KR20050043973A - 금속 및 자기 물질의 펩티드 매개 합성 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 자기 물질에 특이적으로 결합할 수 있는 아미노산 올리고머를 포함하도록 개질된 생물학적 분자를 사용하여, 자기 나노결정을 제조하는 방법을 포함한다.

Description

금속 및 자기 물질의 펩티드 매개 합성{PEPTIDE MEDIATED SYNTHESIS OF METALLIC AND MAGNETIC MATERIALS}
관련 출원
본 출원은 2002년 9월 18일에 출원된 임시 특허 출원 제60/411,804호 (Belcher et al.)에 대해 우선권을 주장하며, 이 출원은 전체로서 본원에 참고자료로 삽입된다.
정부 지원의 진술
본 출원에서 수행된 연구는 부분적으로 미 육군 연구국 (Army Research Office)으로부터 재정 지원을 받았으며 (DADD19-99-0155), 정부는 일정한 권리를 소유할 수 있다.
또한, 뉴클레오티드 및(또는) 아미노산 서열 목록은 컴퓨터 상에서 읽을 수 있는 형태의 자료로서 참고자료로 삽입된다.
발명의 기술 분야
본 발명은 무기 물질에 결합할 수 있는 유기 물질, 구체적으로는 자기 물질을 포함하는 금속 물질에 강하고 직접적으로 결합하는 특이적인 펩티드 서열에 관한 것이다.
생물학적 시스템에서, 유기 분자는 탄산칼슘 및 실리카와 같은 무기 재료의 응집 (nucleation) 및 무기상에 대해, 그리고 구성 단위의 생물학적 기능에 필요한 복합체 구조로의 조립에 대해 놀랄만한 조절 수준을 나타낸다.
생물학적 과정에 의해 생성된 재료는 통상적으로 연질이며, 놀랍도록 복잡한 구조로 배열된 분자 구성 단위 (즉, 지질, 펩티드 및 핵산)의 대단히 간단한 집합으로 구성된다. 집적 회로 상에 최소의 특징부들을 구성하기 위해 계열 리쏘그래프 공정 (lithographic processing) 접근법에 의존하는 반도체 산업과 달리, 생물체는 대개 다수의 분자 성분에 대해 동시에 작용하는 비공유력을 사용하여 그의 구조적 "청사진"을 제작한다. 또한, 상기 구조는 흔히 임의의 분자 성분을 변화시키지 않으면서 둘 이상의 가용형 사이에서 훌륭하게 재배열될 수 있다.
차세대 미세전자 장치의 제조를 위한 "생물학적" 재료의 사용은, 종래 공정법의 한계를 해결할 수 있는 해법을 제공한다. 이 접근법에서 중요한 인자는, 생물학적-무기 재료의 적절한 친화성 및 조합의 동정, 독특하고 특이적인 조합을 생성하기 위한 합성 방법 및 인식의 동정, 및 적절한 구성 단위의 합성이다.
발명의 요약
본원 발명자들은 금속 및 자기 물질을 포함하는 무기 물질을 조절된 복잡한 구조로 조립시키고 그 조립을 조절하는 구조체를 설계했고 생물학적 물질을 제조했다. 특히 관심 대상인 것은 강자성 물질, 및 나노입자성 물질을 포함하는 입자성 물질이다. 흥미로운 전기, 자기 또는 광학적 성질을 갖는 물질을 제조하고 설계하기 위한 생물학적 물질의 용도는, 특징부의 크기를 감소시키고 예를 들어, 물질의 광전자적 성질의 조절, 뿐만 아니라 물질 제조의 조절을 개선시키기 위해 사용될 수 있다. 예를 들어, 본 발명에서는 종래에 고온 제조법을 포함했던 물질 제조를 위해 실온 방법이 개발되었다.
자기 물질을 포함하는 금속 물질 (예를 들어 Co, CoPt, SmCo5 또는 FePt)에 강하고 직접적으로 결합하는 특이적인 펩티드 서열을 선택하기 위해, 표면 상에 수백만 개의 상이한 펩티드 서열을 발현하는 대규모의 박테리아 파지 집단을 발현하는 조합 펩티드 파지 디스플레이 라이브러리를 바이오팬닝 (biopanning) 기술과 결합했다. 본원 발명자들은 자연계 및 II-VI 반도체에서 증명된 바와 같이, 펩티드를 포함하는 상기 금속 및 자기 물질 결합 분자가 무기 물질의 응집을 조절하는데 사용될 수 있음을 발견했다. 만일 단백질이 자기 물질을 포함하는 금속의 응집을 조절하는데 사용될 수 있다면, 자기 나노입자는 전통적인 방법을 사용하는 것보다 훨씬 저렴하고 용이하게 제조되고 응용될 수 있다. 자석 및 자기 물질을 포함하는 나노분자 금속은, 예를 들어 마이크로 또는 나노기계, 다이나모, 발전기, 자기 저장장치, 또는 자성이거나 자화될 수 있는 물질에 대한 기타 임의의 용도에 사용될 수 있다. 이러한 물질들의 다른 용도는, 자기 물질을 포함하는 금속 표면의 개질이다. 펩티드는 자기 물질의 표면 상에 물질을 결합시키는 링커로서 작용하여 복합 나노구조를 자가-조립시킬 수 있고, 이는 신규한 전자 장치의 기초를 형성할 수 있다.
본원 발명자들은 결합 펩티드를 선택 (조합 펩티드 라이브러리 및 팬닝 기술을 사용하여)하는 이러한 접근법이 자기 물질을 포함하는 금속 물질의 응집을 형성하고 조절하는데에도 사용될 수 있음을 인식했다. 자기 나노입자를 포함하는 금속 입자를 합성하기 위해 연구되고 있는 기타 기술들은, 불활성 분위기에서 비싼 시약을 사용하여 수행되어야만 하는 고온 합성을 기초로 하고, 소정의 형상 및 결정성을 갖는 나노입자를 포함하는 입자를 제조하기 위해 합성 후 추가의 공정 및 정제를 필요로 한다. 그 결과, 종래의 방식에 의한 자기 나노입자의 제조는 비용이 많이 들고 큰 규모 및(또는) 부피의 생산에는 도움이 되지 않는다. 본원에 제시된 접근법은 일반적으로 실온에서 값싼 시약을 사용하여 수행되어 조절된 결정성을 갖는 나노입자를 생성하고, 조절된 결정 구조 및 배향을 갖는 자기 나노입자를 포함하는 금속 입자의 합성 비용을 줄여준다.
자기 물질을 포함하는 금속 물질의 펩티드-매개 합성은, 자기 나노입자를 포함하는 금속 물질의 합성에 대해 훨씬 저렴하면서 환경 친화적인 접근법을 제공한다. 현재 자기 나노입자를 포함하는 금속 나노입자를 제조하기 위한 프로토콜은, 시간 및 비용 소모적이며 유기 계면활성제로 코팅된 나노입자를 생성한다. 이러한 계면활성제는 나노입자의 추가적인 개질에 바람직하지 않다. 분자 생물학 분야의 발전은 펩티드의 관능화를 가능케 하였으므로, 펩티드로부터 성장시킨 입자 및 나노입자도 용이하게 관능화될 것이다. 펩티드 관능화는 전자 장치로의 포함 및 자기 기억 장치로의 집적을 용이하게 한다.
본 발명의 한 형태는 금속, 나노입자-, 및 자기 또는 기타 물질들에 결합하고 잘-규칙화된 구조로 조직화되도록 유전자 조작된 자가-조립되는 생물학적 분자, 예를 들어 박테리오파지의 사용 방법이다. 이러한 구조는 예를 들어, 입자 및 나노입자의 나노규모 배열일 수 있다. 예를 들어, 박테리오파지를 사용하여 특정 표면 (예를 들어, 반도체)에 대해 자가-조립되는 생물학적 물질을 특이적인 결합 성질에 대해 선택할 수 있고, 따라서 본원에 교시된 개질된 박테리오파지 및 방법은 선택된 물질의 잘-규칙화된 구조를 생성하는데 사용될 수 있다.
보다 구체적으로, 본 발명은 자기 물질을 포함하는 금속 물질, 입자 및 나노입자를 생성하기 위한 조성물 및 방법을 포함한다. 하나의 실시태양은, 자기 표면을 포함하는 금속 표면에 특이적으로 결합하는 부분을 포함하는 분자를 제공하는 단계, 및 자기 물질 전구체를 포함하는 하나 이상의 금속 물질 전구체를 자기 입자를 포함하는 금속 물질을 형성케 하는 조건하에서 분자와 접촉시키는 단계를 포함하는, 자기 입자를 포함하는 금속 입자의 제조 방법이다. 분자는 예를 들어, 아미노산 올리고머 또는 펩티드와 같은 생물학적 분자일 수 있다. 올리고머는 예를 들어, 약 7 내지 약 100 아미노산 길이, 보다 특히 약 7 내지 약 30 아미노산 길이, 보다 특히 약 7 내지 약 20 아미노산 길이일 수 있고, 조합 라이브러리의 부분을 형성하고(하거나) 키메릭 분자를 포함할 수 있다.
본원에 개시된 자기 입자를 포함하는 금속 물질의 형태는, 예를 들어 Co, CoPt, SmCo5 및(또는) FePt로부터 형성될 수 있다. 본 발명의 다른 방법은 아미노산 올리고머 라이브러리를 자기 물질과 접촉시켜 자기 물질에 특이적으로 결합하는 올리고머를 선택하는 단계, 및 자기 물질에 특이적으로 결합하는 상기 올리고머를 용리하는 단계를 포함하는, 자기 물질과 비-자기 상호작용으로 결합하는 분자를 동정하는 방법을 포함한다. 올리고머 라이브러리는 자가-조립되는 분자의 라이브러리, 예를 들어 M13 파지 라이브러리와 같은 파지 라이브러리일 수 있다. 라이브러리는 심지어 박테리아에 포함될 수 있고, 외부적으로 조립될 수 있다.
자기 입자의 제조 방법은 또한, 자기 분자 형성을 개시하는 분자를 자기 물질 전구체 및 환원제와 접촉시키는 단계를 포함할 수 있다. 자기 물질 전구체에 의한 자기 분자의 형성을 개시하는 분자는 예를 들어 실온, 또는 예를 들어 100, 200 또는 심지어 300℃ 미만의 온도에서 접촉될 수 있다. 분자는 예를 들어, 약 7 내지 20 아미노산 길이의 아미노산 올리고머일 수 있다. 자기 입자는 자기 양자 점 (dot) 또는 심지어 필름 형태인 Co, CoPt, SmCo5 또는 FePt 자기 입자일 수 있다. 당업자는 본원에 개시된 하나 이상의 자기 입자 또는 그의 조합이 특정 용도를 위해 광범위한 분류의 1-, 2- 및 3-차원적 배치, 형상 등으로 위치될 수 있음을 인식할 것이다.
본 발명은 또한 자기 입자, 예를 들어 본원에 기술된 방법으로 제조된 나노입자를 포함한다. 이러한 자기 입자들은 자기 물질 결합 펩티드를 기질에 고정시키고; 자기 입자를 형성하는 조건하에서 하나 이상의 자기 물질 전구체를 자기 물질 결합 펩티드와 접촉시키고; 기질 상에 자기 결정을 형성시킴으로써 제조된 집적 회로의 일부를 형성할 수 있다. 자기 물질 결합 펩티드는 기질, 예를 들어 규소 또는 기타 반도체 기질에 화학적으로 연결될 수 있다. 본 발명의 자기 입자는 기억 장치, 단기간- 또는 장기간의 저장 장치, 인식 시스템의 제조, 또는 당업자가 상기 입자들로 제조할 수 있다고 인식할 임의의 용도에 사용될 수 있다. 본 발명의 자기 마이크로-, 나노- 및 펨토-입자에 대한 기타 예시적인 용도는 마이크로 또는 나노-모터, 다이나모 등을 포함한다.
본 발명의 다른 형태는 특이적인 정렬 성질을 갖는 나노입자의 생성 방법이다. 이는 예를 들어 특이적인 결합 성질을 갖는 M13 박테리오파지를 생성하고, 박테리오파지를 고농도로 증폭시켜 (예를 들어, 파지 라이브러리를 박테리아 숙주 배양물과 인큐베이션하여 감염, 복제시키고, 후속적으로 바이러스를 정제함), 파지를 재현탁시킴으로써 달성된다.
이러한 유사한 방법은 네메틱 (nemetic) 상의 방향성 배열 (order), 콜레스테릭 (cholesteric) 상의 꼬인 (twisted) 네메틱 구조, 및 스멕틱 (smectic) 상의 방향성 및 위치성 배열의 3가지의 액정상을 갖는 박테리오파지를 생성하는데 사용될 수 있다. 본 발명의 한 면은, 특정 반도체 표면에 결합하는 부분을 포함하는 자가-조립되는 생물학적 분자를 고농도로 증폭시키는 단계, 및 하나 이상의 반도체 물질 전구체를 자가-조립되는 생물학적 분자와 접촉시켜 결정을 형성시키거나 그 형성을 유도하는 단계를 포함하는, 폴리머, 예를 들어 필름의 제조 방법이다.
본 발명의 다른 형태는 예를 들어, 반도체 표면에의 결합에 대해 선택된 M13 박테리오파지를 사용하고, 파지를 다양한 농도로 재현탁함으로써, 상이한 콜레스테릭 간격 (pitch)을 갖는 나노입자를 생성하는 방법이다. 본 발명의 다른 형태는 예를 들어, 유전자 조작된 M13 박테리오파지를 사용하고 박테리오파지를 재현탁하여, 정렬된 나노입자로 주조 (casting) 필름을 제조하는 방법이다.
본 발명의 또 다른 형태는 나노입자의 용액을 표면에 첨가하는 단계, 표면 상의 나노입자 용액을 증발시키는 단계, 및 나노입자가 자기 분자인 경우 나노입자를 표면에 어닐링시키는 단계를 포함하는, 나노입자 필름의 제조 방법이다. 표면은 분자가 공유 또는 비-공유 결합으로 결합할 수 있는 임의의 미세제조된 고체 표면, 예를 들어 랭뮤어-보젯 (Langmuir-Bodgett) 필름, 유리, 관능화된 유리, 게르마늄, 규소, PTFE, 폴리스티렌, 갈륨 비소, 금, 은, 또는 표면 상에 결합된 아미노, 카르복실, 티올 또는 히드록실 관능기를 포함하는 물질을 포함할 수 있다. 어닐링은 통상적으로 불활성 기체 (예를 들어, 질소) 하의 고온에서 일어난다. 본 발명의 다른 형태는 본원에 기술된 방법으로 제조된 나노입자 필름이다.
도면의 간단한 설명
본 발명의 특징 및 장점을 보다 완전히 이해하기 위해 첨부된 도면과 함께 본 발명의 상세한 설명을 참조하고, 여기서 상이한 도면의 상응하는 도면 부호는 상응하는 부분을 나타내며:
도 1은 금 4f-전자 신호 (A-C)의 강도에 의한 파지-기질 상호작용의 X-레이 광전자 분광법 (XPS) 원소 조성 측정, 반도체 헤테로구조 (D)에 대한 파지 식별 모델, 및 두-성분 인식 결합부를 갖는 2가 합성 펩티드의 예시 (E-F)이고;
도 2는 본 발명에 따른 M13 파지의 스멕틱 정렬에 대한 개략도를 나타내고;
도 3은 (A-B) POM, (C) AFM, (D) SEM, (E) TEM, 및 (F) 전자 회절 삽입물 (insert)을 갖는 TEM 영상을 사용한 A7-ZnS 현탁액의 영상을 포함하고;
도 4는 (A) 필름의 사진, (B) 필름 구조의 개략도, (C) AFM 영상, (D) SEM 영상, (E-F) x-z 및 z-y 평면에 따른 TEM 영상으로서 M13 박테리오파지 나노입자의 영상을 포함하고;
도 5는 (A) 어닐링된 SmCo5 나노입자의 TEM 영상, (B) 선택 영역의 전자 회절 패턴을 갖는 TEM 영상, 및 (C) 어닐링된 SmCo5 나노입자의 STEM 영상이고;
도 6은 (A) Co에 대한 Co-특이적 파지의 특이성, 및 (B) 본 발명에 따른 Co 상의 Co-특이적 파지의 등온성을 예증하는 결합 분석의 예시이고;
도 7은 (A) CoPt에 선택적으로 결합하는 7-제한 (constrained) 펩티드를 발현하는 파지, (B) 무작위 펩티드를 발현하는 파지, 및 (C) 야생형 파지를 사용하여 제조된 CoPt 나노입자에 대한 일련의 고해상도 TEM 영상을 포함하고;
도 8은 (A) Co에 선택적으로 결합하는 12mer 펩티드를 사용하여 성장시킨 Co 나노입자의 고해상도 TEM 영상, 및 (B) 상응하는 전자 회절 패턴이고;
도 9는 (A) 12mer 펩티드를 발현하고 FePt에 대해 선택적인 파지를 사용하여 성장시킨 FePt 나노입자의 고해상도 TEM 영상이고, 여기서 (B)는 전자 회절 패턴을 나타내며, 이들 모두는 (C) 야생형 파지를 사용하여 성장시킨 FePt 나노입자와 비교되고;
도 10은 (A) 주형으로서 SmCo5에 선택적으로 결합하는 12mer를 사용하여 성장시킨 SmCo5 나노입자의 고해상도 TEM 영상, (B) (A)에서 선택된 영역의 전자 회절 패턴, 및 (C) 대조군으로서 야생형 파지를 사용하여 성장시킨 SmCo5 나노입자이고;
도 11은 (A) P3 단백질에 결합된 Co 나노입자를 갖는 Co-특이적 파지의 AFM 영상, 및 (B) 상응하는 MFM 영상이고;
도 12는 (A) 생물학적으로 제조된 FePt 나노입자의 자기이력 루프 (hysteresis loop), 및 (B) 보자력을 명확히 하기 위한 루프 중심부의 고해상도 스캔이고;
도 13은 (A) 생물학적으로 제조된 SmCo5 나노입자의 자기이력 루프, 및 (B) 보자력을 명확히 하기 위해 보다 작은 축 상에 플롯팅한 루프의 중심부이고;
도 14는 (A) P8 단백질 상에 CoPt 특이적 12mer 서열을 발현하도록 유전자 조작된 파지를 사용하여 성장시킨 CoPt 나노입자의 TEM, (B) 동일한 CoPt 나노입자의 고해상도 TEM 영상, (C) 상응하는 전자 회절 패턴, (D) 유사하게 제조된 입자의 STEM 영상, (E) Pt에 대한 STEM 맵핑, 및 (F) 본 발명에 따른 Co에 대한 STEM 맵핑을 포함한다.
발명의 상세한 설명
본 출원은 2002년 9월 18일에 출원된 임시 특허 출원 제60/411,804호 (Belcher et al.)에 대해 우선권을 주장하며, 이 출원은 도면, 요약서, 상세한 설명, 실시예, 청구범위 및 서열 목록을 포함하는 전체로서 본원에 참고자료로 삽입된다.
본 발명의 다양한 실시태양의 실시 및 사용은 이하 상세하게 기술되지만, 본 발명은 광범위한 특정 분야에서 실시될 수 있는 다수의 응용 가능한 발명적 개념을 제공하고 있음을 이해해야 한다. 본원에서 논의된 특정 실시태양은 본 발명을 실시 및 사용하기 위한 특정 방식을 단지 예시하고 있을 뿐이고, 본 발명의 영역을 한정하는 것이 아니다.
본 발명의 이해를 용이하게 하기 위해, 이하 다수의 용어들을 추가로 기술한다. 본원에 사용된 "금속 물질"은 예를 들어, 금속 합금, 금속 산화물 및 순수 금속을 포함하고 (이에 한정되지는 않음), 자성 및(또는) 강자성 성질을 가질 수 있거나 가지지 않을 수 있으며 결정성, 다결정성 또는 비결정성일 수 있는 성분일 수 있다. 금속 물질은 또한 입자, 패턴화된 표면 또는 층상 필름을 포함하는 다양한 공간적 형태로 존재할 수 있다. "입자"라는 용어는 상기 물질의 크기 및 형상을 지칭할 수 있고, 미크론-규모의 입자, 나노-규모의 입자 (나노입자로 불림), 금속 물질의 단일 분자, 및 본원에 기술되지는 않았지만 본원에 기재된 생물학적 방법으로 조절되는 기타 크기 및 형상의 물질을 포함한다.
본원에서 결합 분자라는 용어는, 금속 물질에 결합하거나 금속 물질을 인식 또는 성장시키는 분자로 정의된다. 결합 분자는 예를 들어 펩티드, 아미노산 올리고머 및 핵산 올리고머를 포함하지만, 이에 한정되지는 않는다. 이러한 결합 분자는 조합 라이브러리 스크리닝으로부터 선택되거나, 상기 라이브러리로부터 독립적으로 합성, 콘쥬게이트 또는 제조될 수 있다. 이러한 결합 분자들은 기질에 커플링, 즉 M13 바이러스와 같은 표면 또는 스캐폴드에 콘쥬게이트될 수 있는데, 여기서 결합 분자는 바이러스 외피 또는 다양한 결합 분자-콘쥬게이트된 구조 상에 디스플레이된다.
본원 발명자들은 이전에 펩티드가 반도체 물질에 결합할 수 있음을 입증했다. 본 발명에서 본원 발명자들은, 펩티드를 포함하는 결합 분자가 자기 물질을 포함하는 금속 물질에 특이적으로 결합할 수 있음을 입증했다. 이러한 펩티드는 또한, 나노입자를 응집시키고 자가-조립시키는 방법으로 개발되었다. 상기 펩티드들의 주요한 특징은 면 특이성을 갖는 기술적으로 중요한 물질을 인식하여 이에 결합하고, 크기-제한된 결정성 반도체 물질을 응집시키며, 응집된 나노입자의 결정상을 조절할 수 있는 능력이다. 펩티드는 또한, 나노입자의 종횡비를 조절하여 광학적 특성을 조절할 수 있다.
간단히 말해서, 생물학적 시스템이 매우 미세한 규모 상에서 아주 복잡한 구조를 조립하는 능력은, 유사한 방식으로 행동할 수 있는 비-생물학적 시스템을 동정하고자 하는 요구에 상당한 흥미를 부여했다. 특히 중요한 것은 흥미로운 전자적 또는 광학적 성질을 갖는 재료에 적용될 수 있는 방법일 것이지만, 자연 진화는 생물 분자와 상기 재료 간의 상호 작용에 대해서는 선택하지 않았다.
본 발명은 생물학적 시스템이 나노규모 구성 단위를 복합적이고 고도의 완전성, 조절된 크기 및 구성적 균일성을 갖는 기능적으로 복잡한 구조로 효과적이고 정확하게 조립한다는 인식에 기초한다.
펩티드 서열 선택
무작위 유기 폴리머 풀 (pool)을 제공하는 하나의 방법은, 결정성 반도체 구조와 반응된 상이한 펩티드를 제공하고, M13 박테리오파지의 pIII 외피 단백질에 융합된 7 내지 12 아미노산을 포함하는 무작위 펩티드의 조합 라이브러리에 기초하는, 파지-디스플레이 라이브러리를 사용하는 것이다. 5카피의 pIII 외피 단백질은 입자의 10-16 nm를 차지하면서 파지 입자의 한 말단 상에 위치한다. 파지-디스플레이 접근법은 펩티드 기질 상호 작용과 그 상호 작용을 코드하는 DNA 간의 물리적인 결합을 제공한다. 본원에 기술된 실시예에서는 예시로서 5가지의 상이한 단일-결정 반도체: GaAs(100), GaAs(111)A, GaAs(111)B, InP(100) 및 Si(100)를 사용했다. 상기 기질들은 펩티드 기질 상호작용의 조직적인 평가, 및 상이한 결정성 구조에 대한 본 발명의 방법의 통상적인 용도의 확인을 가능케 한다.
특정 결정에 성공적으로 결합된 단백질 서열은 표면으로부터 용리되고, 예를 들면 수백만 배 증폭되어, 더욱 엄격한 조건하에서 기질과 반응된다. 라이브러리에서 가장 특이적인 결합 펩티드를 갖는 파지를 선택하기 위해, 상기 방법은 5회 반복된다. 예를 들어 제3, 제4 및 제5회전의 파지 선택 후, 결정-특이적 파지가 단리되고 그 DNA가 시퀀싱된다. 결정 조성 (예를 들어, GaAs에는 결합하지만 Si에는 결합하지 않음) 및 결정성 면 (예를 들어, (100) GaAs에는 결합하지만, (111)B GaAs에는 결합하지 않음)에 대해 선택적인 펩티드 결합을 동정했다.
GaAs(100)으로부터 선택된 20개의 클론을 분석하여 GaAs 표면에 대한 에피토프 결합 도메인을 결정했다. 개질된 pIII 또는 pVIII 단백질의 부분 펩티드 서열은 하기 표 1에 도시했고, GaAs에 노출된 펩티드 중에서 유사한 아미노산 서열을 나타냈다.
GaAs 표면에 대한 노출 횟수가 증가할수록, 비하전된 극성 및 루이스-염기 관능기의 수가 증가된다. 제3, 4 및 5회 시퀀싱으로부터의 파지 클론은 각각 평균 30%, 40% 및 44%의 극성 관능기를 포함했지만, 루이스-염기 관능기의 분율은 동시에 41%에서 48%로, 55%로 증가했다. 본 라이브러리로부터의 무작위 12-mer 펩티드에서 단 34%의 관능기만을 구성해야 하는 루이스 염기가 증가한 것은, 펩티드 상의 루이스 염기와 GaAs 표면 상의 루이스-산 위치 간의 상호 작용이 상기 클론이 나타내는 선택적 결합을 매개할 수 있음을 시사한다.
라이브러리로부터 선택된 개질된 12-mer의 예상 구조는 작은 펩티드에 적당할 것 같은 신장된 (extended) 입체 구조를 가질 수 있으며, 이는 펩티드가 GaAs의 단위 세포 (5.65 Å)보다 더 길도록 만든다. 따라서, 펩티드가 GaAs 결정을 인식하는 데에는 작은 결합 도메인만 필요할 것이다. 표 1에 강조된 이러한 짧은 펩티드 도메인은 아민 루이스 염기, 예를 들어 아스파라긴 및 글루타민의 존재 외에, 세린- 및 트레오닌-풍부 부위를 포함한다. 정확한 결합 서열을 결정하기 위해, 7-mer 및 이황화 제한 7-mer 라이브러리를 포함하는 보다 짧은 라이브러리로 표면을 스크리닝했다. 결합 도메인의 크기 및 가요성을 감소시키는 상기 보다 짧은 라이브러리를 사용하면, 펩티드-표면의 상호 작용이 적어져 선택 세대 간에 예상되는 상호 작용 강도의 증가를 얻을 수 있다.
M13 외피 단백질에 대한 비오틴화 항체로 파지에 결합된, 스트렙타비딘-표지된 20-nm 콜로이드 금 입자로 태그된 파지는, 특이적인 결합의 정량적 분석에 사용되었다. 금 4f-전자 신호의 강도로 파지 기질 상호 작용을 관찰하면서 (도 1A-C), X-레이 광전자 분광법 (XPS) 원소 조성 측정을 수행했다. G1-3 파지의 존재없이, 항체와 금 스트렙타비딘은 GaAs(100)기질에 결합하지 않았다. 따라서, 금-스트렙타비딘 결합은 파지에 특이적이고 기질에 대한 파지 결합의 지시자이다. XPS를 사용하여, GaAs(100)에 특이적으로 결합했지만 Si(100)에는 그렇지 않은 GaAs(100)으로부터 단리된 G1-3 클론도 발견했다 (도 1A 참조). 상보적인 방식으로, (100) Si 표면에 대해 스크리닝된 S1 클론은 (100) GaAs 표면에 대해 낮은 결합을 나타냈다.
일부 GaAs 클론은 또한, 다른 섬아연광 구조인 InP (100)의 표면에 결합한다. 선택적 결합의 원리가 화학적 인지, 구조적 인지 또는 전자적인지 여부는 아직 연구 중에 있다. 또한, 기질 표면 상의 자연 산화물의 존재가 펩티드 결합의 선택성을 변화시킬 수 있다.
G1-3 클론은 GaAs의 (111)A (갈륨 말단) 또는 (111)B (비소 말단)면보다 GaAs(100)에 대해 우선적으로 결합하는 것으로 입증되었다 (도 1B, C). G1-3 클론 표면 농도는, 갈륨-풍부 (111)A 또는 비소-풍부 (111)B 표면 상에서보다 그의 선택에 사용되는 (100) 표면 상에서 더욱 높았다. 상기의 각각 다른 표면은 각각 다른 화학적 반응성을 갖는 것으로 알려져 있고, 여러 가지의 결정면에 대한 파지의 결합에서 선택성의 존재가 입증된 것은 놀라운 점이 아니다. 두 가지의 111 표면 모두는 부피가 큰 말단에 의해 동일한 기하학적 구조이지만, 표면 재구성을 비교할 때 표면 이중층의 최외측에 Ga 또는 As 원소를 갖는 것 간의 차이는 더욱 명백해진다. 여러 가지 GaAs 표면의 산화물 조성 또한 다를 것으로 예상되고, 이는 펩티드 결합의 특성에 영향을 미칠 수 있다.
G1-3 파지 클론에 노출된 기질로부터의 결합 에너지에 대한 Ga 2p 전자의 강도는 도 1C에 플롯팅했다. 도 1B의 결과로부터 예상되는 바와 같이, GaAs (100), (111)A 및 (111)B 표면 상에서 관찰된 Ga 2p 강도는 금 농도에 반비례한다. 보다 높은 금-스트렙타비딘 농도를 갖는 표면 상에서 Ga 2p 강도의 감소는, 파지에 의한 표면 덮임의 증가로 인한 것이다. XPS는 약 30 Å의 시료 채취 깊이를 갖는 표면 기술이므로, 유기층의 두께가 증가할수록 무기 기질로부터의 신호가 감소한다. 이러한 관찰은 금-스트렙타비딘의 강도가 실제 GaAs 표면 상에 결정 특이적 결합 서열을 포함하는 파지의 존재 때문임을 확인하는데 사용된다. 결합 연구는 동일한 수의 특이적 파지 클론을 동일한 표면적을 갖는 여러 가지 반도체 기질에 노출시켰을 경우, XPS 데이터와 관련되어 수행된다. 야생형 클론 (무작위 펩티드 삽입이 없음)은 GaAs에 결합하지 않았다 (플라크가 검출되지 않음). G1-3 클론에 대해, 용리된 파지 집단은 GaAs(111)A 표면에서보다 GaAs(100)에서 12배 컸다.
GaAs(100) 및 InP(100)에 결합된 G1-3, G12-3 및 G7-4 클론은 원자력 현미경법 (AFM)으로 영상화했다. In-P 결합은 GaAs 결합보다 높은 이온 특성을 가지고 있지만, InP 결정은 GaAs와 동종 구조인 섬아연광 구조를 갖는다. AFM에서 관찰된 10-nm 너비 및 900-nm 길이의 파지는 투과 전자 현미경법 (TEM)으로 관찰된 M13 파지의 치수와 일치하고, M13 항체에 결합된 금 구는 파지에 결합된 것으로 관찰되었다 (데이터는 도시하지 않았음). InP 표면은 고농도의 파지를 갖는다. 상기 데이터는 원자 크기, 전하, 극성 및 결정 구조를 포함한 기질 인식에 관련된 다수의 인자들이 존재한다는 것을 시사한다.
G1-3 클론 (음염색된)은 TEM 영상에서 GaAs 결정성 웨이퍼에 결합된 것으로 나타난다 (도시하지는 않음). 데이터는 결합이 주요 외피 단백질과의 비특이적 상호 작용에 의한 것이 아니라, G1-3의 개질된 pIII 단백질에 의해 이루어짐을 확인해 준다. 따라서, 본 발명의 펩티드는 조립되는 나노구조 및 헤테로구조 (도 1E)에서 특이적인 펩티드-반도체 상호 작용을 유도하는데 사용될 수 있다.
X-레이 형광 현미경법은 각각 다른 화학적 및 구조적 조성의 표면에 아주 근접한, 파지의 섬아연광 표면에 대한 우선적인 결합을 입증하는데 사용된다. 겹친 사각 패턴은 GaAs 웨이퍼로 에칭되는데, 이 패턴은 1-㎛의 GaAs 선, 및 각 선 사이에 4-㎛의 SiO2 간격을 포함한다 (도 1A-1B). G12-3 클론은 GaAs/SiO2 패턴화 기질과 상호 작용되고, 비특이적 결합을 감소시키기 위해 세척되어, 면역 형광 탐침, 테트라메틸 로다민 (TMR)으로 태그된다. 태그된 파지는 도 1B에서 3개의 보다 밝은 선 (만일, 유색이라면 적색) 및 중앙점으로 발견되어, G12-3이 GaAs에만 결합한다는 것과 일치한다. 패턴의 SiO2 부위는 파지에 의해 결합되지 않은 채로 유지되며 어두운 색이다. 이러한 결과는 파지에 노출되지는 않았지만 1차 항체 및 TMR에 노출된 대조군에서는 관찰되지 않는다 (도 1A). 파지가 결합되지 않은 G12-3 펩티드를 사용하여 동일한 결과를 얻었다.
GaAs 클론 G12-3는 AlGaAs보다 GaAs에 대해 기질-특이적인 것으로 관찰되었다 (도 1C). AlAs 및 GaAs는 실온에서 각각 5.66 Å 및 5.65 Å의 실질적으로 동일한 격자 제한을 가지므로, AlxGal-xAs의 삼원 합금은 GaAs 기질 상에서 에피택셜하게 성장될 수 있다. GaAs 및 AlGaAs는 섬아연광 결정 구조를 갖지만, G12-3 클론은 GaAs에 대해서만 결합 선택성을 갖는다. GaAs 및 Al0.98Ga0.02As의 교대되는 층으로 구성된 다층 기질이 사용된다. 기질 재료는 절단되고, 이어서 G12-3 클론과 반응된다.
G12-3 클론은 20-nm 금-스트렙타비딘 나노 입자로 표지된다. 주사 전자 현미경법 (SEM)에 의한 검사 결과, 헤테로구조 내에 Al0.98Ga0.02As의 교대되는 층이 나타났다 (도 1C). 갈륨 및 알루미늄의 X-레이 원소 분석은 헤테로구조의 GaAs 층에 대해서만 금-스트렙타비딘 입자를 맵핑하는데 사용되고, 화학적 조성에 대한 고도의 결합 특이성을 나타낸다. 도 1D에서, 형광 및 SEM 영상에서 나타난 바와 같이 반도체 헤테로구조에 대한 파지의 식별 모델을 나타냈다 (도 1A-C).
본 발명은 유기 펩티드 서열과 무기 반도체 기질 간의 결합을 동정, 개선 및 증폭하는데 대한 파지-디스플레이 라이브러리의 강력한 용도를 입증해 준다. 이러한 무기 결정의 펩티드 인식 및 특이성은 펩티드 라이브러리를 사용하여 GaN, ZnS, CdS, Fe3O4, Fe2O3, CdSe, ZnSe 및 CaCO3를 포함한 기타 기질로 확장되었다.
두 성분을 인식하는 2가 합성 펩티드 (도 1E-F)는 현재 설계되고 있는 중인데, 이러한 펩티드는 나노 입자를 반도체 구조 상의 특정 위치로 향하게 하는 잠재성이 있다. 상기 유기 및 무기쌍은 새로운 세대의 복합적이고, 복잡한 전자적 구조를 생성하기 위한 강력한 구성 단위를 제공해야 한다.
금속 및 자기 물질
본 발명에서, 결합 분자의 특이적인 결합 및 인식은 입자 및 나노입자를 포함하는 자성 및 강자성 물질을 포함 (이에 한정되지는 않음)하는 금속 물질에까지 예상치 못한 방식으로 확장된다. 자기 물질을 포함하는 금속 물질 (예를 들어 Co, SmCo5, CoPt 및 FePt)에 강하고 직접적으로 결합하고 이를 인식하는 특이적인 펩티드 서열을 선택하기 위해, 표면 상에 수백개의 상이한 펩티드 서열을 발현하는 대규모의 박테리오파지 집단을 발현하는 조합 펩티드 파지 디스플레이 라이브러리를 바이오팬닝 기술과 접목시켰다. 본원 발명자들은 이러한 자기 물질 결합 펩티드가 자연계, 및 III-V 및 II-VI 반도체에서 입증된 것과 마찬가지로 무기 물질의 응집을 조절하는데 사용될 수 있다는 것을 발견했다. 만일 단백질이 자기 물질의 응집을 조절하는데 사용될 수 있다면, 자기 나노입자는 종래의 방법을 사용하는 것보다 저렴하고 용이하게 제조될 수 있다. 나노분자 자석 및 자기물질은, 예를 들어 마이크로 또는 나노기계, 다이나모, 발전기, 자기 저장장치, 또는 자성이거나 자화될 수 있는 물질에 대한 기타 임의의 용도에 사용될 수 있다. 이러한 물질들의 다른 용도는, 자기 물질 표면의 개질이다. 펩티드는 자기 물질의 표면 상에 기타 물질을 결합시키기 위한 링커로서 작용하여 복합 나노구조를 자가-조립시킬 수 있고, 이는 신규한 전자 장치의 기초를 형성할 수 있다.
본원 발명자들은 결합 펩티드를 선택하는 이러한 접근법 (조합 펩티드 라이브러리 및 팬닝 기술을 사용하는)이 자기 물질에는 사용된 적이 없고, 자기 물질의 응집을 조절하는데에 펩티드가 사용된 적이 없었음을 인식했다. 자기 나노입자를 합성하기 위해 현재 다수의 기타 기술들이 연구 중에 있다. 이러한 모든 노력들은 불활성 분위기에서 비싼 시약을 사용하여 수행되어야만 하는 고온 합성에 기초하고, 소정의 형상 및 결정성을 갖는 나노입자를 제조하기 위해 합성 후 추가의 공정 및 정제를 필요로 한다. 그 결과, 종래의 방식에 의한 자기 나노입자의 제조는 비용이 매우 많이 들고, 규모 증가에 도움이 되지 않는다. 본 발명에 제시된 접근법은 실온에서 값싼 시약을 사용하여 수행되어 조절된 결정성을 갖는 나노입자를 생성할 수 있으므로, 자기 나노입자 합성에 보다 저렴한 접근법이 된다. 이 접근법은 또한, 결정 구조 및 결정 배향을 조절하는데 사용될 수 있다.
자기 물질의 펩티드-매개 합성은 자기 나노입자의 합성에 대해 훨씬 저렴하면서 환경 친화적인 접근법을 제공한다. 현재 자기 나노입자를 제조하기 위한 프로토콜은 시간 소모적이며 고가이다. 또한, 현재의 프로토콜은 유기 계면활성제로 코팅된 나노입자를 생성한다. 이러한 계면활성제는 나노입자의 추가적인 개질에 바람직하지 않다. 분자 생물학 분야의 발전은 펩티드의 관능화를 가능케 하여 펩티드로부터 성장시킨 나노입자도 용이하게 관능화될 것임을 암시하고 있고, 이는 전자 장치로의 포함 및 자기 기억 장치로의 집적을 용이하게 한다.
자기 나노입자를 제조하기 위한 현재의 기술은 고온, 불활성 분위기, 고가의 시약, 번거로운 정제, 및 합성후 개질을 필요로 하는 비싸면서 시간 소모적인 것이다. 입자 형성을 매개하기 위해 펩티드를 사용하여 자기 나노입자를 제조하는 이러한 신기술은, 이러한 모든 걱정을 경감시켜 보다 신속하면서 값싼 입자 합성을 가능케 한다. 또한, 결정 구조 및 배향을 보다 우수하게 조절할 수 있다.
대량의 나노입자를 제조하기 위해 충분한 펩티드를 제조하는 데에는 공지된 기술을 사용할 수 있다. 펩티드 또는 관심 대상인 펩티드를 제조하기 위해 유전적으로 설계된 유기체를 사용할 수 있다. 펩티드(들)은 예를 들어, M13 박테리오파지의 외피 단백질 중 하나에서 제조될 수 있다. 박테리오파지는 또한, 추가적인 외피 단백질에서 단백질을 발현하도록 설계 또는 조작될 수 있다. 나아가, 대장균 (E. coli)과 같은 박테리아는 하나 이상의 설계안 또는 관심 대상인 위치에서 관심 대상인 펩티드를 발현하도록 조작될 수 있다. 본원에서 제조된 자기 물질을 편재화 또는 배치시키기 위해 펩티드를 사용할 경우 하나의 분명한 장점은, 일반적으로 2차원으로 한정되는, 예를 들어 광리쏘그래피 (photolithography)를 사용하는 반도체 공정에서 고유의 한계점들을 갖지 않는다는 것이다. 본 발명의 펩티드(들)은 펩티드를 3차원적으로 배치 또는 합성시키는 매트릭스 내 또는 그 주위에서 사용될 수 있다. 그 다음, 이러한 펩티드들은 필름으로, 입구 등의 표면, 측면 또는 하부 상에 선 또는 줄무늬, 층, 돗트, 홈을 형성할 수 있다.
자기 나노구조는 기억 장치, 센서, 자성액 (ferrofluids) 등을 포함하는 다양한 용도를 가지고 있다. 본원에 기술된 물질, 입자 및 나노입자는 이러한 모든 분야에 적용될 수 있다.
나아가 또한, 본 발명의 금속 및 자기 물질은 이하를 포함하는 용도에서의 사용 방법에 사용될 수 있다. 추가적인 용도는 치료, 진단, 엔지니어링, 반응의 화학 엔지니어링 공정, 세포, 및 환경적 용도를 포함한다. 예를 들어, 자기 분리가 수행될 수 있다 (대규모 반응 공정에서의 벌크 분리를 포함). 기타 용도는 정제, 치료, 생체적합성, 약물 전달, 영상화 조영제, 외부적으로 배치될 수 있는 (adressable) 자석의 편재화 (생체내)를 포함한다. 약물 전달은 입자를 약물 또는 화학치료제에 커플링하여 자기장으로 신체내에 편재화시키는 것을 포함할 수 있다. 적절하게 입자를 설계하면 세포를 통과시킬 수 잇다. 다른 용도는 혈액-뇨 검출이다. 공학적 용도에서, 형광 및 복굴절 물질을 포함하는 광활성 물질에 커플링된 종횡비가 조절된 자기 입자로 디스플레이 장치를 제조할 수 있다. 결합 현상이 결합 원소에 커플링된 자기 입자에 대한 관성 모멘트를 변화시키는 센서 장치를 제조할 수 있다. 관성 모멘트 변화는 커플링된 광학적 활성제의 사용을 포함하여, 편광 소멸을 통해 검출될 수 있다. 다른 용도는 저장 장치이다. 예를 들어, 판독이 시간에 따라 변화하는 자기장에 대한 반응을 포함하는 메모리를 제조할 수 있다. 기록 단계는 특정 잔기의 특정 어드레스에 대한 결합을 포함할 수 있다. 세포에 대한 용도는 세포 개질 및 세포 유발자극을 포함한다. 세포 변형에서, 자기 입자의 크기는 시약과 커플링된 입자가 세포 내로 투과하도록 조정될 수 있다. 자기장은 투과를 위한 동력으로 사용될 수 있다. 이는 트랜스펙션 과정에 유용할 수 있다. 세포 유발자극에서 자기 입자와 커플링된 시약은 세포내로 들어갈 수 있고, 시간에 따라 변화하는 자기장이 세포 내에서 반응을 유발하는데 사용될 수 있다.
자기 분리는 예를 들어, 고전적인 친화도 기반 시험관내 분리 및 시약의 생체내 편재화를 포함한다. 친화도 기반 분리에서, 자기 나노입자는 보다 작은 크기 및 보다 큰 종횡비, 및 크기와 형상 분포에 대한 조절의 우수성으로 인해 장점을 가질 수 있다. 다른 장점은 입자가 높은 자기 유전율을 가질 경우에 있다. 입자는 길 수 있고 자기장 내에서 회전할 수 있으므로, 형상 효과로부터 추가적인 힘이 생성될 수 있다. 보다 강력한 분리력은 시약 mg 당 달성될 수 있다. 시약의 생체내 편재화에서, 자기 입자는 시약과 커플링되어 주사되거나 섭취될 수 있다. 공간적으로 변화하는 외부의 장 (field)을 대상에게 가하여, 가장 높은 구배 B 영역에 입자가 모이도록 할 수 있다. 시약을 더한 작은 크기의 입자는 시약이 조직에 접근하거나, 심지어 세포를 통과하도록 할 수 있다.
보다 구체적으로, 본원 발명자들은 조합 펩티드 파지 디스플레이 라이브러리 (즉, 표면 상에 수백 개의 상이한 펩티드 서열을 발현하는 대규모의 박테리아 파지 집단) 및 바이오팬닝 기술을 사용하여, 자기 물질 (ε-Co, CoPt, FePt)에 강하고 직접적으로 결합하는 특이적인 펩티드 서열을 선택했다. 자기 물질에 고친화도로 상호작용하는 특이적인 펩티드 서열을 선택 및 동정함으로써, 잠재적으로 자기 나노구조의 응집을 조절하는데 사용될 수 있는 펩티드를 신속하고 용이하게 동정할 수 있다. 자기 나노입자의 응집을 조절하는 펩티드를 사용하면, 주위 조건하에서 자기 나노구조를 합성할 수 있다. 자기 나노입자를 제조하기 위한 종래의 프로토콜은 흔히 정교한 합성 반응식 및 대규모의 정제를 필요로 하는데, 이는 펩티드-매개 응집이 나노입자 합성보다 훨씬 저렴한 대안을 제시할 수 있음을 의미한다.
본 발명의 하나의 특별한 장점은, 본 접근법으로 선택된 펩티드는 그 선택될 펩티드가 자기 물질에 특이적 및 직접적으로 결합하도록 한다는 것이다. 이러한 펩티드는 조절된 결정성을 갖는 자기 나노구조로 선택적으로 응집될 수 있는 것으로 입증되었다. 현재까지, Co 나노입자는 육방 밀집 구조의 Co로 제조되었고, CoPt 및 FePt 나노입자는 전형적으로 인바 (Invar) 합금과 관련된 층상 결정으로 제조되어 왔다. 이러한 결정 구조는 각각의 물질에 대해 가장 큰 자화성을 나타내고, 이러한 물질들은 나노미터 길이 규모에서 바람직한 자기적 성질을 갖는다. 이러한 성질들로 인해 상기 물질들은 차세대 자기 기억 장치를 제조하기 위한 훌륭한 후보 물질이 된다. 현재 기억 장치는 16.3 Gb/in2의 밀도를 갖는 CoCr 합금으로 제조된다. 이러한 나노입자의 크기가 작아질수록, 테라비트/in2 범위의 밀도를 갖는 기억 장치의 제조가 가능하게 된다. 본 발명에 의해, HCP P6/mm 결정성을 갖는 SmCo5 나노입자가 제조된다.
나노입자의 응집을 제어하는 데에 펩티드를 사용하면 나노입자의 기능화도 촉진한다. 전통 방식으로 제조한 나노입자는 종종 추가 기능화 (활성 또는 활성을 갖는 기 부착)를 만드는 소수성 계면활성제로 코팅되며 이는 귀찮은 과정이다. 본원에 개시된 바와 같이 제조된 나노입자는 펩티드로 코팅되는데, 이는 당업자에게 잘 공지된 다양한 화학적 및 생물학적 기술을 사용하여 상대적으로 기능화시키기 쉽다. 이들 나노입자를 더 기능화하는 것은 자가-조립이 복합 아키텍쳐 및 기억 장치로 하게 해 준다.
펩티드를 사용하여 이들 결정성을 제어하도록 제조된 입자들 및 나노입자들은 이들의 작은 크기, 높은 자기화율 및 제조의 용이성 때문에 자기 기록 산업을 혁신할 능력을 지닌다.
실시예 I. 펩티드 제조, 단리, 선택 및 특징확인
펩티드 선택. 파지 디스플레이 또는 펩티드 라이브러리를 0.1%의 TWEEN-20을 함유하는 Tris-완충 식염수 (TBS) 중의 반도체 또는 기타 결정과 접촉시켜, 표면 상에서 파지-파지 상호 작용을 감소시켰다. 실온에서 1시간 동안 흔든 다음, 표면을 pH 7.5의 Tris-완충 식염수에 10회 노출시켜 세척했고, TWEEN-20의 농도를 0.1%에서 0.5% (v/v)로 증가시켰다. 10분 동안 글리신-HCl (pH 2.2)을 첨가하여, 표면으로부터 파지를 용리했다. 그 다음, 용리된 파지 용액을 새로운 튜브에 옮기고, Tris-HCl (pH 9.1)로 중화했다. 용리된 파지의 역가를 측정하여 결합 효율을 비교했다.
제3 라운드의 기질 노출 후 용리된 파지를 그의 대장균 (Escherichia coli) ER2537 숙주와 혼합하여, LB XGal/IPTG 플레이트에 플레이팅했다. 라이브러리 파지는 벡터 M13mp19로부터 유래한 것으로 lacZα 유전자를 가지기 때문에, Xgal (5-브로모-4-클로로-3-인도일-β-D-갈락토시드) 및 IPTG (이소프로필-β-D-티오갈락토시드)를 함유하는 배지 상에 플레이팅했을 때 파지 플라크는 청색이었다. 랜덤 펩티드 삽입체를 갖는 파지 플라크를 선택하기 위해 청/백 스크리닝을 사용했다. 플라크를 찍어서 상기 플레이트로부터 DNA를 시퀀싱했다.
기질 제조. 기질 배향을 X-레이 회절로 확인했고, 적절한 화학 특이적 에칭으로 자연 산화물을 제거했다. 이하의 에칭을 GaAs 및 InP 표면 상에서 시험했다: 각각 1분 및 10분의 에칭 시간에서 NH4OH:H2O 1:10, HCl:H2O 1:10, H3PO4:H2O2:H2O 3:1:50. GaAs 및 InP 에칭된 표면에 대해 가장 우수한 원소비 및 최소의 산화물 형성 (XPS를 사용)은, 1분 동안 HCl:H2O를 사용한 다음 탈이온수로 1분 동안 세정하여 달성했다. 그러나, 라이브러리의 초기 스크리닝에서 GaAs에 대해 수산화암모늄 에칭을 사용했기 때문에, 기타 모든 GaAs 기질 실시예에 대해서도 이 에칭을 사용했다. Si(100) 웨이퍼를 1분 동안 HF:H2O 1:40 용액에서 에칭한 다음, 탈이온수로 세정했다. 모든 표면을 세정 용액으로부터 직접 꺼내 즉시 파지 라이브러리로 도입했다. 파지에 노출시키지 않은 대조군 기질의 표면은, AFM 및 XPS로 에칭 방법의 효과 및 표면의 형태에 대해 특징확인하고 맵핑했다.
GaAs 및 Al0.98Ga0.02As의 다층 기질을 분자 빔 에피택시로 GaAs (100)상에서 성장시켰다. 에피택셜하게 성장된 층을 5 x 1017 cm-3 수준에서 Si-도핑 (n-형)했다.
항체 및 금 표지. XPS, SEM 및 AFM 실시예에 대해서, 기질을 Tris-완충 식염수에서 1 h 동안 파지에 노출시킨 다음, 항-fd 박테리오파지-비오틴 콘쥬게이트, fd 파지의 pIII 단백질에 대한 항체, (인산염 완충액 중의 1:500, 시그마)에 30분 동안 도입한 후, 인산염 완충액에서 세정했다. 스트렙타비딘-20-nm 콜로이드 금 표지 (인산염 완충 식염수 중의 1:200 (PBS), 시그마)를 비오틴-스트렙타비딘 상호 작용으로 비오틴-콘쥬게이트된 파지에 결합시키고; 표면을 표지에 30분 동안 노출시킨 다음 PBS로 수 회 세정했다.
X-레이 광전자 분광법 (XPS). XPS에서 나타난 금 신호가 GaAs 표면과의 비특이적 항체 상호 작용이 아니라 파지에 결합된 금으로부터 나타나는 것임을 확실하게 하기 위해, XPS 실시예에 대해 하기 대조군을 제조했다. 제조된 GaAs (100) 표면을 (1) 파지 없이 항체 및 스트렙타비딘-금 표지에, (2) 파지 없이 G1-3 파지 및 스트렙타비딘-금 표지에, 그리고 (3) G1-3 파지 또는 항체 없이 스트렙타비딘-금 표지에 노출시켰다.
사용된 XPS 기구는 단색광 1,487-eV X-레이를 생성하는 알루미늄 애노드가 있는 피지컬 일렉트로닉스 (Physical Electronics) Phi ESCA 5700이었다. 모든 표본은 GaAs 표면의 산화를 제한하기 위해 파지를 금-태그 (상기 기술한 바와 같이)한 후 즉시 챔버에 도입했고, XPS 챔버 내에서 샘플의 탈기를 줄이기 위해 고진공에서 밤새 펌핑했다.
원자력 현미경법 (AFM). 사용된 AFM은 G 스캐너로 팁 스캐닝 방식에 의해 작동하는, 자이스 액시오버트 (Zeiss Axiovert) 100s-2tv 상에 장착된 디지탈 인스트루먼츠 바이오스코프 (Digital Instruments Bioscope)였다. 태핑 방식으로 공기 중에서 화상을 제작했다. AFM 탐침은 그의 공명 주파수 200±400 kHz 근처로 구동된 125-mm의 캔틸레버 및 20±100 Nm-1의 스프링 상수를 갖는 에칭된 규소였다. 스캐닝 속도는 대략 1±5 mms-1였다. 샘플의 기울기를 없애기 위해, 1차원 평면으로 영상을 보정했다.
투과 전자 현미경법 (TEM). 필립스 (Philips) EM208로 60 kV에서 TEM 화상을 제작했다. G1-3 파지 (TBS에서 1:100으로 희석됨)를 GaAs 단편 (500 mm)과 30분 동안 인큐베이션하여, 원심분리로 결합하지 않은 파지로부터 입자를 분리하고, TBS로 세정하여 TBS에 재현탁했다. 표본을 2%의 우라닐 아세테이트로 염색했다.
주사 전자 현미경법 (SEM). G12-3 파지 (TBS에서 1:100으로 희석)를 새로 절단된 헤테로-구조 표면과 30분 동안 인큐베이션하고, TBS로 세정했다. G12-3 파지를 20-nm 콜로이드 금으로 태그했다. 히타찌 (Hitachi) 4700 전계 방출 주사 전자 현미경 상에 장착된 노리안 (Norian) 검출 시스템으로, 5 kV에서 SEM 및 원소 맵핑 영상을 수집했다.
실시예 2: 바이오필름
본원 발명자들은 유기-무기 하이브리드 물질이 신규 물질 및 소자에 대한 새로운 길을 제공할 것임을 인지하였다. 크키가 제어된 나노구조로 인해 반도체 물질의 광학적 및 전기적으로 조율 가능한 성질을 부여하고, 유기 첨가제로 인해 무기 형태, 상 및 응집 방향성을 조정한다. 생물학적 물질의 단분산성은 매우 배열된 (ordered) 스멕틱 배열 구조에 일치되는 시스템을 만들어 준다. 본원 방법을 사용하여, 유전적으로 조작된, 자가-조립된 생물학적 분자, 예를 들어 특이적 반도체 표면의 인지 부분을 갖는 M13 박테리오파지를 사용하여 II-VI 반도체 물질의 다중 길이 규모 정렬이면서 매우 정렬된 나노미터 단위를 생성하였다.
본원 발명의 구성 및 방법을 사용하여, 본원에 기술된 인지 및 자가-배열 시스템을 사용하여 반도체 물질을 나노- 및 다중 길이 규모로 정렬을 이루었다. 반도체의 인지 및 자가 배열을 이용하여 현재의 광리쏘그래피 (photolithographic) 성능을 넘는 전자 소자의 마이크로 가공을 향상할 수 있다. 이들 물질의 적용으로, 광전자 소자 예컨대 발광 디스플레이, 광학적 검출기 및 레이저; 고속 인터커넥트; 및 나노미터 규모 컴퓨터 성분 및 생물학적 센서를 들 수 있다. 본 발명을 사용하여 만들어진 바이오필름의 다른 용도로, 잘 배열된 액정 디스플레이 및 유기-무기 디스플레이 기술을 들 수 있다.
필름, 섬유 및 다른 구조는 심지어 생물학적 톡신을 비롯한 소분자의 검출을 위한 고밀도 센서를 포함할 수 있다. 다른 용도로 광학적 코팅 및 광학적 스위치를 포함한다. 임의로, 본원에서 기술한 물질의 하나 또는 그 이상을 사용하여 단일층 또는 다중층으로 또는 심지어 이들의 조합으로 또는 이들을 스트리에이션으로 의료 임플란트 또는 뼈 임플란트를 위한 스캐폴드를 구성할 수 있고, 이는 당업자에게는 자명할 것이다.
본원 발명의 다른 용도로 전기 및 자기 인터페이스, 또는 심지어 고밀도 저장, 예컨대 양자 컴퓨팅을 위한 용도의 3D 전자 나노구조의 구성을 포함한다. 다르게는, 의료 용도를 위하여 재구성될 수 있는 바이러스의 고밀도 및 안정한 저장물, 예를 들어 생물학적으로 적합한 백신, 보조제, 필름으로 만들어진 백신 용기는 본 발명으로 만들어진 매트릭스로 만들 수 있다. 정보 저장, 예를 들어 아머 (armor)나 코딩된 천에서 방어 친구 또는 적을 동정 (identification)하는 부문은 동정을 위한 양자 도트 패턴에 기초한다. 본원의 나노섬유는 심지어 화폐의 코딩 및 동정에도 사용될 수 있다.
잘 배열·제어된 2차원 및 3차원 구조를 나노길이 규모로 구축하는 것은 차세대 광학적, 전자 및 자기 물질 및 소자를 구축하는 분야의 주요한 목적이다. 특이한 나노입자를 제조하는 현재 추세가 되고 있는 방법은 길이 규모 및 물질의 유형에 의하여 제한된다. 본원 발명은 자가-조립 유기 또는 생물학적 분자 또는 입자, 예를 들어 M13 박테리오파지의 성질을 활용하여, 사용될 수 있는 반도체 물질의 범위 뿐만 아니라 나노입자의 정렬, 크기 및 규모를 확장할 수 있다.
본원 발명자는 이방성 형태를 갖는 생체물질이 대체적인 방식으로 잘 배열된 구조를 구축함을 인식하였다. 특이적 반도체 표면에 대한 인지 부분 (펩티드 또는 아미노산 올리고머)을 갖는 유전적으로 조작된 M13 박테리오파지를 사용하여 II- IV 반도체 물질의 나노- 및 다중 길이 규모의 정렬을 달성하였다.
세쓰 (Seth) 및 동료들은 위치 및 방향 배열성이 있는 Fd 바이러스 스멕틱 배열의 특징을 규명하였다. Fd 바이러스의 스멕틱 구조는 나노입자의 2차원 및 3차원 정렬을 구축하는 데에 구조의 다중 규모 및 나노규모의 배열 모두에 커다란 용도를 갖고 있다. 박테리오파지 M13은 유전적으로 변형할 수 있고, Fd 바이러스와 동일한 모양을 갖게끔 성공적으로 선택될 수 있으며 II-VI 반도체 표면에 대하여 특이한 결합 친화도를 가지므로 박테리오파지 M13을 사용하였다. 따라서, M13은 나노입자의 다중 규모 및 나노규모의 배열을 수행할 수 있는 스멕틱 구조에 대한 이상적인 공급원이다.
본 발명자는 반도체 표면에 결합할 수 있는 펩티드 삽입물을 함유하는 M13 박테리오파지를 찾기 위한 조합 스크리닝 방법을 사용하였다. 이들 반도체 표면은 황화아연, 황화카드뮴 및 황화철과 같은 물질을 포함한다. 분자생물학 기술을 사용하여, 특이 반도체 물질 및 물질 표면에 결합하는 박테리오파지 조합 라이브러리 클론을 클론시키고 액정 형성에 충분할 만큼 높은 농도까지 증폭하였다.
섬유상 (filamentous) 박테리오파지, Fd는 기다란 막대기 모양 (길이: 880 nm, 직경: 6.6nm)이고 단분산 분자량 (분자량: 1.64×107)을 갖는다. 이들 성질로 인해 고농도 용액에서 용액 (lyotropic) 액정 거동을 갖게끔 한다. 생물학적 선택성 및 자가-조립성을 이용하여 박테리오파지의 이방성 모양을 잘 배열된 나노입자를 구축하는 방법으로 개발하였다. 단분산 박테리오파지를 표준 증폭 방법을 통하여 제조하였다. 본원 발명에서, M13, 유사한 섬유상 박테리오파지를 유전적으로 변형하여 황화아연, 황화카드뮴 및 황화철과 같은 나노입자를 결합하였다.
박테리오파지의 중간규모 배열을 들어 나노입자의 나노규모의 배열을 형성을 설명하였다. 이들 나노입자를 미크론 도메인 및 센티미터 길이 규모로 더욱 조직화하였다. 반도체 나노입자는 양자 제한 효과를 보여주며, 액정 내에 합성 및 배열될 수 있다.
특이 펩티드 삽입물을 함유한 박테리오파지 M13 현탁액을 AFM, TEM, 및 SEM을 사용하여 만들고 확인하였다. 나노입자의 균일 2D 및 3D 배열을 모든 샘플에 걸쳐 관찰하였다.
AFM: AFM은 G 스캐너를 갖는 팁 스캐닝 모드에서 작동하는, 짜이스 액시오버트 (Zeiss Axiovert) 100s-2tv에 장착된 디지탈 인스트루먼츠 바이오스코프 (Digital Instruments Bioscope)를 포함한다. 트랩핑 모드를 사용하여 공기 중에서 화상을 찍었다. AFM 프로브는 125 mm 캔틸레버를 갖고 200 ± 400 KHz의 공명 주파수 그처에 구동되는 스프링 상수가 20 ± 100 Nm-1인 에칭된 실리콘이다. 스캔 속도는 1±5 mms-1 정도이다. 샘플 경사를 제거하기 위하여 1차 면을 사용하여 화상을 고르게하였다. 도 2A 및 2B는 AFM을 사용하여 관찰된 M13 파지의 스멕틱 정렬의 개략적 다이어그램이다.
TEM: 60kV에서 필립스 (Philips) EM 208을 사용하여 TEM 화상을 찍었다. G1-3 파지 (TBS에서 1:100으로 희석)을 30분 동안 반도체 물질과 함께 배양하고, 원심분리하여 비결합 파지로부터 입자를 분리하고, TBS로 세정하고, TBS에서 재현탁시켰다. 샘플을 2% 우라닐 아세테이트로 염색 (staining)하였다.
SEM: 파지 (TBS에서 1:100으로 희석함)를 30분간 금방 제거한 헤테로 구조 표면에 배양하고, TBS로 세정하였다. G12-3 파지를 20 nm 콜로이드성 금으로 태그하였다. 5kV에서 히타치 4700 전계 방출 전자 주사 현미경에 장착된 노리안 검출 시스템을 사용하여 SEM 및 원소 맵핑 화상을 수집하였다.
표준 분자 생물학적 기술을 사용하여 반도체 표면에 특이한 결합 성질을 갖는 유전적으로 조작된 M13 박테리오파지를 증폭시키고 정제하였다. 다량 증폭을 위하여 3.2mL의 박테리오파지 현탁액 (농도: ~107 파지/㎕) 및 밤새 배양한 컬쳐 4mL를 400 ml LB 배양액에 첨가하였다. 증폭 후에, ~30mg의 펠렛이 침전되었다. 실온에서 Na2S 용액을 ZnCl2로 도핑한 A7파지 현탁액에 첨가함으로써 현탁액을 제조하였다. 각각 1mM ZnCl2 및 Na2S 용액 20㎕을 ~ 30 mg의 파지 펠렛에 첨가함으로써 A7 파지 현탁액의 최대 농도를 제조하였다. 269nm에서 3.84 mg/mL의 소멸계수를 사용하여 그 농도를 계산하였다.
등방성 현탁액의 농도가 증가할수록, 방향적 배열성을 갖는 네메틱 상, 비틀어진 네마틱 구조인 콜레스테릭 상, 및 방향적 및 위치적 배열성을 을 갖는 스멕틱 구조 모두 관찰되었다. 이들 상들은 나노입자를 갖지 않는 Fd 바이러스에서 관찰되어졌다.
편광 현미경 (POM): M13 파지 현탁액을 편광현미경을 통하여 확인하였다. 각 현탁액을 직경 0.7 mm의 유리모세관 튜브에 충전하였다. 고농도 현탁액 (127 mg/mL)은 평행 편광 하에서 무지개빛 [5]을 나타내었고 교차 편광하에서 스멕틱 결을 보였다 (도 3A). 표 2에 나타난 바와 같이 현탁액의 농도를 바꾸어가면서 도 3B의 콜레스테릭 간격 (pitch)을 조절할 수 있었다. 샘플 제조 후 24시간 후에 간격 길이를 측정하고, 현미경 사진을 찍었다.
콜레스테릭 간격 및 농도와의 관계
농도(mg/ml) 간격 길이(㎛)
76.30 31.9
71.22 51.6
56.38 84.8
50.52 101.9
43.16 163.7
37.04 176.1
27.54 259.7
AFM. :
AFM 관찰을 위하여, M13 박테리오파지 현탁액의 M13 현탁액 5㎕ (농도: 30mg/㎛)을 데시케이터 내에서 4시간 동안 3-아미노 프로필 트리에틸 실란에 의하여 실란화된 8mm × 8mm 운모 기질 위에서 24시간 동안 건조하였다. 탭핑 모드를 사용하여 화상을 찍었다. 길이 880nm, 폭 6.6nm의 M13 박테리오파지의 이방성 모양 때문에 자가-조립 배열 구조가 관찰되었다. 도 3C에서, M13 파지는 사진면에 놓여있고, 스멕틱 정렬을 형성하였다.
SEM:
SEM 관찰을 위하여, 박테리오파지 및 ZnS 나노입자 스멕틱 현탁액 샘플을 건조하는 임계점 (박테리오파지 현탁액 농도, 127 mg/mL)을 준비하였다. 도 3D에서, 나노입자가 풍부한 영역 및 박테리오파지가 풍부한 영역을 관찰하였다. 나노입자 및 박테리오파지 간의 분리 길이는 박테리오파지의 길이와 상응하다. ZnS 부르자이트 결정 구조를 TEM으로써 스멕틱 현탁액의 희석 샘플을 사용한 전자 회절 패턴에 의하여 확인하였다 (도 3E 및 3F).
바이오필름의 제조
박테리오파지 펠렛을 트리스 완충 염수 400 ㎕ (TBS, pH 7.5) 및 1 mM ZnCl2 200㎕에 현탁하고, 여기에 1mM Na2S를 첨가하였다. 실온에서 24시간 동안 요동시킨 후, 현탁액 (1mL의 에펜도르프 튜브에 함유)을 데시케이터에서 1주일 동안 천천히 건조시켰다. 반투명한 필름 ~15 ㎛ 두께가 튜브의 내측에 형성되었다. 도 4에서 보여진 이 필름을 집게를 사용하여 조심스럽게 취하였다. 바이오필름의 개략적 다이어그램을 도 4B에 나타내었다.
바이오필름의 SEM 관찰: A7-ZnS 필름의 나노규모 박테리오파지 정렬을 SEM을 사용하여 관찰하였다. SEM 분석을 수행하기 위하여, 아르곤 분위기 하에서 필름을 자르고, 다음에 2nm의 크롬으로 진공 부착을 통하여 코팅시켰다. 도 4D의 매우 조밀하게 팩킹된 구조를 샘플 전체에 걸쳐서 관찰하였다. 개별 파지의 평균 길이, 895nm는 파지의 880nm에 사리에 맞게 유사하였다. 이 필름은 나노입자와 박테리오파지 층 간의 주기성을 보여주는 A- 또는 C- 유사형 라멜라 형태를 보여주었다. 주기성 길이는 박테리오파지의 것에 상응한다. 나노입자의 평균 크기는 개별 입자의 TEM 관찰과 유사한 ~20nm이다.
바이오필름의 TEM 관찰
에폭시 수지 (LR 화이트) 중에 하루 동안 필름을 내장함으로써 ZnS 나노입자 정렬을 조사하고, 촉진제 10㎕를 첨가함으로써 중합하였다. 경화 후, 수지를 라이카 울트라마이크로톰 (Leica Ultramicrotome)을 사용하여 절단하였다. 이들 ~ 50 nm 절편을 증류수 위에 띄우고, 블랭크 금 그리드 위에서 집어내었다. 개략도 도 4 E-F에서 x-z 면에 상응하는 로우로 평행하게 정렬된 나노입자를 관찰하였다. 각 박테리오파지는 A7 잔기의 5 카피를 갖고, 각 A7은 하나의 나노입자 (2~3 nm 크기)를 인지하며, 폭 약 20nm로 정렬되고 길이로 2 마이크로미터 초과로 펼쳐있다. 평행하게 형성된 폭 20nm 길이 2 마이크로미터 밴드는 ~ 700 nm로 떨어져있다. 이 차이는 TEM 내에서의 관찰에 대하여 파지 층의 기울어진 스멕틱 정렬로부터 나올 수 있는데, 이는 마빈 등에 의하여 보고되었다. 나노입자 층 면과 같이 y-z 축도 도1F에 나타난 바와 유사하게 관찰되었다. 정렬된 입자의 SAED 패턴은 ZnS 입자가 부르자이트 육방정계 구조를 가짐을 보여주었다.
바이오필름의 AFM 관찰: 바이러스 필름의 표면 배향을 AFM을 사용하여 조사하였다. 도 4C에서, 파지가 스멕틱 O로 명명된 표면 대부분에서 인접한 법선 벡터 (박테리오파지 축, director normal) 간이 거의 직각이 되는 평행하게 정렬된 헤링본 패턴을 형성하는 것으로 보여진다. 이 필름은 수십 마이크로미터까지 지속되는 범위가 길다란 법선 벡터 배열을 나타낸다. 두 도메인 층이 서로 만나는 영역의 일부에서, 두개 또는 세개의 다층 길이 규모의 박테리오파지가 스멕틱 C 배열 구조와 평행하고 지속적으로 정렬된다.
인지 및 자가-배열 시스템을 사용한 반도체 물질의 나노 및 다중 길이 규모 정렬은 전자 소자의 미래 마이크로가공을 개선한다. 이들 소자들은 현재의 광리쏘그래피 성능을 능가하는 능력을 갖고 있다. 이들 물질의 다른 중요한 용도로 광전소자 예컨대 발광 디스플레이, 광 검출기, 및 레이저, 고속 인터커넥트, 나노미터 규모 컴퓨터 성분 및 생물학적 센서를 포함한다.
실시예 III: 금속 및 자기 물질의 형성
파지 디스플레이 기술을 사용하여 자기 물질에 선택적으로 결합하는 신규한 펩티드를 개발하였다. 이들 특수 연구에서, 먼저 자기물질의 콜로이드 분산액을 합성함으로써 자기 물질의 필름을 제조하였다. 다음에 이들 콜로이드 용액을 Si 웨이퍼 위로 점적 코팅 (drop coating)하였고, 질소 하에서 어닐링하여 원하는 결정 구조를 생성하였다. 다음에 파지 디스플레이를 이들 필름 위 (ε-Co, CoPt 및 FePt)에서 수행하고, 각 기질에 선택적으로 결합하는 펩티드를 개발하였다. 다음에 이들 펩티드를 사용하여, 목적의 펩티드를 발현하는 파지, 금속 염 및 환원제를 혼합함으로써 독특한 나노입자를 응집하였다.
제어된 크기 및 구성을 갖는 나노입자의 합성은 근본적이고 기술적인 관심을 끈다. 지난 수년간, 얻어진 나노입자의 크기 및 모양이 놀랍게 제어된 금속 및 반도체로 구성된 나노입자의 합성을 기술하는 논문이 아주 많이 나왔다. 최근에는, 파지 디스플레이를 통하여 동정된 펩티드가 무기 표면에 선택적으로 결합할 수 있고, 반도체 나노입자의 응집을 제어하는 데 사용될 수 있음을 보여주고 있다. 이 경우에서, 펩티드는 크기, 모양, 조성 및 심지어는 얻어지는 나노입자의 결정성을 제어할 수 있다. 반도체 나노입자의 합성을 제어하는 데에 펩티드의 성공 덕택에 관심이 되는 다른 물질에 이 기술을 적용하는 데에도 커다란 관심이 가고 있다.
특히 관심이 가는 상업적으로 유용한 물질 부류는 입자 및 나노입자를 포함하는 강자성체 (ferromagnet)이다. 강자성 물질은 자기 기록 산업에서 매년마다 수억 달러를 차지하는 초석이다. 현재 소자들은 높은 자기화율 및 제조의 용이성 때문에 데이터 저장에 CoCr 합금을 사용한다. 다른 물질은 금속성 Co인데 이는 107 ergs/cm3의 범위로 자기 이방성을 갖는다. 높은 자기 이방성은 직경 10nm 정도로 작은 입자가 단일 도메인으로 작용하고 기억 요소로 기능할 수 있음을 제시한다. 현재 기술은 수백 나노미터 범위의 도메인 크기를 갖는 기억 요소를 사용하므로, 10 nm 크기 범위의 Co 나노입자를 생성하는 것은 훨씬 더 조밀한 기억 장치를 이끌게 하는 극적인 개선일 것이다. 더 흥미있는 강자성 물질은 Pt의 자기 합금, 특히 FePt 및 CoPt이다. 이들 물질은 인바 효과 때문에 매우 큰 자기 이방성 (108 ergs/cm3)을 가지는데, Fe 및 Pt 원자의 층형성에 의해 야기되는 격자 상수 내의 섭동이 Pt가 자기 상태를 발달시키게 한다. 이들 시스템에 의해 가져지는 큰 이방성은 2 nm 정도로 작은 나노입자가 실온에서 강자성체로 작용하는 것을 제시하는데, 이는 이들이 매우 고밀도의 기억소자의 개발에 사용될 수 있음을 암시한다.
이들 시스템의 고 자기 이방성 때문에, 이들 물질로 이루어진 입자 및 나노입자의 합성에 아주 많은 노력이 들어갔다. 몇몇 어려운 합성 프로토콜이 ε-Co, FePt 및 CoPt에 대하여 개발되어 왔고, 이들 모두 동일한 기초적인 약점을 안고 있다. 이들 합성 전략 모두가 상승된 온도에서 계면활성제의 존재 하에서 나노입자의 한정된 침전에 의존한다. 이들 나노입자 제조의 모두가 비싼 시약으로 불활성 분위기에서 수행되어야 하므로, 매우 고가이고 규모 증가를 어렵게 한다. 더구나, 이들 제조는 종종, 원하는 결정성에 이르기 위하여 고온 어닐링 및 입자의 단분산 분포를 얻기 위해 크기 선택적인 침전을 비롯한 입자의 추가의 개질을 요구한다. 이들 가외의 합성 단계는 합성 전략의 비용을 증가시킨다.
이들 물질은 상업적으로 중요하기 때문에, 신규 합성 전략이 바람직하다. 펩티드 매개 합성을 자기 물질에 적용하는 것은 이러한 대체안을 제공한다. 이들 연구에서, 소기의 자성 물질 (Co, CoPt, SmCo5 및 FePt)에 파지 디스플레이 선택을 수행하여 높은 친화도로 자기 물질에 특이적으로 결합하는 펩티드를 동정하였다. 특징확인 후에, 이들 펩티드를 사용하여 자기 나노입자의 응집을 제어하였다. 이들 연구에서, 소기의 펩티드를 발현하는 파지를 소기의 금속의 금속염과 혼합하였다. 다음에 환원제 (NaBH4)를 첨가하여 나노입자를 생성하였다. 나노입자를 형성하고, TEM을 사용하여 확인하였다. 주위 조건에서 본원발명의 합성을 수행하여 자기 나노입자를 생성하기 위한 기존의 합성 전략의 더 값싼 대안을 제공하였다.
자기 나노입자의 X선 회절 분석
파지 디스플레이에서의 기질로 사용하기 위하여 자기 표면을 생성하여야 했다. 이를 달성하기 위해, 자기 나노입자를 통상의 방식으로 제조하고, Si 웨이퍼에 점적 코팅하였다. 파지 디스플레이 연구를 시작하기 앞서, 표면을 x선 회절 (XRD)로 특징확인하여 물질이 적합한 결정성을 갖는가를 확인하였다.
ε-Co에 대하여 얻은 XRD 패턴은 문헌으로부터 얻은 패턴과 연관성이 잘 맞았으며, 특히 두드러지는 45도 및 50도 사이에 트리플릿 피크를 보여주는데, 이들은 ε-Co의 (221), (310) 및 (311) 결정면에 상응하기 때문이다. FePt 및 CoPt 패턴도 FePt 및 CoPt의 (001), (110), (111), (200), (002), (210), (112) 및 (202) 면에 상응하는 피크를 갖는 FePt11에 대한 문헌의 스펙트럼에도 일치하였다. SmCo5에서의 XRD는 (101), (110) 및 (111) 면을 나타내는 피크를 갖는 HCP SmCo5에 대한 문헌값과 일치하였다. 이는 HCP SmCo5 나노입자의 처음 보고된 합성이다. 도 5A는 SmCo5 나노입자의 고해상도 TEM 화상이고, 5B는 전자 회절 패턴을 보여주는 TEM 화상의 선택된 영역이다. 회절 패턴 내의 여러 스팟은 HCP SmCo5의 알려진 면과 잘 맞았다 (도 51B). 도 5C는 어닐링된 SmCo5 나노입자의 STEM 화상이며 이들의 크기, 모양 및 전체 형태를 도시한다.
서열 분석 및 결합된 파지의 결합 분석 (Binding Assay)
표 3은 관심있는 자기 물질에 결합하는 능력에 대하여 파지 디스플레이를 사용하여 선택된 모든 펩티드를 나열한다.
자기 결합 성질을 갖는 선택된 클론
물질 7개 구속 서열 12개 펩티드 서열
ε-Co * ALSPHSAPLTLY (서열 번호: 15)
CoPt NAGDHAN (서열 번호:12) SVSVGMKPSPRP (서열 번호: 16)
FePt SKNSNIL (서열 번호:13) HNKHLPSTQPLA (서열 번호: 17)
SmCo5 TKPSVVQ (서열 번호:14) WDPYSHLLQHPQ (서열 번호: 18)
* ε-Co에서 7개로 구속된 서열에 대하여는 공통 서열 (consensus sequence)이 얻어지지 않았다
선택된 모든 서열은 금속 표면에 대한 고친화성을 가는 유용한 서열처럼 보였다. 히스티딘 잔기 (residue)는 서열의 여러군데에서 보인다. 이미다졸 측기 때문에, 히스티딘은 금속에 대한 뛰어난 리간드이므로, 이들 서열 내에 히스티딘의 존재가 예기된다. CoPt에서 7- 구속 서열은 예외로 하면 Pt 합금에 대하여 단리된 서열 모두가 리신 잔기를 함유한다. 리신-Pt 상호작용은 중요 항암제인 시스플라틴의 기능에 중요하다고 믿어지고 있다. 리신-Pt 상호작용은 이들 서열이 이들 물질에 선택적으로 결합하는 것을 제시하나, 본원은 공지되든 비공지든 상호작용의 어떠한 메카니즘에 제한받지 않는다.
특이적 결합 분석: 자기물질에 대한 단리된 파지의 친화성을 결정하기 위하여, 두가지 연구를 수행하였다. 처음 연구에서, 다른 여러개의 펩티드 함유 파지를 본원의 Co 특이적 파지, 랜덤 파지 및 야생형 파지를 포함하는 Co 표면에 노출시켰다. 추가로, Co 특이적 파지를 다른 여러 물질 표면에 노출시켰다. 결과를 도 6에 묘사하였다. Co 특이적 파지는 야생형 파지 또는 랜덤 파지 라이브러리 서열보다 비교적 더 높은 친화성을 가졌다 (도 6A). 또한, Co-특이적 파지는 Si 보다 Co에 대한 더 큰 친화력을 보여주었는데, 이는 Co 표면에 더 선호적으로 결합함을 제시한다.
두번째 연구에서, Co 표면을 Co 특이적 파지의 용액 내로 침지시켰다. 이 연구를 다른 여러 파지 농도에서 반복하였다. 흡착된 파지의 양 대 파지의 농도를 플롯팅하였더니 (도 6B), 파지의 Co 표면으로의 흡착이 표면의 분석물의 흡착에 관한 랑뮤어 모델을 따르는 것을 나타내었다. 이 흡착이 랑뮤어 형태이기 때문에, 역수에 관한 플롯을 생성하니 흡착된 파지와 농도 간의 선형 상관관계를 보여주었다 (나타내지 않음). 이 직선의 경사는 결합상수와 일치하고, Co의 경우, 파지의 Kads는 2×10-12 M이었다. 이는 파지와 무기 표면간의 결합과 관련된 열역학적 성질의 처음 측정이어서 설명하기는 어렵지만, 이 결합상수의 크기는 다른 생물학적 상호반응과 상응한다. 이 접근은 CoPt 및 FePt 시스템에 대하여 사용될 수 있다.
두 연구는 파지 디스플레이를 사용하여 선택된 펩티드가 다른 물질이 아닌 Co에 관하여 특이적 결합을 가짐을 보여준다. 자기 물질을 포함하여 직접 금속 물질 형성에 이 특이성을 사용할 수 있다.
펩티드 매개 응집을 통해 제조한 나노입자의 TEM 분석
본원 발명의 한 태양으로, 결정성을 변형 및(또는) 제어하기 위하여 펩티드를 사용하여 나노입자를 제조하였다. 표 3에서 보인 7- 구속 서열을 사용하여 성장된 CoPt 나노입자의 고해상도 TEM 화상을 찍었다 (보이지 않음). 이들 나노입자는 0.19 및 0.22 nm의 격자 스페이싱을 갖고 있는데, 이는 L10 CoPt의 격자 스페이싱과 상관된다.
랜덤 펩티드 삽입물을 갖는 파지를 사용하여 성장된 CoPt 나노입자의 화상처럼, 야생형 파지를 사용하여 자란 나노입자의 고해상도 TEM 화상을 찍었다 (묘사하지 않음). 양 대조 연구에서, 나노입자는 형성되겠지만, 이들은 CoPt 선택적 펩티드가 있게끔 자란 입자가 갖는 결정성이 결여되었다. 파지의 부재 하에서 성장한 나노입자는 용액 밖으로 응집 및 침전되고 TEM 화상이 거의 불가능하게 만든다.
FePt에 선택적인 12mer를 발현하는 파지를 사용하여 성장한 FePt 나노입자의 고해상도 TEM 화상을 찍었다 (나타내지 않음). 이들 나노입자는 CoPt 나노입자와 유사한 격자 스페이싱을 나타내는데, 이는 L10 FePt으로 이루어졌음을 제시한다. 동일한 입자, 예를 들어 야생형 파지의 존재하에서 성장한 FePt 나노입자의 전자 회절 패턴을 찍었다 (나타내지 않음). 마찬가지로, 이들 나노입자는 FePt 선택적 파지로 성장한 나노입자의 결정성이 결여되었다. 또한, 파지가 없이 성장한 나노입자는 화상으로 찍을 수 있기 전에 용액밖으로 응집 및 침전하였다.
표1로부터의 7- 구속 서열을 사용하여 성장한 CoPt 나노입자의 고해상도 TEM 화상을 도 7에서 나타내었다. 이들 나노입자의 격자 스페이싱은 약 0.22nm이며 약 0.19nm의 HCP Co의 문헌값과 잘 맞으며 (도 7A), L10 CoPt의 격자 간격과 잘 맞는다. 선택된 영역을 또한 사용하여 나노입자의 전자 회절 패턴을 관찰하였다 (보이지 않음). HCP Co 면에 상관하는 몇개의 밴드가 회절 패턴 중에 존재하는데, 이는 나노입자가 실제로 HCP Co로 이루어짐을 나타낸다. 야생형 파지 (도 7C) 또는 비특이적 파지 (도 7B)로 한 대조 실험에서는, 나노입자는 여전히 형성하지만, CoPt 선택적 펩티드를 갖도록 성장한 입자가 갖는 결정성이 결여되었다. 파지가 없이 성장한 나노입자는 용액밖으로 응집 및 침전하였으며, TEM 화상화를 거의 불가능하게 하였다.
도 8은 Co에 특이적으로 결합하는 12mer를 발현하는 파지를 사용하여 성장한 Co 나노입자의 고해상도 TEM 화상을 보여준다 (도 8A). 이들 입자의 격자 스페이싱은 0.2nm인데, 이는 HCP Co (0.19 nm)의 문헌값과 잘 맞는다. 이들 나노입자에 대한 전자 회절 패턴을 위하여 선택된 영역을 선택하였다 (도 8B). HCP Co의 면에 상관하는 회절 패턴에 몇개 밴드가 존재하는데, 이는 나노입자가 HCP Co로 이루어졌음을 보여준다. 야생형 파지, 비특이적 파지와 관련하는, 또는 파지 없는 대조구 실험에서, Co 입자는 용액밖으로 응집 및 침전하였다 (보여주지 않음)
도 9A는 FePt에 선택적인 12mer를 발현하는 파지를 사용하여 성장한 FePt 나노입자의 고해상도 TEM 화상을 보여준다. 이들 나노입자는 CoPt 나노입자와 유사한 격자 스페이싱을 나타내는데, 이는 L10 FePt으로 이루어졌음을 제시한다. 도 9B는 상응하는 전자 회절 패턴이고, 도 9C는 야생형 파지의 존재하에서 성장한 FePt 나노입자의 화상이다. 야생형 파지의 부재 하에서, 나노입자는 FePt 선택적 파지로 성장한 나노입자의 결정성이 결여되었다. 또한, 파지가 없이 성장한 나노입자는 화상으로 찍을 수 있기 전에 용액밖으로 응집 및 침전하였다.
또한 SmCo5에 특이적인 12mer를 발현하는 파지를 사용하여 성장한 SmCo5 나노입자의 고해상도 TEM 화상을 찍었다 (도 10A). 선택적인 영역을 사용하여 전자 회절 패턴을 관찰하였다 (도 10B). 마찬가지로, 회절 패턴은 HCP SmCo5의 면과 상관된 몇개의 밴드를 보여주었다. SmCo5 시스템으로 수행된 대조 실험을 Co 시스템에 관찰된 것과 유사한 결과가 나왔으며, 비특이적 파지를 사용할 경우 나노입자가 용액으로부터 응집 및(또는) 침전되었다. 이러한 입자의 TEM 화상은 일부 결정 도메인을 보였으나, 물질의 대부분이 비정질이었다.
나노입자의 MFM 특징확인
자기력 현미경 (MFM)을 사용하여 나노입자의 자기 성질을 확인하였다. Co 나노입자를 응집하는 데에 사용되는 파지의 원자간 힘 화상을 먼저 찍었다 (도 11A). 나노입자의 커다란 응집물이 파지의 끝 부분에 명백하였는데, 예상한 바 대로 P3 단백질이 나노입자의 응집을 제어하고 있음을 나타낸다. 상응하는 MFM 화상을 찍어서 이들 결과를 확인하였다 (도 11B). 여기서, 파지가 비자기성이기 때문에 파지를 볼 수 없었으나, 나노입자의 응집물이 깨끗하게 보이는데, 이는 나노입자가 자기 비이방성을 가짐을 나타낸다.
SQUID:
본원 발명의 한 태양으로, 초전도 양자 간섭 소자 (SQUID) 자기계를 사용하여 나노입자의 자기 성질을 정성화할 수 있다. SQUID 자기계를 사용하여 이 입자를 더 특징확인하였다. SQUID로써, 파지 상에 발현된 12mer 펩티드를 사용하여 성장한 FePt 나노입자에 대한 실온 히스테리시스 루프를 찍었다 (도 12A). 스캔의 중심부의 고해상도 히스테리시스 루프도 찍어서 보자력의 존재를 명백화하였다 (도 12B). 이들 샘플은 비교적 낮은 보자력을 가졌다 (대략 50 Oe). 이 데이타는 주변 조건 하에서 성장한 강자성 나노입자의 첫번째 사례를 보여준다. 또한, 히스테리시스 루프를 생물학적으로 제조된 SmCo5 나노입자 상에서 측정하였다 (도 13). 히스테리시스는 이들 나노입자에 대하여 더 컸다 (400 Oe). SmCo5의 거시적 샘플은 전형적으로 FePt 보다 더 큰 보자력 값을 보여주므로 이 결과를 예기할 수 있었다.
P8 코트 단백질 상의 자기적으로 특이한 펩티드
본원 발명의 한 태양으로, M13 박테리오파지의 p3 단백질 상에 발현되는 자기 특이적 파지를 사용하여 자기 거동을 갖는 나노입자를 제조하였다. p3 단백질은 막대형 파지의 한 끝부분에 단지 존재하고 제한된 수로 존재한다 (파지 당 3-5 카피). 별법으로, p8 코팅 단백질은 파지의 길이를 따라 발현되고, 파지 당 수백 카피가 있다. 이런 까닭으로, p8 단백질을 조작하여 CoPt 특이적 펩티드를 발현하고, CoPt 나노입자를 파지의 길이를 따라 응집하였다. 물질 제조의 한 예를 아래에 나타내었다. 물질 및 생물 과학의 해당 업자에게 명백한 다른 방법도 불필요한 실험없이 사용할 수 있다.
자기 입자 및 나노입자를 비롯한 자기 물질의 응집 시에, 파지가 있든 없든, 펩티드를 충분히 높은 온도까지 가열하여 고온 어닐링 과정에 스캐폴드 (scaffold)과 관련있는 결합 분자를 태워 제거할 수 있다. 예를 들어, 500℃ 또는 1000℃까지 가열을 수 차례 수행하여 최적이 되게 태워 제거할 수 있다. 또한 이 온도는 금속 어닐링을 위한 범위일 수 있고, 이로써 다결정질 도메인을 단일 결정 도메인으로 융합할 수 있다.
방법
물질: 염화사마륨(III), 백금(II) 아세틸아세토네이트 (Pt(Acac)2), 디히드로겐 헥사클로로플라티네이트 (H2PtCl6) 및 옥타카르보닐 코발트 (CoCl2)를 알파 애사 (Alfa Aesar)로부터 구입하였다. 펜타카르보닐 철 (Fe(CO)5), 염화코발트 (CoCl2), 염화철 (FeCl2), 트리옥틸포스핀 옥시드 (TOPD), 나트륨 보로히드라이드 (NaBH4), 올레일 아민 및 올레산을 알드리치로부터 구입하였다.
ε-Co의 나노입자 합성. 5ml의 o-디클로로벤젠에 0.6g의 Co2(CO)8를 처음 녹임으로써 Co 나노입자를 제조하였다. 이 혼합물을 1시간 동안 교반하여 Co 및 20ml의 o-디클로로벤젠을 녹이고, Ar 하에서 3구 반응 용기 내에 0.416g의 TOPO 및 0.2mL의 올레산을 혼합하였다. 다음에 이 혼합물을 100℃로 가열하였다. 다음에, 5분간 진공에 노출시키고 용존된 모든 O2 및 H2O를 제거하였다. 다음에 혼합물을 비점까지 가열하고 (180℃), Co 용액을 첨가하였다. 혼합물이 흑색으로 변하고 CO 가스의 구름이 생성되었다. 환류 20분 후, 반응물을 실온까지 냉각하였다. 입자를 정제하기 위하여, Co 나노입자 용액 3mL를 에탄올 3mL과 혼합하였다. 1시간 후, 혼합물을 10000 rpm 으로 5분간 원심분리하였다. 침전물을 3mL의 CH2Cl2 다음에 3ml의 에탄올에서 재현탁시키고, 원심분리 단계를 반복하였다. 다음에 침전물을 3ml의 CH2Cl2에서 재현탁시켰다.
FePt의 나노입자 합성: Ar 하에서 20ml 페놀 에테르, 0.205g Pt(Acac)2 및 0.358g 1,2-테트라데칸디올을 혼합하여 100℃로 가열하였고, 그 후 0.16mL 올레산, 0.17mL 올레일 아민, 및 0.13 mL의 Fe(CO)5를 첨가하였다. 혼합물을 300℃로 가열하고, 30분 동안 환류하고 실온으로 냉각하게 하였다. FePt 나노입자를 Co 나노입자와 동일한 방식으로 정제하였다.
CoPt의 나노입자 합성: 0.16 g의 Co2(CO)8 을 0.13mL Fe(CO)5로 치환한 것을 제외하고는 FePt의 제조와 동일하게 제조하였다.
SmCo5의 나노입자 합성.: SmCo5의 나노입자를 제조하기 위하여 억류 침전법 접근으로 행하였다. 나노입자를 제조하는 데 이전의 수고에 이 기술을 적응시켰다. 38.75 mg CoCl2를 16.0 mg SmCl3과 혼합하고 페닐 에테르 20ml 중에 녹였다. 다음에 0.357ml의 올레산을 혼합물에 첨가하고, 다음에 Ar 하에서 100℃로 가열하였다. 다음에 1.35ml 트리옥틸포스핀을 첨가하였다. 다음에 혼합물을 10분 동안 진공에 노출하여 용액으로부터 남아있는 용존된 산소 또는 물을 제거하였다. 용액을 진공으로 퍼징한 후에, 290℃로 가열하여 페닐 에테르를 비등시켰다. 다음에 1mL의 수퍼안히드라이드 용액을 첨가하였다. 용액을 청색에서 흑색으로 즉시 변하였다. 다음에 흑색 혼합물을 20분간 환류하고 실온으로 냉각하게 하였다.
필름 형성.: 파지 디스플레이 선택을 위해서 필름을 제조하기 위하여, 나노입자의 콜로이드 용액을 Si 슬라이드 위로 점적 코팅하였다. 용매를 증발시켰다. FePt 및 CoPt의 경우, 다음에 이 슬라이드를 질소 하에서 30분 동안 700℃에 어닐링하여 L10 상을 형성하였다. XRD 분석을 이들 슬라이드 위에 수행하여 적당한 물질임을 확인하였다.
펩티드 선택.: 파지 디스플레이 라이브러리 기술을 사용하여 ε-Co에 배제적으로 결합하는 펩티드 및 CoPt 및 FePt의 L10-상을 찾았다. 구체적으로, 1㎛ (또는 초기양)을 시작하여 Ph.D. -12(tm) 및 Ph.D. -7 CTM 파지 디스플레이 펩티드 라이브러리 키트를 사용하여, 자기 기질 (TBS 1ml 중)에 대하여 선택을 개시하였다. ε-Co에 대하여, TBST 중에 NaBH4의 10mM 용액 중에 수행하였다. 5라운드의 팬닝 후, 펩티드 및 펩티드의 DNA를 단리하고 서열을 유니버시티 오브 텍사스 DNA 코어 퍼실러티 (University of Texas DNA Core Facility)로부터 얻었다. 박테리오파지 상에서 표시한 펩티드에 상응하는 이들 서열을 분석하여 공통 서열을 결정하였다. DNA 서열의 분석은 위치 당 아미노산의 퍼센트 풍부도로 구성된다. 처음 두 라운드에서 비특이적 결합의 가능성 때문에, 분석은 단지 마지막 세번 팬닝 라운드에서 수행하였다.
결합 친화도: 펩티드가 ε-Co, CoPt, 및 FePt에 특이적으로 결합하는가를 결정하기 위하여 결합 친화도를 결정하였다. 역가 수 (titer count)를 공통 펩티드 팬닝 연구로부터 얻고, ε-Co, CoPt, 및 FePt에 올리지 않는 WT 및 랜덤 펩티드의 적정 계수와 비교하였다. 다음에 파지의 농도를 변화하면서 팬닝 연구를 수행하여 흥미가는 금속 표면에 대한 파지의 결합 상수를 결정하였다.
Co의 펩티드 매개 응집: 약 880 ㎕ 물을 1mM CoCl2 100㎕ 및 20㎕의 파지 용액 (pfu=1011)과 혼합하였다. 혼합물을 천천히 30분간 휘젓고, 그 후 100 mM NaBH4 100㎕을 첨가하였다. 용액을 보텍스 교반하고, 다시 5분간 배양하였다. 다음에 CH2Cl2 중에 녹인 올레산 및 TOPO 용액을 100ml를 첨가하였다. 혼합물을 보텍스 교반하고 1시간 동안 천천히 휘저었다. 이 기간 동안 CH2Cl2 층이 어두운 회색으로 변하였다. 이를 여러 Co-1, Co-2, 야생형 파지도 및 파지를 포함하지 않는 TBS 용액으로 하여 반복하였다.
Co의 펩티드-매개 응집: 응집을 위해, 1 mM CoCl2 용액 50㎕을 1 mM H2PtCl6 용액 50㎕과 혼합하였다. 다음에 파지 용액 10mL를 첨가하였다 (pfu= 1011). 혼합물을 30분간 천천히 휘젓고 다음에 100mM NaBH4 20㎕를 첨가하였다. 용액을 즉시 보텍스 교반하여 텀블러에서 30분간 두었다. 최종 용액은 노란색이었다.
FePT의 펩티드 매개 응집: FeCl2 용액을 CoCl2 대신 사용하는 것을 제외하고는 CoPt와 유사한 방식으로 FePt를 제조하였다.
SmCo5의 펩티드 매개 응집: 1mM CoCl2 100㎕대신 16.7 ㎕의 1mM SmCl3 및 1mM CoCl2 83 ㎕로 대체한 것을 제외하고 Co 합성과 동일하다.
펩티드의 P8 발현: 유전적으로 변형된 E. coli를 20 mL LB 배지에서 밤새 증폭하고, 1:100으로 희석하고 다음에 O.D. =0.6으로 자라게 하였다. 테트라시클린-HCl (1000x) 및 100mM IPTG를 1mM 최종 농도가 되게 첨가하였다. IPTG는 변형된 p8 단백질의, 조립 동안에 바이러스 코팅 내로 혼입하기 위한 셀 내에서의 생성을 개시하였다. 혼합물을 1시간 동안 진탕하지 않고 놓아 두었다. 다음에 1시간 후에 헬퍼 파지에 의한 감염 다음에 39℃에서 밤새 진탕하였다. 다음에 파지를 원심분리 및 PEG 침전으로써 분리 및 정제하였다. 증폭된 파지 펠렛을 10mL TBS (pH 7.5)로 재현탁하고, 18 MW 물 중에 투석하였다. 5mM CoCl2 및 5mM H2PtC16의 0.5mL를 1mL의 증폭된 파지 스톡에 첨가하고 이를 스피닝 다운하여 상청액을 제거하였다. 60분간 진탕하고 이 후 100mM NaBH4 0.5mL를 환원제로 첨가하였다.
CoPt 면에 대한 예상된 값에 상응하는 많은 밴드를 보여주는 선택된 영역 전자 회절도과 함께 나노입자의 TEM 화상을 찍었다. P8 단백질을 따라 성장한 CoPt 나노입자를 갖는 이들 파지 중 하나의 STEM 화상을 또한 찍었다. 이들 구조의 길이는 파지의 길이와 연관있다 (800nm). 도 14A는 나노입자의 TEM 화상을 나타내고, 도 14B는 CoPt 면에 대한 예기된 값에 상응하는 많은 밴드를 보여주는 선택된 면적 전자 회절 패턴 (도 14C)을 갖는 해상 화상을 나타낸다. P8 단백질을 따라 성장한 CoPt 나노입자를 갖는 이들 파지 중 하나의 STEM 화상을 도 14D에서 나타내었다. Pt에 대한 EDS 맵핑 (도 14E) 및 Co에 대한 EDS 맵핑 (도 14F)에서 Co 및 Pt가 모두 동일한 농도에서 구조의 길이를 따라서 모두 발견됨을 나타내었다.
본원 발명은 파지 디스플레이를 사용하여 자기 물질에 결합하는 펩티드를 동정할 수 있음을 설명한다. 이러한 동정은 신속하고 비용 효과적이고 추가적인 물질을 요구하지 않는다. 다음에 이들 펩티드를 사용하여 자기 나노입자의 응집을 제어할 수 있어 얻어지는 나노입자의 크기, 구성 및 결정성 제어를 사용자에게 제공한다. 이들 펩티드는 주위 조건 하에서 나노입자의 합성을 가능하게 하여 현재 합성 전략의 바람직한 대체안이 되게한다.
파지 디스플레이 라이브러리 및 이들을 바이오팬닝에서 사용하는 실험 방법을 예를 들어 벨쳐 등의 미국 특허공개: (1) "Biological Control of Nanoparticle Nucleation, Shape, and Crystal Phase"; 2003년 4월 10일에 공개된 2003/0068900; (2) "Nanoscale Ordering of Hybrid Materials Using Genetically Engineered Mesoscale Virus"; 2003년 4월 17일 공개된 2003/0073104; (3) "Biological Control of Nanoparticles"; 2003년 6월 19일 공개된 2003/0113714; 및 (4) "Molecular Recognition of Materials"; 2003년 8월 7일 공개된 2003/0148380에 추가로 기술되어 있다.
본원 발명의 적용은 용도 방법을 포함하여 다음의 참고 문헌에 기술되어 있다. 자기 공명 화상 내의 초상자성 물질의 용도는 콜로이드 및 중합체로 피복된 초상자성 금속 산화물의 용도를 비롯하여 예를 들어 팔마치 (Palmacci) 등에 허여된 미국 특허 5262176 (1993년 11월 16일)에 개시되어 있고 이는 참고문헌에 전체로서 혼입되어 있다. 초상자성 물질은 또한 예를 들어 이는 펩티드 서열에 유도화된 생상용성 덱스트란 피복 초상자성 산화철 입자를 비롯하여 리 조셉슨 등, Bioconjugate Chem, 1999,10 186-191에 기술되어 있는데, 이는 본원에 참고문헌으로 전체로 혼입되어 있다. 적용은 자기 공명 화상화 및 자기 분리를 포함한다. 문헌 [J. Manuel Perez et al., J. Am. Chem. Soc., 2003, 125, 10192-10193]에서 핵산 및 단백질을 포함하는 다수의 표적을 검출할 수 있는 MRI를 포함한 자기 나노센서에서 사용되는 자기 나노입자의 바이러스 유도 자가 조립을 기술한다. 이 문헌은 참고문헌으로 본원에 전체가 기술되어 있다.
끝으로, 마이크로리쏘그래피 및 나노리쏘그래피를 포함하는 당업계의 다양한 공지된 방법, 및 기능화된 레지스트 및 자가 조립 단층을 사용하여 표면을 패턴화하였다.
본원 발명의 다양한 태양의 사용 및 제조를 아래에 자세히 설명하지만, 본원 발명이 다양한 특이한 문헌 내에 포함될 수 있는 많은 적용가능한 다수의 발명성 개념을 제공함을 인지할 것이다. 본원에서 설명되는 특이 태양은 발명을 만들고 이용하기 위한 특이한 방법의 단지 예시적인 것이고, 본원의 범위를 제한하는 것은 아니다.
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Claims (32)

  1. 자기 물질 표면에 특이적으로 결합하는 부분을 포함하는 분자를 제공하는 단계; 및
    자기 물질을 형성케 하는 조건하에서 하나 이상의 자기 물질 전구체를 상기 분자와 접촉시키는 단계
    를 포함하는, 자기 물질의 제조 방법.
  2. 자기 물질 형성을 개시하는 분자를 자기 물질 전구체 및 환원제와 접촉시키는 단계를 포함하는, 자기 물질의 제조 방법.
  3. 자기 물질 결합 분자를 기질에 결합시키는 단계;
    자기 물질을 형성하는 조건하에서 하나 이상의 자기 물질 전구체를 상기 자기 물질 결합 분자와 접촉시키는 단계; 및
    자기 물질을 형성시키는 단계
    를 포함하는, 자기 물질의 제조 방법.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 분자가 자기 물질 표면에 특이적으로 결합하는 부분으로서 아미노산 올리고머를 포함하는 것인 방법.
  5. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 분자가 조합 라이브러리 스크리닝으로부터 선택된 것인 방법.
  6. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 자기 물질을 단리하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
  7. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 분자가 자가-조립되는 분자의 일부를 포함하는 펩티드로서 추가로 정의되는 것인 방법.
  8. 제7항에 있어서, 상기 자가 조립되는 분자가 파지인 방법.
  9. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 자기 물질이 나노입자인 방법.
  10. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 분자가 표면 상에 하나 이상의 자기 물질 결합 아미노산 올리고머를 노출하는 키메릭 단백질을 포함하는 것인 방법.
  11. 결합 분자 및 하나 이상의 자기 물질 전구체를 사용하여 형성된 자기 물질.
  12. 금속염 및 환원제의 존재하에 자기 물질 특이적 결합 분자를 사용하여 형성된 자기 물질.
  13. 제11항 또는 제12항에 있어서, 나노입자를 포함하는 자기 물질.
  14. ε-Co에 특이적으로 결합하는 펩티드를 포함하는 조성물.
  15. CoPt에 특이적으로 결합하는 펩티드를 포함하는 조성물.
  16. FePt에 특이적으로 결합하는 펩티드를 포함하는 조성물.
  17. SmCo5에 특이적으로 결합하는 펩티드를 포함하는 조성물.
  18. 강자성 표면에 특이적으로 결합하는 펩티드를 포함하는 조성물.
  19. 분자의 라이브러리를 자기 물질과 접촉시키는 단계;
    라이브러리로부터 비-결합 분자를 제거하는 단계; 및
    자기 물질로부터 결합된 분자를 용리하는 단계
    를 포함하는, 자기 물질에 특이적으로 결합하는 분자의 단리 방법.
  20. 제19항에 있어서, 상기 분자 라이브러리가 파지 디스플레이 라이브러리를 포함하는 것으로 추가로 정의되는 것인 방법.
  21. 제19항에 있어서, 상기 분자 라이브러리가 조합 화학 라이브러리를 포함하는 것으로 추가로 정의되는 것인 방법.
  22. 제19항에 있어서, 상기 분자가 자기 물질에 특이적으로 결합하는 아미노산 올리고머를 포함하는 것인 방법.
  23. 결합 분자를 사용하여 합성된 입자의 용액을 표면에 첨가하는 단계;
    표면 상의 나노입자 용액을 증발시키는 단계; 및
    입자를 표면에 어닐링시켜 입자의 필름을 생성하는 단계
    를 포함하는, 입자 필름의 제조 방법.
  24. 제23항에 있어서, 상기 입자가 나노입자인 방법.
  25. 금속 표면에 특이적으로 결합하는 부분을 포함하는 분자를 제공하는 단계; 및
    금속 물질을 형성케 하는 조건하에서 하나 이상의 금속 물질 전구체를 상기 분자와 접촉시키는 단계
    를 포함하는, 금속 물질의 제조 방법.
  26. 자기 물질에 특이적으로 결합하는 분자를 300℃ 이하의 온도에서 자기 물질 전구체와 접촉시켜 자기 물질을 형성시키는 단계를 포함하는, 자기 물질의 제조 방법.
  27. 금속 물질에 특이적으로 결합하는 분자를 300℃ 이하의 온도에서 금속 물질 전구체와 접촉시켜 금속 물질을 형성시키는 단계를 포함하는, 금속 물질의 제조 방법.
  28. 자기 물질에 특이적으로 결합하는 올리고펩티드, 및 자기 물질을 포함하는 조성물.
  29. SmCo5 나노입자를 포함하는 조성물.
  30. 결합 분자-합성된 금속 입자를 포함하는 금속 물질.
  31. 다결정으로부터 단일 결정성 물질에 어닐링된, 결합 분자 합성된 금속 나노입자의 집단을 포함하는 금속 물질.
  32. 바이러스로부터 독립적으로 합성된, 결합 분자 합성된 금속 나노입자의 집단을 포함하는 금속 물질.
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