KR100945433B1

KR100945433B1 - 도데카머 펩티드 마이다스-1 내지 마이다스-12를 이용한 금나노구조물의 합성 방법

Info

Publication number: KR100945433B1
Application number: KR1020070099324A
Authority: KR
Inventors: 허호길; 김정옥; 김대희; 명노상
Original assignee: 광주과학기술원
Priority date: 2007-10-02
Filing date: 2007-10-02
Publication date: 2010-03-05
Also published as: KR20090034128A

Abstract

본 발명은 조합형 파지 디스플레이 펩티드 라이브러리(combinatorial phage display peptide library)로부터 분리된 금 합성용 도데카머 펩티드(dodecamer peptide) Midas-2와 Midas-2 내의 1번과 3번 내지 제12번 위치의 각 아미노산을 글리신으로 치환하여 얻은 Midas-1 및 Midas-3 내지 Midas-12를 이용하여 금 나노구조물(금 나노판 및 금 나노입자)을 합성하는 방법에 관한 것이다.

본 발명의 도데카머 펩티드(dodecamer peptide)인 Midas(구체적으로는, Midas-1 내지 Midas-12)를 이용하여 금 나노구조물(나노판 및 나노입자)을 합성하는 방법은 높은 온도, 높은 압력 및 독성 화학약품을 필요로 하지 않기 때문에 친환경적인 뿐만 아니라, 합성 공정이 매우 간단하여 비용 절감의 효과가 탁월하다.

한편, 본 발명에 사용되는 상기 도데카머 펩티드는 박테리아 유전자에 적용되어 박테리아 막 표면 상에 디스플레이됨으로써, 금속 복원(metal remediation) 및 금속 해독(metal detoxification)에 응용될 수 있으며, 상기 도데카머 펩티드를 이용하여 합성된 나노판들은 직경이 크고 두께가 얇아서 가스 센서(gas sensor) 등에 응용될 수 있다.

금 나노구조물, 단결정, 금 나노판, 다결정, 금 나노입자, 도데카머 펩티드 Midas, 조합형 파지 디스플레이 펩티드 라이브러리, TEM, SEM, EDS, SAED 패턴.

Description

도데카머 펩티드 마이다스-1 내지 마이다스-12를 이용한 금 나노구조물의 합성 방법{A Method for Synthesis of Gold Nanostructures Using The Dodecamer Peptides Midas-1 to Midas-12}

나노기술(nanotechnology)은 최근에 매우 빠른 속도로 발전하는 연구 분야로서, 1차원 이상의 나노미터 범위(일반적으로 1 내지 100 나노미터 규모)의 물질들의 합성 및 이러한 크기의 소자들의 제조와 관련된 응용 과학기술 분야이다. 나노구조물들의 물리적, 화학적, 기계적 및 전기적 특성들은 거대구조의 대응체(bulk counterpart)와 상이한 나노구조물의 차원(dimension)에 크게 의존한다. 화학증착(CVD)법, 분자 빔 에피텍시(MBE)법, 기상-액상-고상(VLS) 성장법, 용융법, 고화법, 열역학적 처리법, 전착법 등을 비롯한 다양한 방법을 이용하여 나노공학적 물질들을 합성한다. 그러나, 이들 종래의 기법들은 에너지 집약적이고 과다한 비용이 소요될 뿐만 아니라, 복잡한 장비들을 필요로 한다. 바이오미메틱 합성 (biomimetic synthesis) 방법들은 보다 청결하고, 비독성적이며, 환경친화적이고, 나노구조물들의 맞춤식(tailored) 차원 및 특성들을 달성할 수 있기 때문에, 나노공학적 물질들을 제조하는 새로운 방법들이다.

나노바이오기술(nanobiotechnology)은 생물 및 생화학과 접목된 나노기술로서, 물리적 및 화학적 방법들 대신에 나노규모 재료들의 합성에 적용되고 있다. 연구자들은 이제 그들의 관심을 신규 나노물질의 합성을 위한 새로운 루트로서 천연 생물학적 시스템으로 돌리고 있다. 몇몇 생물들과 미생물들은 세포내 및 세포외에서 무기 물질들을 천연적으로 생산 및 합성할 수 있다는 것이 잘 알려져 있다. 예를 들어, 규조류는 규산성 물질들을 합성하고, 주자성 박테리아(magnetotactic bacteria)는 세포질에서 자철석(Fe₃O₄) 나노입자들을 생산하며, S-층 박테리아는 세포 표면 상에서 석고 및 탄산칼슘 층들을 형성시킨다. 또한, 박테리아와 진균류를 비롯한 다수의 미생물들은 잠재적인 환경친화적 나노공장(nanofactory)로서 최근에 연구 대상으로 떠오르고 있다. 원핵생물들 중 Pseudomonas stutzeri AG259, Lactobacillus sp., Bacillus subtillis 및 Klebsiella aerogenes는 은(Ag), 금 (Au), Au-Ag 합금 및 CdS를 비롯한 각종 금속성 및 반도체성 나노입자들을 합성하는데 사용되었다. 진핵생물들 중 진균류인 Verticillium sp.는 세포내에서 금 및 은 나노입자들을 합성하는데 사용되었다. 진균류인 Fusarium oxysporum은 세포외에 서 금, 은 및 CdS 나노입자들 뿐만 아니라, Au-Ag 합금을 형성시킬 수 있다. 일부 연구 그룹들은 미생물들 이외에 식물 추출물들이 금속 나노구조물의 합성에 사용될 수 있다는 것을 밝혀냈다. 레몬그래스(lemongrass) 식물들과 HAuCl₄의반응에 의해 얇고 편평한 삼각형의 단결정 금 나노입자들을 고수율로 합성하였다. Aloe vera 잎 추출물을 이용한 HAuCl₄의환원에 의해 단결정의 삼각형 금 나노입자들과 구형 은 나노입자들을 합성하였다.

금속 나노입자들의 생물학적 합성에 대한 정확한 메카니즘은 불분명하다. 그러나, 미생물, 특히 박테리아를 이용한 나노입자들의 합성을 위해 제안된 메카니즘은 존재한다. 박테리아가 극한 환경 조건들(예컨대, 금속 이온 또는 금속의 높은 온도)에 노출될 때, 특이적인 방어 시스템이 개시되어 독성 환경 조건들을 극복하게 된다. 유출(발산) 시스템, 용해도 및 독성은 각각 산화환원 전위, 금속의 착화, 침전의 변화에 의해 세포내에서 및/또는 세포외에서 변화하고, 금속 이송 시스템의 결여는 미생물 방어 시스템으로서 제안된다. 전술한 설명에도 불구하고, 금속 합성 메카니즘은 미생물의 종류와 금속 이온 또는 금속의 종류에 따라 상이할 수 있다.

나노규모 물질들의 바이오미메틱 합성은 나노기술분야에서 나노규모 물질들을 합성하는 생물학적 시스템의 모방이다. 특히, 분자 바이오미메틱스(molecular biomimetics)는 다양한 생분자(biomolecule)를 이용하여 나노구조물을 합성하고, 기능성 나노물질들에 몇몇 추가의 특성들을 제공하는 것이다. 첫째는 단백질 주형이 분자 레벨에서 조작될 수 있다는 것을 의미하는 유전자 툴(genetic tool)의 가 능성이다. 둘째는 특정 단백질들이 특정 무기물을 인식할 수 있다는 것을 의미하는 무기물의 인식(recognition of inorganics)이다. 셋째는 나노물질들이 생물학적 분자들에 의해 생성될 수 있다는 것을 의미하는 자기조립(self-assembly)이다.

단백질들은 분자들 및 이온들의 이송, 세포 성분의 합성, 신호 전달, 시스템 통합, 반응 촉매 작용 등에 있어서 중요한 역할을 한다. 또한, 생물로부터 유래한 단백질이 무기 이온들을 환원시키고 무기 물질들을 합성할 수 있다는 것이 보도되었다. 생물로부터 단백질들과 펩티드들을 분리하는데 모든 노력의 촛점이 맞춰지고 있다. 그러나, 특정 단백질들과 펩티드들을 분리하는데 일정한 한계가 있는데, 유전자 조작의 어려움, 시간 및 노력의 소요 등이 그 예이다. 따라서, 거대한 생물학적 시스템으로부터가 아니라 단백질들, 특히 펩티드들의 라이브러리들로부터 무기(無機) 인식 단백질들 및 펩티드들의 동정에 대한 새로운 연구가 출현되고 있다.

최근에, 조합형 펩티드 파지 디스플레이 기술들은 금속 입자들 및 약물들과 같은 표적 기질들에 대한 높은 친화성을 가지는 특정 펩티드들을 선별하는데 폭넓게 사용된다.

도 1에 나타나 있는 바와 같이, 바이러스 게놈과 박테리아 플라스미드에 무작위 서열을 갖는 소형 올리고뉴클레오티드를 삽입한 후에 파지 외피와 세포 표면 상에서 펩티드들을 발현시킴으로써, 무작위 펩티드 라이브러리들을 생성시킨다.

표적 기질에 결합하는, 디스플레이된 특정 펩티드는 표적 결합, 용출 및 증폭을 포함하는 수 회의 바이오패닝(biopaning)에 의해 분리된다. 그 후, 특정 펩티드의 아미노산 서열들은 파지 및 박테리아 코딩 유전자의 서열화에 의해 획득된다. 전술한 조합형 파지 디스플레이 라이브러리들의 기술로부터 실리카, 은 및 아연과 결합하는 특정 금속-결합 펩티들에 대한 몇몇 연구 보고서가 있었다. 이들 선별된 기질 특이성 펩티드들은 추가 응용을 위해 가공 및 변형될 수 있다.

한편, 금(gold)은 가장 안정적이고 고귀한 금속으로 알려져 있다. 또한, 나노규모의 금 재료들은 광전 소자, 바이오의약 및 촉매를 비롯한 각종 분야에 적용될 수 있는 크기-의존성 및 형상-의존성 전기적, 광학적, 촉매적 특성들을 가진다. 최근에, 2차원(2-D) 나노규모 금속 재료들(예컨대, 판, 시트, 디스크 등)은 이들의 넓은 표면적 및 센서 분야에의 응용 가능성으로 인하여 많이 연구되어 왔다. 습식 화학적, 열적, 폴리올 방법 등을 이용하여 2-D 금 나노구조물들을 제조하는 것에 대하여 보고한 일부 논문이 있다.

몇몇 보고서에 의하면, 일부 식물 추출물들은 2-D 금 나노구조물을 합성할 수 있다는 것이 밝혀졌다. 또한, 최근에 조합형 파지 디스플레이는 환원제 및 안정화제로서 특정 금속 결합 또는 합성 펩티드를 분리하는데 사용되었다. 그러나, 펩티드 파지 디스플레이를 이용한 금 결합 펩티드의 분리에 대하여는 아직까지 보고된 바 없다.

본 발명자들은 예의 연구한 끝에 조합형 파지 디스플레이 펩티드 라이브러리로부터 도데카머 펩티드를 분리한 후, 이를 이용하여 2차원(2-D) 금 나노판들 및 0차원(O-D) 금 나노입자들을 합성하는 방법을 창안해 내었다. 또한, 글리신 스크리닝에 의해 펩티드 Midas-2 서열의 11번 위치의 티로신 잔기가 나노물질들의 합성에 중요하다는 것을 밝혀내고, 합성된 나노구조물들을 분석 및 비교하였다. 결론적으 로, 본 발명자들은 도데카머 펩티드 Midas-2가 금 나노판들 및 금 나노입자들을 비롯한 다양한 금 나노구조물들의 합성에 이용될 수 있다는 것을 밝혀냈다.

본 발명은 조합형 파지 디스플레이 펩티드 라이브러리(combinatorial phage display peptide library)로부터 분리된 도데카머 펩티드(dodecamer peptide)들인 Midas-1 내지 Midas-12를 이용하여 금 나노구조물(금 나노판 및 금 나노입자)을 합성하는, 친환경적이고 경제적인 방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.

본 발명은 하기 아미노산 서열들을 갖는 급 합성용 도데카머 펩티드 Midas-1 및 Midas 3 내지 Midas 12를 생산하는 방법으로서, (a) 표적 금속성 금 분말 (target metallic gold powder)을 0.1% Tween-20 함유 트리스-완충 식염수(TBST)로 세척한 후, 세척된 금속성 금 분말의 용액에 TBST 1㎖ 중의 희석된 3∼5 × 10¹⁰개의 파지(page)를 첨가하고, 실온에서 항온배양한 후에 반응된 시료를 TBST 완충액으로 세척하고, 금속성 금 분말에 결합된 파지를 글리신-HCl의 첨가에 의해 용출시키는 단계; (b) 파지들을 포함하는 상청액을 트리스-HCl의 첨가에 의해 중화시킨 후, 용출된 파지들을 적정하고, E.coli의 감염에 의해 증폭시키는 단계; (c) 금속성 금 입자들의 표면 상에 결합하는 파지들을 폴리에틸렌글리콜 /NaCl에 의해 분리하는 단계; (d) 단계 (a) 내지 (c)를 2회 이상 추가로 반복하는 단계; (e) 5-브로모-4-클로로-3-인돌릴-β-D-갈락토시다제(X-Gal) 및 이소프로필-β-D-티오갈락토시다제(IPTG)를 함유하는 LB(Luria Broth) 배지 내의 감염된 E. coli를 파지 유전자 의 발현을 가리키는 청색 플라크(plaque)에 의해 분리한 후, 단일 가닥 파지 DNA를 정제하고 서열화함으로써, TGTSVLIATPYV(여기서, T는 트레오닌이고, G는 글리신이며, S는 세린이고, V는 발린이며, L은 류신이고, I는 이소류신이며, A는 알라닌이고, P는 프롤린이며, Y는 티로신임)의 아미노산 서열을 갖는 금 합성용 도데카머 펩티드 Midas-2를 수득하는 단계; 및 (f) Midas-2 내의 1번과 3번 내지 제12번 위치의 각 아미노산을 글리신으로 치환하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법을 제공한다: GGTSVLIATPYV(Midas-1); TGGSVLIATPYV(Midas-3); TGTGVLIATPYV (Midas-4); TGTSGLIATPYV(Midas-5); TGTSVGIATPYV(Midas-6); TGTSVLGATPYV (Midas-7); TGTSVLIGTPYV(Midas-8); TGTSVLIAGPYV(Midas-9); TGTSVLIATGYV (Midas-10); TGTSVLIATPGV(Midas-11); TGTSVLIATPYG(Midas-12).

상기 방법은 표적 재료로 코팅된 기질이나 친화성 표지(affinity tag)가 부착된 표적을 갖는 파지 용액을 사용하는 종래 기술과는 달리 결합 파지의 분리를 위한 표적 재료로서 금속성 금 분말을 직접 사용하여 금-결합 펩티드들을 분리하는 방법이다. 즉, 패닝(표적 결합 및 용출), 적정, 증폭 및 서열화에 의해 금-결합 펩티드의 분리를 수행한다.

상기 글리신-HCl의 pH는 2.0 내지 2.4인 것이 바람직하고, 상기 트리스-HCl의 pH는 8.9 내지 9.3인 것이 바람직하다. 상기 폴리에틸렌글리콜은 20% 폴리에틸렌글리콜-8000인 것이 바람직하고, 상기 NaCl의 농도는 2.5M인 것이 바람직하다.

또한, 본 발명은 도데카머 펩티드(dodecamer peptide) Midas-1 내지 Midas-10 및 Midas-12 중 하나를 이용하여 금 나노구조물(gold nanostructure)을 합성하 는 방법으로서, (a) 도데카머 펩티드(dodecamer peptide) Midas-1 내지 Midas-10 및 Midas-12 중 하나를 정제수에 용해시킨 후에 염화금산(HAuCl₄)을 첨가하고, 25℃ 내지 57℃의 온도에서 3일 이상 항온배양하는 단계; 및 (b) 25℃ 내지 57℃의 온도에서 30∼50분 동안 12000∼16000rpm으로 원심분리한 후, 고압증기멸균된 정제수로 세척하고 증류수로 재현탁시킴으로써, 침전물 형태의 금 나노구조물을 생성시키는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법을 제공한다.

상기 금 나노구조물은 삼각형 또는 육각형의 단결정 금 나노판과 구형, 오각형 또는 불규칙 형상의 다결정 금 나노입자를 포함한다.

또한, 본 발명은 도데카머 펩티드(dodecamer peptide) Midas-11을 이용하여 금 나노구조물(gold nanostructure)을 합성하는 방법으로서, (a) 도데카머 펩티드(dodecamer peptide) Midas-11을 정제수에 용해시킨 후에 염화금산(HAuCl₄)을 첨가하고, 37℃ 내지 57℃의 온도에서 3일 이상 항온배양하는 단계; 및 (b) 37℃ 내지 57℃의 온도에서 30∼50분 동안 12000∼16000rpm으로 원심분리한 후, 고압증기멸균된 정제수로 세척하고 증류수로 재현탁시킴으로써, 침전물 형태의 금 나노구조물을 생성시키는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법을 제공한다.

상기 금 나노구조물은 나선형의 단결정 금 나노판이다.

본 발명의 도데카머 펩티드(dodecamer peptide)인 Midas(구체적으로는, Midas-1 내지 Midas-12)를 이용하여 금 나노구조물(나노판 및 나노입자)을 합성하 는 방법은 높은 온도, 높은 압력 및 독성 화학약품을 필요로 하지 않기 때문에 친환경적인 뿐만 아니라, 합성 공정이 매우 간단하여 비용 절감의 효과가 탁월하다.

한편, 본 발명에 사용되는 상기 도데카머 펩티드는 박테리아 유전자에 적용되어 박테리아 막 표면 상에 디스플레이됨으로써, 금속 복원(metal remediation) 및 금속 해독(metal detoxification)에 응용될 수 있으며, 상기 도데카머 펩티드를 이용하여 합성된 나노판들은 직경이 크고 두께가 얇아서 가스 센서(gas sensor) 등에 응용될 수 있다. 또한, 위와 같은 특정 펩티드를 이용한 세포 표면들의 조작을 통하여, 생물용출(bioleaching), 생물정화(bioremediation), 생물무기물화 (biomineralization) 및 나노물질들의 합성에 응용할 수 있다. 또한, 나노-크기의 금 합성 펩티드 뿐만 아니라, 독성인 중금속 이온들의 형태를 보다 덜 독성인 금속 나노입자들로 변화시키는 다른 펩티드들은 펩티드 파지 디스플레이에 의해 밝혀질 수 있고, 미생물 공학에 응용될 수 있을 것이다.

하기 실시예를 통하여 본 발명을 보다 상세히 설명하고자 한다. 그러나, 하기 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 것일 뿐이므로, 본 발명의 범주가 하기 실시예에 국한되는 것으로 해석되어서는 아니된다. 따라서, 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자는 첨부된 특허청구범위에 기재된 사항으로부터 도출되는 기술적 사상의 범위 내에서 하기 실시예의 다양한 변형, 수정 및 응용이 가능하다는 것을 이해할 수 있을 것이다.

실시예

재료(화학약품 및 반응시약)

염화금산 삼수화물(HAuCl₄·3H₂O) 및 금속성 금 분말을 미국 미주리주 세인트루이스시 소재 Aldrich로부터 구입하고, 모두 서열화된 펩티들을 한국 광주광역시 소재 Gen Co. Ltd.로부터 구입하였다. 70% 질산을 한국 서울특별시 소재 DO Chemical Co. Ltd.로부터 구입하였다. 모든 반응시약들은 추가의 정제 공정을 거치지 아니하고 구입시의 상태대로 사용하였다. 여과 시스템에 의해 탈이온수를 정제하고, 고압증기멸균하여 미생물 오염을 방지하였다.

금-결합 펩티드들의 분리

무작위 파지 디스플레이 펩티드 라이브러리(Ph.D.-12 파지 디스플레이 펩티드 라이브러리 키드)를 미국 매사츄세츠주 소재 New England BioLab으로부터 구입하였다. 금-결합 펩티드를 분리하기 위한 모든 공정들은 제조업체의 지시 사항에 따랐다. 그러나, 표적 재료로 코팅된 기질이나 친화성 표지(affinity tag)가 부착된 표적을 갖는 파지 용액 대신에 결합 파지의 분리를 위한 표적 재료로서 에펜도르프 튜브 내의 금속성 금 분말을 직접 사용하였다.

즉, 패닝(표적 결합 및 용출), 적정, 증폭 및 서열화에 의해 금-결합 펩티드들의 분리를 수행하였다. 표적 금속성 금 분말을 0.1% Tween-20 함유 트리스-완충 식염수(TBST)로 3회 세척하였다. 이어서, 세척된 금속성 금 분말의 용액에 TBST 1㎖ 중의 희석된 4×10¹⁰개의 파지(phage)를 첨가하였다. 실온에서 1시간 동안 항온배양한 후, 반응된 시료를 TBST 완충액으로 10회 세척하고, 금속성 금 분말에 결합 된 파지를 글리신-HCl(pH 2.2)의 첨가에 의해 용출시켰다. 파지들을 포함하는 상청액을 트리스-HCl(pH 9.1)의 첨가에 의해 중화시켰다. 용출된 파지들을 적정하고, Escherichia coli ER2537의 감염에 의해 증폭시켰다. 입자들의 표면 상에 결합하는 파지들을 20% 폴리에틸렌글리콜-8000/2.5M NaCl(PEG/NaCl)에 의해 분리하였다. 2회의 추가 패닝 단계 중에 적정 및 증폭을 반복적으로 수행하였다. 5-브로모-4-클로로-3-인돌릴-β-D-갈락토시다제(X-Gal) 및 이소프로필-β-D-티오갈락토시다제 (IPTG)를 함유하는 LB(Luria Broth) 배지 내의 감염된 E.coli ER2537를 파지 유전자의 발현을 가리키는 청색 플라크에 의해 분리하였다. 이어서, 단일 가닥 파지 DNA를 정제하고 서열화하였다.

이와 같이 무작위 파지 디스플레이 펩티드 라이브러리로부터 금속성 금 분말에 특이적인 결합 친화성을 갖는 펩티드를 동정하고 서열화하여 얻은 도데카머 펩티드의 아미노산 서열은 TGTSVLIATPYV이었다. Midas라 명명되는 펩티드(Midas는 아미노산 서열의 2번 위치의 글리신 때문에 Midas-2라 불리기도 함)는 금속성 금에 특이적으로 결합할 수 있을 뿐만 아니라, 금 이온으로부터 금 나노구조물들을 합성하는데 사용될 수 있다.

Midas-2는 비하전된 극성 아미노산 그룹의 4개 영역(트레오닌₁ _,3,9 및 세린₄), 극성 지방족 아미노산 그룹의 7개 영역(글리신₂, 발린₅, 류신₆, 이소류신₇, 알라닌₈ 및 프롤린₁₀), 및 방향족 아미노산 그룹의 1개 영역(티로신₁₁)으로 구성된다(여기서, 밑첨자는 Midas-2의 서열상의 각 아미노산의 위치를 의미함). 금 이온들을 인식하 고 이들과 상호작용할 수 있는 것으로 주지되어 있는 특정 아미노산(예컨대, 시스테인 및 리신)이 존재하지만, Midas-2는 황 (sulfur)기를 함유하는 시스테인 잔기들과 아미노기를 함유하는 리신 잔기들 없이도 금 나노구조물을 합성할 수 있다. 따라서, Midas-2의 발견은 유례가 없는 일이다.

금 나노구조물의 합성

0.2㎎의 펩티드를 정제수에 먼저 용해시킨 후, 0.5mM HAuCl₄를 첨가하였다(총 부피는 1㎖임). 합성에 미치는 온도의 영향을 조사하기 위하여, 빛의 부재하에서 에펜도르프 튜브내에서 25℃와 37℃에서 3일 동안 항온배양하였다. 3일 동안 반응한 후의 용액의 색은 무색이었다. 도 2에 나타나 있는 바와 같이, 단파장의 자외선을 교란시키지 않는 수정 셀(quartz cell)에서 24시간, 48시간 및 72시간에 자외선-가시광선 분광기를 이용하여 표면 플라즈몬 공면(SPR) 밴드를 측정하였다. 구형 금 나노구조물들이 약 520∼545nm에서 강한 색채를 띠는 SPR 밴드를 보인다. 또한, 액체 용액 중의 금 나노구조물의 색상은 적색이고, 이들의 SPR 밴드는 나노구조물들의 크기, 형태 및 응집(aggregation)에 의존하는데, Midas-2를 이용하여 합성된 금 나노구조물들은 520∼545nm 근처에서 SPR 밴드를 나타내지 않았지만, 시간의 경과에 따라 밴드의 높이가 증가하였다. 이와 같이 SPR 밴드를 발견할 수 없다는 것은 합성된 금 나노구조물의 표면과 펩티드 Midas-2의 특이적 상호작용이 SPR에 영향을 미치는 것으로 파악된다. 또한, 가시광선의 파장보다 긴 750nm 내지 1.4㎛의 파장의 전자기파인 근적외선(NIR) 영역은 다소 높은 흡광도값을 나타내었다(도 2 참조). 이러한 사실은 용액 중의 이방성(anisotropic) 금 입자들의 합성을 의미한다. 또한, 합성된 금 나노구조물들의 양은 고유한 금 나노입자들의 SPR 밴드와 색상 변화가 없도록 하는데 기여한다.

추가의 자외선-가시광선 분광분석법, 투과 전자 현미경법/에너지 분산 X선 분광분석법, 및 주사 전자 현미경법/에너지 분산 X-선 분광분석법에 의한 측정을 위하여, 25℃에서 40분 동안 14000rpm에서 원심분리함으로써 합성된 금 나노입자들을 수집하고, 고압증기멸균된 정제수로 3회 세척하고, 100㎕의 증류수로 재현탁시켰다.

Midas-2를 이용하여 합성된 금 침전물의 형태의 특징은 TEM 및 EDS를 사용하여 밝혀냈다. 도 3 (A)는 육각형 시트, 삼각형 시트, 오각형 입자, 구형 입자 및 불규칙 형상의 입자를 포함하는 나노미터 규모의 금 구조물의 형태를 나타낸 것이다. 합성된 금 나노구조물들의 크기 분포는 250개의 금 나노구조물들의 직경을 측정함으로써 결정하였다(도 3 (B) 참조). 육각형 및 삼각형 금 나노판들(합성된 금 나노구조물들의 20%, 직경 25.0∼117.6nm, 평균 직경 64.2nm)은 두께가 얇기 때문에 투명하고, 그 크기가 구형 및 불규칙 형상의 금 나노입자들(합성된 금 나노구조물들의 80%, 직경 14.3∼57.7nm, 평균 직경 11.8nm)보다 크다. 또한, 도 3 (C)의 EDS 데이터는 Midas-2를 이용하여 합성된 모든 나노규모 판들 및 입자들이 금속성 금이라는 것을 나타낸다. 또한, 탄소(C) 및 구리(Cu) 피크는 탄소-구리 그리드에 기인한 것이고, 질소(N), 산소(O) 및 일부 탄소(C)의 작은 피크는 펩티드 성분들에 기인한 것이다. 도 3 (D)에서 입자들을 둘러싼 재료들로부터 얻은 EDS 데이터는 질 소(N), 산소(O) 및 탄소(C)의 피크가 높을수록 금(Au)의 피크가 낮다는 것을 보여준다는 가정을 뒷받침한다.

금 나노판들 및 금 나노입자들의 제한시야 전자 회절(SAED) 패턴은 도 4에 나타나 있다. SAED 패턴 분석 결과, 나노판은 단결정이었다(도 4 (A) 참조). 단결정 구조물들이 라이팅 스폿(lighting spot)의 독특한 기하학적 형성을 가지며, 미지의 물질들로부터 유래한 단결정은 스폿 패턴(spot pattern)의 독특한 기하학적 형상으로부터 평가될 수 있다. 그러나, 다수의 단결정의 다양한 방향성에 기인하여 라이팅 링(lighting ring)을 부여하는 다결정 구조물은 합성된 금 나노입자들의 경우에 관찰되었다(도 4 (B) 참조). 이는 금 나노판들의 합성 메카니즘이 금 나노입자들의 합성 메카니즘과 상이하다는 것을 의미한다.

에너지 분산 X-선 분광분석법(EDS)과 주사 전자 현미경법(SEM)은 금 나노구조물들의 추가의 특성 규명에 사용되었다(도 5 참조). 금 나노판들은 Midas-2로 덮여있는 것으로 보이고, EDS 데이터는 질소(N)와 산소(O)의 보다 높은 조성을 나타내는 금 나노판을 덮고 있는 펩티드에 대한 측정 결과인 도 5 (C)와 금 나노판들에 대한 측정 결과인 도 5 (D)를 비교함으로써, 전술한 TEM/EDS 분석과 일치함을 확인하였다.

다른 펩티드와 대비되는 Midas -2의 금에 대한 특이성 분석

은, 아연 및 실리카와 각각 결합하는 것으로 알려진 다른 펩티드들인 AG4, c04 및 Si3-3과 비교함으로써, 금 합성용 펩티드 Midas-2dml 특이성을 분석하였다, 이들 3가지 다른 펩티드들, 즉 AG4, c04 및 Si3-3의 서열은 하기 표 1에 제시되어 있다. 한편, 실험을 위해 온도를 25℃로 고정시켰다.

펩티드	서열
AG4¹	A Y S S G A P P M P P F
co4²	H Y Q H N T H H P S R W
Si3-3³	A P P G H H H W H I H H

¹: 은-결합 펩티드(silver-binding peptide)

²: 아연-결합 펩티드(zinc-binding peptide)

³: 실리카-결합 펩티드(silica-binding peptide)

[여기서, A는 알라닌이고, Y는 티로신이며, S는 세린이고, G는 글리신이며, P는 프롤린이고, M은 메티오닌이며, F는 페닐알라닌이고, H는 히스티딘이며, Q는 글루타민이고, N은 아스파라긴이며, T는 트레오닌이고, R은 아르기닌이며, W는 트립토판이다].

Midas-2, AG4, c04 및 Si3-3의 금에 대한 특이성을 평가하기 위하여, 이들 펩티드들을 금 이온과 반응시켰다. TEM 및 EDS 분석을 수행하여, 침전물들의 형성 및 형태를 평가하였다. 도 6 (A), (B) 및 (C)는 각각 AG4, c03 및 Si3-3에 의해 형성된 금 침전물들의 TEM 및 EDS 분석 결과를 나타낸 것이다. 도 6에 나타나 있는 바와 같이, AG4, c03 및 Si3-3은 모두 금 이온을 금 나노입자들로 환원시킬 수 있다. 따라서, AG4, c03 및 Si3-3을 이용한 금 나노입자들의 합성은 비특이적 반응이다. 금 나노입자들의 크기와 형태는 펩티드에 따라 매우 다양하기 때문에, 특정 관능기를 갖는 특정 펩티드를 발견함으로써 금 나노구조물들의 크기와 형태를 조절할 수 있다.

비록 금 이온들이 은- 결합 펩티드(AG4), 아연-결합 펩티드(c04) 및 실리카-결합 펩티드(Si3-3)에 의해 환원되고 불규칙 형상의 입자들이 합성된다는 것이 사실일지라도, 육각형, 삼각형 및 오각형의 나노구조물들은 이들 펩티드에 의해 형성되지 않았다.

시간의 경과에 따른 금 나노구조물의 합성 결과 분석

시간의 경과에 따른 금 나노구조물의 합성 결과 분석을 위해 제조된 Midas-2 및 HAuCl₄와 반응된 시료는 24시간, 48시간 및 72시간마다 40분 동안 14000rpm에서 원심분리함으로써 분리하였다. 원심분리 후에 상청액을 ppb 레벨까지 2% HNO₃ 용액으로 희석시켰다. 반응 용액에 용해된 잔존 금 이온의 농도를 유도 결합 플라즈마-질량 분석기(ICP-MS)에 의해 분석하였다.

도 7은 Midas-2 용액 중의 금 이온 농도의 감소를 시간 함수로서 나타낸 것이다. 24시간, 48시간 및 72시간에 ICP-MS에 의해 금 이온 농도를 측정하였다. 금 이온(HAuCl₄)의 실제 초기 농도는 0.5mM이지만, ICP-MS에 의해 측정된, 금 이온들의 초기 첨가 지점을 나타내는 농도는 0.42mM이었으며, 시간의 경과에 따라 금 이온들의 농도가 감소된다는 것이 밝혀졌다. 처음 2시간 동안 금 이온 농도의 가장 급격한 감소 범위가 나타났으며, 72시간 후에 0.23mM까지 점차로 감소하였는데, 이는 72시간 후에도 금 합성 반응이 계속 진행 중이고, 펩티드 Midas-2 0.2 ㎎/㎖와 금 이온 0.5mM을 이용한 금 나노구조물의 합성에 있어서 72시간은 충분한 시간이 아니라는 것을 의미한다. 이는 도 2에 나타나 있는 바와 같이 24시간, 48시간, 72시간의 반응 중에 반응 용액의 색상 변화와 금의 특이적 SPR 밴드가 나타나지 않았던 자외선-가시광선 분광분석 데이터의 결과와 일치한다.

Midas -2의 글리신 스캐닝

금 합성용 펩티드 Midas-2 내의 1번과 3번 내지 제12번 위치의 각 아미노산을 글리신으로 치환하여, 어느 아미노산이 금 나노구조물의 합성에 중요한 역할을 하는지를 조사하였다. 하기 표 2에 Midas-1 내지 Midas-12의 아미노산 서열이 제시되어 있다.

Midas -1 내지 Midas -12를 이용한 금 나노구조물들의 합성 및 이들 금 나노구조물들의 특성 규명

동일한 조건에서 25℃에서 3일 동안 Midas-1 내지 Midas-12의 12가지 펩티드를 이용하여 금 나노구조물들을 합성하였다. 도 8은 72시간 반응 후에 자외선-가시광선 분광기에 의해 측정된 12개 시료들의 SPR 밴드를 나타낸 것이다. Midas-5를 제외하고는, 대부분의 시료들의 일반적인 경향은 SPR 밴드의 부재라는 측면에서 Midas-2와 유사하였다. Midas-5와 HAuCl₄를 반응시킨지 72시간 후에, 반응 용액의 색상이 무색에서 연분홍색으로 변화되었다. 또한, 반응 용액은 약 520∼545nm에서의 고유한 금의 특정 SPR보다 다소 높은 578.5nm에서의 SPR 밴드를 나타낸다. 그러나, SPR 밴드의 외관은 펩티드 Midas-5를 이용하여 합성한 대량의 금 나노입자들에 기인할 수 있고, SPR 밴드의 적색 편이(red-shift)는 펩티드 Midas-5와 합성된 금 나노입자들 표면의 특이적인 상호작용에 의해 영향을 받는 듯하다. 또한, Midas-9 및 Midas-10의 파상 밴드(undulating band)는 불용성 펩티드들과 이들의 반응 용액에 의해 어느 정도 영향을 받는 듯하다. 또한, Midas-11의 반응 용액은 가장 낮은자외선(UV)-흡광도를 나타낸다(도 8 참조).

또한, 12가지 펩티드들을 이용하여 합성한 침전물들의 형태적 특징은 도 9에 나타나 있는 바와 같이 TEM에 의해 규명되었다. 도 9에 있어서의 A1 내지 A12의 TEM 이미지는 Midas-11을 이용하여 합성한 금 나노구조물 A11의 경우를 제외하고는 나머지 다른 펩티드들을 이용한 금 나노구조물들의 형성을 분명히 나타낸다. 펩티드 Midas-11은 25℃에서 3일 동안 반응한 후에 금 나노구조물들(특히 육각형 및 삼각형 시트 형태의 금 나노구조물들)을 합성하지 못한다. 도 8에서, Midas-11의 반응 용액의 자외선-가시광선 스펙트럼은 다른 것들에 비하여 가장 낮은 흡수 밴드를 나타낸다. 이들 결과로부터, Midas-11이 Midas-2의 11번 위치에서 글리신으로 치환된 것이기 때문에, 메틸벤질알콜의 작용기를 갖는 티로신 잔기는 Midas-2의 서열에 있어서 금 나노구조물들의 합성에 가장 중요한 아미노산인 듯하다.

Midas -11을 이용한 금 나노구조물들의 합성에 있어서의 온도의 영향

Midas-11을 이용한 금 나노구조물들의 합성에 있어서의 온도의 영향을 조사하기 위하여, 3일 동안 일정한 시간 간격으로 37℃에서 57℃까지 온도를 변화시켰다. 도 10은 상이한 온도에서의 SEM 이미지를 나타낸 것인데, 이는 Midas-11이 각각 37℃, 47℃ 및 57℃에서 마이크로미터 규모의 폭과 나노미터 규모의 두께를 가진 금 나노판들을 생성시킬 수 있다는 것을 밝힌 것이다. 따라서, 25℃의 온도는 금 이온들을 활성화시켜 금 나노구조물들을 생성시키기에는 너무 낮은 온도인 듯하다.

도 11 (A) 및 (B)는 금 나노판들이 높은 가속 전압에서 전자에 투명하고, 두께가 대략 수십 나노미터라는 것을 나타낸다. 또한, 도 10 (C)에 있어서의 SEM 이미지는 나노판들이 독특한 나선형 구조를 갖는다는 것을 밝혀낸다. 도 11 (D) 및 (E)에 나타나 있는 바와 같이, SAED 및 EDS 분석에 의해 금 나노판들이 단결정의 금속성 금이라는 것을 확인하였다.

도 12에 나타나 있는 바와 같이, 11개의 다른 펩티드들을 이용하여 합성한 금 나노판들과 금 나노입자들을 3일 동안 37℃에서 반응시켰고, 상기 금 나노판들과 금 나노입자들의 크기 및 형태는 TEM에 의해 분석하였다. 37℃에서 합성된 금 나노구조물들의 크기는 25℃에서 합성된 금 나노구조물들의 크기보다 수십 내지 수백 나노미터 더 컸다. 그러나, Midas-11은 37℃에서 마이크로미터 규모의 직경을 갖는 금 나노판들을 생성시킬 수 있는 반면에, 다른 펩티드들과는 달리 25℃에서 금 나노구조물들을 생성시키지 못했다.

도 1은 조합형 펩티드 파지 및 세포-표면 디스플레이 프로토콜의 개략적인 다이어그램이다.

도 2는 25℃에서 0.5 mM HAuCl₄와 Midas-2의 반응 용액의 자외선-가시광선 스펙트럼 분석 결과(파장에 따른 흡광도 변화)를 시간의 함수로서 나타낸 그래프이다.

도 3은 25℃에서 3일 동안 Midas-2를 이용하여 합성한 금 나노구조물들의 투과 전자 현미경(TEM) 이미지(A), 금 나노구조물들의 크기 분포(B), 육각형의 금 나노판의 에너지 분산 X-선 분광분석(EDS) 데이터(C), 및 금 나노구조물을 둘러싼 펩티드의 에너지 분산 X-선 분광분석(EDS) 데이터(D)를 나타낸 것이다.

도 4는 25℃에서 Midas-2를 이용하여 합성한 육각형의 금 나노판의 제한시야 전자 회절(SAED) 패턴(A)과 25℃에서 Midas-2를 이용하여 합성한 구형의 금 나노입자의 제한시야 전자 회절(SAED) 패턴(B)을 나타낸 것이다.

도 5는 25℃에서 Midas-2를 이용하여 합성한 금 나노판의 주사 전자 현미경 (SEM) 이미지(A), 금 나노판의 에너지 분산 X-선 분광분석(EDS) 결과(B), 및 금 나노판을 둘러싼 펩티드의 에너지 분산 X-선 분광분석(EDS) 결과(C)를 나타낸 것이다 .

도 6은 25℃로 고정된 온도에서 AG4, c04 및 Si3-3을 이용하여 합성한 금 나노입자들의 투과 전자 현미경(TEM) 이미지(A1, A2 및 A3)와 에너지 분산 X-선 분광 분석(EDS) 결과(B1, B2 및 B3)을 나타낸 것이다.

도 7은 25℃로 고정된 온도에서 0.2 ㎎의 Midas-2와 0.5 mM의 HAuCl₄의 반응 용액에 있어서의 시간의 경과에 따른 금 이온 농도의 감소를 나타낸 그래프이다.

도 8은 25℃에서 3일 동안 금 이온과 12가지 펩티드의 반응 용액의 자외선-가시광선 스펙트럼 분석 결과(파장에 따른 흡광도 변화)를 나타낸 그래프이다.

도 9는 25℃에서 3일 동안 금 이온과 반응된 12가지 펩티드 Midas-1 내지 Midas-12를 이용하여 합성한 금 나노구조물들의 투과 전자 현미경(TEM) 이미지(A1 내지 A12)를 나타낸 것이다.

도 10은 37℃(A), 47℃(B) 및 57℃에서 Midas-11을 이용하여 합성한 금 나노판들의 주사 전자 현미경(SEM) 이미지를 나타낸 것이다.

도 11은 37℃로 고정된 온도에서 3일 동안 Midas-11을 이용하여 합성한 금 나노판의 주사 전자 현미경(SEM) 이미지(A 및 B), 투과 전자 현미경(TEM) 이미지 (C), 및 제한시야 전자 회절(SAED) 패턴(D), 및 에너지 분산 X-선 분광분석(SED) 데이터(E)를 나타낸 것이다.

도 12는 37℃에서 3일 동안 12가지 펩티드 Midas-1 내지 Midas-12를 이용하여 합성한 금 나노판들 및 나노입자들의 투과 전자 현미경(TEM) 이미지(A1 내지 A12)를 나타낸 것이다.

<110> Gwangju Institute of Science and Technology <120> A Method for Synthesis of Gold Nanostructures Using the Dodecamer Peptides Midas-1 to Midas-12 <140> 10-2007-0099324 <141> 2007-10-02 <160> 12 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Midas-1 <400> 1 Gly Gly Thr Ser Val Leu Ile Ala Thr Pro Tyr Val 1 5 10 <210> 2 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Midas-2 <400> 2 Thr Gly Thr Ser Val Leu Ile Ala Thr Pro Tyr Val 1 5 10 <210> 3 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Midas-3 <400> 3 Thr Gly Gly Ser Val Leu Ile Ala Thr Pro Tyr Val 1 5 10 <210> 4 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Midas-4 <400> 4 Thr Gly Thr Gly Val Leu Ile Ala Thr Pro Tyr Val 1 5 10 <210> 5 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Midas-5 <400> 5 Thr Gly Thr Ser Gly Leu Ile Ala Thr Pro Tyr Val 1 5 10 <210> 6 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Midas-6 <400> 6 Thr Gly Thr Ser Val Gly Ile Ala Thr Pro Tyr Val 1 5 10 <210> 7 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Midas-7 <400> 7 Thr Gly Thr Ser Val Leu Gly Ala Thr Pro Tyr Val 1 5 10 <210> 8 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Midas-8 <400> 8 Thr Gly Thr Ser Val Leu Ile Gly Thr Pro Tyr Val 1 5 10 <210> 9 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Midas-9 <400> 9 Thr Gly Thr Ser Val Leu Ile Ala Gly Pro Tyr Val 1 5 10 <210> 10 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Midas-10 <400> 10 Thr Gly Thr Ser Val Leu Ile Ala Thr Gly Tyr Val 1 5 10 <210> 11 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Midas-11 <400> 11 Thr Gly Thr Ser Val Leu Ile Ala Thr Pro Gly Val 1 5 10 <210> 12 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Midas-12 <400> 12 Thr Gly Thr Ser Val Leu Ile Ala Thr Pro Tyr Gly 1 5 10

Claims

하기 아미노산 서열들을 갖는 금 합성용 도데카머 펩티드 Midas-1 및 Midas-3 내지 Midas-12를 생산하는 방법으로서,

(a) 표적 금속성 금 분말(target metallic gold powder)을 0.1% Tween-20 함유 트리스-완충 식염수(TBST)로 세척한 후, 세척된 금속성 금 분말의 용액에 TBST 1㎖ 중의 희석된 3∼5 × 10¹⁰개의 파지(page)를 첨가하고, 실온에서 항온배양한 후에 반응된 시료를 TBST 완충액으로 세척하고, 금속성 금 분말에 결합된 파지를 글리신-HCl의 첨가에 의해 용출시키는 단계;

(b) 파지들을 포함하는 상청액을 트리스-HCl의 첨가에 의해 중화시킨 후, 용출된 파지들을 적정하고, E.coli의 감염에 의해 증폭시키는 단계;

(c) 금속성 금 입자들의 표면 상에 결합하는 파지들을 폴리에틸렌글리콜 /NaCl에 의해 분리하는 단계;

(d) 단계 (a) 내지 (c)를 2회 이상 추가로 반복하는 단계;

(e) 5-브로모-4-클로로-3-인돌릴-β-D-갈락토시다제(X-Gal) 및 이소프로필-β-D-티오갈락토시다제(IPTG)를 함유하는 LB(Luria Broth) 배지 내의 감염된 E. coli를 파지 유전자의 발현을 가리키는 청색 플라크(plaque)에 의해 분리한 후, 단일 가닥 파지 DNA를 정제하고 서열화함으로써, TGTSVLIATPYV(여기서, T는 트레오닌이고, G는 글리신이며, S는 세린이고, V는 발린이며, L은 류신이고, I는 이소류신이며, A는 알라닌이고, P는 프롤린이며, Y는 티로신임)의 아미노산 서열을 갖는 금 합성용 도데카머 펩티드 Midas-2를 수득하는 단계; 및

(f) Midas-2 내의 1번과 3번 내지 제12번 위치의 각 아미노산을 글리신으로 치환하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법:

GGTSVLIATPYV(Midas-1);

TGGSVLIATPYV(Midas-3);

TGTGVLIATPYV(Midas-4);

TGTSGLIATPYV(Midas-5);

TGTSVGIATPYV(Midas-6);

TGTSVLGATPYV(Midas-7);

TGTSVLIGTPYV(Midas-8);

TGTSVLIAGPYV(Midas-9);

TGTSVLIATGYV(Midas-10);

TGTSVLIATPGV(Midas-11);

TGTSVLIATPYG(Midas-12).
도데카머 펩티드(dodecamer peptide) Midas-1 내지 Midas-10 및 Midas-12 중 하나를 이용하여 금 나노구조물(gold nanostructure)을 합성하는 방법으로서,

(a) 도데카머 펩티드(dodecamer peptide) Midas-1 내지 Midas-10 및 Midas- 12 중 하나를 정제수에 용해시킨 후에 염화금산(HAuCl₄)을 첨가하고, 25℃ 내지 57℃의 온도에서 3일 이상 항온배양하는 단계; 및

(b) 25℃ 내지 57℃의 온도에서 30∼50분 동안 12000∼16000rpm으로 원심분리한 후, 고압증기멸균된 정제수로 세척하고 증류수로 재현탁시킴으로써, 침전물 형태의 금 나노구조물을 생성시키는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
제 2 항에 있어서,

상기 금 나노구조물은 삼각형 또는 육각형의 단결정 금 나노판과 구형, 오각형 또는 불규칙 형상의 다결정 금 나노입자를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
도데카머 펩티드(dodecamer peptide) Midas-11을 이용하여 금 나노구조물(gold nanostructure)을 합성하는 방법으로서,

(a) 도데카머 펩티드(dodecamer peptide) Midas-11을 정제수에 용해시킨 후에 염화금산(HAuCl₄)을 첨가하고, 37℃ 내지 57℃의 온도에서 3일 이상 항온배양하는 단계; 및

(b) 37℃ 내지 57℃의 온도에서 30∼50분 동안 12000∼16000rpm으로 원심분리한 후, 고압증기멸균된 정제수로 세척하고 증류수로 재현탁시킴으로써, 침전물 형태의 금 나노구조물을 생성시키는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
제 4 항에 있어서,

상기 금 나노구조물은 나선형의 단결정 금 나노판인 것을 특징으로 하는 방법.