abstract
【解決手段】ベータ−セクレターゼ(BACE),アミロイド前駆体蛋白質(APP),pin−1,プレセニリン1(PS−1)および/またはプレセニリン2(PS−2)遺伝子の発現および/または活性に対するRNA干渉(RNAi)を媒介しうる小核酸分子,例えば,短干渉核酸(siNA),短干渉RNA(siRNA),二本鎖RNA(dsRNA),マイクロRNA(miRNA),および短ヘアピンRNA(shRNA)分子及びその使用。該小核酸分子はアルツハイマー病およびBACE,APP,pin−1,PS−1および/またはPS−2の発現または活性の調節に応答する他の任意の病気の治療において有用である。
【選択図】なし
Description
シンセターゼのdsRNA媒介性活性化の結果リボヌクレアーゼLによるmRNAの非特異的切断が生ずるインターフェロン応答とは異なるようである。
al.,2001,Science,293,834)。RNAi応答はまた,一般にRNA誘導性サイレンシング複合体(RISC)と称されるエンドヌクレアーゼ複合体を特徴とし,これはsiRNAデュープレックスのアンチセンス鎖に相補的な配列を有する一本鎖RNAの切断を媒介する。標的RNAの切断は,siRNAデュープレックスのアンチセンス鎖に相補的な領域の中央部で生ずる(Elbashir et al.,2001,Genes Dev.,15,188)。
,20,6877)。さらに,Elbashirら(上掲)はまた,siRNAを2’−O−メチルヌクレオチドで置換すると,RNAi活性が完全に破壊されたことを報告する。Liら(国際公開WO00/44914)およびBeachら(国際公開WO01/68836)は,siRNAがリン酸−糖骨格またはヌクレオシドのいずれかに窒素またはイオウ複素原子の少なくとも1つを含むよう修飾することができることを予備的に示唆する。しかし,いずれの出願も,siRNA分子においてそのような修飾がどの程度許容されるかを仮定しておらず,そのような修飾siRNAのそれ以上の指針または実例を提供していない。Kreutzerら(カナダ特許出願2,359,180)もまた,dsRNAコンストラクトにおいて二本鎖RNA依存性蛋白質キナーゼPKRの活性化を妨げる目的で用いるためのある種の化学的修飾,特に2’−アミノまたは2’−O−メチルヌクレオチド,および2’−Oまたは4’−Cメチレン架橋を含むヌクレオチドを記載する。しかし,Kreutzerらも同様に,siRNA分子においてこれらの修飾がどの程度許容されるかについての実例または指針を提供していない。
elloら(国際公開WO01/29058)は,dsRNA媒介性RNAiに関与する特定の遺伝子の同定を記載する。Deschamps Depailletteら(国際公開WO99/07409)は,ある種の抗ウイルス剤と組み合わせた特別のdsRNA分子からなる特定の組成物を記載する。Waterhouseら(国際公開99/53050)は,ある種のdsRNAを用いて植物細胞における核酸の表現型の発現を減少させるある種の方法を記載する。Driscollら(国際公開WO01/49844)は,標的生物において遺伝子サイレンシングを促進するのに用いるための特定のDNAコンストラクトを記載する。
本発明は,小核酸分子,例えば,短干渉核酸(siNA),短干渉RNA(siRNA),二本鎖RNA(dsRNA),マイクロRNA(miRNA),および短ヘアピンRNA(shRNA)分子を用いるRNA干渉(RNAi)によりBACE発現を調節するのに有用な化合物,組成物,および方法に関する。本発明はまた,小核酸分子,例えば,短干渉核酸(siNA),短干渉RNA(siRNA),二本鎖RNA(dsRNA),マイクロRNA(miRNA),および短ヘアピンRNA(shRNA)分子を用いるR
NA干渉(RNAi)により,BACE遺伝子,または遺伝子発現のBACE経路に関与する遺伝子の発現および活性および/またはBACE活性を調節するのに有用な化合物,組成物,および方法に関する。特に,本発明は,BACE遺伝子の発現を調節するのに用いられる小核酸分子,例えば,短干渉核酸(siNA),短干渉RNA(siRNA),二本鎖RNA(dsRNA),マイクロRNA(miRNA),および短ヘアピンRNA(shRNA)分子および方法を特徴とする。本発明のsiNAは,修飾しなくてもよく,化学的に修飾してもよい。本発明のsiNAは,化学的に合成してもよく,ベクターから発現させてもよく,酵素的に合成してもよい。本発明はまた,RNA干渉(RNAi)により細胞におけるBACE遺伝子の発現または活性を調節しうる種々の化学的に修飾された合成短干渉核酸(siNA)分子を特徴とする。化学的に修飾されたsiNAを使用することにより,インビボでのヌクレアーゼ分解に対する耐性の増加,および/または細胞取り込みの改良のため,天然のsiNA分子の種々の特性が改良される。さらに,初期に発表された研究に反して,多くの化学的修飾を有するsiNAはそのRNAi活性を保持している。本発明のsiNA分子は,種々の治療,診断,標的評価,ゲノム発見,遺伝子工学,およびファーマコゲノミクスの用途に有用な試薬および方法を提供する。
チド配列と相互作用することができ,このことによりBACE遺伝子発現のサイレンシングを媒介することができるヌクレオチド配列を含み,ここで,siNAは,例えば,BACE遺伝子のクロマチン構造を調節し,BACE遺伝子の転写を防止する細胞プロセスによりBACE遺伝子発現の制御を媒介する。
ドを有するアンチセンス領域を含み,ここで,アンチセンス領域はBACE蛋白質をコードするRNA配列に相補的であり,前記siNAはさらに約19−約29ヌクレオチドを有するセンス領域を含み,ここで,前記センス領域および前記アンチセンス領域は,少なくとも約19の相補的ヌクレオチドを有する直鎖状分子を含む。
RNA配列にユニークである配列を標的とするよう設計することができる。
酸(siNA)分子を特徴とし,ここで,化学的修飾は,式I:
各R1およびR2は,独立して,任意のヌクレオチド,非ヌクレオチド,またはポリヌクレオチドであり,これは天然に生ずるものであっても化学的に修飾されたものでもよく,各XおよびYは,独立して,O,S,N,アルキル,または置換アルキルであり,各ZおよびWは,独立して,O,S,N,アルキル,置換アルキル,O−アルキル,S−アルキル,アルカリール,またはアラルキルであり,W,X,Y,およびZは任意に全てOでなくてもよい]
を有する骨格修飾ヌクレオチド間結合を含む,1またはそれ以上(例えば,約1,2,3,4,5,6,7,8,9,10個またはそれ以上)のヌクレオチドを含む。
各R3,R4,R5,R6,R7,R8,R10,R11およびR12は,独立して,H,OH,アルキル,置換アルキル,アルカリールまたはアラルキル,F,Cl,Br,CN,CF3,OCF3,OCN,O−アルキル,S−アルキル,N−アルキル,O−アルケニル,S−アルケニル,N−アルケニル,SO−アルキル,アルキル−OSH,アルキル−OH,O−アルキル−OH,O−アルキル−SH,S−アルキル−OH,S−アルキル−SH,アルキル−S−アルキル,アルキル−O−アルキル,ONO2,NO2,N3,NH2,アミノアルキル,アミノ酸,アミノアシル,ONH2,O−アミノアルキル,O−アミノ酸,O−アミノアシル,ヘテロシクロアルキル,ヘテロシクロアルカリール,アミノアルキルアミノ,ポリアルキルアミノ,置換シリル,または式1を有する基であり;R9は,O,S,CH2,S=O,CHF,またはCF2であり,Bは,ヌクレオシド塩基,例えば,アデニン,グアニン,ウラシル,シトシン,チミン,2−アミノアデノシン,5−メチルシトシン,2,6−ジアミノプリン,または標的RNAに相補的であっても相補的でなくてもよい他の任意の天然に生じない塩基,または非ヌクレオシド塩基,例えば,フェニル,ナフチル,3−ニトロピロール,5−ニトロインドール,ネブラリン,ピリドン,ピリジノン,または標的RNAに相補的であっても相補的でなくてもよい他の任意の天然に生じない万能塩基である]
を有する1またはそれ以上(例えば,約1,2,3,4,5,6,7,8,9,10個またはそれ以上)のヌクレオチドまたは非ヌクレオチドを含む。
各R3,R4,R5,R6,R7,R8,R10,R11およびR12は,独立して,H,OH,アルキル,置換アルキル,アルカリールまたはアラルキル,F,Cl,Br,CN,CF3,OCF3,OCN,O−アルキル,S−アルキル,N−アルキル,O−アルケニル,S−アルケニル,N−アルケニル,SO−アルキル,アルキル−OSH,アルキル−OH,O−アルキル−OH,O−アルキル−SH,S−アルキル−OH,S−アルキル−SH,アルキル−S−アルキル,アルキル−O−アルキル,ONO2,NO2,N3,NH2,アミノアルキル,アミノ酸,アミノアシル,ONH2,O−アミノアルキル,O−アミノ酸,O−アミノアシル,ヘテロシクロアルキル,ヘテロシクロアルカリール,アミノアルキルアミノ,ポリアルキルアミノ,置換シリル,または式1を有する基であり;R9は,O,S,CH2,S=O,CHF,またはCF2であり,Bは,ヌクレオシド塩基,例えば,アデニン,グアニン,ウラシル,シトシン,チミン,2−アミノアデノシン,5−メチルシトシン,2,6−ジアミノプリン,または標的RNAに相補的であっても相補的でなくてもよいように用いることができる他の任意の天然に生じない塩基,または非ヌクレオシド塩基,例えば,フェニル,ナフチル,3−ニトロピロール,5−ニトロインドール,ネブラリン,ピリドン,ピリジノン,または標的RNAに相補的であっても相補的でなくてもよい他の任意の天然に生じない万能塩基である]
を有する1またはそれ以上(例えば,約1,2,3,4,5,6,7,8,9,10個またはそれ以上)のヌクレオチドまたは非ヌクレオチドを含む。
各XおよびYは,独立して,O,S,N,アルキル,置換アルキル,またはアルキルハロであり;各ZおよびWは,独立して,O,S,N,アルキル,置換アルキル,O−アルキル,S−アルキル,アルカリール,アラルキル,またはアルキルハロであり;W,X,YおよびZはすべてOではない]
を有する5’末端リン酸基を含む。
,5,6,7,8,9,10個またはそれ以上)の万能塩基修飾ヌクレオチドを含み,任意にセンス鎖の3’末端,5’末端,または3’末端および5’末端の両方に末端キャップ分子を含み;かつ,アンチセンス鎖が約1−約10個またはそれ以上,特に約1,2,3,4,5,6,7,8,9,10個またはそれ以上のホスホロチオエートヌクレオチド間結合,および/または1またはそれ以上(例えば,約1,2,3,4,5,6,7,8,9,10個またはそれ以上)の2’−デオキシ,2’−O−メチル,2’−デオキシ−2’−フルオロ,および/または1またはそれ以上(例えば,約1,2,3,4,5,6,7,8,9,10個またはそれ以上)の万能塩基修飾ヌクレオチドを含み,任意にアンチセンス鎖の3’末端,5’末端,または3’末端および5’末端の両方に末端キャップ分子を含むsiNA分子を特徴とする。別の態様においては,センスおよび/またはアンチセンスsiNA鎖の1またはそれ以上,例えば,約1,2,3,4,5,6,7,8,9,10個またはそれ以上のピリミジンヌクレオチドは,2’−デオキシ,2’−O−メチルおよび/または2’−デオキシ−2’−フルオロヌクレオチドで化学的に修飾されており,同じまたは異なる鎖に存在する1またはそれ以上,例えば,約1,2,3,4,5,6,7,8,9,10個またはそれ以上のホスホロチオエートヌクレオチド間結合,および/または3’末端,5’末端,または3’末端および5’末端の両方に末端キャップ分子を有していても有していなくてもよい。
のヌクレオチド間結合は,2’−5’ヌクレオチド間結合を含むことができ,またはsiNA分子の一方または両方の鎖のプリンヌクレオチドの約1,2,3,4,5,6,7,8,9,10個またはそれ以上,例えばすべてのヌクレオチド間結合は,2’−5’ヌクレオチド間結合を含むことができる。
各R3,R4,R5,R6,R7,R8,R10,R11,R12,およびR13は,独立して,H,OH,アルキル,置換アルキル,アルカリールまたはアラルキル,F,Cl,Br,CN,CF3,OCF3,OCN,O−アルキル,S−アルキル,N−アルキル,O−アルケニル,S−アルケニル,N−アルケニル,SO−アルキル,アルキル−OSH,アルキル−OH,O−アルキル−OH,O−アルキル−SH,S−アルキル−OH,S−アルキル−SH,アルキル−S−アルキル,アルキル−O−アルキル,ONO2,NO2,N3,NH2,アミノアルキル,アミノ酸,アミノアシル,ONH2,O−アミノアルキル,O−アミノ酸,O−アミノアシル,ヘテロシクロアルキル,ヘテロシクロアルカリール,アミノアルキルアミノ,ポリアルキルアミノ,置換シリル,または式1を有する基であり;R9は,O,S,CH2,S=O,CHF,またはCF2である]
を有する化合物を含む。
各R3,R4,R5,R6,R7,R8,R10,R11,R12,およびR13は,独立して,H,OH,アルキル,置換アルキル,アルカリールまたはアラルキル,F,Cl,Br,CN,CF3,OCF3,OCN,O−アルキル,S−アルキル,N−アルキル,O−アルケニル,S−アルケニル,N−アルケニル,SO−アルキル,アルキル−OSH,アルキル−OH,O−アルキル−OH,O−アルキル−SH,S−アルキル−OH,S−アルキル−SH,アルキル−S−アルキル,アルキル−O−アルキル,ONO2,NO2,N3,NH2,アミノアルキル,アミノ酸,アミノアシル,ONH2,O−アミノアルキル,O−アミノ酸,O−アミノアシル,ヘテロシクロアルキル,ヘテロシクロアルカリール,アミノアルキルアミノ,ポリアルキルアミノ,置換シリル,または式Iを有する基であり;R9は,0,S,CH2,S=0,CHF,またはCF2であり,R2,R3,R8またはR13のいずれかは,本発明のsiNA分子への結合の点として働く]
を有する化合物を含む。
を有する化合物を含む。
またはそれ以上(例えば,約1,2,3,4,5,6,7,8,9,10個またはそれ以上)の非環状ヌクレオチドを含む。
リンヌクレオチドである),ここで,前記アンチセンス領域中に存在する3’末端ヌクレオチドオーバーハングを含む任意のヌクレオチドは2’−デオキシヌクレオチドである。
−2’−フルオロピリミジンヌクレオチドであり(例えば,すべてのピリミジンヌクレオチドが2’−デオキシ−2’−フルオロピリミジンヌクレオチドであるか,あるいは複数のピリミジンヌクレオチドが2’−デオキシ−2’−フルオロピリミジンヌクレオチドである),センス領域中に存在する1またはそれ以上のプリンヌクレオチドはプリンリボヌクレオチドであり(例えば,すべてのプリンヌクレオチドがプリンリボヌクレオチドであるか,あるいは複数のプリンヌクレオチドがプリンリボヌクレオチドである),およびセンス領域の3’末端,5’末端,または3’末端および5’末端の両方に任意に存在していてもよい反転デオキシ無塩基修飾を含み,センス領域はさらに任意に,約1−約4個(例えば,約1,2,3,または4個)の2’−デオキシリボヌクレオチドを有する3’末端オーバーハングを含み;かつ,siNAはアンチセンス領域を含み,ここで,アンチセンス領域中に存在する1またはそれ以上のピリミジンヌクレオチドは,2’−デオキシ−2’−フルオロピリミジンヌクレオチドであり(例えば,すべてのピリミジンヌクレオチドが2’−デオキシ−2’−フルオロピリミジンヌクレオチドであるか,あるいは複数のピリミジンヌクレオチドが2’−デオキシ−2’−フルオロピリミジンヌクレオチドである),アンチセンス領域中に存在する任意のプリンヌクレオチドは2’−O−メチルプリンヌクレオチドであり(例えば,すべてのプリンヌクレオチドが2’−O−メチルプリンヌクレオチドであるか,あるいは複数のプリンヌクレオチドが2’−O−メチルプリンヌクレオチドである),および末端キャップ修飾,例えば,本明細書に記載されるかまたは図10に示される任意の修飾を含み,これは任意にアンチセンス配列の3’末端,5’末端,または3’末端および5’末端の両方に存在してもよく,アンチセンス領域はさらに任意に約1−約4個(例えば,約1,2,3,または4個)の2’−デオキシヌクレオチドを有する3’末端ヌクレオチドオーバーハングを含んでいてもよく,ここで,オーバーハングヌクレオチドはさらに1またはそれ以上(例えば,1,2,3,または4個)のホスホロチオエートヌクレオチド間結合を含むことができる。これらの化学的に修飾されたsiNAの非限定的例は,図4および5および本明細書の表IIIに示される。
ンヌクレオチドである),アンチセンス領域中に存在する1またはそれ以上のプリンヌクレオチドは,2’−デオキシヌクレオチド,ロック核酸(LNA)ヌクレオチド,2’−メトキシエチルヌクレオチド,4’−チオヌクレオチド,および2’−O−メチルヌクレオチドからなる群より選択され(例えば,すべてのプリンヌクレオチドが2’−デオキシヌクレオチド,ロック核酸(LNA)ヌクレオチド,2’−メトキシエチルヌクレオチド,4’−チオヌクレオチド,および2’−O−メチルヌクレオチドからなる群より選択されるか,あるいは複数のプリンヌクレオチドが2’−デオキシヌクレオチド,ロック核酸(LNA)ヌクレオチド,2’−メトキシエチルヌクレオチド,4’−チオヌクレオチド,および2’−O−メチルヌクレオチドからなる群より選択される),および末端キャップ修飾,例えば,本明細書に記載されるかまたは図10に示されるいずれかの修飾を含み,これは任意にアンチセンス配列の3’末端,5’末端,または3’末端および5’末端の両方に存在していてもよく,アンチセンス領域はさらに任意に,約1−約4個(例えば,約1,2,3,または4個)の2’−デオキシヌクレオチドを有する3’末端ヌクレオチドオーバーハングを含んでいてもよく,ここで,オーバーハングヌクレオチドはさらに1またはそれ以上(例えば1,2,3,または4個)のホスホロチオエートヌクレオチド間結合を含むことができる。
のリガンドである。化学的に修飾されたsiNA分子に結合させることができる,本発明により企図される特定のコンジュゲート分子の例は,Vargeeseら(米国特許出願10/201,394,本明細書の一部としてここに引用する)に記載される。用いられるコンジュゲートのタイプおよび本発明のsiNA分子のコンジュゲーションの程度は,同時にsiNAがRNAi活性を媒介する能力を維持しながら,siNAコンストラクトの改良された薬物動態学プロファイル,生物利用性,および/または安定性について評価することができる。このように,当業者は,例えば,当該技術分野において一般的に知られる動物モデルにおいて,種々のコンジュゲートで修飾されたsiNAコンストラクトをスクリーニングして,siNAコンジュゲート複合体がRNAiを媒介する能力を維持しながら改良された特性を有するかを判定することができる。
Chemistry,45,1628を参照)。
べて本明細書の一部としてここに引用する)に記載されるものが挙げられる。"非ヌクレ
オチド"はさらに,1またはそれ以上のヌクレオチドユニットの代わりに糖および/また
はリン酸置換のいずれかにより核酸鎖中に取り込むことができ,残りの塩基がその酵素活性を発揮することを可能とする任意の基または化合物を意味する。基または化合物は,般に認識されているヌクレオチド塩基,例えばアデノシン,グアニン,シトシン,ウラシルまたはチミンを,例えば糖のC1位に含まない場合,無塩基でありうる。
,標的核酸配列に対する相補性を有する一本鎖ポリヌクレオチドを含み,siNA中に存在する1またはそれ以上のピリミジンヌクレオチドは2’−デオキシ−2’−フルオロピリミジンヌクレオチドであり(例えば,すべてのピリミジンヌクレオチドが2’−デオキシ−2’−フルオロピリミジンヌクレオチドであるか,あるいは複数のピリミジンヌクレオチドが2’−デオキシ−2’−フルオロピリミジンヌクレオチドである),およびアンチセンス領域中に存在する任意のプリンヌクレオチドは2’−デオキシプリンヌクレオチドであり(例えば,すべてのプリンヌクレオチドが2’−デオキシプリンヌクレオチドであるかあるいは複数のプリンヌクレオチドが2’−デオキシプリンヌクレオチドである),および末端キャップ修飾,例えば,本明細書に記載されるかまたは図10に示される任意の修飾を含み,これは任意にアンチセンス配列の3’末端,5’末端,または3’末端および5’末端の両方に存在してもよく,siNAはさらに任意にsiNA分子の3’末端に約1−約4個(例えば,約1,2,3,または4個)の末端2’−デオキシヌクレオチドを含んでいてもよく,ここで末端ヌクレオチドはさらに1またはそれ以上(例えば,1,2,3,または4個)のホスホロチオエートヌクレオチド間結合を含むことができ,siNAはさらに任意に,末端リン酸基,例えば5’末端リン酸基を含むことができる。
ド間結合を含むことができ,siNAはさらに任意に,末端リン酸基,例えば5’末端リン酸基を含むことができる。
of Nucleic Acid Structure,Springer−Verlag ed.,1984を参照)を有する修飾ヌクレオチドを含むsiNA分子を特徴とする。このように,本発明の一本鎖siNA分子中に存在する化学的に修飾されたヌクレオチドは,好ましくは,ヌクレアーゼ分解に耐性であり,同時にRNAiを媒介する能力を維持する。
飾してもよく,siNA鎖の一方はBACE遺伝子のRNAに相補的な配列を含み,siNAのセンス鎖配列は標的RNAの配列と同一の配列を含み;そして(b)組織外植片におけるBACE遺伝子の発現を調節するのに適した条件下で,siNA分子を特定の生物に由来する組織外植片の細胞に導入する,ことを含む。別の態様においては,この方法はさらに,その生物におけるBACE遺伝子の発現を調節するのに適した条件下で,組織外植片をその組織が由来する生物に戻すかまたは別の生物に導入することを含む。
調節する方法を特徴とし,該方法は,(a)本発明のsiNA分子を合成し,これは化学的に修飾してもよく,siNAはBACE遺伝子のRNAに対する相補性を有する一本鎖配列を含み;そして(b)組織外植片におけるBACE遺伝子の発現を調節するのに適した条件下で,siNA分子を特定の生物に由来する組織外植片の細胞に導入する,ことを含む。別の態様においては,この方法はさらに,その生物におけるBACE遺伝子の発現を調節するのに適した条件下で,組織外植片をその組織が由来する生物に戻すかまたは別の生物に導入することを含む。
ることができる。例えば,本発明を用いて,経路における標的遺伝子の活性を阻害して,遺伝子機能分析,mRNA機能分析,または翻訳分析において,特性決定されていない遺伝子の機能を決定することができる。本発明は,医薬開発に向けて,種々の疾病および健康状態に関与する可能性のある標的遺伝子経路を決定するために用いることができる。本発明は,例えば,アルツハイマー病の進行および/または維持に関与する遺伝子発現の経路を理解するために用いることができる。
siNAコンストラクトの鎖のそれぞれにおいて塩基対形成したヌクレオチドの数を示し,例えば,19塩基対を有する21ヌクレオチドのセンス鎖およびアンチセンス鎖を有するsiNAコンストラクトについては,複雑性は419となる)を有するランダム化されたsiNAコンストラクトのライブラリを生成し;そして(b)標的BACE RNA配列中のRNAi標的部位を決定するのに適した条件下で,上述の(a)のsiNAコンストラクトをアッセイする,の各工程を含む方法を特徴とする。別の態様においては,(a)のsiNA分子は,固定された長さ,例えば約23ヌクレオチドの長さの鎖を含む。さらに別の態様においては,(a)のsiNA分子は異なる長さのものであり,例えば,約19−約25(例えば,約19,20,21,22,23,24,または25)ヌクレオチドの長さの鎖を有する。1つの態様においては,アッセイは,本明細書の実施例7に記載されるような,再構成されたインビトロsiNAアッセイを含むことができる。別の態様においては,アッセイは,標的RNAが発現されている細胞培養系を含むことができる。別の態様においては,BACE RNAのフラグメントを,例えば,ゲル電気泳動,ノザンブロット分析,またはRNAse保護アッセイにより検出可能なレベルの切断について分析して,標的BACE RNA配列中の最も適当な標的部位を決定する。標的BACE
RNA配列は,当該技術分野において知られるように,例えば,クローニングおよび/またはインビトロ系については転写により,インビボ系においては細胞発現により,得ることができる。
1またはそれ以上のsiNA分子の組を合成し;そして(c)標的RNA配列中のRNAi標的を決定するのに適した条件下で(b)のsiNA分子をアッセイする,の各工程を含む方法を特徴とする。1つの態様においては,(b)のsiNA分子は,固定された長さ,例えば約23ヌクレオチドの長さの鎖を有する。別の態様においては,(b)のsiNA分子は,異なる長さ,例えば,約19−約25(例えば,約19,20,21,22,23,24,または25)ヌクレオチドの長さの鎖を有する。1つの態様においては,アッセイは,本明細書に記載されるような再構成されたインビトロsiNAアッセイを含んでいてもよい。別の態様においては,アッセイは,標的RNAが発現されている細胞培養系を含むことができる。標的RNAのフラグメントを,検出可能なレベルの切断について,例えばゲル電気泳動,ノザンブロット分析,またはRNAse保護アッセイにより分析して,標的RNA配列中の最も適当な標的部位を決定する。標的RNA配列は,当該技術分野において知られるようにして,例えば,クローニングおよび/またはインビトロ系については転写により,インビボ系においては発現により,得ることができる。
を意味し,ここで,システムはRNAi活性に必要な成分を含む。"生物学的システム"との用語には,例えば,細胞,組織,または生物,またはそれらの抽出物が含まれる。生物学的システムとの用語にはまた,インビトロの設定で用いることができる再構成されたRNAi系が含まれる。
ド配列の単離に用いることができる(b)の化学成分は,ジメトキシトリチル基等のトリチル基を含み,これは本明細書に記載されるトリチルオン合成戦略において利用することができる。さらに別の態様においては,ジメトキシトリチル基等の化学成分は,精製の間に,例えば酸性条件を用いて除去する。
トラクトを特徴とし,siNAコンストラクトは,siNAコンストラクトのヌクレアーゼ耐性を増加させる1またはそれ以上の化学的修飾,例えば,式I−VIIのいずれかまたはそれらの任意の組み合わせを有する1またはそれ以上の化学的修飾を含む。
化学的修飾を含む。
iNAコンストラクトの生物利用性を増加させる,本明細書に記載される1またはそれ以上の化学的修飾を含む。そのようなコンジュゲートの非限定的例は,Vargeese et al.,米国特許出願10/201,394(本明細書の一部としてここに引用する)に記載されている。
NA","短干渉核酸分子","短干渉オリゴヌクレオチド分子",または"化学的に修飾された短干渉核酸分子"との用語は,配列特異的様式でRNA干渉("RNAi")または遺伝
子サイレンシングを媒介しうる任意の核酸分子を表す(例えば,Bass,2001,Nature,411,428−429;Elbashir et al.,2001,Nature,411,494−498;およびKreutzer et al.,国際公開WO00/44895;Zernicka−Goetz et al.,国際公開WO01/36646;Fire,国際公開WO99/32619;Plaetinck et al.,国際公開WO00/01846;Mello and Fire,国際公開WO01/29058;Deschamps−Depaillette,国際公開WO99/07409;およびLi et al.,国際公開WO00/44914;Allshire,2002,Science,297,1818−1819;Volpe et
al.,2002,Science,297,1833−1837;Jenuwein,2002,Science,297,2215−2218;およびHall et al.,2002,Science,297,2232−2237;Hutvagner and Zamore,2002,Science,297,2056−60;McManus et al.,2002,RNA,8,842−850;Reinhart et al.,2002,Gene&Dev.,16,1616−1626;およびReinhart&Bartel,2002,Science,297,1831を参照)。本発明のsiNA分子の非限定的例は,図4−6および本明細書の表IIおよびIIIに示される。例えば,siNAは,自己相補的なセンス領域およびアンチセンス領域を含む二本鎖ポリヌクレオチド分子であってもよく,ここで,アンチセンス領域は標的核酸分子またはその一部中のヌクレオチド配列に相補的なヌクレオチド配列を含み,センス領域は標的核酸配列またはその一部に対応するヌクレオチド配列を有する。siNAは2つの別々のオリゴヌクレオチドから組み立てることができ,ここで一方の鎖はセンス鎖であり,他方はアンチセンス鎖であり,アンチセンス鎖およびセンス鎖は自己相補的であり(すなわち,各鎖は,他方の鎖中のヌクレオチド配列に相補的なヌクレオチド配列を含む);アンチセンス鎖は標的核酸分子またはその一部中のヌクレオチド配列に相補的なヌクレオチド配列を含み,センス鎖は標的核酸配列またはその一部に対応するヌクレオチド配列を含む。あるいは,siNAは単一のオリゴヌクレオチドから組み立ててもよく,ここで,siNAの自己相補的センス領域およびアンチセンス領域は,核酸系または非核酸系のリンカーにより連結されている。siNAは,自己相補的センス領域およびアンチセンス領域を有するヘアピン二次構造を有するポリヌクレオチドであってもよく,ここで,アンチセンス領域は別の標的核酸分子またはその一部中のヌクレオチド配列に相補的なヌクレオチド配列を含み,センス領域は,標的核酸配列またはその一部に対応するヌクレオチド配列を有する。siNAは2またはそれ以上のループ構造および自己相補的センス領域およびアンチセンス領域を含むステムを有する環状一本鎖ポリヌクレオチドであってもよく,ここで,アンチセンス領域は標的核酸分子またはその一部中のヌクレオチド配列に相補的なヌクレオチド配列を含み,センス領域は標的核酸配列またはその一部に対応するヌクレオチド配列を有し,環状ポリヌクレオチドは,インビボまたはインビトロでプロセシングされて,RNAiを媒介しうる活性なsiNA分子を生ずることができる。siNAはまた,標的核酸分子またはその一部中のヌクレオチド配列に相補的なヌクレオチド配列を有する一本鎖ポリヌクレオチドを含んでいてもよく(例えば,そのようなsiNA分子がsiNA分子中に標的核酸配列またはその一部に対応するヌクレオチド配列の存在を必要としない場合),ここで,一本鎖ポリヌクレオチドはさらに末端リン酸基,例えば5’−リン酸(例えば,Martinez et al.,2002,Cell.,110,563−574およびSchwarz eta l.,2002,Molecular Cell,10,537−568を参照),または5’,3’−二リン酸を含んでいてもよい。ある態様においては,本発明のsiNA分子は,標的遺伝子のヌクレオチド配列に相補的なヌクレオチド配列を含む。別の態様においては,本発明のsiNA分子は,標的遺伝子の発現の阻害が引き起こされるように,標的遺伝子のヌクレオチド配列と相互作用する。本明細書において用いる場合,siNA分子はRNAのみを含む分子に限定される必要はなく,化学的に修飾されたヌクレオチドおよび非ヌクレオチドも包含する。ある態様においては,本発明の短干渉核酸分子は2’−ヒドロキシ(2’−OH)含有ヌクレオチドを欠失している。本出願人は,ある態様において,RNAiを媒介するために2’−ヒドロキシ基を有するヌクレオチドの存在を必要としない短干渉核酸を記載する。すなわち,本発明の短干渉核酸分子は,任意にリボヌクレオチド(例えば,2’−OH基を有するヌクレオチド)を含まなくてもよい。しかし,RNAiを支持するためにsiNA分子中にリボヌクレオチドの存在を必要としないそのようなsiNA分子は,2’−OH基を有する1またはそれ以上のヌクレオチドを含む,結合したリンカーまたは他の結合しているかまたは会合している基,成分,または鎖を有することができる。任意に,siNA分子は,ヌクレオチド位置の約5,10,20,30,40,または50%にリボヌクレオチドを含
むことができる。本発明の修飾短干渉核酸分子はまた,短干渉修飾オリゴヌクレオチド"
siMON"と称される。本明細書において用いる場合,siNAとの用語は,配列特異
的RNAiを媒介しうる核酸分子を記述するために用いられる他の用語,例えば,短干渉RNA(siRNA),二本鎖RNA(dsRNA),マイクロRNA(miRNA),短ヘアピンRNA(shRNA),短干渉オリゴヌクレオチド,短干渉核酸,短干渉修飾オリゴヌクレオチド,化学的に修飾されたsiRNA,転写後遺伝子サイレンシングRNA(ptgsRNA),および他のものと同等であることを意味する。さらに,本明細書において用いる場合,RNAiとの用語は,配列特異的RNA干渉を記述する他の用語,例えば転写後遺伝子サイレンシング,または後成遺伝学(epigenetics)と同等であることを意味する。例えば,本発明のsiNA分子を用いて,転写後レベルまたは転写前レベルの両方で後成的に遺伝子をサイレンシングさせることができる。非限定的例においては,本発明のsiNA分子による遺伝子発現の後成的制御は,クロマチン構造のsiNA媒介性修飾により生じて遺伝子発現を変化させることができる(例えば,Allshire,2002,Science,297,1818−1819;Volpe et al.,2002,Science,297,1833−1837;Jenuwein,2002,Science,297,2215−2218;およびHall et al.,2002,Science,297,2232−2237を参照)。
al.,1987,CSH Symp.Quant.Biol.LII pp.123−133;Frier et al,1986,Proc.Nat.Acad.Sci.USA 83:9373−9377;Turner et al.,1987,J.Am.Chem.Soc.109:3783−3785を参照)。相補性のパーセンテージは,核酸分子中の,第2の核酸配列と水素結合(例えば,ワトソン−クリック塩基対形成)を形成しうる連続する残基のパーセンテージを示す(例えば,10塩基中の5,6,7.8,9,10塩基は,50%,60%,70%,80%,90%,および100%の相補性である)。"完全な相補性"とは,核酸配列の連続する残基がすべて第2の核酸配列中の同じ数の連続する残基と水素結合するであろうことを意味する。
−約24ヌクレオチドの長さであり,特定の態様においては,約18,19,20,21,22,23,または24ヌクレオチドの長さである。別の態様においては,本発明のsiNAデュープレックスは,独立して,約17−約23(例えば,約17,18,19,20,21,22または23)塩基対を含む。さらに別の態様においては,ヘアピンまたは環状構造を含む本発明のsiNA分子は,約35−約55(例えば,約35,40,45,50または55)ヌクレオチドの長さであるか,または約38−約44(例えば,38,39,40,41,42,43または44)ヌクレオチドの長さであり,約16−約22(例えば,約16,17,18,19,20,21または22)塩基対を含む。本発明の例示的siNA分子は,表IIおよびIIIおよび図4および5に示される。本発明の例示的合成siNA分子は,表IIIおよび/または図4−5に示される。
ヌクレオチド"とは,β−D−リボフラノース成分の2’位にヒドロキシル基を有するヌ
クレオチドを意味する。この用語は,二本鎖RNA,一本鎖RNA,単離されたRNA,例えば部分的に生成されたRNA,本質的に純粋なRNA,合成RNA,組換え的に製造されたRNA,ならびに1またはそれ以上のヌクレオチドの付加,欠失,置換および/または変更により天然に生ずるRNAと異なるように変更されたRNAを含む。そのような変更は,非ヌクレオチド物質の付加,例えば,siNAの末端または内部(例えばRNAの少なくとも1またはそれ以上のヌクレオチド)への付加を含むことができる。本発明のRNA分子中のヌクレオチドはまた,標準的ではないヌクレオチド,例えば,天然に生じないヌクレオチドまたは化学的に合成されたヌクレオチドまたはデオキシヌクレオチドを含むことができる。これらの変更されたRNAは,類似体または天然に生ずるRNAの類似体と称することができる。
いては,被験者はヒトまたはヒト細胞である。
ヒト細胞を特徴とする。
図1は,siNA分子を合成するスキームの非限定的例を示す。相補的siNA配列鎖である鎖1および鎖2をタンデムで合成し,切断可能な結合,例えばヌクレオチドスクシネートまたは無塩基スクシネートで結合させる。これは,固体支持体上の固相合成において用いられる切断可能なリンカーと同じであっても異なっていていてもよい。合成は固相でも液相でもよく,示される例においては合成は固相合成である。合成は,タンデムオリゴヌクレオチドの末端ヌクレオチド上にジメトキシトリチル基等の保護基が残るように実施する。オリゴヌクレオチドを切断および脱保護すると,2つのsiNA鎖は自発的にハイブリダイズしてsiNAデュープレックスを形成するため,末端保護基の性質を利用してデュープレックスを精製することができる。これは,例えば,末端保護基を有するデュープレックス/オリゴヌクレオチドのみが単離されるトリチルオン精製法を適用することにより行うことができる。
す図である。外来一本鎖RNA,例えばウイルス,トランスポゾン,または他の外因性RNAからRNA依存性RNAポリメラーゼ(RdRP)により生成される二本鎖RNA(dsRNA)が,ダイサー(DICER)酵素を活性化し,次にこれはsiNAデュープレックスを生成する。あるいは,合成されたまたは発現されたsiNAを適当な手段により細胞内に直接導入することができる。活性なsiNA複合体が形成され,これは標的RNAを認識し,その結果,RISCエンドヌクレアーゼ複合体により標的RNAが分解されるか,またはRNA依存性RNAポリメラーゼ(RdRP)により追加のRNAが合成され,これはダイサーを活性化して追加のsiNA分子が生じ,このことによりRNAi応答が増幅される。
ヌクレオチドを除き2’−デオキシ−2’−フルオロ修飾ヌクレオチドであり,これはリボヌクレオチド,デオキシヌクレオチド,万能塩基,または本明細書に記載される他の化学的修飾を含むことができる。
におけるBACE mRNAの減少の非限定的例を示す。A549細胞を25nMのsiNAと複合体化した0.25μg/ウエルの脂質でトランスフェクトした。リボヌクレオチドおよび3’末端ジチミジンキャップを含むsiNAコンストラクトのスクリーニング産物を,未処理細胞,スクランブル化siNA対照コンストラクト(Scram1およびScram2),および脂質のみでトランスフェクトした細胞(トランスフェクション対照)と比較した。図面に示されるように,すべてのsiNAコンストラクトはBACE RNA発現の有意な減少を示す。
本発明の核酸分子の作用のメカニズム
以下の議論は,現在知られている短干渉RNAにより媒介されるRNA干渉の提唱されるメカニズムを記載するが,限定を意味するものではなく,先行技術であると認めるものではない。本出願人は,本明細書において,化学的に修飾された短干渉核酸がsiRNA分子と類似のまたは改良されたRNAi媒介能力を有し,インビボで改良された安定性および活性を有すると予測されることを示す。したがって,この議論は,siRNAのみに限定されることを意味するものではなく,siNA全体に適用することができる。"RN
Aiを媒介する改良された能力"または"改良されたRNAi活性"とは,インビトロおよ
び/またはインビボで測定されたRNAi活性を含むことを意味し,ここで,RNAi活性はsiNAがRNAiを媒介する能力と本発明のsiNAの安定性との両方を反映する。本発明においては,これらの活性の積を,全RNA siRNAまたは複数のリボヌクレオチドを含むsiNAと比較して,インビトロおよび/またはインビボで増加させることができる。場合によっては,siNA分子の活性または安定性は低下するかもしれないが(すなわち,10分の1以下),siNA分子の全体的活性はインビトロおよび/またはインビボで増強される。
al.,2001,Science,293,834)。RNAi応答はまた,一般に
RNA誘導性サイレンシング複合体(RISC)と称される,siRNAを含むエンドヌクレアーゼ複合体を特徴とし,これはsiRNAと相同な配列を有する一本鎖RNAの切断を媒介する。標的RNAの切断は,siRNAデュープレックスのガイド配列に相補的な領域の中央部で生ずる(Elbashir et al.,2001,Genes Dev.,15,188)。さらに,RNA干渉には,小さいRNA(例えば,マイクロRNAまたはmiRNA)に媒介される遺伝子サイレンシングが関与する場合もある。これはおそらくは,クロマチン構造を制御する細胞性メカニズムによるものであり,このことにより標的遺伝子配列の転写が妨害される(例えば,Allshire,2002,Science,297,1818−1819;Volpe et al.,2002,Science,297,1833−1837;Jenuwein,2002,Science,297,2215−2218;およびHall et al.,2002,Science,297,2232−2237を参照)。このように,本発明のsiNA分子は,RNA転写産物との相互作用を介して,あるいは特定の遺伝子配列との相互作用により,遺伝子サイレンシングを媒介するために用いることができ,そのような相互作用により転写レベルまたは転写後レベルのいずれかで遺伝子サイレンシングが生ずる。
100ヌクレオチドを越える長さの核酸の合成は,自動化方法を用いては困難であり,そのような分子の治療コストは非常に高くなる。本発明においては,好ましくは,小さい核酸モチーフ("小さい"とは,100ヌクレオチド以下の長さ,好ましくは80ヌクレオチド以下の長さ,最も好ましくは50ヌクレオチド以下の長さの核酸モチーフ,例えば,別々のsiNAオリゴヌクレオチド配列またはタンデムで合成されたsiNA配列を表す)が外的デリバリーに用いられる。これらの分子は構造が簡単であるため,核酸が蛋白質および/またはRNA構造の標的領域に進入する能力が高い。本発明の例示的分子は化学的に合成するが,他の分子も同様に合成することができる。
キャッピングは,THF中16%N−メチルイミダゾール(ABI)およびTHF中10%無水酢酸/10%2,6−ルチジン(ABI)中で行い;酸化溶液は,THF中16.9mM I2,49mMピリジン,9%水(PERSEPTIVE(登録商標))である
。Burdick&Jackson合成等級アセトニトリルは試薬瓶から直接用いる。S−エチルテトラゾール溶液(アセトニトリル中0.25M)は,American International Chemical,Inc.から入手した固体から作成する。あるいは,ホスホロチオエート結合の導入のためには,ボーケージ試薬(3H−1,2−ベンゾジチオール−3−オン1,1−ジオキシド,アセトニトリル中0.05M)を用いる。
1で3回洗浄し,ボルテックスし,次に上清を最初の上清に加える。オリゴリボヌクレオチドを含む合わせた上清を乾燥して,白色粉末を得る。
eら(1990 Nucleic Acids Res.,18,5433)およびWincottら(1995 Nucleic Acids Res.23,2677−2684),Wincottら(1997,Methods Mol.Bio.,74,59)に記載の方法にしたがい,慣用の核酸保護基およびカップリング基,例えば,5’末端にジメトキシトリチル,および3’末端にホスホルアミダイトを用いて行う。非限定的例においては,小スケールの合成は,394 Applied Biosystems,Inc.合成機で,改変した0.2μmolスケールのプロトコルを用いて,アルキルシリル保護ヌクレオチドについては7.5分間のカップリング工程を,2’−O−メチル化ヌクレオチドについては2.5分間のカップリング工程を行う。表Vは,合成サイクルにおいて用いる試薬の量および接触時間の概要を示す。あるいは,0.2μmolスケールでの合成は,96ウエルプレート合成機,例えば,Protogene(Palo Alto,CA)により製造される装置で,サイクルに最少の改変を加えて行うことができる。2’−O−メチル残基の各カップリングサイクルにおいては,ポリマー結合5’−ヒドロキシルに対して33倍過剰(60μLの0.11M=6.6μmol)の2’−O−メチルホスホルアミダイトおよび75倍過剰のS−エチルテトラゾール(60μLの0.25M=15μmol)を用いることができる。リボ残基の各カップリングサイクルにおいては,ポリマー結合5’−ヒドロキシルに対して66倍過剰(120μLの0.11M=13.2μumol)のアルキルシリル(リボ)保護ホスホルアミダイトおよび150倍過剰のS−エチルテトラゾール(120μLの0.25M=30μmol)を用いることができる。394 Applied Biosystems,Inc.合成機における平均カップリング収率は,トリチル画分の比色定量により決定して,典型的には97.5−99%である。394 Applied Biosystems,Inc.合成器で用いる他のオリゴヌクレオチド合成試薬は以下のとおりである:脱トリチル化溶液は塩化メチレン中3%TCA(ABI)であり;キャッピングは,THF中16%N−メチルイミダゾ
ール(ABI)およびTHF中10%無水酢酸/10%2,6−ルチジン(ABI)中で行い;酸化溶液は,THF中16.9mM I2,49mMピリジン,9%水(PERS
EPTIVE(登録商標))である。Burdick&Jackson合成等級アセトニトリルは試薬瓶から直接用いる。S−エチルテトラゾール溶液(アセトニトリル中0.25M)は,American International Chemical,Inc.から入手した固体から作成する。あるいは,ホスホロチオエート結合の導入のためには,ボーケージ試薬(3H−1,2−ベンゾジチオール−3−オン1,1−ジオキシド,アセトニトリル中0.05M)を用いる。
テックスし,次に上清を最初の上清に加える。オリゴリボヌクレオチドを含む合わせた上清を乾燥して,白色粉末を得る。塩基脱保護オリゴリボヌクレオチドを無水TEA/HF/NMP溶液(1.5mL N−メチルピロリジノン,750μL TEAおよび1.0mL TEA・3HFの溶液300μL,HF濃度1.4M)に再懸濁し,65℃に加熱する。1.5時間後,オリゴマーを1.5M NH4HCO3で反応を停止させる。
Acids Symp.Ser.31,163を参照)。siNAコンストラクトは,一般的な方法を用いてゲル電気泳動により精製するか,または高速液体クロマトグラフィー(HPLC;Wincott et al.,(上掲)を参照,その全体を本明細書の一部としてここに引用する)により精製し,水に再懸濁する。
づいて構築することができる。siNA分子を発現しうる組換えベクターを本明細書に記載されるようにデリバリーし,標的細胞中に残留させることができる。あるいは,siNA分子の過渡的発現を与えるウイルスベクターを用いてもよい。
修飾(塩基,糖および/またはリン酸)を有する化学的に合成した核酸分子は,血清リボヌクレアーゼによる分解を防止することができ,このことによりその抗力を高めることができる(例えば,Eckstein et al.,国際公開WO92/07065;Perrault et al.,1990 Nature 344,565;Pieken et al.,1991 Science 253,314;Usman and
Cedergren,1992 Trends in Biochem.Sci.17,334;Usman et al.,国際公開WO93/15187;Rossi et al.,国際公開WO91/03162;Sproat,米国特許5,334,711;Gold et al.,US6,300,074およびBurgin et al.,(上掲)を参照(これらはすべて本明細書の一部としてここに引用する)。上述の参考文献はすべて,本明細書に記載される核酸分子の塩基,リン酸および/または糖成分になしうる種々の化学修飾を記載する。細胞中におけるその抗力を増強するよう修飾し,およびオリゴヌクレオチドの合成時間を短縮し化学物質の必要性を減少するために核酸分子から塩基を除去することが望ましい。
れない限り,本明細書に記載されるように,同様の修飾を用いて本発明のsiNA核酸分子を修飾することができる。
本発明の核酸分子を異なる組織に由来する多数の細胞タイプにデリバリーおよび/または局在化することを改良すると予測される(Sullenger and Cech,米国特許5,854,038を参照)。本明細書に記載される分子のコンジュゲートは,生物分解性のリンカー,例えば生物分解性核酸リンカー分子を介して,生物学的に活性な分子に結合させることができる。
ミノ,またはSHである。この用語は,また,少なくとも1つの炭素−炭素二重結合を含む不飽和炭化水素基であるアルケニル基を含み,直鎖,分枝鎖,および環状基を含む。好ましくは,アルケニル基は1−12個の炭素を有する。より好ましくは,これは1−7個の炭素原子,より好ましくは1−4個の炭素原子の低級アルケニルである。アルケニル基は置換されていてもされていなくてもよい。置換されている場合,置換基は,好ましくは,ヒドロキシル,シアノ,アルコキシ,=O,=S,NO2,ハロゲン,N(CH3)2,
アミノ,またはSHから選択される。"アルキル"との用語はまた,少なくとも1つの炭素−炭素三重結合を含む不飽和の炭化水素基を有するアルキニル基を含み,直鎖,分枝鎖,および環状基を含む。好ましくは,アルキニル基は1−12個の炭素を有する。より好ましくは,これは1−7個の炭素,より好ましくは1−4個の炭素を有する低級アルキニルである。アルキニル基は,置換されていてもされていなくてもよい。置換されている場合,置換基は,好ましくは,ヒドロキシル,シアノ,アルコキシ,=O,=S,NO2また
はN(CH3)2,アミノまたはSHである。
エステル"とは,−C(O)−OR’(式中,Rはアルキル,アリール,アルキルアリー
ルまたは水素のいずれかである)を表す。
,Usman and McSwiggen(上掲);Eckstein et al.,国際公開WO92/07065;Usman et al.,国際公開WO93/15187;Uhlman&Peyman,(上掲)(すべて本明細書の一部としてここに引用する)を参照)。当該技術分野において知られる修飾核酸塩基のいくつかの例があり,Limbach et al.,1994,Nucleic Acids Res.22,2183にまとめられている。核酸中に導入することができる塩基修飾のいくつかの非限定的例としては,例えば,イノシン,プリン,ピリジン−4−オン,ピリジン−2−オン,フェニル,シュードウラシル,2,4,6−トリメトキシベンゼン,3−メチルウラシル,ジヒドロウリジン,ナフチル,アミノフェニル,5−アルキルシチジン(例えば5−メチルシチジン),5−アルキルウリジン(例えばリボチミジン),5−ハロウリジン(例えば5−ブロモウリジン)または6−アザピリミジンまたは6−アルキルピリミジン(例えば6−メチルウリジン),プロピンおよびその他のものが挙げられる(Burgin et al.,1996,Biochemistry,35,14090;Uhlman&Peyman,上掲)。この観点において,"修飾塩基"とは,1’位におけるアデニン,グアニン,シトシンおよびウラシル以外のヌクレオチド塩基またはそれらの同等物を意味する。
過性を高め,標的とする細胞を認識し結合する能力を付与するであろう。
本発明のsiNA分子は,単独で,または他の療法と組み合わせて,種々の神経変性性疾病,例えば,アルツハイマー病,痴呆,発作(CVA),および細胞または組織におけるBACEのレベルに関連する他のいずれかの疾病または健康状態の治療に用いるために適合させることができる。例えば,siNA分子は,被験者に投与するためのリポソーム等のデリバリーベヒクル,担体および希釈剤,およびそれらの塩を含むことができ,および/または薬学的に許容しうる処方中に存在することができる。核酸分子のデリバリーの方法は,Akhtar et al.,1992,Trends Cell Bio.,2,139;Delivery Strategies for Antisense Oligonucleotide Therapeutics,ed.Akhtar,1995;Maurer et al.,1999,Mol.Membr.Biol.,16,129−140;Hofland and Huang,1999,Handb.Exp.Pharmacol.,137,165−192;およびLee et al..2000,ACSSymp.Ser.,752,184−192(いずれも本明細書の一部としてここに引用する)に記載されている。Beigelman et al.,米国特許6,395,713およびSullivan et al.,PCT WO94/02595は,さらに,核酸分子をデリバリーするための一般的な方法を記載する。これらのプロトコルを用いて,事実上いかなる核酸分子もデリバリーすることができる。核酸分子は当業者に知られる種々の方法によって細胞に投与することができ,これには,限定されないが,リポソームへの封入,イオントホレシス,または他のベヒクル,例えば,ヒドロゲル,シクロデキストリン(例えば,Gonzalez et al.,1999,Bioconjugate Chem.,10,1068−1074を参照),生分解性ナノカプセル,および生体接着性小球体への組み込み,または蛋白質性ベクター(O’Hare and Normand,国際公開WO00/53722)によるものが含まれる。あるいは,核酸/ベヒクルの組み合わせを,直接注入により,または注入ポンプを用いることにより局所的にデリバリーする。本発明の核酸分子の直接注入は,標準的な針とシリンジの方法論を用いて,または例えばConry et al.,1999,Cliva.Cancer Res.,5,2330−2337およびBarry et al.,国際公開WO99/31262に記載される無針手法により,皮下,筋肉内,または皮膚内に行うことができる。本発明の分子は医薬品として用いることができる。医薬品は,被験者における疾病状態を予防し,発症を調節しまたは治療する(症状をある程度,好ましくは症状をすべて軽減する)。
)に適当な形態の組成物または処方を表す。適当な形態は,部分的には,使用する投与経路(例えば経口,経皮,または注射)に依存する。そのような形態は,組成物または処方が標的細胞(すなわち,負に荷電した核酸がデリバリーされることが望まれる細胞)に到達することを妨害してはならない。例えば,血流中に注入される医薬組成物は可溶性でなければならない。他の因子は当該技術分野において知られており,例えば,毒性,および組成物または処方がその効果を発揮することを妨害する形態等を考慮することが含まれる。
et al.,1998,J.Pharm.Sci.,87,1308−1315;Tyler et al.,1999,FEBS Lett.,421,280−284;Pardridge et al.,1995,PNAS USA.,92,5592−5596;Boado,1995,Adv.Drug Delivery Rev.,15,73−107;Aldrian−Herrada et al.,1998,Nucleic Acids Res.,26,4910−4916;およびTyler et
al.,1999,PNAS USA.,96,7053−7058に記載される物質が含まれる。
新生標的組織における溢出および捕獲のため,腫瘍中に選択的に蓄積することが示されている(Lasic et al.,Science 1995,267,1275−1276;Oku et al.,1995,Biochim.Biophys.Acta,1238,86−90)。長期間循環リポソームは,特に,MPSの組織で蓄積することが知られている慣用のカチオン性リポソームと比べて,DNAおよびRNAの薬物動態学および薬力学を増強する(Liu et al.,J.Biol.Chem.1995,42,24864−24870;Choi et al.,国際公開WO96/10391;Ansell et al.,国際公開WO96/10390;Holland et al.,国際公開WO96/10392)。長期間循環リポソームはまた,代謝的に攻撃的なMPS組織,例えば肝臓および脾臓における蓄積を回避するその能力に基づいて,カチオン性リポソームと比較して薬剤をヌクレアーゼ分解からより強く保護するようである。
ishing Co.(A.R.Gennaro edit.1985)(本明細書の一部としてここに引用する)に記載されている。例えば,保存剤,安定剤,染料,および風味剤を用いることができる。これらには,安息香酸ナトリウム,ソルビン酸,およびp−ヒドロキシ安息香酸のエステルが含まれる。さらに,抗酸化剤および懸濁剤を用いてもよい。
例えば,ステアリン酸マグネシウム,ステアリン酸またはタルクでありうる。錠剤は被覆しなくてもよく,既知の手法により被覆してもよい。場合によっては,既知の手法によりそのような被覆を調製して,胃腸管における崩壊および吸収を遅延させ,このことによりより長い期間の持続的な作用を与えることができる。例えば,遅延用材料,例えばグリセリルモノステアレートまたはグリセリルジステアレートを用いることができる。
した適当な分散剤または湿潤剤および懸濁剤を用いて,当該技術分野において知られるように処方することができる。滅菌した注射可能な製品はまた,無毒性の非経口的に許容可能な希釈剤または溶媒中の滅菌した注射可能な溶液または懸濁液,例えば,1,3−ブタンジオール中の溶液であってもよい。用いることのできる許容可能なベヒクルおよび溶媒の例は,水,リンゲル溶液および等張塩化ナトリウム溶液である。さらに,滅菌し固定した油を溶媒または懸濁媒体として便利に用いることができる。この目的のためには,任意の非刺激性の固定した油,例えば,合成のモノグリセリドまたはジグリセリドを用いることができる。さらに,脂肪酸,例えば,オレイン酸を注射可能な薬剤の製造において用いることができる。
and Wu,1987,J.Biol.Chem.262,4429−4432)は,肝細胞に独特であり,分枝鎖ガラクトース末端糖蛋白質,例えばアシアロオロソムコイド(ASOR)に結合する。別の例においては,多くの癌細胞中で葉酸レセプターが過剰発現されている。そのような糖蛋白質,合成グリココンジュゲート,または葉酸のレセプターへの結合は,オリゴサッカライド鎖の分枝の程度に強く依存する親和性で生ずる。例えば,三触角構造は,二触角または一触角鎖より高い親和性で結合する(Baenziger and Fiete,1980,Cell,22,611−620;Connol
ly et al.,1982,J.Biol.Chem.,257,939−945)。Lee and Lee(1987,Glycoconjugate J.,4,317−328)は,ガラクトースと比較してレセプターに対してより高い親和性を有するN−アセチル−D−ガラクトースアミンを炭水化物成分として用いることによりこの高い特異性を得た。この"クラスタリング効果"はまた,マンノシル末端糖蛋白質またはグリココンジュゲートの結合および取込についても記載されている(Ponpipom et al.,1981,J.Med.Client.,24,1388−1395)。ガラクトース,ガラクトースアミンまたは葉酸に基づくコンジュゲートを使用して外来性化合物を細胞膜を超えて輸送することにより,例えば,肝疾患,肝臓の癌,または他の癌の治療に標的化デリバリー法を提供することができる。また,バイオコンジュゲートの使用により,治療に必要な治療用化合物の必要用量を低下させることができる。さらに,本発明の核酸バイオコンジュゲートを使用することにより,治療薬の生物利用性,薬力学,および薬物動態学的パラメータを調節することができる。そのようなバイオコンジュゲートの非限定的例は,Vargeese et al.,米国特許出願10/201,394,(2001年8月13日出願);およびMatulic−Adamic et al,米国特許出願60/362,016(2002年3月6日出願)に記載されている。
Proc.Natl.Acad.Sci. USA 83,399;Scanlon et al.,1991,Proc.Natl.Acad.Sci. USA ,88,10591−5;Kashani−Sabet et al.,1992 Antisense Res.Dev.,2,3−15;Dropulic et al.,1992
J.Virol 66,1432−41;Weerasinghe et al.,1991 J.Virol,65,5531−4;Ojwang et al.,1992
Proc.Natl.Acad.Sci. USA 89,10802−6;Chen
et al.,1992 Nucleic Acids Res.,20,4581−9;Sarver et al.,1990 Science 247,1222−1225;Thompson et al.,1995 Nucleic Acids Res.23,2259;Good et al.,1997,Gene Therapy,4,45)。当業者は,真核生物細胞中で任意の核酸を適当なDNA/RNAベクターから発現させることができることを認識するであろう。そのような核酸の活性は,酵素的核酸によりそれらを一次転写産物から放出させることにより増大させることができる(Draper et al.,PCT WO93/23569,Sullivan et al.,PCT WO94/02595;Ohkawa et al.,1992 Nucleic Acids Symp.Ser.,27,15−6;Taira et al.,1991, Nucleic Acids Res.,19,5125−30;Ventura et al.,1993 Nucleic Acids Res.,21,3249−55;Chowrira et al.,1994 J.Biol.Chem.269,25856)。
発現しうる組換えベクターは,上述のようにデリバリーされ,標的細胞中に残留することができる。あるいは,核酸分子の過渡的発現を与えるウイルスベクターを用いることもできる。そのようなベクターは,必要に応じて繰り返し投与することができる。いったん発現されれば,siNA分子は標的mRNAと相互作用して,RNAi応答を生ずる。siNA分子を発現するベクターの輸送は,全身的(例えば,静脈内または筋肉内投与により),患者から外植された標的細胞に投与した後,被験者に再導入することにより,または所望の標的細胞中への導入を可能とする他のいずれかの手段により,行うことができる(総説については,Couture et al.,1996,TIG.,12,510を参照)。
et al.,2002,Nature Medicine,advance online publication doi:10.1038/nm725を参照)。
ーム(ORF);および/またはイントロン(介在配列)を含んでいてもよい。
.,1992 EMBO J.11,4411−8;Lisziewicz et al.,1993 Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.,90,8000−4;Thompson et al.,1995 Nucleic Acids Res.23,2259;Sullenger&Cech,1993,Science,262,1566)。より詳細には,転写ユニット,例えばU6小核(snRNA),転移RNA(tRNA)およびアデノウイルスVA RNAをコードする遺伝子に由来するものは,細胞中において高濃度の所望のRNA分子(例えばsiNA)を生成するのに有用である(Thompson et al.,(上掲);Couture and Stinchcomb,1996,(上掲);Noonberg et al.,1994,Nucleic Acid Res.,22,2830;Noonberg et al.,米国特許5,1624,803;Good et al.,1997,Gene Ther.4,45;Beicrelman et al.,国際公開WO96/18736)。上述のsiNA転写ユニットは,哺乳動物細胞中に導入するために種々のベクター中に組み込むことができる。ベクターとしては,限定されないが,プラスミドDNAベクター,ウイルスDNAベクター(例えばアデノウイルスまたはアデノ随伴ウイルスベクター),またはウイルスRNAベクター(例えばレトロウイルスまたはアルファウイルスベクター)が挙げられる(総説については,Couture and Stinchcomb,1996,(上掲)を参照)。
なように連結されており,配列は,siNA分子の発現および/またはデリバリーを可能とする様式で,開始領域,オープンリーディングフレームおよび終止領域に動作可能なように連結されている。さらに別の態様においては,発現ベクターは,a)転写開始領域;b)転写終止領域;c)イントロン;およびd)少なくとも1つのsiNA分子をコードする核酸配列を含み;この配列は,核酸分子の発現および/またはデリバリーを可能とする様式で,開始領域,イントロンおよび終止領域に動作可能なように連結されている。
−末端に動作可能なように連結されており,配列は,siNA分子の発現および/またはデリバリーを可能とする様式で,開始領域,イントロン,オープンリーディングフレームおよび終止領域に動作可能なように連結されている。
アルツハイマー病は,進行性の不溶性プラーク形成および脳における4kDのアミロイドβペプチド(Aβ)から構成される血管沈着を特徴とする。これらのプラークは,シナプスの多大な喪失を示すジストロフィー性軸索,神経細線維もつれの形成,およびグリオーシスを特徴とする。Aβは,大きなタイプI貫膜蛋白質であるβ−アミロイド前駆体蛋白質(APP)の蛋白質分解性切断から生ずる(Kang et al.,1987,Nature,325,733)。APPがプロセシングされてAβが生成するためには,
β−セクレターゼおよびγ−セクレターゼによる2つの切断部位が必要である。APPのβ−セクレターゼ切断により100kDの可溶性アミノ末端フラグメントであるAPPsβが細胞質に放出され,後に12kDの貫膜カルボキシ末端フラグメントであるC99が残る。あるいは,APPはα−セクレターゼにより切断されて,細胞質APPsαおよび貫膜C83フラグメントが生成する。残った貫膜フラグメントであるC99およびC83はいずれも,γ−セクレターゼによりさらに切断されて,それぞれ,アルツハイマー関連Aβおよび非病原性ペプチドp3が放出され分泌される(Vassar et al.,1999,Science,286,735−741)。家族性アルツハイマー病の初期の発病は,P1位におけるMetからLeuへの置換を有する変異体APP蛋白質を特徴とし,これは"スウェーデン"型家族性変異の特性を表す(Mullan et al.,1992,Nature Genet.,1,345)。このAPP変異は,β−セクレターゼ切断の劇的な増強を特徴とする(Citron et al.,1992,Nature,360,672)。
ムチャネルブロッカー,例えばNimodipine(登録商標)は,カルシウムの過負荷から神経細胞を保護し,このことにより神経細胞の生存を長くするため,アルツハイマー病の治療に利点がある可能性があると考えられている。ヌートロピック化合物,例えばアセチル−L−カルニチン(Alcar(登録商標))およびインスリンは,細胞代謝に基づく認識および記憶機能の増強のため,アルツハイマー病の治療にある程度の利点を有することが提唱されている。
本発明の例示的siNA分子は,切断可能なリンカー,例えば,スクシニル系リンカーを用いて,タンデムで合成する。本明細書に記載されるタンデム合成の後に,1段階精製プロセスを行って,RNAi分子を高収率で得る。この方法はハイスループットRNAiスクリーニングを支えるsiNA合成に非常に適しており,マルチカラムまたはマルチウエルの合成プラットフォームに容易に適合させることができる。
反応を停止させる。
rs C18 SepPak lgカートリッジを用いて,容易に行うことができる。サンプルを負荷し,1CVのH2Oまたは50mM NaOAcで洗浄する。失敗配列は1
CVの14%ACN(水性;50mM NaOAcおよび50mMNaClを含む)で溶出する。次にカラムを1CVのH2O等で洗浄し,例えば,1CVの1%水性トリフルオ
ロ酢酸(TFA)をカラムに通し,次にさらに1CVの1%水性TFAをカラムに加えて約10分間放置することにより,カラム上で脱トリチル化を行う。残りのTFA溶液を除去し,カラムをH2Oで,次に1CVの1MNaClおよび再度のH2Oで洗浄する。次に,siNAデュープレックス生成物を,例えば,1CVの20%水性CANを用いて溶出する。
目的とするRNA標的,例えばウイルスまたはヒトmRNA転写産物の配列を,例えばコンピュータフォールディングアルゴリズムを用いることにより,標的部位についてスクリーニングする。非限定的例においては,Genbank等のデータベースから得られる遺伝子またはRNA遺伝子転写産物の配列を用いて,標的に対して相補性を有するsiNA標的を生成する。そのような配列は,データベースから得ることができるか,または当該技術分野において知られるように実験的に決定することができる。既知の標的部位,例えば,リボザイムまたはアンチセンス等の他の核酸分子を用いた研究に基づいて有効な標的部位であると決定されている標的部位,または疾病または健康状態と関連していることが知られている標的,例えば変異または欠失を含む部位を用いて,これらの部位を標的とするsiNA分子を設計することができる。種々のパラメータを用いて,標的RNA配列中でいずれの部位が最も適当な標的部位であるかを判定することができる。これらのパラメータには,限定されないが,二次または三次RNA構造,標的配列のヌクレオチド塩基組成,標的配列の種々の領域間のホモロジーの程度,またはRNA転写産物中の標的配列の相対的位置が含まれる。これらの判定に基づいて,RNA転写産物中の任意の数の標的部位を選択して,例えば,インビトロRNA切断アッセイ,培養細胞,または動物モデルを用いることにより,効力についてsiNA分子をスクリーニングすることができる。非限定的例においては,用いるべきsiNAコンストラクトのサイズに基づいて,転写産物中のいずれかの位置の1−1000個の標的部位を選択する。当該技術分野において知られる方法,例えば標的遺伝子発現の有効な減少を判定するマルチウエルまたはマルチプレートアッセイを用いて,siNA分子をスクリーニングするためのハイスループットスクリーニングアッセイを開発することができる。
以下の非限定的工程を用いて,所定の遺伝子配列または転写産物を標的とするsiNAの選択を行うことができる。
ラグメントまたはサブ配列,例えば23ヌクレオチドフラグメントのリストを作成する。この工程は,典型的にはあつらえのPerlスクリプトを用いて行うが,市販の配列分析プログラム,例えば,Oligo,MacVector,またはthe GCG Wisconsin Packageも同様に用いることができる。
場合には(パラグラフ7に記載されるように),オリゴを合成する前にセンス鎖およびアンチセンス鎖の両方の2つの3’末端ヌクレオチドをTTで置き換える。
siNAの標的部位は,実施例3に記載されるsiNA分子のライブラリを用いて,あるいは本明細書の実施例6に記載されるようなインビトロsiNAシステムを用いて,BACE RNA標的の配列を分析し,任意にフォールディング(siNAの標的へのアクセス可能性を判定するために分析される任意の所与の配列の構造)に基づいて標的部位に優先順位を付けることにより,選択した。siNA分子は,それぞれの標的に結合することができるように設計し,任意に個々にコンピュータフォールディングにより分析して,siNA分子が標的配列と相互作用しうるか否かを評価した。種々の長さのsiNA分子を選択して,活性を最適化することができる。一般に,標的RNAと結合するかさもなくばこれと相互作用する十分な数の相補的ヌクレオチド塩基が選択されるが,種々の長さまたは塩基組成のsiNAデュープレックスに適応させるように,相補性の程度を調節することができる。そのような方法論を用いることにより,siNA分子は,任意の既知のRNA配列,例えば,任意の遺伝子転写産物に対応するRNA配列中の部位を標的とするよう設計することができる。
するためのsiNA化合物のリードを拾い上げることができる(例えば,図11を参照)。
siNA分子は,RNAメッセージ中の種々の部位,例えば,本明細書に記載されるRNA配列中の標的配列と相互作用するよう設計することができる。siNA分子の一方の鎖の配列は,上述した標的部位配列に相補的である。siNA分子は,本明細書に記載される方法を用いて化学的に合成することができる。対照配列として用いられる不活性siNA分子は,siNA分子の配列を標的配列に相補的ではないようにスクランブル化することにより,合成することができる。一般に,siNAコンストラクトは,本明細書に記載されるように,固相オリゴヌクレオチド合成方法を用いて合成することができる(例えば,Usman et al.,米国特許5,804,683;5,831,071;5,998,203;6,117,657;6,353,098;6,362,323;6,437,117;6,469,158;Scaringe et al.,米国特許6,111,086;6,008,400;6,111,086を参照(いずれもその全体を本明細書の一部としてここに引用する))。
al.,米国特許5,631,360(その全体を本明細書の一部としてここに引用する)に記載されるように,2’−デオキシ−2’−アミノヌクレオシドにはN−フタロイル保護を用いることができる。
用する))。
RNAiを無細胞システムにおいて再現するインビトロアッセイを用いて,BACE RNA標的を標的とするsiNAコンストラクトを評価する。アッセイは,Tuschlら(1999,Genes and Development,13,3191−3197)およびZamoreら(2000,Cell,101,25−33)に記載され,BACE標的RNA用に適合させた系を含む。シンシチウム胚盤葉に由来するショウジョウバエ抽出物を用いてインビトロでRNAi活性を再構築する。標的RNAは,BACEを発現する適当なプラスミドからT7RNAポリメラーゼを用いてインビトロ転写することにより,または本明細書に記載されるように化学合成により作製する。センスおよびアンチセンスsiNA鎖(例えば各20μM)は,緩衝液(例えば,100mM酢酸カリウム,30mM HEPES−KOH,pH7.4,2mM酢酸マグネシウム)中で90℃で1分間,次に37℃で1時間インキュベートすることによりアニーリングさせ,次に溶解緩衝液(例えば100mM酢酸カリウム,30mM HEPES−KOH(pH7.4),2mM酢酸マグネシウム)で希釈する。アニーリングは,アガロースゲルを用いてTBE緩衝液でゲル電気泳動し,臭化エチジウムで染色することによりモニターすることができる。ショウジョウバエの溶解物は,OregonRハエからの0−2時間齢の胚を用いて調製し,酵母糖蜜寒天上に回収し,絨毛膜を除去し溶解する。溶解物を遠心分離し,上清を単離する。アッセイは,50%溶解物[vol/vol],RNA(10−50pMの最終濃度),およびsiNA(10nMの最終濃度)を含む10%[vol/vol]溶解緩衝液を含有する反応混合物を含む。反応混合物はまた,10mMのクレアチンリン酸,10μg/mlのクレアチンホスホキナーゼ,100μMのGTP,100μMのUTP,100μMのCTP,500μMのATP,5mMのDTT,0.1U/μLのRNasin(Promega),および100μMの各アミノ酸を含む。酢酸カリウムの最終濃度は100mMに調節する。反応は氷上で予め組立て,25℃で10分間プレインキュベートした後にRNAを加え,25℃でさらに60分間インキュベートする。4倍容量の1.25x Passive Lysis Buffer(Promega)で反応を停止させる。標的RNAの切断は,RT−PCR分析または当該技術分野において知られる他の方法によりアッセイし,反応からsiNAが省略されている対照反応と比較する。
上述したようにして,ヒトBACE RNAを標的とするsiNA分子を設計し,合成する。これらの核酸分子は,例えば以下の方法を用いることにより,インビボで切断活性について試験することができる。BACE RNA中の標的配列およびヌクレオチドの位置は表IIおよびIIIに示される。
細胞(例えば,A549細胞,7PA2,CHO,またはAPPsw細胞)は,トランスフェクションの前日に,例えば,EGM−2(BioWhittaker)中で1x105細胞/ウエルで6−ウエルディッシュに播種する。siNA(例えば最終濃度20n
M)およびカチオン性脂質(例えば最終濃度2μg/ml)を,ポリスチレン管でEGM基礎培地(BioWhittaker)中で,37℃で30分間複合体化させる。ボルテックスした後,複合体化したsiNAを各ウエルに加え,示される時間インキュベートする。最初の最適化実験のためには,細胞を例えば,1x103で96ウエルプレートに播
種し,記載されるようにしてsiNA複合体を加える。siNAの細胞へのデリバリーの効率は,脂質と複合体化した蛍光siNAを用いて決定する。6ウエルディッシュ中の細胞をsiNAとともに24時間インキュベートし,PBSですすぎ,2%パラホルムアルデヒド中で室温で15分間固定する。siNAの取り込みは蛍光顕微鏡を用いて可視化する。
siNAのデリバリーの後,例えば,6ウエル用にはQiagenRNA精製キットを,または96ウエルアッセイ用にはRneasy抽出キットを用いて,細胞から総RNAを調製する。Taqman分析のためには,5’末端に共有結合させたレポーター染料(FAMまたはJOE)および3’末端にコンジュゲート化したクエンチャー染料TAMRAを有する二重標識プローブを合成する。1段階RT−PCR増幅は,例えば,ABI PRISM 7700 Sequence Detectorで,10μlの総RNA,
100nMのフォワードプライマー,900nMのリバースプライマー,100nMのプローブ,1XTaqMan PCR反応緩衝液(PE−Applied Biosystems),5.5mM MgCl2,300μMの各dATP,dCTP,dGTP,お
よびdTTP,10UのRNase阻害剤(Promega),1.25UのAmpliTaqGold(PE−Applied Biosystems)および10UのM−MLVリバーストランスクリプターゼ(Promega)から構成される50μlの反応液を用いて行う。熱サイクリング条件は,48℃で30分間,95℃で10分間,次に95℃で15秒間および60℃で1分間を40サイクルからなるものでありうる。mRNAレベルの定量は,段階的に希釈した総細胞RNA(300,100,33,11ng/rxn)から生成した標準に対して行い,平行してTaqMan反応で測定したβ−アクチンまたはGAPDH mRNAに対して標準化する。目的とする各遺伝子について,上側プライマーおよび下側プライマー,および蛍光標識したプローブを設計する。特定のPCR産物中へのSYBR GreenI染料のリアルタイム取り込みは,ガラスキャピラリー管で光サイクラーを用いて測定することができる。対照cRNAを用いて,各プライマー対について標準曲線を作成する。値は,各サンプルにおいてGAPDHに対する相対的発現として表す。
核抽出物は,標準的なマイクロ調製手法(例えば,Andrews and Faller,1991,Nucleic Acids Research,19,2499を参照)を用いて調製することができる。例えばTCA沈殿を用いて,上清からの蛋白質抽出物を調製する。等量の20%TCAを細胞上清に加え,氷上で1時間インキュベートし,5分間の遠心分離によりペレット化する。ペレットをアセトンで洗浄し,乾燥し,水に再懸濁する。細胞蛋白質抽出物を10%Bis−Tris NuPage(核抽出物)または4−12%Tris−グリシン(上清抽出物)ポリアクリルアミドゲルに流し,ニトロセルロース膜に移す。非特異的結合は,例えば,5%無脂乳とともに1時間インキュベートすることによりブロッキングすることができ,次に一次抗体で4℃で16時間反応させる。洗浄した後,二次抗体,例えば(1:10,000希釈)を室温で1時間適用し,SuperSignal試薬(Pierce)でシグナルを検出する。
細胞培養
Vassarら(1999,Science,286,735−741)は,BACE阻害を研究するための培養細胞モデルを記載する。BACE mRNAを標的とする特異的アンチセンス核酸分子を用いて,脂質媒介性トランスフェクションにより101細胞およびAPPsw(スウェーデン型アミロイド前駆体蛋白質を発現)細胞における内因性BACE発現の阻害実験を行った。アンチセンス処理により,ノザンブロット分析により両方のBACE mRNAが,およびELISAによりAPPspsw("スウェーデン"型β−セクレターゼ切断産物)が劇的に減少し,いずれのパラメータについても75−80%の最大阻害が得られた。このモデルはまた,APPsw細胞におけるアミロイドβ−ペプチド産生に及ぼすBACE阻害の影響を研究するために用いることができる。同様に,そのようなモデルを用いて,本発明のsiRNA分子を有効性および効力についてスクリーニングすることができる。
度で加え,溶液を軽くボルテックスする。siNA分子を所望の最終濃度で加え,溶液を再び軽くボルテックスし,室温で10分間インキュベートする。用量応答実験においては,10分間のインキュベート後にRNA/脂質複合体をDMEMで連続希釈する。
動物モデルにおいて抗BACE剤の効力を評価することは,ヒトの臨床試験の重要な前提条件である。Gamesら(1995,Nature,373,523−527)は,変異体ヒト家族性APP型(Valの代わりにPhe717)を過剰発現させたトランスジェニックマウスモデルを記載する。このモデルから,アルツハイマー病の病理上顕著な特徴の多くを進行的に発症するマウスが得られ,したがって,本発明のsiNAコンストラクト等の治療用薬剤を試験するモデルを提供する。
siNAコンストラクト(表IIおよびIII)を,例えばA549細胞において,BACE RNA発現を低下させる効力について試験する。トランスフェクションの時点で細胞が70−90%コンフルエントであるように,トランスフェクションの約24時間前に,96ウエルプレートに5,000−7,500細胞/ウエル,100μl/ウエルで細胞を播種する。トランスフェクションのためには,アニーリングしたsiNAを50μl/ウエルの容量でトランスフェクション試薬(リポフェクタミン2000,Invitrogen)と混合し,室温で20分間インキュベートする。siNAトランスフェクション混合物を細胞に加えて,150μlの容量中最終siNA濃度を25nMとする。各siNAトランスフェクション混合物を3回のsiNA処理用に3つのウエルに加える。細胞をsiNAトランスフェクション混合物の連続的存在下で37℃で24時間インキュベートする。24時間において,処理した細胞の各ウエルからRNAを調製する。まずトランスフェクション混合物を有する上清を除去して廃棄し,次に細胞を溶解し,各ウエルからRNAを調製する。処理後の標的遺伝子の発現を,標的遺伝子および標準化用に対照遺伝子(36B4,RNAポリメラーゼサブユニット)についてRT−PCRにより評価する。3回の実験のデータを平均し,各処理について標準偏差を求める。標準化したデータをグラフに表し,活性なsiNAによる標的mRNAの減少のパーセントをそれぞれの反転対照siNAと比較して判定する。
RNAの発現の有意な低下を示す。そのようなスクリーニングから得られたリードを,次にさらにアッセイする。非限定的例においては,リボヌクレオチドおよび3’末端ジチミジンキャップを含むsiNAコンストラクト,ならびに,2’−デオキシ−2’−フルオロピリミジンヌクレオチドおよびプリンリボヌクレオチドを含み,siNAのセンス鎖が5’および3’末端反転デオキシ無塩基キャップでさらに修飾されており,アンチセンス鎖が3’末端ホスホロチオエートヌクレオチド間結合を含む,化学的に修飾されたsiNAコンストラクトをアッセイする。表IVに記載されるさらに別の安定化化学も同様に活性についてアッセイする。これらのsiNAコンストラクトを,適当なマッチした化学の反転対照と比較する。さらに,siNAコンストラクトはまた,未処理細胞,脂質およびスクランブル化siNAコンストラクトでトランスフェクトした細胞,および脂質のみでトランスフェクトした細胞(トランスフェクション対照)とも比較する。
BACE発現の調節に関連しうる特定の変性性状態および疾病状態としては,限定されないが,アルツハイマー病,痴呆,発作(CVA),および単独でまたは他の療法との組
み合わせで,細胞または組織におけるBACEのレベルに関連する他のいずれかの疾病または健康状態が挙げられる。BACE発現(特にBACE RNAのレベル)の低下,したがって,それぞれの蛋白質のレベルの低下は,疾病または健康状態の症状をある程度軽減する。
本発明のsiNA分子は,種々の応用において,例えば,臨床,工業,環境,農業および/または研究の設定において,種々の診断用途,例えば分子標的(例えばRNA)の同定に用いることができる。そのようなsiNA分子の診断における使用は,再構成されたRNAi系,例えば,細胞溶解物または部分的に精製された細胞溶解物を利用することを含む。本発明のsiNA分子を診断手段として使用し,疾病に罹患した細胞内の遺伝的浮動および変異を検査するか,または細胞において内因性のまたは外来の(例えばウイルス)RNAの存在を検出することができる。siNA活性と標的RNAの構造との間の密接な関係により,分子のいずれの領域においても,標的RNAの塩基対形成および3次元構造を変更する変異を検出することができる。本発明に記載されるsiNA分子を複数使用することにより,インビトロならびに細胞および組織におけるRNAの構造および機能に重要なヌクレオチド変化をマッピングすることができる。siNA分子による標的RNAの切断を使用して,遺伝子の発現を阻害し,疾病または感染の進行における特定の遺伝子産物の役割を明らかにすることができる。このようにして,他の遺伝子標的を疾病の重要な介在物として明らかにすることができる。これらの実験は,組み合わせ療法の可能性を提供することにより,疾病進行のよりよい治療につながるであろう(例えば,異なる遺伝子を標的とする多数のsiNA分子,既知の小分子阻害剤と組み合わせたsiNA分子,siNA分子および/または他の化学的または生物学的分子と組み合わせた間欠的治療)。本発明のsiNA分子の他のインビトロにおける使用は当該技術分野においてよく知られており,これには,疾病,感染または関連する健康状態に伴うmRNAの存在の検出が含まれる。そのようなRNAは,siNA分子で処理した後,標準的な方法論,例えば蛍光共鳴エネルギー移動(FRET)を使用して切断産物の存在を判定することにより検出する。
より高い変異型と野生型の比率はより高いリスクと相関関係があるであろう。
る"との用語は,他の2つのいずれかと置き換えることができる。本明細書において用い
られる用語および表現は,説明の用語として用いるものであり,限定ではない。そのような用語および表現の使用においては,示されかつ記載されている特徴またはその一部の等価物を排除することを意図するものではなく,特許請求の範囲に記載される本発明の範囲中で種々の変更が可能であることが理解される。すなわち,好ましい態様および任意の特徴により本発明を特定的に開示してきたが,当業者には本明細書に記載される概念の変更および変種が可能であり,そのような変更および変種も特許請求の範囲に定義される本発明の範囲内であると考えられることが理解されるべきである。
Claims (32)
- RNA干渉により1またはそれ以上のBACE遺伝子の発現をダウンレギュレートする短干渉核酸(siNA)分子。
- 前記BACE遺伝子がGenbank受託番号NM_012104を含む配列をコードする,請求項1記載のsiNA分子。
- 前記siNA分子がリボヌクレオチドを含まない,請求項1記載のsiNA分子。
- 前記siNA分子がリボヌクレオチドを含む,請求項1記載のsiNA分子。
- 前記siNA分子が二本鎖である,請求項1記載のsiNA分子。
- 前記siNA分子がBACE蛋白質をコードするヌクレオチド配列またはその一部に相補的なヌクレオチド配列を含むアンチセンス鎖を含み,前記siNA分子がさらにセンス鎖を含み,ここで,前記センス鎖がBACE遺伝子またはその一部のヌクレオチド配列に対応するヌクレオチド配列を含む,請求項5記載のsiNA分子。
- 前記アンチセンス鎖および前記センス鎖がそれぞれ約19−約29ヌクレオチドを含み,前記アンチセンス鎖および前記センス鎖が少なくとも約19の相補的ヌクレオチドを共有する,請求項6記載のsiNA分子。
- 前記siNA分子がBACE蛋白質をコードするヌクレオチド配列またはその一部に相補的なヌクレオチド配列を含むアンチセンス領域を含み,前記siNA分子がさらにセンス領域を含み,ここで,前記センス領域はBACE遺伝子またはその一部のヌクレオチド配列に対応するヌクレオチド配列を含む,請求項5記載のsiNA分子。
- 前記アンチセンス領域および前記センス領域がそれぞれ約19−約29ヌクレオチドを含み,前記アンチセンス領域および前記センス領域が少なくとも約19の相補的ヌクレオチドを共有する,請求項8記載のsiNA分子。
- 前記siNA分子が一本鎖である,請求項1記載のsiNA分子。
- 前記siNA分子がBACE蛋白質をコードするヌクレオチド配列またはその一部に相補的なヌクレオチド配列を含む,請求項10記載のsiNA分子。
- 前記siNA分子が約19−約29ヌクレオチドを有する配列を含む,請求項11記載のsiNA分子。
- 前記siNA分子がセンス領域およびアンチセンス領域を含み,前記アンチセンス領域はBACE蛋白質をコードするヌクレオチド配列またはその一部に相補的なヌクレオチド配列を含み,前記センス領域は前記アンチセンス領域に相補的なヌクレオチド配列を含む,請求項1記載のsiNA分子。
- 前記siNA分子が2つのオリゴヌクレオチドフラグメントから組み立てられ,一方のオリゴヌクレオチドフラグメントは前記siNA分子のセンス領域を含み,第2のオリゴヌクレオチドフラグメントはアンチセンス領域を含む,請求項1記載のsiNA分子。
- 前記センス領域および前記アンチセンス領域が別々のオリゴヌクレオチドを含む,請求項
13記載のsiNA分子。 - 前記センス領域および前記アンチセンス領域がリンカー分子により連結されている,請求項13記載のsiNA分子。
- 前記リンカー分子がポリヌクレオチドリンカーである,請求項16記載のsiNA分子。
- 前記リンカー分子が非ヌクレオチドリンカーである,請求項16記載のsiNA分子。
- 前記センス領域が3’末端オーバーハングを含み,前記アンチセンス領域が3’末端オーバーハングを含む,請求項13記載のsiNA分子。
- 前記3’末端オーバーハングがそれぞれ約2ヌクレオチドを含む,請求項19記載のsiNA分子。
- アンチセンス領域の3’末端オーバーハングがBACE蛋白質をコードするRNAに相補的である,請求項19記載のsiNA分子。
- 前記センス領域が1またはそれ以上の2’−O−メチルピリミジンヌクレオチドおよび1またはそれ以上の2’−デオキシプリンヌクレオチドを含む,請求項13記載のsiNA分子。
- 前記センス領域中に存在する任意のピリミジンヌクレオチドが2’−デオキシ−2’−フルオロピリミジンヌクレオチドを含み,前記センス領域中に存在する任意のプリンヌクレオチドが2’−デオキシプリンヌクレオチドを含む,請求項13記載のsiNA分子。
- 前記センス領域中に存在する3’末端ヌクレオチドオーバーハングを含む任意のヌクレオチドが2’−デオキシヌクレオチドを含む,請求項19記載のsiNA分子。
- 前記センス領域が3’末端および5’末端を含み,および末端キャップ成分が前記センス領域の5’末端,3’末端,または5’末端および3’末端の両方に存在する,請求項13記載のsiNA分子。
- 前記末端キャップ成分が反転デオキシ無塩基成分である,請求項25記載のsiNA分子。
- 前記アンチセンス領域が1またはそれ以上の2’−デオキシ−2’−フルオロピリミジンヌクレオチドおよび1またはそれ以上の2’−O−メチルプリンヌクレオチドを含む,請求項13記載のsiNA分子。
- 前記アンチセンス領域中に存在する任意のピリミジンヌクレオチドが2’−デオキシ−2’−フルオロピリミジンヌクレオチドを含み,前記アンチセンス領域中に存在する任意のプリンヌクレオチドが2’−O−メチルプリンヌクレオチドを含む,請求項13記載のsiNA分子。
- 前記アンチセンス領域中に存在する3’末端ヌクレオチドオーバーハングを含む任意のヌクレオチドが2’−デオキシヌクレオチドを含む,請求項19記載のsiNA分子。
- 前記アンチセンス領域が前記アンチセンス領域の3’末端にホスホロチオエートヌクレオチド間結合を含む,請求項28記載のsiNA分子。
- 前記アンチセンス領域が,前記アンチセンス領域の3’末端にグリセリル修飾を含む,請求項13記載のsiNA分子。
- 前記3’末端オーバーハングがデオキシリボヌクレオチドを含む,請求項19記載のsiNA分子。
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