ES2583277T3 - Péptidos de unión a materiales inorgánicos - Google Patents

Abstract

Un método para el aislamiento de partículas de polvo que comprenden una entidad inorgánica de interés de una mezcla de partículas de polvo, que comprende las etapas de: (a) poner en contacto el polvo con un péptido de unión a materiales inorgánicos capaz de unirse específicamente a la entidad inorgánica de interés, y (b) aislar las partículas de polvo a las que se ha unido el péptido de unión a materiales inorgánicos.

Description

imagen1

imagen2

imagen3

imagen4

imagen5

imagen6

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

(a)

poner en contacto el polvo con un péptido de unión a materiales inorgánicos capaz de unirse específicamente a la entidad inorgánica de interés,

y

(b)

aislar las partículas de polvo a la que se ha unido el péptido de unión a materiales inorgánicos.

Los polvos que se pueden someter al método de esta realización incluyen típicamente partículas de polvo que comprende, o consisten en materiales inorgánicos (en lo sucesivo, las partículas de polvo que comprenden o consisten en materiales inorgánicos serán referidas como partículas de polvo inorgánico). Se entenderá que el método es adecuado tanto para el aislamiento de partículas de polvo inorgánico de mezclas de polvo puramente inorgánicas, o de mezclas que contienen tanto las partículas de polvo inorgánico como de otros tipos, especialmente partículas de polvo que consisten en materiales orgánicos, p. ej., poliméricos.

El método de acuerdo con la invención se puede aplicar a partículas de polvo de diferentes tamaños, incluyendo aquellas con un tamaño, p. ej., medido por medio de métodos de tamizado, de menos de 1 mm, concretamente menos de 100 µm, o menos de 10 µm, e incluso más preferido menos de 1 µm. El método es particularmente adecuado para nanopolvos. Tales polvos tienen preferiblemente un tamaño de partícula, expresado con frecuencia como tamaño medio de partícula, de 500 nm o menos, preferiblemente 300 nm o menos y 10 nm o más, preferiblemente 50 nm o más. A menudo, la partícula tiene un tamaño que oscila de alrededor de 250 a 100 nm. Tales tamaños de partícula se pueden medir mediante métodos granulométricos conocidos en la técnica, p. ej. difractometría láser.

Los polvos sometidos al método de este aspecto son preferiblemente no solubles en agua. Típicamente, su solubilidad es inferior a 100 mg/l, más preferiblemente inferior a 10 mg/l o incluso menos de 1 mg/l en agua a una temperatura de 20°C.

Como se indicó anteriormente, la referencia al "aislamiento de partículas de polvo" incluye métodos en donde las partículas de polvo que comprenden una entidad inorgánica de interés se identifican y separan de las partículas que no comprenden la entidad inorgánica de interés en una mezcla en polvo, o en donde se separan directamente de las partículas que no comprenden la entidad inorgánica de interés. Esta identificación y/o separación también es referida aquí como clasificación de polvos, especialmente nanopolvos.

La "entidad inorgánica de interés" que está comprendida en o proporcionada por las partículas de polvo que se van a aislar de acuerdo con el método de la invención incluye un compuesto inorgánico que se caracteriza por su composición química, p. ej., un metal, óxido de metal o un semiconductor o carbono. Los compuestos adecuados incluyen los seleccionados entre aluminio, antimonio, berilio, cadmio, cobre, cromo, oro, hierro, plomo, selenio, paladio, platino, titanio, zinc y óxidos de los mismos, particularmente entre TiO2, ZnO, Al2O3 o entre acero, incluido acero inoxidable. Por ejemplo, las partículas de polvo que se van a aislar puede consistir en los materiales mencionados anteriormente a los que se puede unir específicamente que el péptido de unión a materiales inorgánicos. En otra realización de este aspecto de la invención, la entidad inorgánica también puede ser una forma cristalográfica inorgánica específica de la partícula o en la partícula que se va a aislar, p. ej., cristalina, amorfa, o una forma cristalina específica. En otra realización más, la entidad inorgánica de interés es una partícula de polvo inorgánico en sí misma, que tiene un diámetro específico al cual se unirá selectivamente el péptido de unión a materiales inorgánicos. Otras morfologías de partículas, aparte del tamaño de partícula también se pueden contemplar como un criterio para el aislamiento de partículas de polvo.

Se entenderá que las entidades inorgánicas de interés son típicamente entidades que se pueden encontrar en, o cerca de la superficie de las partículas de polvo, preferentemente en la superficie.

Las mezclas de polvo que se van a someter al método de acuerdo con la invención comprenden típicamente al menos dos tipos de polvos, un tipo que proporciona la entidad inorgánica de interés, no proporcionando el otro la entidad inorgánica de interés. Sin embargo, el número de tipos de polvos no está particularmente limitado, tal como en el caso de mezclas de polvo que contienen partículas inorgánicas a lo largo de un intervalo de tamaños a partir de los cuales se van a aislar las partículas de polvo de un tamaño de partícula específico.

La mezcla de polvo se puede someter al método como tal, pero se prefiere dispersar las partículas de polvo para proporcionar una suspensión, preferiblemente una suspensión acuosa, de la mezcla de polvo en la que se va a realizar el método de acuerdo con la invención. Se debe entender que la referencia a una suspensión acuosa, medios acuosos, soluciones acuosas o similares en esta solicitud, significa sistemas disolventes en los que 50% (v/v) o más, preferiblemente 70% o más, más preferiblemente 90% o más y en particular, sustancialmente 100% del volumen total del disolvente o los disolventes es agua. Las soluciones acuosas que contienen los péptidos de unión a materiales inorgánicos u utilizadas para lavar partículas a las que se unen los péptidos de unión a materiales inorgánicos pueden comprender adicionalmente tampones y sales según sea necesario.

La unión del péptido de unión a materiales inorgánicos a entidades inorgánicas de interés generalmente se produce espontáneamente, sin la necesidad de la aplicación de energía externa. Por ejemplo, con el fin de lograr una unión, el péptido/solución de péptido pueden permanecer en contacto con las partículas de polvo a una temperatura que

imagen7

imagen8

Materiales

Estado Secuencia

imagen9

imagen10 SPHPGPY (SEQ ID NO: 6) (p. ej., Jószai 2006)

Al

Superficie plana VPSSGPQDTGTT (SEQ ID NO: 7) (p. ej., Zuo 2005)

Ag

polvo AYSSGAPPMPPF (SEQ ID NO: 8) NPSSLFRYLPSD (SEQ ID NO: 9) (p. ej., Naik 2002 o Xu 2005)

SiO2

polvo amorfo MSPHPHPRHHHT (SEQ ID NO: 10) RGRRRRLSCRLL (SEQ ID NO: 11) KPSHHHHHTGAN (SEQ ID NO: 12) (p. ej., Naik 2002)

zeolitas

polvo VKTQATSREEPPRLPSKHRPG (SEQ ID NO: 13) MDHGKYRQKGATPG (SEQ ID NO: 14) (p. ej., Schembri 1999)

ZnO

polvo NTRMTARQHANHKSTQ (SEQ ID NO: 15) VRTRDDARTHRK (SEQ ID NO: 16) (p. ej., Kjaergaard 2000)

CaCO3

Polvo cristalino de calcita o aragonita HTQNMRMYEPWF (SEQ ID NO: 17) DVFSSFNLKHMR (SEQ ID NO: 18) (p. ej., Gaskin 2000)

Cr2O3

Polvo cristalino WRPKAATN (SEQ ID NO: 19) RIRHRLVGQ (SEQ ID NO: 20) (p. ej., Gaskin, 2004)

Ti

polvo RKLPDAPGMHTW (SEQ ID NO: 21) (p. ej., Sano 2003)

TiO2

Polvo de anatasa CHKKPSKSC (SEQ ID NO: 22) (p. ej., Chen 2006)

Fe2O3

polvo RRTVKHHVN (SEQ ID NO: 23) (p. ej., Brown 1997)

GaAs

Polvo monocristalino AQNPSDDNNTHTH (SEQ ID NO: 24) RLELAIPLQGSG (SEQ ID NO: 25) TPPRPIQYNHTS (SEQ ID NO: 26) (p. ej., Whaley 2000)

ZnS, CdS

Polvo nanocristalino NNPMHQN (SEQ ID NO: 27) (p. ej., Lee 2002 o Mao 2004)

nanotubo C

nanotubo C

HWSAWWIRSNQS (SEQ ID NO: 28) (p. ej., Wang 2003)

PPyCl

Superficie plana THRTSTLDYFVI (SEQ ID NO: 29) (p. ej., Sanghvi 2005)

Tabla 1: Péptidos inorgánicos identificados mediante presentación en fagos o presentación en la superficie celular contra polvos inorgánicos o contra superficies planas.

De acuerdo con lo anterior, se describe adicionalmente como un tercer aspecto un método para la identificación de 5 defectos o inhomogeneidades en una superficie mediante la detección de una entidad inorgánica de interés, que comprende las etapas de:

(a1) seleccionar un péptido contra la entidad inorgánica de interés por medio de tecnologías de presentación que es capaz de unirse específicamente a la entidad inorgánica de interés;

(a2) sintetizar o expresar el péptido de unión a materiales inorgánicos seleccionado en el apartado (a1), 10 seguido de las etapas de:

(a)

poner en contacto la superficie con el péptido de unión a materiales inorgánicos, que porta un marcador detectable y es capaz de unirse específicamente a la entidad inorgánica de interés;

(b)

eliminar el péptido no unido; y

(c)

detectar el péptido que queda en la superficie.

15 Se entenderá que las realizaciones y las realizaciones preferidas de este método son las mismas que las descritas para el método para la identificación de defectos o inhomogeneidades sobre una superficie descrita anteriormente. Se entenderá que el marcador detectable se ancla generalmente al péptido después de la etapa (a2) y antes de la etapa (a) o, alternativamente, se expresa junto con el péptido en la etapa (a2).

La invención proporciona como un aspecto adicional un método para el aislamiento de partículas de polvo que

20 comprenden una entidad inorgánica de interés a partir de una mezcla de partículas de polvo, que comprende las etapas de:

(a1) seleccionar un péptido contra la entidad inorgánica de interés mediante tecnologías de presentación que es capaz de unirse específicamente a la entidad inorgánica de interés;

imagen11

imagen12

antibióticos a la célula anfitriona. A modo de ilustración, se emplean fácilmente para este fin el gen de resistencia a ampicilina (amp'), y el gen de resistencia a la tetraciclina (Tet').

La memoria descriptiva describe además una célula anfitriona que comprende la molécula de ácido nucleico o el vector.

5 Los vectores construidos como se ha descrito se introducen en una célula anfitriona para la amplificación y/o expresión. Los vectores se pueden introducir en las células anfitrionas utilizando métodos de transformación convencionales incluyendo electroporación, precipitación con fosfato de calcio y similares. Si el vector es una partícula infecciosa tal como un virus, el propio vector proporciona la entrada a la célula anfitriona. La transfección de las células anfitrionas que contienen un vector de expresión replicable que codifica la fusión del gen y la producción

10 de partículas de fago de acuerdo con procedimientos convencionales proporciona partículas de fago en las que la proteína de fusión se presenta sobre la superficie de la partícula de fago. Las células anfitrionas preferidas incluyen, sin ser limitantes, E. coli.

En una realización diferente, la memoria descriptiva describe un método para producir un péptido de la invención, que comprende cultivar el anfitrión descrito en la presente memoria en condiciones adecuadas y aislar el péptido

15 producido. Los métodos adecuados para producir péptidos en anfitriones apropiados son conocidos en la técnica y se han descrito anteriormente. Además, un péptido de la invención también puede ser producido mediante traducción in vitro de ARNm en un sistema de expresión libre de células adecuado o se puede sintetizar como se ha descrito anteriormente.

En una realización preferida del método de la invención, la estructura de la superficie inorgánica de interés es de

20 acero inoxidable y el péptido de unión a materiales inorgánicos que se une específicamente a dicha estructura inorgánica de interés es el péptido de la invención que comprende la secuencia de aminoácidos MTWDPSLASPRS (SEQ ID NO: 31).

En otra realización preferida del método de la invención, la estructura de la superficie inorgánica de interés es TiO2 y el péptido de unión a materiales inorgánicos que se une específicamente a dicha estructura inorgánica de interés es

25 el péptido de la invención que comprende la secuencia de aminoácidos LNAAVPFTMAGS (SEQ ID NO: 32).

Definiciones generales

Los aminoácidos se representan en la presente memoria, o bien con el código de una sola letra o bien con el código de tres letras o ambos. Estos códigos son bien conocidos en la técnica. Por ejemplo, los códigos de los aminoácidos convencionales se muestran en siguiente Tabla 2.

Aminoácidos

código de una letra código de tres letras

Alanina

A Ala

Arginina

R Arg

Asparragina

N Asn

Ácido aspártico

D Asp

Cisteína

C Cys

Ácido glutamico

E Glu

Glutamina

Q Gln

Glicina

G Gly

Histidina

H His

Isoleucina

I Ile

Leucina

L Leu

5

10

15

20

25

30

35

Aminoácidos

código de una letra código de tres letras

Lisina

K Lys

Metionina

M Met

Fenilalanina

F Phe

Prolina

P Pro

Serina

S Ser

Treonina

T Thr

Triptófano

W Trp

Tirosina

Y Tyr

Valina

V Val

Tabla 2: códigos de una letra y de tres letras para aminoácidos convencionales

El término "purificación por afinidad", según se utiliza en la presente memoria, significa la purificación de una molécula basada en la atracción o unión específica de la molécula a un producto químico o compañero de unión para formar una combinación o complejo que permite que la molécula sea separada de las impurezas mientras permanece unida al ó atraída por el radical del compañero.

Tal según se utiliza en la presente memoria, "conjunto de codones" se refiere a un conjunto de diferentes secuencias de tripletes de nucleótidos utilizado para codificar aminoácidos variantes deseados. Un conjunto de oligonucleótidos se puede sintetizar, por ejemplo, mediante síntesis en fase sólida, incluyendo secuencias que representan todas las posibles combinaciones de tripletes de nucleótidos proporcionadas por el conjunto de codones y que codificarán el grupo deseado de aminoácidos. Una forma convencional de designación de codones es la del código IUB, que se conoce en la técnica y se describe en la presente memoria.

"Célula", "línea celular" y "cultivo celular" se utilizan indistintamente en la presente memoria y tales designaciones incluyen toda la progenie de una célula o línea celular. Así, por ejemplo, términos como "transformantes" y "células transformadas" incluyen la célula sujeto primaria y los cultivos derivados de la misma sin tener en cuenta el número de transferencias. También se entiende que toda la progenie puede no ser precisamente idéntica en el contenido de ADN, debido a mutaciones deliberadas o inadvertidas. Se incluye la progenie mutante que tiene la misma función o actividad biológica que se escruta en la célula transformada originalmente. Cuando se pretendan designaciones diferentes, quedará claro a partir del contexto.

Según se utiliza en la presente memoria, el término "secuencias de control" cuando se refiere a la expresión significa secuencias de ADN necesarias para la expresión de una secuencia codificante conectada operativamente en un organismo anfitrión concreto. Las secuencias de control que son adecuadas para procariotas, p. ej., incluyen un promotor, opcionalmente una secuencia operadora, un sitio de unión al ribosoma, y posiblemente, otras secuencias todavía poco conocidos. Se sabe que las células eucarióticas utilizan promotores, señales de poliadenilación, y potenciadores.

El término "proteína de la cubierta", de acuerdo con la presente invención, significa una proteína, al menos una parte de la cual está presente en la superficie de la partícula de virus. Desde una perspectiva funcional, una proteína de la cubierta es cualquier proteína que se asocia con una partícula de virus durante el procedimiento de ensamblaje viral en una célula anfitriona, y permanece asociada con el virus ensamblado hasta que éste infecta otra célula anfitriona. La proteína de la cubierta puede ser la proteína principal de la cubierta o puede ser una proteína menor de la cubierta. Un proteína de la cubierta "principal" es generalmente una proteína de la cubierta que está presente en la cubierta viral preferiblemente con al menos aproximadamente 5, más preferiblemente al menos aproximadamente 7, incluso más preferiblemente al menos aproximadamente 10 copias de la proteína o más. Una proteína principal de la cubierta puede estar presente en decenas, cientos o incluso miles de copias por virión. Un ejemplo de una proteína principal de la cubierta es la proteína p8 de fago filamentoso.

Tal como se utiliza aquí, el término "límite de detección" para una entidad química en un análisis concreto es la

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

concentración mínima de esa entidad que puede ser detectada por encima del nivel de fondo para que análisis. Por ejemplo, en el ELISA de fagos, el "límite de detección" para un fago concreto que presenta un péptido de unión a materiales inorgánicos concreto, es la concentración de fagos a la cual el fago concreto produce una señal de ELISA por encima de la producida por un fago de control que no presenta el péptido unión a materiales inorgánicos.

"Polipéptido", se refiere a un péptido o proteína que contiene dos o más aminoácidos unidos por enlaces peptídicos, e incluye péptidos, oligómeros, proteínas, y similares. El término "péptido" según se utiliza en la presente memoria describe un grupo de moléculas que consisten en hasta 30 aminoácidos, mientras que las "proteínas" consisten en más de 30 aminoácidos. Los polipéptidos pueden contener aminoácidos naturales, modificados o sintéticos. Los polipéptidos también se pueden modificar de forma natural, por ejemplo mediante procesamiento post-traduccional,

o químicamente, por ejemplo mediante amidación, acilación, entrecruzamiento, y similares.

Una "proteína de fusión" y un "polipéptido de fusión" se refieren a un polipéptido que tiene dos porciones unidas covalentemente entre sí, donde cada una de las porciones es un polipéptido que tiene una propiedad diferente. La propiedad puede ser una propiedad biológica, tal como una actividad in vitro o in vivo. La propiedad también puede ser una simple propiedad química o física, tal como la unión a un antígeno diana, la catálisis de una reacción, etc. Las dos porciones pueden estar unidas directamente por un solo enlace peptídico o a través de un conector peptídico que contiene uno o más residuos de aminoácido. En general, las dos porciones y el conector estarán en marco de lectura entre sí. Preferiblemente, las dos porciones del polipéptido se obtienen de polipéptidos heterólogos

o diferentes. Un ejemplo de una proteína de fusión es un péptido de unión a materiales inorgánicos fusionado a una proteína de la cubierta del fago. Otro ejemplo de una proteína de fusión es un péptido de unión a materiales inorgánicos fusionado a un péptido o proteína marcadores.

Existe en la técnica un gran número de métodos adecuados para producir polipéptidos en anfitriones apropiados. Si el anfitrión es un organismo unicelular, tal como un procariota, una célula de mamífero o insecto, el experto en la técnica puede volver a una variedad de condiciones de cultivo. Convenientemente, la proteína producida se recoge del medio de cultivo, de los productos lisados de los organismos cultivados o de las membranas (biológicas) aisladas mediante técnicas establecidas. En el caso de un organismo multicelular, el anfitrión puede ser una célula que es parte de o deriva de una parte del organismo, por ejemplo dicha célula anfitriona puede ser la parte cosechable de una planta. Un método preferido implica la producción recombinante de proteínas en anfitriones como se indicó anteriormente. Por ejemplo, las secuencias de ácido nucleico que comprenden la molécula de ácido nucleico de acuerdo con la invención pueden ser sintetizadas por PCR e insertadas en un vector de expresión. Posteriormente un anfitrión adecuado puede ser transformado con el vector de expresión. A continuación, el anfitrión se cultiva para producir el polipéptido deseado, que es aislado y purificado. Tales métodos son bien conocidos en la técnica (véase,

p. ej., Sambrook et al., más arriba).

El vector de expresión también puede tener una secuencia señal secretora fusionada al ADN que codifica el péptido. Esta secuencia se localiza típicamente inmediatamente 5' con respecto al gen que codifica la proteína de fusión, y de ese modo, se transcribirá en el extremo amino de la proteína de fusión. Sin embargo, en ciertos casos, se ha demostrado que la secuencia señal se encuentra en posiciones distintas de 5' con respecto al gen que codifica la proteína que se va a secretar. Esta secuencia dirige la proteína a la que está anclada a través de la membrana interna de la célula bacteriana. El ADN que codifica la secuencia señal se puede obtener como un fragmento de endonucleasa de restricción de cualquier gen que codifica una proteína que tiene una secuencia señal. Las secuencias señal procarióticas adecuadas se pueden obtenerse de genes que codifican, p. ej., LamB u OmpF (Wong et al., Gene, 68:1931 (1983), MaIE, PhoA y otros genes. Una secuencia señal procariótica preferida para la práctica de esta invención es la secuencia señal de enterotoxina termoestable H (STH) de E. coli como describen Chang et al., Gene 55:189 (1987), y malE.

El vector también incluye típicamente un promotor para dirigir la expresión de la proteína de fusión. Los promotores usados más comúnmente en los vectores procarióticos incluyen el sistema promotor lac Z, el promotor pho A de la fosfatasa alcalina (Ap), el promotor lambda pL de bacteriófago (un promotor sensible a la temperatura), el promotor tac (un promotor híbrido trp-lac que está regulado por el represor lac), el promotor de triptófano, y el promotor del bacteriófago T7. Para descripciones generales de los promotores, véase la sección 17 de Sambrook et al. más arriba. Si bien estos son los promotores más comúnmente utilizados, se pueden usar también otros promotores microbianos adecuados.

El vector también puede incluir otras secuencias de ácido nucleico, p. ej., secuencias que codifican etiquetas gD, epítopos c-Myc, etiquetas de poli-histidina, proteínas de fluorescencia (p. ej., GFP) o proteína beta-galactosidasa que pueden ser útiles para la detección o purificación de la proteína de fusión expresada sobre la superficie del fago

o célula. Secuencias de ácido nucleico que codifican, por ejemplo, una etiqueta gD, también proporcionan la selección positiva o negativa de células o virus que expresan la proteína de fusión. En algunas realizaciones, la etiqueta gD se fusiona preferiblemente a un péptido que no se fusiona al componente de proteína de la cubierta viral. Las secuencias de ácido nucleico que codifican, por ejemplo, una etiqueta de polihistidina, son útiles para la identificación de proteínas de fusión que incluyen péptidos que se unen a un antígeno específico utilizando inmunohistoquímica. Las etiquetas útiles para la detección de la unión de péptidos se pueden fusionar o a un péptido no fusionado a un componente de la proteína de la cubierta viral o un péptido fusionado a un componente de la proteína de la cubierta viral.

imagen13

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

que la clasificación se basa en la afinidad intrínseca con el ligando, y se utilizan vectores fagémidos, que simplifican las manipulaciones de ADN. Lowman y Wells, Methods: A companion to Methods in Enzymology, 3:2050216 (1991).

Un "fagémido" es un vector plasmídico que tiene un origen de replicación bacteriano, p. ej., Co1E1, y una copia de una región intergénica de un bacteriófago. El fagémido se puede utilizar en cualquier bacteriófago conocido, incluyendo bacteriófago filamentoso y bacteriófago lambdoide. El plásmido también contendrá generalmente un marcador seleccionable para la resistencia a antibióticos. Los segmentos de ADN clonados en estos vectores pueden propagarse en forma de plásmidos. Cuando se proporcionan células que albergan estos vectores con todos los genes necesarios para la producción de partículas de fago, el modo de replicación del plásmido cambia a la replicación de círculo rodador para generar copias de una hebra del ADN plasmídico y partículas de empaquetamiento del fago. El fagémido puede formar partículas de fago infecciosas o no infecciosas. Este término incluye fagémidos que contienen un gen de la proteína de la cubierta del fago o un fragmento del mismo unido a un gen de un polipéptido heterólogo como una fusión de genes de tal manera que el polipéptido heterólogo se presenta sobre la superficie de la partícula de fago.

El término "vector de fago" significa una forma replicativa de doble hebra de un bacteriófago que contiene un gen heterólogo y susceptible de replicación. El vector de fago tiene un origen de replicación de fago que permite la replicación del fago y la formación de partículas de fago. El fago es preferiblemente un bacteriófago filamentoso, tal como un fago M13, f1, fd, Pf3 o un derivado de los mismos, o un fago lambdoide, tal como lambda, 21, phi80, phi81, 82, 424, 434, etc., o una derivado de los mismos.

Figuras

Figura 1: Estudio de unión del péptido de unión a ZnO-fluoresceína VRTRDDARTHRK (SEQ ID NO: 16). (A) El péptido de unión a ZnO (0,1 mg/ml) y los polvos inorgánicos de ZnO o Fe2O3 se mezclaron en tampón de unión (Tris 50 mM/Tween® al 0,5%/NaCl 15 mM (pH = 7,6)) durante 1 h y después se lavaron durante la noche con el mismo tampón. El polvo se examinó a continuación mediante microscopía óptica con fluorescencia. (B) Interacción del péptido de unión a ZnO con dos tipos de sustratos de acero galvanizado. El Galva Gi206031 es skinpasado, descromado y tiene un aspecto Z caracterizado por muy pocos defectos, mientras que el Galva DX510 es no skinpasado, descromado, Epasivado y tiene un aspecto A con algunos defectos. (C) Interacción del péptido de unión a ZnO con (i) zinc metálico, (ii) óxido de zinc (iii) hidróxido de zinc (iv) aluminio o (v) óxido de aluminio puros. Los óxidos se han formado calentando el sustrato de zinc 1 min a 200°C y el sustrato de aluminio 1 min a 800°C. Los hidróxidos se han formado atacando el sustrato con NaOH 0,1 M durante 10 min a temperatura ambiente. Todos los sustratos se saturaron primero con BSA al 1% antes de la unión.

Figura 2: Efecto del pre-tratamiento alcalino o de calentamiento del sustrato galvaGi206031 sobre suinteracción con el péptido de unión a ZnO. Parte superior (Izquierda) sustrato no tratado, es decir lavado con una mezcla de etanol/acetona (Medio) Sustrato lavado 1 min a 60°C con Novaclean al 1,5%. (Derecha) Sustrato lavado 1 min a 60°C con Novaclean al 1,5% y calentado 2 minutos a 260°C. Los sustratos se observaron bajo el microscopio óptico con fluorescencia. La intensidad de fluorescencia de la fluoresceína se midió en una longitud de onda de emisión de 535 nm (λ excitación = 485 nm) sobre 20 líneas horizontales por muestra. La intensidad media se calculó sobre 10 muestras. Parte inferior: Análisis XPS de la superficie Galva Gi206031 después de la incubación en tampón de unión (Tris 50 mM/Tween® al 0,5%/NaCl 15 mM (pH = 7,6)) después de diferentes pretratamientos de lavado. (Primera línea) Sustrato no tratado es decir sustrato lavado solo con una mezcla 50/50 de etanol y acetona. (Segunda Línea) Sustrato lavado 1 min a 60°C con Novaclean al 1,5%. (Tercera línea) Substrato lavado 1 min a 60°C con Novaclean al 1,5% y calentado 2 minutos a 260°C. Las composiciones de las muestras elementales se expresan en porcentaje atómico.

Figura 3: (Parte superior) Estudio de la interacción cinética entre el péptido de unión ZnO (0,1 mg/ml) y elsustrato galva206031. Los sustratos se lavaron con un detergente alcalino, se saturaron con BSA al 1% y a continuación se llevaron a cabo interacciones de unión durante 1,5, 15 o 60 min. A continuación, los sustratos se lavaron durante la noche con Tris 50 mM/Tween® al 0,5%/NaCl 15 mM (pH = 7,6) y se observaron mediante microscopía de fluorescencia. (Parte inferior) estudio de desorción del péptido de unión a ZnO sobregalva206031: efecto de lavados exhaustivos con tampones ácidos o alcalinos después de la interacciónpéptido-sustrato. El péptido de unión a ZnO (0,1 mg/ml) y el sustrato de acero galvanizado se mezclaron en tampón de unión (Tris 50 mM/ Tween® al 0,5%/NaCl 15 mM (pH = 7,6)) durante 1 h y después se lavaron durante la noche con un tampón a pH 2, 4, 10, o 14 que contenía Tween al 2%. Los sustratos se examinaron a continuación mediante microscopía óptica con fluorescencia. El último sustrato se calentó 10 min a 200°C. El péptido con ZnOfluoresceína en solución en las mismas condiciones es todavía fluorescente.

Figura 4: Adherencia diferencial de péptido de unión a ZnO a múltiples superficies. Interacción de péptido de unión a ZnO con un sustrato de zinc parcialmente recubierto con una capa de 50 nm de Ag (parte derecha). La Ag se depositó sobre la lámina de Zn mediante PVD y se colocaron máscaras en algunos lugares con el fin de mantener los cuadrados de composición de Zn. El sustrato se sometió a tratamiento térmico para formar el óxido y a continuación se llevó a cabo la unión. (Parte derecha) Observación del sustrato bajo fluorescencia después del reconocimiento del péptido de unión a ZnO.

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

Figura 5: Cuatro rondas de inmunoprecipitación con el kit de presentación en fagos PhD12 frente a unsustrato de acero inoxidable y TiO2. La tabla muestra la disminución del número de fagos después de cada ronda. Se secuenciaron aproximadamente 30 fagos después de la tercera y cuarta ronda de selección. La secuencia del péptido de consenso para el acero inoxidable y TiO2 se describen en el marco. La secuencia del péptido para acero inoxidable se produjo en 70% de los clones y la secuencia para TiO2 en 50% de los clones.

Figura 6: Técnicas indirectas para medir la unión de los fagos que contienen la secuencia de consenso alsustrato de interés. (A) Representación esquemática del método utilizado para etiquetar fluorescentemente el fago. Un anticuerpo para la cubierta del fago se liga a la biotina. La conexión biotina-estreptavidina se utiliza para anclar al fago una fluoresceína conjugada con estreptavidina. (B) Mediciones de fluorescencia de los fagos que contienen la secuencia del péptido para acero inoxidable en la interacción con el sustrato de acero inoxidable (dos parches circulares a la izquierda), de los fagos que contienen la secuencia del péptido Ti en la interacción con el sustrato de acero inoxidable (primer parche circular a la derecha) y de los fagos que contienen una secuencia de péptidos al azar en la interacción con el sustrato de acero inoxidable (parche circular del extremo derecho). La intensidad de fluorescencia se indica debajo. (C) Placas resultantes de un título de fago que muestra una clara preferencia 3:1 de fagos que contienen el péptido para TiO2 para el sustrato de TiO2 en comparación con el sustrato de acero inoxidable.

Figura 7: Interacción de péptidos sintéticos con un colorante de fluoresceína N-terminal con sus respectivos sustratos. (A) Reconocimiento del péptido de unión a TiO2 con el sustrato de TiO2 o Si. Reconocimiento del péptido de unión a TiO2 amidado para el sustrato de TiO2. (B) Reconocimiento del péptido de unión a acero inoxidable para los sustratos de acero inoxidable o Si. Reconocimiento del péptido de unión a acero inoxidable amidado para el sustrato de acero inoxidable. (C) Reconocimiento del péptido de unión de acero inoxidable para los sustratos de acero inoxidable o Si (control negativo).

Figura 8: Mediciones QCM de la adsorción del péptido de unión a TiO2 sintético, péptido de unión a aceroinoxidable y péptido de unión a acero inoxidable amidado sobre sustratos de acero inoxidable. Se utilizó péptido de unión a TiO2 como control negativo. El desplazamiento en la frecuencia de resonancia se representa gráficamente como una función del tiempo. Los sensores QCM se estabilizaron primero en el tampón de unión Tris 50 mM/Tween® al 0,5%/NaCl 15 mM (pH = 7,6). Los péptidos se cargaron a un tiempo de 5 min y se inyectó tampón para enjuagar una vez que la curva de adsorción se estabilizó.

Figura 9: Mediciones QCM de la adsorción del péptido de unión a acero inoxidable sintético, péptido unión aTiO2 y péptido de unión a TiO2 amidado sobre sustratos de TiO2. Se utilizó péptido de unión de acero inoxidable como control negativo. El desplazamiento en la frecuencia de resonancia se representa gráficamente como una función del tiempo. Los sensores QCM se estabilizaron primero en el tampón de unión Tris 50 mM/Tween® al 0,5%/NaCl 15 mM (pH = 7,6). Los péptidos se cargaron a un tiempo de 5 min y se inyectó tampón para enjuagar una vez que la curva de adsorción se estabilizó.

Figura 10: Adherencia diferencial del péptido de unión a TiO2/acero inoxidable a múltiples superficies. El péptido sintético para TiO2-fluoresceína se incubó con un sustrato compuesto de una parte izquierda de acero inoxidable y una parte derecha de TiO2.

Figura 11: Estrategias disponibles con el fin de aplicar la clasificación de una mezcla nanopolvo. En un enfoque (Figura 11A) el GEPI dirigido a partículas X se añade a la suspensión acuosa de una combinación de partículas X e Y que se va a clasificar. El GEPI anclará específicamente sobre las partículas X. En un primer ejemplo (Figura A1), la dispersión acuosa de partículas Y y [partículas X -GEPI] se puede procesar adicionalmente sobre un soporte que presenta una gran afinidad por el GEPI o incluso más generalmente para moléculas basadas en aminoácidos: las partículas Y permanecerán en suspensión y las partículas X serán recuperadas después de la elución desde el soporte de afinidad. En un segundo ejemplo, el péptido de unión a materiales inorgánicos (GEPI) comprende una etiqueta; tal como por ejemplo una etiqueta de histidina o cualquier otro radical químico o biológico que permite una unión de afinidad adicional a un soporte complementario adecuado; ejemplos son sistemas de tipo biotina-estreptavidina o sistemas de tipo histidina-iones metálicos. En otro ejemplo más, el GEPI puede injertarse con un aducto químico o biológico super-hidrofobo/-hidrófilo y la clasificación se podría procesar basándose en esta característica específica físico-química recién inducida del complejo [partícula X-GEPI-aducto]. En otro enfoque (Figura 11 B), el GEPI dirigido a partículas X es conectado/injertado a un soporte y la combinación de nanopartículas adecuadamente dispersadas en una suspensión acuosa es procesada sobre el soporte funcionalizado. En un ejemplo (Figura B2) el GEPI podría ser injertado sobre un marco de material macroporoso de naturaleza orgánica, inorgánica o biológica; la suspensión de nanopartículas que se va a clasificar se pone en contacto/tamiza con el marco funcionalizado, las partículas X se conectan/adhieren al instante a GEPI-X y las partículas Y fluyen. En un ejemplo alternativo (Figura B1) el GEPI se puede inmovilizar sobre una matriz como cuentas de cromatografía o sobre una resina o sobre una membrana de cualquier tipo de composición química y cualquier forma física; en consecuencia, la suspensión de nanopartículas que se va a clasificar se filtra/tamiza sobre la matriz, resina, membrana (filtración tangencial, por ejemplo) funcionalizadas, las partículas X se conectan/adhieren al instante a GEPI-X y las partículas Y fluyen. El marco o matriz funcionalizados también pueden ser tubos de cerámica o cualquier otro.

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

Habiendo descrito generalmente la invención, la misma se entenderá más fácilmente mediante la referencia a los siguientes ejemplos.

Ejemplo 1: Materiales y Métodos

Material

Se adquirieron polvos de ZnO (99,99%), Fe2O3 (99,98%) y Cu2O (99,9%) de Sigma-Aldrich. Los sustratos de acero galvanizado fueron suministrados por la empresa siderúrgica ArcelorMittal. Los sustratos galvanizados tienen sus superficies recubiertas por una fina capa de ZnO para evitar la corrosión. El acero galvanizado de la referencia Gi206031 es skinpasado, descromado y tiene un aspecto Z (pocos defectos en la superficie, buena calidad). El acero galvanizado de referencia DX510 es no skinpasado, es decir de rugosidad heterogénea, cromado, E-pasivado con una fina capa de fosfato y tiene un aspecto A (más defectos). Los sustratos de acero galvanizado fueron caracterizados mediante espectroscopia Auger y de tiempo de vuelo (TOF)-SIMS (datos no mostrados). Las láminas de metal puro (99,9%) de Zn, Si, Ag y Al fueron adquiridas de Goodfellow (Alemania). La sal sódica de fluoresceína fue adquirida de Fluka (Alemania). El péptido de unión a ZnO VRTRDDARTHRK (SEQ ID NO: 16) con un colorante de fluoresceína en el extremo N proviene de Eurogentec (Lieja, Bélgica).

Los kits de presentación en fagos PhD12 y PhDC7C se adquirieron de New England Biolabs. Los sustratos de acero inoxidable y TiO2 fueron ofrecidos por ArcelorMittal. El acero inoxidable es una aleación de CrFe-Ni. El sustrato de TiO2 es un recubrimiento por depósito físico en fase de vapor (PVD) amorfo de 50 nm sobre un sustrato de acero inoxidable. Se utilizaron dos tipos de configuración de sustrato. Las primeras tres rondas de selección se realizaron sobre discos de 5 mm de diámetro de sustrato inorgánico mientras que la cuarta ronda se realizó en una profundidad de 5 mm moldeada en una lámina de acero inoxidable o TiO2.

Medios

Tween®-20 (Sigma-Aldrich), isopropil-β-D-tiogalactosidasa (IPTG) (Eurogentec, Lieja, Bélgica), 5-bromo-4-cloro-3indolil-β-D-galactosidasa (X-Gal) (Eurogentec, Lieja, Bélgica), tetraciclina (Fluka), PEG-8000 (Sigma-Aldrich) anticuerpos anti-fd fueron adquiridos de Sigma-Aldrich. La fluoresceína conjugada con estreptavidina se adquirió de Molecular Probes.

Preparación de péptidos

Los péptidos se solubilizaron en tampón de unión Tris 50 mM/Tween® al 0,5%/NaCl 15 mM (pH = 7,6) a una concentración de 0,1 mg/ml.

Preparación de sustratos

Los polvos se lavaron con tampón de unión antes de la interacción. sustratos de acero galvanizado se lavaron primero 10 min con una mezcla de etanol/acetona y después con Novaclean 271 F al 1,5% durante 1 min a 60°C. Novaclean es un detergente alcalino comercial (grupo Arnaud, Francia). Las láminas de Zn y Al puras se lavaron 10 min con una mezcla de etanol/acetona. El óxido de metal se formó calentando el sustrato de zinc 1 min a 200°C y el sustrato de aluminio 1 min a 800°C. Los hidróxidos se formaron al atacar sustratos con NaOH 0,1 M durante 10 min a RT. Los sustratos de acero inoxidable y TiO2 se lavaron con una mezcla de acetona/etanol. Todos los sustratos se lavaron a continuación con agua y se incubaron en tampón de unión antes de la interacción con el péptido.

Estudios de unión

Todos los sustratos o polvos lavados se saturaron durante 2 h con BSA al 1% antes de la unión. El péptido de unión a ZnO (0,1 mg/ml) y los polvos/sustratos inorgánicos se mezclaron en tampón de unión Tris 50 mM/Tween® al 0,5%/NaCl 15 mM (pH = 7,6) durante 1 h y a continuación se lavaron durante la noche con un tampón Tris 50 mM/Tween® al 0,5%/NaCl 15 mM (pH = 7,6). Los sustratos de acero inoxidable y TiO2 se pusieron en contacto con el péptido de unión a acero inoxidable/TiO2 (0,1 mg/ml) y se incubaron en tampón de unión (Tris 50 mM/Tween® al 0,5%/NaCl 15 mM (pH = 7,6)) durante 1 h y después se lavaron durante la noche con Tris 50 mM/Tween® al 0,5%/NaCl 15 mM (pH = 7,6).

Análisis con microscopio

Después de la unión, los polvos/sustratos se examinaron mediante microscopía óptica con fluorescencia. Se llevó a cabo la formación de imágenes confocal utilizando un microscopio confocal láser invertido Leica TCS SP2 (Leica Microsystems, Alemania). Las imágenes digitalizadas fueron adquiridas utilizando un 63x (NA 1.2). La fluoresceína se visualizó mediante el uso de una longitud de onda de excitación de 488 nm y la emisión de luz se registró a 535 nm. La adquisición se ajustó para evitar cualquier diafonía de las tres emisiones de fluorescencia. Se llevaron a cabo series de secciones ópticas para analizar la distribución espacial de la fluorescencia, se registraron con una etapa Z que oscilaba entre 1 y 2 μm. El procesamiento de imágenes, incluyendo la sustracción del fondo, se llevó a cabo con el soporte lógico Analys (versión 2.5).

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

Análisis XPS

Las mediciones XPS se realizaron en un espectrómetro de electrones para el sistema de análisis de superficie multitécnica. Este sistema está equipado con un analizador de energía de electrones de espejo cilíndrico de doble fase. La fuente de fotones es una fuente de rayos de doble ánodo Cameca SCX 700. Se utiliza una fuente de fuente de rayos X Al Kα no monocromatizada (hv = 1486,6 eV) como la fuente de excitación en todos los casos. Utilizando la líneas de fotoelectrones Au 4f7/2 y Cu 2p3/2, se realizó una calibración de energía del espectrómetro. Las cargas electrostáticas de la superficie se detectaron para algunas muestras, lo que dio como resultado efectos de retraso variables, por lo tanto todas las escalas de energía que correspondían a los espectros XPS referidos se normalizaron a partir de la posición de la energía de la línea de fotoelectrones C 1 s del carbono atmosférico (CH2)n: 285 eV. Las mediciones de fotoemisión se llevaron a cabo en una serie de muestras antes y después de la eliminación parcial de la contaminación por carbono superficial por pulverización catódica de iones. La pulverización catódica se llevó a cabo durante 10 min en la cámara de análisis de ultra alto vacío (UHV) con un haz de iones Ar+ de 0,6 keV (30 mA cm-2). Las composiciones de muestras elementales se evaluaron mediante XPS utilizando las áreas integradas de los picos de nivel básico C 1 s, N 1 S, O 1 s, A12p, Ca 2P3, Cu2P3, Zn 2p3. El contenido de la fracción molar Xi de un elemento i (con i = 0, C ...) en un sustrato analizado se calculó con la relación: Xi = Ai/Si/Σ Ai/Si siendo Ai la zona del pico relacionada con el átomo i, y Si el factor de sensibilidad del átomo i.

Selección de péptidos de unión a materiales inorgánicos por presentación en fagos

Los experimentos se realizaron de acuerdo con el procedimiento de inmunoprecipitación descrito en el protocolo de los kits PhD12 o PhDC7C de Biolabs. Se realizaron cuatro rondas de selección por afinidad para sustratos de acero inoxidable o TiO2 con el fin de extraer los péptidos consenso. Los fagos eluidos de la cuarta ronda se titularon sobre placas de agar y se tomaron muestras de aproximadamente 30 clones de fagos individuales para recuperar secuencias peptídicas.

Secuenciación de ADN

Se llevó a cabo la secuenciación S de los fagos M13 después de 4 rondas de selección con el cebador de secuenciación inversa 96 gIII (5' CCC TCA TAG TTA GCG TAA CG-3' (SEQ ID NO: 30)).

Medición de la afinidad fago-sustrato con

(i)

Anticuerpos fluorescentes

Los sustratos se expusieron a 20 µl de fago (106 fagos/µl determinado mediante titulación). Después de 30 minutos, las muestras recibieron un lavado intermedio con solución salina tamponada con Tris que contenía BSA al 1% y Tween® ·20 al 0,5% (TBST-BSA). A continuación las muestras se expusieron a 20 µl de anti-fd biotinilado (dilución 1/50 de la solución de partida) durante 30 minutos. Se realizó un segundo lavado intermedio y las muestras se expusieron finalmente durante 30 minutos a 20 µl de fluoresceína conjugada con estreptavidina (dilución 1/100 de la solución de partida). A continuación las muestras recibieron un lavado final con 4X TBST-BSA, 4X TBST, 4X TBS, 4X H2O.

(ii)

mediciones de titulación

Los sustratos se expusieron a 20 µl de fago (106 fago/µl determinado mediante titulación). Después de 30 minutos, las muestras recibieron un lavado intermedio con TBS/BSA al 1%/Tween®-20 al 0,5%. A continuación los fagos eluyeron a pH 2 y se titularon como se describe en el kit de presentación en fagos. Los resultados de la titulación fueron placas con placas víricas azules. El número de placas se correspondía con el número de fagos que se unían al sustrato. La población de fagos se diluyó antes de cultivarla en placas de modo que el número de placas en una placa dada se podía contar con la mano.

Medición de la afinidad del péptido por el sustrato con

(i)

Un colorante de fluoresceína

Las tres secuencias consenso fueron solicitadas por Eurogentec (Lieja, Bélgica) con el colorante de fluoresceína en el extremo N-terminal. Los péptidos sintéticos se solubilizaron en tampón de unión Tris 50 mM/Tween® al 0,5%/NaCl 15 mM (pH = 7,6) y se pusieron en contacto con los respectivos sustratos como se describe en la sección de unión. Los sustratos se caracterizaron mediante análisis microscópicos.

(ii)

Mediciones QCM-D

Una QCM consiste en un disco de cuarzo fino intercalado entre un par de electrodos. La frecuencia de resonancia del cristal, cuando es excitado por una tensión CA, depende de la masa oscilante total, incluyendo el agua acoplada. La QCM proporciona de ese modo una medida de la "masa húmeda". Una capa adsorbida "blanda" (viscoelástica) amortiguará la oscilación del cristal. La disipación se puede medir a múltiples frecuencias y mediante la aplicación de un modelo viscoelástico, se pueden determinar la masa, el espesor, el módulo de cizalla elástico y la viscosidad de cizalladura de la película que se adhiere. El aparato QCM-D (D300, Q-Sense, Suecia) de los autores de la presente

imagen14

5

10

15

20

25

30

35

40

45

Análisis XPS del sustrato Galva Gi206031 en tampón de unión

C1s (% at) N1s (% at) O1s (% at) Al2p (% at) Ca2p3 (% at) Cu2p3 (% at) Zn2p3 (% at)

sustrato sin tratar

61,81 0,78 24,07 9,54 0,17 0 2,55

sustrato desengrasado

46,08 1,44 33,39 0,7 0,26 0,45 15,92

sustrato desengrasado y calentado

50,51 0,51 28 0,23 0 0 19,55

Tabla 3: Porcentaje atómico de cada elemento en la superficie de acero galvanizado sometida a (i) un lavado con acetona/etanol (sustrato no tratado), (ii) un lavado de detergente alcalino (sustrato desengrasado) y (iii) un lavado alcalino más un calentamiento a 260°C (sustrato desengrasado y calentado).

Para comprobar si los diferentes perfiles de intensidad no se deben a diferencias en la capacidad de humectación del sustrato, se midieron los ángulos de contacto entre el agua y las superficies de acero galvanizado sometidas a diferentes condiciones de lavado. Se determinó un valor de 79,1°± 2,6 para sustratos lavados con etanol, un valor de 7,5°± 0,2 para los sustratos lavados con detergente alcalino y un valor de 73,6°± 2,8 para sustratos desengrasados y calentados. En consecuencia, las diferencias en la intensidad no se deben a diferencias en la capacidad de humectación del sustrato debido a que se puede observar un elevado perfil de intensidad con ángulos de contacto bajos o altos.

2.3 Cinética, resistencia y durabilidad de la interacción del péptido para ZnO -superficie de acero galvanizado

Se consideraron la cinética, la resistencia y la durabilidad de la interacción del péptido de unión a ZnO con la superficie de acero galvanizado de referencia Gi206031. En ese objetivo, los péptidos para ZnO se mezclaron durante 1,5, 15, o 60 min con el sustrato y después se lavaron durante la noche. Como se muestra en la Figura 3, el reconocimiento es realmente rápido y ha alcanzado su nivel máximo después de 1 min de contacto de unión.

A continuación, se investigó la fuerza de unión de péptido de unión a ZnO para el sustrato de acero galvanizado. Los sustratos sumergidos en péptidos de unión de ZnO se lavaron a continuación exhaustivamente con tampón ácido o alcalino y se midió la fluorescencia residual. También se investigó la resistencia térmica de la unión. La Figura 3 muestra que la interacción péptido-sustrato es fuerte, los péptidos persisten sobre el sustrato después de los lavados con tampón a pH 10 y 4. El tratamiento térmico interrumpe solo parcialmente la interacción. Los péptidos solamente se retiran del sustrato galvanizado después de lavados exhaustivos con un tampón de pH 2 o 14. El propio péptido todavía es fluorescente bajo las mismas condiciones de pH y térmicas.

A continuación, se investigó la durabilidad del recubrimiento con péptido sobre el acero mediante la medición de la intensidad de los péptidos-fluoresceína unidos sobre las superficies de acero después de 2 semanas. La fluorescencia de la muestra se reduce en un factor de 2 veces después de 2 semanas a temperatura ambiente, pero la fluoresceína sola en las mismas condiciones experimenta a la misma disminución debido a fotoblanqueo (Boxer, 1979).

2.4 Adherencia diferencial de los péptidos de unión a ZnO a superficies inorgánicas

Con el fin de poner de relieve la adherencia diferencial de los péptidos de unión a ZnO a múltiples superficies, se construyó un sustrato patrón que consistía en una capa de plata de 50 nm depositada mediante PVD sobre una lámina de zinc puro con máscaras en algunos lugares con el fin de mantener los cuadrados de zinc. Substrato se sometió a tratamiento térmico para formar una capa de óxido y se llevó a cabo la unión. Como se muestra en la Figura 4, el péptido de unión a ZnO reconoce la zona de ZnO con una afinidad diez veces mayor que la zona de óxido de plata. Los bordes del cuadrado son irregulares lo que se pone de manifiesto por la unión del péptido fluorescente.

En esta fase, el péptido de unión a ZnO fluorescente aparece como una buena herramienta detectora de defectos sobre las superficies de acero galvanizado. Con el fin de validar este concepto sobre otro tipo de superficies inorgánicas, péptidos se aislaron frente a otras dos superficies inorgánicas (acero inoxidable y TiO2 amorfo) y se utilizaron para detectar defectos de recubrimiento.

Ejemplo 3: Selección de péptidos de unión a TiO2 y acero inoxidable y su uso como detectores de control de calidad

3.1 Selección de péptidos de unión a acero inoxidable y TiO2 mediante presentación en fagos

Una biblioteca de virus que expresaban secuencias de péptidos al azar se expuso al sustrato inorgánico de interés: superficies de acero inoxidable y TiO2 amorfo. Se sometieron a ensayo dos bibliotecas diferentes de Biolabs: PhD12 y PhDC7C. Ambas bibliotecas se basan en el bacteriófago M13 que expresa una modificación en la proteína menor

imagen15

imagen16

imagen17

imagen18

Claims (1)

1. imagen1