KR101352640B1

KR101352640B1 - 온도－조절성 펩타이드－금 나노입자의 하이브리드 구체의 동시적 합성방법

Info

Publication number: KR101352640B1
Application number: KR1020110015319A
Authority: KR
Inventors: 허호길; 김정옥
Original assignee: 광주과학기술원
Priority date: 2011-02-22
Filing date: 2011-02-22
Publication date: 2014-01-17
Also published as: KR20120096120A

Abstract

본 발명은 금-결합 펩타이드의 자가-조립을 유도하여 하이브리드 구조물을 형성시키고, 동시에 상기 구조체 내에 금 나노입자를 형성시키는 단계를 포함하는 펩타이드-금 나노입자 하이브리드 구체를 합성하는 신규한 방법에 관한 것이다. 본 발명은 온도에 따라 그 크기를 조절할 수 있으며 상기 구조를 이용하여 바이오의학, 전기적 이용에 이용될 수 있다.

Description

온도－조절성 펩타이드－금 나노입자의 하이브리드 구체의 동시적 합성방법{Simultaneous Synthesis of Temperature-Tunable Peptide and Gold Nanoparticle Hybrid Spheres}

본 발명은 펩타이드-금 나노 하이브리드 구체의 합성방법 및 그에 의해 제조된 펩타이드-금 나노 하이브리드 구체에 관한 것이다.

전통적인 생물학적 분자의 자가-조립이 비공유결합, 정전기적 인력, 수소 결합, 소수성 결합 및 방향족 스태킹 상호작용을 경유하여 일어나는데 반하여, 자기-조립 생물학적 분자들(예컨대, 펩타이드, 단백질, DNA 등)은 뛰어난 환경 양성 방법으로 위계적인 무기 나노 엔지니어링 물질을 형성하는데 도와주는 주형으로서 연구되어왔다(1,2). 게다가 자가-조립 생물학적 분자가 주변 변수(예컨대, 온도, pH, 빛)에 반응하여 모양 및 형태 또는 물리적 성질이 변하는 능력은 바이오의학 산업 및 의약 전달계, 바이오센싱, 조직 엔지니어링을 포함하는 바이오-나노테크놀로지에 많은 잠재적인 응용을 활용하도록 하였다(3-6). 비록 다양한 자극-반응 유기체들이 합성 고분자, 펩타이드에 의해 합성되지만, 이들은 미생물로부터 직접 분리하거나 상 분리 및 세포 표면 발현 방법에 의한 간접적으로 분리할 수 있고, 이는 매우 관심을 끄는 물질들 중에 하나이다. 왜냐하면 이것은 온화한 환경에서 1) 일차 아미노산 서열을 조절함으로써 화학적 성질을 조절하고, 2) 다양한 무기 이온을 포함되도록 킬레이트화 하며, 이들이 금속성, 반도체 및 단열성 무기 나노 구조형태가 되도록 환원시키며(7-11), 3) 핵형화 및 무기 나노물질의 성장 방식을 조절함에 따라 결정 구조 및 형태학을 조절한다(7, 12-17). 게다가, 어떤 펩타이드는 자가-조립하여 그 결과 예컨대, 사슬형, 시트형 및 구형을 포함하는 컴플렉스 구조를 구성한다(18-22).

이러한 이형구조들 대부분은 펩타이드가 자가-조립하여 골격/주형을 형성하고 뒤이어 무기 나노구조의 합성이 일어나는 두 단계 과정을 이용하여 합성되었다.

보다 최근에는, 일단계 과정이 개발되어, 구조적인 복합체 및 매우 정렬된 나노구조물의 자발적인 형성이 가능하게 되었다. 예를 들어, 이전부터 펩타이드 나노 튜브 및 나노구체의 합성이 유용한 것으로 알려져 있는 자가-조립의 양이온적 다이페닐알라닌 펩타이드는 물에서 구형, 펩타이드-폴리옥소음이온(포스포 텅스텐산, PTA) 하이브리드 나노구조체의 합성에 직접적으로 이용할 수 있다(23-26). 게다가 은과 결합 친화력이 매우 좋은 지방족 탄소가 달린 펩타이드 AG3(AYSSGAPPMPPF)은 HEPES 완충 용액에서 EPES 완로 코팅된 이중PE선 구조를 형성할 수 있다(22). 이러한 진보에도 불구하고, 수용성 조건 아래에서 자극-반응의 생물학적 분자들 및 잘 설계된 초분자 구조무기 나노 완충 완로 인 조립을 하기에 아직 제한적인 문제들이 존재한다.

이번 연구에서, 본 발명자들은 생리학적인 온도에서 수용성 용액조건으로 펩타이드-금 나노입자 하이브리드 구체를 형성하는데 간단한 일 단계 방법을 설명하였다. 예전에 박테리오 파지 조합의 펩타이드 라이브러리에서 분리하였던 펩타이드 제1 서열(NPSSLFRYLPSD)는 수용성 용액에서 펩타이드-금 나노입자 하이브리드 구체를 합성하는데 이용하였다(9).

일단 형성되면, 하이브리드 구조로부터 금 나노입자의 제거는 구체의 안정도에 영향을 주지 않았다. 게다가, 펩타이드-금 나노입자 하이브리드 구체의 크기는 온도-의존적인 방식으로 조절될 수 있음을 보여주었다. 바람직한 기능적 무기 물질들이 있는 펩타이드 기반의 초분자 구조와 결합하는 이 방법은 특유의 물리적, 화학적, 생물학적 성질을 가지는 계층적 구조를 “bottom-up" 조립 방식을 이용하는데 새로운 방법을 제공할 것이다.

본 명세서 전체에 걸쳐 다수의 논문 및 특허문헌이 참조되고 그 인용이 표시되어 있다. 인용된 논문 및 특허문헌의 개시 내용은 그 전체로서 본 명세서에 참조로 삽입되어 본 발명이 속하는 기술 분야의 수준 및 본 발명의 내용이 보다 명확하게 설명된다.

본 발명자들은 펩타이드-금 나노입자 하이브리드 구체를 보다 간단한 방법, 특히 원-스텝으로 제조할 수 있는 방법을 개발하고자 노력하였다. 그 결과, 금 이온 환원제 및 자가-조립 유도제로서 금-결합 펩타이드를 이용하여 금 나노입자를 제조하는 경우에는 금-결합 펩타이드의 자가-조립이 유도되고 하이브리드 구조물에 대한 스캐폴드를 형성되면서 동시에 상기 스캐폴드 내에 금 나노입자가 형성됨을 확인함으로써 본 발명을 완성하게 되었다.

따라서 본 발명의 목적은 금-펩타이드 나노입자 하이브리드 구체의 제조 방법을 제조하는 데 있다.

본 발명의 다른 목적은 펩타이드-금 나노입자 하이브리드 구체를 제공하는데 있다.

본 발명의 다른 목적 및 이점은 하기의 발명의 상세한 설명, 청구범위 및 도면에 의해 보다 명확하게 된다.

본 발명의 일 양태에 따르면, 본 발명은 (i) 금 이온 환원제 및 자가-조립 유도제로서의 금-결합 펩타이드 및 (ii) 금 염(gold salt)을 접촉시켜 상기 금-결합 펩타이드의 자가-조립을 유도하여 하이브리드 구조물에 대한 스캐폴드를 형성시키면서 동시에 상기 스캐폴드 내에 금 나노입자를 형성시키는 단계를 포함하는 펩타이드-금 나노입자 하이브리드 구체의 제조방법을 제공한다.

본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 상기 제조방법을 이용하여 생성된 펩타이드-금 나노입자 하이브리드 구체를 제공한다.

본 발명자들은 펩타이드-금 나노입자 하이브리드 구체를 보다 간단한 방법, 특히 원-스텝으로 제조할 수 있는 방법을 개발하고자 노력하였다. 그 결과, 금 이온 환원제 및 자가-조립 유도제로서 금-결합 펩타이드를 이용하여 금 나노입자를 제조하는 경우에는 금-결합 펩타이드의 자가-조립이 유도되고 하이브리드 구조물에 대한 스캐폴드를 형성되면서 동시에 상기 스캐폴드 내에 금 나노입자가 형성됨을 확인하였다.

본 발명에 이용되는 금-결합 펩타이드는 금 이온 환원제 및 자가-조립 유도제 작용을 한다. 금 이온 환원제로서의 금-결합 펩타이드는 금 이온에 결합하고 이어 금 이온을 환원시키는 작용을 한다. 자가-조립 유도제로서의 금-결합 펩타이드는 금 결합 펩타이드를 구성하는 아미노산의 R-기 사이의 상호작용에 의해 자가-조립을 유도하는 작용을 한다.

본 명세서에서 용어 “펩타이드”는 펩타이드 결합에 의해 아미노산 잔기들이 서로 결합되어 형성된 선형의 분자를 의미한다.

본 발명의 펩타이드는 당업계에 공지된 화학적 합성 방법, 특히 고상 합성 기술(solid-phase synthesis techniques)에 따라 제조될 수 있다(Merrifield, J. Amer . Chem . Soc . 85:2149-54(1963); Stewart, et al., Solid Phase Peptide Synthesis, 2nd. ed., Pierce Chem. Co.: Rockford, 111(1984)).

또한, 본 발명의 펩타이드는 파아지 디스플레이 기술로 얻을 수 있다(Smith GP "Filamentous fusion phage: novel expression vectors that display cloned antigens on the virion surface". Science 228(4705):13151317(1985); Smith GP, Petrenko VA. "Phage display". Chem . Rev . 97(2):391410(1997)). 또한, 본 발명의 펩타이드는 유전자 클로닝 방법으로 얻을 수 있다. 보다 상세하게는, 금-결합 펩타이드를 코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 적합한 숙주세포에 형질전환시켜 금-결합 펩타이드를 발현하도록 할 수 있다(see Sambrook, J. et al., Molecular Cloning . A Laboratory Manual, 3rd ed. Cold Spring Harbor Press(2001)).

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명에서 이용되는 금-결합 펩타이드는 R-기로서 방향족 기를 가지는 아미노산(예컨대, Trp, Tyr 또는 Phe)을 포함한다. 보다 바람직하게는, 상기 금-결합 펩타이드는 R-기로서 방향족 기를 가지는 아미노산을 최소 2개 이상 포함한다.

하기의 실시예에서 입증된 바와 같이, 방향족 기를 가지는 아미노산은 펩타이드-금 나노 입자 하이브리드 구체의 형성에 매우 중요한 역할을 담당한다.

본 발명에서 이용되는 금-결합 펩타이드의 길이는 특별하게 제한되는 않으며, 바람직하게는 10-20 아미노산 잔기, 보다 바람직하게는 10-15개의 아미노산 잔기로 이루어진다.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 상기 금-결합 펩타이드에서 펩타이드는 서열목록 제1서열 및 제2서열로 구성된 군으로부터 선택되는 펩타이드 서열, 보다 바람직하게는 제1서열로 구성되어 있다.

하기 실시예에서 언급한 것처럼 펩타이드의 일차 서열과 펩타이드와 금 나노 하이브리드 구체 사이의 관계를 결정하기 위해, 펩타이드 제1서열에 있는 방향족 기를 포함하고 있는 페닐알라닌 및 타이로신 잔기를 각각 글라이신 및 세린 잔기로 치환한 경우 펩타이드 구형 구조체가 형성되지 않고 네트워크형, 와이어-유사 구조, 비패턴형 구조로 대신하게 된다. 하기 실시예에서 제시된 치환 펩타이드는 제1서열이 치환된 것으로서, 각각 NPSSLFRSLPSD(Y에서 S로), NPSSLFRGLPSD(Y에서 G로), NPSSLGRYLPSD(F에서 G로) 및 NPSSLGRSLPSD(F 및 Y에서 G 및 S로)이다. 도 6의 결과는 펩타이드 제1서열의 특정 아미노산 치환이 펩타이드 구체 구조체를 형성할 수 없었다는 것을 보여준다. 하나의 펩타이드에서의 방향족 기를 가지는 아미노산과 그 밖의 R-기를 가지는 아미노산 서열 사이의 상호작용(예컨대, 비공유결합, 정전기적 인력, 수소 결합, 소수성 결합 또는 방향족 스태킹 상호작용), 그리고 동일한 다른 펩타이드 분자들 사이에서의 방향족 기를 가지는 아미노산 사이의 상호작용 등에 의해 구체가 형성되는 것으로 판단된다.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 이용되는 금 염(gold salt)은 금 입자를 생성시키는 데 이용되는 어떠한 금염도 포함된다. 금 입자를 형성시키는데 다른 물질의 도움 없이 금 염과 상기 금-결합 펩타이드를 단순하게 반응시켜 얻을 수 있다. 바람직한 금 염은 HAuCl₄, HAuBr₄, NaAuCl₄ _,AuCl₃·3H₂O 및 NaAuCl₄·2H₂O를 포함하며, 가장 바람직하게는 HAuCl₄이다. HAuCl₄(Chloroauric acid)은 수용성 조건에서 사각 평면의 [AuCl4] 이온과 양성자로 해리되며, 금 배위 복합체를 이루는데 전구체로서의 역할을 담당한다.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 사용되는 금 염의 농도는 0.01-1.0 mM이고, 보다 바람직하게는 0.05-0.2 mM이며, 가장 바람직하게는 0.08-0.15 mM이다.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명의 펩타이드-금 나노 입자 하이브리드 구체는 수용성 용액에서 생성된다. 유기용매 등에서 다양한 물리화학적 방법에 의해 나노입자를 합성할 수 있으나, 이는 고에너지, 고비용의 문제 및 고독성의 단점을 가지고 있다. 본 발명에서 수용상과 같이 생체 유사적인 조건에서 반응이 전개될 경우 친환경적이고 인체에 해를 끼치지 않는 방식에 의해 도입이 가능하므로 기존의 합성 방법에 비하여 보다 개선된 발명이라 할 수 있다.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 금 염과의 반응시 pH는 1.0-5.0이고, 가장 바람직하게는 pH 3.0-4.0이다. pH가 높아 염기성을 띠는 조건인 경우에는 펩타이드-금 나노입자 하이브리드 구체의 안정성이 떨어져 그 형태가 유지되지 못하고 해리된다. 또한 펩타이드로 이루어진 구체이므로 단백질 분해효소 K와 같은 단백질 분해효소가 첨가된 환경에서 구체의 안정성이 떨어지게 되어 그 형태를 유지하기 어렵다. 반응 시간은 바람직하게는 1-48시간이고, 보다 바람직하게는 12-36시간이며, 가장 바람직하게는 약 24시간이다.

한편, 본 발명은 상기 펩타이드-금 나노입자 하이브리드 구체는 온도에 따라 그 크기를 조절할 수 있는 방법을 제공한다. 예를 들어, 펩타이드-금 나노입자 하이브리드 구체를 본 발명에 따라 다양한 온도에서 제조한 경우, 펩타이드 구체의 평균 직경은 37℃(473 nm), 50℃(208 nm) 및 70℃(114 nm)로 반응 온도를 증가시킬 때 각각 그 크기가 약 56% 및 76%만큼 감소된다.

하기 실시예에서 기록한 온도 이외인 경우에도 펩타이드-금 나노입자 하이브리드 구체의 직경의 크기를 조절하는데 있어서 온도가 올라갈수록 직경의 크기가 작아지는 특징을 이용하여 구체의 크기 의존적인 특이성이 필요한 수용체와의 결합, 막 채널을 통과하기 위한 크기를 고려하여 제조할 수 있다. 특히 온도가 올라갈수록 생성되는 구체 크기가 가지는 범위가 더욱 일정하게 되는 특징이 관찰되는바, 크기의 일정함이 필요로 되는 분야에서 당해 기술적인 특징이 가지는 장점을 크게 이용할 수 있다.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 펩타이드-금 나노입자 하이브리드 구체는 온도가 상승함에 따라 그 크기 분포가 일정하게 된다.

도 4a 내지 4c에서 펩타이드-금 나노입자 하이브리드 구체의 크기 분포가 온도가 상승함에 따라 그 크기의 분포도가 (473.8± 121.5 nm(도 4a), 208.15± 53.1 nm(도 4b), 114.4± 19.6 nm(도 4c)) 점점 일정하게 형성된다.

본 발명의 펩타이드-금 나노입자 하이브리드 구체는 그 자체로서 용도를 가지고 있지만(예컨대, CT 조영제 또는 온열치료), 기능성을 더 부여하기 위하여 추가적인 기능성 물질을 결합시킬 수 있다.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명의 방법은 펩타이드-금 나노입자 하이브리드 구체의 표면을 기능화(functionalization)하는 단계를 추가적으로 포함한다. 본 명세서에서 용어 “기능화”는 펩타이드-금 나노입자 하이브리드 구체에 의해 추가적인 기능성 물질을 상기 구체의 표면에 컨쥬게이션시키는 것을 의미한다.

펩타이드-금 나노입자 하이브리드 구체에 의해 컨쥬게이션시킬 수 있는 기능성 물질은 특별하게 제한되지 않으며, 예를 들어 의약 및 표지물질을 포함한다. 또한, 상기 기능성 물질은 핵산분자(DNA, RNA), 단백질, 펩타이드, 지질, 탄수화물 및 저분자량 화합물을 포함한다.

상기 펩타이드-금 나노입자 하이브리드 구체에 의해 컨쥬게이션시킬 수 있는 표지물질은 당업계에 공지된 어떠한 표지물질도 포함하며, 예를 들어 FAM^TM, TAMRA^TM, HEX^TM, 플루오로세인, 로다민, 루시퍼 엘로우, B-파이토에리쓰린, 9-아크리딘이소티오시아네이트, 루시퍼 엘로우 VS, 4-아세트아미도-4'-이소티오-시아나토스틸벤-2,2'-다이설폰산, 7-다이에틸아미노-3-(4'-이소티오시아토페닐)-4-메틸쿠마린, 석시니미딜-파이렌부티레이트, 4-아세트아미도-4'-이소티오시아나토스틸벤-2,2'-다이설폰산 유도체, LC™-Red 640, LC™-Red 705, Cy5, Cy5.5, 리사민, 이소티오시아네이트, 에리쓰로신 이소티오시아네이트, 다이에틸렌트리아민 펜타아세테이트, 1-다이메틸아미노나프틸-5-설포네이트, 1-아닐리노-8-나프탈렌 설포네이트, 2-p-토우이디닐-6-나프탈렌 설포네이트, 3-페닐-7-이소시아나토쿠마린, 9-이소티오시아나토아크리딘, 아크리딘 오렌지, N-(p-(2-벤족사조일릴)페닐)멜레이미드, 벤족사디아졸, 스틸벤 및 파이렌 및 이들의 유도체를 포함한다.

펩타이드-금 나노입자 하이브리드 구체 표면의 기능화는 당업계에 공지된 다양한 방법을 이용하여 실시할 수 있다. 예를 들어, 기능성 물질에 다양한 반응기를 결합시켜 펩타이드-금 나노입자 하이브리드 구체 표면에 컨쥬게이션 시킬 수 있다. 컨쥬게이션 용도로 이용되는 상기 반응기는 알데하이드; 에폭시; 할로알킬; 1차아민; 티올; 말레이미드; 에스테르(바람직하게는 N-하이드록시석시너마이드 에스테르 작용기); 그리고 카르복실기(하이드록시-석시너마이드 에스테르 형성에 의해 활성화됨)와 히드록실기(사이아노겐 브로마이드로 활성화됨)와 같은 활성화되는 반응기를 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다.

펩타이드-금 나노입자 하이브리드 구체 표면의 기능화는 상기 구체의 펩타이드의 말단 또는 금, 바람직하게는 금에 기능성 물질을 공유결합시켜 실시할 수 있다.

본 발명의 펩타이드-금 나노입자 하이브리드 구체는 의약 전달 시스템, 조영제, 바이오 나노 테크놀로지 등 다양한 분야에 이용 가능한다.

본 발명의 특징 및 이점을 요약하면 다음과 같다.

(a) 본 발명은 한 단계에 의해 펩타이드-금 결합 하이브리드 구체를 생성하는 방법을 제공한다.

(b) 본 발명은 펩타이드-금 결합 하이브리드 구체의 크기를 온도에 의해 조절할 수 있는 방법을 제공한다.

(c) 본 발명에 의해 크기가 조절되어 합성된 구체는 바이오의학, 생물학적 시스템에 필요한 나노 구체, 전자현미경 등과 같은 분야에서 이용될 수 있다.

도 1은 자가-조립 펩타이드 및 금 나노 입자 하이브리드 구체 영상 및 그래프 등으로 패널 a는 SEM 영상이고, 패널 b는 EDX 분석 그래프, 패널 c 및 d는 TEM 영상을 보여준다.
도 2는 자가-조립 펩타이드 및 금 나노 입자 하이브리드 구체의 횡단면 분석을 위한 자료로서, 패널 a는 TEM 영상, 패널 b는 HR-TEM 영상, 패널 c는 EDX 도표화 자료이다.
도 3는 시간이 지남에 따른 펩타이드 제1 서열에 의한 금 이온 농도의 감소를 보여주는 그래프(패널 a) 및 3시간 동안 항온 처리하여 얻은 TEM 영상(패널 b 및 c)이다.
도 4a는 온도에 의해 사이즈가 조절되는 자가-조립 펩타이드 및 금 나노 입자 하이브리드 구체의 TEM 영상(위) 및 크기의 분포를 보여주는 그래프(아래)로 37℃에서의 영상 및 수치이다.
도 4b는 온도에 의해 사이즈가 조절되는 자가-조립 펩타이드 및 금 나노 입자 하이브리드 구체의 TEM 영상(위) 및 크기의 분포를 보여주는 그래프(아래)로 50℃에서의 영상 및 수치이다.
도 4c는 온도에 의해 사이즈가 조절되는 자가-조립 펩타이드 및 금 나노 입자 하이브리드 구체의 TEM 영상(위) 및 크기의 분포를 보여주는 그래프(아래)로 70℃에서의 영상 및 수치이다.
도 5는 자가-조립 펩타이드 및 금 나노 입자 하이브리드 구체에 KI/I₂에 의한 금 에칭의 효과를 보여주는 TEM 영상이다.
도 6은 자가-조립 펩타이드 및 금 나노 입자 하이브리드 구체에서 Y에서 G(패널 a), Y에서 S(패널 b), F에서 G(패널 c), FY에서 GS(패널 d)로 펩타이드 서열을 변경시 펩타이드 서열의 기능적 분석에 대한 TEM 영상이다.
도 7은 자가-조립 펩타이드 및 금 나노 입자 하이브리드 구체 형성을 보여주는 개괄적인 도표이다.
도 8은 금 존재(빨간 선)시 및 금 부존재(검은 선)시 펩타이드 제1 서열에 대한 CD 스펙트럼을 분석한 도표이다.
도 9는 KI/I₂에 의한 금 에칭 처리 후 자가-조립 펩타이드 및 금 나노 입자 하이브리드 구체에 대한 SEM 영상(패널 a 및 b) 및 EDX 분석(패널 c)이다.
도 10은 산성 및 염기성 조건과 단백질 분해 효소 K를 처리하였을 때, 자가-조립 펩타이드 및 금 나노 입자 하이브리드 구체의 안정성을 보여주는 TEM 영상이다.
도 11은 자가-조립 펩타이드 및 금 나노 입자 하이브리드 구체에 결합한 펩타이드 FAM-Si#6-C의 컨포컬 레이저 스캐닝 현미경(CLSM) 영상이다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다.

실시예

실험 재료 및 실험 방법

화학 시료 및 펩타이드

HAuCl₄3H₂O 및 ClAuPMe₃은 Aldrich Chemicals(St. Louis, MO)에서, HNO3은 Duksan Pure Chemicals Co. Ltd(대한민국)에서 구입하였다. 나노 순수물은 Milli-Q system(Millipore, Billerica, MA)을 이용하여 만들었고, 미생물 감염을 피하기 위해 미리 멸균처리 하였다. 모든 다른 화학 시약은 시약급이었다. 모든 펩타이드는 AnyGen Co. Ltd.(광주, 대한민국)에서 구입하였다.

펩타이드-금 나노 입자 하이브리드 구체의 동시 합성

펩타이드 제1서열(0.2 mg) 및 HAuCl₄3H₂O를 부피 1 ml가 되도록 맞추고(pH 약 3), 이어 37℃에서 어두운 곳에서 24시간 동안 항온 처리하였다. 펩타이드 서열에서 특정 아미노산을 바꾼 변형된 펩타이드는 상기 기술한 동일한 반응 조건을 이용하여 기능적으로 분석하였다. 펩타이드 구체가 있는 금 나노 입자의 합성에 있어 온도의 영향을 50℃ 또는 70℃에서 반응 혼합물을 항온 처리함으로써 결정하였다. 합성된 나노 물질들은 25℃에서 5분 간 9,300g으로 원심분리하여 선별하였고, 멸균된 탈 이온수를 이용하여 두 번 세척하고, 추가적 분석을 위해 100 ml의 물에 재현탁하였다.

원편광 이색성 분광기(Circular dichroism (CD) spectroscopy)

나노 구조체의 CD 스펙트럼은 190-250 nm에서 298K에서 J-810 spectropolarimeter(Jasco, Tokyo, Japan) 및 1 mm 길이의 쿼츠 큐빗을 이용하여 기록하였다. 어두운 조건 아래 37℃에서 항온 처리 24시간 후에 물에 있는 펩타이드 0.2 mg/ml를 이용하여 분석을 수행하였다.

속도론 연구

시간이 지남에 따른 금 이온 농도의 변화를 펩타이드 제1 서열 0.2 mg 및 HAuCl₄ 0.1 mM로 구성된 반응 샘플을 이용하여 실험을 3번 수행하였다. 샘플은 37℃에서 항온 처리하였고, 0, 1, 3, 6, 12, 또는 24시간 후에 원심 분리하였다. 최종 상층액 용액을 2% HNO₃과 함께 묽혔고 금 이온 농도는 유도 결합 플라스마 방출 분광계(inductively coupled plasma optical emission spectrometry (ICP-OES), Optima model 5300DV instrument (PerkinElmer, Waltham, MA))를 이용하여 측정하였다.

금 에칭

KI/I₂ 금 에칭 용액을 처리하여 합성한 금 나노 입자를 펩타이드 표면에서 제거하였다. KI/I₂ 금 에칭 용액은 4 g의 KI , 1 g의 I₂ 및 물 40 ml를 첨가하여 25℃에서 지속적으로 휘저으며 만들었다. 세척된 샘플 100 ml에 20 ml의 에칭 용액을 첨가하였다. 혼합물은 25℃에서 5분 동안 항온 처리하였고, 탈 이온수로 두 번 세척하였다.

안정성 검사

산성, 염기성 항온 처리 조건 및 촉매 처리 후에 펩타이드-수용 하이브리드 구체 구조체의 안정성을 측정하였다. 합성된 펩타이드-금 나노구체 100 ml 부분 표본에 10% 트라이플루오로아세트산 또는 1 M NaOH를 실온에서 5시간 동안 처리하였고 그 뒤에 지난 연구에 따라 수행하였다(1). 촉매 반응 조건을 위해, 나노구체를 20 mg 단백질 분해효소 K(GeneAll Biotechnology, Seoul, Korea)를 Tris-HCl 완충용액(pH 8.0)에 처리하여 37℃에서 1시간 동안 항온 처리하였다. 항온 처리 후, 모든 처리한 샘플을 원심분리 하였고, 탈 이온수로 세척하고 분석 이전에 물에 재현탁시켰다.

형광 염료-표지한 펩타이드와의 표면 기능화

조립한 펩타이드 및 금 나노입자 하이브리드 구체를 1 mg의 FAM-Si#6-C 펩타이드와 함께 20℃에서 24시간 동안 항온 처리하였다. 샘플을 원심분리 하였고, 탈 이온수로 두 번 세척하였다. 하이브리드 구체 위에 금 나노 입자와 형광 염료로 표지된 펩타이드가 결합한 강도는 컨포컬 레이저 스캐닝 현미경을 이용하여 분석하였다(CLSM, LSM5, Zeiss, Germany).

합성된 나노 물질들의 구조적 특성

전계 방출-투과 전자 현미경(field emission-transmission electron microscopy (FE-TEM)), 고 해상도-투과 전자 현미경(high resolution TEM (HR-TEM)), 주사 전자 현미경(scanning electron microscopy (SEM)) 및 에너지 분산 분광 분석(energy-dispersive X-ray spectroscopy (EDX))을 이용하여 형성된 나노구조체의 특성을 판단하였다. Tecnai F20 FE-TEM (Philips Electron Optics, Eindhoven, The Netherlands)을 이용하여 TEM 분석을 실시하였고, 200 kV의 가속 전압에서 JEM-2100 HR-TEM(JEOL, Tokyo, Japan)을 이용하여 EDX 분석을 실시하였다. 샘플을 탄소로 코팅된 구리 서포트 그리드 위에 나노 구조체를 두어 만들었고, 그 다음 공기 건조하였다. SEM 분석을 위한 샘플을 EDX 분석을 위해 준비한 Hitachi S-4700 SEM(Tokyo, Japan)을 이용하여 10 kV의 가속 전압에서 분석하였다. 샘플을 실리콘 웨이퍼에서 나노 구조체를 포함하는 ~5 μL현탁액에 두어 제조하였고 그 다음 공기로 건조시켰다.

실험결과 및 토의 사항

펩타이드 제1 서열은 생리학적 온도에서 수용액 조건하에 펩타이드 구체를 형성하는 동시에 금 나노입자에 금 이온을 줄이도록 하는 전구체로서 이용되었다. 전에 박테리오 파지 조합의 펩타이드 라이브러리를 이용하여 분리하였던 펩타이드 제1 서열은 실온의 인산완충용액에서 은과 강력한 친화도를 가지고, 금속의 은 나노 입자에 은 이온을 감소시킬 수 있음을 보여주었다(9). 0.1 mM HAuCl₄에서 37℃에서 24시간 동안 펩타이드 제1 서열(0.2 mg)를 항온 처리시 어둡고 보라색의 침전물이 형성되는데 이는 펩타이드에 의해 금 나노입자가 펩타이드에 의해 줄어들었음을 시사한다. TEM 및 SEM 분석으로 초미세 구형 하이브리드 펩타이드-금 나노 입자가 평균 직경 473 nm로 컨쥬게이션되어 있음을 보여주었다(도 1). EDX 분석으로 초미세 구형 구조가 금 나노 입자를 포함하고 있다는 것을 증명하였다(도 1, 패널b). 펩타이드 제1 서열이 없는 염화금산을 항온 처리하면, 어떠한 침전물 또는 구형-유사 구조들의 형성이 일어나지 않았다. 비슷하게, 불수용성 유기 금(ClAuPMe₃)을 펩타이드 제1 서열과 함께 동일한 반응 환경에서 항온 처리시키는 경우 보라색 침전물 및 구형 구조가 전혀 형성되지 않았다(데이터가 나타나지 않음). 이것은 염화금산이 펩타이드 제1 서열의 자가-조립, 핵형화 및 펩타이드 구조 안에서 금 나노 입자의 성장에 있어 매우 중요한 역할을 하고 있음을 보여준다. 도 1 패널d에서 보여주는 TEM 이미지 분석으로 표면-연관된 금 나노 입자가 평균 8.6 nm의 크기를 가진다는 사실을 알 수 있었으나, 표면에 금 나노 입자가 위치하는 장소가 표면 위인지 또는 펩타이드 구형 내부에 위치하는지 여부는 이러한 분석들에 의해서는 확실하지 않았다.

횡단면 분석을 이용하여 이들 하이브리드 구체 내부에 있는 금 나노 입자의 분포를 판단하였다. 횡단면 TEM 이미지 분석의 결과(도 2 패널a)는 금 나노 입자의 큰 크기(평균 직경 8.6 nm)는 주로 펩타이드 구체 표면에 위치한데 반하여, HR-TEM 분석의 결과는 작은 금 나노 입자(평균 직경 2.5~4.5 nm)는 하이브리드 구체 내부에 위치하고 있음을 명백히 보여주었다(도 2 패널b). 금의 EDX 전기 미세탐침 분석으로 펩타이드 구체를 통해 금 나노입자의 존재를 확인하였다(도 2 패널c). 이러한 결과들은 AG4가 금속 금 나노 입자를 포함하고 동시에 금 이온을 감소시키는 초미세 구형 입자로 자가 조립시킬 수 있음을 보여준다. 이것은 펩타이드 구체 내부에 끼워 들어가는 펩타이드 제1 서열에 의해 초기 감소 중에 작은 크기의 금 나노 입자가 형성되는 것으로 보인다. 한편, 금 나노 입자 표면은 반응 용액 안에서 금 이온에 노출 시 계속적인 성장 과정이 일어나기 쉽다. 이것은 펩타이드 구체 내부에서 발견되는 끼워 들어간 금 나노 입자(직경의 범위가 2.5-4.5 nm)와 비교하여 금 나노 입자 표면의 다소 큰 크기(평균 직경이 8.6 nm)에 의해 증명되었다. 항온 처리 시간의 작용으로 금 이온의 반응 속도를 결정하기 위해 속도 연구를 시행하였다. ICP-OES 분석(도 3 패널a)으로 금 이온 농도가 항온 처리 6시간 후 0.1 mM에서 0.04 mM으로 감소하였고, 뒤이어 24시간이 지나 0.03 mM까지 약간 더 감소하였다. 이러한 결과는 펩타이드 제1 서열이 초기 반응 단계에서 금 이온의 빠른 감소에 관여하고 있다는 것을 시사한다. 반응의 초기 단계에서 금 나노 입자와 상호 작용하는 펩타이드 구체의 중간체 구조를 확인하기 위해 TEM 영상을 찍었다. 도 3 패널b의 결과는 목 유사 구조 및 작은 크기의 펩타이드 구체(직경이 90-400 nm)가 반응 초반 3시간 동안에 형성된다는 것을 보여준다(5). 게다가 도 3 패널c의 결과는 다른 내부 구조를 가지고 있는 반구 구조 및 불완전 펩타이드 구체가 존재하며, 작은 구체는 응집 반응을 경유하여 보다 큰 크기로 합체된다.

펩타이드 제1 서열의 두 번째 구조는 CD 스펙트럼을 이용하여 조사하였다. 금 이온을 가지는 펩타이드 제1 서열은 질서 있는 2차 구조를 가지지 않으나 199 nm에서 강한 음성 피크는 물에서 펩타이드의 랜덤 코일 형태를 이루고 있음과 금 이온이 용액에 첨가되지 않은 조건에서의 대조군 실험과 비교하였을 때 낮은 강도를 보여주었다(도 8). 이 결과는 펩타이드 제1 서열은 금 이온의 존재와 무관하게 랜덤 코일 형태로 존재한다는 것을 시사한다. 그러나 금 이온의 존재는 CD 신호의 강도를 떨어뜨리고, 이것은 금 이온과 특이적으로 상호 작용하는 펩타이드 구형 구조의 형태와 관련이 있다(27). 도 4에서 보여주었던 결과는 펩타이드 구체의 크기는 반응 온도에 의해 조절된다는 것을 보여준다. 펩타이드 구체의 평균 직경은 37℃(473 nm), 50℃(208 nm) 및 70℃(114 nm)로 반응 온도를 증가시킬 때 각각 약 56% 및 76%만큼 감소되었다(도 4). 그러나, 펩타이드 구체의 크기의 감소에도 불구하고, 구체 표면에 분포한 금 나노 입자의 크기는 반응 온도에 반응하여 큰 변화가 일어나지 않았고, 금 나노 입자의 평균 직경은 각각 37℃에서 8.6 nm, 50℃에서 8.3 nm 및 70℃에서 8.1 nm이었다(도 4).

금 나노 입자 없이 펩타이드 구체를 얻기 위해, 펩타이드 구체 표면 및 내부에서 금 나노 입자의 용해를 KI/I₂ 용액을 처리하여 수행하였다. EDX 분석으로 KI/I₂ 처리 후에 원소의 금 나노 입자가 펩타이드 구체의 내부 및 표면 위에 없는 것을 확인하였다(도 9). 도 5의 TEM 영상은 KI/I₂ 에칭 결과 구체 구조체에서 금 나노 입자를 성공적으로 제거한 것을 보여준다. 게다가, 이러한 연구들은 펩타이드 구체가 금 나노 입자들이 없는 조건에서 안정적으로 존재하고 있다는 것을 보여주었다. 고 해상도 TEM 영상은 또한 금 나노 입자가 들어간 하이브리드 구체의 울퉁불퉁한 표면과 대조적으로 금 나노 입자가 없는 펩타이드 구체의 표면을 보여준다(도 1 및 도 5 패널b). 함께 고려해보면, 이러한 결과들은 일단 자가-조립 펩타이드 구체 구조체가 형성되면, 금 나노 입자에 영향 받지 않고 안정하게 구조를 유지하는 것을 시사한다. 게다가 펩타이드의 이형 구조체 및 금 나노 입자 하이브리드는 물론 금 나노 입자가 없는 동형 자가-조립 펩타이드 구체는 항박테리아 제재 또는 유전자 및 의약 전달 시스템과 같이 널리 잠재적으로 이용 가능할 것이다(28, 29).

하이브리드 구체의 안정성은 또한 미래 바이오 나노 테크놀로지의 응용을 위해 극심한 화학적 및 촉매 조건 아래에서 관찰되어지는 것이 필요하다(30). 자가-조립 펩타이드 및 금 나노 입자 하이브리드 구조체는 25℃에서 10% TFA를 처리한 후에 안정적으로 관찰되었다(도 10 패널a). 게다가 KI/I₂ 처리에 의해 금 나노 입자의 제거 후에 유지되는 펩타이드 구체 구조체는 10% TFA로 처리에 의해 형성된 매우 높은 산성 조건에서도 안정하였다(도 10 패널d). 대조적으로, 염기 조건(1 M NaOH)에서 5시간 동안 하이브리드 펩타이드 및 금 나노 입자 구체를 항온 처리시킨 결과 구체의 분해가 일어났다(도 10 패널b). 비슷하게, 37℃ 조건에서 1시간 동안 단백질 분해효소 K와 함께 하이브리드 구체에 처리한 결과 구체의 파괴가 일어나고 금 나노 입자가 빠져 나왔다(도 10 패널c). 이러한 결과는 자가-조립 펩타이드 구체는 금 나노 입자의 존재와 무관하게 산성 조건 아래에서 안정하지만 염기성 조건이나 단백질 분해 효소의 존재 하에서는 안정하지 않음을 가리킨다. 이는 하이브리드 구체가 산성 조건에서 새로운 기능적 구조로서 특이적인 이용을 제공한다는 것을 보여준다.

펩타이드 제1 서열의 일차 서열과 펩타이드와 금 나노 하이브리드 구체 사이의 관계를 결정하기 위해, 펩타이드 제1 서열의 서열에 있는 방향족 기를 포함하고 있는 페닐알라닌과 타이로신 잔기를 각각 글라이신 및 세린 잔기로 치환하였다. 이러한 분석에서 사용되는 펩타이드 서열들은 각각 NPSSLFRSLPSD(Y에서 S로), NPSSLFRGLPSD (Y에서 G로), NPSSLGRYLPSD (F에서 G로) 및 NPSSLGRSLPSD (F 및 Y에서 G 및 S로)이다. 도 6의 결과는 펩타이드 제1 서열의 테스트한 특정 아미노산을 치환한 결과 펩타이드 구체 구조체를 형성할 수 없었다는 것을 보여준다. 대신에 변형된 펩타이드 모두 네트워크형, 와이어-유사 구조, 비패턴형으로 금 나노 입자와 응집을 이루며 형성되었다(도 6). 흥미로운 점은, 금에 대한 활성적 환원제 역할을 하는 타이로신이 글라이신 또는 세린으로 치환되는 경우에서 조차 금 나노 입자들은 여전히 변형된 펩타이드에 의해 형성되었다는 것이다(31). 이러한 연구 결과들은 타이로신 잔기 단독으로 금 이온의 환원에 충분하지 않으며, 펩타이드 제1 서열 내부에서 몇몇 단일 아미노산의 변형이 나노 구체 구조체의 자가-조립을 억제한다는 것을 보여주었다. 게다가 펩타이드 제1 서열의 일차적 구조는 금 이온의 존재 하에 나노 구체 구조체의 합성이 일어나도록 하는 새로운 기능을 가지고 있는 것을 보여준다. 특정 펩타이드들 안에 내재한 아미노산의 변화가 금 나노 구조체의 합성, 모양 및 응집에 영향을 미친다는 것을 보여준 이전의 사실들에 주목해야 한다(10). 예를 들어, 펩타이드 A3의 세린과 함께 타이로신 잔기 중 하나가 치환된 결과 금 나노 입자 및 금 나노 입자와 함께 자가-조립하는 펩타이드 나노리본의 형성하는 능력을 잃어버린다(22, 32). 이러한 인식에도 불구하고, 펩타이드 제1 서열과 구체 형성 사이의 일반적인 관계는 아직까지 알려지지 않았다.

형광 염료인 NHS-형광물질을 N-말단 및 시스테인에 연결된 C-말단에 각각 연결하는 예전에 설계된 펩타이드(FAM-Si#6-C)를 이용함으로써 하이브리드 구체의 표면 기능화를 개발하였다(도 11)(11). 이는 금과 결합하는 것이 알려져 있다. 컨포컬 레이저 스캐닝 현미경을 이용하여 하이브리드 구조체 내부에서 금 나노 입자와 특이적으로 결합하는 형광 염료로 표지된 펩타이드가 방출하는 빛의 강도를 측정하였다. 도 11의 결과는 FAM-Si#6-C 펩타이드가 하이브리드 구체 표면 위에서 결합하는 것을 보여준다. 이것은 하이브리드 구조체 표면에 노출된 부분에서 금 나노 싸이올(-SH)기를 포함하는 생물학적 활성 분자들이 쉽게 개질될 수 있으며, 이러한 하이브리드 구조체는 다양한 적용에 유용할 것을 시사한다.

도 7의 도식은 자가-조립하는 펩타이드 및 금 나노 하이브리드 구조체의 동시적 합성을 보여준다. 펩타이드 자가-조립 및 금의 핵형화는 동시에 일어나며, 이는 펩타이드 제1 서열 및 염화금산의 특이적 상호작용에 의해 보조된다. 조립 과정의 초기 단계는 목-유사 구조체, 작은 크기의 펩타이드 구체, 반구 및 불완전 펩타이드 구체를 경유하며 진행한다. 이러한 구조체들은 융합하여 펩타이드 구체 입자 내부 및 표면에 위치하는 금 나노입자와 함께 펩타이드 및 금 나노 입자 하이브리드 구조체를 형성하도록 성장한다.

본 발명자들은 금 나노 입자와 함께 자가-조립 펩타이드로 구성된 온도에 의해 조절 가능한 조립, 펩타이드 및 무기 하이브리드 구체를 설명하였다. 하이브리드 구체는 37℃에서 산성 수용액 조건에서 형성되었다. 이 반응에서 형성된 금 나노 입자는 펩타이드 구체의 내부와 표면 모두에 위치하며, 이는 두 반응 물질의 특이적인 상호 작용을 경유하여 동시적인 펩타이드의 자가-조립 및 금 이온의 핵형화를 보여준다. 금 나노 입자가 있는 펩타이드 구체의 크기는 조절가능하며, 반응 온도와 반비례 관계에 있다. 금 제거 실험은 일단 형성되면 펩타이드 구체는 금 나노 입자의 존재와 무관하게 안정하다는 것을 보여주었다. 구체의 결합은 펩타이드 서열의 일차 아미노산에 달려있으며 방향족 기가 포함된 아미노산에 의해 특히 영향 받았다. 여기에 사용된 다기능 하이브리드 생체분자를 형성하는 방법은 의약전달계, 바이오 이미징 및 바이오센서 시스템을 위한 바이오 메디컬, 전기 및 나노테크놀로지 영역 등의 폭넓게 이용될 다양한 나노 구조체를 생성하는데 도움이 될 것이다.

이상으로 본 발명의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적인 기술은 단지 바람직한 구현예일 뿐이며, 이에 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백하다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항과 그의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.

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서열목록 전자파일 첨부

Claims

(i) 금 이온 환원제 및 자가-조립 유도제로서의 금-결합 펩타이드 및 (ii) 금 염(gold salt)을 접촉시켜 상기 금-결합 펩타이드의 자가-조립을 유도하여 하이브리드 구조물에 대한 스캐폴드를 형성시키면서 동시에 상기 스캐폴드 내에 금 나노입자를 형성시키는 단계를 포함하고, 상기 금-결합 펩타이드는 펩타이드 서열목록 제1서열 및 제2서열로 구성된 군으로부터 선택되는 펩타이드 서열로 이루어져 있으며, 상기 단계는 pH 1-5의 수용성 용액 조건에서 실시되는 펩타이드-금 나노입자 하이브리드 구체(구조물)의 제조방법.
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제 1 항에 있어서, 상기 금염은 HAuCl₄, HAuBr₄, NaAuCl_4,AuCl₃·3H₂O 및 NaAuCl₄·2H₂O 로 구성된 군에서 선택되는 적어도 하나인 것을 특징으로 하는 방법.
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제 1 항에 있어서, 상기 수용성 용액 조건은 pH 3-4의 수용성 용액 조건인 것을 특징으로 하는 방법.
제 1 항에 있어서, 상기 펩타이드-금 나노입자 하이브리드 구체는 온도에 의해 그 크기가 변화되는 것을 특징으로 하는 방법.
제 10 항에 있어서, 상기 펩타이드-금 나노입자 하이브리드 구체는 온도가 상승함에 따라 그 크기가 감소하는 것을 특징으로 하는 방법.
제 1 항에 있어서, 상기 펩타이드-금 나노입자 하이브리드 구체는 온도가 상승함에 따라 그 크기 분포가 일정해 지는 것을 특징으로 하는 방법.
제 1 항에 있어서, 상기 방법은 상기 펩타이드-금 나노입자 하이브리드 구체의 표면을 기능화(functionalization)하는 단계를 추가적으로 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
제 13 항에 있어서, 상기 기능화는 표지물질을 이용하여 실시하는 것을 특징으로 하는 방법.
제 1 항, 제 6 항 및 제 9 항 내지 제 14 항 중 어느 한 항의 방법에 의해 제조된 펩타이드-금 나노입자 하이브리드 구체.
제 1 항, 제 6 항 및 제 9 항 내지 제 12 항 중 어느 한 항의 방법에 의해 제조된 펩타이드-금 나노입자 하이브리드 구체 및 표지물질을 추가적으로 포함하며, 상기 펩타이드-금 나노입자 하이브리드 구체는 그 표면이 상기 표지물질로 기능화 되어 있는 것을 특징으로 하는 표지 조성물.