KR100942320B1 - 나노입자의 생물학적 조절 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 반도체 및 원소 탄소-함유 재료에 대한 아미노산 올리고머의 선택적 결합을 위한 조성물 및 방법을 포함한다. 본 발명의 한 형태는, 재료에 특이적으로 결합하는 아미노산 올리고머를 재료를 형성할 수 있는 용액과 상호 작용시킴으로써, 반도체 또는 원소 탄소-함유 재료의 입자 크기를 조절하는 방법이다. 동일한 방법은 반도체 재료의 나노결정 입자의 종횡비를 조절하는데 사용될 수 있다. 본 발명의 다른 형태는, 반도체 또는 원소 탄소-함유 재료로부터 나노와이어를 생성하는 방법이다. 본 발명의 또 다른 형태는, 하나 이상의 생물학적 재료를 결합시킬 수 있는 기질, 상기 기질에 결합된 하나 이상의 생물학적 재료, 및 하나 이상의 생물학적 재료에 결합된 하나 이상의 원소 탄소-함유 분자를 포함하는 생물학적 스캐폴드이다.
나노결정, 반도체, 생물학적 스캐폴드, 원소 탄소 함유 재료

Description

나노입자의 생물학적 조절{Biological Control of Nanoparticles}
본 발명은 통상적으로, 특히 유기 폴리머를 사용하는 반도체 재료 및 원소 탄소-함유 재료의 표면 인식에 대한 여러 가지 재료의 선택적 인식에 관한 것이다.
본 출원은 2001년 9월 28일에 출원된 임시 특허 출원 제60/325,664호에 대해 우선권을 주장한다.
본 출원에서 수행된 연구는 부분적으로 미 육군 연구국 (Army Research Office)으로부터 재정 지원을 받았다 (DADD19-99-0155).
뉴클레오티드 및(또는) 아미노산 서열 목록은 컴퓨터 상에서 읽을 수 있는 형태의 자료로서 참고자료로 삽입된다.
생물학적 시스템에서, 유기 분자는 무기 재료, 예를 들어 탄산칼슘 및 실리카의 응집 및 무기상에 대해, 그리고 미세결정 및 기타 나노규모 구성 단위의 생물학적 기능에 필요한 복합체 구조로의 조립에 대해 놀랄만한 조절 수준을 나타낸다. 이러한 조절은 이론적으로, 흥미로운 자기적, 전기적 또는 광학적 특성을 갖는 재료에 적용될 수 있다.
생물학적 과정에 의해 생성된 재료는 통상적으로 연질이며, 놀랍도록 복잡한 구조로 배열된 분자 구성 단위 (즉, 지질, 펩티드 및 핵산)의 대단히 간단한 집합 으로 구성된다. 집적 회로 상에 최소의 특징부들을 구성하기 위해 계열 리쏘그래프 공정 (lithographic processing) 접근법에 의존하는 반도체 산업과 달리, 생물체는 다수의 분자 성분들에 동시에 작용하는 공유 및 비공유력 모두를 사용하여 그의 구조적 "청사진"을 제작한다. 또한, 상기 구조는 흔히 임의의 분자 성분을 변화시키지 않으면서 둘 이상의 가용형 사이에서 훌륭하게 재배열될 수 있다.
차세대 미세전자, 광학 및 자기 장치의 제조를 위한 "생물학적" 재료의 사용은, 종래 공정법의 한계를 해결할 수 있는 해법을 제공한다. 상기 접근법에서 중요한 인자는, 생물학적-무기-유기 재료의 적절한 친화성 및 조합의 동정, 독특하고 특이적인 조합을 생성하기 위한 합성 방법 및 인식의 동정, 및 적절한 구성 단위의 합성에 대한 이해이다.
발명의 요약
본 발명은 여러 가지 유기 및 무기 재료에 대한 향상된 선택성을 갖는 유기 폴리머, 예를 들어 펩티드의 선택, 생산, 단리 및 특징화에 기초한다. 본 발명의 하나의 실시태양에서, 생물학적 재료, 예를 들어 파지 디스플레이 라이브러리와 같은 조합 라이브러리는, 반복적인 회전의 펩티드 진화를 이용하는 표적의 지정된 분자 인식을 야기한다. 유기 폴리머 (예를 들어, 펩티드)는 반도체 표면 및 원소 탄소-함유 화합물, 예를 들어 탄소 나노튜브 및 흑연을 포함하는 (이에 한정되지는 않음) 다양한 범위의 재료에 높은 특이성으로 결합하도록 생성되고 유도될 수 있다. 또한, 본 발명은 특히 생물학적 재료의 특정 배향, 형상 또는 구조 (예를 들어, 결정의 형상 또는 배향), 구조적으로 유사한 재료의 조성물이 사용되는지 여부 를 인식할 수 있는 유기 인식 분자 (예를 들어, 유기 폴리머)가 선택적으로 단리되도록 한다.
본 발명의 하나의 실시태양에서, 생물학적 스캐폴드가 개시된다. 스캐폴드는 하나 이상의 생물학적 재료가 결합할 수 있는 기질, 기질에 결합된 하나 이상의 생물학적 재료, 및 생물학적 재료에 결합된 하나 이상의 원소 탄소-함유 분자를 포함한다. 본 발명의 다른 실시태양에서, 하나 이상의 생물학적 재료가 결합할 수 있는 기질, 기질에 결합된 제1 생물학적 재료 및 제1 생물학적 재료에 결합된 제2 생물학적 재료, 및 제2 생물학적 재료에 결합된 하나 이상의 원소 탄소-함유 분자를 포함하는 생물학적 스캐폴드가 개시된다.
본 발명의 또 다른 실시태양에서, 생물학적 스캐폴드는 하나 이상의 박테리오파지가 결합할 수 있는 기질, 기질에 결합된 하나 이상의 박테리오파지, 박테리오파지의 일부분을 인식하는 하나 이상의 펩티드, 및 펩티드를 인식하는 하나 이상의 원소 탄소-함유 분자를 포함한다.
본 발명의 또 다른 실시태양에서, 생물학적 스캐폴드의 제조 방법이 개시된다. 이 방법은 하나 이상의 생물학적 재료가 결합할 수 있는 기질을 제공하고, 기질에 하나 이상의 생물학적 재료를 결합시키며, 하나 이상의 원소 탄소-함유 분자를 생물학적 재료와 접촉시켜 생물학적 스캐폴드를 형성하는 것을 포함한다.
본 발명의 또 다른 실시태양에서, 분자가 기술된다. 분자는 원소 탄소-함유 분자를 선택적으로 인식하는 유기 폴리머를 포함한다.
본 발명의 또 다른 실시태양에서, 유도된 (directed) 반도체 형성 방법이 기 술된다. 이 방법은 소정의 면 특이성 반도체 재료를 제1 이온과 접촉시켜 반도체 재료 전구물질을 생성하고, 반도체 재료 전구물질에 제2 이온을 첨가하는 단계를 포함하며, 여기서 분자는 소정의 면 특이적 반도체 재료가 형성되도록 유도한다. 분자는 예를 들어, 키메릭 외피 단백질의 부분으로서 박테리오파지 표면 상에 위치할 수 있는 아미노산 올리고머 또는 펩티드를 포함할 수 있다. 분자는 심지어 핵산 올리고머일 수 있고, 조합 라이브러리로부터 선택될 수 있다. 분자는 약 7 내지 20개 아미노산의 아미노산 폴리머일 수 있다. 본 발명은 또한, 본 발명의 방법으로 제조된 반도체 재료를 포함한다.
본 발명의 재료 및 방법을 사용하여 유도되고 성장된 조절된 결정에 대한 용도는 신규한 광학적, 전자적 및 자기적 특성을 갖는 재료를 포함한다. 당업자에게 공지될 수 있는 바와 같이, 자세한 광학적, 전자적 및 자기적 특성은 예를 들어, 장치의 패턴화에 의한 반도체 결정의 형성에 의해 유도될 수 있고, 본 발명을 사용하는 패턴화는 패턴의 층상법 또는 패턴을 내려놓아 패턴, 층 또는 심지어 둘 다에서 결정이 형성되도록 하는 것을 포함할 수 있다.
본 발명을 사용하여 형성된 패턴 및(또는) 층의 다른 용도는, 고밀도 자기 저장을 위한 반도체 장치의 형성이다. 예를 들어, 양자 컴퓨팅에 사용하기 위한 트랜지스터의 형성에 대해서는 다른 구조가 사용될 수 있다. 하지만, 본 발명으로 제조된 패턴, 구조 및 신규 재료에 대한 다른 용도는 의학적 용도를 위한 영상화 및 영상화 조영제를 포함한다.
반도체 및 반도체 결정 및 구조의 유도된 형성에 대한 상기 하나의 용도는, 양자 도트 패턴에 기초한 정보 저장, 예를 들어 군대에서 아근 또는 적, 또는 심지어 직원 상황의 확인을 포함한다. 양자 도트는 직물, 갑옷 또는 사람에게서 확인에 의하여 개개의 군인 또는 직원을 확인하는데 사용될 수 있다. 이와 달리, 도트는 돈의 패브릭을 코딩하는데 사용될 수 있다. 본 발명의 또 다른 용도는, 본 발명의 펩티드를 사용하여 전달될 약을 트랩핑하는데 있어, 약물 전달을 위한 이관능성 및 다관능성 펩티드를 생성하는 것이다. 또한 다른 용도는, 약물을 전달하는 펩티드를 사용하는 약물 트랩핑에 의한 유전자 또는 단백질 발현에 기초한 생체내 및 시험관내 진단법에 대한 것이다.
본 발명의 특징 및 장점을 더욱 완전하게 이해하기 위해, 참조 도면과 함께 발명의 상세한 설명을 참조한다.
도면의 간단한 설명
본 발명의 특징 및 장점을 더욱 완전하게 이해하기 위해, 참조 도면과 함께 발명의 상세한 설명을 참조한다.
도 1은 본 발명에 따라 선택된 무작위 아미노산 서열을 나타내고;
도 2는 본 발명에 따른 구조의 XPS 스펙트럼을 나타내고;
도 3은 본 발명에 따른 헤테로구조의 파지 인식을 나타내고;
도 4-8은 본 발명에 따른 특이적 아미노산 서열을 나타내고;
도 9는 본 발명에 따른 파지 라이브러리의 펩티드 삽입 구조를 나타내고;
도 10은 본 발명에 따른 3 및 4회전의 선택에서 여러 가지 아미노산 치환을 나타내고;
도 11은 본 발명에 따른 5회전의 선택 후 아미노산 치환을 나타내고;
도 12는 본 발명에 따른 ZnS 나노 입자로부터 제조된 나노와이어를 나타내고;
도 13은 본 발명에 따른 탄소 플랜체트 (planchet)에 대한 PhD-C7C 라이브러리 선택으로부터 수득된 유기 폴리머 (예를 들어, 펩티드) 서열을 나타내고;
도 14는 본 발명에 따른 탄소 플랜체트에 대한 PhD-12 라이브러리 선택으로부터 수득된 유기 폴리머 (예를 들어, 펩티드) 서열을 나타내고;
도 15는 본 발명에 따른 SWNT 페이스트 응집물에 대한 pHD-12 라이브러리 선택으로부터 수득된 유기 폴리머 (예를 들어, 펩티드) 서열을 나타내고;
도 16은 본 발명에 따른 HOPG에 대한 PhD-12 라이브러리 선택으로부터 수득된 유기 폴리머 (예를 들어, 펩티드) 서열을 나타내고;
도 17은 본 발명에 따른 SWNT 페이스트 응집물에 대한 여러 가지 파지 클론의 결합 효율을 나타내고;
도 18은 본 발명에 따른 탄소 플랜체트에 대한 여러 가지 파지 클론의 결합 효율을 나타내고;
도 19는 본 발명에 따른 탄소 플랜체트에 결합된 여러 가지 파지 클론의 다중초점 영상을 나타내고;
도 20은 본 발명에 따른 탄소 플랜체트에 결합된 여러 가지 비오틴 결합 펩티드의 다중초점 영상을 나타내고;
도 21은 본 발명에 따른 습윤 SWNT 페이스트에 결합된 여러 가지 파지 클론 의 다중초점 영상을 나타내고;
도 22는 본 발명에 따른 HOPG 상에서 파지 클론의 AFM 영상을 나타내고;
도 23은 SWNT 정제 음성 컬럼의 개략도를 나타내고;
도 24는 SWNT에 대한 파지 결합 (파지-SWNT)의 개략도를 나타내고;
도 25는 SWNT 결합 펩티드를 사용한 n-형 SWNT 개질의 개략도를 나타내고;
도 26은 약물 방출 시스템으로서 SWNT의 응용에 대한 개략도를 나타내고;
도 27은 암 약물에 있어서 SWNTs의 응용에 대한 개략도를 나타낸다.
본 발명의 여러 가지 실시태양의 제작 및 사용은 이하에서 자세하게 설명될 것이지만, 본 발명은 다양한 구체적인 상황에서 실시될 수 있는 다수의 이용 가능한 독창적인 발명의 개념을 제공함을 이해해야 한다. 본원에서 논한 특정 실시태양은 발명을 구성하고 이용하는 특정 방식의 단순한 예시일 뿐이고, 본 발명 영역의 한계를 정하는 것은 아니다.
본원에 사용된 용어들은 본 발명이 해당하는 분야의 당업자에게 통상적으로 이해된 의미를 갖는다. "하나 (a, an)" 및 "그 (the)"와 같은 용어들은 단수의 물질만을 지칭하고자 하는 것이 아니고, 설명을 위해 특정 실시예가 사용될 수 있는 통상적인 군을 포함한다. 본원의 용어는 발명의 특정 실시태양을 기술하기 위해 사용되지만, 청구범위에 기술된 것을 제외하고는 그의 사용이 본 발명을 제한하는 것은 아니다.
본원의 용어는 발명의 특정 실시태양을 기술하기 위해 사용되지만, 청구범위 에 기술된 것을 제외하고는 그의 사용이 본 발명을 제한하는 것은 아니다. 본 명세서 전체에 사용된 바와 같이, "양자 도트", "나노 입자" 및 "입자"라는 용어는 상호 교체되어 사용될 수 있다.
본원에 사용된 바와 같이, "생물학적 재료" 및(또는) "생물학적 재료"라는 용어는 바이러스, 박테리오파지, 박테리아, 펩티드, 단백질, 아미노산, 스테로이드, 약물, 발색단, 항체, 효소, 단일 가닥 또는 이중 가닥 핵산, 및 그의 임의의 화학적 개질을 나타낸다. 생물학적 재료는 자가 조립되어 기질의 접촉 표면 상에 건조 박막을 형성할 수 있다. 자가 조립은 표면 상에 생물학적 재료가 무작위적으로 또는 균일하게 정렬될 수 있도록 한다. 또한, 생물학적 재료는 용매 농도, 전기 및(또는) 자기장의 적용, 광학, 또는 기타 화학적 또는 장 (field) 상호 작용에 의해 외부적으로 조절되는 건조 박막을 형성할 수 있다. 본원에 사용된 바와 같이, 생물학적 재료 및 "유기 폴리머" 및 "폴리머성 유기 재료"는 상호 교체되어 사용될 수 있다. 본원에 사용된 바와 같이, 유기 폴리머는 다중 유닛의 유기 재료를 나타내며, 여기서 유기 재료는 동일하거나 또는 다를 수 있는 여러 가지의 "모노머"를 포함한다. 예를 들어, 단백질, 항체, 펩티드, 핵산, 키메릭 분자, 약물, 및 생물학적 시스템 (예를 들어, 진핵 생물)에 존재하는 것으로 공지된 기타 탄소-함유 재료가 유기 폴리머의 예이다. 기타 유기 폴리머는 천연물들을 모방할 수 있는 합성 모노머와 함께 하나 이상의 생물학적 모노머를 포함하는 생물학적 폴리머의 유도체 또는 유사체일 수 있다.
"무기 분자" 또는 "무기 화합물"이라는 용어는 예를 들어, 인듐 주석 산화 물, 도핑제, 금속, 무기물, 방사성 동위원소, 염, 및 그의 조합과 같은 화합물을 나타낸다. 금속은 Ba, Sr, Ti, Bi, Ta, Zr, Fe, Ni, Mn, Pb, La, Li, Na, K, Rb, Cs, Fr, Be, Mg, Ca, Nb, Tl, Hg, Cu, Co, Rh, Sc 또는 Y를 포함할 수 있다. 무기 화합물은 예를 들어 고 유전 상수 재료 (절연체), 예를 들어 당업자에게 공지된 바륨 스트론튬 티타네이트, 바륨 지르코네이트 티타네이트, 납 지르코네이트 티타네이트, 납 란탄 티타네이트, 스트론튬 티타네이트, 바륨 티타네이트, 바륨 마그네슘 플루오라이드, 비스무트 티타네이트, 스트론튬 비스무트 탄탈라이트 및 스트론튬 비스무트 탄탈라이트 니오베이트, 또는 그의 변이체를 포함할 수 있다.
"유기 분자" 또는 "유기 화합물"이라는 용어는 탄소 단독으로 또는 조합으로 함유하는 화합물, 예를 들어 뉴클레오티드, 폴리뉴클레오티드, 뉴클레오시드, 스테로이드, DNA, RNA, 펩티드, 단백질, 항체, 효소, 탄수화물, 지질, 전도성 폴리머, 약물 및 그의 조합을 나타낸다. 약물은 항생제, 항균제, 항염증제, 진통제, 항히스타민제, 및 포유류의 병적 (또는 잠재적으로 병적인) 증상에 대해 치료적으로 또는 예방적으로 사용되는 임의의 약제를 포함할 수 있다.
"원소 탄소-함유 분자"라는 용어는 통상적으로, 탄소의 동소체 형태를 나타낸다. 예를 들어 다이아몬드, 흑연, 활성탄, 탄소60, 카본 블랙, 공업 탄소, 목탄, 코크스 및 철을 포함하지만 이에 한정되지는 않는다. 기타 예로서 탄소 플랜체트, 고도로 규칙화된 열분해 흑연 (HOPG), 단일벽 나노튜브 (SWNT), 단일벽 나노튜브 페이스트, 다중벽 나노튜브, 다중벽 나노튜브 페이스트, 및 금속 포화 탄소-함유 재료를 포함하지만 이에 한정되지는 않는다.
본원에 사용된 바와 같이, "기질"은 분자가 공유 결합 또는 비공유 결합으로 결합되는 미세제조된 고체 표면일 수 있고, 예를 들어 규소, 랭뮤어-보제트 필름, 관능화 유리, 게르마늄, 세라믹, 규소, 반도체 재료, PTFE, 탄소, 폴리카르보네이트, 운모, 마일라, 플라스틱, 석영, 폴리스티렌, 갈륨 아세나이드, 금, 은, 금속, 금속 합금, 직물, 및 그 표면 상에 혼입된 아미노, 카르복실, 티올 또는 히드록실과 같은 관능기를 가질 수 있는 그의 조합을 포함한다. 유사하게, 기질은 유기 재료, 예를 들어 생물학적 재료가 결합할 수 있는 표면을 갖는 단백질, 포유류 세포, 항체, 기관, 또는 조직일 수 있다. 표면은 크거나 또는 작을 수 있고, 반드시 균일해야 하지는 않지만 접촉 표면으로서 기능해야만 한다 (반드시 단층은 아님). 기질은 다공성, 평면성 또는 비평면성일 수 있다. 기질은 기질 자체 또는 유기 또는 무기 분자로 제조되고 유기 또는 무기 분자가 접촉할 수 있는 제2 층 (예를 들어, 기질 또는 접촉 표면을 갖는 생물학적 재료)일 수 있는 접촉 표면을 포함한다.
본원 발명자들은 종래에 펩티드가 반도체 재료에 결합할 수 있음을 보여주었다. 결합하는 펩티드에 유용한 반도체 재료는 갈륨 아세나이드, 인화인듐, 질화갈륨, 황화아연, 알루미늄 아세나이드, 알루미늄 갈륨 아세나이드, 황화카드뮴, 카드뮴 셀레나이드, 아연 셀레나이드, 황화납, 질화 붕소 및 규소를 포함하지만 이에 한정되지는 않는다.
반도체 나노결정은 크기 및 형상-의존성 광학적 및 전기적 성질을 갖는다. 이러한 다양한 특성으로 인해 여러 가지 장치, 예를 들어 발광 다이오드 (LED), 단 일 전자 트랜지스터, 광전지, 광학 및 자기 기억장치, 및 진단 표지와 센서에 응용될 잠재성이 있다. 입자 크기, 형상 및 상의 조절은 또한, 자동차 페인트와 같은 보호 코팅 및 가정용 페인트와 같은 안료에 있어서 중요하다. 반도체 재료는 특정 형상 및 크기로 가공될 수 있는데, 여기서 상기 반도체 재료의 광학적 및 전기적 특성은 다수의 장치에 사용하기 위해 최적으로 개발될 수 있다.
본원 발명자들은 또한, 나노 입자의 응집 및 그의 자가 조립을 유도하는 방법을 개발했다. 펩티드의 주요 특징은 면 특이성을 가지고 과학 기술적으로 중요한 재료를 인식하여 결합하고, 크기-제한 결정성 반도체 재료를 응집하며, 응집된 나노 입자의 결정상을 조절할 수 있는 능력이다. 펩티드는 또한, 재료의 종횡비를 조절하여 광학적 특성을 조절할 수 있다.
간단히 말해서, 생물학적 시스템이 매우 미세한 규모로 아주 복잡한 구조로 조립하는 능력은, 유사한 방식으로 행동할 수 있는 비-생물학적 시스템을 동정하고자 하는 요구에 상당한 흥미를 부여했다. 특히 중요한 것은 흥미로운 전자적 또는 광학적 특성을 갖는 재료에 적용될 수 있는 방법일 것이지만, 자연 진화는 생물 분자와 상기 재료 간의 상호 작용에 대해서는 선택하지 않았다.
본 발명은 생물학적 시스템이 나노규모 구성 단위를 복합적이고 고도의 완전성, 조절된 크기 및 구성적 균일성을 갖는 기능적으로 복잡한 구조로 효과적이고 정확하게 조립하는 인식에 기초한다.
무작위 유기 폴리머 풀 (pool)을 제공하는 하나의 방법은, 파지-디스플레이 라이브러리를 사용하는 것이다. 파지-디스플레이 라이브러리는 결정성 반도체 구 조 또는 기타 재료와 반응성인 각각 다른 펩티드를 제공하며, M13 콜리파지의 pIII 외피 단백질에 융합된 7 내지 12개의 아미노산을 포함하는 무작위 펩티드의 조합 라이브러리이다. 5카피의 pIII 외피 단백질은 입자의 10-16 nm를 차지하면서 파지 입자의 한 말단 상에 위치한다. 파지-디스플레이 접근법은 펩티드 기질 상호 작용과 그 상호 작용을 코드하는 DNA 간의 물리적인 결합을 제공한다.
펩티드 서열은 반도체와 같은 여러 가지 재료, 및 탄소 나노튜브 및 흑연과 같은 원소 탄소-함유 분자에 대해 친화성을 갖도록 개발되었다. 5가지의 각각 다른 단일-결정 반도체, GaAs(100), GaAs(111)A, GaAs(111)B, InP(100) 및 Si(100)은 이하 실시예에서 사용되었다. 상기 반도체는 펩티드 상호 작용의 조직적인 평가 및 각각 다른 결정성 구조에 대한 본 발명의 방법의 통상적인 용도의 확인을 가능하게 한다. 또한, 원소 탄소-함유 분자, 예를 들어 탄소 플랜체트, 고도로 규칙화된 열분해 흑연 (HOPG) 및 단일벽 나노튜브 (SWNT) 페이스트가 사용되었다.
파지-디스플레이 라이브러리를 사용하여, 특정 결정에 성공적으로 결합된 단백질 서열이 표면으로부터 용리되고, 예를 들면 백만 배 증폭되어, 더욱 엄격한 조건하에서 기질에 대해 반응된다. 라이브러리에서 가장 특이적인 결합 펩티드를 갖는 파지를 선택하기 위해, 상기 방법은 3 내지 7회 반복된다. 예를 들어 제3, 제4 및 제5회전의 파지 선택 후, 결정-특이적 파지가 단리되어 그 DNA가 시퀀싱되고, 결정 조성 (예를 들어, GaAs에는 결합하지만 Si에는 결합하지 않음) 및 결정성 면 (예를 들어, (100) GaAs에는 결합하지만, (111)B GaAs에는 결합하지 않음)에 선택적인 펩티드 결합을 동정한다.
GaAs(100)으로부터 선택된 20개의 클론을 분석하여, 아미노산 관능성 분석으로 GaAs 표면에 대한 에피토프 결합 도메인을 결정했다. 개질된 pIII 또는 pVIII 단백질의 부분 펩티드 서열은 도 1에 도시되어, GaAs에 노출된 펩티드 중에서 유사한 결합 도메인을 보여준다. GaAs 표면에 대한 노출 횟수가 증가할수록, 비하전된 극성 및 루이스-염기 관능기의 수가 증가된다. 제3, 4 및 5회 시퀀싱으로부터의 파지 클론은 각각 평균 30%, 40% 및 44%의 극성 관능기를 포함했지만, 루이스-염기 관능기의 분율은 동시에 41%에서 48%로, 55%로 증가했다. 본 라이브러리로부터의 무작위 12-mer 펩티드에서 단 34%의 관능기만을 구성해야 하는 루이스 염기가 증가한 것은, 펩티드 상의 루이스 염기와 GaAs 표면 상의 루이스-산 위치 간의 상호 작용이 상기 펩티드가 나타내는 선택적 결합을 매개할 수 있음을 시사한다.
라이브러리로부터 선택된 개질된 12-mer의 예상 구조는 작은 펩티드에 적당할 것 같은 신장된 입체 구조를 가질 수 있으며, 이는 펩티드가 GaAs의 단위 세포 (5.65 Å)보다 더 길도록 만든다. 따라서, 펩티드가 GaAs 결정을 인식하는 데에는 작은 결합 도메인만 필요할 것이다. 도 1에 강조된 상기 짧은 펩티드 도메인은 아민 루이스 염기, 예를 들어 아스파라긴 및 글루타민의 존재 외에, 세린- 및 트레오닌-풍부 부위를 포함한다. 정확한 결합 서열을 결정하기 위해, 7-mer 및 이황화 제한 7-mer 라이브러리를 포함하는 보다 짧은 라이브러리로 표면을 스크리닝했다. 결합 도메인의 크기 및 가요성을 감소시키는 상기 보다 짧은 라이브러리를 사용하면, 펩티드-표면의 상호 작용이 적어져, 선택 세대 간에 예상되는 상호 작용 강도의 증가를 얻을 수 있다.
M13 외피 단백질에 대한 비오틴화 항체로 파지에 결합된, 스트렙타비딘-표지된 20-nm 콜로이드 금 입자로 태그된 파지는, 특이적인 결합의 정량적 분석에 사용된다. 금 4f-전자 신호의 강도를 통해 파지 기질 상호 작용을 관찰하면서 (도 2a-c), X-레이 광전자 분광법 (XPS) 원소 조성 측정을 수행했다. G1-3 파지의 존재없이, 항체와 금 스트렙타비딘은 GaAs(100)기질에 결합하지 않는다는 것을 XPS로 확인했다. 따라서, 금-스트렙타비딘 결합은 파지 상에 발현된 펩티드에 특이적이고 기질에 대한 파지 결합의 지시자이다. XPS를 사용하여, GaAs(100)에 특이적으로 결합했지만 Si(100)에는 그렇지 않은 GaAs(100)으로부터 단리된 G1-3 서열도 발견했다 (도 2a 참조). 상보적인 방식으로, (100) Si 표면에 대해 스크리닝된 S1 클론은 (100) GaAs 표면에 대해 낮은 결합을 나타냈다.
일부 GaAs 서열은 또한, 다른 섬아연광 구조인 InP (100)의 표면에 결합한다. 선택적 결합의 원리가 화학적, 구조적 또는 전자적인지 여부는 아직 연구 중이다. 또한, 기질 표면 상에 자연 산화물의 존재가 펩티드 결합의 선택성을 변화시킬 수 있다.
G1-3 클론은 GaAs의 (111)A (갈륨 말단) 또는 (111)B (비소 말단)면보다 GaAs(100)에 대해 우선적으로 결합하는 것으로 입증되었다 (도 2b, c). G1-3 클론 표면 농도는, 갈륨-풍부 (111)A 또는 비소-풍부 (111)B 표면 상에서보다 그의 선택에 사용되는 (100) 표면 상에서 더욱 높았다. 상기의 각각 다른 표면은 각각 다른 화학적 반응성을 갖는 것으로 알려져 있고, 여러 가지의 결정면에 대한 파지의 결합에서 선택성의 존재가 입증된 것은 놀라운 점이 아니다. 두 가지의 111 표면 모 두는 부피가 큰 말단에 의해 동일한 기하학적 구조이지만, 표면 재구성을 비교할 때 표면 이중층의 최외측에 Ga 또는 As 원소를 갖는 것 간의 차이는 더욱 명백해진다. 여러 가지 GaAs 표면의 산화물 조성 또한 다를 것으로 예상되고, 이는 펩티드 결합의 특성에 영향을 미칠 수 있다.
G1-3 파지 클론에 노출된 기질로부터의 결합 에너지에 대한 Ga 2p 전자의 강도는 2c에 플롯팅했다. 도 2b의 결과로부터 예상되는 바와 같이, GaAs (100), (111)A 및 (111)B 표면 상에서 관찰된 Ga 2p 강도는 금 농도에 반비례한다. 보다 높은 금-스트렙타비딘 농도를 갖는 표면 상에서 Ga 2p 강도의 감소는, 파지에 의한 표면 덮임의 증가로 인한 것이다. XPS는 약 30 Å의 시료 채취 깊이를 갖는 표면 기술이므로, 유기층의 두께가 증가할수록 무기 기질로부터의 신호가 감소한다. 이러한 관찰은 금-스트렙타비딘의 강도가 실제 GaAs 표면 상에 결정 특이적 결합 서열을 포함하는 파지의 존재 때문임을 확인하는데 사용된다. 결합 연구는 동일한 수의 특이적 파지 클론을 동일한 표면적을 갖는 여러 가지 반도체 기질에 노출시켰을 경우, XPS 데이터와 관련되어 수행된다. 야생형 클론 (무작위 펩티드 삽입이 없음)은 GaAs에 결합하지 않았다 (플라크가 검출되지 않음). G1-3 클론에 대해, 용리된 파지 집단은 GaAs(111)A 표면에서보다 GaAs(100)에서 12배 컸다.
GaAs(100) 및 InP(100)에 결합된 G1-3, G12-3 및 G7-4 클론은 원자력 현미경법 (AFM)으로 영상화했다. In-P 결합은 GaAs 결합보다 높은 이온 특성을 가지고 있지만, InP 결정은 GaAs와 동종 구조인 섬아연광 구조를 갖는다. AFM에서 관찰된 10-nm 너비 및 900-nm 길이의 파지는 투과 전자 현미경법 (TEM)으로 관찰된 M13 파 지의 치수와 일치하고, M13 항체에 결합된 금 구는 파지에 결합된 것으로 관찰되었다 (데이터는 도시하지 않았음). InP 표면은 고농도의 파지를 갖는다. 상기 데이터는 원자 크기, 전하, 극성 및 결정 구조를 포함한 기질 인식에 관련된 다수의 인자들이 존재한다는 것을 시사한다.
G1-3 클론 (음염색된)은 TEM 영상에서 GaAs 결정성 웨이퍼에 결합된 것으로 나타난다 (도시하지는 않음). 데이터는 결합이 주요 외피 단백질과의 비특이적 상호 작용에 의한 것이 아니라, G1-3의 개질된 pIII 단백질에 의해 이루어짐을 확인해 준다. 따라서, 본 발명의 펩티드는 조립되는 나노구조 및 헤테로구조 (도 4)에서 특이적인 펩티드-반도체 상호 작용을 유도하는데 사용될 수 있다.
X-레이 형광 현미경법은 각각 다른 화학적 및 구조적 조성의 표면에 아주 근접한, 파지의 섬아연광 표면에 대한 우선적인 결합을 입증하는데 사용된다. 겹친 사각 패턴은 GaAs 웨이퍼로 에칭되는데, 이 패턴은 1-㎛의 GaAs 선, 및 각 선 사이에 4-㎛의 SiO2 간격을 포함한다 (도 3a, 3b). G12-3 클론은 GaAs/SiO2 패턴화 기질과 상호 작용되고, 비특이적 결합을 감소시키기 위해 세척되어, 면역 형광 탐침, 테트라메틸 로다민 (TMR)으로 태그된다. 태그된 파지는 도 3b에서 3개의 적색선 및 중앙점으로 발견되어, G12-3이 GaAs에만 결합한다는 것과 일치한다. 패턴의 SiO2 부위는 파지에 의해 결합되지 않은 채로 유지되며 어두운 색이다. 이러한 결과는 파지에 노출되지는 않았지만 1차 항체 및 TMR에 노출된 대조군에서는 관찰되지 않는다 (도 3a). 파지가 결합되지 않은 G12-3 펩티드를 사용하여 동일한 결과 를 얻었다.
GaAs 클론 G12-3는 AlGaAs보다 GaAs에 대해 기질-특이적인 것으로 관찰되었다 (도 3c). AlAs 및 GaAs는 실온에서 각각 5.66 Å 및 5.65 Å의 실질적으로 동일한 격자 제한을 가지므로, AlxGal-xAs의 삼원 합금은 GaAs 기질 상에서 에피택셜하게 성장될 수 있다. GaAs 및 AlGaAs는 섬아연광 결정 구조를 갖지만, G12-3 클론은 GaAs에 대해서만 결합 선택성을 갖는다. GaAs 및 Al0.98Ga0.02As의 교대되는 층으로 구성된 다층 기질이 사용된다. 기질 재료는 절단되고, 이어서 G12-3 클론과 반응된다.
G12-3 클론은 20-nm 금-스트렙타비딘 나노 입자로 표지된다. 주사 전자 현미경법 (SEM)에 의한 검사 결과, 헤테로구조 내에 Al0.98Ga0.02As의 교대되는 층이 나타났다 (도 3c). 갈륨 및 알루미늄의 X-레이 원소 분석은 헤테로구조의 GaAs 층에 대해서만 금-스트렙타비딘 입자를 맵핑하는데 사용되고, 화학적 조성에 대한 고도의 결합 특이성을 나타낸다. 도 3d에서, 형광 및 SEM 영상에서 나타난 바와 같이 반도체 헤테로구조에 대한 파지의 식별 모델을 나타냈다 (도 3a-c).
본 발명은 유기 펩티드 서열과 무기 반도체 기질 간의 결합을 동정, 개선 및 증폭하는데 대한 파지-디스플레이 라이브러리의 강력한 용도를 입증해 준다. 이러한 무기 결정의 펩티드 인식 및 특이성은 GaAs, InP 및 Si에 대해 상기 입증되었고, 본원 발명자들에 의해 펩티드 라이브러리를 사용하여 GaN, ZnS, CdS, Fe3O4, Fe2O3, CdSe, ZnSe 및 CaCO3를 포함한 기타 기질로 확장되었다. 두 성분을 인식하는 2가 합성 펩티드 (도 4)는 현재 설계되고 있는 중인데, 이러한 펩티드는 나노 입자를 반도체 구조 상의 특정 위치로 향하게 하는 잠재성이 있다. 상기 유기 및 무기쌍과 잠재적으로 다가인 주형은 새로운 세대의 복합적이고, 복잡한 전자적 구조를 생성하기 위한 강력한 구성 단위를 제공해야 한다.
실시예 I. 펩티드 생성, 단리, 선택 및 특징화
펩티드 선택. 파지 디스플레이 또는 펩티드 라이브러리를 여러 가지 물질, 예를 들어 0.1%의 TWEEN-20을 함유하는 Tris-완충 식염수 (TBS) 중의 반도체 결정과 접촉시켜, 표면 상에서 파지-파지 상호 작용을 감소시켰다. 실온에서 1시간 동안 흔든 다음, 표면을 pH 7.5의 Tris-완충 식염수에 10회 노출시켜 세척했고, 선택 회전이 진행됨에 따라 TWEEN-20의 농도를 0.1%에서 0.5%(v/v)로 증가시켰다. 결합을 파괴하기 위해 10분 동안 글리신-HCl (pH 2.2)을 첨가하여, 표면으로부터 파지를 용리했다. 그 다음, 용리된 파지 용액을 새로운 튜브에 옮기고, Tris-HCl (pH 9.1)로 중화했다. 용리된 파지의 역가를 측정하여 결합 효율을 비교했다.
제3회전의 기질 노출 후 용리된 파지를 그의 대장균 (Escherichia coli) ER2537 또는 ER2738 숙주와 혼합하여, LB XGal/IPTG 플레이트에 플레이팅했다. 라이브러리 파지는 벡터 M13mp19로부터 유래한 것으로 lacZα 유전자를 가지기 때문에, Xgal (5-브로모-4-클로로-3-인도일-β-D-갈락토시드) 및 IPTG (이소프로필-β-D-티오갈락토시드)를 함유하는 배지 상에 플레이팅했을 때 파지 플라크는 청색이었다. 무작위 펩티드 삽입체를 갖는 파지 플라크를 선택하기 위해 청/백 스크리닝을 사용했다. 플라크를 찍어서 상기 플레이트로부터 DNA를 시퀀싱했다.
기질 제조. 기질 배향을 X-레이 회절로 확인했고, 적절한 화학 특이적 에칭으로 자연 산화물을 제거했다. 이하의 에칭을 GaAs 및 InP 표면 상에서 시험했다: 각각 1분 및 10분의 에칭 시간에서 NH4OH:H2O 1:10, HCl:H2O 1:10, H3 PO4:H2O2:H2O 3:1:50. GaAs 및 InP 에칭된 표면에 대해 가장 우수한 원소비 및 최소의 산화물 형성 (XPS를 사용)은, 1분 동안 HCl:H2O를 사용한 다음 탈이온수로 1분 동안 세정하여 달성했다. 그러나, 라이브러리의 초기 스크리닝에서 GaAs에 대해 수산화암모늄 에칭을 사용했기 때문에, 기타 모든 GaAs 기질 실시예에 대해서도 이 에칭을 사용했다. Si(100) 웨이퍼를 1분 동안 HF:H2O 1:40 용액에서 에칭한 다음, 탈이온수로 세정했다. 모든 표면을 세정 용액으로부터 직접 꺼내 즉시 파지 라이브러리로 도입했다. 파지에 노출시키지 않은 대조군 기질의 표면은, AFM 및 XPS로 에칭 방법의 효과 및 표면의 형태에 대해 특징화하고 맵핑했다.
GaAs 및 Al0.98Ga0.02As의 다층 기질을 분자 빔 에피택시로 (100) GaAs 상에서 성장시켰다. 에피택셜하게 성장된 층을 5 x 1017 cm-3 수준에서 Si-도핑 (n-형)했다.
항체 및 금 표지. XPS, SEM 및 AFM 실시예에 대해서, 기질을 Tris-완충 식염수에서 1 h 동안 파지에 노출시킨 다음, 항-fd 박테리오파지-비오틴 콘쥬게이트, fd 파지의 pIII 단백질에 대한 항체, (인산염 완충액 중의 1:500, 시그마)에 30분 동안 도입한 후, 인산염 완충액에서 세정했다. 스트렙타비딘/20-nm 콜로이드 금 표지 (인산염 완충 식염수 중의 1:200 (PBS), 시그마)를 비오틴-스트렙타비딘 상호 작용으로 비오틴-콘쥬게이트된 파지에 결합시키고; 표면을 표지에 30분 동안 노출시킨 다음 PBS로 수 회 세정했다.
X-레이 광전자 분광법 (XPS). XPS에서 나타난 금 신호가 GaAs 표면과의 비특이적 항체 상호 작용이 아니라 파지에 결합된 금으로부터 나타나는 것임을 확실하게 하기 위해, XPS 실시예에 대해 하기 대조군을 제조했다. 제조된 (100) GaAs 표면을 (1) 파지 없이 항체 및 스트렙타비딘-금 표지에, (2) 파지 없이 G1-3 파지 및 스트렙타비딘-금 표지에, 그리고 (3) G1-3 파지 또는 항체 없이 스트렙타비딘-금 표지에 노출시켰다.
사용된 XPS 기구는 단색광 1,487-eV X-레이를 생성하는 알루미늄 양극이 있는 피지컬 일렉트로닉스 (Physical Electronics) Phi ESCA 5700이었다. 모든 표본은 GaAs 표면의 산화를 제한하기 위해 파지를 금-태그 (상기 기술한 바와 같이)한 후 즉시 챔버에 도입했고, XPS 챔버 내에서 표본의 탈기를 줄이기 위해 고진공에서 밤새 펌핑했다.
원자력 현미경법 (AFM). 사용된 AFM은 G 스캐너로 팁 스캐닝 방식에 의해 작동하는, 자이스 액시오버트 (Zeiss Axiovert) 100s-2tv 상에 장착된 디지탈 인스트루먼츠 바이오스코프 (Digital Instruments Bioscope)였다. 태핑 방식으로 공기 중에서 영상을 제작했다. AFM 탐침은 그의 공명 주파수 200±400 kHz 근처로 구동 된 125-mm의 캔틸레버 및 20±100 Nm-1의 스프링 상수를 갖는 에칭된 규소였다. 스캐닝 속도는 대략 1±5 mms-1였다. 샘플의 기울기를 없애기 위해, 1차원 평면으로 영상을 보정했다.
투과 전자 현미경법 (TEM). 필립스 (Philips) EM208로 60 kV에서 TEM 영상을 제작했다. G1-3 파지 (TBS에서 1:100으로 희석됨)를 GaAs 단편 (500 mm)과 30분 동안 인큐베이션하여, 원심분리로 결합하지 않은 파지로부터 입자를 분리하고, TBS로 세정하여 TBS에 재현탁했다. 표본을 2%의 우라닐 아세테이트로 염색했다.
주사 전자 현미경법 (SEM). G12-3 파지 (TBS에서 1:100으로 희석)를 새로 절단된 헤테로-구조 표면과 30분 동안 인큐베이션하고, TBS로 세정했다. G12-3 파지를 20-nm 콜로이드 금으로 태그했다. 히타찌 (Hitachi) 4700 장 방출 주사 전자 현미경 상에 장착된 노리안 (Norian) 검출 시스템으로, 5 kV에서 SEM 및 원소 맵핑 영상을 수집했다.
실시예 II. 입자 및 배향 특이적 펩티드의 선택
반도체 나노결정은 크기 및 형상-의존성 광학적 및 전기적 특성을 가지므로 다양한 장치, 예를 들어 발광 다이오드 (LED), 단일 전자 트랜지스터, 광전지, 광학 및 자기 기억 장치, 진단 마커 및 센서에 응용될 수 있는 잠재성이 있다. 입자 크기, 형상 및 상의 조절은 또한, 보호 코팅 및 안료 (자동차 페인트, 가정용 페인트)에서 중요하다. 상기 광학적 및 전기적 특성을 이용하기 위해, 다른 사항들 중에서도 맞춘 크기 및 형상을 갖는 결정화 반도체 나노결정을 합성할 필요가 있다.
본 발명은 (1) 면 특이성을 가지고 기술적으로 중요한 재료를 인식하여 결합할 수 있고; (2) 크기 제한 결정성 반도체 재료를 응집할 수 있으며; (3) 응집된 나노 입자의 결정상을 조절할 수 있고; (4) 나노결정의 종횡비 및 예를 들어, 그의 광학적 특성을 조절할 수 있는 펩티드의 선택 및 사용을 위한 조성물 및 방법을 포함한다.
본 실시예에서 사용된 재료는 예를 들어, 황화아연, 황화카드뮴, 카드뮴 셀레늄 및 아연 셀레늄과 같은 재료를 포함하는 II-VI족 반도체였다. 크기 및 결정 대조군은 또한, 코발트, 망간, 산화철, 황화철 및 황화납, 및 기타 광학 및 자기 재료를 사용할 수 있다. 당업자들은 본 발명을 사용하여 복합적인 전자적 장치, 광전자 장치, 예를 들어 발광 디스플레이, 광학적 검출기 및 레이저, 패스트 인터커넥트, 파장-선택적 스위치, 나노규모 컴퓨터 부품, 포유류 이식물, 및 환경과 현장 진단 기구의 완전히 새로운 제조 방법에 대한 기초가 되는 무기-생물학적 재료 구성 단위를 제조할 수 있다.
도 4-8은 예를 들어, 반도체 재료에 결합할 수 있는 펩티드를 발현하는 파지 디스플레이 라이브러리를 사용한 펩티드의 발현을 나타낸다. 분자 생물학의 당업자는 단백질 표면 상에 적절한 방식으로 짧거나 혹은 심지어 긴 펩티드 서열을 "디스플레이"하는데 기타 발현 시스템이 사용될 수 있음을 인식할 수 있을 것이다. 파지 디스플레이는 본원에서 실시예로서 사용될 수 있다. 파지-디스플레이 라이브러리는 7 내지 12개의 아미노산을 포함하는 무작위 펩티드의 조합 라이브러리이다. 펩티드는 예를 들어, M13 콜리파지의 pIII 외피 단백질에 융합되거나, 또는 그와 키메라를 형성할 수 있다. 파지는 결정성 반도체 구조와 반응한 각각 다른 펩티드를 제공했다. M13 pIII 외피 단백질은, pIII 외피 단백질의 5 카피가 입자의 10-16 nm를 차지하면서 파지 입자의 한 말단 상에 위치하기 때문에 유용하다. 파지-디스플레이 접근법은 펩티드 기질 상호 작용과 그 상호 작용을 코드하는 DNA 간에 물리적 결합을 제공했다. 시험한 반도체 재료는 ZnS, CdS, CdSe 및 ZnSe를 포함한다.
특이적 결합 특성을 갖는 펩티드를 수득하기 위해, 특정 결정에 성공적으로 결합한 단백질 서열을 표면으로부터 용리하고, 예를 들어 백만 배로 증폭하여, 더욱 엄격한 조건하에서 기질에 대해 반응시켰다. 라이브러리에서 가장 특이적으로 결합하는 파지를 선택하기 위해, 상기 방법을 5회 반복했다. 예를 들어 제3, 제4 및 제5회전의 파지 선택 후, 결정-특이적 파지를 단리하고 표면 결합의 원인이 되는 펩티드 모티프를 판독하기 위해 DNA를 시퀀싱했다.
본 발명의 한 실시예에서, 2개의 각각 다른 펩티드가 2개의 각각 다른 양자 도트 상 (phase)을 응집하는 것으로 밝혀졌다. 선형 12-mer 펩티드, Z8은 3-4 nm 입자의 황화아연 입방체 상을 성장시키는 것으로 나타났다. 7-mer 이황화 제한 펩티드, A7은 육각형 상의 ZnS 나노 입자를 성장시킨 것으로 단리되었다. 또한, 상기 펩티드는 성장한 나노 입자의 종횡비 (형상)에 영향을 미쳤다. A7 펩티드는 파지의 p3에 여전히 결합되어 있거나 또는 금 상에 단층으로 결합되어 있는 동안에도 상기 "활성"을 가지고 있었다. 또한, 파지/반도체 나노입자 나노와이어는, 바이러스 외피 상의 p8 단백질에 대한 A7 융합으로 성장했다. 파지 외피 상에 성장한 나 노 입자는 ZnS 입자의 완벽한 결정 정렬을 나타냈다.
펩티드는 나노입자 크기, 형태 및 종횡비를 조절한다. 형상-조절 아미노산 서열을 디스플레이하는 파지는 ZnS, CdS, ZnSe 및 CdSe 결정에 특이적으로 결합하는 것으로 단리, 특징화 및 선택했다. 상기 펩티드의 결합 친화도 및 식별력을 시험하고, 그 결과에 기초해 펩티드는 보다 고도의 친화도 결합을 위해 처리될 것이다. 시험을 수행하기 위해, 파지 라이브러리를 mm-크기의 다결정성 ZnS 단편에 대해 스크리닝했다. 결합 클론을 시퀀싱하고 제3, 제4 및 제5회전의 선택 후 증폭했다. 서열을 분석하고, ZnS에 결합하여 펩티드가 ZnS 나노 입자를 응집하는 능력에 대해 클론을 시험했다.
수성 조건 중의 실온에서 ZnS 입자 크기 및 단분산성을 조절하기 위한 시도로서, Z8, A7 및 Z10 클론으로 나타낸 클론들을 ZnS 합성 실험에 첨가했다. ZnS-특이적 클론을 밀리몰 농도의 ZnCl2 용액 중의 Zn+2 이온과 상호 작용시켰다. 파지에 결합된 ZnS-특이적 펩티드는 캡핑 리간드로서 기능하여, 파지-ZnCl2 용액에 Na2S를 첨가할 경우 결정성 입자 크기를 조절했다.
밀리몰 농도의 Na2S를 도입할 때, 결정성 재료는 현탁액으로 존재하는 것으로 관찰되었다. 현탁액을 투과 전자 현미경법 (TEM) 및 전자 회절 (ED)을 사용하여, 입자 크기 및 결정 구조에 대해 분석했다. TEM 및 ED 데이터에 의하면, 파지 클론에 결합된 ZnS-특이적 펩티드를 첨가하면 형성되는 ZnS 결정의 입자 크기에 영향을 미치는 것으로 나타났다.
ZnS의 존재하에 성장한 결정은 약 5 nm의 크기이고 분리된 입자인 것으로 관찰되었다. ZnS 파지 클론 없이 성장한 결정은 훨씬 큰 (>100 nm) 크기 범위를 나타냈다.
ZnS 특이적 클론의 결합 도메인 (아미노에서 카르복시 말단으로 기재함).
A7 Asn Asn Pro Met His Gln Asn Cys (서열 번호 232)
Z8 Val Ile Ser Asn His Ala Glu Ser Ser Arg Arg Leu (서열 번호 72)
Z10 Ser Gly Pro Ala His Gly Met Phe Ala Arg Pro Leu (서열 번호 233)

CdS 특이적 클론의 결합 도메인 (아미노에서 카르복시 말단으로 기재함).
E1: Cys His Ala Ser Asn Arg Leu Ser Cys (서열 번호 12)
E14: Gly Thr Phe Thr Pro Arg Pro Thr Pro Ile Tyr Pro (서열 번호 14)
E15: Gln Met Ser Glu Asn Leu Thr Ser Gln Ile Glu Ser (서열 번호 15)
JCW-96: Ser Pro Gly Asp Ser Leu Lys Lys Leu Ala Ala Ser (서열 번호 28)
JCW-106: Ser Leu Thr Pro Leu Thr Thr Ser His Leu Arg Ser (서열 번호:30)
JCW-137: Ser Leu Thr Pro Leu Thr Thr Ser His Leu Arg Ser (서열 번호:30)
JCW-182: Cys Thr Tyr Ser Arg Leu His Leu Cys (서열 번호 234)
JCW-201: Cys Arg Pro Tyr Asn Ile His Gln Cys (서열 번호 235)
JCW-205: Cys Pro Phe Lys Thr Ala Phe Pro Cys (서열 번호 236)

파지 생성 동안 발현된 펩티드 삽입체 구조, 예를 들어 이황화 결합을 갖는 12-mer 선형 및 7-mer 제한 라이브러리를 사용하여 유사한 결과를 얻었다.
7개 아미노산의 제한 루프 라이브러리에 비해 12개 아미노산의 선형 라이브러리를 사용하여 ZnS에 대해 선택된 펩티드는, ZnS의 결정 구조 및 ZnS 나노결정의 종횡비 모두에 현저한 영향을 미쳤다.
ZnS에 대해 선택된 12 mer 선형 펩티드를 디스플레이하는 파지의 존재하에 성장한 나노 입자의 고해상도 격자 영상에서, 결정은 입방체 (섬아연광) 형태의 ZnS의 3-4 nm 구 (종횡비 1:1)로 성장한 것으로 나타났다. 이와 반대로, ZnS에 결합하는 것으로 선택된 7 mer 제한 펩티드는, 육각형 (부르자이트 (wurzite)) 형태의 ZnS의 타원형 입자 및 와이어 (종횡비 2:1 및 종횡비 8:1)로 성장했다. 따라서, 나노결정 특성은 펩티드의 길이 및 서열을 조절함으로써 조작할 수 있다. 또한, 결정의 전자 회절 패턴에서 각각 다른 클론의 펩티드가 2가지의 각각 다른 ZnS 결정 구조를 안정화시킬 수 있는 것으로 나타났다. Z8 12 mer 펩티드는 섬아연광 구조를 안정화시켰고, A7 7 mer 제한 펩티드는 부르자이트 구조를 안정화시켰다.
도 10은 제3, 제4 및 제5회전의 선택 후 ZnS 펩티드에 대한 서열 진화를 나타낸다. 7 mer 제한 라이브러리로의 펩티드 선택에 대해, 가장 우수한 결합 펩티드 서열은 제5회전의 선택에서 얻었다. 이 서열을 A7로 명명했다. 제5회전의 선택 후 단리된 클론의 약 30%가 A7 서열을 가지고 있었다. 위치 번호 7에서 ASN/GLN은 제3회전의 선택으로부터 중요해지기 시작하는 것으로 밝혀졌다. 제4회전의 선택에서, ASN/GLN은 또한 위치 번호 1 및 2에서 중요하게 되었다. 이러한 중요성은 5회전에서 증가했다. 3, 4 및 5회전까지 전부 위치 2에서는 양전하가 중요하게 되었다. 도 11은 본 발명에 따른 제5회전의 선택 후 아미노산 치환을 나타낸다.
결합 친화도의 변화를 시험하기 위해, A7 서열에서 위치-지정 돌연변이 유발을 수행했다. 시험한 돌연변이는, 위치 3: his ala; 위치 4: met ala; 위치 2: gln ala; 및 위치 6: asn ala를 포함한다. 상기 변화들은 동시에, 개별적으로 또 는 조합으로 펩티드에 이루어질 수 있다.
따라서, ZnS 결합에 대해 정의된 아미노산 서열 모티프는 아미드-아미드-Xaa-Xaa-양성-아미드-아미드 또는 ASN/GLN - ASN/GLN - PRO - MET - HIS - ASN/GLN - ASN/GLN (서열 번호:237)였다 (아미노에서 카르복시 말단으로 기재함).
결합 연구를 통해 ZnS에 대해 단리된 클론은, 외래 클론 및 외래 기질에 비해 ZnS, 그들이 성장된 기질에 대해 우선적으로 상호 작용하는 것으로 나타났다.
각각 다른 클론의 각각 다른 기질, 예를 들어 FeS, Si, CdS 및 ZnS와의 상호 작용 결과, ZnS에 대한 결합 연구를 통해 단리된 클론은 그들이 성장된 ZnS에 대해 우선적으로 상호 작용하는 것으로 나타났다. 간단히 말해서, 세척 및 감염 후 파지 역가를 계산하고 비교했다. Z8 및 Z10에 대해, ZnS를 제외한 임의의 기질에 대해서는 역가 수가 분명하지 않았다. 펩티드 삽입체가 없는 야생형 클론을, 엔지니어링된 삽입체가 실제 관심 대상인 상호 작용을 매개했는지를 증명하기 위해 대조군으로서 사용했다. 펩티드가 없으면, 0의 역가 수로 증명되는 바와 같이 특이적 결합이 일어나지 않았다.
상기 사용한 방법과 동일한 결합 방법을 사용하여, 여러 가지의 각각 다른 ZnS 클론을 서로 비교했다. 동일한 농도에서 각각 다른 펩티드 삽입체를 갖는 클론을, 유사한 크기의 ZnS 조각과 1시간 동안 상호 작용시켰다. 기질-파지 복합체를 반복해서 세척하고, pH를 변화시켜 결합된 파지를 용리했다. 용리액을 박테리아에 감염시키고, 밤새 배양한 후 플라크를 계산했다. Z8이 선택된 12 mer 선형 펩티드의 ZnS에 대해 가장 큰 친화도를 나타냈다. 야생형은 ZnS 결정에 결합하지 않았다. Z8, Z10 및 야생형 펩티드는 Si, FeS 또는 CdS 결정에 결합하지 않았다.
펩티드 관능화 표면 상에서 나노결정의 합성 및 조립을 측정했다. A7 펩티드를 ZnS 구조 조절 능력에 대해 단독으로 시험했다. 파지에 결합된 경우 ZnS 결정을 특이적으로 선택하고 성장시키는 A7 펩티드를, 용액으로부터 ZnS 나노결정을 형성시킬 수 있는 금 기질 상의 관능화 표면의 형태로 적용했다. 자가 조립된 단층의 제조에 사용한 방법을 관능화 표면의 제조에 사용했다.
ZnS 나노결정의 형성에 있어서 A7의 능력 및 선택성을 결정하기 위해, 금 기질 상에서 각각 다른 표면 화학적 성질을 갖는 각각 다른 종류의 표면을 ZnS 전구물질 용액과 접촉시켰다. ZnCl2 및 Na2S를 ZnS 전구물질 용액으로서 사용했다. CdCl2 및 Na2S의 CdS 전구물질 용액을 CdS원으로 사용했다. 네 표면 상에서 형성된 결정은 SEM/EDS 및 TEM 관찰로 특징화했다.
대조군 표면 1은 블랭크 금 기질로 구성되었다. ZnS 용액 또는 CdS 용액 중에서 70 h 동안 유지시킨 후, 결정 형성은 관찰되지 않았다. 대조군 표면 2는 금 기질 상에서 2-머캅토에틸아민 자가 조립된 단층으로 구성되었다. 이 표면은 ZnS 및 CdS 나노결정 형성을 유도할 수 없었다. 일부 위치에서는, ZnS 침전물이 관찰되었다. CdS 시스템에 대해서는, 드문드문 분포된 2 미크론의 CdS 결정이 관찰되었다. Cd+2 및 S-2 모두의 농도가 1 X 10-3 M일 때, 상기 결정의 침전이 일어난다.
시험한 3번째 표면은 A7-단독 관능화 금 표면이었다. 상기 표면은 5 nm의 ZnS 나노결정을 형성할 수 있지만, CdS 나노결정을 형성할 수는 없었다.
시험한 4번째 표면은 A7 펩티드 용액 중에서 대조군 표면 2를 유지시켜 제조된 A7-아민 관능화 금 표면이었다. 상기 표면 상에서 형성된 ZnS 결정은 5 nm였고, CdS 결정은 1-3 ㎛였다. CdS 결정은 또한, 아민-단독 표면 상에서 형성될 수 있었다.
4개의 표면에 대한 결과에 의하면, A7 펩티드는 그것이 선택된 ZnS 나노결정을 형성시킬 수 있지만, CdS 나노결정을 형성시킬 수는 없었다. 또한, CdS에 대해 선택된 펩티드는 CdS 나노 입자를 응집할 수 있었다.
반도체 재료를 특이적으로 응집할 수 있는 펩티드는, M13의 p8 주요 외피 단백질 상에서 발현되었다. p8 단백질은 고도로 배향된 결정성 단백질 외피로 자가 조립하는 것으로 알려져 있다. 만일 펩티드 삽입체가 높은 카피수로 발현될 수 있다면, p8 단백질의 결정성 구조가 펩티드 삽입체로 이전될 수 있을 것이라는 것이 가설이다. 또한, 만일 소정의 펩티드 삽입체가 p8 외피에 대해 결정 배향을 유지한다면 상기 펩티드 삽입체로부터 응집된 결정은 결정학적으로 관련된 나노결정으로 성장할 것으로 예측된다. 이러한 예측을 고해상도 TEM으로 시험하고 확인했다.
도 12는 나노와이어를 형성하는데 사용된 p8 및 p3 삽입체의 개략도를 나타낸다. ZnS 나노와이어는 M13 파지의 p8 단백질 외피를 따라 A7 펩티드 융합으로부터 ZnS 나노 입자의 응집으로 형성된다. ZnS 나노 입자는 파지의 표면을 코팅했다. p8 단백질 내에 A7 펩티드 삽입체를 갖는 M13 파지의 외피 상에 응집된 ZnS의 HR TEM 영상은, 파지의 외피 상에 응집된 나노결정이 완전하게 배향되었음을 보여준다. 파지 외피가 p8-A7 융합 외피 단백질 및 야생형 p8 단백질의 혼합물인지의 여부는 명확하지 않다. Z8 펩티드 삽입체에 대해서도 유사한 실험을 수행하였고, ZnS 결정 또한 파지를 따라 응집되었지만 서로에 대해 배향되지는 않았다.
결과를 영상화하기 위해 원자력 현미경법 (AFM)을 사용하였는데, 이는 p8-A7 자가 조립 결정이 A7 펩티드 서열의 위치에서 키메릭 단백질의 융기를 따라 나노와이어를 생성하면서 파지의 표면을 코팅함을 보여준다 (데이터는 도시하지 않음). 나노와이어는 M13의 외피를 따라 p8-A7의 융합 위치에서 ZnS 나노 입자의 응집으로 형성되었다.
p8 단백질에 A7 펩티드 삽입체를 갖는 M13 파지 외피 상의 ZnS 나노결정 응집을 고해상도 TEM으로 확인했다. 일부 야생형 p8 단백질이 p8-A7 융합 외피 단백질과 혼합되어 발견되었지만, 결정 응집은 달성되었다. 파지 외피 상에 응집된 나노결정은, 격자 영상화에서 증명되는 바와 같이 (데이터는 도시하지 않음) 완전히 배향되었다. 데이터는 펩티드가 배향이 완전히 보존되면서 주요 외피 단백질에 디스플레이될 수 있고, 상기 배향된 펩티드는 배향된 단분산 ZnS 반도체 나노 입자를 응집할 수 있음을 증명해 준다.
누적적인 데이터는 일부 펩티드가 배향이 완전하게 보존되면서 주요 외피 단백질에 디스플레이될 수 있고, 상기 펩티드는 배향된 ZnS 반도체 나노 입자를 응집할 수 있음을 보여주었다.
펩티드 선택. 파지 디스플레이 또는 펩티드 라이브러리를, 0.1% TWEEN-20을 함유하는 Tris-완충 식염수 (TBS) 중에서 반도체 또는 기타 결정과 접촉시켜, 표면 상의 파지-파지 상호 작용을 감소시켰다. 실온에서 1시간 동안 흔든 후, 표면을 Tris-완충 식염수, pH 7.5에 10회 노출시켜 세척했고, 선택 회전이 진행됨에 따라 TWEEN-20 농도를 0.1% 에서 0.5%(v/v)로 증가시켰다. 결합을 파괴하기 위해 10분 동안 글리신-HCl (pH 2.2)을 첨가하여, 파지 디스플레이를 표면으로부터 용리했다. 용리한 파지 용액을 새로운 튜브로 옮긴 다음, Tris-HCl (pH 9.1)로 중화했다. 용리한 파지의 역가를 측정하여 결합 효율을 비교했다.
제3회전의 기질 노출 후 용리한 파지를 그의 대장균 (Escherichia coli) ER2537 또는 ER2738 숙주와 혼합하여, 루리아-버타니 (Luria-Bertani, LB) XGal/IPTG 플레이트에 플레이팅했다. 라이브러리 파지는 벡터 M13mp19로부터 유래한 것으로 lacZα 유전자를 가지기 때문에, Xgal (5-브로모-4-클로로-3-인도일-β-D-갈락토시드) 및 IPTG (이소프로필-β-D-티오갈락토시드)를 함유하는 배지 상에 플레이팅했을 때 파지 플라크 또는 감염된 경우에는 청색이었다. 무작위 펩티드 삽입체를 갖는 파지 플라크를 선택하기 위해 청/백 스크리닝을 사용했다. 상기 플라크로부터 DNA를 단리하고 시퀀싱했다.
원자력 현미경법 (AFM). 사용된 AFM은 태핑 방식으로 작동하는 자이스 액시오버트 100s-2tv 상에 장착된 디지탈 인스트루먼츠 바이오스코프였다. 태핑 방식으로 공기 중에서 영상을 제작했다. AFM 탐침은 그의 공명 주파수 200±400 kHz 근처로 구동된 125-mm의 캔틸레버 및 20±100 Nm-1의 스프링 상수를 갖는 에칭된 규소였다. 스캐닝 속도는 대략 1±5 mms-1였다. 샘플의 기울기를 없애기 위해, 1차원 평면으로 영상을 보정했다.
투과 전자 현미경법 (TEM). 제올 (JEOL) 2010 및 제올200CX 투과 전자 현미경으로 TEM 영상을 제작했다. 사용된 TEM 격자는 금 상의 탄소였다. 착색제는 사용하지 않았다. 표본을 성장시킨 다음 반응 혼합물을 분자량 차단 필터 상에서 농축하고, 멸균수로 4회 세척하여 임의의 과량 이온 또는 파지에 결합되지 않은 입자를 제거했다. 20-50 ㎕로 농축한 후, 표본을 TEM 또는 AFM 시편 격자 상에 건조시켰다.
실시예 III. 원소 탄소-함유 분자에 대해 친화성을 갖는 생물학적 재료
본 실시예에서, 탄소 플랜체트, 고도로 규칙화된 열분해 흑연 (HOPG) 및 단일벽 나노튜브 (SWNT) 페이스트에 대해 친화성을 갖는 7- 및 12-mer 펩티드 서열을 파지 디스플레이로 결정했다. 바이오팬닝 (biopanning)으로부터 선택된 파지 클론 중에서, 클론 그래프5-01 (N'-WWSWHPW-C')(서열 번호 238) 및 그래프53-01 (N'-HWSWWHP-C')(서열 번호 239)은 파지 결합 연구에서 탄소 플랜체트에 가장 효율적으로 결합하였다. 클론 Hipco12R44-01 (N'-DMPRTTMSPPPR-C')(서열 번호 196)은 SWNT 페이스트에 가장 잘 결합했다.
상기 파지가 상응하는 기질에 결합하는 상대적인 능력은, 파지를 플루오레신-표지된 항-M13 파지 항체로 표지하고, 이를 다중초점 현미경법으로 그의 기질 상에서 시각화함으로써 증명했다. 다중초점 현미경법은 또한, 상기 기질-특이적 서열을 포함하는 형광-표지된 합성 펩티드에 대한 기질의 결합을 시각화하는데 사용되었다. 클론 그래프5-01은 AFM으로 측정된 바와 같이, HOPG에 대해 일부 교차 반응성을 나타냈다. 또 다른 방법의 예는 이하 서술한다.
바이오팬닝. 탄소 플랜체트 (테드 펠라 사 (Ted Pella, Inc.)로부터 입수, 직경 약 12.7 mm x 두께 1.6 mm의 크기; 약 5 x 2 x 1.6 mm의 단편) 및 고도로 규칙화된 열분해 흑연 (HOPG) (오스틴, 텍사스 대학으로부터 입수)을, 바이오팬닝의 흑연원으로 사용했다. SWNT 페이스트를 시가형의 응집물로 성형하고 (약 0.1 습식g 이상), 바이오팬닝에 사용하기 전에 약 하룻밤 이상 건조시켰다 (최종 건조 질량은 약 0.05 g). PhD-C7C 및 PhD-12mer 라이브러리는 뉴 잉글랜드 바이오랩스 사 (New England Biolabs, Inc., 메사추세츠주 베버리 소재)로부터 입수했고, 바이오팬닝은 제조업자의 지시서에 따라 실시했다. 각각의 기질에 대한 바이오팬닝을 1회 이상 반복했다.
파지 클론 명명법. 탄소 플랜체트에 대해 선택된 파지 클론의 명칭은, "그래프"로 시작한다. SWNT 페이스트에 대해 선택된 파지 클론은 "Hipco"로 시작한다. HOPG에 대해 선택된 파지 클론은 "HOPG"로 시작한다. 12-mer 삽입체를 갖는 선택된 클론은 (기질)12R(회전#)(회전 반복#)-(서열 번호)로 명명한 반면, 제한 7-mer 삽입체를 갖는 클론은 (기질)(회전#)(회전 반복#)-(서열 번호)로 명명했다.
펩티드. 비오틴 결합 펩티드 Hipco2B (N'-DMPRTTMSPPPRGGGK-C'-비오틴)(서열 번호 244)는, 진메드 신테시스 사 (Genemed Synthesis, Inc., 캘리포니아주 샌프란시스코 소재)가 합성했다. 비오틴 결합 펩티드 흑연1B (N'-ACWWSWHPWCGGGK-C'-비오틴)(서열 번호 240), JH127B (N'-ACDSPHRHSCGGGK-C'-비오틴)(서열 번호 241), 및 JH127MixB (N'-ACPRSSHDHCGGGK-C'-비오틴)(서열 번호 242)는 ICMB 프로테인 마이크로어낼리시스 퍼실리티 (Protein Microanalysis Facility, 오스틴, 텍사 스 대학)가 합성했으며, 역상 HPLC (하이포어 (HiPore) RP318 250 x 1O mm 컬럼, 바이오래드 (BioRad, 캘리포니아주 허큘레스), 아세토니트릴 구배)로 정제했다. 흑연1B 펩티드의 시스테인 간의 이황화 결합 형성은 화학 분야에 공지된 방법에 따라 요오드 산화로 수행했고, 고리화된 흑연1B 펩티드를 얻었다. 펩티드의 순도 및 분자 질량은, 전자분무 이온화 질량 분광측정법 (에스콰이어 (Esquire)-LC00113, 브루커 달토닉스 사 (Bruker Daltonics, Inc.), 메사추세츠주 빌레리카 소재)을 사용하여 측정했다.
파지 결합 연구. 건조시킨 편평, 정사각형의 SWNT 페이스트 응집물 (약 0.05 습식g 및 0.0025 건조g 이상) 및 약 0.04 g의 탄소 플랜체트 단편을 결합 연구에 사용했다. 사용하기 전에 2회 이상 파지 클론을 증폭하고, 역가를 측정했다 (파지 라이브러리 제조업자의 지시서에 따라). 동량 (약 5x1010 pfu 이상)의 각 파지 클론을 별도로, 미세 원심분리 튜브에서 흔들면서 실온에서 1시간 동안 1 ml의 TBS-T [50 mM Tris, 150 mM NaCl, pH 7.5, 0.1% Tween-20] 중에서, SWNT/탄소 플랜체트 (예를 들어, 응집물로서)와 인큐베이션했다. 그 다음, 응집물 표면을 TBS-T (1회 세척 당 1 ml)로 9-10회 세척하고, 0.2 M의 글리신 HCl (pH 2.2) 0.5 ml에 8분 동안 노출시켜 표면으로부터 파지를 용리했다. 용리된 파지를 즉시 새로운 튜브로 옮기고, 1 M의 Tris HCl (pH 9.1) 0.15 ml로 중화한 다음, 역가를 2회 측정했다. 각각의 결합 실험을 2회 수행했다. 본 발명의 하나의 실시태양에서, 동일한 응집물 (원래 실험에서 사용된 것)을 사용한 SWNT 응집물의 반복 결합 연구는 1시 간 동안 100% 에탄올 1 ml로의 초기 세척, 및 그 다음 1 ml의 물로의 2회 세척을 포함했다.
다중초점 현미경법. 파지 클론을 사용 전에 2회 이상 증폭하고 역가를 측정했다 (파지 라이브러리 제조업자의 지시서에 따라). 동량 (5 x 109 pfu)의 각 파지 클론을 별도로, 미세 원심분리 튜브에서 가끔식 진탕하면서 1시간 동안 0.2-0.3 ml의 TBS-T 중에서, 탄소 플랜체트 단편 또는 소량의 습윤 SWNT 페이스트와 인큐베이션했다. 그 다음, 탄소 플랜체트/SWNT 응집물(들)을 TBS-T (1회 세척 당 1 ml)로 2회 세척하고, 0.2-0.3 ml의 비오틴 결합 쥐 모노클로날 항-M13 항체 (TBS-T 중에 1:100으로 희석, 엑살파 바이올로지칼즈 사 (Exalpha Biologicals, Inc.), 메사추세츠주 보스턴 소재)와 45분 동안 인큐베이션했다. 응집물을 TBS-T (1회 세척 당 1 ml)로 2회 세척하고, 0.2-0.3 ml의 스트렙타비딘-플루오레신 (TBS-T 중에 1:100으로 희석, 아머샴 파마시아 바이오테크 (Amersham Pharmacia Biotech, 스웨덴 웁살라 소재)로부터 입수)과 10분 동안 인큐베이션한 다음, TBS-T (1회 세척 당 1 ml)로 2회 세척했다. 그리고, 과량의 액체를 응집물로부터 제거했다. SWNT 페이스트를 겔/마운트 (바이오메디아 사 (Biomedia Corp.), 캘리포니아주 포스터 시티 소재)에 재현탁하여 유리 슬라이드 상에 놓고, 1번 커버슬립으로 덮었다. 탄소 플랜체트를 진공 그리스와 함께 유리 슬라이드 상에 놓고, 겔/마운트로 덮어 커버슬립으로 덮었다. SWNT 페이스트 표본에 대해서는, 각 표지 및 세척 단계를 위해 원심분리가 필요했다.
펩티드 (약 1 mg/ml 이상)를 별도로, 미세 원심분리 튜브 중에서 가끔식 진탕하면서 1시간 동안0.15 ml의 TBS-T 중에서, 탄소 플랜체트 단편 또는 소량의 습윤 SWNT 페이스트와 인큐베이션했다. Hipco2B의 원래 10 mg/ml 모액은 55%의 아세토니트릴에서, 고리화 및 비고리화 흑연1B는 45%의 아세토니트릴 중에서 가용성인 것으로 나타났다. TBS-T 중에서 희석될 경우, 상기 펩티드는 백색 침전물을 형성했다. 그 다음, 기질을 TBS-T (1회 세척 당 1 ml)로 2-3회 세척하고, 0.15 ml의 스트렙타비딘-플루오레신 (TBS 중에 1:100으로 희석)과 15분 동안 인큐베이션한 다음, TBS로 2-3회 세척했다 (1회 세척 당 1 ml). 과량의 액체를 기질로부터 제거했다. SWNT 페이스트를 겔/마운트에 재현탁하여 유리 슬라이드 상에 놓고, 커버슬립으로 덮었다. 탄소 플랜체트를 진공 그리스와 함께 유리 슬라이드 상에 놓고, 겔/마운트로 덮어 커버슬립으로 덮었다. SWNT 페이스트 표본에 대해서는, 각 표지 및 세척 단계를 위해 원심분리가 필요했다.
다중초점 영상은 라이카 (Leica) TCS 4D 다중초점 현미경 (ICMB 코어 퍼실리티 (Core Facility), 오스틴, 텍사스 대학) 상에서 얻었다. 영상을 최대 강도 합성으로서 나타냈다.
AFM. 사용하기 전에 2회 이상 파지 클론을 증폭하고 역가를 측정했다 (파지 라이브러리 제조업자의 지시서에 따라). 동량 (5 x 109 pfu)의 각 파지 클론을 별도로, 35 mm x 10 mm 페트리 접시에서 흔들면서 1시간 동안, TBS 2 ml 중의 새로이 절단된 HOPG 층과 인큐베이션했다. 그 다음, 기질을 미세 원심분리 튜브로 옮기 고, 물로 2회 세척하여 (1회 세척 당 1 ml) 밤새 건조시켰다. 영상은 멀티모드 원자력 현미경 (디지탈 인스트루먼츠, 캘리포니아주 산타 바바라 소재) 상에서 태핑 방식을 사용하여, 공기 중에서 제작했다.
서열의 바이오팬닝. 탄소 플랜체트, HOPG 및 SWNT 페이스트에 대해 특이성을 갖는 클론을 선택하기 위해, 12-mer 및 제한 7-mer 서열이 pIII 외피 단백질에 삽입된 M13 파지 라이브러리를 사용했다.
탄소 플랜체트에 대해. PhD-C7C 라이브러리를 사용하여 탄소 플랜체트에 대해 선택하여, 도 13에 나타난 바와 같이 제4회전에서 펩티드 삽입체 서열 N'-WWSWHPW-C' (서열 번호 238)을 갖는 우성 파지 클론을 얻었다. 선택을 반복하여, 제4회전에서 유사한 우성 서열 N'-HWSWWHP-C' (서열 번호 239) 및 보다 낮은 우성 서열 N'-YFSWWHP-C' (서열 번호 243)을 수득했다. 도 14에 나타난 바와 같이, PhD-12 라이브러리로 선택하여, 제5회전에서 공통 (consensus) 서열 N'-NHRIWESFWPSA-C' (서열 번호 172)을 수득했고, 선택을 반복하여 제6회전에서 서열 N'-VSRHQSWHPHDL-C' (서열 번호 179) 및 N'-YWPSKHWWWLAP-C' (서열 번호 180)을 수득했다. 상기 서열은 방향족 잔기가 풍부했고, 공통적으로 S, W, H 및 P 잔기를 포함했다. 본 발명의 하나의 실시태양에서, PhD-12 라이브러리에 의한 선택의 5회전에서 N'-SHPWNAQRELSV-C' (서열 번호 178)이 관찰되었지만, 이는 SWNT 페이스트에 대한 바이오팬닝으로부터 유래한 오염 서열이었으며, 후속 회전에서는 사라졌다.
SWNT 페이스트에 대해. SWNT 페이스트에 대한 PhD-C7C 라이브러리의 바이오 팬닝은, "야생형" 파지 클론 (pIII에 펩티드 삽입체를 포함하지 않는)에 의해 선택된 파지가 우세함으로 인해 성공적이지 못했다. 도 15에 나타난 바와 같이, PhD-12 라이브러리에 의한 선택의 제4회전에서 공통 서열 N'-SHPWNAQRELSV-C' (서열 번호 178)을 수득했고, 선택 과정을 2 및 3회 반복하여 서열 N'-LLADTTHHRPWT-C' (서열 번호 192), N'-DMPRTTMSPPPR-C' (서열 번호 196) 및 N'-TKNMLSLPVGPG-C' (서열 번호 195)를 수득했다.
HOPG에 대해. PhD-C7C 라이브러리를 사용한 HOPG에 대한 선택은 수행하지 않았지만, 도 16에 나타난 바와 같이 PhD-12 라이브러리로 제5회전에서 우성 서열 N'-TSNPHTRHYYPI-C' (서열 번호 219) 및 보다 낮은 우성 서열 N'-KMDRHDPSPALL-C' (서열 번호 221) 및 N'-SNFTTQMTFYTG-C' (서열 번호 220)를 수득했다. (주의: 서열 N'- LLADTTHHRPWT-C' (서열 번호 192)는 또한 첫번째 선택에서 관찰되었지만, SWNT 페이스트에 대한 바이오팬닝으로부터 오염 서열인 것으로 밝혀졌다.)
바이오팬닝으로부터 수득한 다수의 주요 서열들의 예는, 하기 표 3에 나타냈다.
바이오팬닝으로 수득한 공통 서열의 예 (N'-에서 C'-말단)
라이브러리 탄소 플랜체트 SWNT 페이스트 HOPG
PhD-C7C WWSWHPW (서열 번호 238) 실패 수행하지 않음
HWSWWHP (서열 번호 239)
YFSWWHP (서열 번호 243)
PhD-12 NHRIWESFWPSA (서열 번호 245) SHPWNAQRELSV (서열 번호 178) TSNPHTRHYYPI (서열 번호 219)
VSRHQSWHPHDL (서열 번호 179) LLADTTHHRPWT (서열 번호 192) KMDRHDPSPALL (서열 번호 221)
YWPSKHWWWLAP (서열 번호 180) DMPRTTMSPPPR (서열 번호 196) SNFTTQMTFYTG (서열 번호 220)
TKNMLSLPVGPG (서열 번호 195)

파지 결합 연구. 바이오팬닝으로부터 측정된 각각 다른 파지 클론의 상대적인 결합 효율은, 탄소 플랜체트 단편 및 SWNT 페이스트 응집물을 개별적으로 동 수 (5 x 1010 pfu)의 각 파지 클론에 1시간 동안 노출시키고, TBS-T로 세척한 후 기질 표면에 결합된 각 잔류 클론의 양을 역가 측정함으로써 시험했다. 그 다음, 결합된 파지를 0.2 M의 글리신 HCl, pH 2.2로 기질로부터 용리하고, 역가 측정으로 정량화했다. 상기 실험에서 사용한 클론은 하기 표 4에 열거했다. A7 (제한 7-mer 삽입체) 및 Z8 (12-mer 삽입체) 클론 및 "야생형" 클론을 음성 대조군으로 사용했다.
파지 결합 연구에 사용한 파지 클론의 PIII 삽입체
파지 클론 라이브러리 원 pIII 삽입체 (N'-에서 C'-말단)
Hipco12R4-01 PhD-12 SHPWNAQRELSV (서열 번호 178)
Hipco12R42-01 PhD-12 LLADTTHHRPWT (서열 번호 192)
Hipco12R44-01 PhD-12 DMPRTTMSPPPR (서열 번호 196)
Hipco12R44-03 PhD-12 TKNMLSLPVGPG (서열 번호 195)
그래프5-01 PhD-C7C WWSWHPW (서열 번호 238)
그래프53-01 PhD-C7C HWSWWHP (서열 번호 239)
그래프53-05 PhD-C7C YFSWWHP (서열 번호 243)
그래프12R5-01 PhD-12 NHRIWESFWPSA (서열 번호 245)
그래프12R62-01 PhD-12 VSRHQSWHPHDL (서열 번호 179)
그래프12R62-02 PhD-12 YWPSKHWWWLAP (서열 번호 180)
A7 PhD-C7C NNPHMQN (서열 번호 229)
Z8 PhD-12 VISNHAESSRRL (서열 번호 230)
그래프4-18 PhD-12,-C7C 삽입체가 없음 ("야생형")

도 17 (패널 A 및 B)에 나타난 바와 같이, 파지 클론 Hipco12R44-01은 기타 모든 SWNT- 또는 탄소 플랜체트-특이적 클론보다 높은 수로 SWNT 페이스트에 결합한 반면, 도 18에 나타난 바와 같이 클론 그래프5-O1 및 그래프53-01은 탄소 플랜체트에 가장 높은 효율로 결합했다. 탄소 플랜체트에 대해 선택된 클론에서, SWNT 페이스트에 대go 약간의 교차 반응이 관찰되었다. 또한, SWNT 페이스트에 대해 선택된 클론은 탄소 플랜체트와 교차 반응하지 않았다.
바이오팬닝 방법으로부터 여러 가지의 공통 서열을 수득했지만, 바이오팬닝에 의해 선택된 모든 파지 클론이 효과적인 결합자 (binder)일 수는 없다 (즉, "효과적인"이란, 상기 형태의 결합 또는 친화도 연구에서 측정된 바와 같이, 야생형 클론의 기질에 대한 친화도보다 높은 친화도를 갖는 것을 의미한다). 상기 결합 연구에서 용리 완충액 (0.2 M 글리신 HCl, pH 2.2)으로 기질로부터 모든 결합 파지를 완전히 제거할 수 없다는 점이, 상기 실험의 분석시 오차의 원인이 될 수 있다. 이러한 결과는 또한, 각 기질에 대한 여러 가지 공통 서열의 선택 및 시험의 중요 성을 설명할 수 있다 (즉, 반복된 바이오팬닝으로 보다 우수한 서열을 수득할 수 있다).
다중초점 현미경법에 의한 기질 상의 파지 및 펩티드의 시각화
탄소 플랜체트. 도 19에 나타난 바와 같이, 탄소 플랜체트-특이적 파지 클론 (그래프5-01 파지 및 그래프53-01 파지)의 그의 기질에 대한 결합은, 탄소 플랜체트 단편을 개별적으로 동 수 (5 x 109 pfu)의 각 클론에 1시간 동안 노출시키고, 파지를 비오틴 결합 항-M13 항체로 표지하여, 항체를 스트렙타비딘-플루오레신으로 표지하고, 복합체를 다중초점 현미경법으로 시각화여, 시각화할 수 있다. (모든 영상은 다르게 나타내지 않으면 250 ㎛ x 250 ㎛였다.) 파지 클론 Hipco12R44-01, JH127 (97 ㎛ x 97 ㎛)(산드라 웨일리 (Sandra Whaley)로부터 입수, 제한 pIII 삽입체 N'-DSPHRHS-C'를 가짐)(서열 번호 231), 및 야생형 (그래프4-18, 삽입체가 없음) 클론을 음성 대조군으로 사용했다. 상기 파지 결합 연구 결과와 일관되게, 도 19에서 나타난 바와 같이 탄소 플랜체트는 클론 그래프5-01에 가장 효과적으로, 그리고 그래프53-01에는 그보다 낮은 정도로 결합했다. 기질과 클론 JH127 간에 상당한 정도의 교차 반응성이 관찰되었지만, 탄소 플랜체트와 클론 Hipco12R44-01 또는 야생형 클론 간에는 아주 적은 결합만 관찰되었다.
상기 파지 클론의 pIII 삽입체에 상응하는 서열을 갖는 펩티드에 대한 탄소 플랜체트의 결합은 또한, 다중초점 현미경법으로 시각화했다. 동량 (1 mg/ml)의 고리화 펩티드 흑연1B (클론 그래프5-01에 상응), 비고리화 펩티드 흑연1B, 펩티드 Hipco2B (클론 Hipco12R44-01에 상응), 펩티드 JH127B (클론 JH127에 상응), 및 펩티드 JH127MixB (또한 클론 JH127에 상응하지만, 혼합 아미노산 서열을 가짐)을 개별적으로 탄소 플랜체트 단편에 1시간 동안 노출시킨 다음, 스트렙타비딘-플루오레신으로 표지했다.
도 20에 나타난 바와 같이, 펩티드 없이 인큐베이션한 표본에서는 검출 가능한 양의 배경 형광이 관찰되어, 스트렙타비딘-플루오레신과 기질 간에 비특이적 결합이 일어남을 보여주었다. 실험에서 파지에도 펩티드에도 노출되지 않은 유사한 표본은 도 19에서 배경 형광을 나타내지 않았기 때문에, 상기 결과는 특정 실험에서 세척이 불충분했기 때문일 가능성이 가장 높다. 이러한 배경 형광에도 불구하고, 비고리화 흑연1B에 노출된 표본은 기타 표본보다 고도의 형광을 나타냈다. 반면, 고리화 흑연1B 및 Hipco2B 표본이 나타낸 형광은 배경보다 높지 않아서, 흑연1B의 고리화가 기질 결합을 방해했음을 나타낸다 (250 ㎛ x 250 ㎛ 영상). 기질과 펩티드 JH127B 및 JH127MixB 간에는 약간 높은 정도의 결합이 관찰되었다. 흑연1B, JH127B 및 JH127MixB 펩티드에 공통적인 아미노산 잔기는 S, P 및 H였다. 이후의 탄소 플랜체트에 대한 펩티드 결합을 시각화하는 다중초점 실험은, 형광을 증강시키기 위해 고농도의 펩티드를 사용해야 하고 배경을 감소시키기 위해 보다 우수한 세척 방법을 사용해야만 했다.
SWNT 페이스트. SWNT 페이스트 (Hipco12R44-01)에 가장 높은 친화도로 SWNT 페이스트가 파지 클론에 결합하는 것은 또한, 도 21에 나타난 바와 같이 다중초점 현미경법으로 시각화했다 (영상 250 ㎛ x 250 ㎛). 그래프5-01 및 야생형 ( 그래프4-18, 삽입체가 없음) 클론을 음성 대조군으로 사용했다. Hipco12R44-O1 클론은 고도의 형광을 나타냈지만, 대조군 표본에서도 상당한 형광이 관찰되었다. 파지가 없는 경우 배경 형광이 관찰되지 않아, 그래프5-01 및 야생형 표본에서의 형광은 항체 또는 스트렙타비딘-플루오레신에 의한 비특이적 기질 결합 때문이 아님을 나타냈다. 상기 다중초점 결합 연구는 파지 결합 연구에 사용된 것과 동일한 크기 정도 (1 ml 중의 5 x 1010 pfu = 5 x 1010 pfu/ml)의 파지 농도 (0.2-0.3 ml 중의 5 x 109 pfu = 1.7-2.5 x 1010 pfu/ml)를 사용했지만, 도 17에 나타난 바와 같이 파지 결합 연구에서 그래프5-01 또는 야생형 클론의 SWNT 페이스트에 대한 결합은 상대적으로 낮게 관찰되었다. 상기 두 실험 간에 관찰된 결합의 차이는, SWNT 페이스트 기질을 제조하고 취급하는 방식 때문일 수 있다. 다중초점 실험에 사용된 습윤, 전성 SWNT 페이스트의 원심분리는 기질 내에서 특이적이고 비특이적 파지 모두를 트랩핑할 수 있지만, 파지 결합 연구에서 큰 건조 SWNT 응집물을 사용하여 이를 방지할 수 있었다. 습윤 페이스트는 다중초점 실험에 사용되어 커버슬립 아래에서의 고정을 용이하게 하지만, 그 후의 다중초점 결합 실험은 건조 SWNT 응집물을 사용해야 한다.
상기 사용된 파지 클론의 pIII 삽입체에 상응하는 서열을 갖는 펩티드로 처리한 SWNT 페이스트 표본도 제조했지만, 시각화하지는 않았다.
AFM에 의한 HOPG 상에서 파지의 시각화
탄소 플랜체트 및 SWNT 페이스트 상에서 파지의 결합은, 기질 표면의 조도 때문에 AFM으로 분석할 수 없었다. 대신, HOPG를 사용했고 결과는 도 22에 나타냈다. 파지 클론 그래프5-01 (탄소 플랜체트에 특이적임)은 HOPG에 결합하는 것으로 관찰될 수 있었지만, 야생형 클론은 HOPG 상에서 쉽게 관찰되지 않았다.
본 실시예에서 다중초점 현미경법에 의한 파지 결합 연구 및 탄소 플랜체트에 대한 펩티드 및 파지 결합의 시각화는, 서열 N'-WWSWHPW-C' (서열 번호 238) 및 N'-HWSWWHP-C' (서열 번호 239)이 탄소 플랜체트에 가장 높은 효율로 결합했음을 일관되게 보여주었다. 또한, 파지 결합 연구 결과 파지 클론 Hipco12R44-01 (N'-DMPRTTMSPPPR-C')(서열 번호 196)이 SWNT 페이스트에 가장 효율적으로 결합한 것으로 나타났다.
파지 결합 연구 및 다중초점 실험에서, 탄소 플랜체트-특이적 파지 클론과 SWNT 페이스트 간에는 약간의 교차 반응성이 관찰되었다. 탄소 플랜체트 및 SWNTs에서 나타난 흑연 구조는, 이론적으로 매우 유사했다. 본 연구에 사용된 "원료" 페이스트에서 SWNTs의 벽은, 오염 물질을 포함하고(하거나) 산화로 손상되었을 가능성이 있다. 가능한 오염 물질의 존재로 인한 서열의 제한된 교차 반응 가능성의 가능성을 없애기 위해 (즉, 고특이성), 보다 순수한 나노튜브원을 사용하는 것이 바람직할 수 있다.
실시예 IV. 원소 탄소-함유 분자에 대한 친화도를 갖는 생물학적 재료의 응용
하기 기술한 실시예는 본 발명의 응용에 대한 설명이며, 여기서 서열 번호 1-245를 사용할 수 있었다. 또한, 실시예는 본 발명의 방법 및 조성물을 사용하여 기타 원소 탄소-함유 분자에 적용될 수 있다.
금속과 반도체 CNT 간의 분리.
단일벽 탄소 나노튜브 (SWNT)의 제조에 대한 현재의 합성 방법으로, 금속 및 반도체 SWNTs의 혼합물을 얻었다. 나노규모 전기 장치를 제조하기 위해, 금속성 SWNT와 반도체 SWNT를 분리하는 것이 바람직하다. 금속성 및 반도체 SWNT 간의 미세 형상 및 대칭의 차이는, 파지 디스플레이 또는 유사한 방법을 사용하여 수득한 신속-진화된 단백질로 구별할 수 있다. 파지 디스플레이 결과로부터 선택된 단백질 서열에 기초하여, 금속성 및 반도체 SWNTs의 혼합물을 정제하기 위한 음성 컬럼을 제조할 수 있다. 만일 금속성 및 반도체 SWNTs의 혼합물이 음성 컬럼을 통과하면, 펩티드와 하나의 금속성 또는 반도체 SWNTs 간에 특이적인 상호 작용으로 인해 용리 시간의 차이가 발생한다. 만일 금속성 SWNTs 결합 펩티드를 음성 컬럼에 적용할 경우, 반도체 SWNTs가 금속성 SWNTs보다 빨리 용리된다. 따라서, 하나의 특이적인 SWNT가 분리될 수 있다. SWNTs를 정제하는 음성 컬럼에 대한 개략도는 도 23에 나타냈다.
탄소 나노튜브의 정렬
나노규모의 장치로서 탄소 나노튜브를 사용하는데 있어 가장 큰 문제 중 하나는, 나노튜브를 3차원 배열로 정렬하는 것이다. 화학 증착 (CVD)법은 그 제작으로부터 독특하게 정렬된 구조를 제조할 수 있지만, CVD법은 또한 금속성 및 반도체 SWNTs의 혼합물을 함께 제조할 수 있다. 나노-전기 장치의 제작은 매우 정밀하기 때문에, 혼합물로부터 반도체 SWNTs를 분리하는 것이 바람직하다. 분리는 상기 기술한 방법에 따라 수행할 수 있다. 상기 실시예에서 여러 가지 접근법, 예를 들어 LB-필름법 및 메니스커스력 조절 등을 사용했지만, 이 방법들은 단순 배향으로 정렬된 SWNT 정렬만을 제조했다. 위치적 및 배향적으로 정렬된 SWNT 2D 또는 3D 구조는, SWNTs에 대해 특이적 결합 특성을 갖는 파지가 사용되는 경우 형성되었다. 도 24에 나타난 바와 같이, 파지로 연결된 SWNTs는 펩티드 유닛으로 연결된 2개의 견고한 블록을 갖는 이블록 코폴리머처럼 행동했다. SWNT 연결된 파지 구성 단위는 정렬된 SWNT 구조를 갖는 결과적인 구조와 함께, 미세상-분리된 라멜라 유사 구조를 생성할 것으로 예상된다.
펩티드 결합에 의한 SWNT에서 P-N 접합 SWNT로의 전환
임의의 화학적 개질없이, 반도체 SWNTs는 통상적으로 고유의 p-형 전기적 특성을 가질 수 있다. 전자-공여기에 의한 화학적 개질은, p-형 SWNT를 n-형 SWNT로 전환시킬 수 있다. 통상적으로 별개의 음전하 및 양전하 단백질을 갖는 주기적으로 결합되는 펩티드는, SWNTs의 전자적 특성의 원인이 될 수 있다. 주기적인 양전하 및 음전하 도메인을 갖는 SWNTs는, P-N 접합 반도체 구조와 동일한 구조일 수 있다. 상기 P-N 접합의 상호 연결은, FET 및 보다 상부 구조인 복잡한 집적 회로가 NAND, NOR, AND, OR 게이트로서 기능하게 할 수 있다. SWNT 결합 펩티드를 사용한 n-형 SWNT 개질의 개략도는 도 25에 도시했다. 이와 동일한 개질은 다중벽 나노튜브 및 다중벽 나노튜브 페이스트에 적용될 수 있다.
나노튜브의 용해도 및 생체 적합성
용매에서의 낮은 용해도는 SWNT의 추가적인 응용을 방해할 수 있다. 통상적으로, 물에서의 용해는 SWNT의 생물학적 응용에 필수적이다. 본 실시예에서 SWNT 를 용해하기 위해 랩핑 폴리머 및 계면 활성제를 사용했지만, 이들은 또한 생물학적 시스템에 적용되어야 한다. SWNT 표면을 인식하는 펩티드와 콘쥬게이션된 친수성 펩티드기는 SWNT를 물에 용해시킬 수 있는 것으로 생각된다. 또한, 친수성 펩티드기를 제거하면 SWNTs를 비극성 용매에 용해시키는데 도움이 될 수 있다. 이와 동일한 개질은 다중벽 나노튜브 및 다중벽 나노튜브 페이스트에 적용될 수 있다.
반도체 SWNT의 와이어링
본 발명에 따라, SWNT (금속성 및 반도체)를 인식하는 펩티드는 함께 와이어링되어 집적 SWNT 회로를 형성할 수 있고, 기능성 전기 장치로서 기능할 수 있다. 이와 유사하게, 와이어링 기술은 다중벽 나노튜브 및 기타 원소 탄소-함유 분자에 적용될 수 있다.
바이오센서
생체 적합성 SWNTs는 개체의 미세한 화학적 또는 물리적 변화를 검출하기 위한 바이오센서로서 사용될 수 있다. 금속성 SWNTs의 전도성은, 통상적으로 SWNTs 주위의 전자 분포에 의해 상당한 영향을 받을 수 있다. 따라서, 생물학적 상호 작용은 2개의 인식 잔기 (하나는 SWNT에 대한 것이고 다른 하나는 생물학적 표적에 대한 것)로 콘쥬게이션된 SWNTs의 전도성을 측정함으로써 관찰될 수 있다. 생물학적 표적 검출-펩티드가 표적 분자에 결합하는 경우, SWNTs의 전자 분포는 주위 펩티드에 의해 영향을 받을 수 있다. 펩티드 결합 및 비결합 상태는 전기적 신호로 관찰할 수 있으며, 항원-항체 검출, 혈액내 뿐만 아니라 다른 곳에서의 글루코스 측정과 같이 직접적으로 바이오센서로서 사용될 수 있다. 다중벽 나노튜브 또는 기타 원소 탄소-함유 분자는 또한, 본 발명의 방법 및 조성물을 사용하여 바이오센서로서 사용될 수 있다.
또한, SWNT에 결합하는 펩티드 사슬의 입체 구조는 pH, 이온 세기, 금속 이온의 농도, 및 온도 변화에도 영향을 받는다. 이러한 환경적 변화는 또한, SWNTs의 전자 분포에 영향을 미칠 수 있다. 상기 모든 변화들은 SWNTs 결합 펩티드를 사용하여 검출될 수 있다.
8. 약물 방출 시스템
SWNTs는 약물을 포함하는 견고한 스캐폴드로서 사용될 수 있다. 또한, 특히 SWNTs 결합 펩티드가 약물에 의해 개질되었다면, SWNTs는 또한 약물을 전달하는데 사용될 수 있다. 예를 들어, 펩티드로 연결된 약물은 시간이 경과함에 따라 서서히 방출될 수 있다. 통상적으로, 상기 약물은 패치형 약물 전달 시스템과 유사하게 기능한다. 약물 방출 시스템으로서 SWNT의 응용에 대한 개략도는 도 26에 도시했다. 또한, 약물은 예를 들면 종양 세포와 같은 질병 위치에 직접적으로 이식될 수 있다.
기타 원소 탄소-함유 분자는 또한, 약물을 방출하는 본 발명의 제약 조성물, 진단 마커, 및(또는) 치료로서 예방 치료, 진단, 모니터링, 및(또는) 스크리닝 (예를 들어, 약물, 증상, 상호 작용, 및(또는) 효과의)을 위한 본 발명의 방법 및 조성물과 사용되는 약물로서 사용될 수 있다.
암 약물
생체 적합성 CNT는 방사성 또는 고독성 약물 전달에 사용될 수 있다. 또한, 다중벽 탄소 나노튜브 (MWNT)는 MWNT에 특이적인 결합 특성을 갖는 펩티드에 의해 생체 적합성 MWNT로 전환될 수 있다. MWNTs는 통상적으로 약 3-4 nm 이상의 MWNT 채널을 포함한다. 상기 MWNT 채널은 화학-/방사능- 치료와 같은 특별한 용도를 위해, 고독성 또는 방사성 약물로 충전될 수 있다. 그렇다면, 고독성 또는 방사성 약물을 포함하는 MWNTs는 종양 세포 또는 개체에 직접 이식될 수 있고, 그 후 목적했던 고독성 또는 방사성 약물을 방출한다. 채널 내부의 직경을 변화시킴으로써, 방출 속도를 조절할 수 있다. 암 약물에 있어서 SWNTs의 응용에 대한 개략도는 도 27에 도시했다.
기타 원소 탄소-함유 분자는 또한, 치료 수단으로서 약제의 치료적 전달 또는 질병 진행 (예를 들어, 암 또는 기타 병리학적 증상에 대해)의 모니터링에 사용될 수 있다.
본 발명은 상기 언급한 모든 성분들을 포함할 수 있거나 포함하지 않을 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 생물학적 스캐폴드는 기질없이 제조될 수 있다. 또한, 본 발명의 방법 및 조성물은 광학, 미세 전자공학, 자기학 및 공학과 같은 분야에 사용될 수 있다. 응용은 원소 탄소-함유 재료의 합성, 탄소 나노튜브 정렬, 생물학적 반도체의 생성, 단일벽 나노튜브 페이스트에 대한 접합 전환, 다중벽 나노튜브 페이스트에 대한 접합 전환, 단일- 및 다중벽 나노튜브 페이스트의 용해도 및 생물학적 적합성 증진, 집적 단일- 및 다중벽 나노튜브 페이스트 제조, 바이오센서 제조, 제약 조성물의 방출, 암 치료, 및 그의 조합을 포함한다.
본 발명은 예시적 실시태양에 관하여 기술되었지만, 이러한 기술은 한정적 의미로 해석되기를 의도하는 것은 아니다. 본 발명의 예시적인 실시태양 및 기타 실시태양의 여러 가지 변화 및 조합은, 명세서를 참고로 하여 당업자에게 명백할 것이다. 따라서, 추가된 청구 범위는 그러한 임의의 변화 또는 실시태양을 포함하는 것을 목적으로 한다.
SEQUENCE LISTING <110> Belcher, Angela M Smalley, Richard E. Ryan, Esther Lee, Seung-Wuk <120> BIOLOGICAL CONTROL OF NANOPARTICLES <130> 119927-1066 <140> N/A <141> 2002-09-25 <150> 60/325,664 <151> 2001-09-28 <160> 245 <170> PatentIn version 3.1 <210> 1 <211> 12 <212> PRT <213> artificial sequence <220> <223> artifical peptide <400> 1 Ala Met Ala Gly Thr Thr Ser Asp Pro Ser Thr Val 1 5 10 <210> 2 <211> 12 <212> PRT <213> artificial sequence <220> <223> peptide <400> 2 Ala Ala Ser Pro Thr Gln Ser Met Ser Gln Ala Pro 1 5 10 <210> 3 <211> 12 <212> PRT <213> artificial sequence <220> <223> peptide <400> 3 His Thr His Thr Asn Asn Asp Ser Pro Asn Gln Ala 1 5 10 <210> 4 <211> 12 <212> PRT <213> artificial sequence <220> <223> peptide <400> 4 Asp Thr Gln Gly Phe His Ser Arg Ser Ser Ser Ala 1 5 10 <210> 5 <211> 12 <212> PRT <213> artificial sequence <220> <223> peptide <400> 5 Thr Ser Ser Ser Ala Leu Gln Pro Ala His Ala Trp 1 5 10 <210> 6 <211> 12 <212> PRT <213> artificial sequence <220> <223> peptide <400> 6 Ser Glu Ser Ser Pro Ile Ser Leu Asp Tyr Arg 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198 Asn Leu Leu Glu Val Ile Ser Leu Pro His Arg Gly 1 5 10 <210> 199 <211> 12 <212> PRT <213> artificial sequence <220> <223> peptide <400> 199 Gln His Pro Asn Asn Ala His Val Arg Gln Phe Pro 1 5 10 <210> 200 <211> 12 <212> PRT <213> artificial sequence <220> <223> peptide <400> 200 Gln His Ala Asn Asn Gln Ala Trp Asn Asn Leu Arg 1 5 10 <210> 201 <211> 12 <212> PRT <213> artificial sequence <220> <223> peptide <400> 201 Gln His Tyr Pro Gly Arg Ala Ile Pro His Ser Thr 1 5 10 <210> 202 <211> 12 <212> PRT <213> artificial sequence <220> <223> peptide <400> 202 Val Pro Pro Pro His Pro Gln Phe Asp His Leu Ile 1 5 10 <210> 203 <211> 12 <212> PRT <213> artificial sequence <220> <223> peptide <400> 203 Leu Lys Met Asn Pro Ser Ile Ser Ser Ser Leu Lys 1 5 10 <210> 204 <211> 12 <212> PRT <213> artificial sequence <220> <223> peptide <400> 204 His Trp Asp Pro Phe Ser Leu Ser Ala Tyr Phe Pro 1 5 10 <210> 205 <211> 12 <212> PRT <213> artificial sequence <220> <223> peptide <400> 205 Trp Ser Pro Gly Gln Gln Arg Leu His Asn Ser Thr 1 5 10 <210> 206 <211> 12 <212> PRT <213> artificial sequence <220> <223> peptide <400> 206 Asn Met Thr Lys His Pro Leu Ala Tyr Thr Glu Pro 1 5 10 <210> 207 <211> 12 <212> PRT <213> artificial sequence <220> <223> peptide <400> 207 His Met Pro Thr Lys Ser Ala Ser Gln Thr Tyr Phe 1 5 10 <210> 208 <211> 12 <212> PRT <213> artificial sequence <220> <223> peptide <400> 208 His Asn Ala Tyr Trp His Trp Pro Pro Ser Met Thr 1 5 10 <210> 209 <211> 12 <212> PRT <213> artificial sequence <220> <223> peptide <400> 209 Val Leu Pro Pro Lys Pro Met Arg Gln Pro Val Ala 1 5 10 <210> 210 <211> 12 <212> PRT <213> artificial sequence <220> <223> peptide <400> 210 Ser Leu His Lys Ile Ser Gln Leu Ser Phe Ala Ser 1 5 10 <210> 211 <211> 12 <212> PRT <213> artificial sequence <220> <223> peptide <400> 211 Trp His Ser Arg Leu Pro Pro Met Thr Val Ala Phe 1 5 10 <210> 212 <211> 12 <212> PRT <213> artificial sequence <220> <223> peptide <400> 212 Thr Pro Trp Phe Gln Trp His Gln Trp Asn Leu Asn 1 5 10 <210> 213 <211> 12 <212> PRT <213> artificial sequence <220> <223> peptide <400> 213 Ser Asp Thr Ile Ser Arg Leu His Val Ser Met Thr 1 5 10 <210> 214 <211> 12 <212> PRT <213> artificial sequence <220> <223> peptide <400> 214 Asn Pro Tyr His Pro Thr Ile Pro Gln Ser Val His 1 5 10 <210> 215 <211> 12 <212> PRT <213> artificial sequence <220> <223> peptide <400> 215 Leu Pro Ser Ala Lys Leu Pro Pro Gly Pro Pro Lys 1 5 10 <210> 216 <211> 12 <212> PRT <213> artificial sequence <220> <223> peptide <400> 216 Thr Ser Asn Pro His Thr Arg His Tyr Tyr Pro Ile 1 5 10 <210> 217 <211> 12 <212> PRT <213> artificial sequence <220> <223> peptide <400> 217 Ser Asn Phe Thr Thr Gln Met Thr Phe Tyr Thr Gly 1 5 10 <210> 218 <211> 12 <212> PRT <213> artificial sequence <220> <223> peptide <400> 218 Lys Met Asp Arg His Asp Pro Ser Pro Ala Leu Leu 1 5 10 <210> 219 <211> 12 <212> PRT <213> artificial sequence <220> <223> peptide <400> 219 Met Pro Ala Val Met Ser Ser Ala Gln Val Pro Arg 1 5 10 <210> 220 <211> 12 <212> PRT <213> artificial sequence <220> <223> peptide <400> 220 Asp Arg Ala Pro Leu Ile Pro Phe Ala Ser Gln His 1 5 10 <210> 221 <211> 12 <212> PRT <213> artificial sequence <220> <223> peptide <400> 221 Asp Gln Tyr Ile Gln Gln Ala His Arg Ser His Ile 1 5 10 <210> 222 <211> 12 <212> PRT <213> artificial sequence <220> <223> peptide <400> 222 His Ala Arg Ile Asn Pro Ser Phe Pro Leu Pro Ile 1 5 10 <210> 223 <211> 12 <212> PRT <213> artificial sequence <220> <223> peptide <400> 223 Gly Trp Trp Pro Tyr Ala Ala Leu Arg Ala Leu Ser 1 5 10 <210> 224 <211> 12 <212> PRT <213> artificial sequence <220> <223> peptide <400> 224 Thr Ala Ala Thr Ser Ser Pro His Ser Arg Ser Pro 1 5 10 <210> 225 <211> 12 <212> PRT <213> artificial sequence <220> <223> peptide <400> 225 Ser Thr Thr Gly Gln Ser Pro Ala Leu Ala Pro Pro 1 5 10 <210> 226 <211> 12 <212> PRT <213> artificial sequence <220> <223> peptide <400> 226 His Ser Ser Trp Tyr Ile Gln His Phe Pro Pro Leu 1 5 10 <210> 227 <211> 12 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Cys 1 5 <210> 235 <211> 9 <212> PRT <213> artificial sequence <220> <223> peptide <400> 235 Cys Arg Pro Tyr Asn Ile His Gln Cys 1 5 <210> 236 <211> 9 <212> PRT <213> artificial sequence <220> <223> peptide <400> 236 Cys Pro Phe Lys Thr Ala Phe Pro Cys 1 5 <210> 237 <211> 7 <212> PRT <213> artificial sequence <220> <223> peptide <220> <221> misc_feature <222> (1)..(2) <223> X = N or Q <220> <221> misc_feature <222> (6)..(7) <223> X = N or Q <400> 237 Xaa Xaa Pro Met His Xaa Xaa 1 5 <210> 238 <211> 7 <212> PRT <213> artificial sequence <220> <223> peptide <400> 238 Trp Trp Ser Trp His Pro Trp 1 5 <210> 239 <211> 7 <212> PRT <213> artificial sequence <220> <223> peptide <400> 239 His Trp Ser Trp Trp His Pro 1 5 <210> 240 <211> 14 <212> PRT <213> artificial sequence <220> <223> peptide <400> 240 Ala Cys Trp Trp Ser Trp His Pro Trp Cys Gly Gly Gly Lys 1 5 10 <210> 241 <211> 14 <212> PRT <213> artificial sequence <220> <223> peptide <400> 241 Ala Cys Asp Ser Pro His Arg His Ser Cys Gly Gly Gly Lys 1 5 10 <210> 242 <211> 14 <212> PRT <213> artificial sequence <220> <223> peptide <400> 242 Ala Cys Pro Arg Ser Ser His Asp His Cys Gly Gly Gly Lys 1 5 10 <210> 243 <211> 7 <212> PRT <213> artificial sequence <220> <223> peptide <400> 243 Tyr Phe Ser Trp Trp His Pro 1 5 <210> 244 <211> 16 <212> PRT <213> artificial sequence <220> <223> peptide <400> 244 Asp Met Pro Arg Thr Thr Met Ser Pro Pro Pro Arg Gly Gly Gly Lys 1 5 10 15 <210> 245 <211> 12 <212> PRT <213> artificial sequence <220> <223> peptide <400> 245 Asn His Arg Ile Trp Glu Ser Phe Trp Pro Ser Ala 1 5 10

Claims (113)

  1. 하나 이상의 펩티드 결합 도메인을 포함하고, 상기 도메인은 표적 반도체 결정성 면에 특이적으로 결합하며 표적 반도체 결정 조성물의 나노결정을 선택적으로 응집하는 것인 조성물.
  2. 제1항에 있어서, 도메인이 표적 반도체 결정 조성물의 나노결정에 결합하는 것인 조성물.
  3. 제1항에 있어서, 도메인이 표적 반도체 조성물의 나노결정에 결합하며, 나노결정이 표적 반도체 조성물의 다른 나노결정과 서로 정렬되어 표적 반도체 조성물의 나노와이어를 형성하는 것인 조성물.
  4. 제1항에 있어서, 도메인이 7 내지 20개의 아미노산인 조성물.
  5. 제1항에 있어서, 도메인이 7 내지 15개의 아미노산인 조성물.
  6. 제1항에 있어서, 도메인이 자유 분자인 조성물.
  7. 제1항에 있어서, 도메인이 표적 결정에 결합하는 것인 조성물.
  8. 제1항에 있어서, 도메인이 기질 표면을 관능화하는 것인 조성물.
  9. 제1항에 있어서, 도메인이 단층으로서 기질 표면에 부착되는 것인 조성물.
  10. 제1항에 있어서, 표적 반도체 결정이 단일 결정인 조성물.
  11. 제1항에 있어서, 표적 반도체 결정이 헤테로구조 결정 표면의 일부인 조성물.
  12. 제1항에 있어서, 표적 반도체 결정이 표적 결정의 단편을 포함하는 것인 조성물.
  13. 제1항에 있어서, 표적 반도체 결정이 III-V족 반도체 결정 또는 II-VI족 반도체 결정인 조성물.
  14. 제1항에 있어서, 표적 반도체 결정이 무기 반도체 결정인 조성물.
  15. 제1항에 있어서, 표적 반도체 결정이 갈륨 아세나이드, 인화인듐, 질화갈륨, 황화아연, 황화카드뮴, 알루미늄 아세나이드, 갈륨 스티비나이드, 알루미늄 갈륨 아세나이드, 알루미늄 스티비나이드, 카드뮴 셀레나이드, 아연 셀레나이드, 카드뮴 텔루라이드, 인듐 아세나이드 및 규소를 포함하는 것인 조성물.
  16. 제1항에 있어서, 표적 반도체 결정 조성물의 나노결정이 크기 및 형상 의존성 광학적 특성을 나타내는 것인 조성물.
  17. 제1항에 있어서, 표적 반도체 결정 조성물의 나노결정이 크기 및 형상 의존성 전기적 특성을 나타내는 것인 조성물.
  18. 제1항에 있어서, 도메인이 조절된 크기를 갖는 나노결정을 응집할 수 있는 것인 조성물.
  19. 제1항에 있어서, 도메인이 조절된 조성을 갖는 나노결정을 응집할 수 있는 것인 조성물.
  20. 제1항에 있어서, 도메인이 조절된 결정상을 갖는 나노결정을 응집할 수 있는 것인 조성물.
  21. 제1항에 있어서, 도메인이 조절된 형상을 갖는 나노결정을 응집할 수 있는 것인 조성물.
  22. 제1항에 있어서, 도메인이 조절된 종횡비를 갖는 나노결정을 응집할 수 있는 것인 조성물.
  23. 제1항에 있어서, 도메인이 조절된 도핑제 수준을 갖는 나노결정을 응집할 수 있는 것인 조성물.
  24. 제1항에 있어서, 도메인이 결정학적 정렬을 나타내는 나노결정을 응집할 수 있는 것인 조성물.
  25. 제1항에 있어서, 도메인이 조절된 배향을 나타내는 나노결정을 응집할 수 있는 것인 조성물.
  26. 제1항에 있어서, 도메인의 아미노산 중 41％ 이상이 루이스-염기 관능기를 갖는 것인 조성물.
  27. 제1항에 있어서, 도메인의 아미노산 중 30％ 이상이 극성 관능기를 갖는 것인 조성물.
  28. 제1항에 있어서, 표적 반도체 결정이 황화카드뮴 및 황화아연을 포함하는 것인 조성물.
  29. 하나 이상의 펩티드 결합 도메인을 포함하고, 상기 도메인은 표적 반도체 결정성 면에 특이적으로 결합하며 표적 반도체 결정 조성물의 나노결정을 선택적으로 응집하는 것인 조성물을 이용하는 것을 특징으로 하는, 유도된(directed) 반도체의 형성 방법.
  30. 제29항에 있어서,
    상기 조성물을 제1 이온과 접촉시켜 반도체 재료 전구물질을 생성하는 단계; 및
    제2 이온을 상기 반도체 재료 전구물질에 첨가하는 단계
    를 포함하며, 이 때 조성물은 반도체 재료의 형성을 유도하는 것인 방법.
  31. 제29항 또는 제30항에 있어서, 상기 조성물이 제2항 내지 제28항 중 어느 한 항의 조성물인 방법.
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