JP2007154066A - 機能性赤外蛍光粒子 - Google Patents
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Abstract
【解決手段】 被検物質に結合することが可能な官能基または物質を有して成る赤外蛍光粒子であって、赤外領域の波長の励起光を照射すると赤外領域の波長の蛍光を放射する赤外蛍光粒子。
【選択図】 なし
Description
(実施例1)
特許公報3336572号の実施例1に従って、「被検物質に結合することが可能な官能基または物質」が固定化される前の赤外蛍光粒子(以下、「赤外蛍光粒子A」ともいう)を合成した。具体的には、Nd2O3:3.5g,Yb2O3:4.0g,Y2O3:18.0gおよびH3PO4:60.0gから成る原料を十分に混合し、アルミナ製の蓋付きルツボに充填した後、電気炉に入れ、室温から700℃位まで、一定昇温速度で2時間かけて昇温し、その後、700℃で6時間焼成した。焼成終了後、直ちに電気炉から取り出し、空気中で放冷した。次いで、ルツボに100℃の熱湯を入れ、煮沸した。その結果得られた蛍光粒子をルツボから取り出し、1規定の硝酸で洗浄し、水洗し、乾燥を行った。以上の操作により、一般式Nd0.1Yb0.1Y0.8PO4で表される赤外蛍光粒子Aを得た。この赤外蛍光粒子Aは、「被検物質に結合することが可能な官能基または物質」が固定化されていない。赤外蛍光粒子Aでは、励起光スペクトルのピーク波長が約810nmの励起光を照射すると約980nmの蛍光スペクトルのピーク波長が得られた。
実施例1の赤外蛍光粒子Aの5重量部を水/エチルアルコール(体積比1/1)に分散させ、アミノ基を有するシランカップリング剤を1重量部混合して1時間撹拌した後、遠心分離に付して上澄みを除去し、次いで120℃で乾燥させた。これにより、アミノ基が固定された赤外蛍光粒子を得た。
アミノ基を有するシランカップリング剤の代わりにエポキシ基を有するシランカップリング剤を用いたこと以外は、実施例2と同様の操作を行った。これにより、エポキシ基が固定された赤外蛍光粒子を得た。
実施例3で得られたエポキシ基が固定された赤外蛍光粒子1重量部を5重量%エタノールアミン水溶液20重量部に分散させて、一晩撹拌した後、水、アセトンによる洗浄を繰り返し、水酸基が固定された赤外蛍光粒子を得た。次いで、かかる水酸基が固定された赤外蛍光粒子1重量部をピリジン20重量部に分散させ、トシルクロライド0.2重量部を加え一晩撹拌した後、トルエンによる洗浄を4回繰り返した。以上の操作によって、トシル基が固定された赤外蛍光粒子を得た。
実施例2で得られた赤外蛍光粒子の1重量部を水に分散させた後、10mg/mlの水溶性カルボジイミド(1‐エチル‐3‐(3‐ジメチルアミノプロピル)カルボジイミド塩酸塩)100重量部を加えて撹拌した後、遠心分離に付して上澄み除去した。次いで、水を加えて撹拌・遠心分離・上澄み除去する洗浄操作を3回繰り返した。PBSバッファー(PBS:phosphate buffered saline)およびストレプトアビジン0.06重量部を加えて37℃にて2時間反応させた後、遠心分離に付して上澄みを除去し、その後、PBSによる洗浄工程を5回繰り返した。これにより、ストレプトアビジンが固定された赤外蛍光粒子を得た。
実施例3で得られたエポキシ基が固定された赤外蛍光粒子の1重量部をPBS100重量部に分散させた後、ストレプトアビジン0.06重量部を加え一晩撹拌した。次いで、PBSによる洗浄を3回繰り返した。これにより、ストレプトアビジンが固定された赤外蛍光粒子を得た。
実施例4で得られたトシル基が固定された赤外蛍光粒子の1重量部をPBS100重量部に分散させた後、ストレプトアビジン0.01重量部を加えて一晩撹拌した。次いで、PBSによる洗浄を3回繰り返した。これにより、ストレプトアビジンが固定された赤外蛍光粒子を得た。
実施例1の赤外蛍光粒子Aの代わりに実施例1で得られたシリカが固定された赤外蛍光粒子を用いたこと以外は、実施例2と同様な操作を行った。つまり、実施例1で得られたシリカが固定された赤外蛍光粒子5重量部を水/エチルアルコール(体積比1/1)に分散させ、アミノ基を有するシランカップリング剤を1重量部混合して1時間撹拌した後、遠心分離に付して上澄みを除去し、次いで120℃で乾燥させた。これにより、アミノ基が固定された赤外蛍光粒子を得た。
実施例2で得られた赤外蛍光粒子の代わりに実施例8で得られた赤外蛍光粒子を用いたこと以外は、実施例5と同様な操作を行った。つまり、実施例8で得られたアミノ基が固定された赤外蛍光粒子を水に分散させた後、10mg/mlの水溶性カルボジイミド(1‐エチル‐3‐(3‐ジメチルアミノプロピル)カルボジイミド塩酸塩)100重量部を加えて撹拌した後、遠心分離に付して上澄み除去した。次いで、水を加えて撹拌・遠心分離・上澄み除去する洗浄操作を3回繰り返した。次いで、PBSバッファーおよびストレプトアビジン0.06重量部を加えて37℃にて2時間反応させた後、遠心分離に付して上澄み除去し、その後、PBSによる洗浄工程を5回繰り返した。これにより、ストレプトアビジンが固定された赤外蛍光粒子を得た。
表面に何も固定されていない赤外蛍光粒子を得た。つまり、実施例1の過程で得られた赤外蛍光粒子Aを用いた。
表面に何も固定されていない有機系赤外蛍光体を準備した。具体的には、赤外蛍光有機色素であるIRDye800 Conjugated Streptavidinをそのまま用いた。
表面に何も固定されていない可視蛍光体を準備した。具体的には、可視蛍光顔料を含んだシンロイヒカラーベースSW−13をそのまま用いた。
(核酸の吸着量の確認試験)
上記の実施例1および比較例1の赤外蛍光粒子に対する核酸(λDNA)の吸着量を確認するために、以下の試験を実施した。なお実施例1の赤外蛍光粒子を用いた場合について説明するが、比較例1の赤外蛍光粒子を用いた場合でも同様の操作となる。
(A)試剤
(イ)実施例1の赤外蛍光粒子を滅菌水に分散させて、0.2mg/mlの分散液を調製した。
(ロ)核酸を単離するための生物試料として、λDNA(ナカライテスク社)を滅菌水で希釈し、10μg/100μlのλDNA溶液を調製した。
(ハ)核酸抽出用溶液として、カオトロピック物質を含む緩衝液であるバッファーA〔7Mグアニジン塩酸塩(ナカライテスク社)、50mMTris−HCl(シグマ社)、pH7.5〕を用いた。
(ニ)洗浄液として、カオトロピック物質を含んだ緩衝液であるバッファーA〔7Mグアニジン塩酸塩(ナカライテスク社)、50mM Tris−HCl(シグマ社)、pH7.5〕を用いた。
(ホ)高濃度の塩を除去するための試剤として、70重量%エタノール溶液と、アセトン溶液を用いた。
(ヘ)実施例1の赤外蛍光粒子に結合した核酸を回収するための溶離液として、滅菌水を用いた。
(1)λDNA溶液100μlに、核酸抽出用溶液1,000μlを注入し、混合した。
(2)その後、実施例1の赤外蛍光粒子の分散液20μlを加えた。
(3)約2分毎に混合しながら、室温で10分間放置した。
(4)遠心分離により、赤外蛍光粒子をチューブ底部に集めた。
(5)ピペットで溶液を吸引し、排出した。
(6)チューブにグアニジン塩酸塩を含む洗浄液を1cc注入した。
(7)実施例1の赤外蛍光粒子と十分混合したのち、再度、遠心分離を行い、上記と同様にして溶液を廃棄した。
(8)洗浄操作を再度繰り返した。
(9)1ccの70重量%エタノールで上記と同様の方法により、核酸が結合した赤外蛍光粒子を洗浄し、高濃度のグアニジン塩酸塩を取り除いた。
(10)再度、1ccの70重量%エタノールと1ccアセトンで洗浄した。
(11)約56℃のヒートブロックに上記チューブを設置し、約10分間放置して、チューブ内および赤外蛍光粒子内のアセトンを完全に蒸発させて除去した。
(12)上記方法で核酸が結合した赤外蛍光粒子に、100μlの滅菌水を加え、約56℃のヒートブロックに上記チューブを設置し、2分毎に混合操作しながら10分間放置した。
(13)次いで、遠心分離に付し、回収する溶液をピペットで吸引し、別の新しいチューブに移した。通常、回収量は70μl程度とした。
(14)このように回収した核酸について、吸光度計(日本分光製、V−570)を用いることによって、その吸光度(OD 260nm)を測定し、核酸の濃度を求めた。そして、この濃度に回収容量をかけて、核酸回収量を求めることによって、核酸の吸着量を得た。
実施例5、実施例6、実施例7および実施例9で得られた、ストレプトアビジンが固定化された赤外蛍光粒子の5μgに、20ng/mlのビオチン化HRP(ホース・ラディッシュ・ペルオキシダーゼ)100μlを加えて30分撹拌し、さらにテトラメチルベンジジン(TMB)100μlを加えて30分静置した。1N硫酸200μlで反応を停止させた後、発色の強さを分光光度計(日本分光製、V−570)を用いて波長450nmの吸光度として計測し、濃度既知の試料との比較に基づいて、ストレプトアビジンおよびビオチン化HRPの結合量を求めた。
実施例1〜9で得られた赤外蛍光粒子および比較例1〜3の材料に対する吸着量または結合量の結果を表1に示す。
次に、各種レーザーおよびSiフォトダイオードを組み合わせて、λDNA、ストレプトアビジンもしくはビオチン化HRPが結合または吸着した赤外蛍光粒子について蛍光強度を測定した。
Claims (11)
- 被検物質に結合することが可能な官能基または物質を有して成り、赤外領域の波長の励起光を照射すると赤外領域の波長の蛍光を放射する、赤外蛍光粒子。
- 前記赤外蛍光粒子に対する励起光スペクトルのピーク波長および蛍光スペクトルのピーク波長が近赤外領域の範囲にあることを特徴とする、請求項1に記載の赤外蛍光粒子。
- 前記赤外蛍光粒子に対する励起光スペクトルのピーク波長が700〜1100nmの範囲にあり、蛍光スペクトルのピーク波長が850〜1200nmの範囲にあることを特徴とする、請求項2に記載の赤外蛍光粒子。
- 前記励起光スペクトルのピーク波長と前記蛍光スペクトルのピーク波長との差が、50nm以上であることを特徴とする、請求項2または請求項3に記載の赤外蛍光粒子。
- 前記赤外蛍光粒子が2nm〜5μmの粒径を有することを特徴とする、請求項1〜4のいずれかに記載の赤外蛍光粒子。
- 前記赤外蛍光粒子が金属酸化物から形成されていることを特徴とする、請求項1〜5のいずれかに記載の赤外蛍光粒子。
- 前記金属酸化物が、遷移金属元素、リン元素および酸素元素から成ることを特徴とする、請求項6に記載の赤外蛍光粒子。
- 前記赤外蛍光粒子が、一般式A1−x−y Ndx Yby PO4(式中、AはY,LuおよびLaからなる群から選択される少なくとも1種以上の元素であり;0<x≦0.5;0<y≦0.5および0<x+y<1である)で表される金属酸化物から形成されていることを特徴とする、請求項7に記載の赤外蛍光粒子。
- 前記被検物質が、生体組織、微生物および細胞から成る群から選択される少なくとも1種以上の被検物質であることを特徴とする、請求項1〜8のいずれかに記載の赤外蛍光粒子。
- 前記官能基が、アミノ基、カルボキシル基、エポキシ基、チオール基、ニトロ基、スクシンイミド基、マレイミド基、ホルミル基、ヒドラジン基およびトシル基から成る群から選択される少なくとも1種以上の官能基であることを特徴とする、請求項1〜9のいずれかに記載の赤外蛍光粒子。
- 前記被検物質に結合することが可能な物質が、シリカ、ヒドロキシアパタイト、リガンド、レセプター、抗原、抗体、ビオチン、アビジン、プロテインA、プロテインG、核酸および糖鎖から成る群から選択される少なくとも1種以上の物質であることを特徴とする、請求項1〜9のいずれかに記載の赤外蛍光粒子。
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