JP2007525205A

JP2007525205A - 短干渉核酸（ｓｉＮＡ）を使用した，ＲＮＡ干渉により仲介されるＨａｉｒｌｅｓｓ（ＨＲ）遺伝子発現の抑制

Info

Publication number: JP2007525205A
Application number: JP2006536610A
Authority: JP
Inventors: マクスウィゲン，ジェームズ
Original assignee: Sirna Therapeutics Inc
Current assignee: Sirna Therapeutics Inc
Priority date: 2003-10-23
Filing date: 2004-08-18
Publication date: 2007-09-06
Also published as: EP1675950A2

Abstract

本発明は，短い干渉核酸（ｓｉＮＡ）分子を使用した，Ｈａｉｒｌｅｓｓ（無毛）（ＨＲ）遺伝子発現の調節に有用な化合物，組成物，及び方法に関する。本発明はまた，小さい核酸分子を使用した，ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）によるＨａｉｒｌｅｓｓ遺伝子の発現，及び／又は活性の経路に関与する他の遺伝子の発現及び活性の調節に有用な化合物，組成物，及び方法にも関する。より詳細には，本発明は，短干渉核酸（ｓｉＮＡ），短干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ），二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ），マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ），及びショートヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）分子のような小さい核酸分子，及びＨａｉｒｌｅｓｓ発現の調節に使用される方法に関する。

Description

本出願は２００３年１０月２３日に出願の米国特許出願公開第１０／６９３，０５９号の一部継続出願であり，同出願は２００３年５月２３日に出願の米国特許出願公開第１０／４４４，８５３号の一部継続出願であり，同出願は２００３年２月２０日に出願の国際特許出願第ＰＣＴ／ＵＳ０３／０５３４６号の一部継続出願，及び２００３年２月２０日に出願の国際特許出願第ＰＣＴ／ＵＳ０３／０５０２８の一部継続出願であり，これら両方は，２００２年２月２０日に出願の米国仮特許出願公開第６０／３５８，５８０号，２００２年３月１１日に出願の米国仮特許出願公開第６０／３６３，１２４号，２００２年６月６日に出願の米国仮特許出願公開第６０／３８６，７８２号，２００２年８月２９日に出願の米国仮特許出願公開第６０／４０６，７８４号，２００２年９月５日に出願の米国仮特許出願公開第６０／４０８，３７８号，２００２年９月９日に出願の米国仮特許出願公開第６０／４０９，２９３号，及び２００３年１月１５日に出願の米国仮特許出願公開第６０／４４０，１２９号の利益を主張する。本願はまた，２００４年４月３０日に出願の国際特許出願第ＰＣＴ／ＵＳ０４／１３４５６号の一部継続出願であり，同出願は２００４年２月１３日に出願の米国特許出願公開第１０／７８０，４４７号の一部継続出願であり，同出願は２００３年４月３０日に出願の米国特許出願公開第１０／４２７，１６０号の一部継続出願であり，同出願は２００２年５月１７日に出願の国際特許出願第ＰＣＴ／ＵＳ０２／１５８７６号の一部継続出願であり，同出願は２００１年５月１８日に出願の米国仮特許出願公開第６０／２９２，２１７号，２００２年３月６日に出願の米国仮特許出願公開第６０／３６２，０１６号，２００１年７月２０日に出願の米国仮特許出願公開第６０／３０６，８８３号，及び２００１年８月１３日に出願の米国仮特許出願公開第６０／３１１，８６５号の利益を主張する。本願はまた，２００３年１２月３日に出の米国特許出願公開第１０／７２７，７８０号の一部継続出願である。本願はまた，２０願０４年２月１０日に出願の米国仮特許出願公開第６０／５４３，４８０号の利益を主張する。本願はまた，２００４年５月２４日に出願の国際特許出願第ＰＣＴ／ＵＳ０４／１６３９０号の一部継続出願であり，同出願は２００４年４月１６日に出願の米国特許出願公開第１０／８２６，９６６号の一部継続出願である。本願は，図面を含めてその全容が参照により本明細書に加入される上記に列挙した全出願の利益を主張する。

本発明は，Ｈａｉｒｌｅｓｓ（無毛）（ＨＲ）遺伝子の発現及び／又は活性の調節に応答する形質，疾患及び病状を，研究，診断及び治療するための化合物，組成物，及び方法に関する。本発明はまた，Ｈａｉｒｌｅｓｓ遺伝子の発現経路に関与する遺伝子の発現及び／又は活性の調節に応答する形質，疾患及び病状に関係した，又はそのような形質，疾患及び病状の持続又は発達を仲介する他の細胞過程に関係した化合物，組成物及び方法にも関する。より詳細には，本発明は，Ｈｉｒｌｅｓｓ遺伝子発現に対するＲＮＡ干渉を仲介し得る，例えば短干渉核酸（ｓｉＮＡ），短干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ），二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ），マイクロ−ＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ），及びショートヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）分子のような，小さい核酸分子に関する。このような小さい核酸分子は，例えば被験者の毛の成長の防止，抑制，若しくは低下，被験者の除毛若しくは脱毛，又は代替的に，被験者のＨａｉｒｌｅｓｓ遺伝子の発現の調節に応答し得る，形質，疾患及び病状，例えば脱毛症及び無毛症の治療に有用である。

以下に，ＲＮＡｉに関する関連技術について説明する。本説明は，続く本発明の理解のためのみに提供される。要約は，以下に説明する研究のいずれかを，特許請求される本発明の先行技術であることを認めるものではない。

ＲＮＡ干渉は，短干渉ＲＮＡにより仲介される，動物における配列特異的な転写後遺伝子サイレンシング（ｓｉＲＮＡ）プロセスを意味する（Ｚａｍｏｒｅ等，２０００，Ｃｅｌｌ，１０１，２５−３３，Ｆｉｒｅ等，１９９８，Ｎａｔｕｒｅ，３９１，８０６，Ｈａｍｉｌｔｏｎ等，１９９９，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２８６，９５０−９５１，Ｌｉｎ等，１９９９，Ｎａｔｕｒｅ，４０２，１２８−１２９，Ｓｈａｒｐ，１９９９，Ｇｅｎｅｓ＆Ｄｅｖ１３：１３９−１４１，及びＳｔｒａｕｓｓ，１９９９，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２８６，８８６）。植物における対応するプロセス（Ｈｅｉｆｅｔｚ等，国際特許出願公開第ＷＯ９９／６１６３１号）は，通常，転写後遺伝子サイレンシング又はＲＮＡサイレンシングと称され，真菌類ではクエリング（ｑｕｅｌｌｉｎｇ）とも称される。転写後遺伝子サイレンシングプロセスは，外来遺伝子の発現を防ぐための進化的に保存された細胞防御機構であると考えられ，種々の植物相及び種族により共有されている（Ｆｉｒｅ等，１９９９，ＴｒｅｎｄｓＧｅｎｅｔ１５，３５８）。このような外来遺伝子発現からの保護は，ウイルス感染，又はトランスポゾン要素のホストゲノム内へのランダムな組み込みから細胞応答を介して誘導される二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）生産に応じて進化してきたもの思われる。相同な一本鎖ＲＮＡ又はウイルスゲノムＲＮＡを特異的に破壊する。細胞内のｄｓＲＮＡの存在は，未だ完全に特定されていない機構を介してＲＮＡｉ応答を誘発する。この機構は，二本鎖ＲＮＡ特異的リボヌクレアーゼに関係する他の周知の機構，例えばｄｓＲＮＡにより仲介されるタンパク質キナーゼＰＫＲ，及び２’，５’−オリゴアデニレートシンセターゼの活性化によるインターフェロン応答と，その結果のリボヌクレアーゼＬによるｍＲＮＡの非特異的な切断等とは異なるように思われる（例えば，米国特許第６，１０７，０９４号，米国特許第５，８９８，０３１号，Ｃｌｅｍｅｎｓ等，１９９７年，Ｊ．Ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ＆ＣｙｔｏｋｉｎｅＲｅｓ１７，５０３−５２４，Ａｄａｈ等，２００１，Ｃｕｒｒ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ８，１１８９を参照）。

細胞内の長いｄｓＲＮＡの存在は，Ｄｉｃｅｒと称されるリボヌクレアーゼＩＩＩ酵素の活性を刺激する（Ｂａｓｓ，２０００，Ｃｅｌｌ，１０１，２３５，Ｚａｍｏｒｅ等，２０００，Ｃｅｌｌ，１０１，２５−３３，Ｈａｍｍｏｎｄ等，２０００，Ｎａｔｕｒｅ，４０４，２９３）。Ｄｉｃｅｒは，ｄｓＲＮＡを，短干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）として周知の短いｄｓＲＮＡ部分にプロセシングすることに関与している（Ｚａｍｏｒｅ等，２０００，Ｃｅｌｌ，１０１，２５−３３，Ｂａｓｓ，２０００，Ｃｅｌｌ，１０１，２３５，Ｂｅｒｓｔｅｉｎ等，２００１，Ｎａｔｕｒｅ，４０９，３６３）。Ｄｉｃｅｒの活性化により得られる短干渉ＲＮＡは，一般に約２１〜約２３個のヌクレオチド長を有し，約１９個の塩基対を含む二重鎖からなる（Ｚａｍｏｒｅ等，２０００，Ｃｅｌｌ，１０１，２５−３３，Ｅｌｂａｓｈｉｒ等，２００１，ＧｅｎｅｓＤｅｖ１５，１８８）。Ｄｉｃｅｒはまた，翻訳抑制に関係する保存された構造を有する前駆体ＲＮＡから，２１個及び２２個のヌクレオチドの小さい一時的ＲＮＡ（ｓｔＲＮＡ）を切断することにも関与している（Ｈｕｔｖａｇｎｅｒ等，２００１，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２９３，８３４）。ＲＮＡｉ応答はまた，通常，ＲＮＡ誘導型サイレンシング複合体（ＲＩＳＣ）と称されるエンドヌクレアーゼ複合体にも関係し，同複合体は，ｓｉＲＮＡ二重鎖のアンチセンス鎖に相補的な配列を有する一本鎖ＲＮＡの切断を仲介する。標的ＲＮＡの切断は，ｓｉＲＮＡ二重鎖のアンチセンス鎖に相補的な領域の中央にて行われる（Ｅｌｂａｓｈｉｒ等，２００１，ＧｅｎｅｓＤｅｖ．，１５，１８８）。

ＲＮＡｉは，様々な系にて研究されている。Ｆｉｒｅ等，１９９８，Ｎａｔｕｒｅ，３９１，８０６，は，最初に土壌線虫にてＲＮＡｉを観察した。Ｂａｈａｍｉａｎ及びＺａｒｂｌ，１９９９，ＭｏｌｅｃｕｌａｒａｎｄＣｅｌｌｕｌａｒＢｉｏｌｏｇｙ，１９，２７４−２８３，並びにＷｉａｎｎｙ及びＧｏｅｔｚ，１９９９，ＮａｔｕｒｅＣｅｌｌＢｉｏｌ２，７０は，哺乳動物系にてｄｓＲＮＡにより仲介されるＲＮＡｉについて記載している。Ｈａｍｍｏｎｄ等，２０００，Ｎａｔｕｒｅ，４０４，２９３は，ｄｓＲＮＡで感染されたショウジョウバエ細胞中のＲＮＡｉについて記載している。Ｅｌｂａｓｈｉｒ等，２００１，Ｎａｔｕｒｅ，４１１，４９４及びＴｕｓｃｈｌ等，特許文献１は，ヒト胚腎臓及びＨｅＬａ細胞を含む培養哺乳類細胞中の合成２１−ヌクレオチドＲＮＡの二重鎖によって誘導されるＲＮＡｉについて記載している。ショウジョウバエ胚溶解物における最近の研究は（Ｅｌｂａｓｈｉｒ等，２００１，ＥＭＢＯＪ２０，６８７７，及びＴｕｓｃｈｌ等，特許文献１），十分なＲＮＡｉ活性の仲介に必須のｓｉＲＮＡの長さ，構造，化学的組成，及び配列に対する特定の要求を明らかにしている。これらの研究では，２１−ヌクレオチドｓｉＲＮＡ二重鎖は，３’−末端ジヌクレオチド・オーバーハングを含む場合に最も活性があることを示している。更に，ｓｉＲＮＡ鎖の一方又は両方を２’−デオキシ（２’−Ｈ）又は２’−Ｏ−メチルヌクレオチドで完全に置換するとＲＮＡｉ活性が消失するが，３’−末端ｓｉＲＮＡオーバーハングヌクレオチドの２’−デオキシヌクレオチド（２’−Ｈ）による置換は許容し得ることが示された。ｓｉＲＮＡ二重鎖の中央の単一のミスマッチ配列もＲＮＡｉ活性を消失させることが示された。加えて，これらの研究では，標的ＲＮＡ内の切断位置はｓｉＲＮＡガイド配列の３’−末端ではなく，５’−末端により規定されることが示された（Ｅｌｂａｓｈｉｒ等，２００１，ＥＭＢＯＪ２０，６８７７）。他の研究では，ｓｉＲＮＡ活性には，ｓｉＲＮＡ二重鎖が標的とする相補的な鎖上に５’−ホスフェートが必要であり，また５’−ホスフェート部分を保持するのにＡＴＰが使用されることが示された（Ｎｙｋａｎｅｎ等，２００１，Ｃｅｌｌ，１０７，３０９）。

研究によれば，二つのヌクレオチド３’−オーバーハングを有する２１−ｍｅｒｓｉＲＮＡ二重鎖の３’−末端ヌクレオチドオーバーハング部分を，デオキシリボヌクレオチドで置換しても，ＲＮＡｉ活性に悪影響を与えないことが示されている。ｓｉＲＮＡの各末端の四つのヌクレオチドのデオキシリボヌクレオチドによる置換は十分許容し得ると報告されているのに対して，デオキシリボヌクレオチドによる完全な置換はＲＮＡｉ活性を消失させる（Ｅｌｂａｓｈｉｒ等，２００１，ＥＭＢＯＪ．，２０，６８７７及びＴｕｓｃｈｌ等，特許文献１）。更に，Ｅｌｂａｓｈｉｒ等，前出，もまたｓｉＲＮＡの２’−０−メチルヌクレオチドによる置換により，ＲＮＡｉ活性が完全に消失することを報告している。Ｌｉ等，国際特許出願公開第ＷＯ００／４４９１４号，及びＢｅａｃｈ等，国際特許出願公開第ＷＯ０１／６８８３６号は，前もって，ｓｉＲＮＡが，少なくとも１個の窒素又は硫黄ヘテロ原子を含めるためにホスフェート−糖バックボーン又はヌクレオシドのいずれかに修飾を有し得ることを示唆していたが，そのような修飾がどの程度ｓｉＲＮＡ分子内で許容されるか仮定する出願は存在せず，またそのような修飾ｉＲＮＡの更なるガイダンスあるいは例は提供されていない。Ｋｒｅｕｔｚｅｒ等，カナダ特許出願第２，３５９，１８０号もまた二本鎖ＲＮＡ依存型タンパク質キナーゼＰＫＲの活性を妨げるための，ｄｓＲＮＡ構成内に使用される特定の化学修飾，詳細には２’−アミノ又は２’−Ｏ−メチルヌクレオチド，及び２’−Ｏ又は４’−Ｃメチレン架橋を含むヌクレオチドについて記載している。しかしながら，Ｋｒｅｕｔｚｅｒ等は同様に，これらの修飾がどの程度ｄｓＲＮＡ分子内で許容され得るかについてのガイダンス又は例を提供していない。

Ｐａｒｒｉｓｈ等，２０００，ＭｏｌｅｃｕｌａｒＣｅｌｌ，６，１０７７−１０８７は，長い（＞２５ｎｔ）ｓｉＲＮＡ転写産物を使用して，土壌線虫のｕｎｃ−２２遺伝子を標的とする特定の化学修飾を試験した。著者等は，チオホスフェートヌクレオチド類似体をＴ７及びＴ３ＲＮＡポリメラーゼにより組み込むことによって，これらｓｉＲＮＡ転写産物内へチオホスフェート残基を導入し，二つのホスホロチオエート修飾塩基を含むＲＮＡにも，ＲＮＡｉと同様に有効性の相当な低下が観察されたことを記述している。また，Ｐａｒｒｉｓｈ等は，三つ以上の残基のホスホロチオエート修飾は，インビトロにてＲＮＡを極めて不安定にし，そのため干渉活性を評価することが不可能であったことを報告した。（１０８１にＩｄ。）著者等はまた，長いｓｉＲＮＡ転写産物内のヌクレオチド糖の２’位における特定の修飾を試験し，リボヌクレオチドをデオキシヌクレオチドに置き換えると，特にウリジンをチミジン置き換え，及び／又はシチジンをデオキシ−シチジンに置き換えた場合に，干渉活性が相当低下することを見いだした。（Ｉｄ。）更に著者等は，ｓｉＲＮＡのセンス及びアンチセンス鎖における，ウラシルの４−チオウラシル，５−ブロモウラシル，５−ヨードウラシル，及び３−（アミノアリル）ウラシルとの置換，及びグアノシンのイノシンとの置換を含む特定の塩基修飾について試験した。４−チオウラシル及び５−ブロモウラシル置換は許容されるものと想定されるのに対して，Ｐａｒｒｉｓｈは，イノシンがどちらかの鎖に組み込まれると，干渉活性が相当低下したことを報告した。Ｐａｒｒｉｓｈはまた，アンチセンス鎖内に５−ヨードウラシル及び３−（アミノアリル）ウラシルを組み込むと，ＲＮＡｉ活性が相当低下することを報告した。

より長いｄｓＲＮＡの使用についても記載されている。例えば，Ｂｅａｃｈ等，国際特許出願公開第ＷＯ０１／６８８３６号は，内因的に誘導されたｄｓＲＮＡを使用して遺伝子発現を減弱させる特定の方法について記載している。Ｔｕｓｃｈｌ，２００１，Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，２，２３９−２４５は，インターフェロン応答を活性化する危険性により，遺伝的疾患又はウイルス感染の治療でのＲＮＡｉの使用を懸念しているが，Ｔｕｓｃｌｉｌ等，特許文献１は，ショウジョウバエのインビトロＲＮＡｉ系と，特定の機能性ゲノム及び特定の治療的応用のための特定のｓｉＲＮＡ分子の使用とを記載している。Ｌｉ等，国際特許出願公開第ＷＯ００／４４９１４号は，，特定の長い（１４１ｂｐ〜４８８ｂｐ）酵素的に合成，又はベクター発現されたｄｓＲＮＡを使用して，特定の標的遺伝子の発現を減弱させること記載している。Ｚｅｒｎｉｃｋａ−Ｇｏｅｔｚ等，国際特許出願公開第ＷＯ０１／３６６４６号は，特定の長い（５５０ｂｐ−７１４ｂｐ），酵素的に合成，又はベクター発現されたｄｓＲＮＡ分子を使用して，哺乳類細胞内の特定の遺伝子の発現を抑制する特定の方法について記載している。Ｆｉｒｅ等，国際特許出願公開第ＷＯ９９／３２６１９号は，線虫類の遺伝子発現の抑制での使用のために特定の長いｄｓＲＮＡ分子を細胞内に導入する特定の方法を記載している。Ｐｌａｅｔｉｎｃｋ等，国際特許出願公開第ＷＯ００／０１８４６号は，特定の長いｄｓＲＮＡを使用して，細胞内で特定の表現型を付与する原因となる特定の遺伝子を確認する方法について記載している。Ｍｅｌｌｏ等，国際特許出願公開第ＷＯ０１／２９０５８号は，ｄｓＲＮＡ−仲介ＲＮＡｉに関与する特定遺伝子の確認について記載している。Ｐａｃｈｕｃｋ等，国際特許出願公開第ＷＯ００／６３３６４号は，特定の長い（少なくとも２００ヌクレオチド）ｄｓＲＮＡの構成について記載している。ＤｅｓｃｈａｍｐｓＤｅｐａｉｌｌｅｔｔｅ等，国際特許出願公開第ＷＯ９９／０７４０９号は，特定の抗ウイルス剤と組合せた特定のｄｓＲＮＡ分子からなる特定の組成物を記載している。Ｗａｔｅｒｈｏｕｓｅ等，国際特許出願公開第９９／５３０５０号，及び１９９８，ＰＮＡＳ，９５，１３９５９−１３９６４は，特定のｄｓＲＮＡを使用して，植物細胞内の核酸の表現型の発現を低下させる特定の方法を記載している。Ｄｒｉｓｃｏｌｌ等，国際特許出願公開第ＷＯ０１／４９８４４号は，標的有機体内で遺伝子サイレンシングを促進するために使用される，特定のＤＮＡ発現構成について記載している。

その他に様々なＲＮＡｉ及び遺伝子サイレンシング系が報告されている。例えば，Ｐａｒｒｉｓｈ等，２０００，ＭｏｌｅｃｕｌａｒＣｅｌｌ，６，１０７７−１０８７は，土壌線虫のｕｎｃ−２２遺伝子を標的とする特定の化学修飾ｄｓＲＮＡ構成を記載している。Ｇｒｏｓｓｎｉｋｌａｕｓ，国際特許出願公開第ＷＯ０１／３８５５１号は，特定のｄｓＲＮＡを使用して植物内のポリコーム遺伝子発現を調節する特定の方法について記載している。Ｃｈｕｒｉｋｏｖ等，国際特許出願公開第ＷＯ０１／４２４４３号は，特定のｄｓＲＮＡを使用して有機体の遺伝的特徴を変更する特定の方法について記載している。Ｃｏｇｏｎｉ等，国際特許出願公開第ＷＯ０１／５３４７５号は，Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａサイレンシング遺伝子を単離する特定の方法，及びその使用について記載している。Ｒｅｅｄ等，国際特許出願公開第ＷＯ０１／６８８３６号は，植物における遺伝子サイレンシングの特定の方法について記載している。Ｈｏｎｅｒ等，国際特許出願公開第ＷＯ０１／７０９４４号は，パーキンソン病モデルとして形質転換線虫類を使用して，特定のｄｓＲＮＡを使用した薬物スクリーニングの特定の方法について記載している。Ｄｅａｋ等，国際特許出願公開第ＷＯ０１／７２７７４号は，Ｄｉ−ｏｓｏｐｈｉｌａ内のＲＮＡｉに関係し得る特定のショウジョウバエ由来遺伝子生成物について記載している。Ａｒｎｄｔ等，国際特許出願公開第ＷＯ０１／９２５１３号は，ＲＮＡｉを向上させる因子を用いて遺伝子抑圧を仲介する特定の方法について記載している。Ｔｕｓｃｈｌ等，国際特許出願公開第ＷＯ０２／４４３２１号は特定の合成ｓｉＲＮＡ構成を記載している。Ｐａｃｈｕｋ等，国際特許出願公開第ＷＯ００／６３３６４号，及びＳａｔｉｓｈｃｈａｎｄｒａｎ等，国際特許出願公開第ＷＯ０１／０４３１３号は，特定の長い（２５０ｂｐ超），ベクター発現ｄｓＲＮＡを使用して特定のポリヌクレオチド配列の機能を抑制する特定の方法，及び組成物について記載している。Ｅｃｈｅｖｅｒｒｉ等，国際特許出願公開第ＷＯ０２／３８８０５号はＲＮＡｉによって同定された特定の土壌線虫遺伝子を記載している。Ｋｒｅｕｔｚｅｒ等，国際特許出願公開第ＷＯ０２／０５５６９２号，ＷＯ０２／０５５６９３号，及び欧州特許第ＥＰ１１４４６２３Ｂ１号は，ｄｓＲＮＡを使用して遺伝子発現を抑制する特定の方法について記載している。Ｇｒａｈａｍ等，国際特許出願公開第ＷＯ９９／４９０２９号，及びＷＯ０１／７０９４９号，並びにオーストラリア特許第ＡＵ４０３７５０１号は，ベクター発現された特定のｓｉＲＮＡ分子について記載している。Ｆｉｒｅ等，米国特許第６，５０６，５５９号は，ＲＮＡｉを仲介する特定の長いｄｓＲＮＡ（２９９ｂｐ〜１０３３ｂｐ）構成を使用して，インビトロで遺伝子発現を抑制する特定の方法について記載している。Ｍａｒｔｉｎｅｚ等，２００２，Ｃｅｌｌ，１１０，５６３−５７４は，Ｈｅｌａ細胞にてＲＮＡ干渉を仲介する特定の５’−リン酸化一本鎖ｓｉＲＮＡを含んだ，特定の一本鎖ｓｉＲＮＡ構成について記載している。Ｈａｒｂｏｒｔｈ等，２００３，Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ＆ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄＤｒｕｇＤｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ，１３，８３−１０５は，化学的に及び構造的に修飾された特定のｓｉＲＮＡ分子について記載している。Ｃｈｉｕ及びＲａｎａ，２００３，ＲＮＡ，９，１０３４−１０４８は，化学的に及び構造的に修飾された特定のｓｉＲＮＡ分子について記載している。Ｗｏｏｌｆ等，国際特許出願公開第ＷＯ０３／０６４６２６号及びＷＯ０３／０６４６２５号は，化学修飾された特定のｄｓＲＮＡ構成について記載している。Ｃｓｅｒｈａｌｍｉ−Ｆｒｉｅｄｍａｎ等，２００４，ＥｘｐＤｅｒｍａｔｏｌ．１３，１５５−６２及びＣｈｒｉｓｔｉａｎｏ，米国特許出願公開第ＵＡ２００３００７７６１４号は，Ｈａｉｒｌｅｓｓ（ＨＲ）ｍＲＮＡを標的とする特定のＤＮＡザイムについて記載している。

国際特許出願公開第ＷＯ０１／７５１６４号

本発明は，短干渉核酸（ｓｉＮＡ）分子を使用した，Ｈａｉｒｌｅｓｓ（無毛）（ＨＲ）遺伝子発現の調節に有用な化合物，組成物，及び方法に関する。本発明はまた，小さい核酸分子を使用したＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）による，Ｈａｉｒｌｅｓｓ遺伝子の発現の調節，及び／又は活性の経路に関与する他の遺伝子の発現及び活性の調節に有用な化合物，組成物，及び方法に関する。より詳細には，本発明は，Ｈａｉｒｌｅｓｓ遺伝子の発現の調節に使用される，例えば短干渉核酸（ｓｉＮＡ），短干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ），二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ），マイクロ−ＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ），及びショートヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）分子のような小さい核酸分子，及び方法に関する。

本発明のｓｉＮＡは，非修飾か，又は化学的に修飾され得る。本発明のｓｉＮＡは，化学的に合成されるか，又はベクターから発現されるか，又は酵素により合成され得る。本発明は，細胞内でＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）によってＨａｉｒｌｅｓｓ遺伝子の発現又は活性を調節し得る，様々な化学的に修飾された合成短干渉核酸（ｓｉＮＡ）分子にも関する。化学修飾されたｓｉＮＡを使用すると，インビボでのヌクレアーゼ分解に対する耐性の向上，及び／又は細胞による取込みが改善することによって，天然ｓｉＮＡ分子の様々な性質が向上される。更に，先に刊行された論文に反して，多数の化学修飾を含むｓｉＮＡは，そのＲＮＡｉ活性を保持する。本発明のｓｉＮＡ分子は，治療的，獣医学的，診断的，標的確認上，ゲノム発見上，遺伝子工学上，及び薬理ゲノミクス上などの多様な用途に有用な試薬及び方法を提供する。

一実施態様において，本発明は，独立して又は組合せて，例えば毛又は毛の成長の維持及び／又は発達に関連したＨａｉｒｌｅｓｓを含むタンパク質のようなタンパク質をコード化するＨａｉｒｌｅｓｓ遺伝子，例えば表Ｉに示すジェンバンク受入番号（ＧｅｎＢａｎｋＡｃｃｅｓｓｉｏｎＮｏ）で参照される配列を含む配列をコード化し，本明細書では一般にＨａｉｒｌｅｓｓ又はＨＲと称する遺伝子の発現を調節する，一種又はそれ以上のｓｉＮＡ分子及び方法に関する。以下に，本発明の多様な局面及び実施態様を，本明細書でＨａｉｒｌｅｓｓ又はＨＲと称する例示的なＨａｉｒｌｅｓｓ遺伝子を参照に説明する。しかしながら，多様な局面及び実施態様は，他のＨａｉｒｌｅｓｓ遺伝子，例えば特定のＨａｉｒｌｅｓｓ遺伝子に関連したＨａｉｒｌｅｓｓ相同遺伝子，ＨＲ−１，ＨＲ−２及び多型（例，ヌクレオチド多型，（ＳＮＰｓ））を含む転写産物異形にも関する。このようなものとして，多様な局面及び実施態様はまた，例えば毛又は毛の成長の維持及び／又は発達に関与するシグナル伝達又は遺伝子発現のＨａｉｒｌｅｓｓ仲介経路に関係する他の遺伝子にも関する。これらの更なる遺伝子の標的部位は，本明細書のＨａｉｒｌｅｓｓ遺伝子について説明した方法により分析することができる。従って，他の遺伝子の調節及びそのような調節による効果は，本明細書に記載されている通りに実行，決定，及び測定することができる。

一実施態様において，本発明は，Ｈａｉｒｌｅｓｓ（ＨＲ）遺伝子の発現を下方調節する二本鎖短干渉核酸（ｓｉＮＡ）分子に関する。ここで該ｓｉＮＡ分子は，約１５〜約２８個の塩基対を含む。

一実施態様において，本発明は，ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）を介してＨａｉｒｌｅｓｓ（ＨＲ）ＲＮＡを切断するよう向けられた二本鎖短干渉核酸（ｓｉＮＡ）分子に関する。ここで二本鎖ｓｉＮＡ分子は，第１の鎖及び第２の鎖を含み，該ｓｉＮＡ分子の各鎖は約１８〜約２８個のヌクレオチド長を有し，該ｓｉＮＡ分子の第１の鎖は，ｓｉＮＡ分子がＲＮＡ干渉を介してＨａｉｒｌｅｓｓＲＮＡを切断するように，ＨａｉｒｌｅｓｓＲＮＡに対して十分な相補性を有するヌクレオチド配列を有し，かつ該ｓｉＮＡ分子の第２の鎖は，第１の鎖に相補的なヌクレオチド配列を有する。

一実施態様において，本発明は，ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）を介してＨａｉｒｌｅｓｓ（ＨＲ）ＲＮＡを切断するよう向けられた二本鎖短干渉核酸（ｓｉＮＡ）分子に関する。ここで二本鎖ｓｉＮＡ分子は，第１の鎖及び第２の鎖を含み，該ｓｉＮＡ分子の各鎖は，約１８〜約２３個のヌクレオチド長を有し，該ｓｉＮＡ分子の第１の鎖は，ｓｉＮＡ分子がＲＮＡ干渉を介してＨａｉｒｌｅｓｓＲＮＡを切断するように，ＨａｉｒｌｅｓｓＲＮＡに対して十分な相補性を有するヌクレオチド配列を有し，かつ該ｓｉＮＡ分子の第２の鎖は，第１の鎖に相補的なヌクレオチド配列を有する。

一実施態様において，本発明は，ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）を介してＨａｉｒｌｅｓｓ（ＨＲ）ＲＮＡを切断するよう向けられた，化学的に合成された二本鎖短干渉核酸（ｓｉＮＡ）分子に関する。ここでｓｉＮＡ分子の各鎖は，約１８〜約２８個のヌクレオチド長を有し，ｓｉＮＡ分子の鎖の一つは，ｓｉＮＡ分子がＲＮＡ干渉を介してＨＲＲＮＡを切断するように，ＨＲＲＮＡに対して十分な相補性を有したヌクレオチド配列を有する。

一実施態様において，本発明は，ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）を介してＨａｉｒｌｅｓｓ（ＨＲ）ＲＮＡを切断するよう向けられた，化学的に合成された二本鎖短干渉核酸（ｓｉＮＡ）分子に関する。ここで，ｓｉＮＡ分子の各鎖は，約１８〜約２３個のヌクレオチド長を有し，ｓｉＮＡ分子の鎖の一つは，ｓｉＮＡ分子がＲＮＡ干渉を介してＨＲＲＮＡを切断するように，ＨＲＲＮＡに対して十分な相補性を有したヌクレオチド配列を有する。

一実施態様において，本発明は，Ｈａｉｒｌｅｓｓ遺伝子の発現を下方調節するｓｉＮＡ分子に関し，ここで例えばＨａｉｒｌｅｓｓ遺伝子は，Ｈａｉｒｌｅｓｓをコード化している配列を含む。一実施態様において，本発明は，Ｈａｉｒｌｅｓｓ遺伝子の発現を下方調節するｓｉＮＡ分子に関し，ここで例えばＨａｉｒｌｅｓｓ遺伝子は，Ｈａｉｒｌｅｓｓ遺伝子発現に関与するＨａｉｒｌｅｓｓをコード化していない配列，又は調節要素を含む。

一実施態様において，本発明のｓｉＮＡは，Ｈａｉｒｌｅｓｓ遺伝子又はＨａｉｒｌｅｓｓ遺伝子ファミリーの発現の抑制に使用される。ここで遺伝子又は遺伝子ファミリー配列は，相同性を共有している。このような相同配列は，当該技術分野にて周知であるように，例えば配列アラインメントを使用して確認することができる。ｓｉＮＡ分子は，例えば完全に相同な配列を使用するか，又は例えばミスマッチ及び／又はゆらぎ塩基対のような非標準塩基対を組み込んで更なる標的配列を提供することにより，このような相同配列を標的にするよう構成されることができる。ミスマッチが確認された場合，非標準塩基対（例えば，ミスマッチ及び／又はゆらぎ塩基）を使用して，二個以上の遺伝子配列を標的とするｓｉＮＡ分子を生産することができる。非限定的な例において，ＵＵ及びＣＣ塩基対等の非標準塩基対を使用して，配列相同性を共有する異なるＨａｉｒｌｅｓｓ配列を標的とし得るｓｉＮＡ分子を生産することができる。このようなものとして，本発明のｓｉＮＡを使用する利点の一つは，１個のｓｉＮＡを相同遺伝子間で保存されているヌクレオチド配列に相補的な核酸配列を含むように構成することができることである。このアプローチでは，２個以上のｓｉＮＡを使用する代わりに，１個のｓｉＮＡを使用して異なる遺伝子を標的として，２種以上の遺伝子の発現を抑制することができる。

一実施態様において，本発明は，ＨａｉｒｌｅｓｓＲＮＡに対してＲＮＡｉ活性を有するｓｉＮＡ分子に関し，ここでｓｉＮＡ分子は，例えば表Ｉに示すジェンバンク受入番号を有する配列等，Ｈａｉｒｌｅｓｓをコード化する配列を有する任意のＲＮＡに相補的な配列を含む。別の一実施態様において，本発明は，ＨａｉｒｌｅｓｓＲＮＡに対してＲＮＡｉ活性を有するｓｉＮＡ分子に関し，ここでｓｉＮＡ分子は，例えば表Ｉに示されていないが，当該技術分野にて毛又は毛の成長の維持及び／又は発達に関連するとして知られる，他の突然変異Ｈａｉｒｌｅｓｓ遺伝子のような異形Ｈａｉｒｌｅｓｓコード化配列を有するＲＮＡに相補的な配列を含む。表ＩＩＩ及びＩＶに示す化学修飾，又は本明細書にて別様に記載される化学修飾は，本発明の任意のｓｉＮＡ構成に適用することができる。別の一実施態様において，本発明のｓｉＮＡ分子は，Ｈａｉｒｌｅｓｓ遺伝子のヌクレオチド配列と相互作用することによって，Ｈａｉｒｌｅｓｓ遺伝子発現のサイレンシングを仲介し得るヌクレオチド配列を含む。ここで例えばｓｉＮＡは，Ｈａｉｒｌｅｓｓ遺伝子のクロマチン構造又はメチル化パターンを変更してＨａｉｒｌｅｓｓ遺伝子の転写を妨げる細胞プロセスによって，Ｈａｉｒｌｅｓｓ遺伝子発現の調節を仲介する。

一実施態様において，本発明のｓｉＮＡ分子は，疾患又は病状（例，脱毛症，抜け毛，及び／又は無毛症）に関連したＨａｉｒｌｅｓｓハプロタイプ多型から生じるＨａｉｒｌｅｓｓタンパク質発現の下方調節，又は抑制に使用される。Ｈａｉｒｌｅｓｓ遺伝子，Ｈａｉｒｌｅｓｓタンパク質，又はＲＮＡレベルの分析を行って，このような多型を伴う被験者，又は本明細書に記載された形質，病状，又は疾患を発症する危険を有する被験者を識別することができる。これら被験者は，例えば本発明のｓｉＮＡ分子，及びＨａｉｒｌｅｓｓ遺伝子発現に関係した疾患の治療に有用な他の任意の組成物による治療に対して従順である。従って，Ｈａｉｒｌｅｓｓタンパク質又はＲＮＡレベルの分析により，被験者を治療する際の治療タイプ，及び治療過程を決定することができる。Ｈａｉｒｌｅｓｓタンパク質又はＲＮＡレベルの測定により，治療結果を予測したり，形質，病状，又は疾患に関連する特定のＨａｉｒｌｅｓｓタンパク質のレベル及び／又は活性を調節する化合物及び組成物の効力を決定したりすることができる。

本発明の一実施態様において，ｓｉＮＡ分子は，Ｈａｉｒｌｅｓｓタンパク質をコード化するヌクレオチド配列又はその一部に相補的なヌクレオチド配列を有するアンチセンス鎖を含む。ｓｉＮＡは更に，Ｈａｉｒｌｅｓｓ遺伝子のヌクレオチド配列又はその一部を含むセンス鎖を含む。

別の一実施態様において，ｓｉＮＡ分子は，Ｈａｉｒｌｅｓｓタンパク質をコード化するヌクレオチド配列又はその一部に相補的なヌクレオチド配列を有するアンチセンス領域を含む。ｓｉＮＡ分子は更に，Ｈａｉｒｌｅｓｓ遺伝子のヌクレオチド配列又はその一部を有するセンス領域を含む。

別の一実施態様において，本発明は，ｓｉＮＡ分子のアンチセンス領域にＨａｉｒｌｅｓｓ遺伝子のヌクレオチド配列，又はＨａｉｒｌｅｓｓ遺伝子の配列の一部に相補的なヌクレオチド配列を有するｓｉＮＡ分子に関する。別の一実施態様において，本発明は，Ｈａｉｒｌｅｓｓ遺伝子配列又はその一部を含む配列に相補的な領域，例えばｓｉＮＡ構成のアンチセンス領域を有するｓｉＮＡ分子に関する。

一実施態様において，ＨａｉｒｌｅｓｓｓｉＮＡ構成のアンチセンス領域は，ＳＥＱＩＤＮＯ１〜３０７又は６１５〜６８７のいずれかを含む配列に相補的な配列を有する。一実施態様において，ＨａｉｒｌｅｓｓｓｉＮＡ構成のアンチセンス領域は，ＳＥＱＩＤＮＯ３０８〜６１４，７１０〜７３１，７５４〜７７５，７９８〜８１９，８４２〜８６３，８８６〜９５１，９７４〜９９５，１０４４〜１０９１，１１０１〜１１１８，１１２２，１１２４，１１２６，１１２９，１１３１，１１３３，１１３５，又は１１３８のいずれかを含む配列を有する。別の一実施態様において，Ｈａｉｒｌｅｓｓ構成のセンス領域は，ＳＥＱＩＤＮＯ１〜３０７，６１５〜６８７，６８８〜７０９，７３２〜７５３，７７６〜７９７，８２０〜８４１，８６４〜８８５，９５２〜９７３，９９６〜１０４３，１０９２〜１１００，１１１９〜１１２０，１１２１，１１２３，１１２５，１１２７，１１２８，１１３０，１１３２，１１３４，１１３６又は１１３７のいずれかを含む配列を有する。

一実施態様において，本発明のｓｉＮＡ分子は，ＳＥＱＩＤＮＯ１〜１１３８のいずれかを含む。ＳＥＱＩＤＮＯ１〜１１３８に示される配列は，限定的なものではない。本発明のｓｉＮＡ分子は，任意の連続したＨａｉｒｌｅｓｓ配列（例，約１５〜約２５，若しくはそれ以上，又は約１５，１６，１７，１８，１９，２０，２１，２２，２３，２４，若しくは２５，又はそれ以上の連続したＨａｉｒｌｅｓｓヌクレオチド）を含み得る。

更に別の一実施態様において，本発明は，例えば表Ｉに示すジェンバンク受入番号で表される配列を含む配列，又はその一部に相補的な，ｓｉＮＡ構成のアンチセンス配列等の配列を有する。表ＩＩＩ及び表ＩＶの化学修飾，及び本明細書に記載される化学修飾は，本発明の任意のｓｉＮＡ構成に適用することができる。

一実施態様において，本発明のｓｉＮＡ分子は，約１５〜約３０（例，約１５，１６，１７，１８，１９，２０，２１，２２，２３，２４，２５，２６，２７，２８，２９，又は３０）個のヌクレオチドを含むアンチセンス鎖を有する。ここでアンチセンス鎖は，Ｈａｉｒｌｅｓｓタンパク質をコード化するＲＮＡ配列，又はその一部に相補性を有し，該ｓｉＮＡは更に約１５〜約３０（例，約１５，１６，１７，１８，１９，２０，２１，２２，２３，２４，２５，２６，２７，２８，２９，又は３０）個のヌクレオチドを含むセンス鎖を有し，該センス鎖及び該アンチセンス鎖は，各鎖の少なくとも約１５個のヌクレオチドが他方の鎖に相補性を有する別個のヌクレオチド配列を有する。

本発明の別の一実施態様において，本発明のｓｉＮＡ分子は，約１５〜約３０（例，約１５，１６，１７，１８，１９，２０，２１，２２，２３，２４，２５，２６，２７，２８，２９，又は３０）個のヌクレオチドを含むアンチセンス領域を有し，ここでアンチセンス領域は，Ｈａｉｒｌｅｓｓタンパク質をコード化するＲＮＡ配列に相補性を有し，該ｓｉＮＡは更に約１５〜約３０（例，約１５，１６，１７，１８，１９，２０，２１，２２，２３，２４，２５，２６，２７，２８，２９，又は３０）個のヌクレオチドを含むセンス領域を有し，該センス領域及び該アンチセンス領域は，センス領域がアンチセンス領域に相補的な少なくとも約１５個のヌクレオチドを有する線状の分子内に含まれる。

一実施態様において，本発明のｓｉＮＡ分子は，Ｈａｉｒｌｅｓｓ遺伝子でコード化されたＲＮＡの発現を調節するＲＮＡｉ活性を有する。Ｈａｉｒｌｅｓｓ遺伝子は，互いにある程度の配列相同性を共有し得るため，ｓｉＮＡ分子は，異なるＨａｉｒｌｅｓｓ標的間にて共有されるか，又は代替的に特定のＨａｉｒｌｅｓｓ標的に特有の配列を選択することによって，Ｈａｉｒｌｅｓｓ遺伝子のクラス，又は代替的に特定のＨａｉｒｌｅｓｓ遺伝子（例，多型異形）を標的とするように構成され得る。従って，一実施態様において，ｓｉＮＡ分子は，１個のｓｉＮＡ分子でＨａｉｒｌｅｓｓ遺伝子クラスを標的とするように，数個のＨａｉｒｌｅｓｓ遺伝子異形間の相同性を有する，ＨａｉｒｌｅｓｓＲＮＡ配列の保存領域を標的とするように構成され得る。従って，一実施態様において，本発明のｓｉＮＡ分子は，被験者のＨａｉｒｌｅｓｓ対立遺伝子の一方又は両方の発現を調節する。別の一実施態様において，ｓｉＮＡ分子は，ＲＮＡｉ活性の仲介においてｓｉＮＡ分子が要求する高い特異性のため，特定のＨａｉｒｌｅｓｓＲＮＡ配列に特有の配列（例，単一Ｈａｉｒｌｅｓｓ対立遺伝子又はＨａｉｒｌｅｓｓ一塩基多型（ＳＮＰ））を標的とするように構成されることができる。

一実施態様において，ＲＮＡ干渉遺伝子サイレンシング応答のメディエータとして作用する本発明の核酸分子は，二本鎖核酸分子である。別の一実施態様において，本発明のｓｉＮＡ分子は，約１５〜約３０（例，約１５，１６，１７，１８，１９，２０，２１，２２，２３，２４，２５，２６，２７，２８，２９，又は３０）個のヌクレオチドを有するオリゴヌクレオチド間に約１５〜約３０個の塩基対を含む二重鎖核酸分子から構成される。更に別の一実施態様において，本発明のｓｉＮＡ分子は，例えば約１９個の塩基対，及び３’−末端モノヌクレオチド，ジヌクレオチド，又はトリヌクレオチド・オーバーハングを有する約２１個のヌクレオチドを含む二重鎖のような，約１〜約３（例，約１，２，又は３）個のヌクレオチドを含むオーバーハング末端を有する二重鎖の核酸分子を含む。更に別の一実施態様において，本発明のｓｉＮＡ分子は，両方の末端が平滑，又は代替的に一方の末端が平滑な平滑末端を有する二重鎖核酸分子を含む。

一実施態様において，本発明は，例えばＨａｉｒｌｅｓｓタンパク質をコード化するＲＮＡのようなＨａｉｒｌｅｓｓ発現核酸分子に特異性を有する一つ又はそれ以上の化学修飾ｓｉＮＡ構成に関する。一実施態様において，本発明は，ＨＲ発現核酸分子に特異性を有し，かつ本明細書に記載されている一つ又はそれ以上の化学修飾を含むＲＮＡベースのｓｉＮＡ分子（例，２’−ＯＨヌクレオチドを含むｓｉＮＡ）に関する。このような化学修飾の非限定的な例には，ホスホロチオエートヌクレオチド間結合，２’−デオキシリボヌクレオチド，２’−Ｏ−メチルリボヌクレオチド，２’−デオキシ−２’−フルオロリボヌクレオチド，"万能"ヌクレオチド，"非環式"ヌクレオチド，５−Ｃ−メチルヌクレオチド，及び末端グリセリル及び／又は逆位デオキシ脱塩基残基の組込みを含むが，これらに限定されるものではない。これらの化学修飾は，多様なｓｉＮＡ構成（例，ＲＮＡベースのｓｉＮＡ構成）に使用される場合，細胞内でＲＮＡｉ活性を保つ一方，同時にこれら化合物の血清安定性を劇的に増大させる。更に，Ｐａｒｒｉｓｈ等，前出により発行されたデータに反して，本願出願人等は，多数の（一より多い）ホスホロチオエート置換は十分許容され，また修飾ｓｉＮＡ構成の血清安定性を相当増大させることを証明する。

一実施態様において，本発明のｓｉＮＡ分子は，修飾ヌクレオチドを含むと同時に，ＲＮＡｉを仲介する能力が保持されている。修飾ヌクレオチドは，例えば安定性，活性，及び／又はバイオアベイラビリティ等のインビトロ又はインビボ特性を改善するために使用され得る。例えば，本発明のｓｉＮＡ分子は，修飾ヌクレオチドを，ｓｉＮＡ分子内に存在するヌクレオチドの総数の割合として含み得る。このようなものとして，本発明のｓｉＮＡ分子は，一般に約５％〜約１００％の修飾ヌクレオチド（例，約５％，１０％，１５％，２０％，２５％，３０％，３５％，４０％，４５％，５０％，５５％，６０％，６５％，７０％，７５％，８０％，８５％，９０％，９５％又は１００％の修飾ヌクレオチド）を含み得る。所定のｓｉＮＡ分子内に存在する修飾ヌクレオチドの実際の割合は，ｓｉＮＡ内に存在するヌクレオチドの総数に依存するであろう。ｓｉＮＡ分子が一本鎖の場合，修飾の割合は，一本鎖ｓｉＮＡ分子内に存在するヌクレオチドの総数に基づき得る。同様に，ｓｉＮＡ分子が二本鎖の場合，修飾の割合は，センス鎖，アンチセンス鎖，又はセンス及びアンチセンス鎖の両方に存在するヌクレオチドの総数に基づき得る。

本発明の一局面は，Ｈａｉｒｌｅｓｓ遺伝子の発現を下方調節する二本鎖短干渉核酸（ｓｉＮＡ）分子に関する。一実施態様において，二本鎖ｓｉＮＡ分子は，一つ又はそれ以上の化学修飾を含み，二本鎖ｓｉＮＡの各鎖は，約２１ヌクレオチド長を含む。一実施態様において，二本鎖ｓｉＮＡ分子は，リボヌクレオチドを含まない。別の一実施態様において，二本鎖ｓｉＮＡ分子は，一つ又はそれ以上のリボヌクレオチドを含む。一実施態様において，二本鎖ｓｉＮＡ分子の各鎖は，独立して約１５〜約３０（例，約１５，１６，１７，１８，１９，２０，２１，２２，２３，２４，２５，２６，２７，２８，２９，又は３０）個のヌクレオチドを含み，ここで各鎖は，他方の鎖のヌクレオチドに相補的な約１５〜約３０個（例，約１５，１６，１７，１８，１９，２０，２１，２２，２３，２４，２５，２６，２７，２８，２９，又は３０個）のヌクレオチドを有する。一実施態様において，二本鎖ｓｉＮＡ分子の一方の鎖は，Ｈａｉｒｌｅｓｓ遺伝子のヌクレオチド配列又はその一部に相補的なヌクレオチド配列を有し，二本鎖ｓｉＮＡ分子の第２の鎖は，Ｈａｉｒｌｅｓｓ遺伝子のヌクレオチド配列又はその一部と実質的に同様のヌクレオチド配列を有する。

別の一実施態様において，本発明は，アンチセンス領域及びセンス領域を含む，Ｈａｉｒｌｅｓｓ遺伝子の発現を下方調節する二本鎖短干渉核酸（ｓｉＮＡ）分子に関する。ここでアンチセンス領域は，Ｈａｉｒｌｅｓｓ遺伝子のヌクレオチド配列又はその一部に相補的なヌクレオチド配列を有し，センス領域は，Ｈａｉｒｌｅｓｓ遺伝子のヌクレオチド配列又はその一部と実質的に同様のヌクレオチド配列を有する。一実施態様において，アンチセンス領域，及びセンス領域は，独立して約１５〜約３０（例．約１５，１６，１７，１８，１９，２０，２１，２２，２３，２４，２５，２６，２７，２８，２９，又は３０）個のヌクレオチドを含み，ここでアンチセンス領域は，センス領域のヌクレオチドに相補的な約１５〜約３０（例，約１５，１６，１７，１８，１９，２０，２１，２２，２３，２４，２５，２６，２７，２８，２９，又は３０）個のヌクレオチドを含む。

別の一実施態様において，本発明は，センス領域及びアンチセンス領域を含む，Ｈａｉｒｌｅｓｓ遺伝子の発現を下方調節する二本鎖短干渉核酸（ｓｉＮＡ）分子に関する。ここでアンチセンス領域は，Ｈａｉｒｌｅｓｓ遺伝子をコード化するＲＮＡのヌクレオチド配列又はその一部に相補的なヌクレオチド配列を有し，センス領域は，アンチセンス領域に相補的なヌクレオチド配列を有する。

一実施態様において，本発明のｓｉＮＡ分子は，平滑末端，即ち，オーバーハングヌクレオチドを含まない末端を含む。例えば，ｓｉＮＡ分子は，本明細書に記載される修飾（例，式Ｉ〜ＶＩＩのヌクレオチド，又は"Ｓｔａｂ００"〜"Ｓｔａｂ３２"（表ＩＶ）を含むｓｉＮＡ構成，又はその任意の組合せ（表ＩＶ参照）を含む）を有し，及び／又は本明細書に記載されているいずれの長さも平滑末端，又はオーバーハングヌクレオチドを有さない末端を含み得る。

一実施態様において，本発明のｓｉＮＡ分子はいずれも，一つ又はそれ以上の平滑末端を含み得る。即ち，ここで平滑末端は，オーバーハングヌクレオチドを有さない。一実施態様において，平滑末端を有するｓｉＮＡ分子は，ｓｉＮＡ分子の各鎖に存在するヌクレオチド数に等しい塩基対数を有する。別の一実施態様において，ｓｉＮＡ分子は一つの平滑末端を含み，ここで例えばアンチセンス鎖の５’−末端及びセンス鎖の３’−末端は，オーバーハングヌクレオチドを含まない。別の一例にて，ｓｉＮＡ分子は一つの平滑末端を含み，ここで例えばアンチセンス鎖の３’−末端及びセンス鎖の５’−末端は，オーバーハングヌクレオチドを含まない。別の一例にて，ａｓｉＮＡ分子は二つの平滑末端を含み，ここで例えばアンチセンス鎖の３’−末端及びセンス鎖の５’−末端，並びにアンチセンス鎖の５’−末端及びセンス鎖の３’−末端は，オーバーハングヌクレオチドを含まない。平滑末端を有するｓｉＮＡ分子は，例えば，約１５〜約３０個のヌクレオチド（例，約１５，１６，１７，１８，１９，２０，２１，２２，２３，２４，２５，２６，２７，２８，２９，又は３０個のヌクレオチド）を有し得る。平滑末端を有するｓｉＮＡ分子内に存在する他のヌクレオチドは，ＲＮＡ干渉を仲介するために，例えばミスマッチ，バルジ，ループ，又はゆらぎ塩基対を有してｓｉＮＡ分子の活性を調節し得る。

"平滑末端"とは，対称的な末端，即ちオーバーハングヌクレオチドを含まない二本鎖ｓｉＮＡ分子の末端を意味する。二本鎖ｓｉＮＡ分子の二つの鎖は，末端にオーバーハングヌクレオチドを含まない状態で互いに整合される。例えば，平滑末端を有するｓｉＮＡ構成は，ｓｉＮＡ分子のセンス及びアンチセンス領域間で互いに相補的な末端ヌクレオチドを有する。

一実施態様において，本発明は，Ｈａｉｒｌｅｓｓ遺伝子の発現を下方調節する二本鎖短干渉核酸（ｓｉＮＡ）分子に関する。ここでｓｉＮＡ分子は二つの別個のオリゴヌクレオチド断片から組立てられ，第一の断片はｓｉＮＡ分子のセンス領域を含み，第二の断片はアンチセンス領域を含む。センス領域は，例えばポリヌクレオチドリンカー又は非ヌクレオチドリンカーのようなリンカー分子を介してアンチセンス領域に接続され得る。

一実施態様において，本発明は，Ｈａｉｒｌｅｓｓ遺伝子の発現を下方調節する二本鎖短干渉核酸（ｓｉＮＡ）分子に関する。ここでｓｉＮＡ分子は約１５〜約３０（例，約１５，１６，１７，１８，１９，２０，２１，２２，２３，２４，２５，２６，２７，２８，２９，又は３０）個の塩基対を含み，またｓｉＮＡ分子の各鎖は，一つ又はそれ以上の化学修飾を含む。別の一実施態様において，二本鎖ｓｉＮＡ分子の一方の鎖は，Ｈａｉｒｌｅｓｓ遺伝子のヌクレオチド配列又はその一部に相補的なヌクレオチド配列を有し，二本鎖ｓｉＮＡ分子の第２の鎖は，Ｈａｉｒｌｅｓｓ遺伝子のヌクレオチド配列又はその一部と実質的に同様のヌクレオチド配列を有する。別の一実施態様において，二本鎖ｓｉＮＡ分子の第１の鎖は，Ｈａｉｒｌｅｓｓ遺伝子のヌクレオチド配列又はその一部に相補的なヌクレオチド配列を有し，また二本鎖ｓｉＮＡ分子の第２の鎖は，Ｈａｉｒｌｅｓｓ遺伝子のヌクレオチド配列又はその一部と実質的に同様のヌクレオチド配列を有する。別の一実施態様において，ｓｉＮＡ分子の各鎖は，約１５〜約３０（例．約１５，１６，１７，１８，１９，２０，２１，２２，２３，２４，２５，２６，２７，２８，２９，又は３０）個のヌクレオチドを有し，各鎖は，他方の鎖のヌクレオチドに相補的な少なくとも約１５〜約３０（例．約１５，１６，１７，１８，１９，２０，２１，２２，２３，２４，２５，２６，２７，２８，２９，又は３０）個のヌクレオチドを有する。Ｈａｉｒｌｅｓｓ遺伝子は，例えば，表Ｉに参照される配列を有し得る。

一実施態様において，本発明のｓｉＮＡ分子は，リボヌクレオチドを含まない。別の一実施態様において，本発明のｓｉＮＡ分子はリボヌクレオチドを含む。

一実施態様において，本発明のｓｉＮＡ分子は，Ｈａｉｒｌｅｓｓ遺伝子のヌクレオチド配列又はその一部に相補的なヌクレオチド配列を含むアンチセンス領域を有し，またｓｉＮＡは更に，Ｈａｉｒｌｅｓｓ遺伝子のヌクレオチド配列又はその一部と実質的に同様のヌクレオチド配列を含むセンス領域を有する。別の一実施態様において，アンチセンス領域及びセンス領域の各々は，約１５〜約３０（例．約１５，１６，１７，１８，１９，２０，２１，２２，２３，２４，２５，２６，２７，２８，２９，又は３０）個のヌクレオチドを有し，アンチセンス領域は，センス領域のヌクレオチドに相補的な少なくとも約１５〜約３０（例．約１５，１６，１７，１８，１９，２０，２１，２２，２３，２４，２５，２６，２７，２８，２９，又は３０）個のヌクレオチドを有する。Ｈａｉｒｌｅｓｓ遺伝子は，例えば，表Ｉに参照される配列を有し得る。別の一実施態様において，ｓｉＮＡは二本鎖核酸分子であり，ここでｓｉＮＡ分子の二つの鎖の各々は，独立して約１５〜約４０（例．約１５，１６，１７，１８，１９，２０，２１，２２，２３，２４，２５，２６，２７，２８，２９，３０，３１，２３，３３，３４，３５，３６，３７，３８，３９，又は４０）個のヌクレオチドを含み，またｓｉＮＡ分子の鎖の一つは，Ｈａｉｒｌｅｓｓ遺伝子の核酸配列又はその一部に相補的な少なくとも約１５個（例，約１５，１６，１７，１８，１９，２０，２１，２２，２３，２４又は２５個又はそれ以上）のヌクレオチドを含む。

一実施態様において，本発明のｓｉＮＡ分子は，センス領域及びアンチセンス領域を有し，ここでアンチセンス領域は，Ｈａｉｒｌｅｓｓ遺伝子でコード化されるＲＮＡのヌクレオチド配列又はその一部に相補的なヌクレオチド配列を有し，センス領域は，アンチセンス領域に相補的なヌクレオチド配列を有する。一実施態様において，ｓｉＮＡ分子は，二つの別個のオリゴヌクレオチド断片から組立てられ，ここで第一の断片はｓｉＮＡ分子のセンス領域を有し，第二の断片はアンチセンス領域を有する。別の一実施態様において，センス領域は，リンカー分子を介してアンチセンス領域に接続される。別の一実施態様において，センス領域は，例えばヌクレオチド又は非ヌクレオチドリンカーのようなリンカー分子を介して，アンチセンス領域に接続される。Ｈａｉｒｌｅｓｓ遺伝子は，例えば，表Ｉに参照される配列を有し得る。

一実施態様において，本発明は，センス領域及びアンチセンス領域を有する，Ｈａｉｒｌｅｓｓ遺伝子の発現を下方調節する二本鎖短干渉核酸（ｓｉＮＡ）分子に関する。ここでアンチセンス領域は，Ｈａｉｒｌｅｓｓ遺伝子でコード化されるＲＮＡのヌクレオチド配列又はその一部に相補的なヌクレオチド配列を有し，センス領域はアンチセンス領域に相補的なヌクレオチド配列を有し，またここでｓｉＮＡ分子は，一つ又はそれ以上の修飾されたピリミジン及び／又はプリンヌクレオチドを含む。一実施態様において，センス領域内のピリミジンヌクレオチドは，２’−Ｏ−メチルピリミジンヌクレオチド又は２’−デオキシ−２’−フルオロピリミジンヌクレオチドであり，センス領域内に存在するプリンヌクレオチドは２’−デオキシプリンヌクレオチドである。別の一実施態様において，センス領域内のピリミジンヌクレオチドは２’−デオキシ−２’−フルオロピリミジンヌクレオチドであり，センス領域内に存在するプリンヌクレオチドは２’−Ｏ−メチルプリンヌクレオチドである。別の一実施態様において，センス領域内のピリミジンヌクレオチドは２’−デオキシ−２’−フルオロピリミジンヌクレオチドであり，センス領域内に存在するプリンヌクレオチドは２’−デオキシプリンヌクレオチドである。一実施態様において，アンチセンス領域内のピリミジンヌクレオチドは２’−デオキシ−２’−フルオロピリミジンヌクレオチドであり，アンチセンス領域内に存在するプリンヌクレオチドは，２’−Ｏ−メチル又は２’−デオキシプリンヌクレオチドである。上記したｓｉＮＡ分子のいずれかの別の一実施態様において，センス鎖の非相補的な領域（例，オーバーハング領域）内に存在する任意のヌクレオチドは，２’−デオキシヌクレオチドである。

一実施態様において，本発明は，Ｈａｉｒｌｅｓｓ遺伝子の発現を下方調節する二本鎖短干渉核酸（ｓｉＮＡ）分子に関する。ここでｓｉＮＡ分子は二つの別個のオリゴヌクレオチド断片から組立てられ，第一の断片はｓｉＮＡ分子のセンス領域を含み，第二の断片はアンチセンス領域を含み，またここで該断片は，断片の５’−末端，３’−末端，又は５’−及び３’−末端の両方にて末端キャップ部分を含むセンス領域を含む。一実施態様において，末端キャップ部分は，逆位デオキシ脱塩基部分又はグリセリル部分である。一実施態様において，ｓｉＮＡ分子の二つの断片の各々は，独立して約１５〜約３０（例．約１５，１６，１７，１８，１９，２０，２１，２２，２３，２４，２５，２６，２７，２８，２９，又は３０）個のヌクレオチドを含む。別の一実施態様において，ｓｉＮＡ分子の二つの断片の各々は，独立して約１５〜約４０（例．約１５，１６，１７，１８，１９，２０，２１，２２，２３，２４，２５，２６，２７，２８，２９，３０，３１，２３，３３，３４，３５，３６，３７，３８，３９，又は４０）個のヌクレオチドを有する。非限定的な例において，ｓｉＮＡ分子の二つの断片の各々は，約２１個のヌクレオチドを含む。

一実施態様において，本発明は，少なくとも一つの修飾ヌクレオチドを含むｓｉＮＡ分子に関し，ここで修飾ヌクレオチドは，２’−デオキシ−２’−フルオロヌクレオチドである。ｓｉＮＡは，例えば約１５〜約４０個のヌクレオチド長を有し得る。一実施態様において，ｓｉＮＡ内に存在する全ピリミジンヌクレオチドは，２’−デオキシ−２’−フルオロピリミジンヌクレオチドである。一実施態様において，ｓｉＮＡ内の修飾ヌクレオチドは，少なくとも一つの２’−デオキシ−２’−フルオロシチジン又は２’−デオキシ−２’−フルオロウリジンヌクレオチドを含む。別の一実施態様において，ｓｉＮＡ内の修飾ヌクレオチドは，少なくとも一つの２’−フルオロシチジン及び少なくとも一つの２’−デオキシ−２’−フルオロウリジンヌクレオチドを含む。一実施態様において，ｓｉＮＡ内に存在する全ウリジンヌクレオチドは，２’−デオキシ−２’−フルオロウリジンヌクレオチドである。一実施態様において，ｓｉＮＡ内に存在する全シチジンヌクレオチドは２’−デオキシ−２’−フルオロシチジンヌクレオチドである。一実施態様において，ｓｉＮＡ内に存在する全アデノシンヌクレオチドは，２’−デオキシ−２’−フルオロアデノシンヌクレオチドである。一実施態様において，ｓｉＮＡ内に存在する全グアノシンヌクレオチドは，２’−デオキシ−２’−フルオログアノシンヌクレオチドである。ｓｉＮＡは，更に例えばホスホロチオエート結合のような，少なくとも一つの修飾されたヌクレオチド間結合を含み得る。一実施態様において，２’−デオキシ−２’−フルオロヌクレオチドはｓｉＮＡ内で，例えばピリミジンヌクレオチドを有する位置のような，リボヌクレアーゼによって切断されやすい特定の選択された位置に存在する。

一実施態様において，本発明は，少なくとも一つの修飾ヌクレオチドをｓｉＮＡ分子に導入することを含む，リボヌクレアーゼによる切断に対するｓｉＮＡ分子の安定性を増大させる方法に関する。ここで修飾ヌクレオチドは，２’−デオキシ−２’−フルオロヌクレオチドである。一実施態様において，ｓｉＮＡ内に存在する全ピリミジンヌクレオチドは，２’−デオキシ−２’−フルオロピリミジンヌクレオチドである。一実施態様において，ｓｉＮＡ内の修飾ヌクレオチドは，少なくとも一つの２’−デオキシ−２’−フルオロシチジン又は２’−デオキシ−２’−フルオロウリジンヌクレオチドを含む。別の一実施態様において，ｓｉＮＡ内の修飾ヌクレオチドは，少なくとも一つの２’−フルオロシチジン及び少なくとも一つの２’−デオキシ−２’−フルオロウリジンヌクレオチドを含む。一実施態様において，ｓｉＮＡ内に存在する全ウリジンヌクレオチドは，２’−デオキシ−２’−フルオロウリジンヌクレオチドである。一実施態様において，ｓｉＮＡ内に存在する全シチジンヌクレオチドは，２’−デオキシ−２’−フルオロシチジンヌクレオチドである。一実施態様において，ｓｉＮＡ内に存在する全アデノシンヌクレオチドは，２’−デオキシ−２’−フルオロアデノシンヌクレオチドである。一実施態様において，ｓｉＮＡ内に存在する全グアノシンヌクレオチドは，２’−デオキシ−２’−フルオログアノシンヌクレオチドである。ｓｉＮＡは更に，例えばホスホロチオエート結合のような，少なくとも一つの修飾ヌクレオチド間結合を有してもよい。一実施態様において，２’−デオキシ−２’−フルオロヌクレオチドは，ｓｉＮＡ内で，例えばピリミジンヌクレオチドを有する位置のような，リボヌクレアーゼによって切断されやすい特定の選択された位置に存在する。

一実施態様において，本発明は，センス領域及びアンチセンス領域を有する，Ｈａｉｒｌｅｓｓ遺伝子の発現を下方調節する二本鎖短干渉核酸（ｓｉＮＡ）分子に関する。ここでアンチセンス領域は，Ｈａｉｒｌｅｓｓ遺伝子でコード化されるＲＮＡのヌクレオチド配列又はその一部に相補的なヌクレオチド配列を有し，センス領域は，アンチセンス領域に相補的なヌクレオチドを有し，またここでアンチセンス領域内に存在するプリンヌクレオチドは，２’−デオキシ−プリンヌクレオチドを含む。代替的な実施態様において，アンチセンス領域内に存在するプリンヌクレオチドは，２’−Ｏ−メチルプリンヌクレオチドを含む。上記の実施態様のどちらかにおいて，アンチセンス領域は，該アンチセンス領域の３’位にてホスホロチオエートヌクレオチド間結合を有し得る。代替的に，上記の実施態様のどちらかにおいて，アンチセンス領域は，該アンチセンス領域の３’位にてグリセリル修飾を有し得る。上記した任意のｓｉＮＡ分子の別の一実施態様において，アンチセンス鎖の非相補的領域（例，オーバーハング領域）内に存在する任意のヌクレオチドは，２’−デオキシヌクレオチドである。

一実施態様において，本発明のｓｉＮＡ分子のアンチセンス領域は，特定のＨａｉｒｌｅｓｓ疾患に関連した対立遺伝子に特有の配列，例えば疾患に特異的な対立遺伝子と関連した単ヌクレオチド多型（ＳＮＰ）を含む配列を含むＨａｉｒｌｅｓｓ転写産物の部分に相補的な配列を含む。そのように，本発明のｓｉＮＡ分子のアンチセンス領域は，特定の対立遺伝子に特有の配列に相補的な配列を含み，疾患，病状，又は形質に関連した対立遺伝子に対する選択的ＲＮＡｉを仲介する特異性を提供することができる。

一実施態様において，本発明は，Ｈａｉｒｌｅｓｓ遺伝子の発現を下方調節する二本鎖短干渉核酸（ｓｉＮＡ）分子に関し，ここでｓｉＮＡ分子は，二つの別個のオリゴヌクレオチド断片から組立てられ，第一の断片はｓｉＮＡ分子のセンス領域を有し，第二の断片はアンチセンス領域を有する。別の一実施態様において，ｓｉＮＡ分子は，各鎖が約２１ヌクレオチド長を有する二本鎖核酸分子を含み，ここでｓｉＮＡ分子の各断片の約１９個のヌクレオチドは，ｓｉＮＡ分子の他方の断片のヌクレオチドに相補性を有し，ｓｉＮＡ分子の各断片の少なくとも二つの３’末端ヌクレオチドは，ｓｉＮＡ分子の他方の断片のヌクレオチドと塩基対形成しない。別の一実施態様において，ｓｉＮＡ分子は，各鎖が約１９ヌクレオチド長を有する二本鎖核酸分子を含み，ここでｓｉＮＡ分子の各断片のヌクレオチドは，ｓｉＮＡ分子の他方の断片の相補的ヌクレオチドと塩基対形成して，少なくとも約１５（例，１５，１６，１７，１８，又は１９）個の塩基対を形成し，またここでｓｉＮＡ分子の一方又は両方の末端は，平滑末端である。一実施態様において，ｓｉＮＡ分子の各断片の二つの３’末端ヌクレオチドの各々は，例えば２’−デオキシ−チミジンのような２’−デオキシ−ピリミジンヌクレオチドである。別の一実施態様において，ｓｉＮＡ分子の各断片の全ヌクレオチドは，ｓｉＮＡ分子の他方の断片の相補的ヌクレオチドと塩基対形成する。別の一実施態様において，ｓｉＮＡ分子は，センス領域及びアンチセンス領域を有する約１９〜約２５個の塩基対を含む二本鎖核酸分子であり，ここでアンチセンス領域の約１９個のヌクレオチドは，Ｈａｉｒｌｅｓｓ遺伝子でコード化されるＲＮＡのヌクレオチド配列又はその一部と塩基対形成する。別の一実施態様において，アンチセンス領域の約２１個のヌクレオチドは，Ｈａｉｒｌｅｓｓ遺伝子でコード化されるＲＮＡのヌクレオチド配列又はその一部と塩基対形成する。上記のいずれかの実施態様において，アンチセンス領域を有する断片の５’−末端は，任意にてリン酸基を含んでもよい。

一実施態様において，本発明は，ＨａｉｒｌｅｓｓＲＮＡ配列（例，Ｈａｉｒｌｅｓｓ経路に関与するＨａｉｒｌｅｓｓ遺伝子でコード化される標的ＲＮＡ配列）の発現を抑制する二本鎖短干渉核酸（ｓｉＮＡ）分子に関する。ここでｓｉＮＡ分子はリボヌクレオチドを含まず，また二重鎖ｓｉＮＡ分子の各鎖は，約１５〜約３０個のヌクレオチドを含む。一実施態様において，ｓｉＮＡ分子は２１ヌクレオチド長を有する。リボヌクレオチドを含まないｓｉＮＡ構成の例は，センス／アンチセンス化学構造（ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）の任意の組合せにおける表ＩＶに示す安定化化学構造の組合せ，例えばＳｔａｂ７／８，Ｓｔａｂ７／１１，Ｓｔａｂ８／８，Ｓｔａｂ１８／８，Ｓｔａｂ１８／１１，Ｓｔａｂ１２／１３，Ｓｔａｂ７／１３，Ｓｔａｂ１８／１３，Ｓｔａｂ７／１９，Ｓｔａｂ８／１９，Ｓｔａｂ１８／１９，Ｓｔａｂ７／２０，Ｓｔａｂ８／２０，Ｓｔａｂ１８／２０，Ｓｔａｂ７／３２，Ｓｔａｂ８／３２，又はＳｔａｂ１８／３２（例，Ｓｔａｂ７，８，１１，１２，１３，１４，１５，１７，１８，１９，２０，若しくは３２のセンス若しくはアンチセンス鎖，又はその任意の組合せを有する任意のｓｉＮＡ）である。

一実施態様において，本発明は，ＲＮＡ干渉を介したＨａｉｒｌｅｓｓＲＮＡの切断に向けられた，化学的に合成された二本鎖ＲＮＡ分子に関し，ここで該ＲＮＡ分子の各鎖は約１５〜約３０個のヌクレオチド長を有し，ＲＮＡ分子の一つの鎖は，ＲＮＡ分子がＲＮＡ干渉を介してＨａｉｒｌｅｓｓＲＮＡを切断するように，ＨａｉｒｌｅｓｓＲＮＡに対して十分な相補性を有するヌクレオチド配列を有し，またＲＮＡ分子の少なくとも一つの鎖は，場合によっては本明細書に記載される例えばデオキシヌクレオチド，２’−Ｏ−メチルヌクレオチド，２’−デオキシ−２’−フルオロヌクレオチド，２’−Ｏ−メトキシエチルヌクレオチド等を含むが，これらに限定されない化学修飾された一つ又はそれ以上のヌクレオチドを含み得る。

一実施態様において，本発明は，本発明のｓｉＮＡ分子を含有する医薬品に関する。

一実施態様において，本発明は，本発明のｓｉＮＡ分子を含有する活性成分に関する。

一実施態様において，本発明は，Ｈａｉｒｌｅｓｓ遺伝子の発現を抑制，下方調節，又は低下させる二本鎖短干渉核酸（ｓｉＮＡ）分子の使用に関する。ここでｓｉＮＡ分子は，一つ又はそれ以上の化学修飾を含み，二本鎖ｓｉＮＡの各鎖は，独立して約１５〜約３０個，又はそれ以上（例，約１５，１６，１７，１８，１９，２０，２１，２２，２３，２４，２５，２６，２７，２８，２９若しくは３０個，又はそれ以上）のヌクレオチド長を有する。一実施態様において，本発明のｓｉＮＡ分子は，一つ又はそれ以上の化学修飾を含む二本鎖核酸分子であり，ここでｓｉＮＡ分子の二つの断片の各々は，独立して約１５〜約４０（例．約１５，１６，１７，１８，１９，２０，２１，２２，２３，２４，２５，２６，２７，２８，２９，３０，３１，２３，３３，３４，３５，３６，３７，３８，３９，又は４０）個のヌクレオチドを含み，鎖の一つは，ＲＮＡをコード化するＨａｉｒｌｅｓｓヌクレオチド配列又はその一部に相補的な少なくとも１５個のヌクレオチド配列を有する。非限定的な例において，ｓｉＮＡ分子の二つの断片の各々は，約２１個のヌクレオチドを有する。別の一実施態様において，ｓｉＮＡ分子は，一つ又はそれ以上の化学修飾を含む二重鎖核酸分子であり，ここで各鎖は約２１ヌクレオチド長を有し，またｓｉＮＡ分子の各断片の約１９ヌクレオチドは，ｓｉＮＡ分子の他方の断片の相補的ヌクレオチドと塩基対形成し，ここでｓｉＮＡ分子の各断片の少なくとも二つの３’末端ヌクレオチドは，ｓｉＮＡ分子の他方の断片のヌクレオチドと塩基対形成しない。別の一実施態様において，ｓｉＮＡ分子は一つ又はそれ以上の化学修飾を含む二重鎖核酸分子であり，ここで各鎖は約１９ヌクレオチド長を有し，またｓｉＮＡ分子の各断片のヌクレオチドは，ｓｉＮＡ分子の他方の断片の相補的ヌクレオチドと塩基対形成して，少なくとも約１５（例１５，１６，１７，１８，又は１９）個の塩基対を形成し，ここでｓｉＮＡ分子の一方又は両方の末端は，平滑末端である。一実施態様において，ｓｉＮＡ分子の各断片の二つの３’末端ヌクレオチドの各々は，例えば２’−デオキシ−チミジンのような２’−デオキシ−ピリミジンヌクレオチドである。別の一実施態様において，ｓｉＮＡ分子の各断片の全ヌクレオチドは，ｓｉＮＡ分子の他方の断片の相補的ヌクレオチドと塩基対形成する。別の一実施態様において，ｓｉＮＡ分子は，センス領域及びアンチセンス領域を有する，約１９〜約２５塩基対を含み，かつ一つ又はそれ以上の化学修飾を含む二本鎖核酸分子であり，ここでアンチセンス領域の約１９個のヌクレオチドは，Ｈａｉｒｌｅｓｓ遺伝子でコード化されるＲＮＡのヌクレオチド配列又はその一部と塩基対形成する。別の一実施態様において，アンチセンス領域の約２１個のヌクレオチドは，Ｈａｉｒｌｅｓｓ遺伝子でコード化されるＲＮＡのヌクレオチド配列又はその一部と塩基対形成する。上記の実施態様のいずれかにおいて，アンチセンス領域を含む断片の５’−末端は，任意にてリン酸基を有してもよい。

一実施態様において，本発明は，Ｈａｉｒｌｅｓｓ遺伝子の発現を抑制，下方調節，又は低下させる二本鎖短干渉核酸（ｓｉＮＡ）分子の使用に関する。ここで二本鎖ｓｉＮＡ分子の一つの鎖は，ＨａｉｒｌｅｓｓＲＮＡのヌクレオチド配列又はその一部に相補的なヌクレオチド配列を有するアンチセンス鎖であり，他方の鎖は，アンチセンス鎖のヌクレオチド配列に相補的なヌクレオチド配列を有するセンス鎖であり，また二本鎖ｓｉＮＡ分子内に存在する大部分のピリミジンヌクレオチドは，糖修飾を含む。

一実施態様において，本発明は，Ｈａｉｒｌｅｓｓ遺伝子の発現を抑制，下方調節，又は低下させる二本鎖短干渉核酸（ｓｉＮＡ）分子に関する。ここで二本鎖ｓｉＮＡ分子の一つの鎖は，ＨａｉｒｌｅｓｓＲＮＡのヌクレオチド配列又はその一部に相補的なヌクレオチド配列を有するアンチセンス鎖であり，また他方の鎖は，アンチセンス鎖のヌクレオチド配列に相補的なヌクレオチド配列を有するセンス鎖であり，また二本鎖ｓｉＮＡ分子内に存在する大部分のピリミジンヌクレオチドは，糖修飾を含む。

一実施態様において，本発明は，Ｈａｉｒｌｅｓｓ遺伝子の発現を抑制，下方調節，又は低下させる二本鎖短干渉核酸（ｓｉＮＡ）分子に関する。ここで二本鎖ｓｉＮＡ分子の一つの鎖は，タンパク質をコード化するＨａｉｒｌｅｓｓＲＮＡのヌクレオチド配列又はその一部に相補的なヌクレオチド配列を有するアンチセンス鎖であり，他方の鎖は，アンチセンス鎖のヌクレオチド配列に相補的なヌクレオチド配列を有するセンス鎖であり，また二本鎖ｓｉＮＡ分子内に存在する大部分のピリミジンヌクレオチドは，糖修飾を含む。一実施態様において，ｓｉＮＡ分子の各鎖は，約１５〜約３０個又はそれ以上（例，約１５，１６，１７，１８，１９，２０，２１，２２，２３，２４，２５，２６，２７，２８，２９，又は３０個又はそれ以上）のヌクレオチドを含み，ここで各鎖は，他方の鎖のヌクレオチドに相補性を有する少なくとも約１５個のヌクレオチドを含む。一実施態様において，ｓｉＮＡ分子は二つのオリゴヌクレオチド断片から組立てられ，ここで一つの断片はｓｉＮＡ分子のアンチセンス鎖のヌクレオチド配列を有し，第二の断片は，ｓｉＮＡ分子のセンス領域のヌクレオチド配列を有する。一実施態様において，センス鎖は，例えばポリヌクレオチドリンカー又は非ヌクレオチドリンカーのようなリンカー分子を介してアンチセンス鎖に接続される。更なる実施態様において，センス鎖内に存在するピリミジンヌクレオチドは２’−デオキシ−２’フルオロピリミジンヌクレオチドであり，センス領域内に存在するプリンヌクレオチドは２’−デオキシプリンヌクレオチドである。別の一実施態様において，センス鎖内に存在するピリミジンヌクレオチドは２’−デオキシ−２’フルオロピリミジンヌクレオチドであり，センス領域内に存在するプリンヌクレオチドは２’−Ｏ−メチルプリンヌクレオチドである。更に別の一実施態様において，アンチセンス鎖内に存在するピリミジンヌクレオチドは，２’−デオキシ−２’−フルオロピリミジンヌクレオチドであり，アンチセンス鎖内に存在する任意のプリンヌクレオチドは２’−デオキシプリンヌクレオチドである。別の一実施態様において，アンチセンス鎖は，一つ又はそれ以上の２’−デオキシ−２’−フルオロピリミジンヌクレオチド及び一つ又はそれ以上の２’−０−メチルプリンヌクレオチドを含む。別の一実施態様において，アンチセンス鎖内に存在するピリミジンヌクレオチドは２’−デオキシ−２’−フルオロピリミジンヌクレオチドであり，アンチセンス鎖内に存在する任意のプリンヌクレオチドは，２’−Ｏ−メチルプリンヌクレオチドである。更なる実施態様において，センス鎖は３’−末端及び５’−末端を有し，ここでセンス鎖の５’−末端，３’−末端，又は５’及び３’末端の両方に末端キャップ部分（例，逆位デオキシ脱塩基部分，又は例えば逆位チミジンのような逆位デオキシヌクレオチド部分）が存在する。別の一実施態様において，アンチセンス鎖は，該アンチセンス鎖の３’末端にてホスホロチオエートヌクレオチド間結合を有する。別の一実施態様において，アンチセンス鎖は，３’末端にてグリセリル修飾を有する。別の一実施態様において，アンチセンス鎖の５’−末端は，任意にてリン酸基を有してもよい。

Ｈａｉｒｌｅｓｓ遺伝子の発現を抑制する二本鎖短干渉核酸（ｓｉＮＡ）分子の上記した任意の実施態様において，二本鎖ｓｉＮＡ分子内に存在する大部分のピリミジンヌクレオチドは糖修飾を有し，ｓｉＮＡ分子の二つの鎖の各々は，約１５〜約３０個又はそれ以上（例，約１５，１６，１７，１８，１９，２０，２１，２２，２３，２４，２５，２６，２７，２８，２９，若しくは３０個，又はそれ以上）のヌクレオチドを有する。一実施態様において，ｓｉＮＡ分子の各鎖の約１５〜約３０個又はそれ以上（例，約１５，１６，１７，１８，１９，２０，２１，２２，２３，２４，２５，２６，２７，２８，２９，若しくは３０個又はそれ以上）のヌクレオチドは，ｓｉＮＡ分子の他方の鎖の相補的なヌクレオチドと塩基対形成する。別の一実施態様において，ｓｉＮＡ分子の各鎖の約１５〜約３０個又はそれ以上（例，約１５，１６，１７，１８，１９，２０，２１，２２，２３，２４，２５，２６，２７，２８，２９，若しくは３０個又はそれ以上）のヌクレオチドは，ｓｉＮＡ分子の他方の鎖の相補的なヌクレオチドと塩基対形成し，ここで少なくともｓｉＮＡ分子の各鎖の二つの３’末端ヌクレオチドは，ｓｉＮＡ分子の他方の鎖のヌクレオチドと塩基対形成しない。別の一実施態様において，ｓｉＮＡ分子の各断片の二つの３’末端ヌクレオチドの各々は，例えば２’−デオキシ−チミジンのような２’−デオキシ−ピリミジンである。一実施態様において，ｓｉＮＡ分子の各鎖は，ｓｉＮＡ分子の他方の鎖の相補的なヌクレオチドと塩基対形成する。一実施態様において，アンチセンス鎖の約１５〜約３０（例，約１５，１６，１７，１８，１９，２０，２１，２２，２３，２４，２５，２６，２７，２８，２９，又は３０）個のヌクレオチドは，ＨａｉｒｌｅｓｓＲＮＡのヌクレオチド配列又はその一部と塩基対形成する。一実施態様において，アンチセンス鎖の約１８〜約２５（例，約１８，１９，２０，２１，２２，２３，２４，又は２５）個のヌクレオチドは，ＨａｉｒｌｅｓｓＲＮＡのヌクレオチド配列又はその一部と塩基対形成する。

一実施態様において，本発明は，Ｈａｉｒｌｅｓｓ遺伝子の発現を抑制する二本鎖短干渉核酸（ｓｉＮＡ）分子に関し，ここで二本鎖ｓｉＮＡ分子の一つの鎖は，ＨａｉｒｌｅｓｓＲＮＡのヌクレオチド配列又はその一部に相補的な配列を有するアンチセンス鎖であり，他方の鎖は，アンチセンス鎖のヌクレオチド配列に相補的なヌクレオチド配列を有するセンス鎖であり，二本鎖ｓｉＮＡ分子内に存在する大部分のピリミジンヌクレオチドは糖修飾を有し，またアンチセンス鎖の５’−末端は，任意にてリン酸基を有してもよい。

一実施態様において，本発明は，Ｈａｉｒｌｅｓｓ遺伝子の発現を抑制する二本鎖短干渉核酸（ｓｉＮＡ）分子に関し，ここで二本鎖ｓｉＮＡ分子の一つの鎖は，ＨａｉｒｌｅｓｓＲＮＡのヌクレオチド配列又はその一部に相補的な配列を有するアンチセンス鎖であり，他方の鎖は，アンチセンス鎖のヌクレオチド配列に相補的なヌクレオチド配列を有するセンス鎖であり，二本鎖ｓｉＮＡ分子内に存在する大部分のピリミジンヌクレオチドは糖修飾を有し，またアンチセンス鎖のヌクレオチド配列又はその一部は，ＨａｉｒｌｅｓｓＲＮＡの未翻訳領域のヌクレオチド配列又はその一部に相補性を有する。

一実施態様において，本発明は，Ｈａｉｒｌｅｓｓ遺伝子の発現を抑制する二本鎖短干渉核酸（ｓｉＮＡ）分子に関し，ここで二本鎖ｓｉＮＡ分子の一つの鎖は，ＨａｉｒｌｅｓｓＲＮＡのヌクレオチド配列又はその一部に相補的な配列を有するアンチセンス鎖であり，他方の鎖は，アンチセンス鎖のヌクレオチド配列に相補的なヌクレオチド配列を有するセンス鎖であり，二本鎖ｓｉＮＡ分子内に存在する大部分のピリミジンヌクレオチドは糖修飾を有し，またアンチセンス鎖のヌクレオチド配列は，ＨａｉｒｌｅｓｓＲＮＡ内に存在するＨａｉｒｌｅｓｓＲＮＡのヌクレオチド配列又はその一部に相補性を有する。

一実施態様において，本発明は，薬剤的に許容される担体又は希釈剤中に本発明のｓｉＮＡ分子を含む組成物に関する。

非限定的な例において，化学修飾ヌクレオチドの核酸分子内への導入は，外来的に送達される天然ＲＮＡ分子に固有の，インビボ安定性及びバイオアベイラビリティの潜在的な限界を克服するための強力なツールを提供し得る。例えば，化学修飾された核酸分子は血清内の半減期が比較的長い傾向を有することから，化学修飾核酸分子の使用は，所定の治療効果を達成する特定の核酸分子の用量を低減し得る可能性がある。更に，特定の化学修飾は，特定の細胞又は組織を標的とすることによって核酸分子のバイオアベイラビリティを向上させ，及び／又は，核酸分子の細胞取り込みを改善し得る。従って，化学修飾核酸分子の活性が，天然核酸分子と比較して，例えば全てＲＮＡの核酸分子と比較して低下した場合でも，修飾核酸分子の活性全体は，その分子の安定性及び／又は送達の改善により天然分子と比較して大きくなり得る。天然非修飾ｓｉＮＡとは異なり，化学修飾ｓｉＮＡはまた，ヒト内でインターフェロン活動の活性化を最小にし得る。

本明細書に記載されるｓｉＮＡ分子の任意の実施態様において，本発明のｓｉＮＡ分子のアンチセンス領域は，該アンチセンス領域の３’−末端においてホスホロチオエートヌクレオチド間結合を有し得る。本明細書に記載されるｓｉＮＡ分子の任意の実施態様において，アンチセンス領域は，該アンチセンス領域の５’−末端において約１〜約５個のホスホロチオエートヌクレオチド間結合を有し得る。本明細書に記載されるｓｉＮＡ分子の任意の実施態様において，本発明のｓｉＮＡ分子の３’−末端ヌクレオチドオーバーハングは，核酸の糖，塩基，又はバックボーンにおいて化学修飾されたリボヌクレオチド又はデオキシリボヌクレオチドを含み得る。本明細書に記載されるｓｉＮＡ分子の任意の実施態様において，３’−末端ヌクレオチドオーバーハングは，一つ又はそれ以上の万能塩基リボヌクレオチドを含み得る。本明細書に記載されるｓｉＮＡ分子の任意の実施態様において，３’−末端ヌクレオチドオーバーハングは，一つ又はそれ以上の非環式ヌクレオチドを含み得る。

本発明の一実施態様は，少なくとも一つの本発明のｓｉＮＡ分子を，該核酸分子を発現させるようコード化する核酸配列を含む発現ベクターを提供する。本発明の別の一実施態様は，そのような発現ベクターを含む哺乳類細胞を提供する。哺乳類細胞は，ヒトの細胞であり得る。発現ベクターのｓｉＮＡ分子は，センス領域及びアンチセンス領域を有し得る。アンチセンス領域は，Ｈａｉｒｌｅｓｓをコード化するＲＮＡ配列又はＤＮＡ配列に相補的な配列を有し得，センス領域は，アンチセンス領域に相補的な配列を有し得る。ｓｉＮＡ分子は，相補的なセンス及びアンチセンス領域を有する二つの別個の鎖を含み得る。ｓｉＮＡ分子は，センス及びアンチセンス領域を有する一つの鎖を含み得る。

一実施態様において，本発明は，細胞又は再構成されたインビトロ系内で，Ｈａｉｒｌｅｓｓに対するＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）を仲介し得る化学修飾された短干渉核酸（ｓｉＮＡ）分子に関する。ここで化学修飾は，式Ｉ

（式中，各Ｒ１及びＲ２は，独立して，天然若しくは任意の化学修飾ヌクレオチド，非ヌクレオチド，又はポリヌクレオチドであり，各Ｘ及びＹは，独立してＯ，Ｓ，Ｎ，アルキル，又は置換アルキルであり，各Ｚ及びＷは，独立してＯ，Ｓ，Ｎ，アルキル，置換アルキル，０−アルキル，Ｓ−アルキル，アルカリル，アラルキル，又はアセチルであり，またＷ，Ｘ，Ｙ，及びＺは，任意にて全てＯではない。）のバックボーン修飾ヌクレオチド間結合を含む，１個又はそれ以上（例，約１，２，３，４，５，６，７，８，９，１０個，又はそれ以上）のヌクレオチドを含む。別の一実施態様において，本発明のバックボーン修飾は，ホスホノアセテート及び／又はチオホスホノアセテートヌクレオチド間結合（例えばＳｈｅｅｈａｎ等，２００３，ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄＲｅｓｅａｒｃｈ，３１，４１０９−４１１８参照）を含む。

式Ｉに示した化学修飾ヌクレオチド間結合は，例えば，Ｚ，Ｗ，Ｘ，及び／又はＹのいずれも，独立して硫黄原子を含むことができ，かつｓｉＮＡ二重鎖の一方又は両方のオリゴヌクレオチド鎖，例えばセンス鎖，アンチセンス鎖，又は両方の鎖に存在し得る。本発明のｓｉＮＡ分子は，１個又はそれ以上（例，約１，２，３，４，５，６，７，８，９，１０個，又はそれ以上）の式Ｉの化学修飾されたヌクレオチド間結合を，センス鎖，アンチセンス鎖，又は両方の鎖の３’−末端，５’−末端，又は３’−末端及び５’−末端の両方において含み得る。例えば，例示的な本発明のｓｉＮＡ分子は，約１〜約５個又はそれ以上（例，約１，２，３，４，５個，又はそれ以上）の式Ｉの化学修飾ヌクレオチド間結合を，センス鎖，アンチセンス鎖，又は両方の鎖の５’−末端にて含み得る。別の非限定的な例において，例示的な本発明のｓｉＮＡ分子は，センス鎖，アンチセンス鎖，又は両方の鎖に，式Ｉの化学修飾ヌクレオチド間結合を伴う１個又はそれ以上（例，約１，２，３，４，５，６，７，８，９，１０個，又はそれ以上）のピリミジンヌクレオチドを有し得る。更に別の非限定的な例において，例示的な本発明のｓｉＮＡ分子は，センス鎖，アンチセンス鎖，又は両方の鎖に，式Ｉの化学修飾ヌクレオチド間結合を伴う１個又はそれ以上（例，約１，２，３，４，５，６，７，８，９，１０個，又はそれ以上）のプリンヌクレオチドを有し得る。別の一実施態様において，式Ｉのヌクレオチド間結合（一つ又は複数）を含む本発明のｓｉＮＡ分子は，式Ｉ〜ＶＩＩのいずれかの化学修飾ヌクレオチド又は非ヌクレオチドを含んでもよい。

一実施態様において，本発明は，細胞又は再構成されたインビトロ系内でＨａｉｒｌｅｓｓに対するＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）を仲介し得る化学修飾された短干渉核酸（ｓｉＮＡ）分子に関する。ここで化学修飾は，１個又はそれ以上（例，約１，２，３，４，５，６，７，８，９，１０個，又はそれ以上）の式ＩＩ

（式中，各Ｒ３，Ｒ４，Ｒ５，Ｒ６，Ｒ７，Ｒ８，Ｒ１０，Ｒ１１及びＲ１２は，独立してＨ，ＯＨ，アルキル，置換アルキル，アルカリル若しくはアラルキル，Ｆ，Ｃｌ，Ｂｒ，ＣＮ，ＣＦ₃，ＯＣＦ₃，ＯＣＮ，Ｏ−アルキル，Ｓ−アルキル，Ｎ−アルキル，Ｏ−アルケニル，Ｓ−アルケニル，Ｎ−アルケニル，ＳＯ−アルキル，アルキル−ＯＳＨ，アルキル−ＯＨ，Ｏ−アルキル−ＯＨ，Ｏ−アルキル−ＳＨ，Ｓ−アルキル−ＯＨ，Ｓ−アルキル−ＳＨ，アルキル−Ｓ−アルキル，アルキル−Ｏ−アルキル，ＯＮＯ₂，ＮＯ₂，Ｎ₃，ＮＨ₂，アミノアルキル，アミノ酸，アミノアシル，ＯＮＨ₂，０−アミノアルキル，０−アミノ酸，Ｏ−アミノアシル，ヘテロシクロアルキル，ヘテロシクロアルカリル，アミノアルキルアミノ，ポリアルキルアミノ，置換シリル，又は式Ｉ若しくはＩＩの基，Ｒ９はＯ，Ｓ，ＣＨ₂，Ｓ＝Ｏ，ＣＨＦ，又はＣＦ₂，そしてＢはアデニン，グアニン，ウラシル，シトシン，チミン，２−アミノアデノシン，５−メチルシトシン，２，６−ジアミノプリンのようなヌクレオシド塩基，若しくは標的ＲＮＡに相補的若しくは非相補的な任意の他の非天然塩基，又はフェニル，ナフチル，３−ニトロピロール，５−ニトロインドール，ネブラリン，ピリドン，ピリジノンのような非ヌクレシド塩基，若しくは標的ＲＮＡに相補的若しくは非相補的な任意の他の非天然万能塩基である。）のヌクレオチド又は非ヌクレオチドを含む。

式ＩＩの化学修飾ヌクレオチド又は非ヌクレオチドは，ｓｉＮＡ二重鎖の一方又は両方，例えばセンス鎖，アンチセンス鎖，又は両方の鎖に存在し得る。本発明のｓｉＮＡ分子は，一つ又はそれ以上の式ＩＩの化学修飾ヌクレオチド又は非ヌクレオチドを，センス鎖，アンチセンス鎖，又は両方の鎖の３’−末端，５’−末端，又は３’及び５’−末端の両方にて含み得る。例えば，例示的な本発明のｓｉＮＡ分子は，約１〜約５個又はそれ以上（例，約１，２，３，４，５個，又はそれ以上）の式ＩＩの化学修飾ヌクレオチド又は非ヌクレオチドを，センス鎖，アンチセンス鎖，又は両方の鎖の５’−末端にて含み得る。別の非限定的な例において，例示的な本発明のｓｉＮＡ分子は約１〜約５個又はそれ以上（例，約１，２，３，４，５個，又はそれ以上）の式ＩＩの化学修飾ヌクレオチド又は非ヌクレオチドを，センス鎖，アンチセンス鎖，又は両方の鎖の３’−末端にて含み得る。

一実施態様において，本発明は，細胞又は再構成されたインビトロ系内でＨａｉｒｌｅｓｓに対するＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）を仲介し得る化学修飾された短干渉核酸（ｓｉＮＡ）分子に関する。ここで，化学修飾は，１個又はそれ以上（例，約１，２，３，４，５，６，７，８，９，１０個，又はそれ以上）の式ＩＩＩ

（式中，各Ｒ３，Ｒ４，Ｒ５，Ｒ６，Ｒ７，Ｒ８，Ｒ１０，Ｒ１１及びＲ１２は，独立してＨ，ＯＨ，アルキル，置換アルキル，アルカリル若しくはアラルキル，Ｆ，Ｃｌ，Ｂｒ，ＣＮ，ＣＦ₃，ＯＣＦ₃，ＯＣＮ，Ｏ−アルキル，Ｓ−アルキル，Ｎ−アルキル，Ｏ−アルケニル，Ｓ−アルケニル，Ｎ−アルケニル，ＳＯ−アルキル，アルキル−ＯＳＨ，アルキル−ＯＨ，Ｏ−アルキル−ＯＨ，Ｏ−アルキル−ＳＨ，Ｓ−アルキル−ＯＨ，Ｓ−アルキル−ＳＨ，アルキル−Ｓ−アルキル，アルキル−Ｏ−アルキル，ＯＮＯ₂，ＮＯ₂，Ｎ₃，ＮＨ₂，アミノアルキル，アミノ酸，アミノアシル，ＯＮＨ₂，Ｏ−アミノアルキル，Ｏ−アミノ酸，Ｏ−アミノアシル，ヘテロシクロアルキル，ヘテロシクロアルカリル，アミノアルキルアミノ，ポリアルキルアミノ，置換シリル，又は式Ｉ若しくはＩＩの基であり，Ｒ９はＯ，Ｓ，ＣＨ₂，Ｓ＝Ｏ，ＣＨＦ，又はＣＦ₂であり，そしてＢは，例えばアデニン，グアニン，ウラシル，シトシン，チミン，２−アミノアデノシン，５−メチルシトシン，２，６−ジアミノプリンのようなヌクレオシド塩基，若しくは標的ＲＮＡに相補的若しくは非相補的に使用することができる任意の他の非天然塩基，又は非ヌクレオチド塩基，例えばフェニル，ナフチル，３−ニトロピロール，５−ニトロインドール，ネブラリン，ピリドン，ピリジノンのような非ヌクレオシド塩基，若しくは標的ＲＮＡに相補的若しくは非相補的な任意の他の非天然万能塩基である。）のヌクレオチド又は非ヌクレオチドを含む。

式ＩＩＩの化学修飾ヌクレオチド又は非ヌクレオチドは，ｓｉＮＡ二重鎖の一方又は両方のオリゴヌクレオチド鎖，例えばセンス鎖，アンチセンス鎖，又は両方の鎖に存在し得る。本発明のｓｉＮＡ分子は，一つ又はそれ以上の式ＩＩＩの化学修飾ヌクレオチド又は非ヌクレオチドを，センス鎖，アンチセンス鎖，又は両方の鎖の３’−末端，５’−末端，又は３’及び５’−末端の両方にて含み得る。例えば，例示的な本発明のｓｉＮＡ分子は，約１〜約５個又はそれ以上（例，約１，２，３，４，５個，又はそれ以上）の式ＩＩＩの化学修飾ヌクレオチド又は非ヌクレオチドを，センス鎖，アンチセンス鎖，又は両方の鎖の５’−末端にて含み得る。別の非限定的な例において，例示的な本発明のｓｉＮＡ分子は，約１〜約５個又はそれ以上（例，約１，２，３，４，５個，又はそれ以上）の式ＩＩＩの化学修飾ヌクレオチド又は非ヌクレオチドを，センス鎖，アンチセンス鎖，又は両方の鎖３’−末端にて含み得る。

別の一実施態様において，本発明のｓｉＮＡ分子は式ＩＩ又はＩＩＩのヌクレオチドを含み，ここで式ＩＩ又はＩＩＩのヌクレオチドは，逆位配置である。例えば，式ＩＩ又はＩＩＩのヌクレオチドはｓｉＮＡ構成に対して，例えば一方又は両方のｓｉＮＡ鎖の３’−末端，５’−末端，又は３’及び５’−末端の両方に対して３’−３’，３’−２’，２’−３’，又は５’−５’配置で接続される。

一実施態様において，本発明は，細胞又は再構成されたインビトロ系内でＨａｉｒｌｅｓｓに対するＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）を仲介し得る化学修飾された短干渉核酸（ｓｉＮＡ）分子に関する。ここで，化学修飾は式ＩＶ

（式中，各Ｘ及びＹは独立してＯ，Ｓ，Ｎ，アルキル，置換アルキル，又はアルキルハロであり，各Ｚ及びＷは，独立してＯ，Ｓ，Ｎ，アルキル，置換アルキル，Ｏ−アルキル，Ｓ−アルキル，アルカリル，アラルキル，アルキルハロ，又はアセチルであり，またＷ，Ｘ，Ｙ及びＺは全てＯではない。）の５’−末端リン酸基を含む。

一実施態様において，本発明は，標的に相補的な鎖，例えば標的ＲＮＡに相補的な鎖上に式ＩＶの５’−末端リン酸基を有するｓｉＮＡ分子に関し，ここでｓｉＮＡ分子は，全てＲＮＡのｓｉＮＡを含む。別の一実施態様において，本発明は，標的に相補的な鎖上に式ＩＶの５’−末端リン酸基を有するｓｉＮＡ分子に関し，ここでｓｉＮＡ分子は約１〜約３（例，約１，２，又は３）個のヌクレオチドを含む３’−末端ヌクレオチドオーバーハングを有し，同オーバーハングは一方又は両方の鎖の３’−末端に約１〜約４（例，約１，２，３，又は４）個のデオキシリボヌクレオチドを含む。別の一実施態様において，式ＩＶの５’−末端リン酸基は，本発明のｓｉＮＡ分子，例えば式Ｉ−ＶＩＩのいずれかの化学修飾を有するｓｉＮＡ分子の標的に相補的な鎖上に存在する。

一実施態様において，本発明は，細胞又は再構成されたインビトロ系内でＨａｉｒｌｅｓｓに対するＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）を仲介し得る化学修飾された短干渉核酸（ｓｉＮＡ）分子に関する。ここで，化学修飾は，一つ又はそれ以上のホスホロチオエートヌクレオチド間結合を有する。例えば，非限定的な例において，本発明は，一方のｓｉＮＡ鎖に約１，２，３，４，５，６，７，８個又はそれ以上のホスホロチオエートヌクレオチド間結合を有する化学修飾された短干渉核酸（ｓｉＮＡ）に関する。また更に別の一実施態様において，本発明は，両方のｓｉＮＡ鎖に約１，２，３，４，５，６，７，８個又はそれ以上のホスホロチオエートヌクレオチド間結合を個別に有する化学修飾された短干渉核酸（ｓｉＮＡ）に関する。ホスホロチオエートヌクレオチド間結合は，ｓｉＮＡ二重鎖の一方又は両方のオリゴヌクレオチド鎖，例えばセンス鎖，アンチセンス鎖，又は両方の鎖に存在し得る。本発明のｓｉＮＡ分子は，センス鎖，アンチセンス鎖，又は両方の鎖の，３’−末端，５’−末端，又は３’及び５’−末端の両方において一つ又はそれ以上のホスホロチオエートヌクレオチド間結合を含み得る。例えば，例示的な本発明のｓｉＮＡ分子は，センス鎖，アンチセンス鎖，又は両方の鎖の５’−末端において約１〜約５個又はそれ以上（例，約１，２，３，４，５，又はそれ以上）の連続的なホスホロチオエートヌクレオチド間結合を含み得る。別の非限定的な例において，例示的な本発明のｓｉＮＡ分子は，センス鎖，アンチセンス鎖，又は両方の鎖に１個又はそれ以上（例，約１，２，３，４，５，６，７，８，９，１０個，又はそれ以上）のピリミジンホスホロチオエートヌクレオチド間結合を含み得る。更に別の非限定的な例において，例示的な本発明のｓｉＮＡ分子は，センス鎖，アンチセンス鎖，又は両方の鎖に１個又はそれ以上（例，約１，２，３，４，５，６，７，８，９，１０個，又はそれ以上）のプリンホスホロチオエートヌクレオチド間結合を含み得る。

一実施態様において，本発明は，センス鎖が１個又はそれ以上，例えば，約１，２，３，４，５，６，７，８，９，１０個，又はそれ以上のホスホロチオエートヌクレオチド間結合，及び／又は１個又はそれ以上（例，約１，２，３，４，５，６，７，８，９，１０個又はそれ以上）の２’−デオキシ，２’−Ｏ−メチル，２’−デオキシ−２’−フルオロ，及び／又は約１個又はそれ以上（例，約１，２，３，４，５，６，７，８，９，１０個又はそれ以上）の万能塩基で修飾されたヌクレオチド，並びに任意にてセンス鎖の３’−末端，５’−末端，又は３’及び５’−末端の両方に末端キャップ分子を含み，アンチセンス鎖が約１〜約１０個又はそれ以上，詳細には約１，２，３，４，５，６，７，８，９，１０個，又はそれ以上のホスホロチオエートヌクレオチド間結合，及び／又は１個又はそれ以上（例，約１，２，３，４，５，６，７，８，９，１０個又はそれ以上）の２’−デオキシ，２’−Ｏ−メチル，２’−デオキシ−２’−フルオロ，及び／又は１個又はそれ以上（例，約１，２，３，４，５，６，７，８，９，１０個又はそれ以上）の万能塩基修飾ヌクレオチド，並びに任意にてアンチセンス鎖の３’−末端，５’−末端，又は３’及び５’−末端の両方に末端キャップ分子を含むｓｉＮＡ分子に関する。別の一実施態様において，センス及び／又はアンチセンスｓｉＮＡ鎖の，１個又はそれ以上，例えば約１，２，３，４，５，６，７，８，９，１０個，又はそれ以上のピリミジンヌクレオチドは，同一又は異なる鎖内に存在する１個又はそれ以上，例えば約１，２，３，４，５，６，７，８，９，１０個，又はそれ以上のホスホロチオエートヌクレオチド間結合，及び／又は３’−末端，５’−末端，又は３’及び５’−末端の両方の末端キャップ分子を伴って，又伴わずに２’−デオキシ，２’−Ｏ−メチル及び／又は２’−デオキシ−２’−フルオロヌクレオチドで化学修飾される。

別の一実施態様において，本発明は，センス鎖が約１〜約５個，詳細には約１，２，３，４，又は５個のホスホロチオエートヌクレオチド間結合，及び／又は１個又はそれ以上（例，約１，２，３，４，５個，又はそれ以上）の２’−デオキシ，２’−Ｏ−メチル，２’−デオキシ−２’−フルオロ，及び／又は１個又はそれ以上（例，約１，２，３，４，５個，又はそれ以上）の万能塩基修飾ヌクレオチド，並びに任意にてセンス鎖の３−末端，５’−末端，又は３’及び５’−末端の両方に末端キャップ分子を含み，アンチセンス鎖が約１〜約５個又はそれ以上，詳細には約１，２，３，４，５個又はそれ以上のホスホロチオエートヌクレオチド間結合，及び／又は１個又はそれ以上（例，約１，２，３，４，５，６，７，８，９，１０個又はそれ以上）の２’−デオキシ，２’−Ｏ−メチル，２’−デオキシ−２’−フルオロ，及び／又は１個又はそれ以上（例，約１，２，３，４，５，６，７，８，９，１０個又はそれ以上）の万能塩基修飾ヌクレオチド，並びに任意にてアンチセンス鎖の３’−末端，５’−末端，又は３’及び５’−末端の両方に末端キャップ分子を含むｓｉＮＡ分子に関する。別の一実施態様において，センス及び／又はアンチセンスｓｉＮＡ鎖の，１個又はそれ以上，例えば約１，２，３，４，５，６，７，８，９，１０個，又はそれ以上のピリミジンヌクレオチドは，同一又は異なる鎖内に存在する約１〜約５個又はそれ以上，例えば約１，２，３，４，５個，又はそれ以上のホスホロチオエートヌクレオチド間結合及び／又は３’−末端，５’−末端，又は３’及び５’−末端の両方の末端キャップ分子を伴って，又は伴わずに２’−デオキシ，２’−Ｏ−メチル及び／又は２’−デオキシ−２’−フルオロヌクレオチドで化学修飾される。

一実施態様において，本発明は，アンチセンス鎖が１個又はそれ以上，例えば，約１，２，３，４，５，６，７，８，９，１０個，又はそれ以上のホスホロチオエートヌクレオチド間結合，及び／又は約１個又はそれ以上（例，約１，２，３，４，５，６，７，８，９，１０個又はそれ以上）の２’−デオキシ，２’−Ｏ−メチル，２’−デオキシ−２’−フルオロ，及び／又は１個又はそれ以上（例，約１，２，３，４，５，６，７，８，９，１０個又はそれ以上）の万能塩基修飾ヌクレオチド，並びに任意にてセンス鎖の３’−末端，５’−末端，又は３’及び５’−末端の両方に末端キャップ分子を含み，アンチセンス鎖が約１〜約１０個又はそれ以上，詳細には約１，２，３，４，５，６，７，８，９，１０個又はそれ以上のホスホロチオエートヌクレオチド間結合，及び／又は１個又はそれ以上（例，約１，２，３，４，５，６，７，８，９，１０個又はそれ以上）の２’−デオキシ，２’−Ｏ−メチル，２’−デオキシ−２’−フルオロ，及び／又は１個又はそれ以上（例，約１，２，３，４，５，６，７，８，９，１０個又はそれ以上）の万能塩基修飾ヌクレオチド，並びに任意にてアンチセンス鎖の３’−末端，５’−末端，又は３’及び５’−末端の両方に末端キャップ分子を含むｓｉＮＡ分子に関する。別の一実施態様において，センス及び／又はアンチセンスｓｉＮＡ鎖の，１個又はそれ以上，例えば約１，２，３，４，５，６，７，８，９，１０個又はそれ以上のピリミジンヌクレオチドは，同一又は異なる鎖内に存在する１個又はそれ以上，例えば，約１，２，３，４，５，６，７，８，９，１０個又はそれ以上のホスホロチオエートヌクレオチド間結合，及び／又は３’−末端，５’−末端，又は３’及び５’−末端の両方の末端キャップ分子を伴って，又は伴わずに２’−デオキシ，２’−Ｏ−メチル及び／又は２’−デオキシ−２’−フルオロヌクレオチドで化学修飾される。

別の一実施態様において，本発明は，アンチセンス鎖が約１〜約５個又はそれ以上，詳細には約１，２，３，４，５個又はそれ以上のホスホロチオエートヌクレオチド間結合，及び／又は１個又はそれ以上（例，約１，２，３，４，５，６，７，８，９，１０個又はそれ以上）の２’−デオキシ，２’−Ｏ−メチル，２’−デオキシ−２’−フルオロ，及び／又は１個又はそれ以上（例，約１，２，３，４，５，６，７，８，９，１０個又はそれ以上）の万能塩基修飾ヌクレオチド，並びに任意にてセンス鎖の３’−末端，５’−末端，又は３’及び５’−末端の両方に末端キャップ分子を含み，アンチセンス鎖が約１〜約５個又はそれ以上，詳細には約１，２，３，４，５個又はそれ以上ホスホロチオエートヌクレオチド間結合，及び／又は１個又はそれ以上（例，約１，２，３，４，５，６，７，８，９，１０個又はそれ以上）の２’−デオキシ，２’−Ｏ−メチル，２’−デオキシ−２’−フルオロ，及び／又は１個又はそれ以上（例，約１，２，３，４，５，６，７，８，９，１０個又はそれ以上）の万能塩基修飾ヌクレオチド，並びに任意にてアンチセンス鎖の３’−末端，５’−末端，又は３’及び５’−末端の両方に末端キャップ分子を含むｓｉＮＡ分子に関する。別の一実施態様において，センス及び／又はアンチセンスｓｉＮＡ鎖の１個又はそれ以上，例えば約１，２，３，４，５，６，７，８，９，１０個又はそれ以上のピリミジンヌクレオチドは，同一又は異なる鎖内に存在する約１〜約５個，例えば約１，２，３，４，５個又はそれ以上のホスホロチオエートヌクレオチド間結合，及び／又は３’−末端，５’−末端，又は３’及び５’−末端の両方の末端キャップ分子を伴って，又は伴わずに２’−デオキシ，２’−Ｏ−メチル及び／又は２’−デオキシ−２’−フルオロヌクレオチドで化学修飾される。

一実施態様において，本発明は，ｓｉＮＡ分子の各鎖内に約１〜約５個又はそれ以上（詳細には約１，２，３，４，５個又はそれ以上）のホスホロチオエートヌクレオチド間結合を含む，化学修飾された短干渉核酸（ｓｉＮＡ）分子に関する。

別の一実施態様において，本発明は，２’−５’ヌクレオチド間結合を含むｓｉＮＡ分子に関する。一つ又は複数の２’−５’ヌクレオチド間結合は，ｓｉＮＡ配列鎖の一方又は両方の３’−末端，５’−末端，又は３’及び５’−末端の両方に存在し得る。加えて，一つ又は複数の２’−５’ヌクレオチド間結合は，ｓｉＮＡ配列鎖の一方又は両方内の様々な他の位置に存在し得，例えばｓｉＮＡ分子の一方又は両方の鎖内のピリミジンヌクレオチドの各ヌクレオチド間結合を含む，約１，２，３，４，５，６，７，８，９，１０個，又はそれ以上の結合は，２’−５’ヌクレオチド間結合を含み得，又はｓｉＮＡ分子の一方又は両方の鎖内のプリンヌクレオチドの各ヌクレオチド間結合を含む，約１，２，３，４，５，６，７，８，９，１０個，又はそれ以上の結合は２’−５’ヌクレオチド間結合を含み得る。

別の一実施態様において，本発明の化学修飾されたｓｉＮＡ分子は，二つの鎖を有する二重鎖を含み，その一方又は両方が化学修飾されてよく，各鎖は独立して約１５〜約３０（例，約１５，１６，１７，１８，１９，２０，２１，２２，２３，２４，２５，２６，２７，２８，２９，又は３０）個のヌクレオチド長を有し，該二重鎖は約１５〜約３０（例，約１５，１６，１７，１８，１９，２０，２１，２２，２３，２４，２５，２６，２７，２８，２９，又は３０）個の塩基対を含み，該化学修飾は式Ｉ〜ＶＩＩのいずれかの構造を有する。例えば，本発明の例示的な化学修飾ｓｉＮＡ分子は，二つの鎖を有する二重鎖を含み，一方又は両方の鎖は式Ｉ〜ＶＩＩのいずれかの化学修飾，又はその任意の組合せにより化学修飾されてもよく，各鎖は約２１個のヌクレオチドから構成されており，また各鎖は２個のヌクレオチドを有する３’−末端ヌクレオチドオーバーハングを有し，該二重鎖は約１９個の塩基対を有する。別の一実施態様において，本発明のｓｉＮＡ分子は，一本鎖ヘアピン構造を含み，該ｓｉＮＡは約３６〜約７０（例，約３６，４０，４５，５０，５５，６０，６５，又は７０）個のヌクレオチド長を有し，かつ約１５〜約３０（例，約１５，１６，１７，１８，１９，２０，２１，２２，２３，２４，２５，２６，２７，２８，２９，又は３０）個の塩基対を含み，該ｓｉＮＡは，式Ｉ〜ＶＩＩのいずれかの構造又はその任意の組合せを含む化学修飾を有し得る。例えば，本発明の例示的な化学修飾ｓｉＮＡ分子は，線状のオリゴヌクレオチドを含み，該線状オリゴヌクレオチドは，式Ｉ〜ＶＩＩのいずれかの化学修飾又はその任意の組合せで化学修飾され，約４２〜約５０（例，約４２，４３，４４，４５，４６，４７，４８，４９，又は５０）個のヌクレオチドを有し，該線状オリゴヌクレオチドは，約１９〜約２１（例，１９，２０，又は２１）個の塩基対，及び２個のヌクレオチドを含む３’−末端ヌクレオチドオーバーハングを含むヘアピン構造を形成する。別の一実施態様において，本発明の線状ｓｉＮＡ分子はステムループモチーフを有し，該ループ部分は生物分解性を有する。例えば，本発明の線状ｓｉＮＡ分子は，インビボでｓｉＮＡ分子のループ部分が生分解すると，例えば約２個のヌクレオチドを含む３’−末端ヌクレオチドオーバーハングのような３’−末端オーバーハングを有する二本鎖ｓｉＮＡ分子を生成し得るようにデザインされている。

別の一実施態様において，本発明のｓｉＮＡ分子はヘアピン構造を含み，該ｓｉＮＡは約３〜約２５（例，約３，４，５，６，７，８，９，１０，１１，１２，１３，１４，１５，１６，１７，１８，１９，２０，２１，２２，２３，２４，又は２５）個の塩基対を含む約２５〜約５０（例，約２５，２６，２７，２８，２９，３０，３１，３２，３３，３４，３５，３６，３７，３８，３９，４０，４１，４２，４３，４４，４５，４６，４７，４８，４９，又は５０）個のヌクレオチド長を有し，またｓｉＮＡは，式Ｉ〜ＶＩＩのいずれかの構造，又はその任意の組合せを有する一つ又はそれ以上の化学修飾を含み得る。例えば，本発明の例示的な化学修飾ｓｉＮＡ分子は，式Ｉ〜ＶＩＩのいずれかの又はその任意の組合せの一つ又はそれ以上の化学修飾で修飾された，約２５〜約３５（例，約２５，２６，２７，２８，２９，３０，３１，３２，３３，３４，又は３５）個のヌクレオチドを含む線状オリゴヌクレオチドを含み，該線状オリゴヌクレオチドは，約３〜約２５（例，約３，４，５，６，７，８，９，１０，１１，１２，１３，１４，１５，１６，１７，１８，１９，２０，２１，２２，２３，２４，又は２５）個の塩基対と，本明細書に記載されているように化学修飾され得る５’−末端リン酸基（例えば，式ＩＶの５’−末端リン酸基）とを有するヘアピン構造を形成している。別の一実施態様において，本発明の線状ｓｉＮＡ分子はステムループモチーフを有し，該ｓｉＮＡ分子のループ部分は生物分解性である。一実施態様において，本発明の線状ｓｉＮＡ分子は，非ヌクレオチドリンカーを含むループ部分を有する。

別の一実施態様において，本発明のｓｉＮＡ分子は非対称ヘアピン構造を含み，該ｓｉＮＡは，約３〜約２５（例，約３，４，５，６，７，８，９，１０，１１，１２，１３，１４，１５，１６，１７，１８，１９，２０，２１，２２，２３，２４，又は２５）個の塩基対を含む約２５〜約５０（例，約２５，２６，２７，２８，２９，３０，３１，３２，３３，３４，３５，３６，３７，３８，３９，４０，４１，４２，４３，４４，４５，４６，４７，４８，４９，又は５０）個のヌクレオチド長を有し，該ｓｉＮＡは式Ｉ〜ＶＩＩのいずれか構造，又はその任意の組合せを有する一つ又はそれ以上の化学修飾を含み得る。例えば，本発明の例示的な化学修飾ｓｉＮＡ分子は，式Ｉ〜ＶＩＩのいずれか，又はその任意の組合せの一つ又はそれ以上の化学修飾で修飾された，約２５〜約３５（例，約２５，２６，２７，２８，２９，３０，３１，３２，３３，３４，又は３５）個のヌクレオチドを含む線状オリゴヌクレオチドを含み，また線状オリゴヌクレオチドは，約３〜約２５（例，約３，４，５，６，７，８，９，１０，１１，１２，１３，１４，１５，１６，１７，１８，１９，２０，２１，２２，２３，２４，又は２５）個の塩基対と，本明細書に記載されているように化学修飾され得る５’−末端リン酸基（例えば，式ＩＶの５’−末端リン酸基）とを有する非対称ヘアピン構造を形成している。一実施態様において，本発明の非対称ヘアピンｓｉＮＡ分子はステムーループモチーフを有し，該ｓｉＮＡ分子のループ部分は生物分解性である。別の一実施態様において，本発明の非対称ヘアピンｓｉＮＡ分子は，非ヌクレオチドリンカーを含むループ部分を有する。

別の一実施態様において，本発明のｓｉＮＡ分子は非対称二本鎖構造を含み，該構造は，センス及びアンチセンス領域を有する別個のポリヌクレオチド鎖を含み，アンチセンス領域は約１５〜約３０（例，約１５，１６，１７，１８，１９，２０，２１，２２，２３，２４，２５，２６，２７，２８，２９，又は３０）個のヌクレオチド長を有し，センス領域は約３〜約２５（例，約３，４，５，６，７，８，９，１０，１１，１２，１３，１４，１５，１６，１７，１８，１９，２０，２１，２２，２３，２４，又は２５）個のヌクレオチド長を有し，センス領域及びアンチセンス領域は，少なくとも３個の相補的なヌクレオチドを有し，該ｓｉＮＡは，式Ｉ〜ＶＩＩのいずれかの構造又はその任意の組合せの一つ又はそれ以上の化学修飾を含み得る。例えば，本発明の例示的な化学修飾ｓｉＮＡ分子は非対称二本鎖構造を含み，該構造は，センス及びアンチセンス領域を有する別個のポリヌクレオチド鎖を含み，アンチセンス領域は約１８〜約２３（例，約１８，１９，２０，２１，２２，又は２３）個のヌクレオチド長を有し，センス領域は約３〜約１５（例，約３，４，５，６，７，８，９，１０，１１，１２，１３，１４，又は１５）個のヌクレオチド長を有し，センス領域及びアンチセンス領域は，少なくとも３個の相補的なヌクレオチドを有し，該ｓｉＮＡは，式Ｉ〜ＶＩＩのいずれかの構造又はその任意の組合せの一つ又はそれ以上の化学修飾を含み得る。別の一実施態様において，非対称二本鎖ｓｉＮＡ分子はまた，本明細書に記載されているように化学修飾され得る５’−末端リン酸基（例えば式ＩＶの５’−末端リン酸基）を有してもよい。

別の一実施態様において，本発明のｓｉＮＡ分子は環状の核酸分子を含み，該ｓｉＮＡは約１５〜約３０（例，約１５，１６，１７，１８，１９，２０，２１，２２，２３，２４，２５，２６，２７，２８，２９，又は３０）個の塩基対を含む約３８〜約７０（例，約３８，４０，４５，５０，５５，６０，６５，又は７０）個のヌクレオチド長を有し，該ｓｉＮＡは式Ｉ〜ＶＩＩのいずれか構造，又はその任意の組合せの一つ又はそれ以上の化学修飾を含み得る。例えば，本発明の例示的な化学修飾ｓｉＮＡ分子は，式Ｉ〜ＶＩＩのいずれか，又はその任意の組合せの一つ又はそれ以上の化学修飾で修飾された約４２〜約５０（例，約４２，４３，４４，４５，４６，４７，４８，４９，又は５０）個のヌクレオチドを含む環状オリゴヌクレオチドを含み，また環状オリゴヌクレオチドは，約１９個の塩基対と２個のループを有するダンベル構造を形成している。

別の一実施態様において，本発明の環状ｓｉＮＡ分子は，２個のループ部分を有し，該ｓｉＮＡ分子の一方又は両方のループは生物分解性である。例えば，本発明の環状ｓｉＮＡ分子は，インビボでｓｉＮＡ分子のループ部分が分解されると，約２個のヌクレオチドを含む３’−末端ヌクレオチドオーバーハングのような３’−末端オーバーハングを有する二重鎖ｓｉＮＡ分子を生成し得るようにデザインされている。

一実施態様において，本発明のｓｉＮＡ分子は，少なくとも１個（例，約１，２，３，４，５，６，７，８，９，１０個，又はそれ以上）の例えば式Ｖ

（式中，各Ｒ３，Ｒ４，Ｒ５，Ｒ６，Ｒ７，Ｒ８，Ｒ１０，Ｒ１１，Ｒ１２，及びＲ１３は，独立してＨ，ＯＨ，アルキル，置換アルキル，アルカリル若しくはアラルキル，Ｆ，Ｃｌ，Ｂｒ，ＣＮ，ＣＦ₃，ＯＣＦ₃，ＯＣＮ，Ｏ−アルキル，Ｓ−アルキル，Ｎ−アルキル，Ｏ−アルケニル，Ｓ−アルケニル，Ｎ−アルケニル，ＳＯ−アルキル，アルキル−ＯＳＨ，アルキル−ＯＨ，Ｏ−アルキル−ＯＨ，Ｏ−アルキル−ＳＨ，Ｓ−アルキル−ＯＨ，Ｓ−アルキル−ＳＨ，アルキル−Ｓ−アルキル，アルキル−Ｏ−アルキル，ＯＮＯ₂，ＮＯ₂，Ｎ₃，ＮＨ₂，アミノアルキル，アミノ酸，アミノアシル，ＯＮＨ₂，Ｏ−アミノアルキル，Ｏ−アミノ酸，Ｏ−アミノアシル，ヘテロシクロアルキル，ヘテロシクロアルカリル，アミノアルキルアミノ，ポリアルキルアミノ，置換シリル，又は式Ｉ若しくはＩＩの基であり，Ｒ９はＯ，Ｓ，ＣＨ₂，Ｓ＝Ｏ，ＣＨＦ，又はＣＦ₂である。）の化合物のような脱塩基部分を有する。

一実施態様において，本発明のｓｉＮＡ分子は，少なくとも１個（例，約１，２，３，４，５，６，７，８，９，１０個，又はそれ以上）の，例えば式ＶＩ

（式中，各Ｒ３，Ｒ４，Ｒ５，Ｒ６，Ｒ７，Ｒ８，Ｒ１０，Ｒ１１，Ｒ１２，及びＲ１３は，独立してＨ，ＯＨ，アルキル，置換アルキル，アルカリル若しくはアラルキル，Ｆ，Ｃｌ，Ｂｒ，ＣＮ，ＣＦ₃，ＯＣＦ₃，ＯＣＮ，Ｏ−アルキル，Ｓ−アルキル，Ｎ−アルキル，Ｏ−アルケニル，Ｓ−アルケニル，Ｎ−アルケニル，ＳＯ−アルキル，アルキル−ＯＳＨ，アルキル−ＯＨ，Ｏ−アルキル−ＯＨ，Ｏ−アルキル−ＳＨ，Ｓ−アルキル−ＯＨ，Ｓ−アルキル−ＳＨ，アルキル−Ｓ−アルキル，アルキル−Ｏ−アルキル，ＯＮＯ₂，ＮＯ₂，Ｎ₃，ＮＨ₂，アミノアルキル，アミノ酸，アミノアシル，ＯＮＨ₂，Ｏ−アミノアルキル，Ｏ−アミノ酸，Ｏ−アミノアシル，ヘテロシクロアルキル，ヘテロシクロアルカリル，アミノアルキルアミノ，ポリアルキルアミノ，置換シリル，又は式Ｉ若しくはＩＩの基であり，Ｒ９は，Ｏ，Ｓ，ＣＨ₂，Ｓ＝Ｏ，ＣＨＦ，又はＣＦ₂であり，Ｒ２，Ｒ３，Ｒ８又はＲ１３のいずれかは，本発明のｓｉＮＡ分子の結合点として働く。）の化合物のような逆位脱塩基部分を有する。

別の一実施態様において，本発明のｓｉＮＡ分子は，少なくとも１個の（例，約１，２，３，４，５，６，７，８，９，１０個，又はそれ以上）の例えば式ＶＩＩ

（式中，各ｎは，独立して１〜１２の整数であり，各Ｒ１，Ｒ２及びＲ３は，独立してＨ，ＯＨ，アルキル，置換アルキル，アルカリル若しくはアラルキル，Ｆ，Ｃｌ，Ｂｒ，ＣＮ，ＣＦ₃，ＯＣＦ₃，ＯＣＮ，０−アルキル，Ｓ−アルキル，Ｎ−アルキル，Ｏ−アルケニル，Ｓ−アルケニル，Ｎ−アルケニル，ＳＯ−アルキル，アルキル−ＯＳＨ，アルキル−ＯＨ，Ｏ−アルキル−ＯＨ，Ｏ−アルキル−ＳＨ，Ｓ−アルキル−ＯＨ，Ｓ−アルキル−ＳＨ，アルキル−Ｓ−アルキル，アルキル−Ｏ−アルキル，ＯＮＯ₂，ＮＯ₂，Ｎ₃，ＮＨ₂，アミノアルキル，アミノ酸，アミノアシル，ＯＮＨ₂，Ｏ−アミノアルキル，Ｏ−アミノ酸，Ｏ−アミノアシル，ヘテロシクロアルキル，ヘテロシクロアルカリル，アミノアルキルアミノ，ポリアルキルアミノ，置換シリル，又は式Ｉの基であり，及びＲ１，Ｒ２又はＲ３は，本発明のｓｉＮＡ分子の結合点として働く。）の化合物のような置換ポリアルキル部分を有する。

別の一実施態様において，本発明は，式ＶＩＩの化合物に関し，式中Ｒ１及びＲ２は，ヒドロキシル（ＯＨ）基であり，ｎ＝１，及びＲ３はＯを含み，かつ本発明の二本鎖ｓｉＮＡ分子若しくは本発明の一本鎖ｓｉＮＡ分子の一方又は両方の鎖の３’−末端，５’−末端，又は３’及び５’−末端の両方の結合点である。この修飾は本明細書では"グリセリル"と称される（例えば図１０の修飾６）。

別の一実施態様において，本発明の化学修飾されたヌクレオシド若しくは非ヌクレオシド（例，式Ｖ，ＶＩ又はＶＩＩのいずれかを有する部分）は，本発明のｓｉＮＡ分子の３’−末端，５’−末端，又は３’及び５’−末端の両方に存在する。例えば，化学修飾されたヌクレオシド若しくは非ヌクレオシド（例，式Ｖ，ＶＩ又はＶＩＩを有する部分）は，ｓｉＮＡ分子のアンチセンス鎖，センス鎖及び／又はアンチセンス鎖及びセンス鎖の両方の３’−末端，５’−末端，又は３’及び５’−末端の両方に存在し得る。一実施態様において，化学修飾されたヌクレオシド若しくは非ヌクレオシド（例，式Ｖ，ＶＩ又はＶＩＩを有する部分）は，本発明の二本鎖ｓｉＮＡ分子のセンス鎖の５’−末端及び３’−末端，並びにアンチセンス鎖の３’−末端に存在する。一実施態様において，化学修飾されたヌクレオシド若しくは非ヌクレオシド（例，式Ｖ，ＶＩ又はＶＩＩを有する部分）は，本発明の二本鎖ｓｉＮＡ分子のセンス鎖の５’−末端及び３’−末端，並びにアンチセンス鎖の３’−末端の末端位置に存在する。一実施態様において，化学修飾されたヌクレオシド若しくは非ヌクレオシド（例，式Ｖ，ＶＩ又はＶＩＩを有する部分）は，本発明の二本鎖ｓｉＮＡ分子のセンス鎖の５’−末端及び３’−末端，並びにアンチセンス鎖の３’−末端に存在する。一実施態様において，化学修飾されたヌクレオシド若しくは非ヌクレオシド（例，式Ｖ，ＶＩ又はＶＩＩを有する部分）は，本発明の二本鎖ｓｉＮＡ分子のセンス鎖の５’−末端及び３’−末端，並びにアンチセンス鎖の３’−末端の終わりから２番目の位置に存在する。加えて，本明細書に記載されるように，ヘアピンｓｉＮＡ分子の３’−末端又は５’−末端に式ＶＩＩの部分が存在し得る。

別の一実施態様において，本発明のｓｉＮＡ分子は，式ＶＩ又はＶＩがｓｉＮＡ構成に対して例えばｓｉＮＡ鎖の一方又は両方の３’−末端，５’−末端，又は３’及び５’−末端の両方に３’−３’，３’−２’，２’−３’，又は５’−５’配置で接続される式Ｖ又はＶＩの脱塩基残基を有する。

一実施態様において，本発明のｓｉＮＡ分子は，例えば該ｓｉＮＡ分子の５’−末端，３’−末端，５’及び３’−末端の両方，又はその任意の組合せの箇所にて，１個又はそれ以上（例，約１，２，３，４，５，６，７，８，９，１０個，又はそれ以上）の固定化核酸（ＬＮＡ）ヌクレオチドを有する。

別の一実施態様において，本発明のｓｉＮＡ分子は，例えばｓｉＮＡ分子の５’−末端，３’−末端，５’及び３’−末端の両方，又はその任意の組合せの箇所にて，１個又はそれ以上（例，約１，２，３，４，５，６，７，８，９，１０個，又はそれ以上）の非環式ヌクレオチドを有する。

一実施態様において，本発明は，センス領域を有する本発明の化学修飾された短干渉核酸（ｓｉＮＡ）分子に関し，ここでセンス領域内に存在する任意（例，一つ若しくはそれ以上，又は全部）のピリミジンヌクレオチドは，２’−デオキシ−２’−フルオロピリミジンヌクレオチドであり（例，全ピリミジンヌクレオチドが２’−デオキシ−２’−フルオロピリミジンヌクレオチド，又は代替的に複数のピリミジンヌクレオチドが２’−デオキシ−２’−フルオロピリミジンヌクレオチド），センス領域内に存在する任意（例，一つ若しくはそれ以上，又は全部）のプリンヌクレオチドは，２’−デオキシプリンヌクレオチドである（例，全プリンヌクレオチドが２’−デオキシプリンヌクレオチド，又は代替的に複数のプリンヌクレオチドが２’−デオキシプリンヌクレオチド）。

一実施態様において，本発明は，センス領域を有する本発明の化学修飾された短干渉核酸（ｓｉＮＡ）分子に関し，ここでセンス領域に存在する任意（例，一つ若しくはそれ以上，又は全部）のピリミジンヌクレオチドは，２’−デオキシ−２’−フルオロピリミジンヌクレオチドであり（例，全ピリミジンヌクレオチドが２’−デオキシ−２’−フルオロピリミジンヌクレオチド，又は代替的に複数のピリミジンヌクレオチドが２’−デオキシ−２’−フルオロピリミジンヌクレオチド），センス領域内に存在する任意（例，一つ若しくはそれ以上，又は全部）のプリンヌクレオチドは，２’−デオキシプリンヌクレオチドであり（例，全プリンヌクレオチドが２’−デオキシプリンヌクレオチド，又は代替的に複数のプリンヌクレオチドが２’−デオキシプリンヌクレオチド），センス領域内に存在する３’−末端ヌクレオチドオーバーハングに含まれる任意のヌクレオチドは，２’−デオキシヌクレオチドである。

一実施態様において，本発明は，センス領域を有する本発明の化学修飾された短干渉核酸（ｓｉＮＡ）分子に関し，ここでセンス領域内に存在する任意（例，一つ若しくはそれ以上，又は全部）のピリミジンヌクレオチドは，２’−デオキシ−２’−フルオロピリミジンヌクレオチドであり（例，全ピリミジンヌクレオチドが２’−デオキシ−２’−フルオロピリミジンヌクレオチド，又は代替的に複数のピリミジンヌクレオチドが２’−デオキシ−２’−フルオロピリミジンヌクレオチド），センス領域内に存在する任意（例，一つ若しくはそれ以上，又は全部）のプリンヌクレオチドは，２’−Ｏ−メチルプリンヌクレオチドである（例，全プリンヌクレオチドが２’−Ｏ−メチルプリンヌクレオチド，又は代替的に複数のプリンヌクレオチドが２’−Ｏ−メチルプリンヌクレオチド）。

一実施態様において，本発明は，センス領域を有する本発明の化学修飾された短干渉核酸（ｓｉＮＡ）分子に関し，ここでセンス領域内に存在する任意（例，一つ若しくはそれ以上，又は全部）のピリミジンヌクレオチドは，２’−デオキシ−２’−フルオロピリミジンヌクレオチドであり（例，全ピリミジンヌクレオチドが２’−デオキシ−２’−フルオロピリミジンヌクレオチド，又は代替的に複数のピリミジンヌクレオチドが２’−デオキシ−２’−フルオロピリミジンヌクレオチド），センス領域内に存在する任意（例，一つ若しくはそれ以上，又は全部）のプリンヌクレオチドは，２’−Ｏ−メチルプリンヌクレオチドであり（例，全プリンヌクレオチドが２’−Ｏ−メチルプリンヌクレオチド，又は代替的に複数のプリンヌクレオチドが２’−Ｏ−メチルプリンヌクレオチド），センス領域内に存在する３’−末端ヌクレオチドオーバーハングに含まれる任意のヌクレオチドは，２’−デオキシヌクレオチドである。

一実施態様において，本発明は，アンチセンス領域を有する本発明の化学修飾された短干渉核酸（ｓｉＮＡ）分子に関し，ここでアンチセンス領域内に存在する任意（例，一つ若しくはそれ以上，又は全部）のピリミジンヌクレオチドは，２’−デオキシ−２’−フルオロピリミジンヌクレオチドであり（例，全ピリミジンヌクレオチドが２’−デオキシ−２’−フルオロピリミジンヌクレオチド，又は代替的に複数のピリミジンヌクレオチドが２’−デオキシ−２’−フルオロピリミジンヌクレオチド），またここでアンチセンス領域内に存在する任意（例，一つ若しくはそれ以上，又は全部）のプリンヌクレオチドは，２’−Ｏ−メチルプリンヌクレオチドである（例，全プリンヌクレオチドが２’−Ｏ−メチルプリンヌクレオチド，又は代替的に複数のプリンヌクレオチドが２’−０−メチルプリンヌクレオチド）。

一実施態様において，本発明は，アンチセンス領域を有する本発明の化学修飾された短干渉核酸（ｓｉＮＡ）分子に関し，ここでアンチセンス領域内に存在する任意（例，一つ若しくはそれ以上，又は全部）のピリミジンヌクレオチドは，２’−デオキシ−２’−フルオロピリミジンヌクレオチドであり（例，全ピリミジンヌクレオチドが２’−デオキシ−２’−フルオロピリミジンヌクレオチド，又は代替的に複数のピリミジンヌクレオチドが２’−デオキシ−２’−フルオロピリミジンヌクレオチド），またここでアンチセンス領域内に存在する任意（例，一つ若しくはそれ以上，又は全部）のプリンヌクレオチドは，２’−Ｏ−メチルプリンヌクレオチドであり（例，全プリンヌクレオチドが２’−Ｏ−メチルプリンヌクレオチド，又は代替的に複数のプリンヌクレオチドが２’−０−メチルプリンヌクレオチド），またここでアンチセンス領域内に存在する３’−末端ヌクレオチドオーバーハングに含まれる任意のヌクレオチドは，２’−デオキシヌクレオチドである。

一実施態様において，本発明は，アンチセンス領域を有する本発明の化学修飾された短干渉核酸（ｓｉＮＡ）分子に関し，ここでアンチセンス領域内に存在する任意（例，一つ若しくはそれ以上，又は全部）のピリミジンヌクレオチドは，２’−デオキシ−２’−フルオロピリミジンヌクレオチドであり（例，全ピリミジンヌクレオチドが２’−デオキシ−２’−フルオロピリミジンヌクレオチド，又は代替的に複数のピリミジンヌクレオチドが２’−デオキシ−２’−フルオロピリミジンヌクレオチド），またここでアンチセンス領域内に存在する任意（例，一つ若しくはそれ以上，又は全部）のプリンヌクレオチドは，２’−デオキシプリンヌクレオチドである（例，全プリンヌクレオチドが２’−デオキシプリンヌクレオチド，又は代替的に複数のプリンヌクレオチドが２’−デオキシプリンヌクレオチド）。

一実施態様において，本発明は，アンチセンス領域を有する本発明の化学修飾された短干渉核酸（ｓｉＮＡ）分子に関し，ここでアンチセンス領域内に存在する任意（例，一つ若しくはそれ以上，又は全部）のピリミジンヌクレオチドは，２’−デオキシ−２’−フルオロピリミジンヌクレオチドであり（例，全ピリミジンヌクレオチドが２’−デオキシ−２’−フルオロピリミジンヌクレオチド，又は代替的に複数のピリミジンヌクレオチドが２’−デオキシ−２’−フルオロピリミジンヌクレオチド），またここでアンチセンス領域内に存在する任意（例，一つ若しくはそれ以上，又は全部）のプリンヌクレオチドは，２’−Ｏ−メチルプリンヌクレオチドである（例，全プリンヌクレオチドが２’−Ｏ−メチルプリンヌクレオチド，又は代替的に複数のプリンヌクレオチドが２’−Ｏ−メチルプリンヌクレオチド）。

一実施態様において，本発明は，細胞又は再構成インビトロ系内でＨａｉｒｌｅｓｓに対するＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）を仲介することができる，センス領域及びアンチセンス領域を有する化学修飾短干渉核酸（ｓｉＮＡ）分子に関する。ここでセンス領域内に存在する一つ又はそれ以上のピリミジンヌクレオチドは，２’−デオキシ−２’−フルオロピリミジンヌクレオチドであり（例，全ピリミジンヌクレオチドが２’−デオキシ−２’−フルオロピリミジンヌクレオチド，又は代替的に複数のピリミジンヌクレオチドが２’−デオキシ−２’−フルオロピリミジンヌクレオチド），センス領域内に存在する一つ又はそれ以上のプリンヌクレオチドは，２’−デオキシプリンヌクレオチドであり（例，全プリンヌクレオチドが２’−デオキシプリンヌクレオチド，又は代替的に複数のプリンヌクレオチドが２’−デオキシプリンヌクレオチド），アンチセンス領域内に存在する一つ又はそれ以上ピリミジンヌクレオチドは，２’−デオキシ−２’−フルオロピリミジンヌクレオチドであり（例，全ピリミジンヌクレオチドが２’−デオキシ−２’−フルオロピリミジンヌクレオチド，又は代替的に複数のピリミジンヌクレオチドが２’−デオキシ−２’−フルオロピリミジンヌクレオチド），アンチセンス領域内に存在する一つ又はそれ以上のプリンヌクレオチドは，２’−Ｏ−メチルプリンヌクレオチドである（例，全プリンヌクレオチドが２’−Ｏ−メチルプリンヌクレオチド，又は代替的に複数のプリンヌクレオチドが２’−０−メチルプリンヌクレオチド）。センス領域及び／又はアンチセンス領域は，任意にてセンス配列，及び／又はアンチセンス配列の３’−末端，５’−末端，又は３’及び５’−末端の両方に存在する末端キャップ修飾，例えば本明細書に記載されているか，又は図１０に示す任意の修飾を有し得る。センス領域，及び／又はアンチセンス領域は，任意にて更に，約１〜約４（例，約１，２，３，又は４）個の２’−デオキシヌクレオチドを有する３’−末端ヌクレオチドオーバーハングを含み得る。オーバーハングヌクレオチドは，更に１個又はそれ以上（例，約１，２，３，４個又はそれ以上）のホスホロチオエート，ホスホノアセテート，及び／又はチオホスホノアセテートヌクレオチド間結合を含み得る。これら化学修飾ｓｉＮＡの非限定的な例を，本明細書の図４及び図５並びに表ＩＩＩ及び表ＩＶに示す。記載した実施態様のいずれかにおいて，センス領域内に存在するプリンヌクレオチドは，二者択一的に２’−Ｏ−メチルプリンヌクレオチドであり（例，全プリンヌクレオチドが２’−Ｏ−メチルプリンヌクレオチド，又は代替的に複数のプリンヌクレオチドが２’−Ｏ−メチルプリンヌクレオチド），アンチセンス領域内に存在する一つ又はそれ以上のプリンヌクレオチドは，２’−Ｏ−メチルプリンヌクレオチドである（例，全プリンヌクレオチドが２’−Ｏ−メチルプリンヌクレオチド，又は代替的に複数のプリンヌクレオチドが２’−Ｏ−メチルプリンヌクレオチド）。同様に，これら実施態様のいずれかにおいて，センス領域内に存在する一つ又はそれ以上のプリンヌクレオチドは，二者択一的にプリンリボヌクレオチドであり（例，全プリンヌクレオチドがプリンリボヌクレオチド，又は代替的に複数のプリンヌクレオチドがプリンリボヌクレオチド），アンチセンス領域内に存在する任意のプリンヌクレオチドは，２’−Ｏ−メチルプリンヌクレオチドである（例，全プリンヌクレオチドが２’−Ｏ−メチルプリンヌクレオチド，又は代替的に複数のプリンヌクレオチドが２’−Ｏ−メチルプリンヌクレオチド）。加えて，これら実施態様のいずれかにおいて，センス領域内に存在する，及び／又はアンチセンス領域内に存在する一つ又はそれ以上のプリンヌクレオチドは，二者択一的に２’−デオキシヌクレオチド，固定化核酸（ＬＮＡ）ヌクレオチド，２’−メトキシエチルヌクレオチド，４’−チオヌクレオチド，及び２’−Ｏ−メチルヌクレオチドからなる群より選択される（例，全プリンヌクレオチドが２’−デオキシヌクレオチド，固定化核酸（ＬＮＡ）ヌクレオチド，２’−メトキシエチルヌクレオチド，４’−チオヌクレオチド，及び２’−Ｏ−メチルヌクレオチドからなる群より選択されるか，又は代替的に複数のプリンヌクレオチドが２’−デオキシヌクレオチド，固定化核酸（ＬＮＡ）ヌクレオチド，２’−メトキシエチルヌクレオチド，４’−チオヌクレオチド，及び２’−Ｏ−メチルヌクレオチドからなる群より選択される）。

別の一実施態様において，本発明のｓｉＮＡ分子内，好ましくは本発明のｓｉＮＡ分子のアンチセンス鎖内（場合によりセンス鎖内にも），及び／又はアンチセンス鎖及びセンス鎖の両方内に存在する任意の修飾ヌクレオチドは，天然に存在するリボヌクレオチドと同様の性質又は特徴を有する修飾ヌクレオチドを含む。例えば，本発明は，ノーザンコンフォメーション（Ｎｏｒｔｈｅｒｎｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ）（例，ノーザン擬似回転周期，例えばＳａｅｎｇｅｒ，ＰｒｉｎｃｉｐｌｅｓｏｆＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄＳｔｒｕｃｔｕｒｅ，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇｅｄ１９８４参照）を有する修飾ヌクレオチドを含むｓｉＮＡ分子に関する。このようなものとして，本発明のｓｉＮＡ分子内，好ましくは本発明のｓｉＮＡ分子のアンチセンス鎖内（場合によりセンス鎖内にも），及び／又はアンチセンス鎖及びセンス鎖の両方内に存在する化学修飾ヌクレオチドは，ヌクレアーゼ分解耐性を有する一方で，ＲＮＡｉを仲介する能力を保持している。ノーザンコンフォメーションを有するヌクレオチドの非限定的な例は，固定化核酸（ＬＮＡ）ヌクレオチド（例，２’−Ｏ，４’−Ｃ−メチレン−（Ｄ−リボフラノシル）ヌクレオチド），２’−メトキシエトキシ（ＭＯＥ）ヌクレオチド，２’−メチル−チオ−エチル，２’−デオキシ−２’−フルオロヌクレオチド，２’−デオキシ−２’−クロロヌクレオチド，２’−アジドヌクレオチド，及び２’−Ｏ−メチルヌクレオチドを含む。

一実施態様において，本発明の二本鎖ｓｉＮＡ分子のセンス鎖は，該センス鎖の３’−末端，５’−末端，又は３’及び５’−末端の両方にて，例えば逆位デオキシ脱塩基部分のような末端キャップ部分（例えば図１０参照）を含む。

一実施態様において，細胞又は再構成インビトロ系内でＨａｉｒｌｅｓｓに対するＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）を仲介することができる化学修飾された短干渉核酸（ｓｉＮＡ）分子に関し，ここで化学修飾は，化学修飾ｓｉＮＡ分子に共有結合しているコンジュゲートを含む。

本発明で想定されるコンジュゲートの非限定的な例は，図面を含めその全容が参照により本明細書に加入される２００３年４月３０日出願のＶａｒｇｅｅｓｅ等，米国特許出願第１０／４２７，１６０号に記載されているコンジュゲート及びリガンドを含む。別の一実施態様において，コンジュゲートは，生物分解性のリンカーを介して化学修飾ｓｉＮＡ分子に共有結合されている。一実施態様において，コンジュゲート分子は，化学修飾ｓｉＮＡ分子のセンス鎖，アンチセンス鎖，又は両方の鎖のいずれかの３’−末端に結合している。別の一実施態様において，コンジュゲート分子は，化学修飾ｓｉＮＡ分子のセンス鎖，アンチセンス鎖，又は両方の鎖のいずれかの５’−末端に結合している。更に別の一実施態様において，コンジュゲート分子は，化学修飾ｓｉＮＡ分子のセンス鎖，アンチセンス鎖，又は両方の鎖のいずれかの３’−末端及び５’−末端の両方，又はその任意の組合せに結合している。一実施態様において，本発明のコンジュゲート分子は，化学修飾ｓｉＮＡ分子の生体系，例えば細胞内への送達を促進する分子を含む。別の一実施態様において，化学修飾ｓｉＮＡ分子に結合したコンジュゲート分子は，ポリエチレングリコール，ヒト血清アルブミン，又は細胞取込みを仲介し得る細胞受容体のためのリガンドである。本発明で想定される，化学修飾ｓｉＮＡ分子に結合し得る特定のコンジュゲート分子の例は，参照により本明細書に加入される２００２年７月２２日出願のＶａｒｇｅｅｓｅ等，米国特許出願第１０／２０１，３９４号に記載されている。使用されるコンジュゲートのタイプ，及び本発明のｓｉＮＡ分子のコンジュゲーションの範囲は，ｓｉＮＡ構成の改良された薬物動態学プロファイル，バイオアベイラビリティ，及び／又は安定性，及び同時にｓｉＮＡのＲＮＡｉを仲介する能力の保持によって評価され得る。このようなものとして，当業者は様々なコンジュゲートで修飾されたｓｉＮＡ構成をスクリーニングしてｓｉＮＡコンジュゲートコンジュゲートが改良された性質を有する一方，例えば周知のように動物モデル内でＲＮＡｉを仲介する能力を保持しているかを決定することができる。

一実施態様において，本発明は，本発明の短干渉核酸（ｓｉＮＡ）分子に関する。ここでｓｉＮＡは更に，ｓｉＮＡのセンス領域をｓｉＮＡのアンチセンス領域に連結するヌクレオチド，非ヌクレオチド，又はヌクレオチド／非ヌクレオチド混合リンカーを含む。一実施態様において，本発明のヌクレオチドリンカーは，２個以上のヌクレオチド長，例えば約３，４，５，６，７，８，９，又は１０個のヌクレオチド長を有するリンカーであり得る。別の一実施態様において，ヌクレオチドリンカーは，核酸アプタマーであり得る。本明細書で使用されるように，"アプタマー"又は"核酸アプタマー"は，標的分子に特異的に結合する核酸分子を意味し，ここで核酸分子は，標的分子により認識される配列を含む配列を自然設定で有する。代替的に，アプタマーは，標的分子に結合する核酸分子であり得，ここで標的分子は核酸に自然には結合しない。標的分子は，関心の任意の分子であり得る。例えば，アプタマーは，タンパク質のリガンド結合ドメインに結合することによって，天然に存在するリガンドとタンパク質との相互作用を防止するのに使用され得る。これは非限定的な例であり，当業者は他の体現もまた当該技術分野にて公知の技術を使用して容易に生成し得ることを理解するであろう（例えば，Ｇｏｌｄ等，１９９５，Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ，６４，７６３，Ｂｒｏｄｙ及びＧｏｌｄ，２０００，Ｊ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ，７４，５，Ｓｕｎ，２０００，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ，２，１００，Ｋｕｓｓｅｒ，２０００，Ｊ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ，７４，２７，Ｈｅｒｍａｎｎ及びＰａｔｅｌ，２０００，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２８７，８２０，並びにＪａｙａｓｅｎａ，１９９９，ＣｌｉｎｉｃａｌＣｈｅｍｉｓｔｒｙ，４５，１６２８参照）。

また更に別の一実施態様において，本発明の非ヌクレオチドリンカーは，脱塩基ヌクレオチド，ポリエーテル，ポリアミン，ポリアミド，ペプチド，炭水化物，脂質，ポリ炭化水素，又は他のポリマー化合物（例，例えば２〜１００のエチレングリコール単位を有するポリエチレングリコール）を含む。特定の例は，全て本明細書に参照により加入されるＳｅｅｌａ及びＫａｉｓｅｒ，ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓＲｅｓ．１９９０，１８：６３５３及びＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓＲｅｓ．１９８７，１５：３１１３，Ｃｌｏａｄ及びＳｃｈｅｐａｒｔｚ，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１９９１，１１３：６３２４，Ｒｉｃｈａｒｄｓｏｎ及びＳｃｈｅｐａｒｔｚ，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１９９１，１１３：５１０９，Ｍａ等，ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓＲｅｓ．１９９３，２１：２５８５及びＢｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ１９９３，３２：１７５１，Ｄｕｒａｎｄ等，ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓＲｅｓ．１９９０，１８：６３５３，ＭｃＣｕｒｄｙ等，Ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅｓ＆Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ１９９１，１０：２８７，Ｊｓｃｈｋｅ等，ＴｅｔｒａｈｅｄｒｏｎＬｅｔｔ．１９９３，３４：３０１，Ｏｎｏ等，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ１９９１，３０：９９１４，Ａｒｎｏｌｄ等，国際特許出願公開第ＷＯ８９／０２４３９号，Ｕｓｍａｎ等，国際特許出願公開第ＷＯ９５／０６７３１号，Ｄｕｄｙｃｚ等，国際特許出願公開第．ＷＯ９５／１１９１０号，並びにＦｅｒｅｎｔｚ及びＶｅｒｄｉｅ，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１９９１，１１３：４０００に記載されたものを含む。"非ヌクレオチド"は更に，一つ又はそれ以上のヌクレオチド単位に代替して核酸鎖内に組み込まれ，残留する塩基の酵素活性を維持する任意の基又は化合物を意味し，それには糖置換，及び／又はホスフェート置換のいずれかが含まれる。基又は化合物は，例えば糖のＣ１位置に通常認識されるヌクレオチド塩基，例えばアデノシン，グアニン，シトシン，ウラシル又はチミン等を含まない脱塩基であり得る。

一実施態様において，本発明は，細胞又は再構成インビトロ系内でＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）を仲介することができる短干渉核酸（ｓｉＮＡ）分子に関する。ここで，二つの別個のオリゴヌクレオチドから組立てられたｓｉＮＡ分子の一方又は両方の鎖は，リボヌクレオチドを含まない。例えば，ｓｉＮＡ分子は一つのオリゴヌクレオチドから組立てられ得，該ｓｉＮＡのセンス及びアンチセンス領域は分離したオリゴヌクレオチドを含み，該オリゴヌクレオチドはオリゴヌクレオチド内に存在するリボヌクレオチド（例，２’−ＯＨ基を有するヌクレオチド）を有さない。別の例では，ｓｉＮＡ分子は一つのオリゴヌクレオチドから組立てられ得，ｓｉＮＡのセンス及びアンチセンス領域は，本明細書に記載されるように，ヌクレオチド又は非ヌクレオチドリンカーによって結合又は環化され，ここでオリゴヌクレオチドは，該オリゴヌクレオチド内に存在するリボヌクレオチド（例２’−ＯＨ基を有するヌクレオチド）を有さない。本願出願人は，驚くべきことに，ｓｉＮＡ分子内のリボヌクレオチド（例，２’−ヒドロキシル基を有するヌクレオチド）の存在は，ＲＮＡｉ活性の支持において必要としない，又は必須でないことを見いだした。このようなものとして，一実施態様において，ｓｉＮＡ内の全位置は，例えば式Ｉ，ＩＩ，ＩＩＩ，ＩＶ，Ｖ，ＶＩ，若しくはＶＩＩ，又はその任意の組合せを有するヌクレオチド及び／又は非ヌクレオチドのような化学修飾ヌクレオチド，及び／又は非ヌクレオチドを，ｓｉＮＡ分子が細胞内でＲＮＡｉ活性を支持する能力が保持される程度に含み得る。

一実施態様において，本発明のｓｉＮＡ分子は，標的核酸配列に相補性を有する一本鎖ポリヌクレオチドを含む，細胞又は再構成インビトロ系内でＲＮＡｉ活性を仲介する一本鎖ｓｉＮＡ分子である。別の一実施態様において，本発明の一本鎖ｓｉＮＡ分子は，５’−末端リン酸基を含む。別の一実施態様において，本発明の一本鎖ｓｉＮＡ分子は，５’−末端リン酸基及び３’−末端リン酸基（例，２’，３’−環状ホスフェート）を含む。別の一実施態様において，本発明の一本鎖ｓｉＮＡ分子は，約１５〜約３０（例，約１５，１６，１７，１８，１９，２０，２１，２２，２３，２４，２５，２６，２７，２８，２９，又は３０）個のヌクレオチドを含む。更に別の一実施態様において，本発明の一本鎖ｓｉＮＡ分子は，本明細書に記載されている一つ又はそれ以上の化学修飾ヌクレオチド又は非ヌクレオチドを含む。例えば，ｓｉＮＡ分子内の全位置は，化学修飾ヌクレオチド，例えば式Ｉ〜ＶＩＩのいずれか，又はその任意の組合せの化学修飾を有するヌクレオチドを，ｓｉＮＡ分子が細胞内でＲＮＡｉ活性を支持する能力が保持される程度に含み得る。

一実施態様において，本発明のｓｉＮＡ分子は，標的核酸配列に相補性を有する一本鎖ポリヌクレオチドを含む，細胞又は再構成インビトロ系内でＲＮＡｉ活性を仲介する一本鎖ｓｉＮＡ分子であり，ここでｓｉＮＡ内に存在する一つ又はそれ以上のピリミジンヌクレオチドは，２’−デオキシ−２’−フルオロピリミジンヌクレオチドであり（例，全ピリミジンヌクレオチドが２’−デオキシ−２’−フルオロピリミジンヌクレオチド，又は代替的に複数のピリミジンヌクレオチドが２’−デオキシ−２’−フルオロピリミジンヌクレオチド），アンチセンス領域内に存在する任意のプリンヌクレオチドは，２’−Ｏ−メチルプリンヌクレオチドであり（例，全プリンヌクレオチドが２’−Ｏ−メチルプリンヌクレオチド，又は代替的に複数のプリンヌクレオチドが２’−Ｏ−メチルプリンヌクレオチド），アンチセンス配列の３’−末端，５’−末端，又は３’及び５’−末端の両方に末端キャップ修飾，例えば本明細書に説明するか，又は図１０に示す任意の修飾が任意に存在する。ｓｉＮＡは，任意にて更に約１〜約４個又はそれ以上（例，約１，２，３，４個又はそれ以上）の末端２’−デオキシヌクレオチドをｓｉＮＡ分子の３’−末端に含み，末端ヌクレオチドは更に１個又はそれ以上（例，１，２，３，４個又はそれ以上）のホスホロチオエート，ホスホノアセテート，及び／又はチオホスホノアセテートヌクレオチド間結合を含み得，ｓｉＮＡは，場合により更に末端リン酸基，例えば５’−末端リン酸基を含む。これら実施態様のいずれかにおいて，アンチセンス領域内に存在する任意のプリンヌクレオチドは，二者択一的に２’−デオキシプリンヌクレオチドである（例，全プリンヌクレオチドが２’−デオキシプリンヌクレオチド，又は代替的に複数のプリンヌクレオチドが２’−デオキシプリンヌクレオチド）。同様に，これら実施態様のいずれかにおいて，ｓｉＮＡ内に存在する任意のプリンヌクレオチド（即ち，センス及び／又はアンチセンス領域内に存在するプリンヌクレオチド）は，二者択一的に固定化核酸（ＬＮＡ）ヌクレオチドであり得る（例，全プリンヌクレオチドがＬＮヌクレオチド，又は代替的に複数のプリンヌクレオチドがＬＮヌクレオチド）。同様に，これら実施態様のいずれかにおいて，ｓｉＮＡ内に存在する任意のプリンヌクレオチドは，二者択一的に２’−メトキシエチルプリンヌクレオチドである（例，全プリンヌクレオチドが２’−メトキシエチルプリンヌクレオチド，又は代替的に複数のプリンヌクレオチドが２’−メトキシエチルプリンヌクレオチド）。別の一実施態様において，本発明の一本鎖ｓｉＮＡ分子内に存在する任意の修飾ヌクレオチドは，天然に存在するリボヌクレオチドと同様の性質又は特徴を有する修飾ヌクレオチドを含む。例えば，本発明は，ノーザンコンフォメーション（例，ノーザン擬似回転周期，例えばＳａｅｎｇｅｒ，ＰｒｉｎｃｉｐｌｅｓｏｆＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄＳｔｒｕｃｔｕｒｅ，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇｅｄ，１９８４参照）を有する修飾ヌクレオチドを含む。このようなものとして，本発明の一本鎖ｓｉＮＡ分子内に存在する化学修飾ヌクレオチドは，好ましくはヌクレアーゼ分解耐性を有する一方で，ＲＮＡｉを仲介する能力を保持する。

一実施態様において，本発明のｓｉＮＡ分子は，該ｓｉＮＡ分子の一つ又はそれ以上の鎖又は領域内の交互の位置に，化学修飾されたヌクレオチド又は非ヌクレオチド（例，式Ｉ〜ＶＩＩのいずれか，例えば２’−デオキシ，２’−デオキシ−２’−フルオロ，又は２’−Ｏ−メチルヌクレオチド）を有する。例えば，そのような化学修飾は，ｓｉＮＡの３’−末端又は５’−末端の一番目又は二番目のヌクレオチドから出発して，ＲＮＡベースのｓｉＮＡ分子の一つ置きの位置に導入し得る。非限定的な例において，本発明の二重鎖ｓｉＮＡ分子の各鎖が２１ヌクレオチド長を有する本発明の二本鎖ｓｉＮＡ分子を提供し，ここで各鎖の位置１，３，５，７，９，１１，１３，１５，１７，１９及び２１は（例，式Ｉ〜ＶＩＩの任意の化合物，例えば２’−デオキシ，２’−デオキシ−２’−フルオロ，又は２’−Ｏ−メチルヌクレオチドによって）化学修飾されている。別の非限定的な例において，ｓｉＮＡの各鎖が２１ヌクレオチド長を有する本発明の二本鎖ｓｉＮＡを提供し，ここで各鎖の位置２，４，６，８，１０，１２，１４，１６，１８，及び２０は（例，式Ｉ〜ＶＩＩの任意の化合物，例えば２’−デオキシ，２’−デオキシ−２’−フルオロ，又は２’−０−メチルヌクレオチドによって）化学修飾されている。このようなｓｉＮＡ分子は，本明細書に記載されるように，更に末端キャップ部分及び／又はバックボーン修飾を有し得る。このようなｓｉＮＡ分子は更に，本明細書に記載されるように平滑末端を有し得る。

一実施態様において，本発明は，細胞内でＨａｉｒｌｅｓｓ遺伝子の発現を調節する方法に関し，同方法は，（ａ）化学修飾されていてもよく，またｓｉＮＡ鎖の一方がＨａｉｒｌｅｓｓ遺伝子のＲＮＡに相補的な配列を有する本発明のｓｉＮＡ分子を合成し，（ｂ）細胞内でＨａｉｒｌｅｓｓ遺伝子の発現を調節するに適切な条件下で，該ｓｉＮＡ分子を細胞内に導入することを含む。

一実施態様において，本発明は，細胞内でＨａｉｒｌｅｓｓ遺伝子の発現を調節する方法に関し，同方法は，（ａ）化学修飾されていてもよく，またｓｉＮＡ鎖の一方がＨａｉｒｌｅｓｓ遺伝子のＲＮＡに相補的な配列を有し，該ｓｉＮＡのセンス鎖配列が標的ＲＮＡの配列と同一又は実質的に同一の配列を有する本発明のｓｉＮＡ分子を合成し，（ｂ）細胞内でＨａｉｒｌｅｓｓ遺伝子の発現を調節するに適切な条件下で，該ｓｉＮＡ分子を細胞内に導入することを含む。

別の一実施態様において，本発明は，細胞内で二つ以上のＨａｉｒｌｅｓｓ遺伝子の発現を調節する方法に関し，同方法は，（ａ）化学修飾されていてもよく，またｓｉＮＡ鎖の一方がＨａｉｒｌｅｓｓ遺伝子のＲＮＡに相補的な配列を有する本発明のｓｉＮＡ分子を合成し，（ｂ）細胞内でＨａｉｒｌｅｓｓ遺伝子の発現を調節するに適切な条件下で，該ｓｉＮＡ分子を細胞内に導入することを含む。

別の一実施態様において，本発明は，細胞内で二つ又はそれ以上のＨａｉｒｌｅｓｓ遺伝子の発現を調節する方法に関し，同方法は，（ａ）化学修飾されていてもよく，またｓｉＮＡ鎖の一方がＨａｉｒｌｅｓｓ遺伝子のＲＮＡに相補的な配列を有し，該ｓｉＮＡのセンス鎖配列が標的ＲＮＡの配列と同一又は実質的に同一の配列を有する本発明のｓｉＮＡ分子を合成し，（ｂ）細胞内でＨａｉｒｌｅｓｓ遺伝子の発現を調節するに適切な条件下で，該ｓｉＮＡ分子を細胞内に導入することを含む。

別の一実施態様において，本発明は，細胞内で二つ以上のＨａｉｒｌｅｓｓ遺伝子の発現を調節する方法に関し，同方法は，（ａ）化学修飾されていてもよく，またｓｉＮＡ鎖の一方がＨａｉｒｌｅｓｓ遺伝子のＲＮＡに相補的な配列を有し，該ｓｉＮＡのセンス鎖配列が標的ＲＮＡの配列と同一又は実質的に同一の配列を有する本発明のｓｉＮＡ分子を合成し，（ｂ）細胞内でＨａｉｒｌｅｓｓ遺伝子の発現を調節するに適切な条件下で，該ｓｉＮＡ分子を細胞内に導入することを含む。

一実施態様において，本発明のｓｉＮＡ分子は，エクスビボで適用される試薬として使用される。例えば，ｓｉＮＡ試薬は治療効果を呈するために被験者内に移植される組織又は細胞内に導入される。細胞及び／又は組織は，後に外植片を受容する有機体又は被験者から得られるか，又は移植に先立って他の有機体又は被験者から得ることができる。ｓｉＮＡ分子は細胞又は組織内の一つ又はそれ以上の遺伝子の発現を調節するのに使用され，それにより細胞又は組織は所望の表現型を獲得したり，又はインビボで移植された際に機能を遂行したりすることができる。一実施態様において，患者から特定の標的細胞を抜き取る。これら抜き取った細胞を，これら細胞によるｓｉＮＡの適切な取り込み条件下において，細胞内で特定のヌクレオチド配列を標的にするｓｉＮＡと接触させる（例，例えばカチオン性脂質，リポソーム，及び同様物等の送達試薬を使用するか，又は例えば電気穿孔法を使用して細胞内へのｓｉＮＡの送達を促進する等）。次に，細胞を同一患者又は他の患者に再導入する。一実施態様において，本発明は，組織外植片内でのＨａｉｒｌｅｓｓ遺伝子発現の調節方法に関し，同方法は，（ａ）化学修飾されていてもよく，またｓｉＮＡ鎖の一方がＨａｉｒｌｅｓｓ遺伝子のＲＮＡに相補的な配列を有する本発明のｓｉＮＡ分子を合成し，（ｂ）組織外植片内でＨａｉｒｌｅｓｓ遺伝子の発現を調節するに適切な条件下で，該ｓｉＮＡ分子を特定の有機体から得た組織外植片の細胞内に導入することを含む。別の一実施態様において，本方法は更に，有機体内でのＨａｉｒｌｅｓｓ遺伝子の発現の調節に適切な条件下で，組織外植片を，該組織が得られた，又は別の有機体内に導入し戻すことを含む。一実施態様において，本発明は，本発明は，組織外植片内でのＨａｉｒｌｅｓｓ遺伝子発現の調節方法に関し，同方法は，（ａ））化学修飾されていてもよく，またｓｉＮＡ鎖の一方がＨａｉｒｌｅｓｓ遺伝子のＲＮＡに相補的な配列を有し，該ｓｉＮＡのセンス鎖配列が標的ＲＮＡの配列と同一又は実質的に同一の配列を有する本発明のｓｉＮＡ分子を合成し，（ｂ）組織外植片内でＨａｉｒｌｅｓｓ遺伝子の発現を調節するに適切な条件下で，該ｓｉＮＡ分子を特定の有機体から得た組織外植片の細胞内に導入することを含む。別の一実施態様において，本方法更に，有機体内でのＨａｉｒｌｅｓｓ遺伝子の発現の調節に適切な条件下で，組織外植片を，該組織が得られた，又は別の有機体内に導入し戻すことを含む。

別の一実施態様において，本発明は，組織外植片内での二つ以上のＨａｉｒｌｅｓｓ遺伝子発現の調節方法に関し，同方法は，（ａ）化学修飾されていてもよく，またｓｉＮＡ鎖の一方がＨａｉｒｌｅｓｓ遺伝子のＲＮＡに相補的な配列を有し，該ｓｉＮＡのセンス鎖配列が標的ＲＮＡの配列と同一又は実質的に同一の配列を有する本発明のｓｉＮＡ分子を合成し，（ｂ）組織外植片内でＨａｉｒｌｅｓｓ遺伝子の発現を調節するに適切な条件下で，該ｓｉＮＡ分子を特定の有機体から得た組織外植片の細胞内に導入することを含む。別の一実施態様において，本方法更に，有機体内でのＨａｉｒｌｅｓｓ遺伝子の発現の調節に適切な条件下で，組織外植片を，該組織が得られた，又は別の有機体内に導入し戻すことを含む。

一実施態様において，被験者又は有機体内でＨａｉｒｌｅｓｓ遺伝子の発現を調節する方法に関し，同方法は，（ａ）化学修飾されていてもよく，またｓｉＮＡ鎖の一方がＨａｉｒｌｅｓｓ遺伝子のＲＮＡに相補的な配列を有する本発明のｓｉＮＡ分子を合成し，（ｂ）被験者又は有機体内でＨａｉｒｌｅｓｓ遺伝子の発現を調節するに適切な条件下で，該ｓｉＮＡ分子を被験者又は有機体内に導入することを含む。

一実施態様において，被験者又は有機体内で二つ以上のＨａｉｒｌｅｓｓ遺伝子の発現を調節する方法に関し，同方法は，（ａ）化学修飾されていてもよく，またｓｉＮＡ鎖の一方がＨａｉｒｌｅｓｓ遺伝子のＲＮＡに相補的な配列を有する本発明のｓｉＮＡ分子を合成し，（ｂ）被験者又は有機体内でＨａｉｒｌｅｓｓ遺伝子の発現を調節するに適切な条件下で，該ｓｉＮＡ分子を被験者又は有機体内に導入することを含む。Ｈａｉｒｌｅｓｓタンパク質又はＲＮＡのレベルは，当該技術分野にて周知のように決定され得る。

一実施態様において，本発明は，細胞内でＨａｉｒｌｅｓｓ遺伝子の発現を調節する方法に関し，同方法は，（ａ）化学修飾されていてもよく，またｓｉＮＡがＨａｉｒｌｅｓｓ遺伝子のＲＮＡに相補的な一本鎖配列を有する本発明のｓｉＮＡ分子を合成し，（ｂ）細胞内でＨａｉｒｌｅｓｓ遺伝子の発現を調節するに適切な条件下で，該ｓｉＮＡ分子を細胞内に導入することを含む。

別の一実施態様において，本発明は，細胞内で二つ以上のＨａｉｒｌｅｓｓ遺伝子の発現を調節する方法に関し，同方法は，（ａ）化学修飾されていてもよく，またｓｉＮＡがＨａｉｒｌｅｓｓ遺伝子のＲＮＡに相補的な一本鎖配列を有する本発明のｓｉＮＡ分子を合成し，（ｂ）細胞内でＨａｉｒｌｅｓｓ遺伝子の発現を調節するに適切な条件下で，該ｓｉＮＡ分子をインビトロ又はインビボで細胞と接触させることを含む。

一実施態様において，本発明は，組織外植片内でのＨａｉｒｌｅｓｓ遺伝子発現の調節方法に関し，同方法は，（ａ）化学修飾されていてもよく，またｓｉＮＡがＨａｉｒｌｅｓｓ遺伝子のＲＮＡに相補的な一本鎖配列を有する本発明のｓｉＮＡ分子を合成し，（ｂ）組織外植片内でＨａｉｒｌｅｓｓ遺伝子の発現を調節するに適切な条件下で，特定の被験者又は有機体から得られた組織外植片細胞をｓｉＮＡ分子と接触させることを含む。

別の一実施態様において，本方法は更に，被験者又は有機体内でのＨａｉｒｌｅｓｓ遺伝子の発現の調節に適切な条件下で，組織外植片を，該組織が得られた，又は別の被験者又は有機体内に導入し戻すことを含む。

別の一実施態様において，本発明は，組織外植片内でのＨａｉｒｌｅｓｓ遺伝子発現の調節方法に関し，同方法は，（ａ）化学修飾されていてもよく，またｓｉＮＡがＨａｉｒｌｅｓｓ遺伝子のＲＮＡに相補的な一本鎖配列を有する本発明のｓｉＮＡ分子を合成し，（ｂ）組織外植片内でＨａｉｒｌｅｓｓ遺伝子の発現を調節するに適切な条件下で，該ｓｉＮＡ分子を特定の被験者又は有機体から得られた組織外植片細胞内に導入することを含む。別の一実施態様において，本方法更に，被験者又は有機体内でのＨａｉｒｌｅｓｓ遺伝子の発現の調節に適切な条件下で，組織外植片を，該組織が得られた，又は別の被験者又は有機体内に導入し戻すことを含む。

一実施態様において，本発明は，被験者又は有機体内でＨａｉｒｌｅｓｓ遺伝子の発現を調節する方法に関し，同方法は，（ａ）化学修飾されていてもよく，またｓｉＮＡがＨａｉｒｌｅｓｓ遺伝子のＲＮＡに相補的な一本鎖配列を有する本発明のｓｉＮＡ分子を合成し，（ｂ）被験者又は有機体内でＨａｉｒｌｅｓｓ遺伝子の発現を調節するに適切な条件下で，該ｓｉＮＡ分子を被験者又は有機体内に導入することを含む。

別の一実施態様において，本発明は，被験者又は有機体内で二つ以上のＨａｉｒｌｅｓｓ遺伝子の発現を調節する方法に関し，同方法は，（ａ）化学修飾されていてもよく，またｓｉＮＡがＨａｉｒｌｅｓｓ遺伝子のＲＮＡに相補的な一本鎖配列を有する本発明のｓｉＮＡ分子を合成し，（ｂ）被験者又は有機体内でＨａｉｒｌｅｓｓ遺伝子の発現を調節するに適切な条件下で，該ｓｉＮＡ分子を被験者又は有機体内に導入することを含む。

一実施態様において，本発明は，被験者又は有機体内でＨａｉｒｌｅｓｓ遺伝子の発現を調節する方法に関し，同方法は，被験者又は有機体内でＨａｉｒｌｅｓｓ遺伝子の発現を調節するに適切な条件下で，本発明のｓｉＮＡ分子を被験者又は有機体と接触させることを含む。

一実施態様において，本発明は，被験者又は有機体の脱毛，又は除毛のための方法に関し，同方法は，被験者又は有機体内でＨａｉｒｌｅｓｓ遺伝子の発現を調節するに適切な条件下で，本発明のｓｉＮＡ分子を被験者又は有機体と接触させることを含む。一実施態様において，ｓｉＮＡは，他の除毛方法，例えば機械的脱毛（例，剃り，引抜き，ワックス脱毛），化学的脱毛，レーザー処置等を行った後に，例えば被験者又は有機体の濾胞のアナゲン期，又はアナゲン期とカタゲン期との間の期間を標的として被験者に投与され，Ｈａｉｒｌｅｓｓの抑制に基づく抜け毛を同調させる。一実施態様において，ｓｉＮＡは被験者に治療の過程で投与され，例えば例えば一日一回，又は週に二，三回，若しくは四回等の様々な時間間隔にて投与される。一実施態様において，ｓｉＮＡは被験者に治療の過程で投与され，例えば週に一回，又は二週に一回投与される。一実施態様において，ｓｉＮＡは被験者に治療の過程で投与され，例えば約１〜約５２週間の間，週に一回投与される。一実施態様において，本発明のｓｉＮＡ分子は，被験者に治療の過程で，約２〜約８（例，２，３，４，５，６，７，又は８）週間の間，週に一回投与される。

一実施態様において，本発明は，被験者又は有機体内で毛の成長を防止，抑制，又は低下させる方法に関し，同方法は，被験者又は有機体内でＨａｉｒｌｅｓｓ遺伝子の発現を調節するに適切な条件下で，本発明の被験者又は有機体をｓｉＮＡ分子と接触させることを含む。一実施態様において，ｓｉＮＡは，他の除毛方法，例えば機械的脱毛（例，剃り，引抜き，ワックス脱毛），化学的脱毛，レーザー処置等を行った後に，例えば被験者又は有機体の濾胞の分裂後期を標的として被験者に投与され，Ｈａｉｒｌｅｓｓ抑制に基づく抜け毛を同調させる。一実施態様において，ｓｉＮＡは被験者に治療の過程で投与され，例えば例えば一日一回，又は週に二，三回，若しくは四回等の様々な時間間隔で投与される。一実施態様において，ｓｉＮＡは被験者に治療の過程で投与され，例えば週に一回，又は二週に一回投与される。一実施態様において，ｓｉＮＡは被験者に治療の過程で投与され，例えば約１〜約５２週間の間，週に一回投与される。一実施態様において，本発明のｓｉＮＡ分子は，被験者に治療の過程で約２〜約８（例，２，３，４，５，６，７，又は８）週間の間，週に一回投与される。

一実施態様において，本発明は，被験者又は有機体内で毛の成長を防止，抑制，又は低下させる方法に関し，同方法は，被験者又は有機体内でＨａｉｒｌｅｓｓ遺伝子の発現を抑制又は下方調節するに適切な条件下で，本発明の被験者又は有機体をｓｉＮＡ分子と接触させることを含む。一実施態様において，ｓｉＮＡは，他の除毛方法，例えば機械的脱毛（例，剃り，引抜き，ワックス脱毛），化学的脱毛，レーザー処置等を行った後に，例えば被験者又は有機体の濾胞のアナゲン期，又はアナゲン期とカタゲン期の間の期間を標的として被験者に投与され，Ｈａｉｒｌｅｓｓ遺伝子発現抑制に基づく抜け毛を同調させる。一実施態様において，ｓｉＮＡは被験者に治療の過程で投与され，例えば例えば一日一回，又は週に二，三回，若しくは四回等の様々な時間間隔で投与される。一実施態様において，ｓｉＮＡは被験者に治療の過程で投与され，例えば週に一回，又は二週に一回投与される。一実施態様において，ｓｉＮＡは被験者に治療の過程で投与され，例えば約１〜約５２週間の間，週に一回投与される。一実施態様において，本発明のｓｉＮＡ分子は，被験者に治療の過程で約２〜約８（例，２，３，４，５，６，７，又は８）週間の間，週に一回投与される。

一実施態様において，本発明は，被験者又は有機体内で毛の成長を防止，抑制，又は低下させる方法に関し，同方法は，被験者又は有機体内でＨａｉｒｌｅｓｓ遺伝子の発現を抑制又は下方調節するに適切な条件下で，本発明の被験者又は有機体をｓｉＮＡ分子と接触させることを含む。一実施態様において，ｓｉＮＡは，他の除毛方法，例えば機械的脱毛（例，剃り，引抜き，ワックス脱毛），化学的脱毛，レーザー処置等を行った後に，例えば被験者又は有機体の濾胞内の分裂後期を標的として被験者に投与され，Ｈａｉｒｌｅｓｓ抑制発現の抑制に基づく抜け毛を同調させる。一実施態様において，ｓｉＮＡは被験者に治療の過程で投与され，例えば例えば一日一回，又は週に二，三回，若しくは四回等の様々な時間間隔で投与される。一実施態様において，ｓｉＮＡは被験者に治療の過程で投与され，例えば週に一回，又は二週に一回投与される。一実施態様において，ｓｉＮＡは被験者に治療の過程で投与され，例えば約１〜約５２週間の間，週に一回投与される。一実施態様において，本発明のｓｉＮＡ分子は，被験者に治療の過程で約２〜約８（例，２，３，４，５，６，７，又は８）週間の間，週に一回投与される。

一実施態様において，本発明は，被験者又は有機体内で脱毛症（例，男性ホルモン性脱毛症）を治療又は予防する方法に関し，同方法は，被験者又は有機体内でＨａｉｒｌｅｓｓ遺伝子を調節するに適切な条件下で，本発明の被験者又は有機体をｓｉＮＡ分子と接触させることを含む。

一実施態様において，本発明は，被験者又は有機体内で無毛症を治療又は予防する方法に関し，同方法は，被験者又は有機体内で適切な条件下で，被験者又は有機体を本発明のｓｉＮＡ分子と接触させることを含む。

別の一実施態様において，本発明は，被験者又は有機体内で二つ以上のＨａｉｒｌｅｓｓ遺伝子の発現を調節する方法に関し，同方法は，被験者又は有機体内でＨａｉｒｌｅｓｓ遺伝子の発現を調節するに適切な条件下で，被験者又は有機体を一つ又はそれ以上の本発明のｓｉＮＡ分子と接触させることを含む。

本発明のｓｉＮＡ分子は，様々なＲＮＡ分子を標的とするＲＮＡｉを介して，標的（例，Ｈａｉｒｌｅｓｓ）遺伝子発現を下方調節又は抑制するようにデザインされ得る。一実施態様において，本発明のｓｉＮＡ分子は，標的遺伝子に対応する様々なＲＮＡを標的にするために使用される。そのようなＲＮＡの非限定的な例には，メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ），一つ又は複数の標的遺伝子の選択的ＲＮＡのスプライスバリアント，一つ又は複数の標的遺伝子の転写後修飾ＲＮＡ，一つ又は複数の標的遺伝子の前駆体ｍＲＮＡ，及び／又はＲＮＡテンプレートが含まれる。選択的スプライシングにより転写産物のファミリーが生成し，これらが適切なエクソンの使用により区別されるとしたら，適切なエクソンを介して遺伝子ファミリーのメンバーの機能を特異的に抑制又は区別することによって，本発明を遺伝子発現の抑制に使用することができる。例えば，選択的にスプライスされた膜貫通ドメインを含むタンパク質は，膜結合型及び分泌型の両方として発現し得る。膜貫通ドメインを含むエクソンを標的とする本発明を使用して，タンパク質の分泌型に対抗して膜結合型を標的とする薬剤の機能的な因果関係を測定することができる。これらＲＮＡ分子を標的とする本発明の用途の非限定的な例には，治療薬への応用，医薬品発見，分子診断及び遺伝子機能，並びに例えば本発明のｓｉＮＡ分子による一塩基多型マッピングを使用した遺伝子マッピングがある。このような応用は，公知の遺伝子配列，又は発現配列タグ（ＥＳＴ）から入手可能な部分配列を使用して実行することができる。

別の一実施態様において，本発明のｓｉＮＡ分子は，一つ又は複数の遺伝子ファミリー，例えばＨａｉｒｌｅｓｓ遺伝子ファミリーに対応する保存された配列を標的とするよう使用される。このようなものとして，複数のＨａｉｒｌｅｓｓ標的を標的とするｓｉＮＡ分子は，その治療効果が増大し得る。更に，ｓｉＮＡは，様々な用途において遺伝子機能の経路を特徴付けるために使用され得る。例えば，本発明は，ある経路（一つ又は複数）の標的遺伝子の活性を抑制して，遺伝子機能解析，ｍＲＮＡ機能解析，又は翻訳解析によって（一つ又は複数の）未だ特徴付けられていない遺伝子の機能を調べることに使用することができる。本発明は，医薬品開発のために，様々な疾患及び病状に関与する潜在的な標的遺伝子経路の決定に使用することができる。本発明は例えば，脱毛症及び無毛症，又は毛若しくは毛の成長の発達及び維持に関係する遺伝子発現の経路を理解するために使用される。

一実施態様において，本発明のｓｉＮＡ分子（一つ又は複数）及び／又は方法は，ＧｅｎｂａｎｋＡｃｃｅｓｓｉｏｎに参照されるＲＮＡをコード化する遺伝子（一つ又は複数），例えば本明細書でジェンバンク受入番号（ＧｅｎｂａｎｋＡｃｃｅｓｓｉｏｎｎｕｍｂｅｒ）と称するＲＮＡ配列（一つ又は複数），例えば表Ｉに示すジェンバンク受入番号をコード化するＨａｉｒｌｅｓｓ遺伝子の発現を下方調節するために使用される。

一実施態様において，本発明は，（ａ）予め定められた複雑性を有するｓｉＮＡ構成のライブラリを生成し，（ｂ）標的ＲＮＡ配列内のＲＮＡｉ標的部位を決定するに適切な条件下で（ａ）のｓｉＮＡ構成をアッセイすることを含む方法に関する。一実施態様において，（ａ）のｓｉＮＡ分子は固定した長さの鎖，例えば約２３ヌクレオチド長の鎖を有する。別の一実施態様において，（ａ）のｓｉＮＡ分子は，異なる長さの鎖，例えば約１５〜約３０（例，約１５，１６，１７，１８，１９，２０，２１，２２，２３，２４，２５，２６，２７，２８，２９，又は３０）ヌクレオチド長の鎖を有する。一実施態様において，このアッセイは，本明細書に記載されるように，再構成インビトロｓｉＮＡアッセイを含むことができる。別の一実施態様において，アッセイは内部で標的ＲＮＡが発現される細胞培養系を用い得る。別の一実施態様において，標的ＲＮＡ断片の検出可能な切断レベルは，例えばゲル電気泳動，ノーザンブロット分析，又はリボヌクレアーゼタンパク質アッセイ等による標的ＲＮＡ配列内の最も適切な標的部位（一つ又は複数）の決定により解析される。標的ＲＮＡ配列は，当業者公知の方法により，例えばインビトロ系でのクローン化及び／又は転写，並びにインビボ系での細胞発現により得ることができる。

一実施態様において，本発明は，（ａ）予め定められた複雑性，例えば４Ｎを有するｓｉＮＡ構成のランダム化ライブラリを生成し，（ここでＮは，ｓｉＮＡ構成の各鎖の塩基対をなすヌクレオチド数を表す）（例，１９の塩基対を有する２１ヌクレオチドのセンス及びアンチセンス鎖を含むｓｉＮＡ構成において，複雑性は４¹⁹となる），（ｂ）標的ＨａｉｒｌｅｓｓＲＮＡ配列内のＲＮＡｉ標的部位を決定するに適切な条件下で，（ａ）のｓｉＮＡ構成をアッセイすることを含む方法に関する。別の一実施態様において，（ａ）のｓｉＮＡ分子は固定した長さの鎖，例えば約２３ヌクレオチド長の鎖を有する。別の一実施態様において，（ａ）のｓｉＮＡ分子は，異なる長さの鎖，例えば約１５〜約３０（例，約１５，１６，１７，１８，１９，２０，２１，２２，２３，２４，２５，２６，２７，２８，２９，又は３０）ヌクレオチド長の鎖を有する。一実施態様において，このアッセイは，本明細書の実施例６に記載されるように，再構成インビトロｓｉＮＡアッセイを含むことができる。別の一実施態様において，アッセイは内部で標的ＲＮＡが発現される細胞培養系を用い得る。別の一実施態様において，ＨａｉｒｌｅｓｓＲＮＡ断片の検出可能な切断レベルは，ゲル電気泳動，ノーザンブロット分析，又はリボヌクレアーゼタンパク質アッセイ等による標的ＨａｉｒｌｅｓｓＲＮＡ配列内の最も適切な標的部位の決定により解析される。標的ＨａｉｒｌｅｓｓＲＮＡ配列は当業者公知の方法により，例えばインビトロ系でのクローン化及び／又は転写，並びにインビボ系での細胞発現により得ることができる。

別の一実施態様において，本発明は，（ａ）標的遺伝子によりコード化されるＲＮＡ標的配列を解析する工程と，（ｂ）（ａ）のＲＮＡの一つ又はそれ以上の領域に相補的な配列を有するｓｉＮＡ分子の一つ又はそれ以上のセットを合成する工程と，（ｃ）標的ＲＮＡ配列内のＲＮＡｉ標的を決定するに適切な条件下で（ｂ）のｓｉＮＡ分子をアッセイすることを含む方法に関する。一実施態様において，（ｂ）のｓｉＮＡ分子は，固定した長さの鎖，例えば約２３ヌクレオチド長の鎖を有する。別の一実施態様において，別の一実施態様において，（ｂ）のｓｉＮＡ分子は，異なる長さの鎖，例えば約１５〜約３０（例，約１５，１６，１７，１８，１９，２０，２１，２２，２３，２４，２５，２６，２７，２８，２９，又は３０）ヌクレオチド長の鎖を有する。一実施態様において，このアッセイは，本明細書の実施例６に記載されるように，再構成インビトロｓｉＮＡアッセイを含む。別の一実施態様において，アッセイは内部で標的ＲＮＡが発現される細胞培養系を用い得る。別の一実施態様において，ＨａｉｒｌｅｓｓＲＮＡ断片の検出可能な切断レベルは，ゲル電気泳動，ノーザンブロット分析，又はリボヌクレアーゼタンパク質アッセイ等による標的ＨａｉｒｌｅｓｓＲＮＡ配列内の最も適切な標的部位の決定により解析される。標的ＨａｉｒｌｅｓｓＲＮＡ配列は当業者公知の方法により，例えばインビトロ系でのクローン化及び／又は転写，並びにインビボ系での細胞発現によって得ることができる。

"標的部位"とは，そのアンチセンス領域内にて標的配列に相補的な配列を含むｓｉＮＡ構成が仲介する切断の"標的とされる"，標的ＲＮＡ内の配列を意味する。

"検出可能な切断レベル"とは，標的ＲＮＡのランダムな分解によって生成したＲＮＡのバックグラウンドを超える切断生成物を認識し得るに十分な程度の切断（及びＲＮＡの切断生成物の形成）を意味する。切断生成物は，標的ＲＮＡの１〜５％から生成されれば，殆どの検出方法においてバックグラウンドを超え十分である。

一実施態様において，本発明は，化学修飾されていてもよい本発明のｓｉＮＡ分子を，薬剤的に許容される担体又は希釈剤中に含む組成物に関する。別の一実施態様において，本発明は，化学修飾されていてもよく，一つ又はそれ以上の遺伝子を標的とする本発明のｓｉＮＡ分子を，薬剤的に許容される担体又は希釈剤中に含む組成物に関する。別の一実施態様において，本発明は，被験者の疾患又は病状を診断する方法に関し，同方法は，被験者の疾患又は病状を診断するに適切な条件下で，本発明の組成物を被験者に投与することを含む。別の一実施態様において，本発明は，本発明は，被験者の疾患，形質又は病状を治療又は予防する方法に関し，同方法は，被験者の疾患，形質又は病状の治療又は予防に適切な条件下で，本発明の組成物を単独で，又は一つ若しくはそれ以上の他の治療的化合物と共に被験者に投与することを含む。更に別の一実施態様において，本発明は，被験者の毛又は毛の成長を抑制，低下又は防止する方法に関し，同方法は，被験者の毛又は毛の成長を抑制，低下又は防止するに適切な条件下で本発明の組成物を被験者に投与することを含む。

別の一実施態様において，本発明は，Ｈａｉｒｌｅｓｓ遺伝子標的を確認する方法に関し，同方法は（ａ）化学修飾されていてもよく，ｓｉＮＡ鎖の一方がＨａｉｒｌｅｓｓ標的遺伝子のＲＮＡに相補的な配列を含む本発明のｓｉＮＡ分子を合成し，（ｂ）細胞，組織，被験者又は有機体内でＨａｉｒｌｅｓｓ標的遺伝子の発現を調節するに適切な条件下で，該ｓｉＮＡ分子を細胞，組織，被験者又は有機体内に導入し，（ｃ）細胞，組織，被験者又は有機体内での表現型の変化の全てをアッセイすることによって，遺伝子機能を決定することを含む。

別の一実施態様において，本発明は，Ｈａｉｒｌｅｓｓ標的を確認する方法に関し，同方法は，（ａ）化学修飾されていてもよく，ｓｉＮＡ鎖の一方がＨａｉｒｌｅｓｓ標的遺伝子のＲＮＡに相補的な配列を含む本発明のｓｉＮＡ分子を合成し，（ｂ）生体系内でＨａｉｒｌｅｓｓ標的遺伝子の発現を調節するに適切な条件下で，該ｓｉＮＡ分子を生体系内に導入し，（ｃ）生体系内での表現型の変化の全てをアッセイすることによって，遺伝子機能を決定することを含む。

"生体系"とは，ヒト又は動物を含むが，これらに限定されない生物源を由来とする，精製された，又は精製形態の材料を意味し，該生体系はＲＮＡｉ活性に必要な構成要素を有している。用語"生体系"には，例えば細胞，組織，被験者若しくは有機体，又はそれらの抽出物が含まれる。生体系という用語には，インビトロ設置に使用される再構成ＲＮＡｉ系も含まれる。

"表現型の変化"とは，本発明の核酸分子（例，ｓｉＮＡ）による接触又は処理に応答して細胞に生じる任意の検出可能な変化を意味する。そのような検出可能な変化には，当該技術分野にて公知の方法でアッセイされ得る形状，寸法，増殖，運動性，タンパク質発現若しくはＲＮＡ発現，又は他の物理的又は化学的変化が含まれるが，これらに限定されるものではない。検出可能な変化には，発現したタンパク質又はアッセイされ得る他の任意の細胞成分を同定するのに使用される例えばＧｒｅｅｎＦｌｏｒｅｓｃｅｎｔタンパク質（ＧＦＰ）のようなレポーター遺伝子／分子，又は他の様々なタグの発現も含まれ得る。

一実施態様において，本発明は，例えば細胞，組織，被験者又は有機体を含む生体系内でＨａｉｒｌｅｓｓ標的遺伝子発現を調節するのに使用され得る，化学修飾されていてもよい本発明のｓｉＮＡ分子を含むキットに関する。別の一実施態様において，本発明は，例えば細胞，組織，被験者又は有機体を含む生体系内でＨａｉｒｌｅｓｓ標的遺伝子の発現の調節に使用され得る，化学修飾されていてもよい二つ以上の本発明のｓｉＮＡ分子を含むキットに関する。

一実施態様において，本発明は，化学修飾されていてもよい一つ又はそれ以上の本発明のｓｉＮＡ分子を含む細胞に関する。別の一実施態様において，本発明のｓｉＮＡ分子を含む細胞は，哺乳類細胞である。更に別の一実施態様では，本発明のｓｉＮＡ分子を含む細胞は，ヒト細胞である。

一実施態様において，化学修飾されていてもよい本発明のｓｉＮＡ分子の合成は，（ａ）ｓｉＮＡ分子の二つの相補的な鎖を合成し，（ｂ）二本鎖ｓｉＮＡ分子を獲得するに適切な条件下で，該二つの相補的な鎖をアニールすることを含む。別の一実施態様において，ｓｉＮＡ分子の二つの相補的な鎖の合成は，固相オリゴヌクレオチド合成を用いる。更に別の一実施態様では，ｓｉＮＡ分子の二つの相補的な鎖の合成は，固相タンデムオリゴヌクレオチド合成を用いる。

一実施態様において，本発明は，ｓｉＮＡ二重鎖分子を合成する方法に関し，同方法は，（ａ）ｓｉＮＡ分子の第一のオリゴヌクレオチド配列鎖を合成する工程と，ここで，第一のオリゴヌクレオチド配列鎖は，ｓｉＮＡの第二のオリゴヌクレオチド配列鎖の合成のための土台として使用され得る切断可能なリンカー分子を有することと，（ｂ）第一のオリゴヌクレオチド配列鎖の土台上にｓｉＮＡ分子の第二のオリゴヌクレオチド配列鎖を合成する工程と，ここで第二のオリゴヌクレオチド配列鎖は更に，ｓｉＮＡ二重鎖の精製に使用され得る化学部分を有することと，（ｃ）二つのｓｉＮＡオリゴヌクレオチド鎖がハイブリダイズして安定な二重鎖を形成するに適切な条件下で，（ａ）のリンカー分子を切断する工程と，（ｄ）第二のオリゴヌクレオチド配列鎖の化学部分を利用してｓｉＮＡ二重鎖を精製する工程とを含む。一実施態様において，（ｃ）のリンカー分子の切断は，例えばメチルアミンのようなアルキルアミン塩基を使用した加水分解条件下でのオリゴヌクレオチドの脱保護中に行われる。一実施態様において，合成方法は，例えば微細孔性ガラス（ＣＰＧ）又はポリスチレンのような固体支持体上での固相合成を含む。ここでは固体支持体を土台として使用して，（ａ）の第一の配列を例えばスクシニルリンカーのような切断可能なリンカー上に合成する。第２の鎖の合成のための土台として使用される（ａ）の切断可能なリンカーは，固体支持体によって誘導されるリンカーと同様の反応性を有し得ため，固体支持体誘導リンカーと（ａ）の切断可能なリンカーの切断とは同時に起こる。別の一実施態様において，結合しているオリゴヌクレオチド配列を切り離すのに使用され得る（ｂ）の化学部分は，例えばジメトキシトリチル基のようなトリチル基を含み，これは本明細書に記載されるように，トリチル−オン−合成に使用され得る。更に別の一実施態様では，例えばジメトキシトリチル基のような化学部分は，例えば酸性条件を用いた精製中に除去される。

更なる実施態様において，ｓｉＮＡの合成方法は，液相合成又は混合合成を用いる。ここではｓｉＮＡ二重鎖の両方の鎖が，第二の配列合成の際の土台として機能する第一の配列に結合した切断可能なリンカーを使用して一列に合成される。別々のｓｉＮＡ配列鎖のハイブリダイゼーションに適切な条件下でリンカーを切断することにより，二重鎖ｓｉＮＡ分子が形成される。

別の一実施態様において，本発明は，ｓｉＮＡ二重鎖分子を合成する方法に関し，同方法は，（ａ）ｓｉＮＡ分子の第一のオリゴヌクレオチド配列鎖を合成する工程と，ここで該配列は，他方のオリゴヌクレオチド配列の合成のための土台として使用され得る切断可能なリンカー分子を有することと，（ｂ）（ａ）の土台上に第一の配列鎖に相補性を有する第二のオリゴヌクレオチドを合成する工程と，ここで第二の配列は二本鎖ｓｉＮＡ分子の他方の鎖を含み，第二の配列は更に，結合しているオリゴヌクレオチド配列を切り離すのに使用され得る化学部分を有することと，（ｃ）切断可能なリンカーで接続されている両方のｓｉＮＡオリゴヌクレオチドを含む完全長配列を切り離すに適切な条件下で，かつ二つのｓｉＮＡオリゴヌクレオチド鎖がハイブリダイズして安定な二重鎖を形成するに適切な条件下で，第二のオリゴヌクレオチド配列鎖の化学部分を利用して（ｂ）の生成物を精製する工程とを含む。一実施態様において，上記の（ｃ）のリンカー分子の切断は，例えば，加水分解条件下でのオリゴヌクレオチドの脱保護中に行われる。別の一実施態様において，上記の（ｃ）のリンカー分子の切断は，オリゴヌクレオチドの脱保護後に行われる。別の一実施態様において，合成方法は，例えば微細孔性ガラス（ＣＰＧ）又はポリスチレンのような固体支持体上での固相合成を含む。ここでは固体支持体を土台として使用して，（ａ）の第一の配列を例えばスクシニルリンカーのような切断可能なリンカー上に合成する。第２の鎖の合成のための土台として使用される（ａ）の切断可能なリンカーは，固体支持体によって誘導されたリンカーと同様又は異なる反応性を有し得ため，固体支持体誘導リンカーと（ａ）の切断可能なリンカーの切断とは同時に又は連続して起こる。一実施態様において，結合しているオリゴヌクレオチド配列を切り離すのに使用され得る（ｂ）の化学部分は，例えばジメトキシトリチル基のようなトリチル基を含む。

別の一実施態様において，本発明は，単一合成プロセスで二本鎖ｓｉＮＡ分子を形成する方法に関する。同方法は，（ａ）第一及び第二の配列を有するオリゴヌクレオチドを合成する工程と，ここで第一の配列は第二の配列に相補性を有し，第一のオリゴヌクレオチド配列は，切断可能なリンカーを介して第二の配列に連結されていることと，また例えば５’−Ｏ−ジメトキシトリチル基（５’−Ｏ−ＤＭＴ）のような，末端の５’−保護基が，第二の配列を有するオリゴヌクレオチド上に残留していることと，（ｂ）オリゴヌクレオチドを脱保護する工程と，それにより二つのオリゴヌクレオチド配列を連結しているリンカーが切断されることと，（ｃ）二本鎖ｓｉＮＡ分子を切り離すに適切な条件下で，本明細書に記載されるように例えばトリチル−オン−合成戦略を使用して，（ｂ）の生成物を精製する工程とを含む。

別の一実施態様において，本発明のｓｉＮＡ分子の合成方法は，その全容が参照により本明細書に加入されるＳｃａｒｉｎｇｅ等，米国特許第５，８８９，１３６号，米国特許第第６，００８，４００号，及び米国特許第第６，１１１，０８６号の教示を含む。

一実施態様において，本発明は，Ｈａｉｒｌｅｓｓに対するＲＮＡｉを仲介するｓｉＮＡ構成に関する。ここでｓｉＮＡ構成は，ｓｉＮＡ構成のヌクレアーゼ耐性を増大させる一つ又はそれ以上の化学修飾，例えば式Ｉ〜ＶＩＩのいずれか，又はその任意の組合せの化学修飾を含む。

別の一実施態様において，本発明は，増大されたヌクレアーゼ耐性を有するｓｉＮＡ分子を生成する方法に関する。同方法は，（ａ）式Ｉ〜ＶＩＩのいずれか，又はその任意の組合せのヌクレオチドをｓｉＮＡ分子に導入する工程と，（ｂ）増大されたヌクレアーゼ耐性を有するｓｉＮＡ分子を単離するに適切な条件下で，ステップ（ａ）のｓｉＮＡ分子をアッセイする工程とを含む。

別の一実施態様において，本発明は，改良された毒物学的プロファイル（例，免疫賦活性が源弱されているか，又は該性質を有さない）ｓｉＮＡ分子を生成する方法に関する。同方法は，（ａ）式Ｉ〜ＶＩＩのいずれか，又はその任意の組合せのヌクレオチド（例，表ＩＶに示すｓｉＮＡのモチーフ）を，ｓｉＮＡ分子内に導入する工程と，（ｂ）改良された毒物学的プロファイルを有するｓｉＮＡ分子を単離するに適切な条件下で，ステップ（ａ）のｓｉＮＡ分子をアッセイする工程とを含む。

別の一実施態様において，本発明は，細胞，被験者又は有機体内でインターフェロン応答を刺激しない（例，インターフェロン応答がない，又はインターフェロン応答が源弱されている）ｓｉＮＡ分子を生成する方法に関する。同方法は，式Ｉ〜ＶＩＩのいずれか，又はその組合せのヌクレオチド（例，表ＩＶに示すｓｉＮＡのモチーフ）を，ｓｉＮＡ分子内に導入する工程と，（ｂ）インターフェロン応答を刺激しないｓｉＮＡ分子を単離するに適切な条件下で，ステップ（ａ）のｓｉＮＡ分子をアッセイする工程とを含む。

"改良された毒物学的プロファイル"とは，化学修飾ｓｉＮＡ構成が，非修飾ｓｉＮＡ，又はより少ない修飾，若しくは改良された毒性を付与する効果が小さい修飾を有するｓｉＮＡ分子と比較して，細胞，被験者又は有機体内で低下された毒性を示すことを意味する。非限定的な例において，改良された毒物学的プロファイルを有するｓｉＮＡ分子は，非修飾ｓｉＮＡ，又はより少ない修飾，若しくは改良された毒性を付与する効果が小さい修飾を有するｓｉＮＡ分子と比較して，細胞，被験者又は有機体内での免疫賦活性応答の低下又は源弱に，より大きく関与する。一実施態様において，改良された毒物学的プロファイルを有するｓｉＮＡ分子は，リボヌクレオチドを含まない。一実施態様において，改良された毒物学的プロファイルを有するｓｉＮＡ分子は，５個より少ないリボヌクレオチド（例１，２，３，又は４個のリボヌクレオチド）を含む。一実施態様において，改良された毒物学的プロファイルを有するｓｉＮＡ分子は，Ｓｔａｂ７，Ｓｔａｂ８，Ｓｔａｂ１１，Ｓｔａｂ１２，Ｓｔａｂ１３，Ｓｔａｂ１６，Ｓｔａｂ１７，Ｓｔａｂ１８，Ｓｔａｂ１９，Ｓｔａｂ２０，Ｓｔａｂ２３，Ｓｔａｂ２４，Ｓｔａｂ２５，Ｓｔａｂ２６，Ｓｔａｂ２７，Ｓｔａｂ２８，Ｓｔａｂ２９，Ｓｔａｂ３０，Ｓｔａｂ３１，Ｓｔａｂ３２又はその任意の組合せ（表ＩＶ参照）を含む。一実施態様において，所定のｓｉＮＡ分子に関連した免疫賦活性応答のレベルは，当該技術分野にて周知のように，例えば特定のｓｉＮＡ分子の免疫賦活性応答を定量するアッセイにおいて，ＰＫＲ／インターフェロン応答，増殖，Ｂ−細胞活性化，及び／又はサイトカイン産生のレベルを測定することにより決定され得る（例えば，参照により本明細書に加入されるＬｅｉｆｅｒ等，２００３，ＪＩｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．２６，３１３−９及び米国特許第５，９６８，９０９号を参照）。

一実施態様において，本発明は，Ｈａｉｒｌｅｓｓに対するＲＮＡｉを仲介するｓｉＮＡ構成に関する。ここでｓｉＮＡ構成は，本明細書に記載されている，ｓｉＮＡ構成のセンス鎖とアンチセンス鎖との間の結合親和力を調節する一つ又はそれ以上の化学修飾を含む。

別の一実施態様において，本発明は，センス鎖とアンチセンス鎖との間の結合親和力が増大されたｓｉＮＡ分子の生成方法に関する。同方法は，（ａ）式Ｉ〜ＶＩＩのいずれか，又はその任意の組合せのヌクレオチドをｓｉＮＡ分子内に導入する工程と，（ｂ）ｓｉＮＡ分子のセンス鎖とアンチセンス鎖との間の結合親和力が増大されたｓｉＮＡ分子を単離するに適切な状況下で，ステップ（ａ）のｓｉＮＡ分子をアッセイする工程とを含む。

一実施態様において，本発明は，Ｈａｉｒｌｅｓｓに対するＲＮＡｉを仲介するｓｉＮＡ構成に関する。ここでｓｉＮＡ構成は，本明細書に記載されている，ｓｉＮＡ構成のアンチセンス鎖と，細胞内の相補的な標的ＲＮＡ配列との間の結合親和力を調節する一つ又はそれ以上の化学修飾を含む。

一実施態様において，本発明は，Ｈａｉｒｌｅｓｓに対するＲＮＡｉを仲介するｓｉＮＡ構成に関する。ここでｓｉＮＡ構成は，本明細書に記載されている，ｓｉＮＡ構成のアンチセンス鎖と，細胞内の相補的な標的ＤＮＡ配列との間の結合親和力を調節する一つ又はそれ以上の化学修飾を含む。

別の一実施態様において，本発明は，センス鎖とアンチセンス鎖との間の結合親和力が増大されたｓｉＮＡ分子の生成方法に関する。同方法は，（ａ）式Ｉ〜ＶＩＩのいずれか，又はその任意の組合せのヌクレオチドをｓｉＮＡ分子内に導入する工程と，（ｂ）ｓｉＮＡ分子のアンチセンス鎖と相補的な標的ＲＮＡ配列との間の結合親和力が増大されたｓｉＮＡ分子を単離するに適切な状況下で，ステップ（ａ）のｓｉＮＡ分子をアッセイする工程とを含む。

別の一実施態様において，本発明は，センス鎖とアンチセンス鎖との間の結合親和力が増大されたｓｉＮＡ分子の生成方法に関する。同方法は，（ａ）式Ｉ〜ＶＩＩのいずれか，又はその任意の組合せのヌクレオチドをｓｉＮＡ分子内に導入する工程と，（ｂ）ｓｉＮＡ分子のアンチセンス鎖と相補的な標的ＤＮＡ配列との間の結合親和力が増大されたｓｉＮＡ分子を単離するに適切な状況下で，ステップ（ａ）のｓｉＮＡ分子をアッセイする工程とを含む。

一実施態様において，本発明は，Ｈａｉｒｌｅｓｓに対するＲＮＡｉを仲介するｓｉＮＡ構成に関する。ここでｓｉＮＡ構成は，本明細書に記載されている，化学修飾されたｓｉＮＡ構成に対して配列相同性を有する，更なる外来性ｓｉＮＡ分子を生成することができる細胞ポリメラーゼのポリメラーゼ活性を調節する一つ又はそれ以上の化学修飾を含む。

別の一実施態様において，本発明は，化学修飾されたｓｉＮＡ構成に対して配列相同性を有する，更なる外来性ｓｉＮＡ分子を生成することができる細胞ポリメラーゼの，増大されたポリメラーゼ活性を調節することができるｓｉＮＡ分子を生成する方法に関する。同方法は，（ａ）式Ｉ〜ＶＩＩのいずれか，又はその任意の組合せのヌクレオチドをｓｉＮＡ分子内に導入する工程と，（ｂ）化学修飾されたｓｉＮＡ構成に対して配列相同性を有する，更なる外来性ｓｉＮＡ分子を生成することができる細胞ポリメラーゼの増大されたポリメラーゼ活性を調節することができるｓｉＮＡ分子を単離するに適切な条件下で，ステップ（ａ）のｓｉＮＡ分子をアッセイする工程とを含む。

一実施態様において，本発明は，細胞内でＨａｉｒｌｅｓｓに対するＲＮＡｉを仲介する化学修飾ｓｉＮＡ構成に関する。ここで化学修飾は，ｓｉＮＡ分子と，標的のＲＮＡ分子，ＤＮＡ分子及び／又はタンパク質，又はそのようなｓｉＮＡ構成によって仲介されるＲＮＡｉの効力を低下させる，ＲＮＡｉに必須の他の要素との相互作用を有意に生じない。

別の一実施態様において，本発明は，Ｈａｉｒｌｅｓに対する改良されたＲＮＡｉ活性を有するｓｉＮＡ分子の生成方法に関する。同方法は，（ａ）式Ｉ〜ＶＩＩのいずれか，又はその任意の組合せのヌクレオチドをｓｉＮＡ分子内に導入する工程と，（ｂ）改良されたＲＮＡｉ活性を有するｓｉＮＡ分子を単離するに適切な条件下で，ステップ（ａ）のｓｉＮＡ分子をアッセイする工程とを含む。

更に別の一実施態様において，本発明は，Ｈａｉｒｌｅｓｓ標的ＲＮＡに対する改良されたＲＮＡｉ活性を有するｓｉＮＡ分子の生成方法に関する。同方法は，（ａ）式Ｉ〜ＶＩＩのいずれか，又はその任意の組合せのヌクレオチドをｓｉＮＡ分子内に導入する工程と，（ｂ）標的ＲＮＡに対する改良されたＲＮＡｉ活性を有するｓｉＮＡ分子を単離するに適切な条件下で，ステップ（ａ）のｓｉＮＡ分子をアッセイする工程とを含む。

更に別の一実施態様において，本発明は，Ｈａｉｒｌｅｓｓ標的ＤＮＡに対する改良されたＲＮＡｉ活性を有するｓｉＮＡ分子の生成方法に関する。同方法は，（ａ）式Ｉ〜ＶＩＩのいずれか，又はその任意の組合せのヌクレオチドをｓｉＮＡ分子内に導入する工程と，（ｂ）標的ＲＮＡに対する改良されたＤＮＡｉ活性を有するｓｉＮＡ分子を単離するに適切な条件下で，ステップ（ａ）のｓｉＮＡ分子をアッセイする工程とを含む。

一実施態様において，本発明は，Ｈａｉｒｌｅｓｓに対するＲＮＡｉを仲介するｓｉＮＡ構成に関する。ここでｓｉＮＡ構成は，本明細書に記載されている，ｓｉＮＡ構成の細胞取込みを調節する一つ又はそれ以上の化学修飾を含む。

別の一実施態様において，本発明は，細胞取込みが改良されたＨａｉｒｌｅｓｓに対するｓｉＮＡ分子を生成する方法に関する。同方法は，（ａ）式Ｉ〜ＶＩＩのいずれか，又はその任意の組合せのヌクレオチドをｓｉＮＡ分子内に導入する工程と，（ｂ）細胞取込みが改良されたｓｉＮＡ分子を単離するに適切な条件下で，ステップ（ａ）のｓｉＮＡ分子をアッセイする工程とを含む。

一実施態様において，本発明は，Ｈａｉｒｌｅｓｓに対するＲＮＡｉを仲介するｓｉＮＡ構成に関する。ここでｓｉＮＡ構成は，本明細書に記載されている，ｓｉＮＡ構成の薬物動態を改良する，例えばポリエチレングリコール若しくはそれと等価なコンジュゲート等のポリマーコンジュゲートを結合させることによって，又はインビボで特定の組織型又は細胞型を標的とするコンジュゲートを結合させることによってｓｉＮＡ構成のバイオアベイラビリティを増大させる，一つ又はそれ以上の化学修飾を含む。このようなコンジュゲートの非限定的な例は，参照により本明細書に加入されるＶａｒｇｅｅｓｅ等，米国特許出願第１０／２０１，３９４号に記載されている。

一実施態様において，本発明は，改良されたバイオアベイラビリティを有する本発明のｓｉＮＡ分子の生成方法に関する。同方法は，（ａ）ｓｉＮＡ分子の構造内にコンジュゲートを導入し，（ｂ）改良されたバイオアベイラビリティを有するｓｉＮＡ分子を単離するに適切な条件下で，ステップ（ａ）のｓｉＮＡ分子をアッセイすることを含む。このようなコンジュゲートは，細胞受容体のためのリガンド，例えば天然タンパク質リガンド由来のペプチド，細胞ＺＩＰコード配列を含むタンパク質局在化配列，抗体，核酸アプタマー，ビタミン及び葉酸及びＮ−アセチルガラクトサミンのような他の補助因子，ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）のようなポリマー，リン脂質，コレステロール，ポリアミン，スペルミン又はスペルミジンのようなポリアミン，並びに他を含み得る。

一実施態様において，本発明は，標的ＲＮＡ配列，又はその一部に相補的な第一のヌクレオチド配列と，該第一の配列に相補的な第二の配列とを有する二本鎖短干渉核酸（ｓｉＮＡ）分子に関し，ここで該第二の配列は，ＲＮＡ干渉の効果的なガイド配列として作用しないように，及び／又はＲＮＡｉを促進する細胞タンパク質として認識されないように，化学修飾されている。

一実施態様において，本発明は，標的ＲＮＡ配列，又はその一部に相補的な第一のヌクレオチド配列と，該第一の配列に相補的な第二の配列とを有する二本鎖短干渉核酸（ｓｉＮＡ）分子に関し，ここで該第二の配列は，それがガイド配列又は標的核酸（例，ＲＮＡ）配列に相補的な配列としてＲＮＡｉ経路内に入り込むことを防止するように，デザイン又は修飾されている。このようなデザイン又は修飾は，本発明のｓｉＮＡの活性を増大させ，及び／又はｓｉＮＡ分子の特異性を高めることが期待される。またこれらの修飾は，任意の標的から外れた効果，及び／又は関連する毒性を最小にすることも期待される。

一実施態様において，本発明は，標的ＲＮＡ配列，又はその一部に相補的な第一のヌクレオチド配列と，該第一の配列に相補的な第二の配列とを有する二本鎖短干渉核酸（ｓｉＮＡ）分子に関し，ここで該第二の配列は，ＲＮＡ干渉仲介のためのガイド配列として作用することができない。

一実施態様において，本発明は，標的ＲＮＡ配列，又はその一部に相補的な第一のヌクレオチド配列と，該第一の配列に相補的な第二の配列とを有する二本鎖短干渉核酸（ｓｉＮＡ）分子に関し，ここで該第二の配列は，末端５’−ヒドロキシル（５’−ＯＨ）又は５’−リン酸基を有さない。

一実施態様において，本発明は，標的ＲＮＡ配列，又はその一部に相補的な第一のヌクレオチド配列と，該第一の配列に相補的な第二の配列とを有する二本鎖短干渉核酸（ｓｉＮＡ）分子に関し，ここで該第二の配列は，該第二の配列の５’−末端において末端キャップ部分を有する。一実施態様において，末端キャップ部分は，逆位脱塩基，逆位デオキシ脱塩基，逆位ヌクレオチド部分，図１０に示す基，アルキル又はシクロアルキル基，複素環，又は第二の配列がＲＮＡｉのガイド配列又はテンプレートとして働くＲＮＡｉ活性を妨げる任意の他の基を含む。

一実施態様において，本発明は，標的ＲＮＡ配列，又はその一部に相補的な第一のヌクレオチド配列と，該第一の配列に相補的な第二の配列とを有する二本鎖短干渉核酸（ｓｉＮＡ）分子に関し，ここで該第二の配列は，該第二の配列の５’−末端及び３’−末端において末端キャップ部分を有する。一実施態様において，各末端キャップ部分は，個々に，逆位脱塩基，逆位デオキシ脱塩基，逆位ヌクレオチド部分，図１０に示す基，アルキル又はシクロアルキル基，複素環，又は第二の配列がＲＮＡｉのガイド配列又はテンプレートとして働くＲＮＡｉ活性を妨げる任意の他の基を含む。

一実施態様において，本発明は，標的核酸（例，ＤＮＡ又はＲＮＡ，例えば遺伝子又は対応するＲＮＡ）の発現を下方調節，又は抑制する改良された特異性を有する本発明のｓｉＮＡ分子の生成方法に関する。同方法は，（ａ）ｓｉＮＡ分子の構造内に一つ又はそれ以上の化学修飾を導入し，（ｂ）改良された特異性を有するｓｉＮＡ分子を単離するに適切な条件下で，ステップ（ａ）のｓｉＮＡ分子をアッセイすることを含む。別の一実施態様において，特異性の改良に使用される化学修飾は，ｓｉＮＡ分子の５’−末端，３’−末端，又は５’及び３’−末端の両方の末端キャップ修飾を含む。末端キャップ修飾は，例えば図１０に示す構造（例，逆位デオキシ脱塩基部分）又は標的から外れた核酸配列に対するＲＮＡ干渉を仲介できないように，ｓｉＮＡ分子の一部（例，センス鎖）を変更する任意の他の化学修飾を含み得る。非限定的な例において，ｓｉＮＡ分子は，ｓｉＮＡ分子のアンチセンス鎖のみが，ＲＩＳＣ仲介による対応する標的ＲＮＡ配列の分解ためのガイド配列として働き得るようデザインされる。これは，ＲＮＡｉ機構によりセンス鎖がガイド配列として認識されることを妨げる，センス鎖への化学修飾の導入によるｓｉＮＡのセンス配列の変更によって達成され得る。一実施態様において，このような化学修飾は，センス鎖の５’−末端の任意の化学基，又はＲＮＡ干渉を仲介するガイド配列として不活性なようにセンス鎖を変更する任意の他の基を含む。これらの修飾により，例えばセンス鎖の５’−末端にはもはや遊離５’−ヒドロキシル（５’−ＯＨ），又は遊離５’−リン酸基（例，ホスフェート，ジホスフェート，トリホスフェート，環式ホスフェート等）が存在しない分子が形成され得る。このようなｓｉＮＡ構成の非限定的な例は，本明細書に記載されており，例えば"Ｓｔａｂ９／１０"，"Ｓｔａｂ７／８"，"Ｓｔａｂ７／１９"，"Ｓｔａｂ１７／２２"，"Ｓｔａｂ２３／２４"，"Ｓｔａｂ２４／２５"，及び"Ｓｔａｂ２４／２６"（例，Ｓｔａｂ７，９，１７，２３，又は２４センス鎖を有する任意のｓｉＮＡ分子）化学構造，及びその異形（表ＩＶ参照）を含み，ここでｓｉＮＡのセンス鎖の５’−末端及び３’−末端は，ヒドロキシル基又はリン酸基を有さない。

一実施態様において，本発明は，標的核酸（例，ＤＮＡ又はＲＮＡ，例えば遺伝子又はその対応するＲＮＡ）の発現を下方調節，又は抑制する改良された特異性を有する本発明のｓｉＮＡ分子の生成方法に関する。同方法は，ｓｉＮＡ分子の鎖又は一部分のＲＮＡｉ活性のためのテンプレート又はガイド配列としての作用を妨げる一つ又はそれ以上の化学修飾を，ｓｉＮＡ分子の構造内に導入することを含む。一実施態様において，ｓｉＮＡ分子の不活性な鎖又は領域は，ｓｉＮＡ分子のセンス鎖又はセンス領域，即ち標的核酸配列に相補性を有さないｓｉＮＡ分子の鎖又は領域である。一実施態様において，このような化学修飾は，５’−ヒドロキシル（５’−ＯＨ）又は５’−リン酸基を含まない，ｓｉＮＡ分子の鎖又は領域の５’−末端の任意の基，又はセンス鎖又はセンス領域をＲＮＡ干渉仲介のためのガイド配列として不活性にする任意の他の基を含む。そのようなｓｉＮＡ構成の非限定的な例は，本明細書に記載されている，例えば"Ｓｔａｂ９／１０"，"Ｓｔａｂ７／８"，"Ｓｔａｂ７／１９"，"Ｓｔａｂ１７／２２"，"Ｓｔａｂ２３／２４"，"Ｓｔａｂ２４／２５"，及び"Ｓｔａｂ２４／２６"（例，Ｓｔａｂ７，９，１７，２３，又は２４のセンス鎖を有する任意のｓｉＮＡ）化学構造及びその異形（表ＩＶ参照）を含み，ここでセンス鎖の５’−末端及び３’−末端は，ヒドロキシル基又はリン酸基を有さない。

一実施態様において，本発明は，標的核酸配列に対するＲＮＡ干渉を仲介する活性を有するｓｉＮＡ分子をスクリーニングするための方法に関する。同方法は，（ａ）複数の未修飾ｓｉＮＡ分子を生成する工程と，（ｂ）標的核酸配列に対するＲＮＡ干渉を仲介する活性を有するｓｉＮＡ分子を単離するに適切な状況下で，ステップ（ａ）のｓｉＮＡ分子をスクリーニングする工程と，（ｃ）化学修飾を（例，本明細書に記載される，又は周知の別の化学修飾）（ｂ）の活性ｓｉＮＡ分子内に導入する工程とを含む。一実施態様において，本方法は更に，標的核酸配列に対するＲＮＡ干渉を仲介する活性を有する化学修飾されたｓｉＮＡ分子を単離するに適切な条件下で，ステップ（ｃ）の化学修飾されたｓｉＮＡ分子を再スクリーニングする工程とを含む。

一実施態様において，本発明は，標的核酸配列に対するＲＮＡ干渉を仲介する活性を有する化学修飾されたｓｉＮＡ分子をスクリーニングするための方法に関する。同方法は，（ａ）複数の化学修飾されたｓｉＮＡ分子（例，本明細書に記載される，又は周知の他のｓｉＮＡ分子）を生成する工程と，（ｂ）標的核酸配列に対するＲＮＡ干渉を仲介する活性を有する化学修飾されたｓｉＮＡ分子を単離するに適切な条件下で，ステップ（ａ）のｓｉＮＡ分子をスクリーニングする工程とを含む。

用語"リガンド"は，別の化合物，例えば受容体と直接的又は間接的に相互作用することができる任意の化合物又は分子，例えば薬物，ペプチド，ホルモン，又は神経伝達物質等を意味する。リガンドと相互作用する受容体は，細胞表面上に存在するか，又は代替的に細胞間受容体に存在し得る。リガンドの受容体との相互作用は生化学的反応を誘起し得るか，又は単に物理的な相互作用又は結合であり得る。

別の一実施態様において，本発明は，改良されたバイオアベイラビリティを有する本発明のｓｉＮＡ分子を生成する方法に関する。同方法は，（ａ）賦形剤製剤をｓｉＮＡ分子に導入し，（ｂ）改良されたバイオアベイラビリティを有するｓｉＮＡ分子を単離するに適切な条件下で，ステップ（ａ）のｓｉＮＡ分子をアッセイすることを含む。このような賦形剤には，シクロデキストリン，脂質，カチオン性脂質，ポリアミン，リン脂質，ナノ粒子，受容体，リガンド，及び他のポリマーが含まれる。

別の一実施態様において，本発明は，改良されたバイオアベイラビリティを有する本発明のｓｉＮＡ分子を生成する方法に関する。同方法は，式Ｉ〜ＶＩＩのいずれか，又はその任意の組合せのヌクレオチドをｓｉＮＡ分子内に導入し，（ｂ）改良されたバイオアベイラビリティを有するｓｉＮＡ分子を単離するに適切な条件下で，ステップ（ａ）のｓｉＮＡ分子をアッセイすることを含む。

別の一実施態様において，ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）は，本発明のｓｉＮＡ化合物と共有結合し得る。結合したＰＥＧは，任意の分子量，好ましくは約２，０００〜約５０，０００ダルトン（Ｄａ）の分子量を有し得る。

本発明を，単独で，又はインビトロ又はインビボでＲＮＡの導入を実行するのに必要な試薬の少なくとも一つを有するキットの構成要素として使用して，サンプル及び／又は被験者を試験し得る。例えば，キットの好ましい構成要素には，本発明のｓｉＮＡ分子と，本明細書に記載されるようにｓｉＮＡを細胞内に導入することを促進するビヒクル（例，脂質の使用，及び周知の他のトランスフェクション方法）が含まれる。キットは，標的の確認のため，例えば遺伝子の機能及び／又は活性を測定するために使用され得るか，又は薬物最適化，及び薬物発見において使用され得る（例えばＵｓｍａｎ等，米国特許出願第６０／４０２，９９６号を参照）。このようなキットはまた，キットの使用者が本発明を実施できるように説明書も含む。

用語"短干渉核酸"，"ｓｉＮＡ"，"短干渉ＲＮＡ"，"ｓｉＲＮＡ"，"短干渉核酸分子"，"短干渉オリゴヌクレオチド分子"，又は"化学修飾された短干渉核酸分子"は，本明細書で使用されているように，配列特異的な方法においてＲＮＡ干渉"ＲＮＡｉ"又は遺伝子サイレンシングを仲介することにより，遺伝子発現又はウイルス複製を抑制又は下方調節し得る任意の核酸分子を指す。（例えばＺａｍｏｒｅ等，２０００，Ｃｅｌｌ，１０１，２５−３３，Ｂａｓｓ，２００１，Ｎａｔｕｒｅ，４１１，４２８−４２９，Ｅｌｂａｓｈｉｒ等，２００１，Ｎａｔｕｒｅ，４１１，４９４−４９８，及びＫｒｅｕｔｚｅｒ等，国際特許出願公開第ＷＯ００／４４８９５号，Ｚｅｒｎｉｃｋａ−Ｇｏｅｔｚ等，国際特許出願公開第ＷＯ０１／３６６４６号，Ｆｉｒｅ，国際特許出願公開第ＷＯ９９／３２６１９号，Ｐｌａｅｔｉｎｃｋ等，国際特許出願公開第ＷＯ００／０１８４６号，Ｍｅｌｌｏ及びＦｉｒｅ，国際特許出願公開第ＷＯ０１／２９０５８号，Ｄｅｓｃｈａｍｐｓ−Ｄｅｐａｉｌｌｅｔｔｅ，国際特許出願公開第ＷＯ９９／０７４０９号，及びＬｉ等，国際特許出願公開第ＷＯ００／４４９１４号，Ａｌｌｓｈｉｒｅ，２００２，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２９７，１８１８−１８１９，Ｖｏｌｐｅ等，２００２，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２９７，１８３３−１８３７，Ｊｅｎｕｗｅｉｎ，２００２，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２９７，２２１５−２２１８，及びＨａｌｌ等，２００２，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２９７，２２３２−２２３７，Ｈｕｔｖａｇｎｅｒ及びＺａｍｏｒｅ，２００２，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２９７，２０５６−６０，ＭｃＭａｎｕｓ等，２００２，ＲＮＡ，８，８４２−８５０，Ｒｅｉｎｈａｒｔ等，２００２，Ｇｅｎｅ＆ａｍｐ，Ｄｅｖ．，１６，１６１６−１６２６，及びＲｅｉｎｈａｒｔ＆Ｂａｒｔｅｌ，２００２，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２９７，１８３１参照）。本発明のｓｉＮＡ分子の非限定的な例は，本明細書にて図４〜６，及び表ＩＩとＩＩＩに示す。例えばｓｉＮＡは，自己相補的なセンス領域及びアンチセンス領域を有する二本鎖ポリヌクレオチド分子であり得，ここでアンチセンス領域は標的核酸分子のヌクレオチド配列又はその一部に相補的なヌクレオチド配列を有し，センス領域は，標的核酸配列又はその一部に一致するヌクレオチド配列を有する。ｓｉＮＡは二つの別個のオリゴヌクレオチドから組立てられてもよく，ここで片方の鎖はセンス鎖で，他方の鎖はアンチセンス鎖であり，またアンチセンス鎖及びセンス鎖は自己相補性を有し（即ち，例えばアンチセンス鎖及びセンス鎖が二重鎖又は二本鎖構造を形成する場合等，各鎖は他方の鎖のヌクレオチド配列に相補的なヌクレオチド配列を有し，例えば二本鎖領域は，約１５〜約３０個，例えば，約１５，１６，１７，１８，１９，２０，２１，２２，２３，２４，２５，２６，２７，２８，２９又は３０個の塩基対を有し，アンチセンス鎖は，標的核酸分子のヌクレオチド配列又はその一部に相補的なヌクレオチド配列を有し，かつセンス鎖は，標的核酸配列，又はその一部に一致するヌクレオチド配列を有する（例，ｓｉＮＡ分子の約１５〜約２５個又はそれ以上のヌクレオチドは，標的核酸，又はその一部に相補性を有する）。代替的に，ｓｉＮＡは単一のオリゴヌクレオチドから組立てられてもよく，ここでｓｉＮＡの自己相補的なセンス領域及びアンチセンス領域は，核酸ベース又は非核酸ベースのリンカー（一つ又は複数）によって連結される。ｓｉＮＡは，自己相補的なセンス領域及びアンチセンス領域を有する二重鎖，非対称二重鎖，ヘアピン又は非対称ヘアピン第二構造を有するポリヌクレオチドであり得，ここでアンチセンス領域は，別個の標的核酸分子のヌクレオチド配列又はその一部に相補的なヌクレオチド配列を有し，センス領域は，標的核酸配列，又はその一部に一致するヌクレオチド配列を有する。ｓｉＮＡは，二つ又はそれ以上のループ構造と，自己相補的なセンス領域及びアンチセンス領域を含むステム部とを有する環状の一本鎖ポリヌクレオチドであり得る。ここでアンチセンス領域は，標的核酸分子のヌクレオチド配列又はその一部に相補的なヌクレオチド配列を有し，センス領域は，標的核酸配列，又はその一部に一致するヌクレオチド配列を有し，また環状ポリヌクレオチドは，インビボ又はインビトロのいずれかで，ＲＮＡｉを仲介し得る活性ｓｉＮＡ分子を生成するように処理され得る。ｓｉＮＡはまた，標的核酸分子のヌクレオチド配列又はその一部に相補的なヌクレオチドを有する一本鎖ポリヌクレオチドを含むことができる（例えばこのようなｓｉＮＡ分子は，該ｓｉＮＡ分子内に標的核酸配列，又はその一部に一致するヌクレオチド配列を必要としない）。ここで一本鎖ポリヌクレオチドは更に，５’−ホスフェート（例えばＭａｒｔｉｎｅｚ等，２００２，Ｃｅｌｌ．，１１０，５６３−５７４及びＳｃｈｗａｒｚ等，２００２，ＭｏｌｅｃｕｌａｒＣｅｌｌ，１０，５３７−５６８参照），又は５’，３’−ジホスフェートのような末端リン酸基を有し得る。特定の実施態様において，本発明のｓｉＮＡ分子は，別個のセンス及びアンチセンス配列又は領域を有し，ここでセンス領域とアンチセンス領域とは，公知のようにヌクレオチド又は非ヌクレオチドリンカー分子で共有結合しているか，又は代替的に，イオン相互作用，水素結合，ファンデルワールス相互作用，疎水性相互作用，及び／又はスタッキング相互作用で非共有結合している。特定の実施態様において，本発明のｓｉＮＡ分子は，標的遺伝子のヌクレオチド配列に相補的なヌクレオチド配列を有する。別の一実施態様において，本発明のｓｉＮＡ分子は，標的遺伝子の発現を抑制するように標的遺伝子のヌクレオチド配列と相互作用する。本明細書で使用されているように，ｓｉＮＡ分子は，ＲＮＡのみを含むものに限定される必要はなく，化学修飾されたヌクレオチド及び非ヌクレオチドをも包含する。特定の実施態様において，本発明の短干渉核酸分子は，２’−ヒドロキシ（２’−ＯＨ）含有ヌクレオチドを欠く。本願出願人は，特定の実施態様において，短干渉核酸はＲＮＡｉの仲介には２’−ヒドロキシ基を含むヌクレオチドの存在を必要としないことを説明する。また，そのようなものとして，本発明の短干渉核酸分子は，任意でリボヌクレオチド（例，２’−ＯＨ基を含むヌクレオチド）を含まない。ＲＮＡｉを支持するためにｓｉＮＡ分子内にリボヌクレオチドの存在を必要としないこのようなｓｉＮＡ分子は，しかしながら，２’−ＯＨ基を有する一つ又はそれ以上のヌクレオチドを含む，結合した一つ若しくは複数のリンカー，又は他の結合若しくは関連する基，部分，又は鎖を有していてもよい。任意にてｓｉＮＡ分子は，ヌクレオチド位置の約５，１０，２０，３０，４０，又は５０％にてリボヌクレオチドを有し得る。本発明の修飾された短干渉核酸分子は，短干渉修飾オリゴヌクレオチド"ｓｉＭＯＮ"とも称され得る。本明細書で使用されるように，用語ｓｉＮＡは，配列特異的なＲＮＡｉを仲介できる核酸分子を説明するために使用される他の用語，例えば短干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ），二重鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ），マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ），ショートヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ），短干渉オリゴヌクレオチド，短干渉核酸，短干渉修飾オリゴヌクレオチド，化学修飾ｓｉＲＮＡ，転写後遺伝子サイレンシングＲＮＡ（ｐｔｇｓＲＮＡ），及び他と等価であるとする。加えて，本明細書で使用されるように，用語ＲＮＡｉは，例えば転写後遺伝子サイレンシング，翻訳抑制，又は後成等，配列特異的なＲＮＡ干渉を説明するために使用される他の用語と等価であるとする。例えば，本発明のｓｉＮＡ分子は，転写後レベル，又は転写前レベルの両方において遺伝子を後成的にサイレンシングするために使用され得る。非限定的な例において，本発明のｓｉＮＡ分子による遺伝子発現の後成的な調節は，ｓｉＮＡ仲介によるクロマチン構造又はメチル化パターンの修飾により，遺伝子発現を変更し得る（例えば，Ｖｅｒｄｅｌ等，２００４，Ｓｃｉｅｎｃｅ，３０３，６７２−６７６，Ｐａｌ−Ｂｈａｄｒａ等，２００４，Ｓｃｉｅｎｃｅ，３０３，６６９−６７２，Ａｌｌｓｈｉｒｅ，２００２，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２９７，１８１８−１８１９，Ｖｏｌｐｅ等，２００２，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２９７，１８３３−１８３７，Ｊｅｎｕｗｅｉｎ，２００２，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２９７，２２１５−２２１８，及びＨａｌｌ等，２００２，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２９７，２２３２−２２３７を参照されたい）。

一実施態様において，本発明のｓｉＮＡ分子は，オリゴヌクレオチド"ＤＦＯ"を形成する二重鎖である（例えば図１４〜１５，及びＶａｉｓｈ等，２００３年１２月３日出願の米国特許出願第１０／７２７，７８０号，及び２００４年５月２４日出願の国際特許出願第ＵＳ０４／１６３９０，を参照されたい）。

一実施態様において，本発明のｓｉＮＡ分子は，多機能ｓｉＮＡである（例えば図１６〜２１，及びＪａｄｈａｖ等，２００４年２月１０日出願の米国特許出願第６０／５４３，４８０号，及び２００４年５月２４日出願の国際特許出願第ＰＣＴ／ＵＳ０４／１６３９０号を参照されたい）。本発明の多機能ｓｉＮＡは，例えば，ＨａｉｒｌｅｓｓＲＮＡの二つの領域を標的とする配列を含み得る（例えば表ＩＩ及びＩＩＩの標的配列を参照されたい）。

本明細書で使用されるように，"非対称ヘアピン"とは，アンチセンス領域，ヌクレオチド又は非ヌクレオチドを有し得るループ部分，及びアンチセンス領域と塩基対をなしてループを有する二重鎖を形成するに十分な相補的なヌクレオチドを含む程度に，アンチセンス領域と比較して数少ないヌクレオチドを含むセンス領域を含む線状ｓｉＮＡ分子を意味する。例えば，本発明の非対称ヘアピンｓｉＮＡ分子は，細胞又はインビトロ系内でＲＮＡｉを仲介するに十分な長さ（例，約１５〜約３０，又は約１５，１６，１７，１８，１９，２０，２１，２２，２３，２４，２５，２６，２７，２８，２９，又は３０ヌクレオチド）のアンチセンス領域，及び約４〜約１２（例，約４，５，６，７，８，９，１０，１１，又は１２）ヌクレオチドを含むループ領域，及びアンチセンス領域に相補的な約３〜約２５（例，約３，４，５，６，７，８，９，１０，１１，１２，１３，１４，１５，１６，１７，１８，１９，２０，２１，２２，２３，２４，又は２５）ヌクレオチドを有するセンス領域を有し得る。非対称ヘアピンｓｉＮＡ分子はまた，化学修飾されていてもよい５’−末端リン酸基を有し得る。非対称ヘアピンｓｉＮＡ分子のループ部分は，ヌクレオチド，非ヌクレオチド，リンカー分子，又は本明細書に記載されるような共有結合分子を含むことができる。

"非対称二重鎖”は，本明細書で使用されるように，センス領域及びアンチセンス領域を含む二つの別個の鎖を有するｓｉＮＡ分子を意味し，ここでセンス領域は，該センス領域がアンチセンス領域と塩基対をなして二重鎖を形成するに十分な相補的なヌクレオチドを含む程度に，アンチセンス領域と比較して少ないヌクレオチドを含む。例えば，本発明の非対称二重鎖ｓｉＮＡ分子は，細胞又はインビトロ系内でＲＮＡｉを仲介するに十分な長さのアンチセンス領域（例，約１５〜約３０，又は約１５，１６，１７，１８，１９，２０，２１，２２，２３，２４，２５，２６，２７，２８，２９，若しくは３０ヌクレオチド），及びアンチセンス領域に相補的な約３〜約２５（例，約３，４，５，６，７，８，９，１０，１１，１２，１３，１４，１５，１６，１７，１８，１９，２０，２１，２２，２３，２４，又は２５）ヌクレオチドを含むセンス領域を有し得る。

"調節する"は，遺伝子の発現，又は一つ又はそれ以上のタンパク質若しくはタンパク質サブユニットをコード化するＲＮＡ分子若しくは等価であるＲＮＡ分子のコード化レベル，又は一つ又はそれ以上のタンパク質若しくはタンパク質サブユニットの活性が，該発現，レベル，又は活性がモジュレータの不在下で観察される場合と比較して増大，又は減少するよう上方調節，又は下方調節されることを意味する。例えば，用語"調節する"は，“抑制する”を意味し得るが，用語“調節する”の用途はこの定義に限定されるものではない。

"抑制する"，"下方調節する"，又は"低下させる"は，遺伝子の発現，又は一つ又はそれ以上のタンパク質若しくはタンパク質サブユニットをコード化するＲＮＡ分子若しくは等価であるＲＮＡ分子のコード化レベル，又は一つ又はそれ以上のタンパク質若しくはタンパク質サブユニットの活性が，本発明の核酸分子（例，ｓｉＮＡ）が存在しない場合に観察されるもの以下に減少することを意味する。一実施態様において，ｓｉＮＡ分子による抑制，下方調節又は低下は，不活性化又は弱化した分子の存在下で観察されるレベル未満である。別の一実施態様において，ｓｉＮＡ分子による抑制，下方調節，又は低下は，例えば，スクランブル配列又はミスマッチを伴うｓｉＮＡ分子の存在下で観察されるレベル未満である。別の一実施態様において，本発明の核酸分子による遺伝子発現の抑制，下方調節，又は低下は，核酸分子の不在下と比較してその核酸分子の存在下にて大きい。一実施態様において，遺伝子発現の抑制，下方調節，又は低下は，例えばＲＮＡｉ仲介による標的核酸分子（例，ＲＮＡ）の切断，又は翻訳抑制のような転写後サイレンシングと関連する。一実施態様において，遺伝子発現の抑制，下方調節，又は低下は，転写前サイレンシングと関連する。

"遺伝子"，又は"標的遺伝子"は，例えば，ポリペプチドをコード化する構造遺伝子を含むが，それに限定されない核酸配列等，ＲＮＡをコード化する核酸を意味する。遺伝子又は標的遺伝子は，例えば小さい一時的ＲＮＡ（ｓｔＲＮＡ），マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ），小核ＲＮＡ（ｓｎＲＮＡ），短干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ），小核小体ＲＮＡ（ｓｎＲＮＡ），リボソームＲＮＡ（ｒＲＮＡ），転移ＲＮＡ（ｔＲＮＡ）及びそれらの前駆体ＲＮＡのような機能性ＲＮＡ（ｆＲＮＡ）又は非コード化ＲＮＡ（ｎｃＲＮＡ）もコード化し得る。

これらの非コード化ＲＮＡは，ｓｉＮＡ仲介ＲＮＡ干渉のための標的核酸分子としての役割を果たし，機能的又は調節的細胞過程に関与するｆＲＮＡ又はｎｃＲＮＡの活性を調節する。従って，疾患に繋がる異常なｆＲＮＡ及びｎｃＲＮＡ活性は，本発明のｓｉＮＡ分子により調節することができる。ｆＲＮＡ及びｎｃＲＮＡを標的とするｓｉＮＡ分子はまた，例えば遺伝子刷り込み，転写，翻訳，又は核酸プロセシング（例，アミノ基転移，メチル化等）のような細胞過程への干渉によって，有機体又は細胞の遺伝子型又は表現型を操作又は変更するのに使用され得る。標的遺伝子は，細胞由来の遺伝子，内在遺伝子，導入遺伝子，又はその感染後に細胞内に存在する例えばウイルスのような病原体の遺伝子等の外来遺伝子であり得る。標的遺伝子を含む細胞は，任意の有機体，例えば植物，動物，原生動物，ウイルス，細菌，又は真菌から由来するか，又はそれらに含まれ得る。植物の非限定的な例としては，単子葉植物，双子葉植物，又は裸子植物がある。動物の非限定的な例としては，脊椎動物又は無脊椎動物がある。真菌の非限定的な例としては，カビ又はイーストがある。再考には，例えばＳｎｙｄｅｒ及びＧｅｒｓｔｅｉｎ，２００３，Ｓｃｉｅｎｃｅ，３００，２５８−２６０を参照されたい。

"非標準塩基対"は，例えば反転（ｆｌｉｐｐｅｄ）ミスマッチ，一水素結合ミスマッチ，トランス型ミスマッチ，三塩基相互作用，及び四塩基相互作用を含む，ミスマッチ及び／又はゆらぎ塩基対のような任意の非ワトソン・クリック塩基対を意味する。そのような非標準塩基対の非限定的な例としては，ＡＣ反転フーグスティーン，ＡＣゆらぎ，ＡＵ反転フーグスティーン，ＧＵゆらぎ，ＡＡＮ７−アミノ，ＣＣ２−カルボニル−アミノ（Ｈｌ）−Ｎ３−アミノ（Ｈ２），ＧＡ共有（ｓｈａｒｅｄ），ＵＣ４−カルボニル−アミノ，ＵＵイミノ−カルボニル，ＡＣ反転ゆらぎ，ＡＵフーグスティーン，ＡＵ反転ワトソン・クリック，ＣＧ反転ワトソン・クリック，ＧＣＮ３−アミノ−アミノＮ３，ＡＡＮ１−アミノ対称，ＡＡＮ７−アミノ対称，ＧＡＮ７−Ｎ１−アミノ−カルボニル，ＧＡ＋カルボニル−アミノＮ７−Ｎ１，ＧＧＮｌ−カルボニル対称，ＧＧＮ３−アミノ対称，ＣＣカルボニル−アミノ対称，ＣＣＮ３−アミノ対称，ＵＵ２−カルボニル−イミノ対称，ＵＵ４−カルボニル−イミノ対称，ＡＡアミノ−Ｎ３，ＡＡＮ１−アミノ，ＡＣアミノ２−カルボニル，ＡＣＮ３−アミノ，ＡＣＮ７−アミノ，ＡＵアミノ−４−カルボニル，ＡＵＮ１−イミノ，ＡＵＮ３−イミノ，ＡＵＮ７−イミノ，ＣＣカルボニル−アミノ，ＧＡ−アミノ−Ｎ１，ＧＡアミノ−Ｎ７，ＧＡカルボニル−アミノ，ＧＡＮ３−アミノ，ＧＣ−アミノ−Ｎ３，ＧＣカルボニル−アミノ，ＧＣＮ３−アミノ，ＧＣＮ７−アミノ，ＧＧアミノ−Ｎ７，ＧＧカルボニル−イミノ，ＧＧＮ７−アミノ，ＧＵアミノ−２−カルボニル，ＧＵカルボニル−イミノ，ＧＵイミノ−２−カルボニル，ＧＵＮ７−イミノ，ｐｓｉＵイミノ−２−カルボニル，ＵＣ４−カルボニル−アミノ，ＵＣイミノ−カルボニル，ＵＵイミノ−４−カルボニル，ＡＣＣ２−Ｈ−Ｎ３，ＧＡカルボニル−Ｃ２−Ｈ，ＵＵイミノ−４−カルボニル２カルボニル−Ｃ５−Ｈ，ＡＣ−アミノ（Ａ）Ｎ３（Ｃ）−カルボニル，ＧＣイミノ−アミノ−カルボニル，Ｇｐｓｉイミノ−２−カルボニルアミノ−２−カルボニル，及びＧＵイミノ−アミノ−２−カルボニル塩基対があるが，これらに限定されるものではない。

本明細書で使用されるように，"Ｈａｉｒｌｅｓｓ"又は"ＨＲ"は，例えば表Ｉに示すＨａｉｒｌｅｓｓジェンバンク受入番号でコード化されるような，Ｈａｉｒｌｅｓｓ活性を有する任意のＨａｉｒｌｅｓｓタンパク質，ペプチド，又はポリペプチドを意味する。用語“Ｈａｉｒｌｅｓｓ”はまた，Ｈａｉｒｌｅｓｓ活性を有する任意のＨａｉｒｌｅｓｓタンパク質，ペプチド，又はポリペプチドをコード化する核酸配列も意味する。用語"Ｈａｉｒｌｅｓｓ"はまた，例えばＨａｉｒｌｅｓｓアイソフォーム（例，ＨＲ−１，ＨＲ−２），突然変異Ｈａｉｒｌｅｓｓ遺伝子，Ｈａｉｒｌｅｓｓ遺伝子のスプライスバリアント，及びＨａｉｒｌｅｓｓ遺伝子多型のような他のＨａｉｒｌｅｓｓコード化配列も含む。

"相同配列"は，例えば遺伝子，遺伝子転写産物，及び／又は非コード化ポリヌクレオチドのような一つ又はそれ以上のポリヌクレオチド配列によって共有されるヌクレオチド配列を意味する。例えば，相同配列は，例えば遺伝子ファミリーの異なるメンバー，異なるタンパク質エピトープ，異なるタンパク質アイソフォーム，又はサイトカイン及び対応する受容体等の完全に分岐した遺伝子のような，関連するが異なるタンパク質をコード化する二つ又はそれ以上の遺伝子によって共有されるヌクレオチド配列であり得る。相同配列は，例えば非コード化ＤＮＡ又はＲＮＡ，調節配列，イントロン，及び転写制御又は調節部位のような，二つ又はそれ以上の非コード化ポリヌクレオチドによって共有されるヌクレオチド配列であり得る。相同配列はまた，二つ以上のポリヌクレオチド配列によって共有される保存された配列領域を含み得る。相同性は，完全に相同である必要はなく（例，１００％），本発明では部分的に相同な配列も想定される（例，９９％，９８％，９７％，９６％，９５％，９４％，９３％，９２％，９１％，９０％，８９％，８８％，８７％，８６％，８５％，８４％，８３％，８２％，８１％，８０％等）。

"保存された配列領域"は，ポリヌクレオチド内の一つ又はそれ以上の領域のヌクレオチド配列が，世代間で，又は一つの生物系，被験者若しくは有機体と別の一生物系，被験者若しくは有機体間で，有意に異ならないことを意味する。このポリヌクレオチドは，非コード化ＤＮＡ及びＲＮＡの両方を含み得る。

"センス領域"は，ｓｉＮＡ分子のアンチセンス領域に相補性を有するｓｉＮＡ分子のヌクレオチド配列を意味する。加えて，ｓｉＮＡ分子のセンス領域は，標的核酸配列に相同性を有する核酸配列を含み得る。

"アンチセンス領域"は，標的核酸配列に相補性を有するｓｉＮＡ分子のヌクレオチド配列を意味する。加えて，ｓｉＮＡ分子のアンチセンス領域は，任意にてｓｉＮＡ分子のセンス領域に相補性を有する核酸配列を含み得る。

"標的核酸"は，その発現又は活性が調節されるべき任意の核酸配列を意味する。標的核酸は，ＤＮＡ又はＲＮＡのいずれであってもよい。

"相補性"は，核酸が従来のワトソン・クリック型又は他の非従来型のいずれかにより別の一核酸配列と一つ又は複数の水素結合を形成し得ることを意味する。本発明の核酸分子を参照すると，相補的配列を有する核酸分子の結合自由エネルギーは，核酸の関連機能，例えばＲＮＡｉ活動を進行させるに十分である。核酸分子の結合自由エネルギーの測定は，当該技術分野にて公知である（例えば，Ｔｕｒｎｅｒ等，１９８７，ＣＳＨＳｙｍｐ．Ｑｕａｎｔ．Ｂｉｏｌ．ＬＩＩｐｐ．１２３−１３３，Ｆｒｉｅｒ等，１９８６，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８３：９３７３−９３７７，Ｔｕｒｎｅｒ等，１９８７，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１０９：３７８３−３７８５参照）。相補性の割合は，第二の核酸配列と水素結合（ワトソン・クリック型塩基対）を形成することができる核酸分子の連続的な残基の割合を示す（例，１０個のオリゴヌクレオチドを有する第二核酸配列と塩基対をなす第一オリゴヌクレオチド１０個のうちの５，６，７，８，９又は１０個ヌクレオチドは，各々５０％，６０％，７０％，８０％，９０％，及び１００％の相補性を示す）。"完全に相補的な"とは，核酸配列の連続する残基の全てが，同数の，第二の核酸配列内の連続する残基と水素結合することを意味する。一実施態様において，本発明のｓｉＮＡ分子は，一つ又はそれ以上の標的核酸分子，又はその一部に相補的な約１５〜約３０又はそれ以上（例，約１５，１６，１７，１８，１９，２０，２１，２２，２３，２４，２５，２６，２７，２８，２９，若しくは３０又はそれ以上）のヌクレオチドを含む。

一実施態様において，Ｈａｉｒｌｅｓｓ遺伝子発現を下方調節又は低下させる本発明のｓｉＮＡ分子は，被験者又は有機体の毛の成長を防止，抑制又は低下させるために使用される。別の一実施態様において，本発明のｓｉＮＡ分子は，除毛又は脱毛に使用される。

一実施態様において，本発明のｓｉＮＡ分子（例，Ｈａｉｒｌｅｓｓの阻害剤を標的とする）は，被験者又は有機体の脱毛症又は無毛症の治療に使用される。

本発明の一実施態様において，本発明のｓｉＮＡ分子の各配列は，独立して約１５〜約３０個のヌクレオチド長を有する。特定の実施態様では，約１５，１６，１７，１８，１９，２０，２１，２２，２３，２４，２５，２６，２７，２８，２９，又は３０個のヌクレオチド長を有する。別の一実施態様において，本発明のｓｉＮＡ二重鎖は，独立して約１５〜約３０個の塩基対（例，約１５，１６，１７，１８，１９，２０，２１，２２，２３，２４，２５，２６，２７，２８，２９，又は３０個）を有する。別の一実施態様において，本発明のｓｉＮＡ分子の一つ又はそれ以上の鎖は，独立して標的核酸分子に相補的な約１５〜約３０（例，約１５，１６，１７，１８，１９，２０，２１，２２，２３，２４，２５，２６，２７，２８，２９，又は３０）個のヌクレオチドを有する。更に別の一実施態様において，本発明のｓｉＮＡ分子は，約３５〜約５５（例，約３５，４０，４５，５０又は５５）個のヌクレオチド長，又は約３８〜約４４（例，約３８，３９，４０，４１，４２，４３，又は４４）個のヌクレオチド長と，約１５〜約２５（例，約１５，１６，１７，１８，１９，２０，２１，２２，２３，２４，又は２５）個の塩基対とを含むヘアピン又は環状構造を有する。例示的な本発明のｓｉＮＡ分子を，表ＩＩに示す。例示的な本発明の合成ｓｉＮＡ分子を，表ＩＩＩ及び／又は図４〜５に示す。

本明細書で使用されるように，"細胞"は，その生物学的な意味において使用され，多細胞有機体全体，例えば特にヒトを意味するものではない。細胞は，有機体，例えば鳥類，植物及び例えばヒト，雌牛，羊，大型猿，小型猿，豚，犬，及び猫のような哺乳類内に存在し得る。細胞は，原核生物（例，細菌細胞）又は真核生物（例，哺乳類又は植物細胞）由来であり得る。細胞は，体細胞でもよく，生殖細胞由来であってもよく，全能性又は多能性，分裂細胞又は非分裂細胞であり得る。細胞はまた，配偶子若しくは胚，幹細胞，又は完全に区別される細胞から由来するか，又はそれらを含み得る。

本発明のｓｉＮＡ分子は，直接加えるか，又はカチオン性脂質と複合体を構成してリポソーム内に封入され，又は別の方法で標的細胞若しくは組織に送達される。核酸，又は核酸複合体は，関連組織にエクスビボ又はインビボで，直接皮膚適用，経皮適用，又は注入を介して，生体高分子に組み込まれ又は組み込まれずに局所投与され得る。特定の実施態様において，本発明の核酸分子は，表ＩＩ〜ＩＩＩ及び／又は図４〜５に示す配列を含む。このような核酸分子の例は，主にこれらの表及び図に定義される配列から構成される。更に，表ＩＶに記載する化学修飾構造は，本発明の任意のｓｉＮＡ配列に適用することができる。

別の一局面において，本発明は，本発明のｓｉＮＡ分子の一つ又はそれ以上を含む哺乳類細胞を提供する。ｓｉＮＡ分子の一つ又はそれ以上は，独立して，同一又は異なる部位を標的とし得る。

"ＲＮＡ"は，少なくとも一つのリボヌクレオチド残基を含む分子を意味する。"リボヌクレオチド"は，Ｐ−Ｄ−リボフラノース部分の２’位にヒドロキシル基を有するヌクレオチドを意味する。本用語は，二本鎖ＲＮＡ，一本鎖ＲＮＡ，一部精製ＲＮＡのような単離ＲＮＡ，本質的に純粋なＲＮＡ，合成ＲＮＡ，組み換え生成ＲＮＡ，並びに一つ以上のヌクレオチドの付加，欠失，置換，及び／又は変更による天然に存在するＲＮＡとは異なる変更ＲＮＡを含む。このような変更には，例えばｓｉＮＡの末端，又は内部，例えばＲＮＡの一つ以上のヌクレオチドに非ヌクレオチド材料を加えることが含まれる。ヌクレオチドｉｎｔｈｅＲＮＡ分子ｏｆ本発明のＲＮＡ分子内のヌクレオチドはまた，例えば天然に存在しないヌクレオチド，又は化学合成されたヌクレオチド若しくはデオキシヌクレオチドであってもよい。これら変更ＲＮＡは，天然に存在するＲＮＡの類似体と称され得る。

"被験者"は，外植される細胞の提供者又は受容者である有機体，又は細胞それ自体を意味する。"被験者"は，本発明の核酸分子が投与され得る有機体も意味する。被験者は，ヒト又はヒトの細胞を含む哺乳類又は哺乳類の細胞であり得る。

本明細書で使用されるように，用語"ホスホロチオエート"は，式Ｉのヌクレオチド間結合を意味し，ここでＺ及び／又はＷは硫黄原子を含む。従って，用語ホスホロチオエートは，ホスホロチオエート及びホスホロジチオエートの両方のヌクレオチド間結合を意味する。

本明細書で使用されるように，用語"ホスホノアセテート"は，式Ｉを有するヌクレオチド間結合を意味し，ここでＺ及び／又はＷは，アセチル又は保護されたアセチル基を含む。

本明細書で使用されるように，用語"チオホスホノアセテート"は，式Ｉのヌクレオチド間結合を意味し，ここでＺはアセチル又は保護されたアセチル基を含み，かつＷは硫黄原子を含むか，又は代替的にＷはアセチル又は保護されたアセチル基を含み，かつＺは硫黄原子を含む。

本明細書で使用されるように，用語"万能塩基"は，天然ＤＮＡ／ＲＮＡ塩基の各々と塩基対を形成し，その間に相違点が殆ど存在しないヌクレオチド塩基類似体を意味する。万能塩基の非限定的な例としては，周知のように，Ｃ−フェニル，Ｃ−ナフチル及び他の芳香族誘導体，イノシン，アゾールカルボキサミド，及びニトロアゾール誘導体，例えば３−ニトロピロール，４−ニトロインドール，５−ニトロインドール，及び６−ニトロインドールがある（例えばＬｏａｋｅｓ，２００１，ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓＲｅｓｅａｒｃｈ，２９，２４３７−２４４７参照）。

本明細書で使用されるように，用語"非環式ヌクレオチド"は，例えば任意のリボース炭素（Ｃ１，Ｃ２，Ｃ３，Ｃ４，又はＣ５）が，独立して，又は組合せて，ヌクレオチドから欠けている非環式リボース糖を有する任意のヌクレオチドを意味する。

本発明の核酸分子は，個別的に，若しくは組合せて，又は他の薬剤と関連して，被験者若しくは有機体において，除毛（脱毛）のために毛の成長を抑制，低下，又は防止するか，又は脱毛症若しくは無毛症を予防又は治療するために使用され得る。例えば，ｓｉＮＡ分子は，治療に適切な条件下で，個別的に，又は一つ又はそれ以上の薬物と組合せて，被験者に投与され得るか，又は当業者に明らかな他の適切な細胞に対して投与され得る。

更なる実施態様において，ｓｉＮＡ分子は，被験者若しくは有機体において，除毛（脱毛）のために毛の成長を抑制，低下，又は防止するか，又は脱毛症若しくは無毛症を予防又は治療するために，他の周知の治療と組合せて使用され得る。例えば，本明細書に記載する分子は，周知のように，被験者若しくは有機体において，除毛（脱毛）のために毛の成長を抑制，低下，又は防止するか，又は脱毛症若しくは無毛症を予防又は治療するために，一つ又はそれ以上の周知の化合物，治療法，又は処置と組合せて使用され得る。

一実施態様において，本発明は，少なくとも一つの本発明のｓｉＮＡ分子を，該ｓｉＮＡ分子を発現させるようにコード化する核酸配列を含む発現ベクターに関する。例えば，ベクターは，二重鎖を含むｓｉＮＡ分子の両方の鎖をコード化する配列を有し得る。ベクターはまた，自己相補的な単一核酸分子をコード化する配列を有し，それによりｓｉＮＡ分子を形成し得る。発現ベクターの非限定的な例は，Ｐａｕｌ等，２００２，ＮａｔｕｒｅＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，１９，５０５，Ｍｉｙａｇｉｓｈｉ及びＴａｉｒａ，２００２，ＮａｔｕｒｅＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，１９，４９７，Ｌｅｅ等，２００２，ＮａｔｕｒｅＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，１９，５００，及びＮｏｖｉｎａ等，２００２，ＮａｔｕｒｅＭｅｄｉｃｉｎｅ，オンライン版ｄｏｉ，１０．１０３８／ｎｍ７２５に記載されている。

別の一実施態様において，本発明は，本発明の発現ベクターを含む哺乳類細胞，例えばヒト細胞に関する。

更に別の一実施態様において，本発明の発現ベクターは，ジェンバンク受入番号，例えば表Ｉに示すジェンバンク受入番号により参照されるＲＮＡ分子に相補性を有する，ｓｉＮＡのための配列を有する。

一実施態様において，本発明の発現ベクターは，同一又は異なり得る二つ又はそれ以上のｓｉＮＡ分子をコード化する核酸配列を有する。

本発明の別の一局面において，標的ＲＮＡ分子と相互作用して，標的ＲＮＡ分子（例えば本明細書にてジェンバンク受入番号で参照される標的ＲＮＡ分子）をコード化する遺伝子を下方調節するｓｉＮＡは，ＤＮＡ又はＲＮＡベクター内に挿入された転写単位から発現される。組み替えベクターは，ＤＮＡプラスミド又はウイルスベクターであり得る。ｓｉＮＡを発現するウイルスベクターは，アデノ関連ウイルス，レトロウイルス，アデノウイルス，又はαウイルスをベースとして構成され得るが，これらに限定されるものではない。ｓｉＮＡ分子を発現可能な組み替えベクターは，本明細書に記載されるように送達され得，標的細胞に存続する。代替的に，ウイルスベクターを使用してｓｉＮＡ分子を一過性発現してもよい。そのようなベクターは必要に応じて繰り返し投与され得る。一旦発現するとｓｉＮＡ分子は結合し，ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）。によって遺伝子機能又は発現を下方調節する。ｓｉＮＡ発現ベクターの送達は，例えば静脈内又は筋内投与，被験者から外植された標的細胞への投与と，それに次ぐ被験者内への再導入，又は所望の標的細胞内への導入を可能にする任意の他の手段による全身的なものである。

"ベクター"は，所望の核酸を送達するために使用される任意の核酸及び／又はウイルスベースの技術を意味する。

本発明の他の特徴及び利点は，以下の実施態様の記載，及び特許請求の範囲により明らかとなるであろう。

図面の簡単な説明
図１は，ｓｉＮＡ分子の合成スキームの非限定的な例を示す。相補的なｓｉＮＡ配列の鎖，鎖１及び鎖２は，一列に合成され，例えばコハク酸ヌクレオチド又は脱塩基スクシネートのような，固体支持体上の固相合成に使用される切断可能なリンカーと同一でも又は異なっていてもよい切断可能な結合によって接続される。合成は，固相又は液相のいずれでもよいが，ここで示す例は固相合成である。合成は，例えばジメトキシトリチル基のような保護基が，線状オリゴヌクレオチドの末端ヌクレオチド上にそのまま残留するように行われる。オリゴヌクレオチドを切断及び脱保護すると，二つのｓｉＮＡ鎖が自発的にハイブリダイズしてｓｉＮＡ二重鎖を形成し，それにより，例えば精製方法にトリチルを適用することにより，末端保護基を伴う二重鎖／オリゴヌクレオチドのみが単離され，末端保護基の性質を利用して二重鎖を精製することができる。

図２は，本発明の方法により合成されたｓｉＮＡ二重鎖の精製のＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量スペクトルを示す。２個のピークは，予想された別個のｓｉＮＡ配列鎖の質量に一致する。その結果，タンデム合成から生成したｓｉＮＡ二重鎖は，トリチル−オン精製の方法体系を使用して，単一体として精製し得ることが示される。

図３は，ＲＮＡｉに関与する標的ＲＮＡ分解の，提案する機構的表現の非限定的な例を示す。例えばウイルス，トランスポゾン，又は他の外来ＲＮＡ等の外来一本鎖ＲＮＡから，ＲＮＡ依存型ＲＮＡポリメラーゼ（ＲｄＲＰ）によって生成した二重鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）がＤｉｃｅｒ酵素を活性化し，これは次にｓｉＮＡ二重鎖を生成する。代替的に，合成又は発現ｓｉＮＡを，適切な手段により細胞内に直接導入してもよい。活性ｓｉＮＡ複合体が生じてこれが標的ＲＮＡを認識し，その結果，ＲＩＳＣエンドヌクレアーゼ複合体により標的ＲＮＡが分解される。あるいはＲＮＡ依存型ＲＮＡポリメラーゼ（ＲｄＲＰ）により更なるＲＮＡが合成され，これはＤｉｃｅｒを活性化して，更なるｓｉＮＡ分子を生成し，ＲＮＡｉ応答を増幅し得る。

図４Ａ−Ｆは，本発明の化学修飾ｉＮＡの非限定的な例（図４Ａ〜４Ｆ）を示す。図にてＮは任意のヌクレオチド（アデノシン，グアノシン，シトシン，ウリジン，又は任意にてチミジン）を表し，例えばチミジンは括弧（ＮＮ）で示されるオーバーハング領域内で置換されてもよい。ｓｉＮＡ構成のセンス鎖及びアンチセンス鎖の多様な修飾が示される。

図４Ａ：センス鎖は２１ヌクレオチドを含み，二つの末端３’−ヌクレオチドは任意にて塩基対をなし，また存在する全ヌクレオチドは，（ＮＮ）ヌクレオチドを除いてリボヌクレオチドであり，（ＮＮ）ヌクレオチドはリボヌクレオチド，デオキシヌクレオチド，万能塩基，又は本明細書に記載される他の化学修飾を含み得る。アンチセンス鎖は任意にて３’−末端グリセリル部分を有する２１ヌクレオチドを含み，二つの末端３’−ヌクレオチドは，任意にて標的ＲＮＡ配列に相補性を有し，また存在する全ヌクレオチドは，（ＮＮ）ヌクレオチドを除いてリボヌクレオチドであり，（ＮＮ）ヌクレオチドはリボヌクレオチド，デオキシヌクレオチド，万能塩基，又は本明細書に記載される他の化学修飾を含み得る。"ｓ"で示される修飾されたヌクレオチド間結合，例えばホスホロチオエート，ホスホロジチオエート又は本明細書に記載される他のヌクレオチド間結合は，任意にてアンチセンス鎖内の（ＮＮ）ヌクレオチドを接続する。

図４Ｂ：センス鎖は２１ヌクレオチドを含み，二つの末端３’−ヌクレオチドは任意にて塩基対をなし，また存在し得る全ピリミジンヌクレオチドは，２’デオキシ−２’−フルオロ修飾ヌクレオチドであり，存在し得るプリンヌクレオチドは（ＮＮ）ヌクレオチドを除いて２’−Ｏ−メチル修飾ヌクレオチドであり，（ＮＮ）ヌクレオチドはリボヌクレオチド，デオキシヌクレオチド，万能塩基，又は本明細書に記載される他の化学修飾を含み得る。アンチセンス鎖は，任意にて３’−末端グリセリル部分を有する２１ヌクレオチドを含み，二つの末端３’−ヌクレオチドは，任意にて標的ＲＮＡ配列に相補性を有し，また存在し得る全ピリミジンヌクレオチドは，２’−デオキシ−２’−フルオロ修飾ヌクレオチドであり，かつ存在し得る全プリンヌクレオチドは，（ＮＮ）ヌクレオチドを除いて，２’−Ｏ−メチル修飾ヌクレオチドであり，（ＮＮ）ヌクレオチドはリボヌクレオチド，デオキシヌクレオチド，万能塩基，又は本明細書に記載される他の化学修飾を含み得る。"ｓ"で示される修飾されたヌクレオチド間結合，例えばホスホロチオエート，ホスホロジチオエート又は本明細書に記載される他のヌクレオチド間結合は，任意にてアンチセンス鎖内の（ＮＮ）ヌクレオチドを接続する。

図４Ｃ：センス鎖は，５’及び３’−末端キャップ部分を有する２１ヌクレオチドを含み，二つの末端３’−ヌクレオチドは，任意にて塩基対をなし，また存在し得る全ピリミジンヌクレオチドは（ＮＮ）ヌクレオチドを除いて２’−０−メチル又は２’−デオキシ−２’−フルオロ修飾ヌクレオチドであり，（ＮＮ）ヌクレオチドはリボヌクレオチド，デオキシヌクレオチド，万能塩基，又は本明細書に記載される他の化学修飾を含み得る。アンチセンス鎖は，任意にて３’−末端グリセリル部分を有する２１ヌクレオチドを含み，また二つの末端３’−ヌクレオチドは，任意にて標的ＲＮＡ配列に相補性を有し，また存在し得る全ピリミジンヌクレオチドは（ＮＮ）ヌクレオチドを除いて２’−デオキシ−２’−フルオロ修飾ヌクレオチドであり，（ＮＮ）ヌクレオチドはリボヌクレオチド，デオキシヌクレオチド，万能塩基，又は本明細書に記載される他の化学修飾を含み得る。"ｓ"で示される修飾されたヌクレオチド間結合，例えばホスホロチオエート，ホスホロジチオエート又は本明細書に記載される他のヌクレオチド間結合は，任意にてアンチセンス鎖内の（ＮＮ）ヌクレオチドを接続する。

図４Ｄ：センス鎖は，５’及び３’−末端キャップ部分を有する２１ヌクレオチドを含み，二つの末端３’−ヌクレオチドは，任意にて塩基対をなし，また存在し得る全ピリミジンヌクレオチドは（ＮＮ）ヌクレオチドを除いて２’−デオキシ−２’−フルオロ修飾ヌクレオチドであり，（ＮＮ）ヌクレオチドはリボヌクレオチド，デオキシヌクレオチド，万能塩基，又は本明細書に記載される他の化学修飾を含み得，また存在し得る全プリンヌクレオチドは，２’−デオキシヌクレオチドである。アンチセンス鎖は，任意にて３’−末端グリセリル部分を有する２１ヌクレオチドを含み，二つの末端３’−ヌクレオチドは，任意にて標的ＲＮＡ配列に相補性を有し，また存在し得る全ピリミジンヌクレオチドは２’−デオキシ−２’−フルオロ修飾ヌクレオチドであり，かつ存在し得る全プリンヌクレオチドは（ＮＮ）ヌクレオチドを除いて２’−Ｏ−メチル修飾ヌクレオチドであり，（ＮＮ）ヌクレオチドはリボヌクレオチド，デオキシヌクレオチド，万能塩基，又は本明細書に記載される他の化学修飾を含み得る。"ｓ"で示される修飾されたヌクレオチド間結合，例えばホスホロチオエート，ホスホロジチオエート又は本明細書に記載される他のヌクレオチド間結合は，任意にてアンチセンス鎖内の（ＮＮ）ヌクレオチドを接続する。

図４Ｅ：センス鎖は，５’及び３’−末端キャップ部分を有する２１ヌクレオチドを含み，二つの末端３’−ヌクレオチドは，任意にて塩基対をなし，また存在し得る全ピリミジンヌクレオチドは（ＮＮ）ヌクレオチドを除いて２’−デオキシ−２’−フルオロ修飾ヌクレオチドであり，（ＮＮ）ヌクレオチドはリボヌクレオチド，デオキシヌクレオチド，万能塩基，又は本明細書に記載される他の化学修飾を含み得る。アンチセンス鎖は，任意にて３’−末端グリセリル部分を有する２１ヌクレオチドを含み，二つの末端３’−ヌクレオチドは任意にて標的ＲＮＡ配列に相補性を有し，また存在し得る全ピリミジンヌクレオチドは２’−デオキシ−２’−フルオロ修飾ヌクレオチドであり，かつ存在し得る全プリンヌクレオチドは（ＮＮ）ヌクレオチドを除いて２’−Ｏ−メチル修飾ヌクレオチドであり，（ＮＮ）ヌクレオチドはリボヌクレオチド，デオキシヌクレオチド，万能塩基，又は本明細書に記載される他の化学修飾を含み得る。"ｓ"で示される修飾されたヌクレオチド間結合，例えばホスホロチオエート，ホスホロジチオエート又は本明細書に記載される他のヌクレオチド間結合は，任意にてアンチセンス鎖内の（ＮＮ）ヌクレオチドを接続する。

図４Ｆ：センス鎖は，５’及び３’−末端キャップ部分を有する２１ヌクレオチドを含み，ここで二つの末端３’−ヌクレオチドは，任意にて塩基対をなし，また存在し得る全ピリミジンヌクレオチドは（ＮＮ）ヌクレオチドを除いて２’−デオキシ−２’−フルオロ修飾ヌクレオチドであり，（ＮＮ）ヌクレオチドはリボヌクレオチド，デオキシヌクレオチド，万能塩基，又は本明細書に記載される他の化学修飾を含み得，また存在し得る全プリンヌクレオチドは，２’−デオキシヌクレオチドである。アンチセンス鎖は，任意にて３’−末端グリセリル部分を有する２１ヌクレオチドを含み，二つの末端３’−ヌクレオチドは，任意にて標的ＲＮＡ配列に相補性を有し，かつ一つの３’−末端ホスホロチオエートヌクレオチド間結合を有し，また存在し得る全ピリミジンヌクレオチドは，２’−デオキシ−２’−フルオロヌクレオチドであり，かつ存在し得る全プリンヌクレオチドは，（ＮＮ）ヌクレオチドを除いて２’−デオキシヌクレオチドであり，リボヌクレオチド，デオキシヌクレオチド，万能塩基，又は本明細書に記載される他の化学修飾を含み得る。"ｓ"で示される修飾されたヌクレオチド間結合，例えばホスホロチオエート，ホスホロジチオエート又は本明細書に記載される他のヌクレオチド間結合は，任意にてアンチセンス鎖内の（ＮＮ）ヌクレオチドを接続する。構成Ａ〜Ｆのアンチセンス鎖は，本発明の任意の標的核酸配列に相補的な配列を含み，更に，図４Ａ〜Ｆに示すいずれかの構成において，グリセリル部分（Ｌ）がアンチセンス鎖の３’−末端に存在する場合，修飾されたヌクレオチド間結合は任意である。

図５Ａ−Ｆは，本発明の特定の化学修飾ｓｉＮＡ配列の非限定的な例を示す。Ａ〜Ｆは図４Ａ〜Ｆに記載された化学修飾をＨａｉｒｌｅｓｓ（ＨＲ）ｓｉＮＡ配列に適用したものである。このような化学修飾は，いずれのＨａｉｒｌｅｓｓ配列及び／又はＨａｉｒｌｅｓｓ多型配列にも適用し得る。

図６は，本発明の異なるｓｉＮＡ構成の非限定的な例を示す。この例は（構成１，２，及び３）１９の代表的な塩基対を有するが，本発明の異なる実施態様は，本明細書に記載される任意数の塩基対を含む。括弧で示される領域は，例えば，約１，２，３，又は４ヌクレオチド長を含み，好ましくは約２ヌクレオチドを含むヌクレオチドオーバーハングを示す。構成１及び２は，ＲＮＡｉ活性のために独立して使用され得る。構成２は，任意にて生物分解性のリンカーとしてデザインされ得るポリヌクレオチド又は非ヌクレオチドリンカーを含み得る。一実施態様において，構成２に示すループ構造は，結果としてインビボ及び／又はインビトロで構成１を生成する生物分解性のリンカーを含み得る。別の例では，構成３は，リンカーがインビボ及び／又はインビトロにて活性ｓｉＮＡ構成の生成に使用されるのと同一原理の下で構成２を生成させるのに使用され得，同構成は任意にて別の生物分解性のリンカーを使用してインビボ及び／又はインビトロにて活性ｓｉＮＡ構成１を生成させ得る。そのようなものとして，ｓｉＮＡ構成の安定性及び／又は活性はインビボ，又はインビトロ及び／又はインビトロで使用するためのｓｉＮＡ構成のデザインに基づいて調節され得る。

図７Ａ−Ｃは，発現カセットを生成してｓｉＮＡヘアピン構成を生成させる際に用いられるスキームの概略を示す。
図７Ａ：ＤＮＡオリゴマーは５’−制限酵素認識部位（Ｒｌ）配列と共に合成され，次いで所定のＨａｉｒｌｅｓｓ標的配列と同一の配列（ｓｉＮＡのセンス領域）を有する領域が合成される。センス領域は，例えば，約１９，２０，２１，又は２２ヌクレオチド（Ｎ）長を含み，これに例えば約３〜約１０ヌクレオチドを含む規定の配列（Ｘ）のループ配列が続く。

図７Ｂ：合成された構成は，次にＤＮＡポリメラーゼにより伸長されて，自己相補的な配列を有するヘアピン構造を生成する。これはＨａｉｒｌｅｓｓ標的配列に特異性を有し，かつ自己相補的なセンス領域及びアンチセンス領域を有するｓｉＮ転写産物を生成することとなる。

図７Ｃ：構成は（例えば，約９５℃）に加熱されて線状配列となり，そのためプライマーを使用して相補的な第二のＤＮＡ鎖を第１の鎖の３’−制限酵素認識配列へ伸長することが可能となる。二本鎖ＤＮＡは次に，細胞内に発現させるため適切なベクター内に挿入される。構成は，例えば制限酵素認識部位を遺伝子工学で作ることによって，及び／又はＰａｕｌ等，２００２，ＮａｔｕｒｅＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，２９，５０５−５０８に記載されているように，ポリ−Ｕ末端領域を使用して，転写から３’−末端ヌクレオチドオーバーハングが形成されるようにデザインされ得る。

図８Ａ−Ｃは，発現カセットを生成して二本鎖ｉＮＡ構成を生成させる際に用いられるスキームの概略を示す。

図８Ａ：ＤＮＡオリゴマーは，５’−制限酵素認識部位（Ｒｌ）配列と主に合成され，次いで所定のＨａｉｒｌｅｓｓ標的配列と同一の配列（ｓｉＮＡのセンス領域）を有する領域が合成される。センス領域は，例えば，約１９，２０，２１，又は２２ヌクレオチド（Ｎ）長を含み，これに規定の配列（Ｘ）のループ配列に隣接する３’−制限酵素認識部位（Ｒ２）が続く。

図８Ｂ：合成された構成は，次にＤＮＡポリメラーゼにより伸長されて，自己相補的な配列を有するヘアピン構造を生成する。

図８Ｃ：この構成は，Ｒ１及びＲ２に特異的な制限酵素で処理されて二本鎖ＤＮＡを生成し，これは次に，細胞内に発現させるため適切なベクター内に挿入される。転写カセットは，Ｕ６プロモーター領域が，ｓｉＮＡの別個のセンス鎖及びアンチセンス鎖を生成するｄｓＤＮＡの各側に隣接するようにデザインされる。ポリＴ末端配列をこの構成に加えて，得られる転写産物内にＵオーバーハングを生成し得る。

図９Ａ−Ｅは，例えばメッセンジャーＲＮＡのような，特定の標的核酸配列内の，ｓｉＮＡ仲介ＲＮＡｉのための標的部位を決定する際に使用される方法の概略を示す。

図９Ａ：ｓｉＮＡオリゴヌクレオチドのプールを，ｓｉＮＡ構成のアンチセンス領域が，標的部位の標的核酸配列全体に相補性を有するように，またセンス領域が，ｓｉＮＡのアンチセンス領域に相補的な配列を有するように合成する。

図９ＢおよびＣ：配列がプールされ，細胞内へのベクターのトランスフェクションがｓｉＮを発現させるように，ベクター内に挿入される。

図９Ｄ：細胞を，標的核酸配列調節に関連した表現型の変化に基づき区分けする。

図９Ｅ：区分けされた細胞からｓｉＮＡを単離して配列を決定し，標的核酸配列内の効果的な標的部位を確認する。

図１０は，例えば本発明のｓｉＮＡ配列の３’−末端の安定化に使用され得る，異なる安定化化学構造（１〜１０）の非限定的な例を示す。これには，（１）［３−３’］逆位デオキシリボース，（２）デオキシリボヌクレオチド，（３）［５’−３’］−３’−デオキシリボヌクレオチド，（４）［５’−３’］−リボヌクレオチド，（５）［５’−３’］−３’−Ｏ−メチルリボヌクレオチド，（６）３’−グリセリル，（７）［３’−５’］−３’−デオキシリボヌクレオチド，（８）［３’−３’］−デオキシリボヌクレオチド，（９）［５’−２’］−デオキシリボヌクレオチド，及び（１０）［５−３’］−ジデオキシリボヌクレオチドが含まれる。図に示す修飾及び非修飾バックボーン化学構造に加えて，これら化学構造は，本明細書に記載されている異なるバックボーン修飾，例えば式Ｉのバックボーン修飾と組合せてもよい。加えて，５’〜末端修飾の２’−デオキシヌクレオチドは，本明細書に記載する別の修飾又は非修飾のヌクレオチド又は非ヌクレオチド，例えば式Ｉ〜ＶＩＩ，若しくはその任意の組合せであってもよい。

図１１は，ヌクレアーゼ耐性を有する一方でＲＮＡｉ活性仲介能力を保持する本発明の化学修飾ｓｉＮＡ構成の同定に使用される戦略の非限定的な例を示す。化学修飾は，経験的デザインパラメータに基づいてｓｉＮＡ構成内に導入される（例，２’−修飾，塩基修飾，バックボーン修飾，末端キャップ修飾等の導入）。修飾構成は，適切な系内で試験される（例，ヌクレアーゼ耐性にはヒト血清，ＰＫ／送達パラメータには動物モデル）。並行して，例えばルシフェラーゼレポータアッセイのような細胞培養系内でｓｉＮＡ構成のＲＮＡｉ活性を試験する。特定の性質を所有する一方でＲＮＡｉ活性を保持するリードｓｉＮＡ構成が次に同定され，更に修飾され再度アッセイされ得る。この同一のアプローチを，次に，改良された薬物動態プロファイル，送達，及びＲＮＡｉ活性を有するｓｉＮＡ−コンジュゲート分子の同定に使用し得る。

図１２は，線状及び二重鎖の構成を含む本発明のリン酸化ｓｉＮＡ分子，及びその非対称誘導体の非限定的な例を示す。

図１３は，本発明の化学修飾された末端リン酸基の非限定的な例を示す。

図１４Ａは，標的核酸配列内で同定される自己相補的なＤＦＯ構成のデザインに使用される，回文及び／又は反復核酸配列を使用した方法体系の非限定的な例を示す。（ｉ）回文配列又は反復配列が，標的配列の核酸内にて同定される。（ｉｉ）配列は，標的核酸配列，及び回文配列に相補的にデザインされる。（ｉｉｉ）非回文配列の逆転反復配列／相補的配列の反復部分が，相補的配列の３’−末端に付加されて，標的核酸に相補的な配列を含む自己相補的なＤＦＯ分子を生成する。（ｉｖ）ＤＦＯ分子は自己的に組立てて，二重鎖オリゴヌクレオチドを形成し得る。図１４Ｂは，オリゴヌクレオチド配列を形成する二重鎖の非限定的な代表例を示す。図１４Ｃは，オリゴヌクレオチド配列を形成する代表的な二重鎖の自己組立ての概略の非限定的な例を示す。図１４Ｄは，オリゴヌクレオチド配列を形成している代表的な二重鎖の自己会合の概略と，それに続く遺伝子発現をもたらす標的核酸との相互作用の非限定的な例を示す。

図１５は，任意の関心標的核酸配列に相補的な配列を有するＤＦＯ構成内に組み込まれた回文及び／又は反復核酸配列を使用した，自己相補的なＤＦＯ構成のデザインの非限定的な例を示す。これらの回文／反復配列の組み込みにより，各鎖が例えばＲＮＡｉにより標的遺伝子の発現の調節を仲介し得る，二重鎖を形成するＤＦＯ構成のデザインが可能になる。最初に，標的配列を同定する。次いで，相補的配列が生成され，ここで人工回文配列（図にてＸＹＸＹＸＹで示す）を生成する相補的な配列内に，ヌクレオチド又は非ヌクレオチド修飾（Ｘ又はＹとして示す）が導入される。非回文配列の逆転反復／相補的配列の反復部分が，相補的配列の３’−末端に付加されて，標的核酸に相補的な配列を含む自己相補的なＤＦＯ分子を生成する。ＤＦＯ分子は，自己組立てにより，二重鎖オリゴヌクレオチドを形成し得る。

図１６は，各々がＲＮＡｉによる異なる標的核酸配列の切断を仲介し得る，二つの別個のポリヌクレオチド配列を含む，本発明の多機能ｓｉＮＡ分子の非限定的な例を示す。図１６Ａは，第一の標的核酸配列に相補的な第一の領域（相補的領域１）と，第二の標的核酸配列に相補的な第二の領域（相補的領域２）とを有する多機能ｓｉＮＡ分子の非限定的な例を示し，ここで第一及び第二の相補的領域は，多機能ｓｉＮＡの各ポリヌクレオチド配列の３’−末端に位置する。多機能ｓｉＮＡ構成の各ポリヌクレオチド配列の点線部分は，ｓｉＮＡ二重鎖の対応する部分に関して対称性を有するが，標的核酸配列に対称性を有さない。図１６Ｂは，第一の標的核酸配列に相補的な第一の領域（相補的領域１）と，第二の標的核酸配列に相補的な第二の領域（相補的領域２）とを有する多機能ｓｉＮＡ分子の非限定的な例を示し，ここで第一及び第二の相補的領域は，多機能ｓｉＮＡの各ポリヌクレオチド配列の５’−末端に位置する。多機能ｓｉＮＡ構成の各ポリヌクレオチド配列の点線部分は，ｓｉＮＡ二重鎖の対応する部分に関して対称性を有するが，標的核酸配列に対称性を有さない。

図１７は，各々がＲＮＡｉによる異なる標的核酸配列の切断を仲介し得る，別個の領域を含む単一のポリヌクレオチド配列を含む，本発明の多機能ｓｉＮＡ分子の非限定的な例を示す。図１７Ａは，第一の標的核酸配列に相補的な第一の領域（相補的領域１）と，第二の標的核酸配列に相補的な第二の領域（相補的領域２）とを有する多機能ｓｉＮＡ分子の非限定的な例を示し，ここで第二の相補的領域は，多機能ｓｉＮＡの各ポリヌクレオチド配列の３’−末端に位置する。多機能ｓｉＮＡ構成の各ポリヌクレオチド配列の点線部分は，ｓｉＮＡ二重鎖の対応する部分に関して対称性を有するが，標的核酸配列に対称性を有さない。図１７Ｂは，第一の標的核酸配列に相補的な第一の領域（相補的領域１）と，第二の標的核酸配列に相補的な第二の領域（相補的領域２）とを有する多機能ｓｉＮＡ分子の非限定的な例を示し，ここで第一の相補的領域は，多機能ｓｉＮＡの各ポリヌクレオチド配列の５’−末端に位置する。多機能ｓｉＮＡ構成の各ポリヌクレオチド配列の点線部分は，ｓｉＮＡ二重鎖の対応する部分に関して対称性を有するが，標的核酸配列に対称性を有さない。一実施態様において，これらの多機能ｓｉＮＡ構成はインビボ又はインビトロにて処理されて，図１６に示す多機能ｓｉＮＡ構成を生成する。

図１８は，各々がＲＮＡｉによる異なる標的核酸配列の切断を仲介し得る，二つの別個のポリヌクレオチド配列を含み，更に自己相補的な，回文配列，又は反復領域を含むことによって，異なる標的核酸配列に対するＲＮＡ干渉を仲介し得る比較的短い二機能ｓｉＮＡ構成を可能にする，本発明の多機能ｓｉＮＡ分子の非限定的な例を示す。図１８Ａは，第一の標的核酸配列に相補的な第一の領域（相補的領域１）と，第二の標的核酸配列に相補的な第二の領域（相補的領域２）とを有する多機能ｓｉＮＡ分子の非限定的な例を示し，ここで第一及び第二の相補的領域は，多機能ｓｉＮＡの各ポリヌクレオチド配列の３’−末端に位置し，また第一及び第二の相補的領域は，更に自己相補的な，回文配列，又は反復領域を含む。多機能ｓｉＮＡ構成の各ポリヌクレオチド配列の点線部分は，ｓｉＮＡ二重鎖の対応する部分に関して対称性を有するが，標的核酸配列に対称性を有さない。図１８Ｂは，第一の標的核酸配列に相補的な第一の領域（相補的領域１）と，第二の標的核酸配列に相補的な第二の領域（相補的領域２）とを有する多機能ｓｉＮＡ分子の非限定的な例を示し，ここで第一及び第二の相補的領域は，多機能ｓｉＮＡの各ポリヌクレオチド配列の５’−末端に位置し，またここで第一及び第二の相補的領域は，更に自己相補的な，回文配列，又は反復領域を含む。多機能ｓｉＮＡ構成の各ポリヌクレオチド配列の点線部分は，ｓｉＮＡ二重鎖の対応する部分に関して対称性を有するが，標的核酸配列に対称性を有さない。

図１９は，各々が，ＲＮＡｉにより誘導される異なる標的核酸配列の切断を仲介し得る別個の領域を含む単一のポリヌクレオチド配列を含み，更に自己相補的な，回文配列，又は反復領域を含むことによって，異なる標的核酸配列に対するＲＮＡ干渉を仲介し得る比較的短い二機能ｓｉＮＡ構成を可能にする，本発明の多機能ｓｉＮＡ分子の非限定的な例を示す。図１９Ａは，第一の標的核酸配列に相補的な第一の領域（相補的領域１）と，第二の標的核酸配列に相補的な第二の領域（相補的領域２）とを有する多機能ｓｉＮＡ分子の非限定的な例を示し，ここで第一及び第二の相補的領域は，多機能ｓｉＮＡの各ポリヌクレオチド配列の３’−末端に位置し，またここで第一及び第二の相補的領域は，更に自己相補的な，回文配列，又は反復領域を含む。多機能ｓｉＮＡ構成の各ポリヌクレオチド配列の点線部分は，ｓｉＮＡ二重鎖の対応する部分に関して対称性を有するが，標的核酸配列に対称性を有さない。図１９Ｂは，第一の標的核酸配列に相補的な第一の領域（相補的領域１）と，第二の標的核酸配列に相補的な第二の領域（相補的領域２）とを有する多機能ｓｉＮＡ分子の非限定的な例を示し，ここで第一の相補的領域は，多機能ｓｉＮＡの各ポリヌクレオチド配列の５’−末端に位置し，またここで第一及び第二の相補的領域は，更に自己相補的な，回文配列，又は反復領域を含む。多機能ｓｉＮＡ構成の各ポリヌクレオチド配列の点線部分は，ｓｉＮＡ二重鎖の対応する部分に関して対称性を有するが，標的核酸配列に対称性を有さない。一実施態様において，これらの多機能ｓｉＮＡ構成はインビボ又はインビトロにて処理されて，図１８に示す多機能ｓｉＮＡ構成を生成する。

図２０は，本発明の多機能ｓｉＮＡ分子が，例えばサイトカイン及び対応する受容体，異なるウイルス株，ウイルス感染又は複製に関与するウイルス及び細胞タンパク質，又は疾患の進行の維持に関係する多様な生物学的経路に関与する異なるタンパク質等，異なるタンパク質をコード化する別個のＲＮＡ分子のような二つの別個の標的核酸分子をどのように標的にし得るかを示す，非限定的な例を示す。多機能ｓｉＮＡ構成の各鎖は，別個の標的核酸分子に相補性を有する領域を含む。多機能ｓｉＮＡ分子は，ｓｉＮＡの各鎖がＲＩＳＣ複合体により使用されて，ＲＮＡ干渉仲介の対応する標的の切断の開始を仲介し得るようにデザインされる。これらのデザインパラメータには，ｓｉＮＡ構成の各末端の不安定化が含まれ得る（例えばＳｃｈｗａｒｚ等，２００３，Ｃｅｌｌ，１１５，１９９−２０８参照）。このような不安定化は，例えばグアノシン−シチジン塩基対，代替塩基対（例，ゆらぎ），又は当該技術分野で公知の，末端ヌクレオチド位置の不安定化化学修飾ヌクレオチドを使用して達成され得る。

図２１は，本発明の多機能ｓｉＮＡ分子が，例えばＲＮＡの代替コード化領域，ＲＮＡのコード化及び非コード化領域，又はＲＮＡの選択的スプライスバリアント領域のような，標的核酸分子内の二つの別個の標的核酸配列を，どのように標的にし得るかを示す，非限定的な例を示す。多機能ｓｉＮＡ構成の各鎖は，分離した標的核酸分子に相補性を有する領域を含む。多機能ｓｉＮＡ分子は，ｓｉＮＡの各鎖がＲＩＳＣ複合体により使用されて，ＲＮＡ干渉仲介の，対応する標的の切断の開始を仲介し得るようにデザインされる。これらのデザインパラメータには，ｓｉＮＡ構成の各末端の不安定化が含まれ得る（例えばＳｃｈｗａｒｚ等，２００３，Ｃｅｌｌ，１１５，１９９−２０８参照）。このような不安定化は，例えばグアノシン−シチジン塩基対，代替塩基対（例，ゆらぎ），又は当該技術分野で公知の，末端ヌクレオチド位置の不安定化化学修飾ヌクレオチドを使用して達成され得る。

図２２は，Ｈａｉｒｌｅｓｓ（ＨＲ２，転写産物異形２）ｍＲＮＡを標的とするｓｉＮＡにより仲介されるＡ３７５細胞内のＨａｉｒｌｅｓｓｍＲＮＡの減少を表す非限定的な例を示す。Ａ３７５細胞は，２５ｎＭｓｉＮＡと複合体を形成する脂質０．２５μｇ／ウエルでトランスフェクトされた。Ｓｔａｂ９／１０安定化化学構造（表ＩＩＩ及びＩＶ参照）を含む活性ｓｉＮＡ構成は，未処理細胞，一致した化学構造の無関連ｓｉＮＡコントロール構成（３３９６５／３３９７１及び３３９７７／３３９８３），及び脂質単独でトランスフェクトされた細胞（トランスフェクションコントロール）と比較された。図に示すように，ｓｉＮＡ構成はＨａｉｒｌｅｓｓＲＮＡ発現を有意に低下させた。

図２３は，Ｈａｉｒｌｅｓｓ（ＨＲ２，転写産物異形２）ｍＲＮＡを標的とするｓｉＮＡにより仲介されるＡ３７５細胞内のＨａｉｒｌｅｓｓｍＲＮＡの減少を表す非限定的な例を示す。Ａ３７５細胞は，２５ｎＭｓｉＮＡと複合体を形成する脂質０．２５μｇ／ウエルでトランスフェクトされた。Ｓｔａｂ２３／２４安定化化学構造（表ＩＩＩ及びＩＶ参照）を含む活性ｓｉＮＡ構成は，未処理細胞，一致した化学構造の無関連ｓｉＮＡコントロール構成（３３９６５／３３９７１及び３３９７７／３３９８３），及び脂質単独でトランスフェクトされた細胞（トランスフェクションコントロール）と比較された。図に示すように，ｓｉＮＡ構成はＨａｉｒｌｅｓｓＲＮＡ発現を有意に低下させた。

図２４は，Ｈａｉｒｌｅｓｓ（ＨＲ２，転写産物異形２）ｍＲＮＡを標的とするｓｉＮＡにより仲介されるＮＭｕＭｇ細胞内のＨａｉｒｌｅｓｓｍＲＮＡの減少を表す非限定的な例を示す。ＮＭｕＭｇ細胞は，２５ｎＭｓｉＮＡと複合体を形成する脂質０．５μｇ／ウエルでトランスフェクトされた。Ｓｔａｂ９／１０安定化化学構造（表ＩＩＩ及びＩＶ参照）を含む活性ｓｉＮＡ構成は，未処理細胞，一致した化学構造の無関連ｓｉＮＡコントロール構成（ＩＣ），及び脂質単独でトランスフェクトされた細胞（トランスフェクションコントロール）と比較された。図に示すように，ｓｉＮＡ構成はＨａｉｒｌｅｓｓＲＮＡ発現を有意に低下させた。

図２５は，Ｈａｉｒｌｅｓｓ（ＨＲ２，転写産物異形２）ｍＲＮＡを標的とするｓｉＮＡにより仲介されるＮＭｕＭｇ細胞内のＨａｉｒｌｅｓｓｍＲＮＡの減少を表す非限定的な例を示す。ＮＭｕＭｇ細胞は，２５ｎＭｓｉＮＡと複合体を形成する脂質０．５μｇ／ウエルでトランスフェクトされた。Ｓｔａｂ７／８及び７／２５安定化化学構造（表ＩＩＩ及びＩＶ参照）を含む活性ｓｉＮＡ構成は，未処理細胞（ＵＮＴ），一致した化学構造の無関連ｓｉＮＡコントロール構成（ＩＣ−１及びＩＣ−２），及び脂質単独でトランスフェクトされた細胞（トランスフェクションコントロール）と比較された。図に示すように，ｓｉＮＡ構成はＨａｉｒｌｅｓｓＲＮＡ発現を有意に低下させた。

本発明の核酸分子の作用機序
以下は，現在周知である短干渉ＲＮＡにより仲介されるＲＮＡ干渉の提案される機構を説明するものであり，本発明を限定することを意味するものではなく，また先行技術を容認するものではない。本願出願人は本明細書において，化学修飾された短干渉核酸がｓｉＲＮＡ分子と同様にＲＮＡｉを仲介する同様の又は向上した能力を有し，またインビボでの向上した安定性及び活性を有することが期待され，従って，本説明は，ｓｉＲＮＡのみに限定されるものではなく，全体としてのｓｉＮＡに適用され得る。"仲介する向上した能力"又は"向上したＲＮＡｉ活性"という表現は，インビトロ及び／又はインビボで測定されたＲＮＡｉ活性を含み，ここでＲＮＡｉ活性とは，本発明のｓｉＮＡのＲＮＡｉを仲介する能力と，安定性との両方を反映するものである。本発明において，これら活性は，全ＲＮＡｓｉＲＮＡ，又は多数のリボヌクレオチドを含むｓｉＮＡと比較して，インビトロ及び／又はインビボで増大され得る。ある場合には，ｓｉＮＡ分子の活性又は安定性は低下し得るが（即ち，１０倍未満），総じてｓｉＮＡ分子の活性はインビトロ及び／又はインビボにて増大される。

ＲＮＡ干渉は，短干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）により仲介される，動物における配列特異的な転写後遺伝子サイレンシングのプロセスを意味する（Ｆｉｒｅ等，１９９８，Ｎａｔｕｒｅ，３９１，８０６）。植物での対応するプロセスは，通常，転写後遺伝子サイレンシング，又はＲＮＡサイレンシングと称され，真菌ではクエリング（ｑｕｅｌｌｉｎｇ）とも称される。転写後遺伝子サイレンシングのプロセスは，外来遺伝子の発現の防止のための進化的に保存された細胞防御機構であると考えられ，多様な植物相及び種族によって共有されている（Ｆｉｒｅ等，１９９９，ＴｒｅｎｄｓＧｅｎｅｔ，１５，３５８）。このような外来遺伝子発現からの保護は，相同な一本鎖ＲＮＡ又はウイルスゲノムＲＮＡを特異的に破壊する，ウイルス感染，又はトランスポゾン要素のホストゲノム内へのランダムな組込みから細胞応答を介して誘導される二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）の生産に応じて進化してきたとものと思われる。細胞内のｄｓＲＮＡの存在は，未だ完全に特定されていない機構を介してＲＮＡｉ応答を誘発する。この機構は，ｄｓＲＮＡにより仲介されるタンパク質キナーゼＰＫＲ及び２’，５’−オリゴアデニレートシンセターゼの活性化によるインターフェロン応答と，その結果のリボヌクレアーゼＬによるｍＲＮＡの非特異的な切断とは異なるものと想定される。

細胞内の長いｄｓＲＮＡの存在は，Ｄｉｃｅｒと称されるリボヌクレアーゼＩＩＩ酵素の活性を刺激する。Ｄｉｃｅｒは，ｄｓＲＮＡを，短干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）として周知の短いｄｓＲＮＡ部分にプロセシングすることに関与している（Ｂｅｒｓｔｅｉｎ等，２００１，Ｎａｔｕｒｅ，４０９，３６３）。Ｄｉｃｅｒの活性化により得られる短干渉ＲＮＡは，一般に約２１〜約２３個のヌクレオチド長を有し，約１９個の塩基対を含む二重鎖を含む。

Ｄｉｃｅｒはまた，保存された構造を有する前駆体ＲＮＡから，翻訳抑制に関係する２１個及び２２個のヌクレオチドの小さい一時的ＲＮＡ（ｓｔＲＮＡ）を切断することにも関与している（Ｈｕｔｖａｇｎｅｒ等，２００１，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２９３，８３４）。ＲＮＡｉ応答はまた，通常，ＲＮＡ誘導型サイレンシング複合体（ＲＩＳＣ）と称される，ｓｉＲＮＡを含むエンドヌクレアーゼ複合体にも関係し，同複合体は，ｓｉＲＮＡに相同な配列を有する一本鎖ＲＮＡの切断を仲介する。標的ＲＮＡの切断は，ｓｉＲＮＡ二重鎖のガイド配列に相補的な領域の中央にて行われる（Ｅｌｂａｓｈｉｒ等，２００１，ＧｅｎｅｓＤｅｖ．，１５，１８８）加えて，ＲＮＡ干渉はまた，おそらくクロマチン構造を調節する細胞機構を介した，小さいＲＮＡ（例，マイクロＲＮＡ又はｍｉＲＮＡ）により仲介される遺伝子サイレンシングにも関与し，それにより標的遺伝子配列の転写を防止する（例えばＡｌｌｓｈｉｒｅ，２００２，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２９７，１８１８−１８１９，Ｖｏｌｐｅ等，２００２，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２９７，１８３３−１８３７，Ｊｅｎｕｗｅｉｎ，２００２，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２９７，２２１５−２２１８，及びＨａｌｌ等，２００２，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２９７，２２３２−２２３７を参照）。そのようなものとして，本発明のｓｉＮＡ分子は，ＲＮ転写産物との相互作用を介した，又は代替的に特定の遺伝子配列との相互作用を介した遺伝子サイレンシングの仲介に使用することができ，ここで該相互作用は，転写レベル又は転写後レベルにおける遺伝子サイレンシングにて行われる。

ＲＮＡｉは，多様な系内で研究されてきた。Ｆｉｒｅ等，１９９８，Ｎａｔｕｒｅ，３９１，８０６，は，ＲＮＡｉを土壌線虫（Ｃ．ｅｌｅｇａｎｔ）中にて最初に観察した。Ｗｉａｎｎｙ及びＧｏｅｔｚ，１９９９，ＮａｔｕｒｅＣｅｌｌＢｉｏｌ．，２，７０は，マウス胚にてｄｓＲＮＡにより仲介されるＲＮＡｉについて記載した。Ｈａｍｍｏｎｄ等，２０００，Ｎａｔｕｒｅ，４０４，２９３は，ｄｓＲＮＡでトランスフェクトしたＤｒｏｏｐＭａ細胞中のＲＮＡｉについて記載している。Ｅｌｂａｓｈｉｒ等，２００１，Ｎａｔｕｒｅ，４１１，４９４は，培養されたヒト胚腎臓，及びＨｅＬａ細胞を含む哺乳類細胞中での，合成した２１個のヌクレオチドからなるＲＮＡ二重鎖の導入によって誘導されるＲＮＡｉについて記載している。最近のショウジョウバエ胚溶解物の研究において，ＲＮＡｉ活性の仲介に必須のｓｉＲＮＡ長，構造，化学的組成，及び配列に対する必要性が明らかとなった。この研究では，２１ヌクレオチドｉＲＮＡ二重鎖は，２−ヌクレオチド３’−末端ヌクレオチドオーバーハングを含む場合に最も活性が高いことを示している。更に，ｓｉＲＮＡ鎖の一方又は両方を２’−デオキシ又は２’−Ｏ−メチルヌクレオチドで置換するとＲＮＡｉ活性が失われるのに対し，デオキシヌクレオチドによる３’−末端ｓｉＲＮＡヌクレオチドの置換は許容されることが示されている。ｓｉＲＮＡ二重鎖中央のミスマッチ配列もまた，ＲＮＡｉ活性を失わせることが示されている。加えて，これらの研究は標的ＲＮＡ内の切断部位は，ｓｉＲＮＡガイド配列の３’−末端ではなく，５’−末端で規定されることも示している（Ｅｌｂａｓｈｉｒ等，２００１，ＥＭＢＯＪ．，２０，６８７７）。別の研究は，ｓｉＲＮＡ活性のためにｓｉＲＮＡ二重鎖の標的に相補的な鎖上には５’−ホスフェートが必要であり，またｓｉＲＮＡ上の５’−ホスフェート部分の維持にＡＴＰが使用されることを指摘している（Ｎｙｋａｎｅｎ等，２００１，Ｃｅｌｌ，１０７，３０９）。しかしながら，５’−ホスフェートを欠いたｓｉＲＮＡ分子は外来的に導入された場合に活性を有し，このことはｓｉＲＮＡ構成の５’−リン酸化がインビボにて行われ得ることを示唆している。

核酸分子の合成
１００ヌクレオチド長より長い核酸の合成は，自動化された方法では困難であり，またそのような分子の治療的コストは高価である。本発明では，小さい核酸モチーフ（"小さい"は，１００ヌクレオチド長以下，好ましくは８０ヌクレオチド長以下，及び最も好ましくは５０ヌクレオチド長以下の核酸モチーフ，例えば，個々のｓｉＮＡオリゴヌクレオチド配列，又は一列に合成されたｓｉＮＡ配列を指す）は，外来的送達に使用されることが好ましい。これら分子の単純な構造は，タンパク質及び／又はＲＮＡ構造の標的とする領域に侵入する核酸の能力を増大させる。例示的な本発明の分子は化学的に合成され，また他の分子も同様に合成することができる。

オリゴヌクレオチド（例，特定の修飾オリゴヌクレオチド，又はリボヌクレオチドを欠いたオリゴヌクレオチド部分）は，例えばその引用の全てが参照により本明細書に加入されるＣａｒｕｔｈｅｒｓ等，１９９２，ＭｅｔｈｏｄｓｉｎＥｎｚｙｎａｏｌｏｇｙ２１１，３−１９，Ｔｈｏｍｐｓｏｎ等，国際特許出願公開第ＷＯ９９／５４４５９号，Ｗｉｎｃｏｔｔ等，１９９５，ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓＲｅｓ．２３，２６７７−２６８４，Ｗｉｎｃｏｔｔ等，１９９７，ＭｅｔｈｏｄｓＭｏｌ．Ｂｉｏ．，７４，５９，Ｂｒｅｎｎａｎ等，１９９８，ＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌＢｉｏｅｎｇ，６１，３３−４５，及びＢｒｅｎｎａｎ，米国特許第６，００１，３１１号に記載されているような，公知のプロトコルを用いて合成される。オリゴヌクレオチドの合成は，５’−末端にジメトキシトリチル，及び３’−末端にホスホロアミダイト等，通常の核酸保護基，及び核酸結合基を利用する。非限定的な例において，３９４ＡｐｐｌｉｅｄＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ製の合成機上にて，０．２μｍｏｌスケールのプロトコルを用いて２’−Ｏ−メチル化ヌクレオチドのための連結ステップ２５分，及び２’−デオキシヌクレオチド又は２’−デオキシ−２’−フルオロヌクレオチドのための第二の連結ステップ４５分により小規模合成を行った。表Ｖに，この合成サイクルに使用される試薬の量及び接触時間を概略する。代替的に，例えばＰｒｏｔｏｇｅｎｅ（ＰａｌｏＡｌｔｏ，ＣＡ）により製造された装置のような９６−ウエルプレート合成機上にて，サイクルに最小限の変更を加えて，０．２μｍｏｌスケールでの合成を行い得る。２’−Ｏ−メチル残基の各連結サイクルにて，ポリマー結合５’−ヒドロキシルに関して３３倍過剰量の２’−Ｏ−メチルホスホロアミダイト（０．１１Ｍの６０μＬ＝６．６μｍｏｌ），及び１０５倍過剰量のＳ−エチルテトラゾール（０．２５Ｍの６６μＬ＝１５μｍｏｌ）を使用し，デオキシ残基の各連結サイクルにて，ポリマー結合５’−ヒドロキシルに関して７０倍過剰量のＳ−エチルテトラゾール（０．２５Ｍの４０μＬ＝１０μｍｏｌ）を使用し得る。トリチル断片の比色定量で測定される３９４ＡｐｐｌｉｅｄＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．製の合成機上での平均連結収率は，一般に９７．５〜９９％である。３９４ＡｐｐｌｉｅｄＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．合成機のための他のオリゴヌクレオチド合成試薬は，以下のものを含む：脱トリチル化溶液は，塩化メチレン（ＡＢＩ）中３％ＴＣＡ，キャッピングはＴＨＦ（ＡＢＩ）中１６％Ｎ−メチルイミダゾール，及びＴＨＦ（ＡＢＩ）中１０％無水酢酸／１０％２，６−ルチジンにより行われ，酸化溶液は，ＴＨＦ中１６．９ｍＭＩ２，４９ｍＭピリジン，９％水である（ＰｅｒＳｅｐｔｉｖｅＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．）。Ｂｕｒｄｉｃｋ＆ＪａｃｋｓｏｎＳｙｎｔｈｅｓｉｓＧｒａｄｅのアセトニトリルは，試薬瓶から直接使用される。Ｓ−エチルテトラゾール溶液（０．２５Ｍ，アセトニトリル中）は，ＡｍｅｒｉｃａｎＩｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌＣｈｅｍｉｃａｌ，Ｉｎｃ．から入手した固体から作成される。代替的に，ホスホロチオエート結合の導入には，Ｂｅａｕｃａｇｅ試薬（３Ｈ−１，２−ベンゾジチオール−３−オン１，１−ジオキシド，０．０５Ｍ，アセトニトリル中）が使用される。

ＤＮＡベースのオリゴヌクレオチドの脱保護は，以下のように行われる：ポリマー結合トリチル−オンオリゴリボヌクレオチドを４ｍＬねじ蓋付きガラス瓶に移し，６５℃で１０分間，４０％のメチルアミン溶液（１ｍＬ）中に懸濁させる。−２０℃に冷却した後，ポリマー支持体から上澄み液を除去する。支持体を１．０ｍＬのＥｔＯＨ：ＭｅＣＮ：Ｈ２０／３：１：１で３回洗浄し，渦状に攪拌した後，上澄み液を第一の上澄み液に加える。一緒にしたオリゴリボヌクレオチドを含んだ上澄み液を乾燥して，白色粉末を得る。

本発明の特定のｓｉＮＡ分子を含むＲＮＡの合成に使用される方法は，Ｕｓｍａｎ等，１９８７，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，１０９，７８４５，Ｓｃａｒｉｎｇｅ等，１９９０，ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓＲｅｓ．，１８，５４３３，及びＷｉｎｃｏｔｔ等，１９９５，ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓＲｅｓ．２３，２６７７−２６８４Ｗｉｎｃｏｔｔ等，１９９７，ＭｅｔｈｏｄｓＭｏｌ．Ｂｉｏ．，７４，５９に記載された手順に従い，通常の核酸保護基，及び核酸結合基，例えば５’−末端にジメトキシトリチル，及び３’−末端にホスホロアミダイトを使用する。非限定的な例において３９４ＡｐｐｌｉｅｄＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．合成機上にて，０．２μｍｏｌスケールのプロトコルを用いてアルキルシリル保護ヌクレオチドのための連結ステップ７．５分間と，２’−Ｏ−メチル化ヌクレオチドのための連結ステップ２．５分間とにより小規模合成を行った。表Ｖに，この合成サイクルに使用される試薬の量及び接触時間を概略する。代替的に，例えばＰｒｏｔｏｇｅｎｅ（ＰａｌｏＡｌｔｏ，ＣＡ）により製造された装置のような９６−ウエルプレート合成機上にて，サイクルに最小限の変更を加えて，０．２μｍｏｌスケールでの合成を行い得る。２’−Ｏ−メチル残基の各連結サイクルにて，ポリマー結合５’−ヒドロキシルに関して３３倍過剰量の２’−Ｏ−メチルホスホロアミダイト（０．１１Ｍの６０μＬ＝６．６μｍｏｌ），及び７５倍過剰量のＳ−エチルテトラゾール（０．２５Ｍの６０μＬ＝１５μｍｏｌ）を使用し，デオキシ残基の各連結サイクルにて，ポリマー結合５’−ヒドロキシルに関して７５倍過剰量のＳ−エチルテトラゾール（０．２５Ｍの６０μＬ＝１０μｍｏｌ）を使用し得る。リボ残基の各連結サイクルにて，ポリマー結合５’−ヒドロキシルに関して６６倍過剰量（０．１１Ｍの１２０μＬ＝１３．２μｍｏｌ）のアルキルシリル（リボ）保護ホスホロアミダイト，及び１５０倍過剰量のＳ−エチルテトラゾール（０．２５Ｍの１２０μＬ＝３０μｍｏｌ）を使用し得る。トリチル断片の比色定量で測定される３９４ＡｐｐｌｉｅｄＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．製の合成機上での平均連結収率は，一般に９７．５〜９９％である。３９４ＡｐｐｌｉｅｄＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．合成機のための他のオリゴヌクレオチド合成試薬は，以下のものを含む：脱トリチル化溶液は，塩化メチレン（ＡＢＩ）中３％ＴＣＡ，キャッピングはＴＨＦ（ＡＢＩ）中１６％Ｎ−メチルイミダゾール，及びＴＨＦ（ＡＢＩ）中１０％無水酢酸／１０％２，６−ルチジンにより行われ，酸化溶液は，ＴＨＦ中１６．９ｍＭＩ２，４９ｍＭピリジン，９％水である（ＰｅｒＳｅｐｔｉｖｅＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．）。Ｂｕｒｄｉｃｋ＆ＪａｃｋｓｏｎＳｙｎｔｈｅｓｉｓＧｒａｄｅのアセトニトリルは，試薬瓶から直接使用される。Ｓ−エチルテトラゾール溶液（０．２５Ｍ，アセトニトリル中）は，ＡｍｅｒｉｃａｎＩｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌＣｈｅｍｉｃａｌ，Ｉｎｃ．から入手した固体から作成される。代替的に，ホスホロチオエート結合の導入には，Ｂｅａｕｃａｇｅ試薬（３Ｈ−１，２−ベンゾジチオール−３−オン１，１−二酸化物，０．０５Ｍ，アセトニトリル中）が使用される。

ＲＮＡの脱保護は，ツーポット又はワンポットプロトコルのいずれかを用いて行われる。ツーポットプロトコルでは，ポリマー結合トリチル−オンオリゴリボヌクレオチドを４ｍＬねじ蓋付きガラス瓶に移し，６５℃で１０分間，４０％のメチルアミン水溶液（１ｍＬ）中に懸濁させる。−２０℃に冷却した後，ポリマー支持体から上澄み液を除去する。支持体を１．０ｍＬのＥｔＯＨ：ＭｅＣＮ：Ｈ２０／３：１：１で３回洗浄し，渦状に攪拌した後，上澄み液を第一の上澄み液に加える。一緒にしたオリゴリボヌクレオチドを含んだ上澄み液を乾燥して，白色粉末を得る。塩基脱保護オリゴリボヌクレオチドを，無水ＴＥＡ／ＨＦ／ＮＭＰ溶液（３００μＬの１．５ｍＬＮ−メチルピロリジノン，７５０μＬＴＥＡ及び１ｍＬＴＥＡ・３ＨＦの溶液で，１．４ＭＨＦ濃度を与える）中に再懸濁させ，６５℃に加熱する。１．５時間後，オリゴマーを１．５ＭＮＨ４ＨＣＯ３でクエンチする。

代替的に，ワンポットプロトコルでは，ポリマー結合トリチル−オンオリゴリボヌクレオチドを４ｍＬねじ蓋付きガラス瓶に移し，６５℃で１５分間，３３％のメチルアミン／ＤＭＳＯ：１／１（０．８ｍＬ）のエタノール溶液中に懸濁させる。ガラス瓶を室温にして，ＴＥＡ・３ＨＦ（０．１ｍＬ）を加え，ガラス瓶を６５℃で１５分間加熱する。サンプルを−２０℃で冷却し，その後１．５ＭＮＨ₄ＨＣＯ₃でクエンチする。

トリチル−オンオリゴマーの精製の際には，クエンチされたＮＨ₄ＨＣＯ₃溶液を，アセトニトリルと，次いで５０ｍＭＴＥＡＡとで予め洗浄されたＣ−１８含有カートリッジ上に充填する。充填カートリッジを水で洗浄した後，ＲＮＡを０．５％ＴＦＡで１３分間，脱トリチル化する。次にカートリッジを水で再び洗浄し，１ＭＮａＣｌで塩交換し，再び水で洗浄する。次にオリゴヌクレオチドを３０％アセトニトリルで溶出する。

ステップごとの平均結合率は，一般に＞９８％である（Ｗｉｎｃｏｔｔ等，１９９５ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓＲｅｓ．２３，２６７７−２６８４）。当業者は，合成の規模は，９６ウエルフォーマットを含むが，それに限定されない上記した例よりも大きい，又は小さい規模に適合し得ることを理解するであろう。

代替的に，本発明の核酸分子は，別々に合成され，合成後に，例えばライゲーションにより（Ｍｏｏｒｅ等，１９９２，Ｓｃｉｅｎｃｅ２５６，９９２３，Ｄｒａｐｅｒ等，国際特許出願公開第ＷＯ９３／２３５６９，Ｓｈａｂａｒｏｖａ等，１９９１，ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓＲｅｓｅａｒｃｈ１９，４２４７，Ｂｅｌｌｏｎ等，１９９７，ヌクレオシド＆ヌクレオチド，１６，９５１，Ｂｅｌｌｏｎ等，１９９７，ＢｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅＣｈｅｍ８，２０４），又は合成及び／又は脱保護後のハイブリダイズにより互いに連結され得る。

本発明のｓｉＮＡ分子はまた，本明細書で実施例１に記載するように，タンデム合成の方法体系により合成され得る。ここで両方のｓｉＮＡ鎖は，切断可能なリンカーによって分離された一個の連続したオリゴヌクレオチド断片，又は鎖として合成され，これは続いて切断されて，ｓｉＮＡ二重鎖をハイブリダイズして精製し得る別個のｓｉＮＡ断片又は鎖を提供する。リンカーは，ポリヌクレオチドリンカー又は非ヌクレオチドリンカーであり得る。本明細書に記載されるように，ｓｉＮＡのタンデム合成は，９６ウエルのようなマルチウエル／マルチプレート合成プラットフォーム，又は同様の，より大きいマルチウエルプラットフォームの両方に容易に適合し得る。本明細書に記載されるようなｓｉＮＡのタンデム合成は，回分式反応器，合成カラム，及び同様物を使用した大規模合成プラットフォームにも容易に適合し得る。

ｓｉＮＡ分子は，二つの別個の核酸鎖又は断片からも組立てられ得，ここで一つの断片はセンス領域を含み，第二の断片はＲＮＡ分子のアンチセンス領域を含む。

本発明の核酸分子は，例えば２’−アミノ，２’−Ｃ−アリル，２’−フルオロ，２’−Ｏ−メチル，２’−Ｈのようなヌクレアーゼ耐性基を用いて，安定性の向上のために広範囲に修飾され得る（再考には，Ｕｓｍａｎ及びＣｅｄｅｒｇｒｅｎ，１９９２，ＴＩＢＳ１７，３４，Ｕｓｍａｎ等，１９９４，ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓＳｙｍｐ．Ｓｅｒ．３１，１６３を参照）。ｓｉＮＡ構成はゲル電気泳動による一般的方法を用いて精製されるか，又は高速液体クロマトグラフィーによって精製され得（ＨＰＬＣ，全体が本明細書に参照により加入されるＷｉｎｃｏｔｔ等，前出，を参照），水中に再懸濁される。

本発明の別の一局面において，本発明のｓｉＮＡ分子は，ＤＮＡ又はＲＮＡベクター内に挿入された転写単位から発現される。組み替えベクターは，ＤＮＡプラスミド又はウイルスベクターであり得る。ｓｉＮＡ発現ウイルスベクターは，アデノ関連ウイルス，レトロウイルス，アデノウイルス，又はαウイルスを基に構成され得るが，これらに限定されるものではない。ｓｉＮＡ分子を発現可能な組み替えベクターは，本明細書に記載されているように送達され，標的細胞内に存続し得る。代替的に，ウイルスベクターは，ｓｉＮＡ分子の一過性発現に使用され得る。

本発明の核酸分子活性の最適化
修飾（塩基，糖及び／又はホスフェート）による核酸分子化学合成は，血清リボヌクレアーゼによる分解を防止することができ，核酸分子の有効性を増大し得る（例えば，全て本明細書に参照により加入されるＥｃｋｓｔｅｉｎ等，国際特許出願公開第ＷＯ９２／０７０６５号，Ｐｅｒｒａｕｌｔ等，１９９０Ｎａｔｕｒｅ３４４，５６５，Ｐｉｅｋｅｎ等，１９９１，Ｓｃｉｅｎｃｅ２５３，３１４，Ｕｓｍａｎ及びＣｅｄｅｒｇｒｅｎ，１９９２，ＴｒｅｎｄｓｉｎＢｉｏｃｈｅｍ．Ｓｃｉ．１７，３３４，Ｕｓｍａｎ等，国際特許出願公開第ＷＯ９３／１５１８７号，及びＲｏｓｓｉ等，国際特許出願公開第ＷＯ９１／０３１６２号，Ｓｐｒｏａｔ，米国特許第５，３３４，７１１号，Ｇｏｌｄ等，米国特許第６，３００，０７４号，及びＢｕｒｇｉｎ等，前出，を参照）。上記の引用は全て，本明細書に記載された核酸分子の塩基，ホスフェート及び／又は糖部分に行うことができる様々な化学修飾について記載している。細胞内での有効性を増大させる修飾と，オリゴヌクレオチド合成時間の短縮，及び化学的必要条件の縮小のための核酸分子からの塩基の除去が所望されている。

核酸分子内に導入することができ，ヌクレアーゼ安定性及び有効性を有意に増大させる糖，塩基及びホスフェート修飾のいくつかの例の記載が，当該技術分野に存在している。例えば，オリゴヌクレオチドは，例えば２’−アミノ，２’−Ｃ−アリル，２’−フルオロ，２’−Ｏ−メチル，２’−Ｏ−アリル，２’−Ｈ，ヌクレオチド塩基修飾のようなヌクレアーゼ耐性基による修飾により，安定性及び／又は生物学的活性が向上される（再考には，その引用の全てが全体として参照により本明細書に加入されるＵｓｍａｎ及びＣｅｄｅｒｇｒｅｎ，１９９２，ＴＩＢＳ．１７，３４，Ｕｓｍａｎ等，１９９４，ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓＳｙｐ．Ｓｅｒ．３１，１６３，Ｂｕｒｇｉｎ等，１９９６，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，３５，１４０９０を参照）。核酸分子の糖修飾は，数多く記載されている（全て参照により全容が本明細書に加入されるＥｃｋｓｔｅｉｎ等，国際特許出願公開第ＷＯ９２／０７０６５号，Ｐｅｒｒａｕｌｔ等，Ｎａｔｕｒｅ，１９９０，３４４，５６５−５６８，Ｐｉｅｋｅｎ等，Ｓｃｉｅｎｃｅ，１９９１，２５３，３１４−３１７，Ｕｓｍａｎ及びＣｅｄｅｒｇｒｅｎ，ＴｒｅｎｄｓｉｎＢｉｏｃｈｅｍ．Ｓｃｉ．，１９９２，１７，３３４−３３９，Ｕｓｍａｎ等，国際特許出願公開第ＷＯ９３／１５１８７号，Ｓｐｒｏａｔ，米国特許第５，３３４，７１１号及びＢｅｉｇｅｌｍａｎ等，１９９５，ＪＢｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７０，２５７０２，Ｂｅｉｇｅｌｍａｎ等，国際特許出願公開第ＷＯ９７／２６２７０号，Ｂｅｉｇｅｌｍａｎ等，米国特許第５，７１６，８２４号，Ｕｓｍａｎ等，米国特許第５，６２７，０５３号，Ｗｏｏｌｆ等，国際特許出願公開第ＷＯ９８／１３５２６号，Ｔｈｏｍｐｓｏｎ等，１９９８年４月２０日出願の米国特許出願第６０／０８２，４０４号，Ｋａｒｐｅｉｓｋｙ等，１９９８，ＴｅｔｒａｈｅｄｒｏｎＬｅｔｔ．，３９，１１３１，Ｅａｒｎｓｈａｗ及びＧａｉｔ，１９９８，Ｂｉｏｐｏｌｙｍｅｒｓ（ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓＳｃｉｅｎｃｅｓ），４８，３９−５５，Ｖｅｒｍａ及びＥｃｋｓｔｅｉｎ，１９９８，Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，６７，９９−１３４，及びＢｕｒｌｉｎａ等，１９９７，ＢｉｏｏｒｇＭｅｄ．Ｃｈｅｍ．，５，１９９９−２０１０を参照）。これらの刊行物には，触媒作用を変更することなく，糖，塩基及び／又はホスフェート修飾，及び同様物を核酸分子内へ組み込む位置を決定する一般的方法及び戦略が記載されている。これら教示を考察することにより，細胞内でのｓｉＮＡのＲＮＡｉ促進能力が有意に抑制されない限りは，同様の修飾を使用して本発明のｓｉＮＡ核酸分子を修飾することができる。

ホスホロチオエート，ホスホロジチオエート，及び／又は５’−メチルホスホネート結合によるオリゴヌクレオチド，ヌクレオチド間結合の化学修飾が安定性を向上させる一方，過剰な修飾は，毒性，又は活性の減少の原因となり得る。従って，核酸分子をデザインする際，これらヌクレオチド間結合の量は最小にされなければならない。これら結合の集中を低減することにより毒性が低下し，その結果これら分子の有効性，及び特異性が高まる。

活性を保持又は向上させる化学修飾を有する短干渉核酸（ｓｉＮＡ）分子を提供する。このような核酸はまた，一般に非修飾核酸と比較してヌクレアーゼ耐性が高い。従って，インビトロ及び／又はインビボ活性は，さほど低下しないものと想定される。調節が目的の場合，外来的に送達される治療的核酸分子は，標的ＲＮＡの翻訳が，望ましくないタンパク質のレベルを低下させる迄十分に長く調節されるよう，細胞内で安定性を最適に保つ必要がある。この期間は疾患の状態に応じて，数時間から数日間の間で変動する。ＲＮＡ及びＤＮＡの化学合成の改良（Ｗｉｎｃｏｔｔ等，１９９５，ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓＲｅｓ．２３，２６７７，Ｃａｒｕｔｈｅｒｓ等，１９９２，ＭｅｔｈｏｄｓｉｎＥｎｚｙｍｏｌｏｇｙ２１１，３−１９（本明細書に参照により加入される））は，上述したように，ヌクレオチド修飾を導入してヌクレアーゼ安定性を高めたことにより，核酸分子を調節する能力が拡大された。

一実施態様において，本発明の核酸分子は，一つ又はそれ以上の（例，約１，２，３，４，５，６，７，８，９，１０，又はそれ以上）Ｇ−クランプヌクレオチドを含む。Ｇ−クランプヌクレオチドは修飾されたシトシン類似体であり，同修飾により二重鎖内の相補的なグアニンのワトソン・クリック及びフーグスティーン面の両方に水素結合の能力が付与される。例えばＬｉｎ及びＭａｔｔｅｕｃｃｉ，１９９８，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，１２０，８５３１−８５３２を参照されたい。オリゴヌクレオチド内の単一のＧ−クランプ類似体の置換によって，相補的なオリゴヌクレオチドとハイブリダイズした際の，螺旋の熱安定性，及びミスマッチ識別が相当高まり得る。このようなヌクレオチドを本発明の核酸分子に含めることにより，標的核酸，相補的配列，又は鋳型鎖に対する親和力及び特異性の両方が高まる。別の一実施態様において，本発明の核酸分子は，一つ又はそれ以上の（例，約１，２，３，４，５，６，７，８，９，１０，又はそれ以上），ＬＮＡ"固定された核酸"ヌクレオチド，例えば２’，４’−Ｃメチレンビシクロヌクレオチドを含む（例えばＷｅｎｇｅｌ等，国際特許出願公開第ＷＯ００／６６６０４号及びＷＯ９９／１４２２６号を参照のこと）。

別の一実施態様において，本発明は，本発明のｓｉＮＡ分子のコンジュゲート，及び／又は複合体を提供する。このコンジュゲート及び／又は複合体は，ｓｉＮＡ分子の生物系内，例えば細胞内への送達を促進するために使用され得る。本発明にて提供されるこのコンジュゲート及び複合体は，治療的化合物を細胞膜を通して移動させ，薬物動態を変更し，及び／又は本発明の核酸分子の局在性を変更して，治療活性を付与し得る。本発明は，細胞膜を通して分子を送達するための新規なコンジュゲート及び／又は複合体のデザイン及び合成を包含する。同コンジュゲート及び／又は複合体は，小分子，脂質，コレステロール，リン脂質，ヌクレオシド，ヌクレオチド，核酸，抗体，毒素，負荷電ポリマー及び他のポリマー，例えばタンパク質，ペプチド，ホルモン，炭化水素，ポリエチレングリコール，又はポリアミドが含まれるが，これらに限定されるものではない。一般に，記載されている輸送体は，個別的に，又は多成分系の一部として，分解性のリンカーと伴に，又は伴わずに使用されるようデザインされている。これらの化合物は，血清の存在下又は不在下で，異なる組織に由来する多数の細胞タイプ内への本発明の核酸分子の送達及び／又は局在化を改善することが期待される（Ｓｕｌｌｅｎｇｅｒ及びＣｅｃｈ，米国特許第５，８５４，０３８号を参照）。本明細書に記載される分子のコンジュゲートは，生物分解性のリンカー，例えば生物分解性の核酸リンカー分子を介して，生物学的に活性な分子に結合することができる。

用語"生物分解性のリンカー"は，本明細書で使用されるように，生物分解性のリンカーとして，一つの分子を他の一つの分子に接続するように，例えば生物学的に活性な分子を本発明のｓｉＮＡ分子，又は本発明のｓｉＮＡ分子のセンス鎖及びアンチセンス鎖に接続するようにデザインされた核酸，又は非核酸リンカー分子を意味する。生物分解性のリンカーは，その安定性が，例えば特定の組織，又は細胞タイプに送達する等，特定の目的のために調節され得るようデザインされる。核酸ベースの生物分解性のリンカー分子の安定性は，例えばリボヌクレオチド，デオキシリボヌクレオチド，及び化学修飾ヌクレオチド，例えば２’−Ｏ−メチル，２’−フルオロ，２’−アミノ，２’−Ｏ−アミノ，２’−Ｃ−アリル，２’−Ｏ−アリル，及び他の２’−修飾，又は塩基修飾ヌクレオチドの組合せ等の様々な化学構造を使用して調節され得る。生物分解性の核酸リンカー分子は，二量体，三量体，四量体，又はより長い核酸分子，例えば，約２，３，４，５，６，７，８，９，１０，１１，１２，１３，１４，１５，１６，１７，１８，１９，又は２０個のヌクレオチド長のオリゴヌクレオチド，又は例えば，ホスホロアミデート又はホスホジエステル結合のようなリンベースの結合を有する一個のヌクレオチドであり得る。生物分解性の核酸リンカー分子はまた，核酸バックボーン，核酸糖，又は核酸塩基修飾を有してもよい。

用語"生物分解性"は，本明細書で使用されるように，生体系内での例えば酵素的分解又は化学分解のような分解を意味する。

用語"生物学的に活性な分子"は，本明細書で使用されるように，系内で生物学的応答を誘発又は調節し得る化合物又は分子を意味する。本明細書にて想定される生物学的に活性なｓｉＮＡ分子の非限定的な例は，単独で，又は他の分子と組合せて，抗体，コレステロール，ホルモン，抗ウイルス，ペプチド，タンパク質，化学療法薬，小分子，ビタミン，補助因子，ヌクレオシド，ヌクレオチド，オリゴヌクレオチド，酵素性核酸，アンチセンス核酸，三重オリゴヌクレオチド，２，５−Ａキメラ，ｓｉＮＡ，ｄｓＲＮＡ，アロザイム，アプタマー，デコイ及びその類似体のような，治療活性を有する分子を含む。本発明の生物学的に活性な分子はまた，他の生物学的に活性な分子，例えば，脂質及びポリマー，例えばポリアミン，ポリアミド，ポリエチレングリコール及び他のポリエステルの薬物動態及び／又は薬力学を調節することができる分子を含む。

用語"リン脂質"は，本明細書で使用されるように，少なくとも一つのリン基を有する疎水性分子を意味する。例えば，リン脂質は，リン含有基，及び飽和又は不飽和アルキル基を有してもよく，任意にてＯＨ，ＣＯＯＨ，オキソ，アミン，又は置換若しくは非置換アリール基で置換される。

外来的に送達された治療的核酸分子（例，ｓｉＮＡ分子）は，ＲＮＡの逆転写が，ＲＮ転写産物のレベルを低下させる迄十分に長く調節されるよう，細胞内で安定性を最適に保つ。核酸分子は，有効な細胞内治療薬として機能するようヌクレアーゼ耐性を有する。本発明及び当該技術分野に記載される核酸分子の化学合成の改良は，上述したように，ヌクレオチド修飾を導入してヌクレアーゼ安定性を高めたことにより，核酸分子を調節する能力が拡大された。

更に別の一実施態様において，ＲＮＡｉに関与するタンパク質の酵素活性を保持又は高める化学修飾を有するｓｉＮＡ分子を提供する。このような核酸はまた，非修飾核酸と比較してヌクレアーゼ耐性が高い。従って，インビトロ及び／又はインビボにて活性が有意に低下しないものと想定される。

本発明の核酸ベースの分子の使用により，組合せ治療の可能性が得られ，それにより更に治療が向上するものと想定される（例，異なる遺伝子を標的とする多数のｓｉＮＡ分子，周知の小分子モジュレータと結合した核酸分子，又は異なるモチーフ及び／又は他の化学的若しくは生物学的分子等の分子の組合せによる周期性治療）。ｓｉＮＡ分子による被験者の治療にはまた，異なるタイプの核酸分子，例えば酵素的核酸分子（リボザイム），アロザイム，アンチセンス，２，５−Ａオリゴアデニレート，デコイ，及びアプタマーとの組合せ治療も含まれる。

別の一局面において，本発明のｓｉＮＡ分子は，例えばセンスｓｉＮＡ鎖のみ，アンチセンスｓｉＮＡ鎖のみ，又は両方のｓｉＮＡ鎖に，一つ又はそれ以上の５’及び／又は３’−キャップ構造を含む。

"キャップ構造"は，オリゴヌクレオチドのいずれかの末端に組み込まれている化学修飾を意味する（例えば，参照により本明細書に加入されるＡｄａｍｉｃ等，米国特許第５，９９８，２０３号を参照）。これらの末端修飾は，核酸分子をエキソヌクレアーゼ分解から保護し，かつ細胞内で送達及び／又は局在化を補助し得る。キャップは５’−末端（５’−キャップ）又は３’−末端（３’−キャップ）に存在し得るか，又は両方の末端に存在し得る。非限定的な例において，５’−キャップはグリセリル，逆位デオキシ脱塩基残基（部分）４’，５’−メチレンヌクレオチド，１−（β−Ｄ−エリトロフラノシル）ヌクレオチド，４’−チオヌクレオチド，炭素環式ヌクレオチド，１，５−アンヒドロヘキシトールヌクレオチド，Ｌ−ヌクレオチド，α−ヌクレオチド，修飾塩基ヌクレオチド，ホスホロジチオエート結合，トレオ−ペントフラノシルヌクレオチド，非環式３’，４’−セコヌクレオチド，非環式３，４−ジヒドロキシブチルヌクレオチド，非環式３，５−ジヒドロキシペンチルヌクレオチド，３’−３’逆位ヌクレオチド部分，３’−３’逆位脱塩基部分，３’−２’逆位ヌクレオチド部分，３’−２’逆位脱塩基部分，１，４−ブタンジオールホスフェート，３’−ホスホロアミデート，ヘキシルホスフェート，アミノヘキシルホスフェート，３’−ホスフェート，３’−ホスホロチオエート，ホスホロジチオエート，又は架橋又は非架橋メチルホスホネート部分を含むが，これらに限定されるものではない。図１０に，キャップ部分の非限定的な例を示す。

３’−キャップの非限定的な例は，グリセリル，逆位デオキシ脱塩基残基（部分），４’，５’−メチレンヌクレオチド，１−（β−Ｄ−エリトロフラノシル）ヌクレオチド，４’−チオヌクレオチド，炭素環式ヌクレオチド，５’−アミノ−アルキルホスフェート，１，３−ジアミノ−２−プロピルホスフェート，３−アミノプロピルホスフェート，６−アミノヘキシルホスフェート，１，２−アミノドデシルホスフェート，ヒドロキシプロピルホスフェート，１，５−アンヒドロヘキシトールヌクレオチド，Ｌ−ヌクレオチド，α−ヌクレオチド，修飾塩基ヌクレオチド，ホスホロジチオエート，トレオ−ペントフラノシルヌクレオチド，非環式３’，４’−セコヌクレオチド，３，４−ジヒドロキシブチルヌクレオチド，３，５−ジヒドロキシペンチルヌクレオチド，５’−５’逆位ヌクレオチド部分，５’−５’逆位脱塩基部分，５’−ホスホロアミデート，５’−ホスホロチオエート，１，４−ブタンジオールホスフェート，５’−アミノ，架橋及び／又は非架橋５’−ホスホロアミデート，ホスホロチオエート及び／又はホスホロジチオエート，架橋又は非架橋メチルホスホネート及び５’−メルカプト部分を含むが，これらに限定されるものではない（より詳細には，参照により本明細書に加入されるＢｅａｕｃａｇｅ及びＩｙｅｒ，１９９３，Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ４９，１９２５を参照）。

用語"非ヌクレオチド"は，糖及び／又はホスフェート置換を含む，核酸鎖の一つ又はそれ以上のヌクレオチド単位の代わりに組み込まれ，残りの塩基がその酵素活性を示し得る任意の基又は化合物を意味する。その基又は化合物は，例えばアデノシン，グアニン，シトシン，ウラシル又はチミンのような，通常認識されるヌクレオチド塩基を含まず，従って１’−位に塩基が存在しないことから脱塩基である。

"アルキル"基は，飽和脂肪族炭素水素を指し，直鎖，分岐鎖，及び環式アルキル基を含む。好ましくは，アルキル基は１〜１２個の炭素を有する。より好ましくは，アルキルは１〜７個の炭素，更に好ましくは１〜４個の炭素を有する低級アルキルである。アルキル基は，置換されても又は置換されていなくてもよい。置換されている場合，置換基（一つ又は複数）は，好ましくはヒドロキシル，シアノ，アルコキシ，＝Ｏ，＝Ｓ，ＮＯ₂又はＮ（ＣＨ₃）₂，−アミノ，又はＳＨである。本用語はまた，少なくとも一つの炭素−炭素二重結合が含まれる不飽和炭素水素基である，直鎖，分岐鎖，及び環式基を含むアルケニル基も含む。好ましくは，アルケニル基は１〜１２個の炭素を有する。より好ましくは，アルケニルは１〜７個の炭素，更に好ましくは１〜４個の炭素を有する低級アルケニルである。アルケニル基は，置換されても又は非置換されていなくてもよい。置換されている場合，置換基（一つ又は複数）は，好ましくはヒドロキシル，シアノ，アルコキシ，＝Ｏ，＝Ｓ，ＮＯ₂，ハロゲン，Ｎ（ＣＨ₃）₂，−アミノ，又はＳＨである。用語"アルキル"はまた，少なくとも一つの炭素−炭素三重結合が含まれる不飽和炭化水素基である，直鎖，分岐鎖，及び環式基を含むアルキニル基も含む。好ましくは，アルキニル基は１〜１２個の炭素を有する。より好ましくは，１〜７個の炭素，更に好ましくはアルキニルは１〜４個の炭素を有する低級アルキニルである。アルキニル基は，置換されても又は置換されていなくてもよい。置換されている場合，置換基（一つ又は複数）は，好ましくはヒドロキシル，シアノ，アルコキシ，＝Ｏ，＝Ｓ，ＮＯ₂若しくはＮ（ＣＨ₃）₂，−アミノ又はＳＨである。

このようなアルキル基は，アリール，アルキルアリール，炭素環式アリール，複素環式アリール，アミド，及びエステル基を含み得る。"アリール"基は，共役したπ電子系を含む少なくとも一つの環を有する芳香族基を指し，炭素環式アリール，複素環式アリール及びビアリール基を含む。これら全ては，任意にて置換されてもよい。アリール基の好ましい置換基（一つ又は複数）は，ハロゲン，トリハロメチル，ヒドロキシル，ＳＨ，ＯＨ，シアノ，アルコキシ，アルキル，アルケニル，アルキニル，及びアミノ基を含む。"アルキルアリール"基は，（上述したような）アリール基に共有結合した（上述したような）アルキル基を指す。炭素環式アリール基は，芳香環上の環原子が全て炭素原子の基である。炭素原子は，任意にて置換されてもよい。複素環式アリール基は，芳香環内に環原子として１〜３個のヘテロ原子を含み，かつ残りの環原子が炭素原子の基である。適切なヘテロ原子には酸素，硫黄，及び窒素が含まれ，また複素環式アリール基には，フラニル，チエニル，ピリジル，ピロリル，Ｎ−低級アルキルピロロ，ピリミジル，ピラジニル，イミダゾリル及び同様物が含まれ，全て任意にて置換されてもよい。"アミド"は−Ｃ（Ｏ）−ＮＨ−Ｒを指し，ここでＲは，アルキルアリール，アルキルアリール又は水素のいずれかである。"エステル"は−Ｃ（Ｏ）−ＯＲ’を指し，ここでＲは，アルキルアリール，アルキルアリール又は水素のいずれかである。

本明細書で使用されるように，"ヌクレオチド"は，当該技術分野では天然塩基（標準），及び周知の修飾塩基を含むと理解されている。このような塩基は，通常，ヌクレオチドの糖部分の１’位に位置する。ヌクレオチドは，通常，塩基，糖及びリン酸基を含む。ヌクレオチドは糖，ホスフェート及び／又は塩基部分が修飾されていても，又はいなくてもよい（これらは交換可能に，ヌクレオチド類似体，修飾ヌクレオチド，非天然ヌクレオチド，非標準ヌクレオチド及びその他とも称される。例えば，全て本明細書に参照により加入されるＵｓｍａｎ及びＭｃＳｗｉｇｇｅｎ，前出，Ｅｃｋｓｔｅｉｎ等，国際特許出願公開第ＷＯ９２／０７０６５号，Ｕｓｍａｎ等，国際特許出願公開第ＷＯ９３／１５１８７号，Ｕｈｌｍａｎ＆Ｐｅｙｍａｎ，前出を参照されたい）。修飾核酸塩基には，Ｌｉｍｂａｃｈ等，１９９４，ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓＲｅｓ．２２，２１８３に要約されているように，公知の数個の例が存在する。核酸分子内に導入され得る塩基修飾の非限定的な数個の例は，イノシン，プリン，ピリジン−４−オン，ピリジン−２−オン，フェニル，シュードウラシル，２，４，６−トリメトキシベンゼン，３−メチルウラシル，ジヒドロウリジン，ナフチル，アミノフェニル，５−アルキルシチジン（例，５−メチルシチジン），５−アルキルウリジン（例，リボチミジン），５−ハロウリジン（例，５−ブロモウリジン）又は６−アザピリミジン若しくは６−アルキルピリミジン（例，６−メチルウリジン），プロピン，及び他を含む（Ｂｕｒｇｉｎ等，１９９６，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，３５，１４０９０，Ｕｈｌｍａｎ＆Ｐｅｙｍａｎ，前出）。本局面において"修飾塩基"は，１’位に存在するアデニン，グアニン，シトシン及びウラシル以外のヌクレオチド塩基，又はその等価物を意味する。

一実施態様において，本発明は，一つ又はそれ以上のホスホロチオエート，ホスホロジチオエート，メチルホスホネート，リン酸トリエステル，モルフォリノ，カルバミン酸アミド，カルボキシメチル，アセトアミデート，ポリアミド，ススフォネート，スルホンアミド，スルファメート，ホルムアセタール，チオホルムアセタール，及び／又はアルキルシリル置換を含むホスフェートバックボーン修飾を有する修飾ｉＮＡ分子に関する。オリゴヌクレオチドバックボーン修飾の再考には，Ｈｕｎｚｉｋｅｒ及びＬｅｕｍａｎｎ，１９９５，ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓＡｎａｌｏｇｕｅｓ：ＳｙｎｔｈｅｓｉｓａｎｄＰｒｏｐｅｒｔｉｅｓ，ｉｎＭｏｄｅｒｎＳｙｎｔｈｅｔｉｃＭｅｔｈｏｄｓ，ＶＣＨ，３３１−４１７，及びＭｅｓｍａｅｋｅｒ等，１９９４，ＮｏｖｅｌＢａｃｋｂｏｎｅＲｅｐｌａｃｅｍｅｎｔｓｆｏｒＯｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ，ｉｎＣａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅＭｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎｓｉｎＡｎｔｉｓｅｎｓｅＲｅｓｅａｒｃｈ，ＡＣＳ，２４−３９を参照されたい。

"脱塩基"は，１’位に塩基を欠いた，又は塩基の代わりに他の化学基を有する糖部分を意味する。例えばＡｄａｍｉｃ等，米国特許第５，９９８，２０３号を参照されたい。

"非修飾ヌクレオシド"は，β−Ｄ−リボフラノースの１’炭素に結合したアデニン，シトシン，グアニン，チミン，又はウラシルのいずれかの塩基を意味する。

"修飾ヌクレオシド"は，非修飾ヌクレオチドの塩基，糖及び／又はホスフェートの化学構造において修飾を含む，任意のヌクレオチド塩基を意味する。修飾ヌクレオチドの非限定的な例は，式Ｉ〜ＶＩＩ，及び／又は本明細書に記載される他の修飾で示される。

本発明に記載されているような２’−修飾ヌクレオチドと関連して，"アミノ"は，修飾されていても，又は修飾されていなくてもよい２’−ＮＨ₂又は２’−Ｏ−ＮＨ₂を意味する。このような修飾基は，例えば，Ｅｃｋｓｔｅｉｎ等，米国特許第５，６７２，６９５号，及びＭａｔｕｌｉｃ−Ａｄａｍｉｃ等，米国特許第６，２４８，８７８号に記載されており，これら双方はその全容が参照により本明細書に加入される。

核酸ｓｉＮＡ構造に様々な修飾を行って，それらの分子の有用性を高めることができる。そのような修飾は，有効期間，インビトロ半減期，安定性，及び標的部位へのそのようなオリゴヌクレオチドの導入の容易性，例えば細胞膜の貫通性を高め，標的細胞に対する認識及び結合能力を付与する。

核酸分子の投与
本発明のｓｉＮＡ分子は，単独で，又は他の治療と組合せて，毛の成長を防止，抑制，又は低下させ，除毛（脱毛）のため，及び／又は脱毛症及び無毛症，及び／又は細胞又は組織内のＨａｉｒｌｅｓｓ（ＨＲ）レベルに関連した，又はそれに応じた任意の他の形質，疾患又は病状の予防若しくは治療に使用されるよう適合され得る。一実施態様において，本発明のｓｉＮＡ分子及び製剤又は組成物は，周知のように，真皮又は濾胞に対して直接又は局所的に投与される（例，局所投与）。（例えばＢｒａｎｄ，２００１，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．，３，２４４−８，Ｒｅｇｎｉｅｒ等，１９９８，Ｊ．ＤｒｕｇＴａｒｇｅｔ，５，２７５−８９，Ｋａｎｉｋｋａｎｎａｎ，２００２，ＢｉｏＤｒｕｇｓ，１６，３３９−４７，Ｗｒａｉｇｈｔ等，２００１，Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｔｈｅｒ．，９０，８９−１０４，並びにＰｒｅａｔ及びＤｕｊａｒｄｉｎ，２００１，ＳＴＰＰｈａｒｍａＳｃｉｅｎｃｅｓ，１１，５７−６８を参照のこと）。

例えば，ｓｉＮＡ分子は，被験者に投与されるためのリポソームを含む送達ビヒクル，担体及び希釈剤並びにそれらの塩を包含し，及び／又は，薬剤的に許容される製剤中に存在し得る。核酸分子の送達方法は，全て本明細書に参照により加入されるＡｋｈｔａｒ等，１９９２，ＴｒｅｎｄｓＣｅｌｌＢｉｏ．，２，１３９，ＤｅｌｉｖｅｒｙＳｔｒａｔｅｇｉｅｓｆｏｒＡｎｔｉｓｅｎｓｅＯｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅＴｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ，ｅｄ．Ａｋｈｔａｒ，１９９５，Ｍａｕｒｅｒ等，１９９９，Ｍｏｌ．Ｍｅｍｂｒ．Ｂｉｏｌ．，１６，１２９−１４０，Ｈｏｆｌａｎｄ及びＨｕａｎｇ，１９９９，Ｈａｎｄｂ．Ｅｘｐ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．，１３７，１６５−１９２，及びＬｅｅ等，２０００，ＡＣＳＳｙｍｐ．Ｓｅｒ．，７５２，１８４−１９２に記載されている。Ｂｅｉｇｅｌｍａｎ等，米国特許第６，３９５，７１３号，及びＳｕｌｌｉｖａｎ等，国際特許出願公開第ＷＯ９４／０２５９５号には更に，核酸分子の一般的な送達方法が記載されている。これらのプロトコルは，事実上，任意の核酸分子の送達に使用され得る。核酸分子は，リポソーム内封入，イオン導入法，又は生物分解性のポリマー，ヒドロゲル，シクロデキストリン（例えばＧｏｎｚａｌｅｚ等，１９９９，ＢｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅＣｈｅｍ．，１０，１０６８−１０７４，Ｗａｎｇ等，国際特許出願公開第ＷＯ０３／４７５１８号及びＷＯ０３／４６１８５号を参照），ポリ（乳酸−コ−グリコール酸）（ＰＬＧＡ）及びＰＬＣＡ微小球（例えば米国特許第６，４４７，７９６号，及び米国特許出願公開第ＵＳ２００２１３０４３０号を参照），生物分解性ナノカプセル，及び生物接着性微小球のような他のビヒクル中への組み込み，又はタンパク質性ベクターの使用（Ｏ’Ｈａｒｅ及びＮｏｒｍａｎｄ，国際特許出願公開第ＷＯ００／５３７２２号）を含むが，これらに限定されない公知の多様な方法によって，細胞に投与することができる。別の一実施態様において，本発明の核酸分子はまた，ポリエチレンイミン及びその誘導体，例えばポリエチレンイミン−ポリエチレングリコール−Ｎ−アセチルガラクトサミン（ＰＥＩ−ＰＥＧ−ＧＡＬ）又はポリエチレンイミン−ポリエチレングリコールトリ−Ｎ−アセチルガラクトサミン（ＰＥＩ−ＰＥＧ−トリＧＡＬ）誘導体と共に調製されるか，又複合体に形成され得る。

一実施態様において，本発明の核酸分子は，その全容が参照により本明細書に加入される米国特許出願公開第２００３００７７８２９号に記載されているように調製される。一実施態様において，かように調製されたｓｉＮＡ分子は，本発明のｓｉＮＡ分子を毛嚢細胞に送達するために使用される。

一実施態様において，本発明のｓｉＮＡ分子は，図面を含めその全容が参照により本明細書に加入される米国特許出願公開第２００１０００７６６６号に記載されているような膜破壊剤と複合体を形成する。別の一実施態様において膜破壊剤（一つ又は複数），及びｓｉＮＡ分子はまた，図面を含めその全容が参照により本明細書に加入される米国特許第６，２３５，３１０号に記載されている脂質のような，カチオン性脂質又はヘルパー脂質分子と複合体を形成する。

一実施態様において，本発明のｓｉＮＡ分子は，全て図面を含めその全容が参照により本明細書に加入される米国特許出願公開第２００３０７７８２９号，並びに国際特許出願公開第ＷＯ００／０３６８３号及びＷＯ０２／０８７５４１号に記載されている送達システムと複合体を形成する。

一実施態様において，本発明の送達システムには，例えば水性及び非水性のジェル，クリーム，マルチプルエマルジョン，マイクロエマルジョン，リポソーム，軟膏，水溶液及び非水性溶液，ローション，エアロゾル，炭素水素ベース及び粉末が含まれ，また可溶化剤，浸透促進剤（例，脂肪酸，脂肪酸エステル，脂肪アルコール及びアミノ酸），及び親水性ポリマー（例，ポリカルボフィル及びポリビニルピロリドン）のような賦形剤を含有してもよい。一実施態様において，薬剤的に許容される担体は，リポソーム又は経皮送達促進剤（ｔｒａｎｓｄｅｒｍａｌｅｎｈａｎｃｅｒ）である。本発明で使用され得るリポソームの例は，以下を含む。（１）ＣｅｌｌＦｅｃｔｉｎ，カチオン性脂質Ｎ，ＮＩ，ＮＩＩ，ＮＩＩＩ−テトラメチル−Ｎ，ＮＩ，ＮＩＩ，ＮＩＩＩ−テトラパルミト−ワイ−スペルミン及びジオレイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＯＰＥ）（ＧＩＢＣＯＢＲＬ）の１：１．５（Ｍ／Ｍ）リポソーム製剤，（２）ＣｙｔｏｆｅｃｔｉｎＧＳＶ，カチオン性脂質及びＤＯＰＥ（ＧｌｅｎＲｅｓｅａｒｃｈ）の２：１（Ｍ／Ｍ）リポソーム製剤，（３）ＤＯＴＡＰ，Ｎ−［１−（２，３−ジオレオイルオキシ）−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリ−メチル−アンモニウムメチルスルフェート（ＢｏｅｈｒｉｎｇｅｒＭａｎｈｅｉｍ），並びに（４）Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ，ポリカチオン性脂質ＤＯＳＰＡ及び中性脂質ＤＯＰＥ（ＧＩＢＣＯＢＲＬ）の３：１（Ｍ／Ｍ）リポソーム製剤。

一実施態様において，本発明の送達システムには，パッチ，錠剤，坐剤，膣坐剤，ジェル及びクリームが含まれ，また可溶化剤及び賦活剤（例，プロピレングリコール，胆汁酸塩，及びアミノ酸）等の賦形剤，並びに他のビヒクル（例，ポリエチレングリコール，脂肪酸エステル及びその誘導体，ヒドロキシプロピルメチルセルロース及びヒアルロン酸等の親水性ポリマー）を含有してもよい。

一実施態様において，本発明のｓｉＮＡ分子は，ポリエチレンイミン（例，線状又は分岐ＰＥＩ）及び／又はポリエチレンイミン誘導体，例えばガラクトースＰＥＩ，コレステロールＰＥＩ，抗体誘導ＰＥＩ，及びポリエチレングリコールＰＥＩ（ＰＥＧ−ＰＥＩ）誘導体のようなグラフトＰＥＩ（ｇｒａｆｔｅｄＰＥＩ）と共に調製されるか，又は複合体を形成する（例えば本明細書に参照により加入されるＯｇｒｉｓ等，２００１，ＡＡＰＡＰｈａｒｍＳｃｉ，３，１−１１，Ｆｕｒｇｅｓｏｎ等，２００３，ＢｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅＣｈｅｍ．，１４，８４０−８４７，Ｋｕｎａｔｈ等，２００２，ＰｈｒａｍａｃｅｕｔｉｃａｌＲｅｓｅａｒｃｈ，１９，８１０−８１７，Ｃｈｏｉ等，２００１，Ｂｕｌｌ．ＫｏｒｅａｎＣｈｅｍ．Ｓｏｃ．，２２，４６−５２，Ｂｅｔｔｉｎｇｅｒ等，１９９９，ＢｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅＣｈｅｍ．，１０，５５８−５６１，Ｐｅｔｅｒｓｏｎ等，２００２，ＢｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅＣｈｅｍ．，１３，８４５−８５４，Ｅｒｂａｃｈｅｒ等，１９９９，ＪｏｕｒｎａｌｏｆＧｅｎｅＭｅｄｉｃｉｎｅＰｒｅｐｒｉｎｔ，１，１−１８，Ｇｏｄｂｅｙ等，１９９９，ＰＮＡＳＵＳＡ，９６，５１７７−５１８１，Ｇｏｄｂｅｙ等，１９９９，ＪｏｕｒｎａｌｏｆＣｏｎｔｒｏｌｌｅｄＲｅｌｅａｓｅ，６０，１４９−１６０，Ｄｉｅｂｏｌｄ等，１９９９，ＪｏｕｒｎａｌｏｆＢｉｏｌｏｇｉｃａｌＣｈｅｍｉｓｔｒｙ，２７４，１９０８７−１９０９４，Ｔｈｏｍａｓ及びＫｌｉｂａｎｏｖ，２００２，ＰＮＡＳＵＳＡ，９９，１４６４０−１４６４５，及びＳａｇａｒａ，米国特許第ＵＳ６，５８６，５２４号を参照）。

一実施態様において，本発明のｓｉＮＡ分子は，例えば全て本明細書に参照により加入されるＶａｒｇｅｅｓｅ等，２００３年４月出願の米国特許出願第１０／４２７，１６０号，米国特許第６，５２８，６３１号，米国特許第６，３３５，４３４号，米国特許第６，２３５，８８６号，米国特許第６，１５３，７３７号，米国特許第５，２１４，１３６号，米国特許第５，１３８，０４５号に記載されている核酸コンジュゲートのようなバイオコンジュゲートを含む。

従って，本発明は，例えば安定剤，緩衝剤，及び同様物のような許容される担体中に，一つ又はそれ以上の本発明の核酸を含む薬剤組成物に関する。本発明のポリヌクレオチドは，投与可能であり（例，ＲＮＡ，ＤＮＡまたはタンパク質），任意の標準的手段を用いて，薬剤組成物を形成するための安定剤，緩衝剤，及び同様物と伴に，又は伴わずに，被験者に導入される。リポソーム送達機構の使用が所望される場合，リポソーム形成のための標準プロトコルに従い得る。本発明の組成物は，調剤されてクリーム，ジェル，スプレー，オイル，又は局所，皮膚，若しくは経皮投与に適切な他の組成物として使用され得る。

本発明は，本明細書に記載されている化合物の薬剤的に許容される製剤も含む。それらの製剤は，上記の化合物の塩，例えば，塩酸塩，臭化水素酸塩，酢酸塩，及びベンゼンスルホン酸塩のような酸付加塩を含む。

薬理学的組成物，又は製剤とは，例えば細胞，又はヒト等の被験者内への，全身又は局所投与のような投与に適した形態の組成物，又は製剤を意味する。適切な形態は，一部には，用法，又は例えば経口，経皮，若しくは注入等，入り込む際の経路に依存する。これらの形態は，組成物又は製剤の標的細胞への到達を妨げるものであってはならない（即ち，ある細胞への送達には，負荷電の核酸が望ましい）。例えば，血流内に注入される薬理学的組成物は，可溶性である必要がある。他の要素も周知であり，それには例えば毒性や，組成物又は製剤がその有効性を発揮することを妨げる形態等の考察が含まれる。

一実施態様において，本発明のｓｉＮＡ分子は，薬剤的に許容される組成物又は製剤による全身投与によって，被験者に投与される。"全身投与"とは，インビボでの薬物の血流内への全身性吸収，又は蓄積と，続く全身への分配を意味する。全身性吸収へ誘導される投与経路は，静脈内，皮下，腹膜内，吸入，経口，肺内及び筋内を含むが，これらに限定されるものではない。これら各投与経路は，本発明のｓｉＮＡ分子を接近可能な疾患組織に暴露する。循環内へ薬物が入り込む割合は，分子量又は分子サイズの関数であることが証明されている。本発明の化合物を含むリポソーム又は他の薬物担体を使用することによって，薬物を潜在的に，例えば細網内皮系組織（ＲＥＳ）のような所定の組織タイプ等に局在化することができる。薬物の細胞表面に対する結合を促進し得るリポソーム製剤，例えばリンパ球及びマクロファージのようなもまた有用である。このアプローチによって，異常細胞のマクロファージ及びリンパ球免疫認識の特異性を利用することにより，薬物の標的細胞への送達を向上させることができる。

"薬剤的に許容される製剤"，又は"薬剤的に許容される組成物"は，本発明の核酸分子を，それらの所望の活性に最も適切な物理的位置へ有効に分配することができる組成物又は製剤を意味する。本発明の核酸分子と適切な製剤を形成する薬剤の非限定的な例は，Ｐ−グリコタンパク質抑制剤（例えばＰｌｕｒｏｎｉｃＰ８５），生物分解性ポリマー，例えば持続放出送達のためのポリ（ＤＬ−ラクチド−コグリコリド）微小球（Ｅｍｅｒｉｃｈ，ＤＦ等，１９９９，ＣｅｌｌＴｒａｎｓｐｌａｎｔ，８，４７−５８），及び例えばポリブチルシアノアクリレート製の充填ナノ粒子を含む。本発明の核酸分子の他の非限定的な送達戦略は，Ｂｏａｄｏ等，１９９８，Ｊ．Ｐｈａｒｍ．Ｓｃｉ．，８７，１３０８−１３１５，Ｔｙｌｅｒ等，１９９９，ＦＥＢＳＬｅｔｔ．，４２１，２８０−２８４，Ｐａｒｄｒｉｄｇｅ等，１９９５，ＰＮＡＳＵＳＡ．，９２，５５９２−５５９６，Ｂｏａｄｏ，１９９５，Ａｄｖ．ＤｒｕｇＤｅｌｉｖｅｒｙＲｅｖ．，１５，７３−１０７，Ａｌｄｒｉａｎ−Ｈｅｒｒａｄａ等，１９９８，ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓＲｅｓ．，２６，４９１０−４９１６，及びＴｙｌｅｒ等，１９９９，ＰＮＡＳＵＳＡ．，９６，７０５３−７０５８に記載されている材料を含む。

本発明はまた，ポリ（エチレングリコール）脂質を含んだ表面修飾リポソーム（ＰＥＧ−修飾，又は長時間循環リポソーム，即ちステルスリポソーム）と，本発明の核酸分子とを含む組成物の使用にも関する。これらの製剤は標的組織内の薬物（例，ｓｉＮＡ）の蓄積を増大させるための方法を提供する。薬物担体のこのクラスは，オプソニン化，及び単核食細胞系（ＭＰＳ又はＲＥＳ）による除去に抵抗することによって，血液循環時間をより長くし，またカプセル化薬物の組織暴露を高めることができる。（Ｌａｓｉｃ等，Ｃｈｅｍ．Ｒｅｖ．１９９５，９５，２６０１−２６２７，Ｉｓｈｉｗａｔａ等，Ｃｈｅｍ．Ｐｈａｒｍ．Ｂｕｌｌ．１９９５，４３，１００５−１０１１）。このようなリポソームは，おそらく血管外遊出，及び新生血管標的組織内への捕獲によって，腫瘍内に選択的に蓄積されることが証明されている（Ｌａｓｉｃ等，Ｓｃｉｅｎｃｅ１９９５，２６７，１２７５−１２７６，Ｏｋｕ等，１９９５，Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ，１２３８，８６−９０）。長時間循環リポソームは，特にＭＰＳの組織内に蓄積することで知られる従来のカチオン性リポソームと比較して，ＤＮＡ及びＲＮＡの薬物動態及び薬力学を高める（Ｌｉｕ等，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．１９９５，４２，２４８６４−２４８７０，Ｃｈｏｉ等，国際特許出願公開第ＷＯ９６／１０３９１号，Ａｎｓｅｌｌ等，国際特許出願公開第ＷＯ９６／１０３９０号，Ｈｏｌｌａｎｄ等，国際特許出願公開第ＷＯ９６／１０３９２号）。長時間循環リポソームは，たとえば肝臓及び秘蔵のような代謝の激しいＭＰＳ組織内の蓄積を避ける能力により，カチオン性リポソームと比較して，薬物をヌクレアーゼ分解から相当保護するものと思われる。

本発明はまた，薬剤的に許容される担体又は希釈剤中に薬剤的有効量の所望の化合物を含む，保管又は投与のために調製された組成物を含む。治療的使用のための許容される担体又は希釈剤は，薬学にて周知であり，例えば参照により本明細書に加入されるＲｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓＰｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌＳｃｉｅｎｃｅｓ，ＭａｃｋＰｕｂｌｉｓｈｉｎｇＣｏ．（Ａ．Ｒ．Ｇｅｎｎａｒｏｅｄｉｔ．１９８５）に記載されている。例えば，保存料，安定剤，色素及び矯味矯臭剤を挙げることができる。それらには，安息香酸ナトリウム，ソルビン酸，及びｐ−ヒドロキシ安息香酸のエステルが含まれる。加えて，酸化防止剤及び懸濁剤を使用することができる。

薬剤的有効用量とは，疾患状態の予防，発症の抑制，又は治療（好ましくは全症状の，ある程度の緩和）に必要な用量である。薬剤的有効用量は，疾患の種類，使用する組成物，投与経路，治療される哺乳類の種類，考慮されている特定の哺乳類の物理的特徴，併用薬，及び当業者が認識し得る他の因子に依存する。一般に，負荷電ポリマーの有効性に応じて，体重１ｋｇあたり０．１ｍｇ／ｋｇ〜１００ｍｇ／日の量の活性成分が投与される。

本発明の核酸分子及びその製剤は，従来の薬剤的に許容される非毒性の担体，補助剤及び／又はビヒクルを含有する単位用量製剤にて，経口で，局所的に，非経口で，吸入若しくはスプレーにより，又は直腸経由で投与され得る。本明細書で使用されるように，用語非経口は，経皮，皮下，血管内（例，静脈内），筋内，又は鞘内注入手法，及び同様物を含む。加えて，本発明の核酸分子，及び薬剤的に許容される担体を含有する薬物製剤を提供する。一種又はそれ以上の本発明の核酸分子が，一種又はそれ以上の薬剤的に許容される非毒性の担体及び／又は希釈剤及び／又は補助剤，及び所望により他の活性成分と共に存在し得る。本発明の核酸分子を含有する薬剤組成物は，例えば，錠剤，トローチ，ロゼンジ，水性若しくは油性懸濁液，分散可能な粉末若しくは顆粒，エマルジョン，硬質若しくは軟質カプセル，又はシロップ若しくはエリキシルのような経口使用に適切な形態であり得る。

経口使用が意図される組成物は，薬剤組成物の製造にて周知の任意の方法に従って製造することができ，またそのような組成物は，一種又はそれ以上の甘味剤，矯味矯臭剤，着色剤又は保存料を含有して，薬剤的に洗練した及び味のよい調剤を提供し得る。錠剤は，錠剤の製造に適切な薬剤的に許容される非毒性の賦形剤との混合物中に，活性成分を含有する。これら賦形剤は，例えば，不活性希釈剤，例えば炭酸カルシウム，炭酸ナトリウム，乳糖，リン酸カルシウム若しくはリン酸ナトリウム，顆粒化剤，及び錠剤崩壊剤，例えば，コーンスターチ，又はアルギン酸，結合剤，例えばデンプン，ゼラチン又はアカシアゴム，及び滑沢剤，例えばステアリン酸マグネシウム，ステアリン酸又はタルクであり得る。錠剤は，コーティングされないか，又は周知の技術でコーティングされ得る。ある場合には，そのようなコーティングは，胃腸管内での崩壊及び吸収遅延させることによって，より長時間に亘る持続作用を得る公知の技術により調製され得る。例えば，モノステアリン酸グリセリル又はステアリン酸グリセリルのような時間遅延材料が使用され得る。

経口使用のための製剤は，硬質のゼラチンカプセルとしても存在し得，ここで活性成分は不活性固体希釈剤，例えば炭酸カルシウム，リン酸カルシウム又はカオリンと混合される。あるいは経口使用のための製剤は，軟質のゼラチンカプセルとしても存在し得，ここで活性成分は，水，又は例えば落花生油，流動パラフィン又はオリーブ油のような油媒体と混合される。

水性懸濁液は，水性懸濁液を製造するに適切な賦形剤との混合物中にて活性物質を含有する。そのような賦形剤は，例えばカルボキシメチルセルロースナトリウム，メチルセルロース，ヒドロプロピル−メチルセルロース，アルギン酸ナトリウム，ポリビニルピロリドン，トラガカントゴム及びアカシアゴムのような懸濁剤，分散剤又は湿潤剤は，天然に存在するリン脂質であり得，例えば，レシチン，又は例えばポリオキシエチレンステアレートのような，アルキレンオキシドと脂肪酸との縮合物，又は例えばヘプタデカエチレンオキシセタノールのような，エチレンオキシドと長鎖脂肪族アルコールとの縮合物，又は例えばモノオレイン酸ポリオキシエチレンソルビトールのような，エチレンオキシドと，脂肪酸及びヘキシトールから誘導された部分エステルとの縮合物，例えばモノオレイン酸ポリエチレンソルビタンのような無水物である。水性懸濁液はまた，一つ又はそれ以上の保存料，例えばエチル，又はｎ−プロピルｐ−ヒドロキシベンゾエート，一種又はそれ以上の着色剤，一種又はそれ以上の矯味矯臭剤，及び例えばショ糖又はサッカリンのような，一種又はそれ以上の甘味剤を含有し得る。

油性懸濁液は，活性成分を，ベジタブルオイル，例えば落花生油，オリーブ油，ごま油若しくはココナッツ油，又は例えば流動パラフィンのような鉱油中に懸濁させて調製され得る。油性懸濁液は，増粘剤，例えば蜜蝋，固形パラフィン又はセチルアルコールを含有してもよい。味のよい経口製剤を作成するために，甘味剤及び矯味矯臭剤を加えてもよい。これら組成物は，例えばアスコルビン酸のような酸化防止剤を加えることにより保存され得る。水を加えて水性懸濁液を調製するに適切な分散可能な粉末及び顆粒は，分散剤若しくは湿潤剤，懸濁剤，及び一つ又はそれ以上の保存料との混合物中に活性成分を提供する。適切な分散剤若しくは湿潤剤，又は懸濁剤は，上記にて既に言及したものに例示される。追加の賦形剤，例えば甘味剤，矯味矯酬剤，及び着色剤存在し得る。

本発明の薬剤組成物は，水中油型のエマルジョンの形態で存在し得る。油相は，ベジタブルオイル若しくは鉱油又はそれらの混合物であり得る。適切な乳化剤は，天然に存在するガム，例えばアカシアガム若しくはトラガカントガム，天然に存在するリン脂質，例えば大豆，レシチン，及び脂肪酸とヘキシトールとから誘導されたエステル若しくは部分エスエル，無水物，例えばモノオレイン酸ソルビタン，及び上記の部分エステルとエチレンオキシドとの縮合物，例えばモノオレイン酸ポリオキシエチレンソルビタンであり得る。エマルジョンはまた，甘味剤及び矯味矯臭剤を含有してもよい。

シロップ及びエリキシルは，甘味剤，例えばグリセロール，プロピレングリコール，ソルビトール，ブドウ糖又はショ糖と共に調製され得る。このような製剤はまた，粘滑剤，保存料，並びに矯味矯臭剤及び着色剤を含有し得る。薬剤組成物は，無菌注射用水性又は油性懸濁液の形態で存在し得る。この懸濁液は，上記に言及してある適切な分散剤又は湿潤剤を用いて，当該技術分野にて周知のように調製され得る。無菌注射用製剤は，例えば１，３−ブタンジオール中の溶液のような，非経口的に許容される非毒性の希釈剤又は溶媒中の注射可能な無菌溶液，又は懸濁液でもあり得る。使用され得る許容されるビヒクル及び溶媒には，水，リンゲル溶液，及び等張塩化ナトリウム溶液がある。加えて，無菌，固定油が従来より溶媒又は懸濁媒体として使用されている。この目的のために，合成モノ又はジグリセリドを含む任意の刺激の少ない固定油を使用し得る。加えて，注射溶液の調製には，例えばオレイン酸のような脂肪酸も有用である。

本発明の核酸分子はまた，例えば薬剤の直腸投与のために坐剤の形態にて投与されてもよい。これらの組成物は，薬物を，常温で固体だが，直腸の温度では液体であり，従って直腸内で融解して薬物を放出する適切な無刺激性賦形剤と共に混合して調製され得る。そのような材料には，ココアバター，及びポリエチレングリコールがある。

本発明の核酸分子は，無菌媒体にて非経口的に投与され得る。薬物は，使用されるビヒクル及び濃度に応じて，ビヒクル中に懸濁されるか，又は溶解されるかのいずれかであり得る。都合よくは，局所麻酔薬のような補助剤，保存料及び緩衝剤をビヒクル中に溶解し得る。

上記した状態の治療には，体重１ｋｇあたり約０．１ｍｇ〜約１４０ｍｇ／日のオーダーの用量レベルが実用的である（被験者一人あたり，約０．５ｍｇ〜約７ｇ／日）。担体材料と組合せて単一用量を形成し得る活性成分量は，治療される対象と，特定の投与モードとに応じて変動する。単位用量形態は，一般に活性成分を約１ｍｇ〜約５００ｍｇ含有する。

任意の特定の被験者のための特定の用量レベルは，使用される特定の化合物の活性，年齢，体重，全身の健康，性別，食事，投与時間，投与経路，及び排泄率，薬物の組合せ，及び治療を受けている特定患者の重症度を含む種々の要因に依存することが理解される。

ヒトではない動物への投与のために，組成物は動物の飼料又は飲料水に加えてもよい。動物飼料及び飲料水組成物を調製して，動物が食事と共に治療的に適量の組成物を摂取すれば都合がよいであろう。組成物を，飼料又は飲料水に加えるためのプレミックスとして形成することも都合がよいと思われる。

本発明の核酸分子は，総合的な治療効果を上昇させるために，他の治療化合物と組合せて投与されてもよい。複数の化合物を使用して徴候を治療することにより有益な効果が増すと共に，副作用が軽減される。

代替的に，本発明の特定のｓｉＮＡ分子は，真核生物プロモーターから細胞内に発現させることができる（例，Ｉｚａｎｔ及びＷｅｉｎｔｒａｕｂ，１９８５，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２２９，３４５，ＭｃＧａｒｒｙ及びＬｉｎｄｑｕｉｓｔ，１９８６，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，ＵＳＡ８３，３９９，Ｓｃａｎｌｏｎ等，１９９１，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８８，１０５９１−５，Ｋａｓｈａｎｉ−Ｓａｂｅｔ等，１９９２，ＡｎｔｉｓｅｎｓｅＲｅｓ．Ｄｅｖ．，２，３−１５，Ｄｒｏｐｕｌｉｃ等，１９９２，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，６６，１４３２−４１，Ｗｅｅｒａｓｉｎｇｈｅ等，１９９１，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，６５，５５３１−４，Ｏｊｗａｎｇ等，１９９２，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８９，１０８０２−６，Ｃｈｅｎ等，１９９２，ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓＲｅｓ．，２０，４５８１−９，Ｓａｒｖｅｒ等，１９９０Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４７，１２２２−１２２５，Ｔｈｏｍｐｓｏｎ等，１９９５，ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓＲｅｓ．，２３，２２５９，Ｇｏｏｄ等，１９９７，ＧｅｎｅＴｈｅｒａｐｙ，４，４５）。当業者は，適切なＤＮＡ／ＲＮＡベクターから，真核生物細胞内で任意の核酸を発現させ得ることを理解するであろう。そのような核酸の活性は，酵素性核酸による一次転写産物からのそれらの放出により増大され得る（Ｄｒａｐｅｒ等，国際特許出願公開第ＷＯ９３／２３５６９号，及びＳｕｌｌｉｖａｎ等，国際特許出願公開第ＷＯ９４／０２５９５号，Ｏｈｋａｗａ等，１９９２，ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓＳｙｍｐ．Ｓｅｒ．，２７，１５−６，Ｔａｉｒａ等，１９９１，ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓＲｅｓ．，１９，５１２５−３０，Ｖｅｎｔｕｒａ等，１９９３，ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓＲｅｓ．，２１，３２４９−５５，Ｃｈｏｗｒｉｒａ等，１９９４，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６９，２５８５６）。

本発明の別の一局面において，本発明のＲＮＡ分子は，ＤＮＡ又はＲＮＡベクター内に挿入された転写単位（例えばＣｏｕｔｕｒｅ等，１９９６，ＴＩＧ．，１２，５１０を参照）から発現し得る。組み替えベクターは，ＤＮＡプラスミド又はウイルスベクターであり得る。ウイルスベクターを発現するｓｉＮＡは，アデノ関連ウイルス，レトロウイルス，アデノウイルス，又はαウイルスを基に構成され得るが，これに限定されるものではない。別の一実施態様において，ｐｏｌＩＩＩベースの構成を使用して本発明の核酸分子を発現させ得る（例えばＴｈｏｍｐｓｏｎ，米国特許第５，９０２，８８０号及び米国特許第６，１４６，８８６号を参照）。ｓｉＮＡ分子を発現可能な組み替えベクターは，上記に説明したように送達され得，標的分子内に存続する。代替的に，ウイルスベクターを使用して核酸分子を一過性発現させることもできる。そのようなベクターは，必要に応じて繰り返し投与され得る。一旦発現すると，ｓｉＮＡ分子は，標的ｍＲＮＡと相互作用して，ＲＮＡｉ応答を生成する。ｓｉＮＡ分子発現ベクターの送達は，例えば静脈投与又は筋内投与するか，被験者から外植された標的細胞へ投与し，続いて被験者内に再導入するか，又は所望の標的細胞内へ導入し得る任意の他の手段を用いることにより全身的なものであり得る（再考には，Ｃｏｕｔｕｒｅ等，１９９６，ＴＩＧ．，１２，５１０を参照）。

一局面において，本発明は，本発明のｓｉＮＡの少なくとも一つをコード化する核酸配列を有する発現ベクターに関する。発現ベクターは，ｓｉＮＡ二重鎖の一方若しくは両方の鎖，又はｓｉＮＡ二重鎖に自己ハイブリダイズする一本の自己相補的な鎖をコード化し得る。本発明のｓｉＮＡをコード化する核酸配列は，ｓｉＮＡ分子の発現を可能にするように，操作可能に連結され得る（例えばＰａｕｌ等，２００２，ＮａｔｕｒｅＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，１９，５０５，Ｍｉｙａｇｉｓｈｉ及びＴａｉｒａ，２００２，ＮａｔｕｒｅＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，１９，４９７，Ｌｅｅ等，２００２，ＮａｔｕｒｅＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，１９，５００，Ｎｏｖｉｎａ等，２００２，ＮａｔｕｒｅＭｅｄｉｃｉｎｅ，オンライン版ｄｏｉ，１０．１０３８／ｎｍ７２５，Ｋａｐｌｉｔｔ等，米国特許第６，１８０，６１３号，Ｄａｖｉｄｓｏｎ，国際特許出願公開第ＷＯ０４／０１３２８０号を参照）。

別の一局面において，本発明はａ）転写開始領域（例，真核生物ｐｏｌＩ，ＩＩ又はＩＩＩ開始領域），ｂ）転写終結領域（例，真核生物ｐｏｌＩ，ＩＩ又はＩＩＩ終結領域），及びｃ）本発明のｓｉＮＡ分子の少なくとも一つをコード化する核酸配列を有する発現ベクターに関し，該配列は，ｓｉＮＡ分子を発現及び／又は送達し得るように，開始領域及び終結領域に，操作可能に連結されている。ベクターは，任意にて，本発明のｓｉＮＡをコード化する配列の５’側又は３’側に操作可能に連結された，タンパク質のためのオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ），及び／又はイントロン（介在配列）を有し得る。

ｓｉＮＡ分子配列の転写は，真核生物ＲＮＡポリメラーゼＩ（ｐｏｌＩ），ＲＮＡポリメラーゼＩＩ（ｐｏｌＩＩ），又はＲＮＡポリメラーゼＩＩＩ（ｐｏｌＩＩＩ）のためのプロモーターから操作され得る。ｐｏｌＩＩ又はｐｏｌＩＩＩプロモーターからの転写産物は，全細胞内にて高いレベルで発現され，所定の細胞型内の所定のｐｏｌＩＩプロモーターのレベルは，近傍に存在する遺伝子調節配列（エンハンサー，サイレンサー等）の性質に依存する。原核生物ＲＮＡポリメラーゼ酵素が適切な細胞内で発現される場合には，原核生物ＲＮＡポリメラーゼプロモーターも使用され得る（Ｅｌｒｏｙ−Ｓｔｅｉｎ及びＭｏｓｓ，１９９０，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８７，６７４３−７，Ｇａｏ及びＨｕａｎｇ１９９３，ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓＲｅｓ．，２１，２８６７−７２，Ｌｉｅｂｅｒ等，１９９３，ＭｅｔｈｏｄｓＥｎｚｙｍｏｌ．，２１７，４７−６６，Ｚｈｏｕ等，１９９０，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．，１０，４５２９−３７）。幾人かの研究者は，このようなプロモーターから発現される核酸分子が，哺乳類細胞内で機能し得ることを証明している（例，Ｋａｓｈａｎｉ−Ｓａｂｅｔ等，１９９２，ＡｎｔｉｓｅｎｓｅＲｅｓ．Ｄｅｖ．，２，３−１５，Ｏｊｗａｎｇ等，１９９２，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８９，１０８０２−６，Ｃｈｅｎ等，１９９２，ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓＲｅｓ．，２０，４５８１−９，Ｙｕ等，１９９３，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９０，６３４０−４，Ｌ’Ｈｕｉｌｌｉｅｒ等，１９９２，ＥＭＢＯＪ．，１１，４４１１−８，Ｌｉｓｚｉｅｗｉｃｚ等，１９９３，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ，９０，８０００−４，Ｔｈｏｍｐｓｏｎ等，１９９５，ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓＲｅｓ．，２３，２２５９，Ｓｕｌｌｅｎｇｅｒ＆Ｃｅｃｈ，１９９３，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２６２，１５６６）。より詳細には，Ｕ６小核ＲＮＡ（ｓｎＲＮＡ），転移ＲＮＡ（ｔＲＮＡ）及びアデノウイルスＶＡＲＮＡをコード化する遺伝子由来の転写単位は，細胞内でｓｉＮＡ等の所望のＲＮＡ分子の高い濃度を生成するのに有用である（Ｔｈｏｍｐｓｏｎ等，前出，Ｃｏｕｔｕｒｅ及びＳｔｉｎｃｈｃｏｍｂ，１９９６，前出，Ｎｏｏｎｂｅｒｇ等，１９９４，ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓＲｅｓ．，２２，２８３０，Ｎｏｏｎｂｅｒｇ等，米国特許第５，６２４，８０３号，Ｇｏｏｄ等，１９９７，ＧｅｎｅＴｈｅｒ．，４，４５，Ｂｅｉｇｅｌｍａｎ等，国際特許出願公開第ＷＯ９６／１８７３６号）。上記のｓｉＮ転写単位は，プラスミドＤＮＡベクター，ウイルスＤＮＡベクター（例えばアデノウイルス又はアデノ関連ウイルスベクター），又はウイルスＲＮＡベクター（例えばレトロウイルス又はαウイルスベクター）を含むがこれに限定されない，哺乳類細胞内に導入するための様々なベクター内に組み込まれ得る（再考には，Ｃｏｕｔｕｒｅ及びＳｔｉｎｃｈｃｏｍｂ，１９９６，前出，を参照）。

別の一局面において本発明は，本発明のｓｉＮＡ分子の少なくとも一つを，該ｓｉＮＡ分子の発現を可能にするようにコード化する核酸配列を有する発現ベクターに関する。一実施態様において，発現ベクターは，ａ）転写開始領域，ｂ）転写終結領域，及びｃ）ｓｉＮＡ分子の少なくとも一つの鎖をコード化する核酸配列を有し，ここで該配列は，ｓｉＮＡ分子を発現及び／又は送達し得るように，該開始領域及び終結領域に操作可能に連結されている。

別の一実施態様において，発現ベクターは，ａ）転写開始領域，ｂ）転写終結領域，ｃ）オープンリーディングフレーム，及びｄ）ｓｉＮＡ分子の少なくとも一つの鎖をコード化する核酸配列を有し，ここで該配列はオープンリーディングフレームの３’−末端に操作可能に連結され，該配列は，ｓｉＮＡ分子を発現及び／又は送達し得るように，開始領域，オープンリーディングフレーム及び終結領域に操作可能に連結されている。更に別の一実施態様において，発現ベクターは，ａ）転写開始領域，ｂ）転写終結領域，ｃ）イントロン，及びｄ）ｓｉＮＡ分子の少なくとも一つをコード化する核酸配列を有し，ここで該配列は，ｓｉＮＡ分子を発現及び／又は送達し得るように，開始領域，イントロン及び終結領域に操作可能に連結されている。

別の一実施態様において，発現ベクターは，ａ）転写開始領域，ｂ）転写終結領域，ｃ）。イントロン，ｄ）オープンリーディングフレーム，及びｅ）ｓｉＮＡ分子の少なくとも一つの鎖をコード化する核酸配列を有し，ここで該配列は，オープンリーディングフレームの３’−末端に操作可能に連結され，該配列は，ｓｉＮＡ分子を発現及び／又は送達し得るように，開始領域，イントロン，オープンリーディングフレーム及び終結領域に操作可能に連結されている。

Ｈａｉｒｌｅｓｓの生物学及び生物化学
以下の説明は，"ＨＡＩＲＬＥＳＳ，ＭＯＵＳＥ，ＨＯＭＯＬＯＧＯＦ，ＨＲ"，Ｃｏｐｙｒｉｇｈｔ（Ｄ１９６６−２００４ＪｏｈｎｓＨｏｐｋｉｎｓＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ）のためのＯＭＩＭデータベースエントリーを脚色したものである。毛の成長は，３期，即ちアナゲン期（成長期），カタゲン期（退行期），及びテロゲン期（休止期）からなる非同期サイクルにて起こる。Ｈａｉｒｌｅｓｓ遺伝子の生成物は，この経路の一つの移行部分を調節し得る。表皮，繊維芽細胞，及び形質転換成長因子ファミリーのメンバーを含むサイトカイン及び成長因子の長いリストが毛の成長に関与しており，Ｈａｉｒｌｅｓｓ遺伝子の転写制御のための様々な潜在的標的を提供する。

無毛マウス（ｈｒ／ｈｒ）マウスは，最初に，１９２６年にＢｒｏｏｋｅによる（Ｂｒｏｏｋｅ，１９２６，Ｊ．Ｈｅｒｅｄ．１７，１７３−１７４）で説明された。続いて，“Ｈａｉｒｌｅｓｓ”遺伝子のイントロン６内への内因性ハツカネズミ白血病プロウイルスの自発的な組込みから突然変異が生じ（Ｓｔｏｙｅ等，１９８８，Ｃｅｌｌ５４，３８３−３９１），その結果，異常なスプライシングが生じ，ホモ接合体ｈｒ／ｈｒマウス内で正常なｍＲＮ転写産物は約５％のみ存在した（Ｃａｃｈｏｎ−Ｇｏｎｚａｌｅｚ等，１９９４，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．９１，７７１７−７７２１）。ヒト，マウス，及びラットＨａｉｒｌｅｓｓ遺伝子によってコード化されたタンパク質は，新奇でかつ保存された６−システインモチーフを伴う単一亜鉛フィンガードメインを含み，ＧＡＴＡファミリー，及びラット精巣内に発現する遺伝子によりコード化されるタンパク質であるＴｓｇａに対して構造的相同性を有して転写因子として機能すると考えられる。

ヒトＨａｉｒｌｅｓｓ遺伝子の完全なコード配列は，Ａｈｍａｄ等，１９９８，Ｓｃｉｅｎｃｅ２７９，７２０−７２４によって決定されており，１８９アミノ酸から構成される。ヒトＨＲ遺伝子の発現パターンは，マウス及びラットにて観察される発現パターンと一致し，脳及び皮膚において相当量の発現と，それ以外の箇所において微量の発現とを伴う。先のマウス及びラットの研究と同様に，ヒトＨＲは，毛を支持する皮膚からの繊維芽細胞内で相当発現し，脳内で最も多量に発現した（Ｔｈｏｍｐｓｏｎ，１９９６，Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．，１６，７８３２−７８４０）。

マウス’Ｈａｉｒｌｅｓｓ’遺伝子に対するヒト相同体のクローンニング，及び特徴付け（遺伝子は，Ｃｉｃｈｏｎ等，１９９８，Ｈｕｍ．Ｍｏｌｅｃ．Ｇｅｎｅｔ．，７，１６７１−１６７９にて報告されている。Ｃｉｃｈｏｎ等は，ヒトＨａｉｒｌｅｓｓ遺伝子は選択的スプライシングを受け，またエクソン１７の選択的使用から生成した少なくとも二つのアイソフォームがヒト組織内に発見されることを証明した。エクソン１７を含むアイソフォームは，皮膚を除く全組織内で優位に発現し，皮膚では比較的短いアイソフォームの限定的な発現が観察される。このエクソン１７配列を欠いたＨａｉｒｌｅｓｓ転写産物の割合の組織特異的な相違は，先天性脱毛症を有する固体に観察される組織−疾患表現型に寄与するものであり得る。

ビタミンＤ受容体（ＶＤＲ），及びＨａｉｒｌｅｓｓ（ＨＲ）遺伝子の両方は，そのどちらかの不活性突然変異により脱毛症を発症することから，哺乳類の毛成長サイクルに重要な役割を果たしている。（Ｈｓｉｅｈ等，２００３，ＪＢｉｏｌＣｌａｅｍ．，２７８，３８６６５−７４）。ＶＤＲは，リガンド活性化転写因子として機能する核内受容体であり，それに対してＨａｉｒｌｅｓｓ遺伝子生成物（ＨＲ）は，甲状腺ホルモン受容体（ＴＲ）及びオーファン核受容体ＲＯＲαの両方の補抑制体として作用する。Ｈｓｅｉｈ等，前出，は，ＶＤＲ−仲介トランス活性化が，ラットＨＲの共発現により著しく抑制されることを証明した。ＨＲの抑圧（ｒｅｐｒｅｓｓｉｖｅ）効果は，合成の及び天然に存在するＶＤＲ応答性プロモーターの両方上にて観察され，また更に，ＶＤＲ−仲介トランス活性化がそのヘテロ二量体パートナー，レチノイドＸ受容体の過剰発現によって増大される際に観察される。インビトロプルダウン法を使用して，著者等は，ＨＲは直接ＶＤＲに結合するが，ＨＲによって機能的に抑圧されない核内受容体には僅かにのみ結合することを見いだした。共免疫沈降のデータは，ＨＲ及びＶＤＲが細胞環境内にて関連性を有することを示し，それによってＨＲ及びＶＤＲのインビボ相互作用が示唆された。ヒトＶＤＲ内のＨＲ接触部位は，活性化機能−２ドメインから分離した他の核内受容体内の，周知の補抑制体ドッキング領域であるリガンド結合ドメインの中央部に局在化していることが見いだされた。共免疫沈降，及びＨＲ欠失体の機能的研究によって，ＶＤＲが，ＴＲ及びＲＯＲαの結合に必要なモチーフを含むＨＲのＣ−末端領域に接触することが明らかとなった。加えて，原位置での（ｉｎｓｉｔｕ）マウス皮膚内のＨＲ及びＶＤＲｍＲＮＡのハイブリダイゼーション分析により，毛嚢細胞内の共局在化が証明され，インビボでのＶＤＲ標的遺伝子発現を抑圧するためのこれらのタンパク質間の細胞内相互作用の仮説と一致した（Ｈｓｉｅｈ等，２００３，ＪＢｉｏｌＣｈｅｍ．，２７８，３８６６５−７４）。

様々な研究にて，マウス及びヒトの両方で，脱毛症はＨａｉｒｌｅｓｓ（ＨＲ）不活性化の特徴であることが示されている（Ｋｏｎｇ等，２００２，ＪｏｕｒｎａｌｏｆｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｖｅＤｅｒｍａｔｏｌｏｇｙ，１１８，６３１−６３８）。毛の成長の調節におけるＨＲの役割を直接的に決定するため，Ｋｏｎｇ等，前出，は，ヒトケラチン１４プロモーターを使用して，形質転換マウスの皮膚内のヒトＨａｉｒｌｅｓｓ遺伝子発現を標的とし，Ｈａｉｒｌｅｓｓ導入遺伝子を発現している無毛ヌルマウスを生成させた。野生型の同腹子を用いて，Ｈａｉｒｌｅｓｓヌル，形質転換，及びヒトＨａｉｒｌｅｓｓ−発現ヌルマウス，二つの形質転換系統を並行して研究した。形質転換マウスは極めて正常である一方ＨＲヌル及びＨＲヌル／ヒトＨＲマウルは成長が遅延し，低カルシウム血症，二次性の上皮小体機能亢進症，及びくる病を発症した。脱毛症を発症したＨＲヌルマウスと対照的に，ＨＲヌル／ヒトＨＲマウスは正常な被毛を示し，またその毛幹及び皮膚組織構造は野生型マウスのものと区別がつかなかった。免疫組織化学解析によって，ヒトＨＲは表皮の基底層，及び毛嚢の外毛根鞘内に高度に発現することが明らかとなった。毛嚢の形態形成中，野生型，ＨＲヌル，形質転換，及びＨＲヌル／ヒトビタミンＤ受容体同腹子の皮膚内で，主な組織学的相違は観察されなかった。しかしながら，誕生から２０日後，脱毛によりアナゲン期が誘発されると，無毛ヌルマウスは毛周期を開始しなかったのに対し，ＨＲヌル／ヒトＨＲマウスは，野生型マウスと同様のアナゲン期毛嚢形成パターンを示した。興味深いことに，形質転換マウスは，遺伝子濃度依存的に，野生型及びＨＲヌル／ヒトＨＲマウスよりも早く毛嚢周期を開始した。これらのデータにより，マウスの出生後の毛嚢周期の開始には，ビタミンＤ受容体が必要であるという直接的な証拠が提供される（Ｋｏｎｇ等，２００２，ＪｏｕｒｎａｌｏｆＩｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｖｅＤｅｒｍａｔｏｌｏｇｙ，１１８，６３１−６３８）。

ビタミンＤ受容体を介して作用する活性ビタミンＤ代謝産物，１，２５−ジヒドロキシビタミンＤは，表皮を含む，様々なビタミンＤ応答性組織内にて遺伝子発現を調節する。表皮分化の仲介におけるビタミンＤ受容体の役割を調べるため，Ｘｉｅ等，２００２，ＪｏｕｒｎａｌｏｆＩｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｖｅＤｅｒｍａｔｏｌｏｇｙ，１１８，１１−１６は，遺伝子ターゲティングによって生成したビタミンＤ受容体ノックアウトマウスの表皮内の組織形態及び分化マーカーの発現を検査した。ホモ接合体ノックアウトマウスは，ヒトのビタミンＤ−依存性くる病タイプＩＩに非常に類似した表現型を示し，それにはくる病及び脱毛症の両方の発症が含まれた。誕生後３ヶ月迄に脱毛症が発症し，８ヶ月迄に徐々に完全な脱毛へと進行した。ホモ接合体ノックアウトマウスの皮膚の組織学的解析により，誕生後３週間から毛嚢が拡張し，皮膚嚢胞が形成されることが明らかとなった。これらの嚢胞は，年齢の上昇に伴いその寸法及び数が両方とも増大した。免疫染色及び原位置での（ｉｎｓｉｔｕ）ハイブリダイゼーション法によって検出されたインボルクリン，プロフィラグリン，及びロリクリンを含む表皮分化マーカーは，誕生から３週間目迄のホモ接合体ノックアウトマウスにて低下した発現レベルを示した。次いで毛嚢内で組織形態の変化が観察された。しかしながら，ケラチン１０レベルは低下されていないことが見いだされた。超微細構造レベルにて，ホモ接合体ノックアウトマウスでは顆粒層内に小さい密な顆粒が多数形成され，周囲のケラチン束は殆ど，又は全く存在せず，またケラトヒリアン顆粒が消失していた。このようなものとして，濾胞間表皮及び毛嚢の両方が，正常な分化のためにビタミンＤ受容体を必要とするものと想定される。二つのプロセス間の時間経過的な異常は，発生時の毛周期のアナゲン期においてビタミンＤ受容体の必要性を欠き，濾胞間表皮の末期分化上に影響を与えることを示す。

毛嚢周期におけるＨａｉｒｌｅｓｓの役割から，Ｈａｉｒｌｅｓｓ遺伝子を標的とする短干渉核酸分子の使用によって，被験者又は有機体の毛の成長を防止，抑制，又は低下させるため，被験者又は有機体の除毛（脱毛）のため，及び／又は被験者又は有機体の脱毛症及び無毛症，及び／又は細胞又は組織内のＨａｉｒｌｅｓｓ（ＨＲ）レベルに関連した又は応答する任意の他の形質，疾患又は病状の予防又は治療のために，単独で，又は他の治療と組合せて，使用することができる新規な薬剤の類が提供される。

実施例
以下は，本発明の核酸の選択，単離，合成及び活性を示す非限定的な実施例である。
実施例１：ｓｉＮＡ構成のタンデム合成
本発明の例示的なｓｉＮＡ分子は，切断可能なリンカー，例えば，スクシニルベースのリンカーを使用して一列（タンデム）に合成される。本明細書に記載されるタンデム合成は，ＲＮＡｉ分子を高収率で提供する一ステップ精製工程の前に行われる。このアプローチは，高スループットのＲＮＡｉスクリーニングに支持されｓｉＮＡ合成に高い順応性を有し，マルチカラム又はマルチウエル合成プラットフォームに容易に適応され得る。

５’−末端ジメトキシトリチル（５’−Ｏ−ＤＭＴ）基がそのまま残留する（トリチル−オン合成）ｓｉＮＡオリゴ及びその相補体のタンデム合成の完了後，オリゴヌクレオチドを上述したように脱保護した。その後，ｓｉＮＡ配列鎖を自発的にハイブリダイズさせた。このハイブリダイズにより，一方の鎖が５’−Ｏ−ＤＭＴ基を保持する一方，相補的な鎖は末端５’−ヒドロキシルを有する二重鎖が得られた。この新たに形成された二重鎖は，分子一方のみがジメトキシトリチル基を有する場合でも，慣例の固相抽出精製（トリチル−オン精製）中に，単一の分子として挙動した。鎖は安定な二重鎖を形成するため，例えば，Ｃ１８カートリッジを用いた，一対のオリゴの精製にはジメトキシトリチル基（又は等価である基，例えば他のトリチル基又は他の疎水性部分）が唯一要求される。

逆位デオキシ脱塩基スクシネート，若しくはグリセリルスクシネートリンカー（図１参照）又は等価の切断可能なリンカー等のタンデムリンカーの導入迄，標準的なホスホロアミダオト合成を行った。使用され得るリンカー結合条件の非限定的な例には，例えばブロモトリピロリジノフォスフォニウムヘキサフルオロホスフェート（ＰｙＢｒＯＰ）のような賦活剤の存在下での例えばジイソプロピルエチルアミン（ＤＩＰＡ）及び／又はＤＭＡＰのような障害塩基が含まれる。リンカーを結合した後，標準的な合成を用いて，末端５’−Ｏ−ＤＭＴをそのままに保持して第二の配列の合成を完了させた。合成後，生成したオリゴヌクレオチドを本明細書に記載した手順に従って脱保護し，例えば５０ｍＭＮａＯＡｃ又は１．５ＭＮＨ₄Ｈ₂ＣＯ₃のような適切な緩衝剤でクエンチした。

ｓｉＮＡ二重鎖の精製は，例えばアセトニトリル，２ＣＶＨ２０，及び２ＣＶ５０ｍＭＮａＯＡｃの１カラム容積（ＣＶ）でコンディショニングしたＷａｔｅｒｓＣ１８ＳｅｐＰａｋ１ｇカートリッジを使用する固相抽出により容易に実行し得る。サンプルを充填した後，１ＣＶＨ２０又は５０ｍＭＮａＯＡｃで洗浄した。不完全配列（failure sequence）を１ＣＶ１４％ＡＣＮ（５０ｍＭＮａＯＡｃ及び５０ｍＭＮａＣｌと水溶液）で溶出した。その後，カラムを，例えば１ＣＶＨ２０で洗浄し，次いで例えば１ＣＶｏｆ１％トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）水溶液を通過させることにより，カラム上で脱トリチル化し，次いでカラムに第二のＣＶｏｆ１％ＴＦＡ水溶液を加え，約１０分間静止させた。残留したＴＦＡ溶液を除去してカラムをＨ２Ｏで，次いで１ＣＶ１ＭＮａＣｌで，更にＨ２Ｏで洗浄した。その後，１ＣＶ２０％ＣＡＮ水溶液を使用してｓｉＮＡ二重鎖生成物を溶出した。

図２に，精製ｓｉＮＡ構成のＭＡＬＤＩ−ＴＯＦマススペクトル分析の例を示す。ここでピークは，個々のｓｉＮＡ二重鎖の計算された質量と一致する。キャピラリゲル電気泳動（ＣＧＥ）で分析した場合，同一の精製ｓｉＮＡが３個のピークを提供する。ピークの一つは，おそらく二重鎖ｓｉＮＡに対応し，ピークの二つはおそらく別々のｓｉＮＡ配列鎖に対応している。同一のｓｉＮＡのイオン交換ＨＰＬＣ分析は，縮小した単一のピークのみを示す。以下に説明するルシフェラーゼレポータアッセイを用いた精製ｓｉＮＡ構成の試験では，別に合成したヌクレオチド配列鎖から生成したｓｉＮＡ構成と比較して同一のＲＮＡｉ活性を示した。

実施例２：任意のＲＮＡ配列内の潜在的なｓｉＮＡ標的部位の同定
関心のＲＮＡ標的の配列，例えばウイルス又はヒトｍＲＮ転写産物の標的部位を，コンピュータ折り畳みアルゴリズムを使用してスクリーニングした。非限定的な例において，例えばジェンバンク等のデータベースから得た遺伝子又はＲＮＡ遺伝子転写産物の配列を使用して，標的に相補性を有するｓｉＮＡ標的を生成した。このような配列はデータベースから得られるか，又は当該技術分野にて周知のように実験的に決定され得る。公知の標的部位，例えば他の核酸分子，例えばリボザイム若しくはアンチセンスの研究に基づいて有効な標的部位であると決定された標的部位，又は例えば突然変異若しくは欠失を含む部位等，疾患又は病状に関連することが周知の標的部位が，関心部位を標的とするｓｉＮＡ分子のデザインに使用され得る。様々なパラメータを使用して，標的ＲＮＡ配列内の最も適切な標的部位を決定し得る。これらパラメータには，二次又は三次のＲＮＡ構成，標的配列のヌクレオチド塩基組成，標的配列の様々な領域間の相同性の程度，又はＲＮＡ転写産物内の標的配列の相対位置が含まれるが，これらに限定されるものではない。これらの測定に基づき，例えばインビトロＲＮＡ切断アッセイ，細胞培養，又は動物モデル等を使用して，ＲＮ転写産物内の任意数の標的部位がｓｉＮＡ分子の有効性のスクリーニングのために選択され得る。非限定的な例では，使用されるｓｉＮＡ構成の大きさに基づいて転写産物内の１〜１０００の標的部位のいずれかを選択した。公知の方法を使用して，ｓｉＮＡ分子スクリーニングのためのマルチウエル又はマルチプレートアッセイ等の高スループットのスクリーニングアッセイが，標的遺伝子発現の有効性低下を測定するために開発され得る。

実施例３：ＲＮＡ内におけるｓｉＮＡ分子の標的部位の選択
以下の非限定的なステップを使用して，所定の遺伝子配列又は転写産物を標的とするｓｉＮＡ分子が選択され得る。
１．標的配列をｉｎｓｉｌｉｃｏで解析して，特定の長さの，例えば２３ヌクレオチド長の断片の配列の全部分をリストした。このステップは一般に，慣習的なＰｅｒｌスクリプトを使用して実行されるが，Ｏｌｉｇｏ，Ｍａｃベクター，又はＧＣＧＷｉｓｃｏｎｓｉｎＰａｃｋａｇｅのような商業的な配列分析プログラムを使用することもできる。

２．ある場合に，ｓｉＮＡは二つ以上の標的配列に対応した。これは例えば同一遺伝子の異なる転写産物を標的とする，二つ以上の遺伝子の異なる転写産物を標的とする，又はヒト遺伝子及び動物のホモログの両方を標的とする場合に当てはまる。この場合，標的の各々について特定の長さのサブ配列リストを作成した後，リストを比較して各リスト内に存在する一致配列を発見した。次いでサブ配列を，所定のサブ配列を含む標的配列の数に従ってランク付けした。目標は殆ど又は全ての標的配列内に存在するサブ配列を見つけることにある。代替的に，ランキングにより例えば突然変異標的配列のような，標的配列に独特のサブ配列を確認することができた。このようなアプローチによって，ｓｉＮＡ分子を使用して突然変異配列を特異的に標的とし，正常配列の発現に影響を与えないようにすることができた。

３．ある場合に，ｓｉＮＡサブ配列は，一つ又はそれ以上の配列内に存在しない一方で，所望の標的配列内に存在した。標的とされないで残留するべきパラロガス（ｐａｒａｌｏｇｏｕｓ）ファミリーメンバーを有する遺伝子を標的とする場合に当てはまる。上記のケース２の場合と同様，各標的につき特定の長さのサブ配列リストを作成し，次いでリストを比較して，標的遺伝子内に存在するが，非標的パラログ内に存在しない配列を発見した。

４．ランク付けされたｓｉＮＡサブ配列は更に解析され，ＧＣ含有量に従ってランク付けされ得た。３０〜７０％のＧＣを含む部位が好ましく，４０〜６０％のＧＣを含む部位が更に好ましいであろう。

５．ランク付けされたｓｉＮＡサブ配列は更に解析され，自己折り畳み及び内部ヘアピンに従ってランク付けされた。比較的弱い内部折り畳みが好ましく，強力なヘアピン構造は回避するべきである。

６．ランク付けされたｓｉＮＡサブ配列は更に解析され，配列内にＧＧＧ又はＣＣＣのｒｕｎを有するか否かに従ってランク付けされた。いずれかの鎖内に存在するＧＧＧ（又は更に多数のＧ）は，オリゴヌクレオチド合成に問題を発生させる場合があり，ＲＮＡｉ活性を妨害する虞があり得るため，よりよい配列が利用される際は常に回避されるべきである。アンチセンス鎖内にＧＧＧが配置されるため，標的鎖内のＣＣＣが探索された。

７．ランク付けされたｓｉＮＡサブ配列は更に解析され，配列の３’−末端上にてジヌクレオチドＵＵ（ウリジンジヌクレオチド）を有する，及び／又は配列の５’−末端上にＡＡを有する（アンチセンス配列上に３’ＵＵを得る）か否かに従ってランク付けされた。これらの配列は末端ＴＴチミジンジヌクレオチドを有するｓｉＮＡ分子のデザインを可能にする。

８．上記したように，サブ配列のランク付けリストから４又は５個の標的部位が選択された。例えば，２３ヌクレオチドを有するサブ配列において，次に選択された各２３−ｍｅｒサブ配列の右側の２１ヌクレオチドをデザインし，ｓｉＮＡ分子二重鎖の上部（センス）鎖が合成された。その一方，各２３−ｍｅｒサブ配列の左側の２１ヌクレオチドの逆相補体がデザインされ，ｓｉＮＡ分子の下部（アンチセンス）鎖が合成された（表ＩＩ及びＩＩＩ参照）。末端ＴＴ残基が配列に所望される場合（段落７に記述したように），オリゴ合成前にセンス鎖及びアンチセンス鎖の両方の３’末端ヌクレオチドをＴＴと交換する。

９．ｓｉＮＡ分子は，インビトロ，細胞培地又は動物モデル系内でスクリーニングされて，最も活性なｓｉＮＡ分子，又は標的ＲＮＡ配列内の最も好ましい標的部位が確認された。

１０．標的核酸配列の選択には，デザインに対する他の考察も使用され得る。Ｒｅｙｎｏｌｄｓ等，２００４，ＮａｔｕｒｅＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙＡｄｖａｎｃｅｄＯｎｌｉｎｅＰｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ，１，Ｆｅｂｒｕａｒｙ２００４，ｄｏｉ，１０．１０３８／ｎｂｔ９３６及びＵｉ−Ｔｅｉ等，２００４，ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓＲｅｓｅａｒｃｈ，３２，ｄｏｉ，１０．１０９３／ｎａｒ／ｇｋｈ２４７を参照されたい。

代替的アプローチでは，Ｈａｉｒｌｅｓｓ標的配列に特異的なｓｉＮＡ構成のプールを使用して，ＨａｉｒｌｅｓｓＲＮＡを発現する，例えば培養されたヒト皮膚繊維芽細胞，又はＳＫＯＶ−３，Ａ３７５，Ａ４３１，Ａ５４９，ＮＭｕＭｇ若しくはＳＫ−Ｎ−ＳＨ細胞のような細胞内の標的部位についてスクリーニングした。このアプローチで使用する一般的戦略を，図９に示す。このプールの非限定的な例は，ＳＥＱＩＤＮＯＳ１−１１３８のいずれかを有する配列を含む。ＨａｉｒｌｅｓｓＲＮＡを発現する細胞（例，培養ヒト皮膚繊維芽細胞，又はＳＫＯＶ−３，Ａ３７５，Ａ４３１，Ａ５４９，ＮＭｕＭｇ若しくはＳＫ−Ｎ−ＳＨ細胞）はｓｉＮＡ構成のプールでトランスフェクトされて，Ｈａｉｒｌｅｓｓ抑制に関連した表現型を示す細胞が区分けされた。ｓｉＮＡ構成のプールは，適切なベクター内に挿入された転写カセットから発現され得る（例えば図７及び図８参照）。表現型がポジティブに変化した細胞からのｓｉＮＡ（例，増殖の低下，ＨａｉｒｌｅｓｓｍＲＮＡレベルの低下，又はＨａｉｒｌｅｓｓタンパク質発現の低下）の配列を決定して，標的ＨａｉｒｌｅｓｓＲＮＡ配列内で最も適切な標的部位（一つ又は複数）を決定した。

実施例４：Ｈａｉｒｌｅｓｓを標的とするｓｉＮＡデザイン
ＨａｉｒｌｅｓｓＲＮＡ標的の配列を解析してｓｉＮＡ標的部位を選択し，任意にて本明細書の実施例３に記述されたようなｓｉＮＡ分子のライブラリーを使用して，又は代替的に本明細書の実施例６に記述されているようなインビトロｓｉＮＡ系を使用して，折り畳み（標的へのｓｉＮＡのアクセシビリティを測定するために解析されたいずれかの所定の配列構造）に基づいて標的部位に優先順位をつけた。ｓｉＮＡ分子は各標的に結合することができるようデザインされ，また任意にて個別的にコンピュータ折り畳みを使用してｓｉＮＡ分子が標的配列と相互作用し得るか否かアクセスすることによって解析された。ｓｉＮＡ活性を最適化するために分子の長さを変更する選択をすることができた。一般には，標的ＲＮＡとの結合，又は別様の相互作用のために，十分数の相補的なヌクレオチド塩基が選択されたが，相補性の程度は，ｓｉＮＡ二重鎖に適応させるために，又はｓｉＮＡ二重鎖の長さ若しくは塩基組成物を変動させるために調節し得る。このような方法体系を用いることにより，任意の遺伝子転写産物に対応するＲＮＡ配列のような任意の周知のＲＮＡ配列内の標的部位に，ｓｉＮＡ分子をデザインすることができた。

化学修飾ｓｉＮＡ構成は，インビボでの全身投与のためのヌクレアーゼ安定性，及び／又は改良された薬物動態，局在化，及び送達特性を提供する一方，ＲＮＡｉ活性の調節能力を保存するようデザインされた。本明細書に記載される化学修飾は，本明細書に記載される，及び一般に周知の合成方法を用いた合成により導入された。次いで合成されたｓｉＮＡ構成は，血清及び／又は細胞／組織抽出物（例，肝臓抽出物）中のヌクレアーゼ安定性についてアッセイされた。合成ｓｉＮＡ構成はまた，本明細書に記載されるようにルシフェラーゼレポータアッセイのような適切なアッセイ，又はＲＮＡｉ活性を定量し得る他の適切なアッセイの一つを使用して，ＲＮＡｉ活性について並行して試験された。ヌクレアーゼ安定性及びＲＮＡｉ活性の両方を有する合成ｓｉＮＡ構成は更に修飾され，安定性及び活性アッセイにおいて再評価された。このように，安定化した活性ｓｉＮＡ構成の化学修飾は，例えば，治療的開発のためのリードｓｉＮＡ分子を精選するための標的スクリーニングアッセイ等，任意の選択されたＲＮＡを標的とする任意のｓｉＮＡ配列に適用することができる（例えば図１１参照）。

実施例５：ｓｉＮＡｓｉＮＡ分子の化学的合成及び精製
ｓｉＮＡは，例えば本明細書に記載されるＲＮＡ配列等のＲＮＡメッセージ中の様々な部位と相互作用するようにデザインされ得る。ｓｉＮＡ分子（一つ又は複数）の一方の鎖の配列は，上述した標的部位配列に相補性を有している。ｓｉＮＡ分子は，本明細書に記載される方法を使用して化学的に合成され得る。調節配列として使用される不活性ｓｉＮＡ分子は，ｓｉＮＡ分子が標的配列に相補性を有さないように該ｓｉＮＡ分子の配列を不規則に変更して合成され得る。一般にｓｉＮＡ構成は，本明細書に記載されるような固相オリゴヌクレオチド合成法を使用して合成され得る（例えば，全て本明細書に参照により加入されるＵｓｍａｎ等，米国特許第．５，８０４，６８３号，米国特許第５，８３１，０７１号，米国特許第５，９９８，２０３号，米国特許第６，１１７，６５７号，米国特許第６，３５３，０９８号，米国特許第６，３６２，３２３号，米国特許第６，４３７，１１７号，米国特許第６，４６９，１５８号，Ｓｃａｒｉｎｇｅ等，米国特許第６，１１１，０８６号，米国特許第６，００８，４００号，米国特許第６，１１１，０８６号を参照）。

非限定的な例において，ＲＮＡオリゴヌクレオチドは，周知のようにホスホロアミダイト構造を用いて段階的に合成される。標準的なホスホロアミダイト構造は，５’−Ｏ−ジメトキシトリチル，２’−Ｏ−ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリル，３’−Ｏ−２−シアノエチルＮ，Ｎ−ジイソプロピルホスホロアミダイト基，及び環外アミン保護基（例，Ｎ６−ベンゾイルアデノシン，Ｎ４アセチルシチジン，及びＮ２−イソブチリルグアノシン）のいずれかを含むヌクレオシドを使用する。代替的に，Ｓｃａｒｉｎｇｅ，前出，に記載されているように，ＲＮＡの合成は，酸に不安定な２’−Ｏ−オルトエスエル保護基と共に２’−Ｏ−シリルエステルを使用してもよい。２’化学構造が異なると，異なる保護基を必要とし，例えば全容が参照により本明細書に加入されるＵｓｍａｎ等，米国特許第５，６３１，３６０号に記載されているように，２’−デオキシ−２’−アミノヌクレオシドはＮ−フタロイル保護を使用し得る。

固相合成中，各ヌクレオチドは，固体支持体に結合したオリゴヌクレオチドに連続して（３’−から５’−の方向へ）加えられた。鎖の３’−末端の第一ヌクレオシドは，様々なリンカーを用いて固体支持体（例，微細孔性ガラス又はポリスチレン）に共有結合された。ヌクレオチド前駆体，リボヌクレオシドホスホロアミダイト，及び賦活剤を組合せ，第一のヌクレオシドの５’−末端上に第二のヌクレオシドホスホロアミダイトを連結させた。次いで支持体を洗浄し，未反応５’−ヒドロキシル基の全てを例えば無水酢酸のようなキャッピング試薬でキャップして，不活性５’−アセチル部分を得る。次いで三価リン結合を酸化して，より安定なホスフェート結合とした。ヌクレオチド付加周期の最後に，５’−Ｏ−保護基を適切な条件下（例，トリチル−ベースの基では酸性条件，シリル−ベースの基ではフッ化物）で切断した。この周期は各ヌクレオシドに関して繰り返された。

連結の効率を最適化するために，修飾の合成条件が用いられ，例えば合成されるべきｓｉＮＡの特定の構成に応じて，異なる連結時間，異なる試薬／ホスホロアミダイト濃度，異なる接触時間，異なる固体支持体及び固体支持体のリンカーの化学構造が使用される。ｓｉＮＡの脱保護及び精製は，全容が参照により本明細書に加入されるＵｓｍａｎ等，米国特許第５，８３１，０７１号，米国特許第６，３５３，０９８号，米国特許第６，４３７，１１７号，及びＢｅｌｌｏｎ等，米国特許第６，０５４，５７６号，米国特許第６，１６２，９０９号，米国特許第６，３０３，７７３号，又はＳｃａｒｉｎｇｅ，前出，に記載されているように実行され得る。また可能な限り最高のｓｉＮＡ構成の収率及び純度を得るように，脱保護の条件を調節し得る。例えば，本願出願人は２’−デオキシ−２’−フルオロヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチドは，適切な脱保護条件下において分解し得ることを観察した。このようなオリゴヌクレオチドは，メチルアミン水溶液を使用して約３５℃で３０分間脱保護される。２’−デオキシ−２’−フルオロ含有オリゴヌクレオチドがリボヌクレオチドをも含む場合，メチルアミン水溶液で約３５℃にて３０分間脱保護した後，ＴＥＡ−ＨＦを加えて，反応物を約６５℃で更に１５分間保持する。

実施例６：ｓｉＮＡ活性を評価するＲＮＡｉインビトロアッセイ
無細胞系内でＲＮＡｉを再現するインビトロアッセイを使用して，ＨａｉｒｌｅｓｓＲＮＡ標的を標的とするｓｉＮＡ構成を評価した。アッセイは，Ｔｕｓｃｈｌ等，１９９９，ＧｅｎｅｓａｎｄＤｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ，１３，３１９１−３１９７，及びＺａｍｏｒｅ等，２０００，Ｃｅｌｌ，１０１，２５−３３に記載されている，Ｈａｉｒｌｅｓｓ標的ＲＮＡに使用するよう適合されたシステムを含む。シンシチウム胚盤葉由来のショウジョウバエ抽出物を使用してインビトロでＲＮＡｉ活性を再構成した。標的ＲＮＡは，Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼを使用して適切なＨａｉｒｌｅｓｓ発現プラスミドからのインビトロ転写を介して生成され，又は本明細書に記載されたような化学合成により生成された。センス及びアンチセンスｓｉＮＡ鎖（例えば各々２０μＭ）を，緩衝液（例えば１００ｍＭ酢酸カリウム，３０ｍＭＨＥＰＥＳ−ＫＯＨ，ｐＨ７．４，２ｍＭ酢酸マグネシウム）中で９０℃で１分間，次いで３７℃で１時間インキュベートすることによりアニールし，次いで溶解物緩衝液（例えば１００ｍＭ酢酸カリウム，３０ｍＭＨＥＰＥＳ−ＫＯＨ，ｐＨ７．４，２ｍＭ酢酸マグネシウム）中で希釈した。アニーリングは，ＴＢＥ緩衝剤中のアガロースゲル電気泳動により監視し得，臭化エチジウムで染色した。適切なＨａｉｒｌｅｓｓ発現プラスミドに適切な発酵糖蜜寒天上で収集したＯｒｅｇｏｎＲハエ由来の０〜２時間経過した幼胚を使用し，これを溶解してショウジョウバエ溶解物を調製した。溶解物を遠心分離して上澄み液を単離した。アッセイは，，ＲＮＡ（１０〜５０ｐＭ最終濃度），及びｓｉＮＡ（１０ｎＭ最終濃度）を含む１０％［ｖｏｌ／ｖｏｌ］溶解物緩衝液から構成された。反応混合物はまた，１０ｍＭリン酸クレアチン，１０ｕｇ．ｍｌクレアチンホスホキナーゼ，１００ｕｍＧＴＰ，１００ｕＭＵＴＰ，１００ｕＭＣＴＰ，５００ｕＭＡＴＰ，５ｍＭＤＴＴ，０．１Ｕ／ｕＬＲＮＡｉｎ（Ｐｒｏｍｅｇａ），及び各アミノ酸１００ｕＭも含んでいた。酢酸カリウムの最終濃度を１００ｍＭに調整した。反応物を氷上で予め集め，ＲＮＡに加える前に２５℃で１０分間プレインキュベートした。その後，２５℃で更に６０分間インキュベートした。反応物を４容量の１．２５ｘＰａｓｓｉｖｅＬｙｓｉｓＢｕｆｆｅｒ（Ｐｒｏｍｅｇａ）でクエンチした。ＲＴ−ＰＣＲ分析又は周知の他の方法を用いて標的ＲＮＡの切断をアッセイし，ｓｉＮＡが存在しないコントロール反応と比較した。

代替的に，アッセイのために内部標識した標的ＲＮＡを，［α−３２Ｐ］ＣＴＰの存在下，インビトロ転写により準備し，クロマトグラフィーによりＧ５０Ｓｅｐｈａｄｅｘカラムを通過させ，更に精製することなく標的ＲＮＡとして使用した。任意にて，Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼ酵素を使用して，標的ＲＮＡの５’−３２Ｐ−末端を標識してもよい。上述したようにアッセイを実行し，標的ＲＮＡ及びＲＮＡｉにより生成した特定のＲＮＡ切断生成物を，ジェルの放射能写真により視覚化した。切断の割合はＰＨＯＳＰＨＯＲＩＭＡＧＥＲ（登録商標）（放射能写真）を使用して，手付かずのコントロールＲＮＡ，又はｓｉＮＡ不在コントロール反応からのＲＮＡと，アッセイにより生成した切断生成物とを表すバンドの定量によって決定された。

一実施態様において，このアッセイは，ｓｉＮＡ仲介ＲＮＡｉ切断のためのＨａｉｒｌｅｓｓＲＮＡ標的に標的部位を決定するのに使用される。ここではＨａｉｒｌｅｓｓＲＮＡ標的の切断を仲介するＲＮＡｉのために，複数のｓｉＮＡ構成が，例えば標識標的ＲＮＡの電気泳動によるアッセイ反応の分析，又はノーザンブロット法，及び当該技術分野で周知の他の方法体系を使用した解析によりスクリーニングされる。

非限定的な例において，Ｈａｉｒｌｅｓｓ（ＨＲ）ＲＮ転写産物を標的とするｓｉＮＡ構成が，無細胞系内でＲＮＡｉを再現するインビトロアッセイによりアッセイされる。ＨｅＬａ細胞由来の溶解物を使用して，インビトロでＲＮＡｉ活性を再構成した。標的ＲＮＡは，Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼを使用して適切なＨＲ２ＲＮＡ発現ｄｓＤＮＡからのインビトロ転写を介して生成された。センス及びアンチセンスｓｉＮＡ鎖（各２０ｕＭ）を，緩衝液（１００ｍＭ酢酸カリウム，３０ｍＭＨＥＰＥＳ−ＫＯＨ，ｐＨ７．４，２ｍＭ酢酸マグネシウム）中で９０℃で１分間，次いで３７℃で１時間インキュベートすることによりアニールした。アニーリングは，ＴＢＥ緩衝剤中のアガロースゲル電気泳動により監視し，臭化エチジウムで染色した。Ｍａｒｔｉｎｅｚプロトコル（ＭａｒｔｉｎｅｚＪ．等，２００２，Ｃｅｌｌ，１１０，５６３−７４）の修正バージョンを用いて，ＨｅＬａ溶解物を調製した。アッセイは，５０％溶解物［ｖｏｌ／ｖｏｌ］を含む反応混合物，ＲＮＡ標的（最終濃度１０〜５０ｐＭ），及びｓｉＮＡ（最終濃度１００ｎＭ）を含む１０％［ｖｏｌ／ｖｏｌ］溶解物緩衝液から構成された。反応混合物はまた，２００μＭＧＴＰ，２ｍＭＡＴＰ，０．１ｍＭＤＴＴ，及び５ｍＭＭｇＣｌ２，１ｍＭＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．５）も含んでいた。反応物を室温で予め集め，ＲＮＡ標的に加える前に３０℃で１５分間プレインキュベートした。その後，３０℃で更に１６０分間インキュベートした。反応物を２容量の染料を含む７Ｍ尿素ジェルでクエンチし，ドライアイス上で素早く冷凍した。ＲＮＡｉにより生成した特定のＲＮＡ切断生成物を，ｄＰＡＧＥ上に分離した。ＰＨＯＳＰＨＯＲＩＭＡＧＥＲ（登録商標）（放射能写真）を使用して，手付かずのコントロールＲＮＡ，又はｓｉＮＡ不在コントロール反応からのＲＮＡと，アッセイにより生成した切断生成物とを表すバンドの定量によって決定された。結果を表ＶＩにまとめる。表ＶＩに示すように，数個のｓｉＮＡ構成（センス／アンチセンス化合物番号，表ＩＩＩ参照）は，この系のＨａｉｒｌｅｓｓＲＮＡの切断活性を示している。切断活性は，高いものについては（＋＋＋）で示し，中間については（＋＋）で示し，低いものについては（＋）で示し，及び切断活性を有さないものは（−）で示す。

実施例７：Ｈａｉｒｌｅｓｓ標的ＲＮＡの核酸抑制
ヒトＨａｉｒｌｅｓｓＲＮＡを標的とするｓｉＮＡ分子は，上記したようにデザイン及び合成された。これら核酸分子のインビボでの切断活性は，例えば以下の手順により試験することができる。標的配列，及びＨａｉｒｌｅｓｓＲＮＡ内のヌクレオチド位置を，表ＩＩ及びＩＩＩに記す。

Ｈａｉｒｌｅｓｓを標的とするｓｉＮＡの有効性を試験するために，二つのフォーマットが使用された。最初に，例えば培養されたヒト皮膚繊維芽細胞，又はＳＫＯＶ−３，Ａ３７５，Ａ４３１，Ａ５４９，ＮＭｕＭｇ若しくはＳＫ−Ｎ−ＳＨ細胞を使用して，細胞培養液内で試薬を試験して，ＲＮＡ及びタンパク質抑制の程度を測定した。本明細書に記載されるように，ｓｉＮＡ試薬（例，表ＩＩ及びＩＩＩ参照）をＨａｉｒｌｅｓｓ標的に対して選択した。これらの試薬を適切なトランスフェクション剤により，例えば培養ヒト皮膚繊維芽細胞，又はＳＫＯＶ−３，Ａ３７５，Ａ４３１，Ａ５４９，ＮＭｕＭｇ若しくはＳＫ−Ｎ−ＳＨ細胞に送達した後に，ＲＮＡ抑制を測定した。標的ＲＮＡの相対的な量は，増幅のリアルタイムＰＣＲ監視（例，ＡＢＩ７７００ＴＡＱＭＡＮ（登録商標））を使用したアクチンとの対比にて測定した。比較は，無関係標的に対して形成したオリゴヌクレオチド配列の混合物，又は同一の長さ及び化学構造を有するが，各位置にてランダムに置換されたランダム化ｓｉＮＡコントロールについて行われた。標的用に第一及び第二のリード試薬が選択され，最適化された。最適なトランスフェクション剤濃度が選択された後，リードｓｉＮＡ分子でＲＮＡの時間経過抑制を実行した。更に，細胞プレーティングフォーマットを使用してＲＮＡ抑制を測定し得る。

ｓｉＮＡの細胞への送達
トランスフェクションの前日，細胞（例，培養されたヒト皮膚繊維芽細胞，又はＳＫＯＶ−３，Ａ３７５，Ａ４３１，Ａ５４９，ＮＭｕＭｇ，若しくはＳＫ−Ｎ−ＳＨ細胞）を，例えばＥＧＭ−２（ＢｉｏＷｈｉｔｔａｋｅｒ）の６ウエル皿の各ウエルに１×１０５細胞にて播種した。ｓｉＮＡ（最終濃度，例えば２０ｎＭ）とカチオン性脂質（例，最終濃度２μｇ／ｍｌ）とを，３７℃で３０分間，ポリスチレンチューブ内にてＥＧＭ基質媒体（ＢｉｏＷｈｉｔｔａｋｅｒ）内で複合した。渦状に攪拌した後，複合ｓｉＮＡを各ウエルに加え，指示された時間インキュベートした。最初の最適化実験では，細胞を，例えば９６ウエルプレート内で例えば１×１０３にて播種し，記述したようにｓｉＮＡ複合体を加えた。脂質と複合された蛍光ｓｉＮＡを用いて細胞へのｓｉＮＡ送達の効率を測定した。６−ウエル皿内の細胞を，ｓｉＮＡと共に２４時間インキュベートし，ＰＢＳで濯ぎ，２％パラホルムアルデヒド中にて室温で１５分間固定した。蛍光顕微鏡を使用してｓｉＮＡの取り込みを視覚化した。

ＴＡＱＭＡＮ（登録商標）増幅のリアルタイムＰＣＲ監視，及びｍＲＮＡのＬｉｇｈｔｃｙｃｌｅｒ定量
ｓｉＮＡ送達後，６−ウエルのＱｉａｇｅｎＲＮＡ精製キット又は９６−ウエルのＲｎｅａｓｙ抽出キットのアッセイにより，細胞から全ＲＮＡを準備した。ＴＡＱＭＡＮ分析（増幅のリアリタイムＰＣＲ監視）では，レポーター染料，ＦＡＭ又はＪＯＥを５’−末端に共有結合させ，クエンチャー染料を３’−末端に共有結合させた二重−標識プローブを合成した。一ステップＲＴ−ＰＣＲ増幅を，１０μｌ総ＲＮＡ，１００ｎＭフォワード（ｆｏｒｗａｒｄ）プライマー，９００ｎＭリバース（ｒｅｖｅｒｓｅ）プライマー，１００ｎＭプローブ，１ＸＴａｑＭａｎＰＣＲ反応緩衝液（ＰＥ−ＡｐｐｌｉｅｄＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓ），５．５ｍＭＭｇＣｌ２，３００μＭ，各ｄＡＴＰ，ｄＣＴＰ，ｄＧＴＰ，及びｄＴＴＰ，１０ＵＲＮＡａｓｅＩｎｈｉｂｉｔｏｒ（Ｐｒｏｍｅｇａ），１．２５ＵＡＭＰＬＩＴＡＱＧＯＬＤ（登録商標）（ＤＮＡポリメラーゼ）（ＰＥ−ＡｐｐｌｉｅｄＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓ），並びに１０ＵＭ−ＭＬＶＲｅｖｅｒｓｅＴｒａｎｓｃｒｉｏｔａｓｅ（Ｐｒｏｍｅｇａ）から構成された５０μｌ反応物を使用して，例えばＡＢＩＰＲＩＳＭ７７００ＳｅｑｕｅｎｃｅＤｅｔｅｃｔｏｒ上で行った。熱周期条件は，４８℃で３０分間，９５℃で１０分間，次いで９５℃で１５秒，及び６０℃で１分間の４０サイクルから構成され得る。連続的に希釈された全細胞ＲＮＡ（３００，１００，３３，１１ｎｇ／ｒｘｎ）から生成した標準に関してｍＲＮＡレベルを計量し，並行ＴＡＱＭＡＮ反応（増幅のリアリタイムＰＣＲ監視）におけるβ−アクチン又はＧＡＰＤＨｍＲＮＡに標準化した。各関心遺伝子について上部及び下部プライマー，及び蛍光標識プローブがデザインされた。特定のＰＣＲ生成物へのＳＹＢＲＧｒｅｅｎＩ染料のリアルタイム組込みは，ライトサイクラー（ｌｉｇｈｔｃｙｌｅｒ）を使用してガラスキャピラリチューブ内で測定し得る。コントロールｃＲＮＡを使用して各プライマーについて，標準曲線を生成した。値は各サンプルのＧＡＰＤＨに対する相対的な表現で表される。

ウエスタンブロッティング
標準的なミクロ製造技術を使用して核抽出物を調製し得る（例えば，Ａｎｄｒｅｗｓ及びＦａｌｌｅｒ，１９９１，ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓＲｅｓｅａｒｃｈ，１９，２４９９参照）。例えばＴＣＡ沈殿を使用して，上澄み液からタンパク質抽出物を調製した。等量の２０％ＴＣＡを細胞上澄み液に加え，氷上で１時間インキュベートし，５分間遠心分離してペレット化した。ペレットをアセトンで洗浄し，乾燥して，水中に再懸濁させた。細胞タンパク質抽出物を，１０％ビス−トリスＮｕＰａｇｅ（核抽出物）又は４〜１２％トリス−グリシン（上澄み液抽出物）ポリアクリルアミドゲル上に流し，ニトロセルロース膜上に転写した。例えば，４℃にて５％無脂肪牛乳で１時間，次いで一次抗体で１６時間インキュベートすることにより，非特異的結合を遮断し得る。洗浄後，二次抗体を例えば（１：１０，０００希釈にて）室温で１時間適用し，ＳｕｐｅｒＳｉｇｎａｌ試薬（Ｐｉｅｒｃｅ）でシグナルを検出した。

実施例８：Ｈａｉｒｌｅｓｓ遺伝子発現の下方調節の評価に有用な動物モデル
動物モデルにおけるＨＲ薬の有効性の評価は，ヒト臨床試験にて重要な必要条件となっている。インビトロアッセイで選択されたリード抗ＨＲｓｉＮＡ分子は，以下のマウス及びラットモデルで更に試験され得る。Ｈａｉｒｌｅｓｓを標的とする本発明のｓｉＮＡ分子の評価に使用される有利な動物モデルについては，参照により本明細書に加入されるＣｈｒｉｓｔｉａｎｏ，米国特許出願公開第２００３００７７６１４号に記載されている。非限定的な例において，Ｃ５７Ｂ１／６Ｊマウスの新生児を，送達後一日目から開始して，ｓｉＮＡで１日２回処理した。マウスの毛の発生が開始すると同時に，電気クリッパーを使用して毛幹を規則的に短縮して皮膚表面への到達を容易にし，かつｓｉＮＡ製剤の貫通性を高めた。各処理では，８５％ＥｔＯＨ及び１５％エチレングリコールビヒクル中に溶解した２μｇのｓｉＮＡを，マウス背部の１平方ｃｍに適用した。適用中，及び適用から１４分後，マウスを一時的に拘束して，製剤の除去を防止した。対照動物を，一致する逆位構造のｓｉＮＡコントロールを含有するビヒクル，又はビヒクルのみで処理した。マウスが評価のために犠牲になる迄，処理を継続（例，２８日，３５日又は８週間）した。皮膚の処理領域全体と未処理の隣接領域とを除去し，ホルマリン溶液中で固定して，標準的手順により包埋及び加工した。毛の成長，密度，及び濾胞発達（例，濾胞の数，又は濾胞のアナゲン期からカタゲン期への移行）のようなパラメータを用いて，対照と比較してｓｉＮＡ処理群を評価した。毛の成長の阻害剤，及び脱毛症又は無毛症治療のアプローチのための他の有利な動物モデルには，Ｔｏｎｇ等，２００３，ＴｒｅｎｄｓＭｏｌ．Ｍｅｄ．，９，７９−８４，Ｐｏｒｔｅｒ，２００３，Ｊ．Ａｎａｔ．，２０２，１２５−３１，Ｉｒｖｉｎｅ及びＣｈｒｉｓｔｉａｎｏ，２００１，Ｃｌｉｎ．Ｅｘｐ．Ｄｅｒｍａｔｏｌ．，２６，５９−７１，並びにＳｕｎｄｂｅｒｇ等，１９９９，Ｅｘｐ．Ｍｏｌ．Ｐａｔｒｏｌ．，６７，１１８−３０に記載されたものが含まれる。

このようなものとして，これらのモデルは，例えば毛の成長の防止，抑制，若しくは低下，又は除毛を評価するに適切な条件下で，動物に適用されるｓｉＮＡ局所製剤を用いて，毛の成長の防止，抑制，若しくは低下，又は除毛（例，脱毛）における本発明のｓｉＮＡ分子の有効性を評価するのに使用され得る。これら及び他のモデルは，同様に，前臨床設定にて本発明のｓｉＮＡ分子の安全性及び有効性の評価にも使用され得る。

実施例９：ＲＮＡｉ仲介によるＨａｉｒｌｅｓｓ発現の抑制
例えば培養ヒト皮膚繊維芽細胞，又はＳＫＯＶ−３，Ａ３７５，Ａ４３１，Ａ５４９，ＮＭｕＭｇ若しくはＳＫ−Ｎ−ＳＨ細胞内で，ＨａｉｒｌｅｓｓＲＮＡ発現の低下におけるｓｉＮＡ構成（表ＩＩＩ）の有効性を試験した。トランスフェクションの約２４時間前，細胞を５，０００〜７，５００細胞／ウエル，１００μｍｌ／ウエルにて９６−ウエルプレート内にプレーティングした。それによりトランスフェクション時には細胞は７０〜９０％融合性を有していた。トアンスフェクションのために，アニールしたｓｉＮＡをトランスフェクション剤（Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ２０００，Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）と共に混合して，５０μｌ／ウエルの容量にし，室温で２０分間インキュベートした。ｓｉＮＡトランスフェクション混合物を細胞に加えて，最終ｓｉＮＡ濃度を２５ｎＭ（１５０μｌ）とした。ｓｉＮＡトランスフェクション混合物の継続的な存在下，細胞を３７℃で２４時間インキュベートした。２４時間後，処理した細胞の各ウエルからＲＮＡを準備した。トランスフェクション混合物を含む上澄みを最初に除去し，廃棄した後，細胞を溶解して，各ウエルよりＲＮＡを準備した。処理後の標的遺伝子の発現については，ＲＴ−ＰＣＲによって標的遺伝子を評価し，標準化のためにコントロール遺伝子（３６Ｂ４，ＲＮＡポリメラーゼサブユニット）について評価した。３重のデータを平均化して，各処理につき標準偏差を決定した。標準化データをグラフに表し，標的ｍＲＮＡ低下の割合を，反転コントロールｓｉＮＡと比較したｓｉＮＡの活性により決定した。

非限定的な例において，Ａ２７５細胞内で化学修飾ｓｉＮＡ構成（表ＩＩＩ）のＨａｉｒｌｅｓｓＲＮＡ発現の低下における有効性を，上述したように試験した。活性ｓｉＮＡを，未処理細胞，一致した化学構造の反転コントロール（３３９６５／３３９７１及び３３９７７／３３９８３），及びトランスフェクションコントロールと比較して評価した。結果を図２２及び図２３に示す。図２２は，ＨａｉｒｌｅｓｓｍＲＮＡ内の様々な部位を標的とするＳｔａｂ９／１０（表ＩＶ）のｓｉＮＡ構成の結果を示す。図２３は，ＨａｉｒｌｅｓｓｍＲＮＡ内の様々な部位を標的とするＳｔａｂ２３／２４ｓｉＮＡの構成の結果を示す。図２２及び図２３に示すように，活性ｓｉＮＡ構成は，一つ又はそれ以上細胞培養実験において，ＨａｉｒｌｅｓｓｍＲＮＡレベルと適切なコントロールとを比較した場合，該一つ又はそれ以上の細胞内でＨａｉｒｌｅｓｓ遺伝子発現を有意に抑制する。

非限定的な例において，ＮＭｕＭｇ細胞内で化学修飾ｓｉＮＡ構成（表ＩＩＩ）のＨａｉｒｌｅｓｓＲＮＡ発現の低下における有効性を，上述したように試験した。活性ｓｉＮＡを，未処理細胞，一致した化学構造の反転コントロール（ＩＣ）及びトランスフェクションコントロールと比較して評価した。結果を図２４及び図２５に示す。図２４は，ＨａｉｒｌｅｓｓｍＲＮＡ内の様々な部位を標的とするＳｔａｂ９／１０（表ＩＶ）のｓｉＮＡ構成の結果を示す。図２５は，ＨａｉｒｌｅｓｓｍＲＮＡ内の様々な部位を標的とするＳｔａｂ７／８のｓｉＮＡ構成の結果を示す。図２４及び図２５に示すように，活性ｓｉＮＡ構成は，マウス細胞培養実験において，ＨａｉｒｌｅｓｓｍＲＮＡレベルと適切なコントロールと比較した場合，マウス細胞内でＨａｉｒｌｅｓｓ遺伝子発現を有意に抑制する。

実施例１０：適応
本発明のｓｉＮＡ分子は，被験者若しくは有機体の毛の成長の防止，抑制，若しくは低下，被験者若しくは有機体の除毛（例，脱毛），又は代替的に被験者若しくは有機体の脱毛症若しくは無毛症，及び細胞若しくは組織内のＨａｉｒｌｅｓｓ（ＨＲ）レベルに関連した，若しくはそれに応答する任意の他の疾患若しくは病状の治療に，単独で又は他の治療若しくは療法と組合せて使用され得る。

本発明のｓｉＮＡ分子と組合せて使用され得る化合物の非限定的な例は，Ｗｉｎｇｌｅｓｓ（例，ＷＮＴ３Ａ），ビタミンＤ受容体（ＶＤＲ），及び／又はＨａｉｒｌｅｓｓ（ＨＲ）遺伝子発現を抑制する組成物，例えばＷｉｎｇｌｅｓｓ（例，ＷＮＴ３Ａ），ビタミンＤ受容体（ＶＤＲ）及び／又はＨａｉｒｌｅｓｓ（ＨＲ）ＲＮＡを標的とするｓｉＮＡ分子等を含むが，これに限定されるものではない。上記の化合物のリストは，本願にて形質，疾病及び疾患の予防又は治療のために本発明の核酸分子（例，ｓｉＮＡ）と組合せて，又はそれに関連して使用され得る化合物及び／又は方法の非限定的な例である。当業者は，他の薬物化合物及び療法も同様に本発明の核酸分子（例，ｓｉＮＡ分子）と容易に組合せ得ることを理解し，従ってそれらの薬物化合物及び療法も本発明の範囲内に含まれることを理解するであろう。

実施例１１：診断的用途
本発明のｓｉＮＡ分子は，例えば臨床的，工業的，環境的，農業的，及び／又は研究設定等の多様な用途にて，例えば分子標的（例，ＲＮＡ）の同定等の多様な診断的用途に使用することができる。このようなｓｉＮＡ分子の診断的用途には，例えば細胞溶解物又は一部精製した細胞溶解物を用いる再構成ＲＮＡｉ系の利用が含まれる。本発明のｓｉＮＡ分子は，診断ツールとして使用され，疾患細胞内の遺伝子のドリフト及び突然変異を検査する，又は例えばウイルスのような細胞内の外因性又は内因性ＲＮＡの存在を検出する際に使用され得る。ｓｉＮＡ活性と標的ＲＮＡ構造との密接な関係は，標的ＲＮＡの塩基対及び三次元構造を変更する，分子の任意の領域内の突然変異を検出することができる。本明細書に記載される多数のｓｉＮＡ分子を使用することによって，インビトロ，並びに細胞及び組織内で，ＲＮＡ構造及び機能にとって重大なヌクレオチド変化をマッピングし得る。標的ＲＮＡのｓｉＮＡ分子による切断は，遺伝子発現を抑制し，疾患又は感染症の進行における特定の遺伝子生成物の役割の定義に使用し得る。この方法で，他の遺伝子標的を疾患の重要な仲介物として規定し得る。この実験は，組合せ治療の可能性から，疾患の進行に対するより良好な治療法となり得る（例，異なる遺伝子を標的とする多数のｓｉＮＡ分子，周知の小分子抑制剤に結合したｓｉＮＡ分子，又はｓｉＮＡ分子及び／又は他の化学的又は生物学的分子との組合せによる断続的な治療）。本発明のｓｉＮＡ分子の他のインビトロ用途も周知であり，それは疾患，感染症，又はそれに関係する病状と関連したｍＲＮＡの存在の検出を含む。このようなＲＮＡは，標準的な方法体系，例えば蛍光共鳴エネルギー転移（ＦＲＥＴ）を使用して，ｓｉＮＡ処理後の切断生成物の存在を測定することによって検出される。

特定の例において，標的ＲＮＡの野生型又は突然変異型のみを切断するｓｉＮＡがアッセイに使用される。第一のｓｉＮＡ分子（即ち，標的ＲＮＡの野生型のみを切断するもの）を使用して，サンプル中に存在する野生型ＲＮＡを同定し，第二のｓｉＮＡ分子（即ち，標的ＲＮＡの突然変異型のみを切断するもの）を使用して，サンプル中に存在する突然変異ＲＮＡを同定する。反応コントロールとして合成の野生型及び突然変異型ＲＮＡの基質を両方のｓｉＮＡ分子で切断し，反応における相対的なｓｉＮＡの有効性，及び"非標的"ＲＮＡ種の切断の欠如を証明する。合成基質からの切断生成物も，サンプル集団の野生型及び突然変異型ＲＮＡを解析するためのサイズマーカーを生成する役割を果たす。従って，各分析は，二つのｓｉＮＡ分子，二つの基質，及び未知の一サンプルを必要し，これらを６個の反応に組合せる。切断生成物の存在は，ＲＮａｓｅ保護アッセイにより測定され，従って各ＲＮＡの完全長及び切断された断片が，ポリアクリルアミドゲルの一レーンで解析され得る。結果を定量して突然変異ＲＮＡの発現の洞察を得ること，標的細胞の所望の表現型の変化の推定上の危険性を知ることは必ずしも要求されない。そのタンパク質生成物が表現型（即ち，疾患又は感染症に関連した）の成長に関与するｍＲＮＡの発現は，危険性を十分確立する。匹敵した特定の活性を備えたプローブを，両方の転写産物に使用した場合，ＲＮＡレベルの定性的比較が適切であり，初期診断のコストが低減される。ＲＮＡレベルを定性的又は定量的のいずれで比較した場合でも，野生型に対する突然変異型の高い割合は，高い危険性と関係する。

明細書中に言及した全特許及び刊行物は，本発明に関係する当業者の技術レベルを示すものである。本開示中に引用した全参照は，各参照の全体が個別的に参照により本明細書に加入されるがごとく，その同一の範囲が本明細書に加入される。

当業者は目的を遂行し，また，それに固有のものも含めて，言及された結論及び利点を得るために非常に適していることを容易に理解するであろう。本明細書に記載されている，現在好ましい実施態様を代表する方法及び組成物は，例示的なものであり，本発明の範囲を限定することを意図するものではない。当業者は本発明の変更及び他の用途を想起し得るが，これらは請求項の範囲にて定義された本発明の趣旨に包含される。

本発明の範囲及び趣旨から逸脱せずに，本明細書に開示された本発明に様々な置換及び修正を行い得ることが当業者には明らかである。従って，そのような追加の実施形態は本発明及び以下の特許請求の範囲内に含まれる。本発明は，当業者に本明細書に記載された化学的修飾の，ＲＮＡｉ活性仲介のための改良された活性を備えた核酸構成の生成に向けた多様な組合せ及び／又は置換を教授する。そのような改良された活性は安定性，バイオアベイラビリティ，及び／又はＲＮＡｉを仲介する細胞応答の活性化を向上され得る。従って，本明細書に記載された特定の実施形態は限定的なものではなく，当業者は本明細書に記載された修飾の特定の組合せが，改良されたｓｉＮＡ分子活性を有するｓｉＮＡ分子を同定する過度の実験を行うことなく，試験され得ることを容易に理解する。

本明細書に例証により記載された本発明は，任意の一つ又は複数の要素，本明細書に特に開示しない一つ又は複数の制限を含まなくとも，適切に実行し得る。従って，例えば，本明細書の各ケースにおいて，用語「を含む」，「を有する」，「からなる」，「本質的に〜から構成される」，及び「から構成される」は，他の用語のいずれかと置き換えてもよい。本明細書で使用されている用語及び表現は，説明を目的とするもので，限定を目的とするものではなく，これら用語及び表現の使用は開示かつ記述した特徴，又はその一部の任意の等価物を除外するものではないが，特許請求される本発明の範囲内に含まれる様々な変更が可能であることが理解される。従って，本発明は好ましい実施態様によって開示されているが，当業者は開示された本願の概念の任意の特徴，修正及び変更に訴え得るが，それら修正及び変更は説明及び添付の特許請求の範囲によって定義される本発明の範囲内に含まれるものと見なされる。

表Ｉ：無毛（Ｈａｉｒｌｅｓｓ）受入番号
ＮＭ０１８４１１
ホモサピエンス無毛ホモログ（マウス）（ＨＲ），転写産物異形２，ｍＲＮＡ
ｇｉ｜２２５４７２０６｜ｒｅｆ｜ＮＭ＿０１８４１１．２｜［２２５４７２０６］
ＮＭ００５１４４
ホモサピエンス無毛ホモログ（マウス）（ＨＲ），転写産物異形１，ｍＲＮＡ
ｇｉ｜２２５４７２０３｜ｒｅｆ｜ＮＭ＿００５１４４．２｜［２２５４７２０３］
ＡＦ０３９１９６
ホモサピエンス推定単一亜鉛フィンガー転写因子タンパク質（無毛）
ｍＲＮＡ，完全ｃｄｓ
ｇｉ｜２０１４９７８６｜ｇｂ｜ＡＦ０３９１９６．３｜［２０１４９７８６］
ＢＣ０６７１２８
ホモサピエンス無毛ホモログ（マウス），転写産物異形１，ｍＲＮＡ（ｃＤＮＡクローン
ＭＧＣ：７０５１６イメージ：６１３８６３１），完全ｃｄｓ
ｇｉ｜４５５０１００２｜ｇｂ｜ＢＣ０６７１２８．１｜［４５５０１００２］
ＡＪ２７７１６５
無毛タンパク質のためのホモサピエンスｍＲＮＡ（常染色体劣性先天性全身脱毛症の原因である推定単一亜鉛フィンガー転写因子タンパク質，ＨＲ遺伝子）
ｇｉ｜７５７３２４６｜ｅｍｂ｜ＡＪ２７７１６５．２｜ＨＳＡ２７７１６５［７５７３２４６］
ＡＦ３６１８６４
アカゲザル無毛ｍＲＮＡ，完全ｃｄｓ
ｇｉ｜１８０２８９７８｜ｇｂ｜ＡＦ３６１８６４．１｜ＡＦ３６１８６４［１８０２８９７８］
ＢＣ００８９４６
ホモサピエンス無毛ホモログ（マウス），ｍＲＮＡ（ｃＤＮＡクローンイメージ：３０５０３５９），部分ｃｄｓ
ｇｉ｜３８０１３９８１｜ｇｂ｜ＢＣ００８９４６．２｜［３８０１３９８１］
ＡＪ２７７２５０
無毛タンパク質のためのホモサピエンス部分ＨＲ遺伝子，エクソン３
ｇｉ｜７５７３５１１｜ｅｍｂ｜ＡＪ２７７２５０．１｜ＨＳＡ２７７２５０［７５７３５１１］
ＡＪ２７７２４９
無毛タンパク質のためのホモサピエンス部分ＨＲ遺伝子，エクソン２及び連結ｃｄｓ
ｇｉ｜７５７９９１４｜ｅｍｂ｜ＡＪ２７７２４９．１｜ＨＳＡ２７７２４９［７５７９９１４］
ＡＪ４００８２９
無毛タンパク質のためのホモサピエンス部分ＨＲ遺伝子，エクソン１１
ｇｉ｜７６３０１０８｜ｅｍｂ｜ＡＪ４００８２９．１｜ＨＳＡ４００８２９［７６３０１０８］
ＡＪ２７７２５２
無毛タンパク質のためのホモサピエンス部分ＨＲ遺伝子，エクソン５
ｇｉ｜１２０５７００６｜ｅｍｂ｜ＡＪ２７７２５２．２｜ＨＳＡ２７７２５２［１２０５７００６］
ＡＪ４００８３７
無毛タンパク質のためのホモサピエンス部分ＨＲ遺伝子，エクソン１９
ｇｉ｜７６３０１４６｜ｅｍｂ｜ＡＪ４００８３７．１｜ＨＳＡ４００８３７［７６３０１４６］
ＡＪ４００８３０
無毛タンパク質のためのホモサピエンス部分ＨＲ遺伝子，エクソン１２
ｇｉ｜７６３０１０９｜ｅｍｂ｜ＡＪ４００８３０．１｜ＨＳＡ４００８３０［７６３０１０９］
ＡＪ２７７２５３
無毛タンパク質のためのホモサピエンス部分ＨＲ遺伝子，エクソン６
ｇｉ｜１２０５７００７｜ｅｍｂ｜ＡＪ２７７２５３．２｜ＨＳＡ２７７２５３［１２０５７００７］
ＡＪ４００８２８
無毛タンパク質のためのホモサピエンス部分ＨＲ遺伝子，エクソン１０
ｇｉ｜６３０１０７｜ｅｍｂ｜ＡＪ４００８２８．１｜ＨＳＡ４００８２８［７６３０１０７］
ＡＪ２７７２５１
無毛タンパク質のためのホモサピエンス部分ＨＲ遺伝子，エクソン４
ｇｉ｜７５７３５１２｜ｅｍｂ｜ＡＪ２７７２５１．１｜ＨＳＡ２７７２５１［７５７３５１２］
ＡＪ４００８３２
無毛タンパク質のためのホモサピエンス部分ＨＲ遺伝子，エクソン１４
ｇｉ｜７６３０１１１｜ｅｍｂ｜ＡＪ４００８３２．１｜ＨＳＡ４００８３２［７６３０１１１］
ＡＪ４００８３６
無毛タンパク質のためのホモサピエンス部分ＨＲ遺伝子，エクソン１８
ｇｉ｜７６３０１１５｜ｅｍｂ｜ＡＪ４００８３６．１｜ＨＳＡ４００８３６［７６３０１１５］
ＡＪ４００８３４
無毛タンパク質のためのホモサピエンス部分ＨＲ遺伝子，エクソン１６
ｇｉ｜７６３０１１３｜ｅｍｂ｜ＡＪ４００８３４．１｜ＨＳＡ４００８３４［７６３０１１３］
ＡＪ４００８３３
無毛タンパク質のためのホモサピエンス部分ＨＲ遺伝子，エクソン１５
ｇｉ｜７６３０１１２｜ｅｍｂ｜ＡＪ４００８３３．１｜ＨＳＡ４００８３３［７６３０１１２］
ＡＪ４００８２６
無毛タンパク質のためのホモサピエンス部分ＨＲ遺伝子，エクソン８
ｇｉ｜６３０１０５｜ｍｂ｜Ｊ４００８２６．１｜ＳＡ４００８２６［７６３０１０５］

ｓｉＮＡ構成の上部配列及び下部配列の３’−末端は、例えば約１、２、３、又は４ヌクレオチド長、好ましくは２ヌクレオチド長のオーバーハングを含み得、下部配列のオーバーハング配列は、任意にて標的配列の一部に相補性を有する。表中の上部及び下部配列は、更に、例えば図４及び図５に示す例示的なｓｉＮＡ構成のように、式Ｉ〜ＶＩＩの化学修正を有するか、又は表ＩＶに記載する修正又はその任意の組合せを有し得る。

ｓｉＮＡ分子の合成スキームの非限定的な例。本発明の方法により合成されたｓｉＮＡ二重鎖の精製のＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量スペクトル。ＲＮＡｉに関与する標的ＲＮＡ分解の，提案する機械的表現の非限定的な例。本発明の化学修飾ｉＮＡの非限定的な例。本発明の特定の化学修飾ｓｉＮＡ配列の非限定的な例。本発明異なるｓｉＮＡ構成の非限定的な例。発現カセットを生成してｓｉＮＡヘアピン構成を生成させる際に用いられるスキームの概略。発現カセットを生成して二本鎖ｉＮＡ構成を生成させる際に用いられるスキームの概略。例えばメッセンジャーＲＮＡのような，特定の標的核酸配列内の，ｓｉＮＡ仲介ＲＮＡｉのための標的部位を決定する際に使用される方法の概略。例えば本発明のｓｉＮＡ配列の３’−末端の安定化に使用され得る，異なる安定化化学構造（１〜１０）の非限定的な例。ヌクレアーゼ耐性を有する一方でＲＮＡｉ活性仲介能力を保持する本発明の化学修飾ｓｉＮＡ構成の同定に使用される戦略の非限定的な例。線状及び二重鎖の構成を含む本発明のリン酸化ｓｉＮＡ分子，及びその非対称誘導体の非限定的な例。本発明の化学修飾された末端リン酸基の非限定的な例。標的核酸配列内で同定される自己相補的なＤＦＯ構成のデザインに使用される，回文及び／又は反復核酸配列を使用した方法体系の非限定的な例。オリゴヌクレオチド配列を形成する二重鎖の非限定的な代表例。オリゴヌクレオチド配列を形成する代表的な二重鎖の自己組立ての概略の非限定的な例。オリゴヌクレオチド配列を形成している代表的な二重鎖の自己会合の概略と，それに続く遺伝子発現をもたらす標的核酸との相互作用の非限定的な例。任意の関心標的核酸配列に相補的な配列を有するＤＦＯ構成内に組み込まれた回文及び／又は反復核酸配列を使用した，自己相補的なＤＦＯ構成のデザインの非限定的な例。各々がＲＮＡｉによる異なる標的核酸配列の切断を仲介し得る，二つの別個のポリヌクレオチド配列を含む，本発明の多機能ｓｉＮＡ分子の非限定的な例。各々がＲＮＡｉによる異なる標的核酸配列の切断を仲介し得る，別個の領域を含む単一のポリヌクレオチド配列を含む，本発明の多機能ｓｉＮＡ分子の非限定的な例。各々がＲＮＡｉによる異なる標的核酸配列の切断を仲介し得る，二つの別個のポリヌクレオチド配列を含み，更に自己相補的な，回文配列，又は反復領域を含むことによって，異なる標的核酸配列に対するＲＮＡ干渉を仲介し得る比較的短い二機能ｓｉＮＡ構成を可能にする，本発明の多機能ｓｉＮＡ分子の非限定的な例。各々が，ＲＮＡｉにより誘導される異なる標的核酸配列の切断を仲介し得る別個の領域を含む単一のポリヌクレオチド配列を含み，更に自己相補的な，回文配列，又は反復領域を含むことによって，異なる標的核酸配列に対するＲＮＡ干渉を仲介し得る比較的短い二機能ｓｉＮＡ構成を可能にする，本発明の多機能ｓｉＮＡ分子の非限定的な例。本発明の多機能ｓｉＮＡ分子が，例えばサイトカイン及び対応する受容体，異なるウイルス株，ウイルス感染又は複製に関与するウイルス及び細胞タンパク質，又は疾患の進行の維持に関係する多様な生物学的経路に関与する異なるタンパク質等，異なるタンパク質をコード化する別個のＲＮＡ分子のような二つの別個の標的核酸分子をどのように標的にし得るかを示す，非限定的な例。本発明の多機能ｓｉＮＡ分子が，標的核酸分子内の二つの別個の標的核酸配列を，どのように標的にし得るかを示す，非限定的な例。Ｈａｉｒｌｅｓｓ（ＨＲ２，転写産物異形２）ｍＲＮＡを標的とするｓｉＮＡにより仲介されるＡ３７５細胞内のＨａｉｒｌｅｓｓｍＲＮＡの減少を表す非限定的な例。Ｈａｉｒｌｅｓｓ（ＨＲ２，転写産物異形２）ｍＲＮＡを標的とするｓｉＮＡにより仲介されるＡ３７５細胞内のＨａｉｒｌｅｓｓｍＲＮＡの減少を表す非限定的な例。Ｈａｉｒｌｅｓｓ（ＨＲ２，転写産物異形２）ｍＲＮＡを標的とするｓｉＮＡにより仲介されるＮＭｕＭｇ細胞内のＨａｉｒｌｅｓｓｍＲＮＡの減少を表す非限定的な例。Ｈａｉｒｌｅｓｓ（ＨＲ２，転写産物異形２）ｍＲＮＡを標的とするｓｉＮＡにより仲介されるＮＭｕＭｇ細胞内のＨａｉｒｌｅｓｓｍＲＮＡの減少を表す非限定的な例。

Claims

ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）を介してＨａｉｒｌｅｓｓ遺伝子でコード化されたＲＮＡの切断を導く，化学的に合成された二本鎖短干渉核酸（ｓｉＮＡ）分子であって，
ａ）前記ｓｉＮＡ分子の各鎖は約１５〜約３０個のヌクレオチド長を有し，
ｂ）前記ｓｉＮＡ分子の一方の鎖は，Ｈａｉｒｌｅｓｓ遺伝子でコード化された前記ＲＮＡに対して，ｓｉＮＡ分子がＲＮＡ干渉を介してＨａｉｒｌｅｓｓ遺伝子でコード化されたＲＮＡの切断を導くのに十分な相補性を有するｓｉＮＡ分子。
前記ｓｉＮＡがリボヌクレオチドを含まない，請求項１に記載のｓｉＮＡ分子。
前記ｓｉＮＡが１個又はそれ以上のリボヌクレオチドを含む，請求項１に記載のｓｉＮＡ分子。
前記二本鎖ｓｉＮＡ分子の一方の鎖は，Ｈａｉｒｌｅｓｓ遺伝子でコード化されたＲＮＡのヌクレオチド配列又はその一部に相補的なヌクレオチド配列を有し，前記二本鎖ｓｉＮＡ分子の第２の鎖は，Ｈａｉｒｌｅｓｓ遺伝子でコード化された前記ＲＮＡのヌクレオチド配列又はその一部と実質的に同様のヌクレオチド配列を有する，請求項１に記載のｓｉＮＡ分子。
ｓｉＮＡ分子の各鎖は約１５〜約３０個のヌクレオチドを含み，各鎖は，他方の鎖のヌクレオチドに相補的な少なくとも約１５個のヌクレオチドを含む請求項４に記載のｓｉＮＡ分子。
前記ｓｉＮＡ分子は，Ｈａｉｒｌｅｓｓ遺伝子でコード化されたＲＮＡのヌクレオチド配列又はその一部に相補的なヌクレオチド配列を有するアンチセンス領域を含み，更に前記ｓｉＮＡ分子はさらにセンス領域を含み，前記センス領域はＨａｉｒｌｅｓｓ遺伝子でコード化された前記ＲＮＡのヌクレオチド配列又はその一部と実質的に同様のヌクレオチド配列を有する，請求項１に記載のｓｉＮＡ分子。
前記アンチセンス領域及び前記センス領域は約１５〜約３０個のヌクレオチドを含み，前記アンチセンス領域は，センス領域のヌクレオチドに相補的な少なくとも約１５個のヌクレオチドを含む，請求項６に記載のｓｉＮＡ分子。
前記ｓｉＮＡ分子はセンス領域及びアンチセンス領域を有し，前記アンチセンス領域は，Ｈａｉｒｌｅｓｓ遺伝子でコード化されたＲＮＡのヌクレオチド配列又はその一部に相補的なヌクレオチド配列を有し，前記センス領域は前記アンチセンス領域に相補的なヌクレオチド配列を有する，請求項１に記載のｓｉＮＡ分子。
前記ｓｉＮＡ分子は二つの別個のオリゴヌクレオチド断片からアセンブリされ，第一の断片は前記ｓｉＮＡ分子のセンス領域を有し，第二の断片は前記ｓｉＮＡ分子のアンチセンス領域を有する請求項６に記載のｓｉＮＡ分子。
前記センス領域はリンカー分子を介してアンチセンス領域に接続される，請求項６に記載のｓｉＮＡ分子。
前記リンカー分子がポリヌクレオチドリンカーである，請求項１０に記載のｓｉＮＡ分子。
前記リンカー分子が非ヌクレオチドリンカーである，請求項１０に記載のｓｉＮＡ分子。
センス領域内のピリミジンヌクレオチドが２’−Ｏ−メチルピリミジンヌクレオチドである，請求項６に記載のｓｉＮＡ分子。
センス領域内のプリンヌクレオチドが２’−デオキシプリンヌクレオチドである，請求項６に記載のｓｉＮＡ分子。
センス領域内に存在するピリミジンヌクレオチドが２’−デオキシ−２’−フルオロピリミジンヌクレオチドである，請求項６に記載のｓｉＮＡ分子。
前記センス領域を含む断片が，前記センス領域を含む断片の５’−末端，３’−末端，又は５’及び３’−末端の両方において末端キャップ部分を含む請求項９に記載のｓｉＮＡ分子。
前記末端キャップ部分が逆位デオキシ脱塩基部分である，請求項１６に記載のｓｉＮＡ分子。
前記アンチセンス領域のピリミジンヌクレオチドが２’−デオキシ−２’−フルオロピリミジンヌクレオチドである，請求項６に記載のｓｉＮＡ分子。
前記アンチセンス領域のプリンヌクレオチドが２’−Ｏ−メチルプリンヌクレオチドである，請求項６に記載のｓｉＮＡ分子。
前記アンチセンス領域内に存在するプリンヌクレオチドが２’−デオキシ−プリンヌクレオチドである，請求項６に記載のｓｉＮＡ分子。
前記アンチセンス領域が，前記アンチセンス領域の３’−末端においてホスホロチオエートヌクレオチド間結合を有する請求項１８に記載のｓｉＮＡ分子。
前記アンチセンス領域が，前記アンチセンス領域の３’−末端においてグリセリル修飾を有する請求項６に記載のｓｉＮＡ分子。
前記ｓｉＮＡ分子の二つの各断片が約２１個のヌクレオチドを含む，請求項９に記載のｓｉＮＡ分子。
ｓｉＮＡ分子の各断片の約１９個のヌクレオチドはｓｉＮＡ分子の他方の断片の相補的なヌクレオチドと塩基対形成し，ｓｉＮＡ分子の各断片の少なくとも二つの３’−末端ヌクレオチドはｓｉＮＡ分子の他方の断片のヌクレオチドと塩基対形成しない，請求項２３に記載のｓｉＮＡ分子。
ｓｉＮＡ分子の各断片の二つの３’−末端ヌクレオチドの各々が，２’−デオキシ−ピリミジンである請求項２４に記載のｓｉＮＡ分子。
前記２’−デオキシ−ピリミジンは２’−デオキシ−チミジンである，請求項２５に記載のｓｉＮＡ分子。
前記ｓｉＮＡ分子の各断片の約２１個のヌクレオチドのすべてが，ｓｉＮＡ分子の他方の断片の相補的なヌクレオチドと塩基対形成する，請求項２３に記載のｓｉＮＡ分子。
アンチセンス領域の約１９個のヌクレオチドが，Ｈａｉｒｌｅｓｓ遺伝子でコード化されたＲＮＡのヌクレオチド配列又はその一部と塩基対形成する，請求項２３に記載のｓｉＮＡ分子。
アンチセンス領域の約２１個のヌクレオチドが，Ｈａｉｒｌｅｓｓ遺伝子でコード化されたＲＮＡのヌクレオチド配列又はその一部と塩基対形成する，請求項２３に記載のｓｉＮＡ分子。
前記アンチセンス領域を有する断片の５’−末端が，任意にてリン酸基を有する請求項９に記載のｓｉＮＡ分子。
薬剤的に許容される担体又は希釈剤中に，請求項１に記載のｓｉＮＡ分子を含有する組成物。
Ｈａｉｒｌｅｓｓ遺伝子でコード化されたＲＮＡが，ジェンバンク受入番号（ＧｅｎｂａｎｋＡｃｃｅｓｓｉｏｎＮｏ）ＮＭ＿０１８４１１を含む請求項１に記載のｓｉＮＡ。
前記ｓｉＮＡがＳＥＱＩＤＮＯ１〜１１３８のいずれかを含む，請求項１に記載のｓｉＮＡ。
薬剤的に許容される担体又は希釈剤と共に請求項３２に記載のｓｉＮＡを含有する組成物。
薬剤的に許容される担体又は希釈剤と共に請求項３３に記載のｓｉＮＡを含有する組成物。