JP2006517186A - 二機能性の生体材料の組成物、方法、および使用 - Google Patents
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Abstract
Description
本出願は、2002年9月4日に出願されたBelcher et al.に対する仮出願番号第60/408,528号の利益を請求し、その全体が参照として本明細書に組み入れられる。
本発明は、一般に、高分子化学の分野に、特に生体材料として使用するための生物学的に修飾されたポリマーに関する。
米国連邦政府は、本発明に一定の権利を有するであろう。本出願の主題は、 の部門からの連邦政府研究費番号 下で一部が行われた。
本発明の範囲を限定することなく、その背景は、ポリマーを有機的または生物学的な置換基(以後、二機能性の生体材料)と共に組み込むことによって生物学的物質(以後、生体材料)を開発することに関して記載してある。列記したヌクレオチドおよび/またはアミノ酸配列は、コンピュータ読み取り可能な形態で材料の参照として組み入れられる。
本明細書に開示された発明は、修飾された二機能的に結合された生体高分子であって、機能的な結合は、生体材料表面と細胞または生物分子との間のものである生体高分子の組成物、方法、および使用である。
本発明の種々の態様の製作および使用を以下に詳述してあるが、本発明は、多種多様な特定の状況で実施されるであろう多くの適用可能な発明概念を提供することが認識されるべきである。本明細書において論議される特定の態様は、単に本発明を製作し使用するための特定の方法を例示するだけであり、本発明の範囲を限定しない。例示の態様の種々の修飾および組み合わせ、並びに本発明のその他の態様が、明細書を参照することにより当業者には明らかであろう。従って、添付の請求の範囲がこのようなあらゆる修飾または態様を含むことが企図される。
大量の1つまたは複数の生物学的な構造を作製するために、繊維状ウイルス(すなわち、バクテリオファージ)を使用してもよい。特定の特性(たとえば、長さ、生来の構造、種)を有する生物学的な構造のランダムな組合せを含む商業的に入手可能なライブラリーを使用してもよい。たとえば、M13大腸菌ファージの微量な外被タンパク質(pIII)に特定のな長さのペプチド(たとえば、直線的な12アミノ酸、直線的な7アミノ酸、またはペプチド上の第1位および第9位のシステインが2つのシステイン間のジスルフィド結合によってループを生じるように強制された7アミノ酸)などの生物学的な構造の各種取り合わせを含む、バクテリオファージ・ライブラリー(また、本明細書において、ファージ・ライブラリーともいわれる)を開発した。このような大規模なライブラリーを使用するもう一つの利点は、選択された材料に接触するか、または結合することができる1つまたは複数の特異的な生物学的な構造(たとえば、ペプチド)を見いだした後に、材料に接触すること、または結合することに関与する特異的なアミノ酸を見いだすためにライブラリーを使用することができることである。これらに対して特異的な生物学的な構造および/または特徴を見いだすために使用する方法の例は、スクリーニング法とも称され、図4に示してある。バイオ・パニングにおいてこれらを使用するためのファージディスプレイライブラリーおよび実験法は、たとえば、Belcher et al.に対する以下の米国特許公報にさらに記載されている:(1)「Biological Control of Nanoparticle Nucleation, Shape, and Crystal Phase」;2003年4月10日に刊行された2003/0068900;(2)「Nanoscale Ordering of Hybrid Materials Using Genetically Engineered Mesoscale Virus」;2003年4月17日に刊行された2003/0073104;(3)「Biological Control of Nanoparticles」;2003年6月19日に刊行された2003/0113714;および(4)「Molecular Recognition of Materials」;2003年8月7日に刊行された2003/0148380。
力価プレートからのファージの濃度(pfu/μL)×(1μl/1E-6L)×(5コピーのpIII/1pfu)×(1mole/6.023×l023分子)(1)
式中、pfu=プラーク形成単位。
材料特異的な生物学的な構造、およびこれらの材料特異的な接触または結合領域を決定するために、一般に数回のバイオ・パニングのラウンドが使用される。それぞれのバイオ・パニングのラウンドについて、材料に対して次のラウンドのバイオ・パニングに使用する量(体積として)を決定するために、ファージ濃度が使用される。ファージの量が少なくとも約109pfuであった材料の新しい部分を、次のスクリーニングのために使用した。材料の結合に関与する共通配列を決定するために、複数ラウンドのバイオ・パニング、一般に少なくとも約5ラウンドを行う。
一般に、本発明のための理想的な材料は、生物学的な構造と接触して、非特異的な相互作用―生理学の技術分野の当業者に周知の相互作用を超える相互作用を形成するであろうものである。本発明のための材料の例は、プラスチック、セラミック、金属、その他の複合物、ポリマー、並びに修飾および/またはこれらの組み合わせを含む。材料は、形成され、混合され、または別の表面に堆積されたものであってもよい。
(a)Aldissiに対する第4,929,389号(「Water-Soluble Conductive Polymer」);(b)Kochem et al.に対する第5,294,372号および第5,401,537号(「Aqueous Dispersions of Intrinsically Electroconductive Polyalkoxythiophenes, a Process for their Preparation and their Use」);(c)Chenに対する第5,670,607号(「Miscible Forms of Electrically Conductive Polyaniline」);(d)Wudl et al.に対する第5,569,798号(「Self-Doped Polymers」);(e)Saida et al.に対する第5,648,453号および第5,688,873号(「Electroconductive Polymer and Process for Producing the Polymer」);(f)Viswanathanに対する第5,968,417号(「Conducting Compositions of Matter」);および、(g)Heeger et al.に対する第6,534,329号(「Visible Light Emitting Diodes Fabricated from Soluble Semiconductor Polymer」)、これらはそれぞれ、合成および特性付けを含むこれらの全ての教示について参照として本明細書に組み入れられる。これらの特許は、たとえばポリマーバックボーンに共有結合で結合するブロンステッド酸基、双性イオン構造、自己ドーピング、ポリマー鎖を酸化または還元させるアクセプターおよびドナーでのドーピング、中性およびイオン状態の間の循環、安定性、および半導電性または電導性の挙動を提供する電子系のπ共役を記載する。加えて、電導性ポリマーの多くの適用も記載されている。
ポリピロールを電流が通ることができるように酸化した。ラジカル陰イオンとして塩化物または「ドーピング剤」を添加すると、非常に共役したバックボーンに沿って電気的中性を提供する。本発明の一つの態様において、PPyClフィルムは、インジウムスズ酸化物(ITO)に電気化学的に沈着させた伝導性のホウケイ酸ガラスである(Delta Technologies, Still Water, MN)。スライドとして形成されたITOガラスは、ヘキサン、メタノール、およびジクロロメタン中でのそれぞれ5分間の超音波処理によって使用前に掃除してもよい。
特異的な材料を選択する生物学的な構造をさらに解析して、材料に対する接触がどのように、またどこで生じるかを決定してもよい。一つの態様において、ペプチドなどの生物学的な構造をシーケンスして、コンセンサス結合領域が決定される。生物学的な構造は、バイオ・パニングのラウンドの後か、または、非特異的な相互作用が除かれる(たとえば、材料を洗浄して、ペプチドなどの未結合の生物学的な構造を除去する)付着のその他の方法で得てもよい。本方法は、分子生物学術の当業者に周知である。
であることを図6の最後のラインに表してある。さらに、コンセンサス結合領域をアミノ酸官能基の反応性について解析し(図7)、官能基と材料との間(すなわち、生物学的な構造および材料の表面の間)で起こり得る相互作用を例証するのを助ける。
いくつかの生物学的な構造、特に別の生物学的な構造の助けによって大量に産生される(たとえば、細菌またはバクテリオファージなどの宿主細胞で発現される)ものは、材料間の相互作用の結果だけでなく、生物学的な構造を産生するために使用する発現系または方法に基づいたコンセンサス領域であるコンセンサス領域を含んでもよい。本発明の一つの態様において、生物学的な構造のコンセンサス領域は、特にバイオパニング(たとえば、増幅)の間に細胞増殖から生じるコンセンサス領域でないことを検証する。たとえば、修飾された宿主が天然に存在する宿主よりも増殖する場合は、コンセンサス領域を含む修飾された宿主は、材料特異的な相互作用によるものではなく、その増殖能力によって選択された可能性がある。
生物学的な構造のコンセンサス領域は、材料と一種の特異的な相互作用を受けることが推定される。相互作用は、以前に記載されているいずれの相互作用(たとえば、共有結合性、電気的、静電的、水素結合性、極性、磁性、その他)であってもよい。生物学的構造と材料との間で生じる相互作用のタイプを決定するために、および相互作用が特異的であることを決定するために、いくつかの方法を利用できる。方法は、分子生物学の当業者に容易に認識され、いくつかの実施例を後述する。
PPyClに対するペプチドの結合研究としての力価カウントの使用は、準定量的であり、PPyCl特異的なファージ、ランダムに選択した操作されたファージ、またはWTファージあたりのファージ・カウントの相対的な結合の比較を提供する。1×108 pfuファージの初期量をPPyClと相互作用させる。次いで、PPyCl試料を1mLの0.1%のTBS-Tで少なくとも約3回洗浄して、結合していないファージを除去した。9分間の500μLのグリシン-HCl(pH2.2)による結合したファージの溶出を使用して、表面に結合したファージを分離させた。力価カウントをコンセンサス・ペプチド・ファージ実験から得て、WTおよびランダムなペプチド・ファージの力価カウントと比較した(およびPPyClの表面から溶出することができるファージの量を比較することによって、PPyCl特異的なファージ、ランダムに選択した操作されたファージ、およびWTの結合能力を比較するために使用する)。500μLのグリシン-HCl(pH2.2)を使用する力価カウント法では、その他のファージよりもうまくPPyCl特異的なファージが結合することを示した(図9)。ランダムに選択した操作されたファージは、29ファージの平均カウントで最低の回収であった。WTは、57カウントの平均的な回収であった。PPyCl特異的なファージは、124カウントの回収率(表面結合したファージ)であった。
免疫化学技術によって、PPyClの表面に結合した蛍光ラベルファージを顕微鏡によって視覚化し、材料に結合したファージの数の定量を可能にする。フルオレッセインでラベルしたストレプトアビジン(Exaplha, Boston, MA)をファージに付着させるために、pVIIIに特異的なM13バクテリオファージに対するビオチン化された抗体(Anti-fd Bacteriophage-Biotin Conjugate from rabbit, Sigma-Aldrich Corp., St. Louis, MO)およびビオチン-ストレプトアビジンの相互作用を使用した。ファージは、蛍光顕微鏡を使用して材料上で視覚化した。ファージは、1×104 pfu/μLの濃度であり、少なくとも約1時間1cm×0.5cmのPPyClの試料と相互作用させた。次いで、材料(PPyCL)を1mLの0.1%のTBS-Tで少なくとも約3回洗浄し、結合していないファージを材料から除去した。1:400希釈の一次抗体(10)(抗体:4%のウシ血清アルブミン[BSA]のpH7.5のTBS溶液)を少なくとも約1時間室温で材料に添加した。試料を1mLのTBS(pH7.5)で少なくとも約2回洗浄した。1:200希釈(フルオレッセインでラベルしたストレプトアビジン:4%のBSAのpH7.5のTBS溶液)のフルオレッセインでラベルしたストレプトアビジンの二次抗体(20)を室温で暗い所で少なくとも約30分間材料に添加した。次いで、材料を1mLのTBS(pH7.5)で少なくとも2回洗浄し、顕微鏡スライド上にマウントした後に視覚化した。イメージを図10に示してあり、微分干渉コントラストオプティクスおよび488nmの選択した励起波長を有する(フルオレッセインのために)Kr/Ar混合気体レーザーを備えたライカTCS 4D共焦点顕微鏡を使用し、発光は、40X油浸レンズで収集した(Microscopy Laboratory of the Institute for Cellular and Molecular Biology, University of Texas, Austin, TX)。
いくつかの材料は、これらの分解速度、免疫原性の反応、その他などを制御する可能性があり、したがって、改善された二機能性の生体材料として役立つであろう。分解速度を制御することにより、組織に関した適用に適した生体材料を設計することができる。本発明の一つの態様において、材料のこのような生物分解性のPLGAは、型に鋳造される。使用される鋳造方法は、ポリマー化学術の当業者に直ちに明らかなものである。一つの例において、材料は、溶媒鋳造である。もう一つの態様において、材料は、平滑面を有する厚さが少なくとも約80〜150μmであろうフィルムに鋳造される。
PLGAに特異的であったペプチドなどの生物学的な構造は、2回目のまたはもっと後のバイオ・パニングラウンド後に選択したファージから得られた。2〜4ラウンドのバイオ・パニングから得られたペプチド配列の結果を図11に示してある。
である。
である。
PLGA-1およびPLGA-2についてのコンセンサス領域が材料に特異的であるが、増殖またはバイオ・パニングなどの宿主変異性に特異的でないことを確かめるために、材料特異的なファージをさらに解析した。PLGA-1およびPLGA-2をランダムおよびWTファージと比較した。
特異的な生物学的構造と生物分解性の材料との間の相互作用により、材料およびまたは、必要に応じて生物学的な構造を認識し、後で修飾することが可能になる。力価カウント(図18)および免疫化学の使用は、PLGAとペプチドの間の相互作用を決定するために利用できる方法のうちのほんのいくつかの例である。PLGAは、フルオレッセイン(520nm)と同じ発光波長で蛍光を発するので、変形例として蛍光免疫化学は使用しなかった。代わりに、原子力光学顕微鏡法(AFM)を使用する視覚化を用いた(図19)。
少なくとも約1x108 pfuのファージで材料(たとえば、PLGA)に添加した。材料を1mLの0.1% TBS-Tで少なくとも約5回洗浄した。少なくとも約9分間、500μLのグリシン-HCl(pH2.2)で材料を溶出することによって非特異的なファージを除去した。比較するために、PLGA支配的なファージ、WT、およびランダムなファージから力価カウントを得た。
ファージの材料との相互作用の定性分析は、AFMを使用して行った。室温で、少なくとも約1時間、PLGAを1×108 pfuのPLGA-1およびWTと相互作用させた。次いで、材料を1mLの0.1% TBS-Tで少なくとも約5回洗浄し、視覚化のためにAFMディスク上にのせた。AFMは、Zeiss Axiovert 100s-2tv上に取り付けられたデジタル・計測器バイオスコープ(Digital Instruments Bioscope)を備え、Gスキャナを有するチップ・スキャニング・モードで作動する。イメージは、タッピングモードを使用して空気中でとった。125-μmカンチレバーでエッチングしたシリコン・プローブを、これらの共鳴振動数(200〜400kHz)近くで駆動する少なくとも約20〜100N/mの弾力係数で使用した。走査速度は、約1〜5μm/sであった。イメージは、試料の偏りを除去するために一次面を使用して平均化した。
を参照されたい。
(図1)本発明に従った材料および生体分子を接続する二機能性のリンカーの微視的な説明図である。
(図2)宿主内部で使用する二機能性のシステムの微視的な説明図である。
(図3)本発明に従って、材料表面上の濃度勾配に生体分子を含む二機能性のリンカーを有する生体材料を使用して神経誘導チャネルを介してガイドされる神経細胞軸索の巨視的な説明図である。
(図4)材料表面を認識する1つまたは複数のペプチドを選択するために使用したスクリーニング(バイオ・パニング)プロセスの説明図である。
(図5)PPyCl特異的なファージから得られるバイオ・パニングラウンド3〜5からのペプチド配列を含む。
(図6)12アミノ酸の位置に対して、位置あたりのパーセント・アミノ酸発生率を比較することによって決定された、PPyClに対して優勢な配列を
として示してあり、それぞれのカラムの最大パーセントは、ペプチド内のその位置について最高のアミノ酸発生率に対応する。
(図7)PPyClの位置あたりのパーセント・アミノ酸群が、共通配列および群全体の発症率と比較することができる(pIII上に発現されたペプチドの組み合わせのライブラリーに関連して)値を与えることを示す。
(図8)PPyClについて選択したファージの増幅研究の例を示し、PPyCl配列は、
であり、ランダム配列は、
である。
(図9)PPyClについて選択したファージの結合親和性研究の例であり、PPyCl配列は、
であり、ランダム配列は、
である。
(図10)(A)ファージを有するPPyCl、(B)10-20のPPyCl特異的なファージ、(C)10-20のランダムなファージ、(D)10-20のWT、(E)10-20、(F)20、および(G)マウンティング媒体類の反射率イメージであり、PPyCl配列は、
であり、ランダム配列は
である。
(図11)本発明に従って、PLGA-特異的なファージから得られるバイオパン・ラウンド2〜4から、ペプチド配列を含む
(図12)12アミノ酸の位置に対して、位置あたりのパーセント・アミノ酸発生率を比較することによって決定された、PLGAに対して優勢な配列を
として示してあり、それぞれのカラムの最大パーセントは、その位置について最高のアミノ酸発生率に対応する。
(図13)PLGA-1の位置あたりのパーセント・アミノ酸群が、共通配列および全体のアミノ酸群の発症率と比較することができる値を与えることを示す(pIII上に発現されたペプチドのコンビナトリアル・ライブラリーと比較して)。
(図14)PLGA特異的なファージから得られるバイオパンのラウンド3〜5からのペプチド配列を含む。
(図15)12アミノ酸の位置に対して、位置あたりのパーセント・アミノ酸発生率を比較することによって決定された、PLGAに対して優勢な配列を
として示してあり、それぞれのカラムの最大パーセントは、その位置について最高のアミノ酸発生率に対応する。
(図16)PLGA-2の位置あたりのパーセント・アミノ酸群が、共通配列およびアミノ酸群の発症率の全体の割合と比較することができる値を与えることを示す(pIII上に発現されたペプチドのコンビナトリアル・ライブラリーと比較して)。
(図17)PLGAについて選択したファージの増幅研究の例であって、PLGA-1配列は、
であり、
PLGA-2配列は、
であり、およびランダム配列は、
である。
(図18)PLGAについて選択したファージの結合親和性を示しており、PLGA-1配列は、
であり、
PLGA-2配列は、
であり、およびランダム配列は、本発明に従って
である。
(図19)(A)数回の洗浄後に材料に結合したPLGA-1ファージであって、スケール・バーは、1μmを表し、(B)PLGAに対するWTであって、試料は、20nmのz-スケールでの4μm×4μmであるAFMイメージを含む。
(図20)T59ペプチド
(T59ファージ由来の配列から合成される)は、PPyClに結合するが、PPyPSSまたはポリスチレン(PS)に結合しないことを証明する。結合は、ビオチン化されたT59ペプチドおよびストレプトアビジン-FITC標識化を使用して研究した。(a)T59ペプチドが添加されていない対照基質。(b)0.5×0.5cm2のPPyCl基質に結合した15μMペプチド。(c)0.5×0.5cm2のPPyCl基質に結合した15μMペプチド。(d)0.5×0.5cm2ポリスチレン(PS)基質に結合した15μMペプチド。全ての試料を等濃度のストレプトアビジン-FITCと共にインキュベートした。バー、10μm。
(図21)PPyClに結合したT59ペプチド(SEQ ID NO.1)は、血清含有培地中で安定なことを示す。結合は、ビオチン化されたT59ペプチドおよびストレプトアビジン-FITCラベルを使用して研究した。(a)T59ペプチドが添加されていない対照基質、(b)および(c)0.5×0.5cm2のPPyCl基質を15μMペプチドと共にインキュベートし、次いで、試料を血清含有培地(pH7.4および15%の血清中)に3時間(b)、7日間(c)、および3週間(d)置いた。バー、10μm。
(図22)GRGDSで修飾したT59ペプチド(SEQ ID NO.1)は、無血清環境におけるPPyClに対するPC12細胞の接着を促進することを示す。(a)無血清培地中においてPPyClに対するT59-RGDを伴わない、および(b)60μMのT59-RGDペプチドで、〜106細胞/試料をインキュベーションすることにより、0.75×0.75cm2のPPyCl表面に対して相互作用し、無血清培地中で細胞接着を促進した。バー、10μm。
Claims (20)
- 二機能性の特異性構造であって;
第1の結合ドメインおよび第2の結合ドメインを含むペプチド・リンカーであって、第1の結合ドメインは、電気伝導性ポリマーまたは生物分解性の材料である第1の生体材料に対して高親和性を有する特異的結合について選択的であり、および第2の結合ドメインは、第2の生体材料に対して高親和性を有する特異的結合について選択的を含む特異性構造。 - 第1の生体材料が電気伝導性合成ポリマーである、請求項1記載の特異性構造。
- 第1の生体材料が生物分解性の材料である、請求項1記載の特異性構造。
- 第1のまたは第2の結合ドメインがペプチドとしてさらに定義される、請求項1記載の特異性構造。
- 第2の結合ドメインが、核酸、ペプチド、タンパク質、発色団、薬物、成長因子、発色団、または有機分子の結合のためのものである、請求項1記載の特異性構造。
- 第2の結合ドメインがプラスチック、セラミック、金属、磁性、コンポジット、ポリマー、並びに修飾、および/またはこれらの組み合わせに対する結合のためのものである、請求項1記載の特異性構造。
- 第2の結合ドメインが細胞または生体分子に対する結合する、請求項1記載の特異性構造。
- 第1の結合ドメインおよび第2の結合ドメインを含む二機能性のペプチド・リンカーであって、
第1の結合ドメインは、合成の生体適合性ポリマー表面に対して選択的であり、および第2の結合ドメインは、材料に対して選択的であるペプチド・リンカー。 - 二機能性のリンカーを作製する方法であって:
生体材料に対して選択的に結合するペプチドのライブラリーから、第1の結合ドメイン・ペプチドを含むペプチドを選択する工程;および、
標的物質に対して選択的に結合するペプチドと共に第2の結合ドメインを含める工程、
を含む方法。 - ライブラリーがペプチド・ファージディスプレイ・ライブラリーである、請求項9記載の方法。
- 第2の結合ドメインが、選択的にタンパク質と結合するペプチドとしてさらに定義される、請求項9記載の方法。
- 第2の結合ドメインがペプチドとしてさらに定義され、およびペプチドが選択的にプラスチック、セラミック、金属、磁性、コンポジット、ポリマー、並びに修飾および/またはこれらの組み合わせと結合する、請求項9記載の方法。
- 電気伝導性合成ポリマーと選択的に結合するペプチドのライブラリーから、第1の結合ドメイン・ペプチドを含むペプチドを選択することを含む方法。
- 生物分解性の材料と選択的に結合するペプチドのライブラリーから、第1の結合ドメイン・ペプチドを含むペプチドを選択することを含む方法。
- ライブラリーが、ペプチド・ファージディスプレイ・ライブラリーである、請求項13または14記載の方法。
- 電気伝導性ポリマーと特異的に結合するペプチドを含む組成物。
- 生物分解性の材料に特異的に結合するペプチドを含む組成物。
- ペプチドが標的に結合するようにさらに機能をもつ、請求項16または17記載の組成物。
- 請求項16記載の組成物によって修飾された表面である電気伝導性ポリマー。
- 請求項17記載の組成物によって修飾された表面である生物分解性の材料。
Applications Claiming Priority (2)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
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