JP2006506399A - バクテリアの染色体ｄｎａ破砕物と非毒性リポポリサッカライドを含む免疫強化及び調節組成物 - Google Patents

Abstract

【課題】
既存の癌治療の免疫療法用製剤に比べて著しく安全であり、経済的かつ有効であり、しかも特異的な免疫反応を誘導する物質を提供すること。
【解決手段】
本発明はバクテリアの染色体ＤＮＡ破砕物と非毒性リポポリサッカライドを主要成分とする免疫強化及び調節の組成物に関するものであって、本発明の混合物は抗癌治療剤及び免疫補助剤として産業的に用いることができる。

Description

本発明は免疫を強化し及び調節する組成物であって、バクテリアの染色体ＤＮＡ破砕物と非毒性リポポリサッカライドを主要成分として含有する組成物に関する。

１９６０年代から発達してきた癌の治療方法は、手術、放射線照射及び化学療法の３つの方法である。米国で１９７３年まで急上昇していた癌死亡率の上昇パターンが緩慢になったのは、このような治療方法がある程度有効であったことを意味する。しかし、手術と放射線療法とは局所的治療方法であるため、癌が限局性癌として早期に遮断された場合のみその予後が良いという制約がある。化学的療法は癌細胞全部を死滅させた場合のみ成功を収めることになる。しかし、そこまで至るためには、同時に宿主、即ち患者の正常組織、特に免疫系組織に相当な被害を与えることになるため、老いた者や弱者の生命を脅かす欠点がある。免疫療法の本質は、免疫監視機構を強化することによって、癌発生に抵抗しようとすることであり、次のような試みがあった。

１)癌の免疫学的予防法：癌組織を同類の動物に接種することによって、同種癌を予防
することができる。例えば動物におけるウイルス性白血病などもその原因ウイルスを用いて予防することができる(ｍｏｒｔｏｎら、１９９１、ｐｒｏｃ. ａｍ. ａｓｓｏｃ. ｃａｎｃｅｒ ｒｅｓ. ２：４９２-４９４)。しかし、この方法は未だ人間に適用されたことはなく、水溶性蛋白質で細胞性免疫を誘発させることは困難である。

２)癌の免疫学的治療法：
‐特異的能動的免疫療法(Ａｃｔｉｖｅ ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｉｍｍｕｎｉｚａｔｉｏ
ｎ)
自家癌細胞または同種癌細胞をそのまま、またはＸ線照射やマイトマイシン-Ｃ(ｍｉｔｏｍｙｃｉｎ-Ｃ)などで調整して不活性化させた状態で、癌患者に接種して免疫の特異的癌監視系細胞を活性化することによって、癌組織の障害を起こす方法である。動物実験では良い成績を収めた例が多いが、人間では成功した例がない。最近、癌組織の特異抗原の発現を高めるためにコン-Ａ(Ｃｏｎ-Ａ)を付けたり、ノイラミニダーゼ(ｎｅｕｒａｍｉ
ｎｉｄａｓｅ)で処理して隠れた抗原を露出させたり、異種の細胞とハイブリドーマを形
成させるなどの様々な方法が研究されている。樹状細胞(ＤＣ)を使用する方法(Ｓｐｒｉ
ｎｚｌら、Ｃａｎｃｅｒ Ｔｒｅａｔ Ｒｅｖ. ２００１ Ａｕｇ；２７(４):２４７-５５)、またはＤＮＡワクチン形態の多様な治療剤(Ｐａｎｔｕｃｋら、Ｉｎｔ Ｊ Ｕｒｏｌ. ２００１ Ｊｕｌ；８(７):Ｓ１-４)が開発されているが、まだ安全性と効果に限界
がある。

‐非特異的免疫療法
現在、この免疫方法が最も脚光を浴びつつあり、ほとんどの種類の癌治療に単独でまたは化学療法剤と併用して用いられている。非特異的な免疫療法とは、文字通り癌の種類に拘わらないという意味であり、今までその作用メカニズムに関する様々な学説が提示されている。まだ研究は進行中であるが、かかる非特異的免疫療法は、網状内皮系細胞、特にリンパ球の活動を刺激し、いわゆる免疫監視機構にその作用点があると考えられる。実際の臨床に用いられる主な物質としてコリネバクテリアがあり、ピシバニール(ＯＫ-４３２)は比較的昔から韓国に紹介され、多くの患者に既に使用されてきた物質である。これは
主に日本で研究され、日本の製薬会社が販売し始めた物質であり、日本と韓国または東南アジアの一部で市販されている。この系統の物質の癌に対する常用の歴史はかなり長く、
既に１９６８年ドイツのＢｕｓｈ Ｆｅｈｌｅｉｓｏｎらは、丹毒を患う患者に発生した癌の進行が中断されたり、または既に存在した癌が少なくなるという現象を見つけた。１８９１年米国シカゴの外科医コーリーは、いわゆるコーリーの混合トキシンというものを作製し、多数の癌患者に使用して相当数の患者に効力を発揮したと発表した。コーリーの混合トキシンは、連鎖状球菌を培養した後、その培地から抽出した物質からなっている。

‐ＢＣＧ(または結核菌)とその連関物質
ＢＣＧ生菌:１９６０年代に米国のオールドとフランスのマースは、ＢＣＧを接種する
ことによって動物の癌が治せることを発表し、続いて１９７０年米国のモートンは、人間の黒色癌腫（melanoma）の治療にＢＣＧを接種することによって良い効果が出たと報告した。その結果、非特異性免疫療法剤としてＢＣＧとそれに関連した物質の広範な使用が始まった。ＢＣＧによる免疫応答増強効果を期待するためには、多量のＢＣＧ接種が要求され、皮下に接種したり、癌組織部位に直接接種する。また、経口投与方法もあるが、新生児の時期に既にＢＣＧを接種され、その後社会生活中に結核菌と接触した人には、そうした経口投与の方式はその効果が得られ難い(なぜなら、ＢＣＧや結核菌から免疫が生じて
、ツベルクリン陽性となった人には吸収されない)。このようにＢＣＧの生菌を用いる治
療方法では、第一、その使用量が多いということ、ならびに注射部位の潰瘍発生と全身的症状としての悪寒、発熱、その他肝機能の障害などの副作用が避けられない事情があり、第二、副作用を低減させるために少量を用いた場合には、その効果が落ちるか、極めて微弱であるという短所がある。

‐非メチル化（Unmethylated） ＣｐＧ ＤＮＡ
哺乳動物ＤＮＡとバクテリアＤＮＡとの特徴的な差異の一つは、哺乳動物ＤＮＡが多くのＣｐＧ抑制（inhibition）とＣｐＧジヌクレオチドのシトシンに選択的にメチル化されているということである。最近、研究者達は、バクテリアＤＮＡに存在するＣｐＧモチーフがポリクローナルＢ細胞を速やかに活性化させてＩｇＭの分泌を促進させること、抗ＩｇＭ抗体により細胞周期が停止させられ、アポトーシスが起こるＢ細胞をバクテリアのＣｐＧモチーフがｃ-ｍｙｃ発現を強力に阻害し、ｍｙｎとｂｌｃ２とｂｃｌ-ＸＬ ｍＲＮＡの発現を増加させてアポトーシスから細胞を保護すると提案した。また、他の研究は、ＣｐＧモチーフがＢ細胞を直接活性化し、短時間にインターロイキン（ＩＬ）-６とＩＬ-１２の分泌を増大させると報告した。米国のＣＰＧ社は、このような性質を用いて、ＣｐＧ配列含有合成オリゴヌクレオチドを用いた免疫補助剤及び喘息治療剤に関する臨床試験を推進している。

前述したように、多様な免疫調節物質を用いた治療剤が開発されているが、実際に人間に適用される方法は、ＢＣＧとＣｐＧぐらいである。ＢＣＧの場合、広範な効果にもかかわらず安全性に問題があり、大量に投与し難く、または血管注射では使用しにくく、ＣｐＧの場合、オリゴヌクレオチド合成により生産コストが高いという問題点があった。

本発明は前記の問題点を解決するとともに、前記の必要性により案出されたものであって、本発明の目的は既存の治療剤に比べて著しく安全であり、経済的かつ有効であり、しかも特異的な免疫反応を誘導する物質を提供することである。

前記の目的を達成するために、本発明はバクテリア由来のＤＮＡ断片及びバクテリア由来の非毒性リポポリサッカライドを含み、免疫を強化し及び調節する組成物を提供する。
本発明の組成物において、前記バクテリア由来ＤＮＡ断片は、その大きさが２.０〜０.５ｋｂであることが望ましく、前記リポポリサッカライドは５０００〜１００００ダルト
ンの範囲内であることが望ましい。

また、本発明の組成物において、バクテリア由来ＤＮＡ断片及びバクテリア由来非毒性リポポリサッカライドの組成は、一般に本発明の効果を奏する最少量のバクテリア由来ＤＮＡ断片及びバクテリア由来非毒性リポポリサッカライドの混合であれば可能であり、特に質量比で５００:１〜１:５００の範囲では用量(ｄｏｓｅ)依存的な効能の増加を示し、毒性がなく、経済性などを考慮して前記の範囲が望ましい。

また、前記二成分の混合は、振盪混合によることが望ましい。
また、本発明の組成物は、免疫補助剤または癌治療剤として有効に用いられ、このような作用は、主にＴヘルパー１タイプの免疫活性化の誘導を通じて表われる。

また、本発明で言及するバクテリアは、大腸菌またはマイコバクテリア（Mycobacterium）であることが望ましく、とりわけ大腸菌であることがさらに望ましく、大腸菌のうち
、Ｅ.ｃｏｌｉ ＥＧ００２１(ＫＣＣＭ-１０３７４)が最も望ましい。

本発明の組成物は、安全性及び細胞免疫の誘導にはＣＩＡ０２によるシナジー効果、免疫強化、特に癌治療のためにはＣＩＡ０５によるシナジー効果を期待することができる。
本発明の発明者は、抗癌補助剤としてバクテリアオリゴヌクレオチドの効果的な生産に成功し、抗癌補助剤としての適切な活性のために修飾（または変形）されたリポポリサッカライドの開発にも成功した。そして、この二種類を組み合せて新たな免疫補助剤ＣＩＡ０７を最終的に開発した。

なお、一般のリポポリサッカライドとＤＮＡとの組み合わせは相乗効果を見せるが、リポポリサッカライドはＴ細胞の独立の抗原として作用するなど、免疫系の多様な個所に作用して多様な反応を見せ、これに対する相乗効果は敗血症のような重大な結果をもたらすかも知れない。

また、本発明の発明者は、健康な人の腸に棲息する大腸菌から、リポポリサッカライド糖鎖の長さが非常に短いリポポリサッカライドを有する菌株(Ｅ.ｃｏｌｉ ＥＧ００２１)を発掘し、この菌株を２００２年５月２日付で韓国西大門区弘済洞３６１-２２１に所在の「韓国微生物保存センター」に寄託番号ＫＣＣＭ１０３７４で寄託し、この菌株からのリポポリサッカライド精製方法を確立した。

免疫活性力価を示す大腸菌ＤＮＡ(ＣＩＡ０２)は、菌株であるＥ. ｃｏｌｉ ＥＧ００２１のゲノムＤＮＡから抽出した。抽出したＤＮＡを断片化(ｆｒａｇｍｅｎｔａｔｉｏ
ｎ)した後、一般的な方法で処理してＣＩＡ０２を得た。

前記方法で得たＣＩＡ０２と修飾（または変形）されたリポポリサッカライド(ＣＩＡ
０５)の混合により、一層強化された効能を示すＣＩＡ０７を作製した。

本発明を以下の実施例によりさらに詳しく説明するが、これらにより限定的に解されるべきでない。

非毒性菌株の発掘
非常に短いリポポリサッカライドを有する変異大腸菌スクリーニング及び発掘
健康な人の腸に住む大腸菌からリポポリサッカライド糖鎖の長さが非常に短いリポポリ
サッカライドを有する菌株(Ｅ.ｃｏｌｉ ＥＧ００２１)を発掘し、該菌株からのリポポ
リサッカライドの精製方法を確立した。

健康な成人男性の腸から得た大腸菌の単一コロニーを液体培養して、実験動物であるＢａｌｂ/Ｃマウスに繰り返し注入して選別する過程を５回繰り返した。その際５０種の菌
株を選別し、選別された５０種の菌株はプレートから一つのコロニーを取って０.９％生
理食塩水４ｍｌに溶解した後、エッペンドルフチューブに１ｍｌ移してＤＮａｓｅ Ｉを２μｌで処置し、３７℃のインキュベータで1時間反応させた。ＤＮａｓｅ Ｉ処理が終
了した菌液は、ＲＮａｓｅ（１０ｍｇ/ｍｌ）を５０μｌ処理した後、３７℃のインキュ
ベータで１時間反応させた。その後、２０ｍｇ/ｍｌのプロテイナーゼＫを１００μｌ入
れた後、３７℃で一晩反応させた。

このような過程を経て得た各菌株のＬＰＳを、ＧＭ-ＣＳＦで分化させたヒトリンパ球
細胞株に処理した後、ＴＮＦ-α分泌を測定して最低値を示す菌種を選択し(表１)、電気
泳動法によりリポポリサッカライドの分子量を確認した。この弱毒化菌株は、形態学的にも菌自体の特性は全く変化することなかった。但しリポポリサッカライドを分離して電気泳動で確認した結果、５万〜１０万の分子量を有するリポポリサッカライドの「ラダー(
ｌａｄｄｅｒ)」がなく、５千〜１万の分子量を有するリポポリサッカライドを主に生産
することを確認した(図３)。そこでこの菌株をＥＧ００２１と命名した。

大腸菌ＤＮＡの製造方法
大腸菌染色体の精製
Ｅ.ｃｏｌｉ ＥＧ００２１を３７℃、ＴＳＢ(Ｔｒｉｐｔｉｃ ｓｏｙ ｂｒｏｔｈ；Ｄｉｆｃｏ)３０ｇ/ｌの培地で１０時間振盪培養した。

１０Ｌ培養後、８０００Ｇで遠心分離して得た細胞1５０ｇを３００ｍｌＴＥ(１０ｍＭ
Ｔｒｉｓ、ｐＨ８.０、２５ｍＭ ＥＤＴＡ)の緩衝溶液で洗浄し遠心分離した後、遠心分離して得た菌体１５０ｇを７５０ｍＬの分解溶液(１０ｍＭ Ｔｒｉｓ(ｐＨ８.０)、２５ｍＭ ＥＤＴＡ. １００ｇ/ｍＬ Ｌｙｓｏｚｙｍｅ)に溶かして３７℃培養器で１時間処理した。

処理後、プロテイナーゼＫ(Ｓｉｇｍａ)を最終１００ｇ/ｍｌとなるように添加した後
、５０℃培養器で１２時間処理した。
フェノール/クロロホルム/イソアミルアルコール(２５：２４：１)と１：１に混ぜて水層を回収する過程を３回繰り返した。

このようにして得た大腸菌染色体は、エタノールを用いて沈澱させて得た。
精製した大腸菌ＤＮＡの濃度は、滅菌蒸留水で希釈した後ＵＶ分光器の波長２６０ｎｍ、２８０ｎｍで測定した。

測定値に対して濃度測定は、下記のようである。
二本鎖ＤＮＡの濃度(μｇ/ｍｌ)＝ＯＤ２６０ｎｍ×希釈倍数×５０
一本鎖ＤＮＡの濃度(μｇ/ｍｌ)＝ＯＤ２６０ｎｍ×希釈倍数×４０
ＯＤ２６０ｎｍ/ＯＤ２８０ｎｍ＝１.７〜１.８である場合に使用した。
染色体の破砕
精製された染色体をＴＥ緩衝溶液に０.５ｍｇ/ｍｌとなるように溶かしてガラスビーカーで超音波破砕した。

超音波破砕機は、Ｓｏｎｉｃｓ社の５００ｗａｔｔ ｓｏｎｉｃａｔｉｏｎ ＶＣＸ５００を用い、チップは６３０-０２２０(ｔｉｐ ｄｉａｍｅｔｅｒ：１/２"(１３ｍｍ))
を用いて、一回に２０ｍｌずつ行った。

なお、最適の効能を示す大腸菌ＤＮＡの大きさを見出すために超音波粉砕機を用いて大腸菌の全体染色体を２００００Ｊで処理して時間依存的に切断してサイズ毎に分離した(
図１)。大腸菌ＤＮＡは、その大きさによって破砕前の全体ＤＮＡ(Ｉｎｔａｃｔ、１０ｋｂ以上)、２.０〜０.５ｋｂ、０.５〜０.１ｋｂ、そして０.１ｋｂ以下に分けた。

大きさによって分けられた大腸菌ＤＮＡの各々の免疫増強効果を確認するために、マウスでの免疫補助剤としての効能を確認した(図２)。ＨＥＬ(Ｓｉｇｍａ)５０μｇを抗原として、各大腸菌ＤＮＡ５０μｇをアジュバンド(ａｄｊｕｖａｎｔ)として、ＩＣＲマウス(雄、4週齢、２０ｇ)腹腔内に０.１ｍｌずつ一週間間隔で２回投与した。最終投与して７日後、全血を採取して血清を分離し、血清内の抗体値をＨＥＬを抗原としてＥＬＩＳＡ法で確認した(図２ａ)。

分析した結果、２.０〜０.５ｋｂの間の大きさが最も高い抗体値を示し、その後反復実験を通じて約１ｋｂの大きさの大腸菌ＤＮＡが最適の効果があることを確認した。
血清内抗体のサブクラスを同一のＥＬＩＳＡ法を用いて、体液免疫及び細胞免疫効果を確認した(図２ｂ、２ｃ)。

前記結果によって決定された、大きさ１ｋｂの大腸菌ＤＮＡを生産するための粉砕条件は、パルスで２００００Ｊ、７分間であった。

大腸菌ＤＮＡからエンドトキシン除去及び純度の確認
エンドトキシン(ｅｎｄｏｔｏｘｉｎ)の除去
破砕後のＤＮＡをクロロホルムで４℃、１２時間処理した後、３倍用量のエタノールを添加して沈澱物を得た。得られた沈澱物にＴｒｉｔｏｎ Ｘ-１１４(Ｓｉｇｍａ)を最終
濃度が０.５％となるように添加した後、４℃、４時間処理してから、３７℃で５分間加
温した後、フェノール/クロロホルム/イソアミルアルコール(２５：２４：１)と１：１で混合して水層を回収した。得られた大腸菌ＤＮＡはエタノールを用いて沈澱させた後、大腸菌ＤＮＡを発熱物質(ｐｙｒｏｇｅｎ)のない水に溶かした。

エンドトキシンを除去したＤＮＡは、ＬＡＬ(Ｌｉｍｕｌｕｓ Ａｍｅｂｏｃｙｔｅ
Ｌｙｓａｔｅ)キット(Ｂｉｏ Ｗｈｉｔｔａｋｅｒ ＱＣＬ-１０００)を用いる分析をして残存エンドトキシンを確認した。

表１は、前記の方法に従ってエンドトキシンを除去した後、精製大腸菌ＤＮＡ(ＣＩＡ
０２)のエンドトキシン値と収率を示す。

残留有機溶媒量は、ＧＣ/ＭＳＤ(ｇａｓ ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ/ｍａｓｓ
ｓｅｌｅｃｔｅｄ ｄｅｔｅｃｔｏｒ)を用いて測定した。使用した機器は、ＨＰ-５８９０Ａ/ＨＰ-５８７０Ｂであり、カラムは５０ｍ.ｕｌｔｒａ-１、ＳＩＭ(Ｓｅｌｅｃｔｅ
ｄ Ｉｏｎ Ｍｏｎｉｔｏｒｉｎｇ)でエタノール、アセトン、クロロホルム、フェノー
ルを測定した(表２)。

Ｂｒａｄ-Ｆｏｒｄ法を用いて大腸菌ＤＮＡｍｇ当りの蛋白質混入を確認し、純度９
９％以上の水準を維持した。

変異大腸菌からリポポリサッカライド(ＣＩＡ０４)の精製
変異大腸菌からリポポリサッカライドの精製
ＤＮＡ分離と同様の方法で大腸菌を用意した。

用意した菌体に２倍容量のエタノールをよく混ぜた後、４０００ｇで遠心分離して沈澱
物を得た後、得られた沈澱物に１.５倍容量のアセトンを加えてよく混ぜた後４０００ｇ
で遠心分離した。得た沈澱物に同量のエチルエーテルを加えてよく混ぜた後、４０００ｇで遠心分離した。遠心分離して得た細胞ペレットを、アルミニウムフォイルで覆って穴をあけ乾燥した。乾燥菌体の重量を測定した後、乾燥重量１ｇ当り７.５ｍｌずつ抽出混合
液(９０％フェノール：クロロホルム：石油(Ｐｅｔｒｏｌｅｕｍ)エーテル＝２：５：８)を添加した。

得られた溶液をガラス遠心管に分けて、２５℃、３０００ｒｐｍ(１２００ｇ)、２０分間遠心分離して得た上層液をフード（hood）で１２時間放置して沈殿させた後、ガラス遠心管に分け、２５℃、３０００ｒｐｍ(１２００ｇ)、２０分間遠心分離してリポポリサッカライドをエチルエーテルに溶かした。その後リポポリサッカライドをエッペンドルフチューブに移した後フードで乾燥させ、化学天秤を用いて乾燥重量を測定した後、エタノールを添加して使用直前まで保管した。

エタノール中に保管された精製大腸菌リポポリサッカライドは、完全にエタノールを除去した後、リポポリサッカライド・スタンダード(Ｌｓｉｔ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｌ
ａｂ.)を用いてリポポリサッカライド内におけるＫＤＯ(２-Ｋｅｔｏ-３-ｄｅｏｘｙｏｃｔｏｎａｔｅ)の量を測定した後、スタンダードから計算して濃度を測定した後、ＳＤＳ-ＰＡＧＥでサイズによって分離し、銀染色で確認した(図３)。リポポリサッカライドの大きさは、約５０００〜１００００ほどであり、一般的な大腸菌リポポリサッカライドに比べて非常に小さなサイズであることを確認した。

変異大腸菌から精製したリポポリサッカライドの毒性除去
リポポリサッカライドのリピドＡ分解による毒性の除去
精製した大腸菌リポポリサッカライドを３ｍｇ/ｍｌ濃度に希釈した後、０.２Ｎ ＮａＯＨを１：１容量比で混ぜた後、６０℃で10分毎に一回ずつ振盪しながら１４０分間脱アシル化させた。

０.２Ｎ ＮａＯＨ当初量の約１/５ほどの１Ｎアセト酸を入れてｐＨ７.０に滴定した
。
ｐＨ滴定後、エタノール沈澱非毒性リポポリサッカライドを得た。

非毒性リポポリサッカライドはＫＤＯ方法でその濃度を測定した後、ＳＤＳ-ＰＡＧＥ
で処理前リポポリサッカライドに比べて、サイズの変化を銀染色により確認した。
染色の結果、アルカリ処理によりリポポリサッカライドのリピドＡが分解されて、処理前のリポポリサッカライドに比べてサイズが小さくなったことを確認した(図４)。
非毒性リポポリサッカライドの毒性除去の確認
非毒性リポポリサッカライドの安全性試験のために、各々炎症性(Ｉｎｆｌａｍｍａｔ
ｏｒｙ)蛋白質の分泌実験、発熱性実験、異常毒性実験を行った。

−炎症性蛋白質分泌試験
精製リポポリサッカライドを対照群として、ＴＨＰ-１(Ａｃｕｔｅ ｍｏｎｏｃｙｔｉｃ ｌｅｕｋｅｍｉａ)に非毒性リポポリサッカライドを高濃度から低濃度まで処理した
後、分泌されるＴＮＦ-αの量を測定した。

対照群である精製リポポリサッカライドがリポポリサッカライド１μｇ当り５ｐｇのＴＮＦ-αを分泌するのに対し、非毒性リポポリサッカライドは非毒性リポポリサッカライ
ド１μｇ当り０.１ｐｇのＴＮＦ-αを分泌し、毒性により誘発される炎症反応が５０倍ほど低減されたことが示された。また、大腸菌ＤＮＡでは、分泌されるＴＮＦ-αの量が１
００ｆｇ未満であり、非毒性リポポリサッカライドは極めて安全な物質であることを示している(図５)。

-異常毒性を否定する試験
二種類以上の齧歯類に試料を大用量で投与した後、体重変化を観察した。
Ａ. モルモット（ｇｕｉｎｅａ ｐｉｇ）試験
体重約３５０ｇのｇｕｉｎｅａ ｐｉｇを使用し、使用前５日以上観察したとき異常がなく、また体重が順調に増加していた。試料の量は、別途規定がない限り動物１匹当り５ｍｌを使用した。動物２匹以上を用いて１回腹腔内に注射し、５日以上観察した。

Ｂ．マウス試験
生後約５週のマウスを使用し、使用前５日以上観察したとき異常がなく、また体重が順調に増加していた。動物２匹以上を用いて１回腹腔内に注射し、７日以上観察した。

観察期間中、何れの動物でも異常を示さなかったとき、試料はこの試験に適合するものとした。実験の結果、試料の注射後に体重の異常な変化が観察されなかった(図６ａ)。
-発熱性試験
３匹のウサギにワクチンを注射した後、直腸体温の変化を観察した。ウサギの耳静脈にウサギ体重１ｋｇ当り、薬物濃度及び量を０．２μｇ/１ｍｌとして注入した後、直腸内
に体温計を挿入して異常な体温の変化を測定した。

ウサギは、体重１．５ｋｇ超のものを用いた。試験に用いたウサギを再使用する場合には、３日間以上経過してから用いた。体温測定は、０.１℃まで測定できる装置を用いた
。注射器と注射針は、予め２５０℃で３０分以上加熱滅菌したものを用いた。動物は、使用１６時間前から試験が終了するまで水以外の食餌は与えなかった。動物を固定するときは、できるだけ拘束の度が過ぎないようにした。

体温測定は、測温部分を６０〜９０ｍｍの範囲内で一定の深さで直腸に挿入し、必要な時間を置いた後観察した。注射前にも動物の体温を測定し、これを対照体温とした。対照体温を測定した後約１５分以内に、予め約３７℃で加温した試料を耳静脈内に注射した。注射後３時間、少なくとも1時間毎に体温を測定した。この測定体温値と対照体温値との
差を求め、これを差体温とした。その差体温の最大値をこの試験動物の発熱反応とした。ここでは動物３匹のサンプルを検討した。

３匹の反応の合計が１.３℃以下である場合の発熱性物質（ピロゲン）試験は陰性、か
つ２.５℃以上である場合の発熱性物質試験は陽性とした。試験は３回実施し、発熱性物
質試験が陰性であるときは該試験に適するとした。

その結果は、下記の表４のようである。

大腸菌破砕ＤＮＡ(ＣＩＡ０２)、非毒性リポポリサッカライド(ＣＩＡ０５)の組み合わせ及び力価確認
大腸菌ＤＮＡ(ＣＩＡ０２)及び非毒性リポポリサッカライド(ＣＩＡ０５)の組み合わせ
それぞれ基準に合わせて生産した二種類の物質、即ち大腸菌ＤＮＡ(ＣＩＡ０２)、非毒性リポポリサッカライド(ＣＩＡ０５)を混合して最適の混合方法と用量を決定した。

混合方法による効果の差異を確認するために、まず抗原に他の物質との結合のための２種類の化学物質(ＭＰＢＨ、ＳＰＢ)を処理した。ＣＩＡ０２とＣＩＡ０５を、修飾された抗原に結合させ、他の方法としてＣＩＡ０２、ＣＩＡ０５、および抗原を混ぜた後、振盪混合した。同時に、用量毎にそれぞれ免疫増強作用を分析した。マウスでの免疫補助剤としての効果を確認するために、ＨＥＬ(Ｓｉｇｍａ)５０μｇを抗原として、ＩＣＲマウス(雄、４週齢、２０ｇ)の腹腔内に０.１ｍｌずつ一週間間隔で２回投与した。最終投与し
て７日後、全血を採取して血清を分離した。血清における抗体値をＨＥＬを抗原として用いてＥＬＩＳＡ法で確認した(図７ａ)。

ＬＰＳ(ＣＩＡ０４)０.５、及び１μｇを対照群とし、これに対し実験群は先ず抗原と
ＣＩＡ０５ ０.５μｇ、及びＣＩＡ０２ ５０μｇを振盪混合した群と、抗原とＣＩＡ
０５ １μｇ、及び ＣＩＡ０２ ５０μｇを振盪混合した群と、修飾（または変形）さ
れた抗原にＣＩＡ０５ ０.５μｇ、及びＣＩＡ０２ ５０μｇを振盪混合した群と、修
飾（または変形）された抗原にＣＩＡ０５ １μｇ、ＣＩＡ０２ ５０μｇを結合した群とに分けた。

実験分析の結果、ＬＰＳ(ＣＩＡ０４)が最も高い抗体活性値を示したが、既に一連の実験を通じて毒性による副作用のため抗癌補助剤としては適しないと判明された(図７ａ)。まず、結合方式による差は殆どなかったが、同一用量で振盪混合する方法が少し優れていた。特に、免疫グロブリンのサブクラスのうちで細胞免疫に関連したＩｇＧ２ａでその差がさらに明らかであり、これは抗癌治療により有効であることを示す(図７ｂ)。また、方法と収率においても、振盪混合する方法がより簡便でかつ処理過程中の損失がないため、混合方法は振盪混合する方法を採択した。用量はＣＩＡ０５の用量によって差異を示すことからＣＩＡ０５量に基いて決定した。０.５μｇと１μｇのうち１μｇである場合に優
れた効果を示すため、用量は１μｇで決定した。

血清抗体のサブクラスにおける体液免疫及び細胞免疫の効果を同様のＥＬＩＳＡ法を用
いて確認した(図７ｂ、７ｃ)。
既存の免疫補助剤との比較試験
決定された製造方法と用量による免疫増強効能を評価するために、これまで使用されて来た免疫補助剤の効能との比較実験をした(図８ａ)。

ＣＩＡ０７の免疫補助剤としての利用可能性を、動物実験を通じて分析した。 ＨＥＬ(Ｓｉｇｍａ Ｌ-６８７６)５０μｇを抗原として、ＩＣＲマウス(雄、４週齢、２０ｇ)の腹腔内に０.１ｍｌずつ一週間間隔で２回投与した。最終投与して７日後、全血を採取し
て血清を分離し、血清の抗体値はＨＥＬを抗原としてＥＬＩＳＡ法で分析した。

ＣＩＡ０７の抗体力価は、既存の動物実験用免疫補助剤であるＣＦＡ(完全フロイント
アジュバント；ｃｏｍｐｌｅｔｅ Ｆｒｅｕｎｄ’s ａｄｊｕｖａｎｔ)と、人間に唯一使用することが公認されたＡｌｕｍ(ａｌｕｍｉｎｉｕｍ ｈｙｄｒｏｘｉｄｅ ｇｅｌ)と同等の効果を示すことが確認された(図８ａ)。しかし、イソタイプスイッチング（isotype switching）を分析した結果、既存の免疫補助剤であるＣＦＡ、ＡｌｕｍなどはＩｇ
Ｇ１の抗体が主に産生されるＴｈ(Ｔ ヘルパー)２タイプの免疫活性化がなされるのに対して、ＣＩＡ０７による免疫増強時には、ＩｇＧ１よりもむしろＩｇＧ２ａの抗体が特異的に多く産生されるＴｈ(Ｔ ヘルパー)１タイプの免疫活性化が誘導されることを確認した(図８ｂ、８ｃ)。

同時に、ＣＩＡ０２の用量を確認するために、各々２５μｇ、５０μｇのＣＩＡ０２にＣＩＡ０５ １μｇを混合して分析した結果、用量にしたがって抗体活性値が変化した。結論としてＣＩＡ０２ ５０μｇ、及びＣＩＡ０５ １μｇを最適の用量として決定した。
全血分析を用いたＣＩＡ力価の確認試験
坑凝固剤としてヘパリンが入っている真空チューブに、健康な成人男性から静脈血を無菌的に採取した。採取した全血は、ＲＰＭＩ １６４０培養培地(２ｍＭ Ｌ-グルタミン、１ｍＭ ピルビン酸ナトリウム、８０μｇ/ｍｌのｇｅｎｔａｍｙｃｉｎ)と１：１で混ぜた。培地と混ぜた全血１ｍｌに、２０μｌのＣＩＡ０７ (ＣＩＡ０２ ５０μｇ＋ＣＩＡ０５ １μｇまたは５００ｎｇ、１００ｎｇ)、またはＨＢＳＳ、２０μｌを添加した
後に、３７℃、５％ＣＯ₂培養器で２４時間培養した。その後、培養上層液を収集して、
ＩＦＮ-γ(Ｒ＆Ｄシステム、２１０-ＴＡ-０１０)及びＩＬ-１２ ｐ７０(Ｒ＆Ｄシステ
ム、２１９-ＩＬ-００５)の分泌量を市販のＥＬＩＳＡキットを用いて測定した。その結
果が図９に示されている。

同様の方法で培地と混ぜた全血１ｍｌに、２０μｌのＣＩＡ０７ (ＣＩＡ０２ ５０μｇ＋ＣＩＡ０５ １μｇ)、ＣＩＡ０２(５０μｇ)、マイコバクテリウムＤＮＡ(５０μｇ)、またはＨＢＳＳ ２０μｌを添加した後にサイトカインの分泌を測定した。

分析の結果、ＣＩＡ０２やＣＩＡ０５を単独で投与したときよりもＣＩＡ０２及びＣＩＡ０５を混合投与したときの方がより相乗的に免疫増強効果が示され、ＣＩＡ０２ ５０μｇ、及びＣＩＡ０５ １μｇの用量のときに最も優れた結果を示した。また、マイコバクテリウムＤＮＡとの比較実験からもＣＩＡ０７はもちろん、ＣＩＡ０２もまたマイコバクテリウムＤＮＡに比べて優れた結果を示した。
ルシフェラーゼアッッイ
先ず生細胞を１２ウェルプレートにウェル当り５×１０⁴細胞(１ｍｌ ＤＭＥＭ/１０
％ＦＢＳ)ほど敷き、３７℃、ＣＯ₂インキュベータで２４時間培養した。ＩＬ-１２ ル
シフェラーゼリポータープラスミド (０.２μｇ/ウェル)、ＰＲＬ-ｎｕｌｌ プラスミド(２０ｎｇ/ウェル)を混ぜておき、血清フリーＤＭＥＭ(５０μｌ/ウェル)とトランスフェクション試薬であるＦｕｇｅｎｅ６(１.５μｌ/ウェル、Ｒｏｃｈｅ Ｃａｔ. Ｎｏ. １
８１４ ４４３)とを混ぜたものに、前記の混ぜたプラスミドを入れた後、５分〜１０
分間放置した。混ぜた混合物を培養した生細胞に５２μｌ/ウェルで入れて混合した後、
３７℃、ＣＯ₂インキュベータで２４時間培養した。培養後ＣＩＡ０７(ウェル当りＣＩＡ０２ ２０μｇ＋ＣＩＡ０５ ４００ｎｇ)を該生細胞に処理して３７℃、ＣＯ₂インキュベータで１２時間培養した。ルシフェラーゼアセッイキット(Ｐｒｏｍｅｇａ Ｃａｔ.ｎｏ.Ｅ１５００)を用いてルシフェラーゼ反応をさせた後、照度計（luminometer）を用い
てルシフェラーゼ活性を測定した。

ＣＩＡ０７がＩＬ-８及びＩＬ-１２プロモーター活性に及ぼす効果をルシフェラーゼ活性で測定した結果、ＩＬ-８及びＩＬ-１２プロモーターにはＮＦ-ｋＢ結合部位が共通し
て存在し、ＲＡＷ２６４.７細胞株でＣＩＡ０７によりＮＦ-ｋＢが活性化されて、プロモーターの活性を増加させることが示された(図１１)。
ＣＩＡの細胞溶解能を用いた抗癌治療効果の測定
ＣＩＡ０７による癌細胞殺傷能は、₅₁Ｃｒ-ｒｅｌｅａｓｅ法で測定した。

５〜８週齢、雄性Ｃ３Ｈ/ＨｅＮマウスの足裏に抗原単独または抗原とＣＩＡ０７を皮
下投与した。
細胞株培養のための基本培地としては、ＲＰＭＩ-１６４０(１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、１００ｕｎｉｔｓ/ｍｌ ペニシリン、１００μｇ/ｍｌ ストレプトマイシン、３００μｇ/ｍｌ グルタミン；Ｇｉｂｃｏ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｇｒａｎｄ Ｉｓｌａｎ
ｄ、ＮＹ)を用い、５６℃で３０分間加熱して非活性化させた１０％ウシ胎児血清(ＦＢＳ)(Ｇｉｂｃｏ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｇｒａｎｄ Ｉｓｌａｎｄ、ＮＹ)を基本培
地に添加した培地を用いた。ＬＡＫ細胞の活性度及び癌細胞介在性殺傷能を測定するために、Ｓａｒｃｏｍａ１８０とマウス膀胱癌細胞株であるＭＢＴ-２を標的細胞として用い
た。

反応細胞株を調製するために、実験群のマウスを頚椎脱臼法で殺した後に脾臓を無菌的に摘出し、口径１００ミクロンのステンレススチール金網の上で、はさみを用いて混合微細断片を作製した後、リン酸緩衝生理食塩水を加えながらガラス棒で軽く粉砕して金網を通過させて組織残屑を除去した。顕微鏡下で単細胞浮遊液であることを確認した後、細胞を基本培地で１回洗浄した後、３７℃で０.８４％塩化アンモニウム溶液に５分間浮遊さ
せて赤血球を溶解させた。さらに、上記細胞を基本培地で２回洗浄した後、完全培地に浮遊させてから培養フラスコに分株して、３７℃、５％ＣＯ₂恒温恒湿器で１時間培養した
。その後フラスコに付着されない細胞を採取して、トリパンブルー色素排除法で生存細胞を計数した後、完全培地で５×１０⁶細胞/ｍｌ密度の細胞浮遊液を作製した。

標的細胞株を培養した後、細胞数を計数した。１０⁶細胞が得られ３００ｇ、３分間遠
心分離した後、沈降した細胞が損傷しないよう注意してパスツールピペットにて上層液を０.２〜０.３ｍｌのみ残して除去した。１００ Ｃｉ Ｎａ_{2 51}ＣｒＯ₄(１ｍｌ Ｃｉ/ｍｌ、ＮＥＺ ０３０Ｓ、ＮＥＮ、米国)を加えて、３７℃振盪恒温槽で１時間ラベル化
させた後、基本培地で３回洗浄し、トリパンブルー色素排除法で生存細胞を計数した。ラベル化された標的細胞を５×１０₄細胞/ｍｌとなるように完全培地に再浮遊させた。

丸底の９６ウェル微細滴定板（タイタープレート）に、ウェル当り５×１０³個の細胞
が入るように前記のラベル化標的細胞を０.１ｍｌずつ分株した。これに上記脾臓細胞を
反応細胞として、反応細胞：標的細胞の割合が１００：１となるように０.１ｍｌ加えた
。３７℃、５％ＣＯ₂恒温恒湿器で４時間培養した。各実験当り３個以上のウェルを作り
、４時間培養が終了した後、５００ｇで１５分間遠心分離し各ウェルから上層液０.１ｍ
ｌを取って、ガンマカウンター(Ｐａｃｋａｒｄ、米国)で放射能を測定した。このとき、最大発光を誘発するために対照ウェルに５％ Ｔｒｉｒｏｎ Ｘ-１００(Ｓｉｇｍａ、米
国)を０.１ｍｌ加え、自然発光を測定するためにラベル化された細胞のみを同一用量の完全培地で培養させた。細胞毒性（cytotoxicity）は、次の式により算出した。

細胞毒性(％)＝(ＥＲ-ＳＲ/ＭＲ-ＳＲ) × １００
ＥＲ：実験群の平均カウント(ｃｐｍ)
ＳＲ：培地のみ培養した標的細胞の平均カウント(ｃｐｍ)
ＭＲ：５％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ-１００で処理した標的細胞の平均カウン
ト(ｃｐｍ)
実験結果は表５に示すとおりである。ＬＡＫ細胞株では、非免疫細胞に比べて８倍の細胞溶解増加能を見せ、ＢＣＧ投与群より１.５倍優れた結果を示した。また、ＭＢＴ-２細胞株では、非免疫細胞に比べて５倍の細胞溶解増加能を見せた。これは各種副作用が報告されているＢＣＧに代わる抗癌治療剤としてのＣＩＡ０７の可能性を示すことと認められる

マウスでの癌抑制能の確認実験
５〜８週齢、雄性Ｃ３Ｈ／ＨｅＪマウスの二ヵ所部位(左側肩、右側大腿部)に５×１０⁵ＭＢＴ２細胞(Ｃ３Ｈ／Ｈｅ由来の膀胱癌細胞株)を皮下注射した。単一の癌組織を生成
させるために、注射の際に複数回刺さないよう注意しなければならない。なお、用いたマウスは実験群当り６〜１０匹である。腫瘍細胞投与の翌日から一週間は毎日１回ずつ、そして次の２週間は二日に一回ずつＣＩＡ０７ １００μｌ(ＣＩＡ０２ ５０μｇ＋ＣＩ
Ａ０５ ５００ｎｇ)あるいは生理食塩水を細胞株移植部位に投与する。皮下組織に形成
された癌の大きさは、一週間に３回ずつカリパスを用いて測定した。実験結果は図１２に示すとおりであり、生理食塩水投与群に比べてＣＩＡ０７投与群での癌組織の成長が抑制されたことを確認することができた。

本発明の二種類の大腸菌由来物質(ＣＩＡ０２、ＣＩＡ０５)を混合した抗癌治療剤(Ｃ
ＩＡ０７)は、既存の治療剤に比べて著しく安全で、生産過程の単純化により生産コスト
を最少化し、また二種類の物質の混合によりさらに有効かつ特異的である免疫反応を誘導することができるという特徴がある。

また、本発明は精製ＤＮＡの物理的加工によりＣｐＧより安価で、ＢＣＧ以上の薬効を示す。
従って、本発明の大腸菌由来抗癌治療剤(ＣＩＡ０７)は、抗癌治療剤及び免疫補助剤として産業的意味が非常に大きいことが認められる。

図１は、本発明組成物で最適の効能を示す大腸菌ＤＮＡのサイズを見出すために、超音波粉砕機を用いて大腸菌の全染色体ＤＮＡを切断し、各分画毎に分離したことを示す写真である。写真において、レーン１は全体(ｉｎｔａｃｔ)、レーン２は１ｋｂ以上、レーン３は２〜０．５ｋｂ、レーン４は０．５ｋｂ未満の大きさのＤＮＡを示す。 図２ａないし図２ｃは、約２〜０．５ｋｂの大腸菌ＤＮＡ(ＣＩＡ０２)の最適免疫増加効果を示すグラフである。 図３は、大腸菌細胞外膜から分離されたリポポリサッカライド分離産物を示す写真である。この写真は、５回バッチの各リポポリサッカライド分離産物を示す。 図４は、分離した大腸菌リポポリサッカライドをアルカリ処理し、リピドＡを分解してその大きさが変化したことを表し、これにより毒性を除去することを示す写真である。写真において、レーン１はリポポリサッカライド分離産物(ＣＩＡ０４)、レーン２はアルカリ処理非毒性リポポリサッカライド(ＣＩＡ０５)を示す。 図５は、非毒性リポポリサッカライド(ＣＩＡ０５)で処理したＴＨＰ-１細胞株におけるＴＮＦ-α分泌の減少を示すグラフである。 図６ａは、マウスでの非毒性リポポリサッカライド(ＣＩＡ０５)の異常毒性試験結果を示すグラフである。 図６ｂは、ｇｕｉｎｅａ ｐｉｇ(モルモット)での非毒性リポポリサッカライド(ＣＩＡ０５)の異常毒性試験結果を示すグラフである。 図７ａないし図７ｃは、大腸菌ＤＮＡ(ＣＩＡ０２)と非毒性リポポリサッカライド(ＣＩＡ０５)の結合方法及び濃度による免疫増加効果を示すグラフである。 図８ａないし図８ｃは、大腸菌由来産物を用いた抗癌治療剤(ＣＩＡ０７)と他免疫補助剤との免疫増加効果を比べた結果を示すグラフである。 図９は、大腸菌由来産物を用いた抗癌治療剤(ＣＩＡ０７)の処理による、ヒト全血でのサイトカイン分泌を示すグラフである。 図１０ａ及び図１０ｂは、大腸菌由来産物を用いた抗癌治療剤(ＣＩＡ０７)及びマイコバクテリウム（Mycobacterim）ＤＮＡの処理による、ヒト全血におけるサイトカインの分泌量を比べて示したグラフである。“Control”は、対照である。 図１１ａ及び図１１ｂは、大腸菌由来産物を用いた抗癌治療剤(ＣＩＡ０７)を生細胞に処理した後、ＮＦ-ｋＢが活性化されてプロモーターの活性を増加させることを示すグラフである。 図１２は、マウス膀胱癌細胞株(ＭＢＴ２)を移植したＣ３Ｈ/ＨｅＪマウスに、大腸菌由来産物を用いた抗癌治療剤(ＣＩＡ０７)を移植部位に投与したとき、癌組織の成長を抑制することを示すグラフである。

Claims (11)

1. (a)バクテリア由来ＤＮＡ断片と、
   (b)バクテリア由来非毒性リポポリサッカライドと
   を含む免疫強化及び調節組成物。
2. 前記バクテリア由来ＤＮＡ断片は、その大きさが２.０〜０.５ｋｂであることを特徴とする請求項１に記載の免疫強化及び調節組成物。
3. 前記リポポリサッカライドは、５０００〜１００００ダルトンの範囲内であることを特徴とする請求項１に記載の免疫強化及び調節組成物。
4. 前記の(ａ)と(ｂ)との組成は、質量比で５００：１〜１：５００であることを特徴とする請求項１に記載の免疫強化及び調節組成物。
5. 前記の(ａ)と(ｂ)との混合は、振盪混合によることを特徴とする請求項１に記載の免疫強化及び調節組成物。
6. 前記組成物は、免疫補助剤として有用であることを特徴とする請求項１に記載の免疫強化及び調節組成物。
7. 前記組成物は、癌治療剤として有用であることを特徴とする請求項１に記載の免疫強化及び調節組成物。
8. 前記組成物は、Ｔヘルパー１タイプの免疫活性化を誘導することを特徴とする請求項１に記載の免疫強化及び調節組成物。
9. 前記バクテリアは、大腸菌またはマイコバクテリアであることを特徴とする請求項１に記載の免疫強化及び調節組成物。
10. 前記バクテリアは、大腸菌であることを特徴とする請求項１または９に記載の免疫強化及び調節組成物。
11. 前記大腸菌の菌株は、Ｅ．ｃｏｌｉ ＥＧ００２１(ＫＣＣＭ-１０３７４)であること
    を特徴とする請求項１０に記載の免疫強化及び調節組成物。
    
    

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