JP2007082475A

JP2007082475A - 生物学的相互作用の解析方法および試薬キット

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Publication number: JP2007082475A
Application number: JP2005275984A
Authority: JP
Inventors: Yoko Ohashi; 陽子大橋
Original assignee: Olympus Corp
Current assignee: Olympus Corp
Priority date: 2005-09-22
Filing date: 2005-09-22
Publication date: 2007-04-05
Anticipated expiration: 2025-09-22
Also published as: JP5226179B2

Abstract

【課題】
生体試料中の任意の相互作用を直接的かつ低侵襲に検出すること。特に、発光によるＲＮＡ干渉のような微弱光信号の変化に起因する画像情報を、細胞単位で個別に撮像する解析方法および試薬キットを提供すること。
【解決手段】
細胞等の生体試料中の相互作用を撮像する撮像方法であって、前記相互作用し得る物質の少なくとも一方に対して発光物質を標識した相互作用物質を１以上の細胞内に存在せしめ、相互作用による結果としての発光物質を光学的に撮像し、撮像した光学的情報を単一の細胞について画像化する工程を含み、画像表現が相互作用に起因する微弱光の有無および／または量を示していることを特徴とする。
【選択図】図２

Description

本発明は、種々の生体に関連する情報を画像化する方法および、細胞等の生体試料中の相互作用し得る物質について視覚的に相互作用を検出する解析方法および試薬キットに関する。詳しくは、本発明は、細胞内の相互作用を生物発光を用いて定量的に検出するレポータアッセイに適用する方法に関する。一例として、本発明は、ＲＮＡ干渉を用いた解析方法および試薬キットを包含する。

生体を内外から調べる技術が目覚ましく発展している。地球上のあらゆる生体は、有望な生物学的用途としての診断、治療、予防医療等の医学的成果に直接的かつ一義的に適用できる生体関連情報を有している。生体関連情報の一例として、生体内または生体外で生きた状態の細胞（ないし細胞を含む生物学的材料）から得られる生物学的相互作用（以降、相互作用と略称する）を得る場合がある。生細胞における相互作用を調べる技術の多くは光信号を発生するレポータ物質を細胞の外部から検出する方法および試薬キットによって実現される。かかるレポータ物質として、例えばオワンクラゲに由来する緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）を生細胞に適用して、画像解析する方法が知られている。中でも、RNA 干渉 (RNAi) は、近年急速に頭角を現してきた有力なレポータアッセイを用いた遺伝子機能解析法であり、細胞や生体内の特異的な標的 mRNA を分解することにより、コードされているタンパク質の発現をノックアウトあるいはノックダウンして遺伝子の機能を調べる方法である。RNA干渉は、siRNA導入後、siRNAが生物学的効果を及ぼすのに十分な時間（2時間〜72時間程度）で効果が見られるが、対象や実験条件により、RNA干渉効果の程度、RNA干渉効果が出るまでの時間が異なっている。従来は、或る時間ポイント毎の細胞を用意し、ノーザン解析、RT-PCR、免疫標識などの手法で確認を行っていた。
特開２００３−２１９８９３

しかしながら、一般に従来の方法では、siRNAの干渉効果の程度、RNA干渉効果が出るまでの時間を調べるためには、多数の生物試料を用意する必要があり、測定間隔も３時間から６時間程度といった粗い条件設定になることが多い。また、siRNAトランスフェクションの効率は、細胞の性質、細胞周期の時期、細胞の培養密度、トランスフェクトされる材料によっても異なるので、目的遺伝子が発現した細胞以外の細胞までも一群として蛍光総量として紛れ込んでしまい、平均した測定データは個々の結果を正確に反映できない場合がある。

従って、本発明は、個々の細胞内外で行われるＲＮＡ干渉の結果を精度よく解析できる方法および試薬キットを提供することを目的とする。また、本発明は、長期間にわたる遺伝子発現量を経時的に解析することが容易な方法および試薬キットを提供することを目的とする。

ルシフェラーゼ遺伝子を導入した細胞の発光像およびＲＮＡ干渉による発光像を，以下の条件を満たす光学系で撮像する。本出願人による光学的実験によれば、対物レンズの開口数（ＮＡ）および投影倍率（β）で表される（ＮＡ÷β）の２乗の値が０．０１以上の光学系で撮像することによって、単一の細胞から発生する発光だけで画像化できることが証明された（特願２００５−２６７５３１号参照）。さらに、本出願人は、検討を進め、同一シャーレ内で培養された複数の細胞において、遺伝子発現の変動パターンが異なることも発見した（特願２００５−４４７３７号参照）。驚くべきことに、上記の撮像条件は、ＲＮＡ干渉における微弱な発光画像にも適用でき、短い時間（例えば１分〜２０分）で生物発光のような微弱な発光成分による細胞画像を撮像できる。さらに、発明者が追究した光学的条件によれば、撮像装置の対物レンズを開口数（ＮＡ）／投影倍率（β）の２乗で表される光学的条件が０．０７１以上である場合に、１〜５分以内で画像化でき、画像解析も可能な細胞画像を提供できること突き止めた。

従って、本発明の解析方法は、細胞内外の相互作用を画像情報に基づいて解析する方法において、前記相互作用し得る物質の少なくとも一方に対して生物学的励起物質としての発光物質を標識した相互作用物質を１以上の細胞内に存在せしめ、相互作用による結果としての発光を光学的に撮像し、撮像した光学的情報を単一の細胞について画像化する工程を含み、画像表現が相互作用に起因する微弱光の有無および／または量を示していることを特徴とする。

ここで、本発明は、前記生体試料として生細胞を含んでいるのが好ましい。

また、本発明は、生物学的励起物質として生物発光をもたらす成分を含んでいるのが好ましい。本発明は、試薬キット化することが可能であり、相互作用を誘起し得る成分および上記発光物質の発光を誘起し得る基質成分を含んでいることを特徴とする。

また、本発明は、上記の方法のいずれかにおいて、生物学的励起物質の活性に影響を与える薬剤との相互作用を評価する工程を含んでいるのが好ましい。

なお、本発明では、特別に説明する場合を除いて「発光」とは生物発光を意味し、「発光物質」とはＢＲＥＴにおいて蛍光物質に対し励起エネルギーを与えることができる任意の発光を有する物質を意味する。

発光を用いたレポーターアッセイでRNA干渉を行うことで、トランスフェクションされた細胞のみに関して連続的なデータ取得を行う事で、より精度の高いデータが得られる。また、長期間にわたる遺伝子発現量を経時的にみることも可能となるので、創薬研究等の臨床用途に広く利用可能である。

以下、本発明を図面を用いて詳細に説明する。図１は、本発明の方法を実施するための装置の概要を示すものである。図１に示すように、本発明にかかる撮像方法を実施するための装置は、撮像対象であるサンプル１を短い露出時間で、ひいてはリアルタイムに撮像するためのものであり、対物レンズ２と集光レンズ３とＣＣＤカメラ４とモニタ５とで構成されている。なお、当該装置は図示の如くズームレンズ６をさらに備えてもよい。これらの基本構成を備えるい装置を、本発明では発光顕微鏡と称することとする。発光顕微鏡は、暗視野での撮像を行うために、適宜、遮光用のフタまたはハウジングによって収容されているのが好ましい。また、適当な培養条件を維持できる培養装置を発光顕微鏡と一体に組合せることで、撮像を長期間に亘り、自動的に実行できる。なお、撮像を行う機構を有する構造であれば、顕微鏡の形態である必要はなく、マイクロプレートリーダーのような測定機器の形態であってもよい。

サンプル１は、発光試料であり、例えば、発光タンパク質（例えば導入された遺伝子（ルシフェラーゼ遺伝子など）から発現された発光タンパク質）や、発光性の細胞や、発光性の細胞の集合体や、発光性の組織試料や、発光性の臓器や、発光性の個体（動物など）などである。また、サンプル１は、具体的には、ルシフェラーゼ遺伝子を導入した発光細胞でもよい。対物レンズ２は、開口数（ＮＡ）および投影倍率（β）で表される（ＮＡ÷β）の2乗の値が０．０１以上のものである。集光レンズ３は、対物レンズ２を介して到達したサンプル１からの発光を集める。ＣＣＤカメラ４は、０℃程度の冷却ＣＣＤカメラであり、対物レンズ２や集光レンズ３を介してサンプル１を撮像する。モニタ５はＣＣＤカメラ４で撮像した画像を出力する。

RNA干渉実験評価を行うため、蛍光タンパク質GFPに対するsiRNAを用いて、RNA干渉の程度を確認した。HeLa細胞に、pEGFP-C1 Vector（BDクロンテック）を導入し、GFPを発現させた細胞に、RNA干渉を起こすためのsiRNAをトランスフェクションした。トランスフェクション後、蛍光顕微鏡IX81（オリンパス製）で観察を行ったところ、siRNA導入を行っていない細胞と比較し、GFPの細胞内での発現量が減少していた。

ルシフェラーゼをレポーター遺伝子としてRNA干渉検出を行うため、ｐｓｉＣＨＥＣＫ^TM−２ Vectors（プロメガ株式会社）のマルチクローニングサイトにGFP遺伝子を導入し、コンストラクトの作製を行った。ｐｓｉＣＨＥＣＫ^TM−２ Vectorのようなベクターを使用した場合、目的遺伝子に対する合成siRNAによるRNA干渉機構が開始されると、標的遺伝子とつながるウミシイタケルシフェラーゼ遺伝子も切断、分解され、これに伴ってウミシイタケルシフェラーゼ活性が減少する。本実施例では、かかる活性の減少を顕微鏡下で継続的に撮像することによって、簡便にRNA干渉効果をモニタリングすることを試みた。

HeLa細胞に作製したコンストラクトを導入後、siRNAの効果を確認した条件でGFPに対するsiRNAのトランスフェクションを行い、発光顕微鏡での観察を行った。35mm系のガラスボトムディッシュ内の細胞に、ＥｎｄｕＲｅｎ^TM Live Cell Substrate（プロメガ株式会社）を添加後、発光顕微鏡のインキュベータ内にＣＯ₂ガスを導入し、37℃にて培養を行いながら3日間の観察を行った。

発光顕微鏡で経時的観察を行った結果を図２に示す。siRNAを導入したHeLa細胞およびネガティブコントロールとしてsiRNA非導入のHeLa細胞の比較を行ったところ、siRNA導入したHeLa細胞株のみに発光量の減少が見られていた。GFPへのRNA干渉がウミシイタケルシフェラーゼからの発光の減少として検出可能であった。

以上、本発明を生細胞内のＲＮＡ干渉を画像解析する例によって説明したが、本発明は、上述した実施の形態および実施例に内在し、且つこの出願より前に他人（または他社）によって出願等されたあらゆる発明によっても自明でないような、あらゆるカテゴリーに属する技術思想を包含するものであり、その技術思想が及ぶ均等物ないし本発明で開示されないあらゆる下位概念の発明を包括する権利範囲を有する。

なお、本発明は、次のような考察に基づき派生する種々の変形例も直接的かつ一義的に包含する。なぜなら、種々の変形例は、本発明と共通する考察を必ず経由して種々の応用に種々転用されるだけだからである。

本発明に関する考察
ＲＮＡ干渉は生体内外のタンパク相互作用の有無を着実に反映する典型的手法である。相互作用を光強度だけで検出しようとすると、非特異的反応や挟雑物ないし自家蛍光等のノイズ信号により信頼性が低くなる。一般に蛍光は、外部から照射された励起光の照射エネルギーにより励起される。従来の生体に関する画像化方法は、なるべく視覚的に見えるように可視化するような過大な照射エネルギーを利用している。蛍光に比べ発光は光励起が要らないので、光毒性も無く、操作上も簡単で実施し易い。また、蛍光は強度変化が不安定だが、発光は安定である。励起光照射による過大なエネルギーによる蛍光検出から発想できない（非自明な）視点として、生物発光は変化量の評価（例えば、遺伝子発現の変動のモニタリング）や連続的かつ広視野の受光に適している。換言すると（上位化すると）、細胞内の活性変化に応じて光強度が変わるような検査項目は、過大な光エネルギーによる画像情報からは実行困難である。また、分光測定やフォトンカウントによる生物発光の検出からは発想できない（非自明な）視点として、同一視野ないし同一試料中の複数の検出対象を個別に比較したり、個々の変化量を評価することである。そもそも、生物発光は、暗すぎて、肉眼または顕微鏡による接眼レンズによって観察できない。従来の顕微鏡がそうであったように、暗すぎて画像を取得できなかった場合、細胞１個づつ取り出したり、別々の容器に遠ざけて検査するしかないので、非常に時間も工数も必要となる。ましてや、細胞内の検査を、１個づつ細胞を溶解したり、すり潰す手技を施すことは面倒である。別々の容器や個別の手技を用いることは、生きた細胞ないし組織を継続的ないし複数調べるには不適である。本発明の方法を適用すれば、１個づつの細胞等の試料について個別に遺伝子発現等の変化を継続的かつ複数調べることができる。さらに、何度でも同じ細胞からデータが取れるという魅力もある。これらの考察内容を総合すれば、本発明の新規性および進歩性は容易に理解されるであろう。

本発明の方法を実施するための装置の概要を示す図である。本発明の方法および試薬キットによるＲＮＡ干渉の経時的解析の結果を示す図である。

符号の説明

１：サンプル
２：対物レンズ
３：集光レンズ
４：ＣＣＤカメラ
５：モニタ
６：ズームレンズ

Claims

細胞内外の相互作用を画像情報に基づいて解析する方法において、前記相互作用し得る物質の少なくとも一方に対して生物学的励起物質としての発光物質を標識した相互作用物質を１以上の細胞内に存在せしめ、相互作用による結果としての発光を光学的に撮像し、撮像した光学的情報を単一の細胞について画像化する工程を含み、画像表現が相互作用に起因する微弱光の有無および／または量を示していることを特徴とする生物学的相互作用の解析方法。
前記生体試料が、生細胞を含んでいることを特徴とする請求項１に記載の方法。
請求項１に記載の解析方法において、生物学的励起物質が、生物発光をもたらす成分を含んでいる解析方法。
請求項１から３のいずれかに記載の方法において、生物学的励起物質の活性に影響を与える薬剤との相互作用を評価する工程を含んでいる解析方法。
請求項１または４に記載の方法において、上記相互作用を誘起し得る成分および上記発光物質の発光を誘起し得る基質成分を含んでいる試薬キット。