JP2007228920A - 新規なインテグラーゼおよびその遺伝子 - Google Patents
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Abstract
【解決手段】下記の(A)及び(B)の理化学的性質を有する新規インテグラーゼ、その遺伝子等を提供する。このような新規なインテグラーゼを使用することで、従来問題であった遺伝子治療あるいは真核生物のゲノム工学による育種における非効率な標的遺伝子組み込みが改善され、さらに副生する部位非特異な遺伝子組み込みを抑制し、効率的な標的遺伝子組み込みを可能とする。
(A)作用および基質特異性;
下記の2種のDNA配列間(attBおよびattP)で部位特異的な組換えを触媒する。
attB:5’-TCGATCAGCTCCGCGGGCAAGACCTTCTCCTTCACGGGGTGGAAGGTCGG-3’
attP:5’-GTTCCAGCCCAACAGTGTTAGTCTTTGCTCTTACCCAGTTGGGCGGGATA-3’
(B)分子量;
約66.5Kd(キロダルトン)である。
Description
(A)作用および基質特異性;
下記の2種のDNA配列間(attBおよびattP)で部位特異的な組換えを触媒する。
attB:5’-TCGATCAGCTCCGCGGGCAAGACCTTCTCCTTCACGGGGTGGAAGGTCGG-3’
attP:5’-GTTCCAGCCCAACAGTGTTAGTCTTTGCTCTTACCCAGTTGGGCGGGATA-3’
(B)分子量;
約66.5Kd(キロダルトン)である。
(4)インテグラーゼ遺伝子が、配列番号2に示す塩基配列または該塩基配列の一若しくは数個の塩基が欠失、置換若しくは付加された塩基配列を有するものである、上記(3)記載の遺伝子。
(6)上記(3)叉は(4)記載の遺伝子とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつインテグラーゼ活性を有するポリペプチドをコードするDNA断片。
(8)細胞内における部位特異的遺伝子組換えもしくは標的遺伝子組み込みを誘導する方法であって、酵素として上記(3)〜(6)いずれか1項に記載のインテグラーゼ遺伝子叉はDNA断片を用いて調製したインテクラーゼ活性を有するものを使用する方法。
本発明のインテグラーゼは、下記の理化学的性質を有するものである。
(A)作用および基質特異性
下記の2種のDNA配列間(attBおよびattP)で部位特異的な組換えを触媒する。
attB:5’-TCGATCAGCTCCGCGGGCAAGACCTTCTCCTTCACGGGGTGGAAGGTCGG-3’
attP:5’-GTTCCAGCCCAACAGTGTTAGTCTTTGCTCTTACCCAGTTGGGCGGGATA-3’
(B)分子量
約66.5kd(キロダルトン)である。
このように調製されたインテグラーゼ遺伝子を適当なベクターに挿入し、真核生物細胞に注入すること、あるいはインテグラーゼ遺伝子のmRNAを真核生物細胞に注入することで、attBとattP DNA配列を含有するDNA間で部位特異的組換えを誘導することができる。具体的には、文献(Thyagarajan, B., et al., Mol. Cell Biol., 21, 3926-3934 (2001)、Gtoth, A. C., et al., Genetics, 166, 1775-1782 (2004))などの方法に準じて実施できる。
プラスミドpGEX−6P−1(GE Healthcare Bioscience社より入手)を鋳型として、以下に示す2種類のプライマーDNAを常法に従って合成し、PCR法によりGST(グルタチオンS−トランスフェラーゼ)遺伝子を増幅した。
プライマー(B)5'-TCCCAGGGGCCCCTGGAACAGAACTTCCAGATCCGATTTTGGAGG-3'
プライマー(D)5'-AAAACCATGGGACGGATCCTCACGCCGCCGCTGTGAACCC−3’
プラスミドpETGST−TG1を保持する大腸菌BL21(DE3)菌をアンピシリンを100μg/ml含有するLB培地で30℃で2時間培養後、終濃度1mMとなるようにIPTGを添加し、25℃で3時間培養した。遠心分離により菌体を回収し、1xPBS緩衝液((140mM NaCl、2.7mM KCl、10.1mM Na2HPO4、1.8mM KH2PO4、pH7.3)で再懸濁した。超音波破砕を30秒間、2回行い、遠心分離によって上清を得た。この上清からBulk GST Purification Module(GE Healthcare Biosciences社製)を用いてGST−TG1インテグラーゼ融合蛋白質を精製した。
TG1インテグラーゼの基質となるattB断片の調製のため、Streptomyces vermitilisの染色体の一部を含むコスミドCL_237_A07(北里大学より入手)を鋳型として、以下に示す2種類のプライマーDNAを常法に従って合成し、該菌株のattB配列を含む500bpのDNA断片をPCR法により増幅した。
5’−TTCCAGGGGCCCCTGAGTACTGCCGAGCGGCCGGATGTCGG−3’
(TG1attB500−3')
5’−AAAACCATGGGACGGATCCCCCGGCTGCTGCTCGTCAAC−3’
Claims (8)
- 下記の理化学的性質を有する新規インテグラーゼ。
(A)作用および基質特異性;
下記の2種のDNA配列間(attBおよびattP)で部位特異的な組換えを触媒する。
attB:5’-TCGATCAGCTCCGCGGGCAAGACCTTCTCCTTCACGGGGTGGAAGGTCGG-3’
attP:5’-GTTCCAGCCCAACAGTGTTAGTCTTTGCTCTTACCCAGTTGGGCGGGATA-3’
(B)分子量;
約66.5Kd(キロダルトン)である。 - 配列番号1に示すアミノ酸配列または該アミノ酸配列の一若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列を有する、請求項1記載のインテグラーゼ。
- 配列番号1に示すアミノ酸配列または該アミノ酸配列の一若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列をコードするインテグラーゼ遺伝子。
- インテグラーゼ遺伝子が、配列番号2に示す塩基配列または該塩基配列の一若しくは数個の塩基が欠失、置換若しくは付加された塩基配列を有するものである、請求項3記載の遺伝子。
- 遺伝子が、アクチノファージTG1に由来するものである、請求項3叉は4記載の遺伝子。
- 請求項3叉は4記載の遺伝子とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつインテグラーゼ活性を有するポリペプチドをコードするDNA断片。
- 細胞内における部位特異的遺伝子組換えもしくは標的遺伝子組み込みを誘導する方法であって、酵素として請求項1又は2記載のインテグラーゼを使用する方法。
- 細胞内における部位特異的遺伝子組換えもしくは標的遺伝子組み込みを誘導する方法であって、酵素として請求項3〜6いずれか1項に記載のインテグラーゼ遺伝子叉はDNA断片を用いて調製したインテクラーゼ活性を有するものを使用する方法。
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