JP2006522923A - バイオセンサー・システム - Google Patents

Abstract

試料中の分析物を電気化学的手法により測定するためのバイオセンサシステムおよび方法であって、分析物反応物質が試料と混合されて反応液を形成し、分析物検出電流を測定するために電極と接触する。該分析物検出電流は、反応液中で生じる分析物特異的反応および電極表面を通る電子の移動を含む電極反応からなる反応順序によってもたらされる試料中の分析物濃度であることを特徴とする。分析物検出電流対時間曲線の複数の値を測定し、評価アルゴリズムによって測定された値から分析物濃度を算出する。直流電圧が分析物特異的反応のあいだ前記電極に印加され、該分析物特異的反応および電極反応が同時に発生し、それによって時間に対して電流が上昇する部分からなる分析物検出電流対時間曲線となり、前記分析物検出電流が前記上昇部分の少なくとも２つの時点において測定され、前記少なくとも２回の測定値が温度誤差補正のための評価アルゴリズムにおいて使用されることにより高精度で迅速な結果が達成される。

Description

本願発明は血液サンプル中の検査対象成分を電気化学的手法で定量するためのシステムならびにその方法に関するものである。このようなシステムはバイオセンザー・システムと呼ばれることが多い。

医療を目的として、血液中に含有される成分であってその濃度が問題となるものについて、その成分の定量のために電気化学的手法が広く用いられている。このような検査対象成分が、多くの場合において酵素が該当するが何らかの特定の試薬とのあいだで特異的な反応を起すと該試薬、これが酵素の場合はこの酵素、の酸化状態が変化することになる。またこのような変化が進行する場合の反応進行速度は検査対象成分の濃度に依存する。一方、このような反応の反応速度は固体電極内における電荷の移動量として測定することが可能である。すなわち当該電極内における電荷の移動速度は該電極に一定の直流電圧を印加することに伴って発生する電流を測定することにほかならない。検査対象成分の濃度は、このようにして測定した電流値から算出される。

以上に述べた電気化学的試験に係わる反応の機序は図１に示すとおりである。まず検査対象成分Ａが酸化されて該検査対象成分の反応生成物Ｐに変化する反応の触媒として酵素が働く。一方該酵素はこの反応に伴って、Ｅ_oxで表される酸化された状態であったものから還元された状態のものＥ_redに変化する。すなわちこのように非常に選択的な酵素反応の進行にともなって電子が該検査対象成分側から酵素側に移動することになる。該酵素はさらにその電子を何らかの媒介成分に移転しもとの酸化された状態のものＥ_oxに戻ることになる。該媒介成分にあってはその酸化された状態にあったものＭ_oxから還元された状態のものＭ_redに変化する。さらにこの還元された状態の媒介成分は固体形状の電極ＥＬに電子を移動させることで酸化された状態のものに戻ることになる。

上述の原理に基づく試験手法が採用されている様々な実例の中で最も重要なものは糖尿病患者血液の糖濃度モニタリングに用いられるグルコース・テストである。糖尿病患者の健康状態は糖の血中濃度を如何に簡便にかつ正確に捉えるかによって大きく左右されることからこのグルコース・テストは、医療上の重要性に加えて営利事業としての重要性も高いものとなっている。グルコース・テストにおいて関係する一般的な酵素としてはグルコース・オキシダーゼやグルコース・デヒドロゲナーゼがあり、良く知られている媒介成分としてはフェロセン、フェロシアニドやフェニレンジアミンがある。

本願発明が有効に利用される分野の主たるものは、酵素を介在させ、かつ電流測定的手法を用いる上記分野であるが、中でも特にグルコースをその測定対象とするものといえる。しかし本願発明の応用分野はこれに留まるものではなく、次に示した酸化還元反応を含んでなる一連の酸化還元反応群のいずれかにおいて生成される成分の測定を目的とする電流測定的手法として広く利用できるものである。

Ａ）検査対象成分に特異的な酸化還元反応であって、該酸化還元反応が均一（液体）系内で進行するのに伴って生成される生成物が然るべく電圧を加えることで当該電極において酸化あるいは還元されることを特徴とする酸化還元反応、または
Ｂ）不均一系において進行する電極反応であって、検査対象成分に特異的な反応によって生成される生成物から電極に電子が移動するかあるいは該生成物に電極側から電子が移動することを特徴とする不均一系電極反応。

ここで述べた種々の反応はそれぞれが何段階かに区別できる反応で構成されていることは誰にでも理解されるところである。たとえば酵素が介在してＭ_redが生成される図１に示した反応は２段階からなる検査対象成分に関して特異的な反応である。しかし、ここで媒介成分の存在が必要となるのは当該酵素から固体形状の当該電極への電子の移動速度が小さすぎる場合のみである。したがって酵素あるいは電極の種類を適宜選択することでこのような媒介成分の存在が不要になることもある。また、逆にこのような媒介成分に係わる反応段階に加えて別の反応段階をも含む系に対する電気化学的テストとして本願発明を利用することも可能である。

この部分以降においては、記述する内容を単純化する目的で、媒介成分を還元状態にする酵素反応を反応Ａ（正方向反応）と電子を還元状態にある該媒介成分から電極に移転する再酸化反応を反応Ｂ（逆方向反応）とからなる反応系を例にとって説明する。しかしここでの説明によって本願発明の利用分野をこのような反応系に限ろうとするものではない。

検体である液体中に適当な電極を浸漬挿入する形式の電気化学的テストには様々な形態のものが存在する。本願発明はこのような様々な形態のものに利用できるが、中でも特に使い捨て型の分析検体エレメントを使用しまた解析機器部もそのような形式の分析検体エレメントを使用し検査を実施することを念頭に設計されているバイオセンサー・システムでの利用を主たる利用分野としている。一般にこのようなシステムにあっては個々のシステムにおいて使用される各構成部品はすべて当該システムと同一の製造元で開発され出荷される。分析検体エレメントは実施する分析に応じて選定された成分（以降にあっては「検査対象成分との反応試薬」と呼ぶ）の他、これに少なくとも２本の電極を組み合わせて構成される。システムを構成するもう一方の側である解析機器部にはバイオセンサーを固定するホルダーが備えられるのが一般的である。該ホルダーにバイオセンサーが固定されると該バイオセンサーに備わった電極と該解析機器部の電子部品間とに必要な電気的接続が形成される。

前記した検査対象成分との反応試薬は紙や多孔性プラスチック材のような多孔性部材に含浸されるようにして保持されることが多い。また該多孔性部材は前記した２本またはそれ以上数の電極材と接続するように配置されていると共に該多孔性部材には検体が注入される。近年にあってはこの分析検体エレメントには従来のものに替わって検査対象成分との反応試薬とそれに付随する電極の双方をキャピラリーの内部に収納したデザインのものが多用されるようになってきている。これを使用する場合には検体を該キャピラリーの開口端に滴下し、該検体が、その後、毛細管現象でその内部に吸入されていくことを期待するものである。検体の液がこのように吸入される工程と同時に、該検体液にはキャピリー内部の検査対象成分との反応試薬が混合あるいは溶解していくことになる。これによって液体反応系が形成され同時に該液体反応系と電極との接続も完成し、すなわち検査対象成分の検体液中の濃度に対応した検査対象成分感知電流の測定がなされることになる。本願発明はさらに詳細にはこのような「キャピラリー型バイオセンサー」に関するものである。

以上述べたような形式のバイオセンサーについての更なる詳細にあっては適宜これまでに公開された文献を参照できる。特にこれらの内でＷＯ９９／３２８８１には特にキャピラリー型バイオセンサー・システムに関する記述がある。該文献にはさらにそれまでに刊行されている該分野の文献が広範囲に収載されており、それらから本分野に係わる技術的知識をより詳細に吸収できる。本願はその明細書としてここに記載した他、ここで言及した公知文献に記載の事項をも併せて本願発明の前提となる技術とするものである。

バイオセンサーの出力に悪影響を及ぼすような誤差の原因にはいくつかあり、それぞれが問題となっている。このような原因の内の一つで重要なものは全血サンプル中の赤血球細胞の濃度、すなわちヘマトクリットのバラツキで、この問題については次の文献に記載がある。

タング他：「ケア実施現場用携帯型測定器によるグルコース測定におけるヘマトクリットの違いがもたらす影響について」、Tang et al.:“Effects of Different Hematocrit Levels on Glucose Measurement with Handheld Meters for Point-of-Care Testing”, Arch Pathol Lab Med, 2000, pp. 1135-1140
上記文献で著者は最新のバイオセンサー技術を持ってしても現実に起こりえる程度のヘマトクリット値のバラツキがグルコース値の測定においてその測定値の２０ないし３０％程度にも及ぶ大幅な誤差を生み出していると述べている。該文献にはこのような誤差の原因と考えられる要素が記載されており、この問題解決の必要性が論じられているものの、ヘマトクリット値に原因する誤差の補正方法を示すには至っていない。

上記とは別の誤差を発生する重要な原因に温度のバラツキがある。電流値測定型テストにおける測定値は測定対象である反応系の液体の温度に大きく依存する。このことから、検査システムによっては反応系液体の温度を慎重に一定温度にコントロールするための対策が必須とされる一方、別の検査システムにあってはそれに変えて、反応系の液体温度を測定しその測定結果の温度値に基づいて一定の計算を行ない、それにしたがって温度依存誤差の補正を行なうという方法が採られている。

前述のＷＯ９９／３２８８１には検体温度とヘマトクリットの双方による影響を補正するために交流を用いた測定を行なうことが記載されている。このような補正を目的に２ｋＨｚないし１０ｋＨｚ程度の交流電圧を当該電極間に印加し、当該検体を挿入したバイオセンサーの系が持つインピーダンスの実数成分ならびに虚数成分を測定するものである。これら測定値から該インピーダンスの大きさならびに位相角度を算出し算出された値に対応した補正係数を別途該測定器に記憶させておいた参照表から求めるというものである。ここで求めた補正係数を従来法により算出したグルコース値に適用して補正後のグルコース値を得ることになる。

本願発明は短時間で結果を出せる利点を損なうことなく高い精度の濃度測定値を得ることを目的になされたものであり、検体中の検査対象成分に関する電気化学的手法による測定を実行するバイオセンサー・システムを提案するものである。本願発明になる該システムは検査対象成分との反応試薬と少なくとも２本の電極、ならびに電子回路部とで構成されるが該検査対象成分との反応試薬は検体である液体と混合されて反応性混合液を形成し、反応性混合液が２本以上あるとした前記電極と接触を果たすことになり該電極間に直流電圧が印加されると該直流電圧が印加された時の検査対象成分の検体中の濃度に応じた大きさの電流が発生することから該検査対象成分の存在ならびに存在する濃度の測定が可能になり、該発生する電流は、当該液体反応系中で検査対象成分に特異的な反応ならびに電極表面を通る電子の流れを生起する電極反応を含む一連の反応が開始進行することによりもたらされるものであることを特徴とし、一方の前記電子回路部は、該電極に印加することが必要な直流電圧の発生源と時刻軸にそって変化する当該検査対象成分の存在に感応した電流値曲線を形成する複数個の値を複数の測定時点において測定し、該測定獲得した測定値に基づき当該検査対象成分の濃度値を一定の解析アルゴリズムにしたがい算出するための測定・解析用の電子回路部を含むものであり、該検査対象成分に特異的な反応が進行し続けるあいだ中継続して前記直流電圧は前記電極間に印加されるものであり、かつ該検査対象成分に特異的な反応と前記電極反応は同時に平行して生起するものであり、また該複数の反応の進行に対応して時刻軸に沿って変化する検査対象成分の検出を示す電流の曲線が描かれ、該曲線は時刻の経過と共に電流が増加する時刻領域を有するものであり、該検査対象成分の存在に感応し発生する電流は前記時刻経過と共に電流が増加する時刻領域内における少なくとも２時点において測定され、該少なくとも２時点分ある測定値を用い前記一定の解析アルゴリズムにしたがって計算を行なうことで温度による影響分誤差の補正を行なう。本願発明は以上説明したシステムに留まらず、それに加えてそれに相当する測定方法にも及ぶものである。

本願発明の発明者は観測対象の反応開始後の早期段階における電流測定値を用いることで精度の高い誤差補正が短時間の内にできることを発見した。ここに発見した事実の根拠・背景は本願明細書への添付図を参照しながら以下に説明する通りである。

図１については既に述べた通りである。

図２は米国特許番号５，２４３，５１６に開示されたものを転記するものである。従来技術に基づくテストにおいて採用される典型的な測定タイミングが示されている。解析機器部に分析検体エレメントを接続し当該電極に検査対象成分検出用電圧を印加する。検体試料が分析検体エレメントの検体試料挿入部位に挿入されることで電極間が電気的に接続されるまでは電流が流れないが、検体試料挿入部位に検体試料が挿入されると瞬時に電流のスパイク（CS:current spike）が検出される。該スパイクの発生は逆に分析機器の検体試料挿入部位に検体試料が挿入され電極間が接続されたことを示すものでもある。この時点を挿入感知点（DD:dose detect）と呼ぶ。このようにスパイクＣＳが検知された後は、すみやかに電極間に印加していた検体試料感知用電圧の印加を解除する。該スパイクＣＳの感知後はインキュベーション期にはいりこの期間に検査対象成分に特異的な反応、正方向反応が始まり進行する。電極反応（逆方向反応）の維持に必要な分析用電圧をこの正方向反応が始まった後に該電極間に印加する。図２の曲線はそれぞれ表示されたグルコース濃度（４濃度）における時刻軸ｔに沿った電流値Ｉ（ｔ）の変化を示すものである。このような直流電流値の対時刻軸曲線を「Ｉ（ｔ）曲線」と呼ぶことにする。

テストに必要なすべての条件が満たされた時にはＩ（ｔ）曲線の形は

に比例する特性関数に相当するものになる（ただし、当該測定用電子機器システムが置かれていた状態の差の影響が顕著なサージ期間ＳＴを過ぎた後において）。この特性関数に比例する曲線を「コットレル電流曲線」というが得られたＩ（ｔ）曲線がこの曲線を逸脱する場合はテストに必要な条件のすべてまたはその一部がなお満たされていないことを意味する。米国特許番号５，２４３，５１６は逆方向反応である電極反応が進行中である期間内の複数の時点において電流測定を複数回実施し図２に示したようなＩ（ｔ）曲線が前記コットレル電流の性質と矛盾しないことを単純な数学的手法にて確認するべきであることを提案し、この確認において矛盾することが判明した場合には当該システムに何らかの不備があるとしなければならないと記している。

図３の曲線は検査対象成分に特異的な反応すなわち正方向反応に必要なインキュベーション期間の最後の時点においてではなく、該インキュベーション期間の初期の時刻（好ましくは挿入感知点ＤＤのおいて、あるいは挿入感知点ＤＤに遅れること５００ミリ秒、より好ましくは３００ミリ秒、さらに好ましくは１００ミリ秒以内）において分析用電圧（逆方向反応である電極反応を進行させるに必要な直流電圧）を印加した時に得られるＩ（ｔ）曲線の代表的な形を示す。従来技術による場合にあっては検体試料感知用電圧を特別に印加することは考えられておらず、分析用電圧の印加を検体試料と電極との接続が達成される前の段階で開始していたに過ぎない。

Ｉ（ｔ）曲線が図３に示したような形を持つに至る背景には様々な要因が複雑に関係している。因みにこれら要因の一つは酵素反応の反応速度であるがこの反応速度は検査対象成分の濃度に依存するのみでなく、その他、温度や反応に関与する各種成分の拡散現象などの影響因子にも依存する（ここでいう拡散現象は温度や血液細胞のような検体試料中の粒子の存在に影響を受けるものである）。酵素反応で生成される生産物は生成されると同時に電極によって消費（逆方向反応の進行）される。この電極反応もまた多くの要素によって影響を受ける。その内の中心的なものは酵素反応の生産物の電極表面の近辺における濃度であり、その濃度自身は同成分の検体試料液体内における拡散し易さを決定する拡散条件に依存している。いずれにしろ本願発明にあってはＩ（ｔ）曲線に初期段階の期間の電流値動向を含めること、すなわち時間の経過と共に直流電流値が上昇するような反応の開始期の電流値動向を含めることが本願発明の特徴である。ここでいう直流電流値が時刻の経過と共に上昇することになる期間を上昇期間（RS:rising section）と呼ぶ。

実際に測定を実施した結果得られるＩ（ｔ）曲線は以上で説明した以上に複雑な形状を持つのが一般的でこれは個々のケースごとに異なる測定設備機器の設定状況に依存して定まる様々な形状を示すものである。特に分析用電圧を印加した直後の期間部分で該曲線が単調な上昇曲線になるとは限らない。図３に破線で示したごとく途中に極大部分を持つことも少なくない。しかし、このような形になる部分はこれまでに説明した一連の反応に対応するものではなく測定設備機器側の非定常状態、特に測定用電子部品回路内の状態がなお定常状態になっていないことに原因するものである。Ｉ（ｔ）曲線に関連して上述の部分で定義した上昇期間はこの部分的極大Ｍが現れるより以前の期間、すなわち一連の酸化還元反応に対応する部分の曲線を指すものである。

本願発明になるところであるが、検査対象成分の検知電流の測定は、Ｉ（ｔ）曲線の前記上昇期間ＲＳ内の時点（極大点Ｍになるまでの期間内の時点）において実施する測定であり上述のごとく複雑な状況において実施することが要求されるものの、このようにして得られる測定値はこの種に測定から導き出される解析結果の精度向上につながるのである。特に該上昇期間ＲＳ内の２点以上の時点において直流電流を測定することで反応混合物の温度の違いが原因となって発生する誤差を補正することが可能になる。また、この上昇期間における電流測定で得た電流値から検査対象成分濃度自身を算出することも併せて行なうものである。さらには、Ｉ（ｔ）曲線の上昇期間に当る期間内において交流測定をも実施できれば他の要因によって発生する誤差、特に検体試料のヘマトクリット値のバラツキが原因となり発生する誤差を補正することが可能となる。直流電流の測定と交流電流の測定は同時に平行して実施されること、すなわち該直流電流の測定期間と該交流電流の測定期間が同一の時間帯オーバーラップするように、例えその全期間にわたってオーバーラップするのでなくその一部分の区間のみであってもオーバーラップするようにして実施されるのが最適である。

本願発明によって高品質の結果が得られるような分析テストが短時間の内に実施・完了できるようになる。この短期間内に完了できるという観点に関して、考慮すべき点は、特定の検査対象成分に高い特異性を持つ酵素反応にあってはその反応速度が特異性の点でそれほどでもない場合に比べて相対的に遅いのが一般であり、したがって従来技術に基づいて測定を実施している限り、インキュベーションにより多くの時間が必要になり引いては分析結果の導出までの時間が一層長くなることを意味する。使用する酵素の種類を変更して当該反応の速度が高いものを利用すると前記特異性の点で劣るものとなり引いてはテストの品質を低下させる結果となるものである。一方本願発明はこれらの要請事項の双方を同時に満たすことができるものである（高い反応特異性と結果導出までの時間の短縮）。

図４〜７は本願発明にしたがって実施したテストにおける結果を示すものである。

図４は図３と同様にＩ（ｔ）曲線を示すものであり、その測定は分析用電圧の印加を挿入感知点において開始する方法を採用している。ここでの検体試料は特定のグルコース濃度（５００ｍｇ／ｄｌ）、該Ｉ（ｔ）曲線間で互いに同一濃度に揃えられているがそのヘマトクリット値と該試料（反応系液体）の温度がそれぞれことなるものを用いている。図４のグラフの曲線はちなみに３種類のヘマトクリット値（２０％、４５％、７０％）ならびに３種類の温度（１０℃、２５℃、４０℃）に対応するものとなっている。Ｉ（ｔ）曲線はそれぞれ異なるシンボルをグラフ右側に記した通りに用いて表示することによりそれぞれを区別している。これと同様のシンボルを図５、図６にも用いている。結果データは測定された生の電流測定値に次式で示されるベースライン修正を加えたものである。

ここで Ｉ_BC：ベースライン修正後の電流値
Ｉ_org：生の電流測定値
Ｃ：実験で定まる定数である。

ここに示したベースライン補正にあっては検体試料中に含まれるグルコース濃度に関するもの以外の電荷キャリア成分による電流（ｔ^-1/2項）ならびに電子回路部のダンピング効果による電流（ｅ^0.1/t項）を測定で得られた電流から減算するものである。

上記以外に、検体試料の準備に当って所与のグルコース濃度、ヘマトクリット値に正確に一致した濃度を得ることが不可能であることに関する補正も必要であった。実際には検体試料は入手できた全血サンプルを希釈し、然るべき量のグルコースを添加する方法で準備しなければならないものである。図４の中に示した値に合わせるために実際に準備したサンプル中の濃度とのあいだの少々の差については線形回帰法によって修正を加えた。

図４からは次のような特性が読み取れる。
− 曲線はいずれもが上昇時期のそれを含んでおり、事実上その期間は挿入感知時点ＤＤ（時刻０）から極大を示す時点までの期間である。
− 時刻軸上で極大が起る位置は温度によって変化する。温度が高いほど極大の位置は早期に発生することになる（１０℃に対応する曲線にあっては極大に至った後もＩ（ｔ）曲線に低下が現れないがこれはそのような低下が電流測定期間の５秒を過ぎてから生起するためである）。しかし、個々の曲線ごとに極大点を電子機器により捉えることは可能である。
− 同一の温度に対応した曲線にあってはヘマトクリットによってＩ（ｔ）曲線にシフトが生起されることが分かる。シフトはヘマトクリットの上昇が測定される電流値を低下させる方向に起っている。

図５は図４の作成に用いたと同じデータによっている。図中の時刻軸についてのみ図４の場合と異なり次式にしたがって時刻軸は標準化されている。

ｔ_norm＝ｔ／ｔ_max
ここでｔ_max：それぞれのＩ（ｔ）曲線における挿入検知点から極大点までの時間、である。

図６は周波数を２ｋＨｚとした時の交流電流値の測定結果を時刻軸に沿って示すものである。ここでは図４の作成時と同じ検体試料を用いている。アドミッタンスＡ（インピーダンスＺの逆数）の値がＳ（Ｏｈｍ^-1）として示されている。該曲線はその初期にあっては比較的大きなバラツキがあるがこれは測定用電子機器が定常状態になっていないことに起因するものである。しかし、長くとも２秒後には安定した値、時刻軸に沿ってゆっくりと上昇する形の曲線が得られている。これは測定に用いられる電子機器が大きなダンピング効果を持っていることを意味している。

図７の曲線は図５の曲線と同じデータを使用して作成されている。ただし電流値には次式による変換が実施されている。

Ｉ_tf＝Ｉ_normｘ（１＋デルタＺｘＡ）
ここでデルタＺは式デルタＺ＝（Ｚ−Ｚ_med）である。また以下の関係が前提となっている。
Ｚ：電極間のインピーダンス。２ｋＨｚの交流電圧を電極間に印加し、Ｚ値に関する初期のバラツキがなくなった時点で測定したインピーダンス値（図６では時刻３秒の時点に相当）。
Ｚ_med：上記と同じ時点における複数個のＺ値のメジアン。
Ａ：図７に示した曲線間に最適な整合性を得るための実験的に定めた重り付け係数。

図４から図７のグラフは比較的簡単な数学的変換を加えることで図４に示した複雑な形状の図４に示すＩ（ｔ）曲線群を図７に示すようにほぼ一本の単純な形状の曲線で代表できる位にまで変換できることを示している。言い換えれば、図４に描かれているＩ（ｔ）曲線群は温度やヘマトクリットの変化に対し非線形的な形で依存しているが、時刻軸に対して適当な変換を加えることでこれら二つのパラメターに依存する関係に関し取り扱いが複雑な関係を線形的な関係に変換できることを意味している。

以上に示した測定値の変換などにより得られる結果は、酵素が関与する正方向反応とその逆方向反応である電極反応が平行して進行する系において電流値測定法により獲得した生の測定データを出発点としても、温度やヘマトクリットといった複雑な形で測定値に影響を与えるパラメターに係わる補正も加えることで、従来技術によっている限り不可能であったような信頼度の高い測定結果データとして完成できることを示すものである。Ｉ（ｔ）曲線の上昇期間において測定した電流測定値に関してはそれらが使えるというのみでなくそれら値を使うのがより望ましいのである。このような事情の所為で測定作業に必要な時間を大幅に短縮することが可能となるものである。なぜなら、まず最初の正方向反応のためのインキュベーション時間が必要でなくなるうえ、さらには該正方向反応と逆方向反応がバランスした定常状態の出現を待つ必要もなくなるからである（この時には媒介成分もそれが消費されるのと同速度で生成されることになり、その濃度が一定値に留まる）。

未知の検体試料中のグルコース濃度分析を行なう簡便な方法は次の工程を含む。
− 測定により図３に示した通りのＩ（ｔ）曲線を作成する。
− ベースライン補正を加える。
− ｔ_maxを獲得する
− 標準化した時刻軸上に定めた一点（たとえば０．７Ｘｔ_max）に対応する時刻において電流値を測定しそれをその後でおこなう評価において使用する。
− 交流測定を行ないその結果に基づいてこの電流値を校正する。
− 校正済みの電流値を標準化した時刻軸上の同じ時点（たとえば０．７Ｘｔ_max）で行なった補正に基づいてグルコース濃度値に変換する。

しかし、以上述べた方法は本発明になるいくつもの測定値評価方法の一つに過ぎない。図４から図７には複数のＩ（ｔ）曲線において上昇期間に当る部分の該曲線の形状が「バリアンス」（検査対象成分すなわちグルコースの濃度）や複数の「コバリアンス」（温度やヘマトクリットといった影響因子）といった影響要因の組み合わせごとに特徴ある形をもつことを示している。したがって、交流電流をＩ（ｔ）曲線の上昇期間内において複数回測定しそれら測定値を適当なアルゴリズムにしたがって操作することで、コバリアンスが及ぼす影響を分離し、最終的には除去してしまうことが可能になる。

本目的を達するためには、上述した数学的−分析的方法に替えてたとえば数値演算的方法を用いることができる。この目的で用いることができる数値演算方法には様々な多変量解析が該当する。このような方法を実現するためのコンピュータ・プログラムは市販されており入手可能である。バイオセンサー・システムの製造業者はそのバイオセンサー・システムの訓練を実施しなければならないがそのために必要な様々なヘマトクリットの検体試料を用い、かつ様々な温度での測定の実施が必要になるがそれらのためのプログラムまでこれら市販品プログラムには含められている。そのようにして実施した訓練の結果は当該電子機器部に該機器をコントロールするプログラムとして導入されるものである。このようにして始めてグルコースならびにヘマトクリット濃度が未知の検体試料を対象とする分析を該電子機器部のトレーニングしておいた温度領域内において実行できるようになる。

ここで実行される温度に依存する誤差の補正は、Ｉ（ｔ）曲線の上昇期間内のただ２点における測定値さえあれば原則として実施が可能になる。しかし、該Ｉ（ｔ）曲線の曲がり具合を示す何らかのデータを追加的に利用するようなアルゴリズムを採用するのが好ましい。このように曲がり具合のデータを用いるとなると２点におけるのではなく時刻軸上の互いに異なる３点における検査対象成分検知電流の測定値が必要になる。

Ｉ（ｔ）曲線の上昇期間にあっては該電流値は測定温度に非常に敏感に変動する。したがって温度の違いをその原因因子とする誤差の補正には特にこの期間におけるＩ（ｔ）曲線の値が重要になる。このために用いる評価アルゴリズムは一般にＩ（ｔ）曲線の前記した極大を示す時点以降における時点での測定値を追加的に一つ採用することになっている。このようにして採用される追加的測定値は特に検査対象成分濃度の変化を捉える精度、および／あるいはヘマトクリットを原因因子とする誤差の補正の品質を向上させる。

しかし、Ｉ（ｔ）曲線の測定に関しては一旦その極大が出現したならばその時点以降の測定は中止するのが望ましい。これにしたがうと、特に温度が高く（たとえば室温程度）極大が挿入検知ＤＤ時点のすぐ後に到来する場合には測定を実施できる期間は非常に短いものになってしまう。その一方、測定実施時の温度が低い（測定機器の使用者が屋外で活動しているなどのため戸外で測定を行なうなど）場合には当該機器は極大が検知されるまで測定体制を継続するために測定データの精度は高いものになる。その場合にあっても測定に要する実質的な時間が延びるというほどのものではない。

図８に示したバイオセンサー・システム１は使い捨て型の分析検体エレメント２と評価機器部３とから構成される。評価機器部３には分析検体エレメント２を挿入しそこに固定できるホルダー４がある。分析検体エレメント２が評価機器部３に装着され、該分析検体エレメント２に備えられた電気接点６を介して評価用機器部３の相手側接点（図示されていない）とのあいだに電気的接続が完成する。

分析検体エレメント２は反応室７を持っている。該反応室７には血液の一滴を落としこむ検体試料送入口８が備わっている。この開口部からは毛細管（図示されていない）が二つの電極９、１０まで延びている。毛細管内部空間には検査対象成分との反応成分（図示されていない）が保持されている。該毛細管内部空間のサイズは検体試料送入口８に滴下された検体試料液体が速やかに該空間内に浸入できるよう、同時に前記反応成分を溶解できるよう、かつ双方の電極９，１０にまで広がり電気的接続を達成できるように形づくられている。この後は上段で説明した通りの反応ならびに評価工程が進行する。

評価機器部３には然るべき電子部品回路が備わっており、所定の電気的測定を行なうと共に当該検体試料中の検査対象成分の濃度を測定値から導出することになる。該評価機器部３には直流電圧ならびに交流電圧を発生する電源、直流ならびに交流電流測定回路、マイクロプロセッサ制御の評価実行システムがある。該マイクロプロセッサ制御の評価実行システムは当該機器部の動作を制御し当該評価アルゴリズムを構成する工程を実行しもって電気的な測定により獲得した測定データから目的の検査対象成分濃度を算出する。

本願発明の実施において用いるシステム１は、それを構成する分析機器部が関わる化学的側面ならびに該分析機器部の作られ方の点で、さらには該システムを構成するもう一方の部分である電子機器部３を形成する電子回路や電子部品の点で、概ね従来技術により提供されているものと同様である（例外として異なる点はこの明細書に記載される通りである）。したがってこのシステムについてはここまでに述べた以上に記載する必要はない。必要に応じて本明細書に記載した従来技術文献を参照できる。

図９の回路図は電子機器部の基本的構成を示す模式図であり、この電子機器部を採用することでバイオセンサーの電極間に直流電圧と交流電圧の双方を同時に印加できるようになると共にそれら各々に対応した電流値を互いに干渉しあうことのない状態で測定できるようになる。

直流電圧ならびに交流電圧のそれぞれは電圧源２０，２１から供給されるもので、加え合せ点２３で加え合されてオペアンプ２４の逆相入力端子に接続される。オペアンプは電圧フォロアとして作用する。該オペアンプはその出力側に直流電圧ならびに交流電圧の低インピーダンス電圧源を形成しこれら両方の電圧はシャント抵抗（分路抵抗）２６を経て分析機器部２の一方の電極（電極１０）に接続される。この電極１０に印加される電圧シグナルをモニターする為にモニタリング出力２７がある。

シャント抵抗２６は交流測定回路２５に属するものである。該シャント抵抗２６を通過した電流は差動増幅器２９を利用して測定される。該差動増幅器２９の出力は前記シャント抵抗２６における電圧低下に比例し、したがって該差動増幅器２９に流れる電流も該圧力低下に比例することになる。ｒｍｓモジュール（整流積分器）３０を使用することで電極９、１０のあいだに流れる交流電流の二乗平均値に相当する出力３１が得られる。

電極の一方９ともう一方の電極１０のあいだに流れる直流電流は交流測定部回路２５からは分離されている電流測定回路３２によって測定される。この直流測定回路は前記とは別のオペアンプ３３を電流―電圧変換器（Ｉ／Ｖコンバータ）として含むようにして構成されている。この回路において、交流信号を除去するために、たとえばここに開示した実施例にあるように、二つのコンデンサ３５，３６を、その一つはＩ／Ｖコンバータの入力に対して並列に、もう一つは該Ｉ／Ｖコンバータのフィードバック抵抗に対して並列に配置することで構成されるフィルターを採用するなど、適当なフィルターが用いられる。このＩ／Ｖコンバータの直流の出力３７は、この結果電極９，１０のあいだに流れる直流の電流に比例することになる。

すべての出力２７、３１、３７はデジタル化され、本明細書に記述される種々な処理をうけるべく当該機器部のマイクロプロセッサ・システムに送出される。

図１０のグラフは図９に示した電子回路図に相当する電子機器により獲得した測定値を示すものである。該グラフに示された複数のＩ（ｔ）曲線はそれぞれに異なった検体試料溶液に関わるものである。またこれら曲線にそれぞれ対応する直流電流の大きさを示す目盛りは該グラフの左側軸に示されている。図１０はこれに加えて交流電流測定により求められるインピーダンスの大きさを示している（右側に示した目盛り軸）。ここに示されるインピーダンスの大きさは何種類もの互いに異なる周波数のあいだで切り替えを行って求められたものである。このグラフにあっては前回の場合と同じ検体試料混合液群のセットを使用しそれぞれ異なる検体試料混合液ごとの曲線にも前回と同様のマークが使用されている。このグラフからは測定された交流電流と直流電流が完全に他方から分離されていることが分かる。すなわち、交流電流に関わる周波数が変更され、それに伴って発生した交流電流の大きさの突然の変化が感知されている時点においても直流信号は何ら変化していない。

検査対象成分の反応を含む一連の反応を示す図である。 従来技術によるテストによって得られる直流電流値の対時刻軸曲線のグラフである。 本願発明によるテストによって得られる直流電流値の対時刻軸曲線のグラフである。 検査対象成分の濃度を図３を得たものと同一とし、該液体反応系の温度ならびにヘマトクリット値が種々異なる条件で求めた電流曲線のグラフである。 図４に示した曲線を得たものと同様の条件で得た測定値を標準化された時刻軸に沿って記述し直したグラフである。 一定濃度の検査対象成分濃度に設定する一方、その反応系液体の温度・ヘマトクリット値条件を種々変更した場合における交流電流値の時刻軸に沿った変化を示す曲線のグラフである。 図５と同様の測定条件で得た電流値について一定の線形変換を加えて作成した曲線のグラフである。 本願発明になるバイオセンサー・システムの典型例における各種組成部品を示す平面図である。 至適な電子回路の一部分を示す模式図である。 図９に示した回路図にしたがった回路により測定した直流電流曲線ならびに交流電流曲線を併記して示すグラフである。

Claims (13)

1. 検査対象成分との反応試薬と少なくとも２本の電極、および電子回路部からなる検体中の検査対象成分を電気化学的手法により測定するためのバイオセンサー・システムであって、
   前記システムが、前記検査対象成分との反応試薬は検体である液体と混合されて反応性混合液を形成し、前記反応性混合液が２本以上あるとした前記電極と接触を果たすことになり前記電極間に直流電圧が印加されると該直流電圧が印加されたときの検査対象成分の検体中の濃度に応じた大きさの電流が発生することから前記検査対象成分の存在と、存在する濃度の測定が可能になり、発生する電流が、当該液体反応系中で検査対象成分に特異的な反応ならびに電極表面を通る電子の流れを生起する電極反応を含む一連の反応が開始進行することによりもたらされ、
   一方の前記電子回路部は、前記電極に印加することが必要な直流電圧の発生源と時刻軸にそって変化する当該検査対象成分の存在に感応した電流値曲線を形成する複数個の値を複数の測定時点において測定し、測定によって得られた測定値に基づき当該検査対象成分の濃度値を一定の解析アルゴリズムにしたがい算出するための測定・解析用の電子回路部を含むものであり、前記検査対象成分に特異的な反応が進行し続けるあいだ中継続して前記直流電圧は前記電極間に印加され、かつ前記検査対象成分に特異的な反応と前記電極反応が同時に並行して生起するものであり、また複数の反応の進行に対応して時刻軸に沿って変化する検査対象成分の検出を示す電流の曲線が描かれ、当該曲線は時刻の経過と共に電流が増加する時刻領域を有するものであり、前記検査対象成分の存在に感応し発生する電流は前記時刻経過と共に電流が増加する時刻領域内における少なくとも２つの時点において測定され、少なくとも２つの時点分ある測定値を用い前記解析アルゴリズムにしたがって計算を行なうことによって温度による影響分誤差の補正がなされる
   ことを特徴とするバイオセンサー・システム。
2. 前記システムが前記検査対象成分との反応試薬および少なくとも２本の前記電極（９，１０）とを含むように構成された使い捨て型分析検体エレメント（２）、および該分析検体エレメント（２）に適応できるべく該分析検体エレメント（２）の装着部（４）に加え該装着部（４）に装着された該分析検体エレメント（２）に備わった電極（９，１０）と前記電子回路とのあいだに電気的接触を確立できるような接点を有する解析機器部（３）から構成されていることを特徴とする請求項１記載のシステム。
3. 分析検体エレメントが毛細管形状の要素カプセルであって毛細管と呼称されるにたる寸法の空間を有しその内部に前記電極（９，１０）と前記検査対象成分との反応試薬とを内包することを特徴とする請求項２記載のバイオセンサー・システム。
4. 検体中の検査対象成分を電気化学的手法により測定するための方法であって、
   該検査対象成分との反応試薬と検体を混合して反応性混合液を形成する工程、
   該反応性混合液を一組２本の電極と接触を果たしめる工程、
   前記検査対象成分の存在に感応した電流の時刻軸に沿った変化曲線がとる値を複数個互いに異なる測定時刻において測定する工程、ただし、前記検査対照成分の存在に感応した電流は前記電極間に直流電圧が印加されると前記電極間に流れるものであり、該検査対象成分の検体中の濃度に応じた大きさの電流であり、該発生する電流は、当該液体反応系中で検査対象成分に特異的な反応ならびに電極表面を通る電子の流れを生起する電極反応を含む一連の反応が開始進行することによりもたらされるものであることを特徴とし、さらに
   該検査対象成分の濃度を前記検査対象成分の存在に感応した電流の測定で得た複数の測定値に関わる一定の解析アルゴリズムにしたがって算出する工程
   から構成されることを特徴とする方法であって、かつ
   該検査対象成分に特異的な反応が進行し続けるあいだにあっては継続して前記直流電圧は前記電極間に印加されるものであり、かつ該検査対象成分に特異的な反応と前記電極反応は同時に並行して生起するものであり、また該複数の反応の進行に対応して時刻軸に沿って変化する検査対象成分の検出を示す電流の曲線が描かれ、該曲線は時刻の経過と共に電流が増加する時刻領域を有するものであり、該検査対象成分の存在に感応し発生する電流は前記時刻経過と共に電流が増加する時刻領域内における少なくとも２時点において測定され、該少なくとも２時点分ある測定値を用い前記解析アルゴリズムにしたがって計算を行なうことで温度による影響分誤差の補正を行なうことになる
   ことを特徴とする方法。
5. 請求項１または４記載の検査対象成分に感応し発生する電流を前記上昇期間中の少なくとも３つの時点において測定し、前記電流の変化を表す曲線の該上昇期間中部分の形状を表すデータとし、これら少なくとも３つに時点において測定して得た検査対象成分に感応し発生する電流に対する少なくとも３つの測定値を温度による影響分誤差の補正のために前記解析アルゴリズムと共に使用すること特徴とする請求項１記載のシステムまたは請求項４記載の方法。
6. 請求項１または４記載の電極に一定の交流電圧を印加し、該交流電圧を印加したことで発生する交流電流を測定して誤差の補正に利用することを特徴とする請求項１記載のシステムまたは請求項４記載の方法。
7. 交流電流の測定を前記上昇期間中に前記検査対象成分の存在に感応し発生する電流の測定と同時に並行して行なうことを特徴とする請求項６記載のシステムまたは方法。
8. 検体が全体血液であり、前記交流電流測定に基づいてなされる誤差の補正が検体である該全体血液のヘマトクリット値のバラツキに起因する誤差の補正を含むことを特徴とする請求項７記載のシステムまたは方法。
9. 検査対象成分の存在に感応し発生する電流値から当該検査対象成分の濃度を算出するための該解析アルゴリズムが該検査対象成分の存在に感応して発生する電流の対時刻曲線に現れる極大を捕捉し、該極大が現れる時刻軸上の位置から事前に与えられた比率にしたがって定まる時点における該電流の対時刻曲線の値を使用すること特徴とする請求項１記載のシステムまたは請求項４記載の方法。
10. 電子回路部が前記直流電流と交流電流を測定するためにそれぞれ専用の互いに独立した構成の回路２つ（２５，３２）を有することを特徴とする請求項７記載システム。
11. 電流測定用の前記回路の一つ（２５）が少なくとも２本はあるとされる前記電極の一つにつながる接続線上に配置され、もう一方の電流測定用の前記回路が前記電極のもう一方につながる接続線上に配置されていることを特徴とする請求項１０記載のシステム。
12. 前記交流電流測定用の回路（２５）が差動増幅器に接続されたシャント抵抗で構成されることを特徴とする請求項１０記載のシステム。
13. 直流電流測定用の回路（３２）がオペアンプで構成される電圧−電流変換器であることを特徴とする請求項１０記載のシステム。

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