JP2006505793A - 膠芽腫の進行に関連する経路を試験するための方法及び材料 - Google Patents

Abstract

本明細書に開示された発明は、癌等の病理学において制御されていない生化学的な経路の試験及び／又は定量化のための方法及びこのような方法を実施するのに適合した試薬及びキットを提供する。

Description

（政府の援助に関する記述）
本発明は、米国国立癌研究所／ＮＩＨ（米国国立衛生研究所）のグラントＵ０１ ＣＡ８８１２７号及びＮＩＨの神経疾患卒中研究部門（National Institute of Neurological Disorders and Stroke）のグラントＫ０８ＮＳ４３１４７−０１号に基づいてなされた。政府は本発明について特定の権利を有するものである。

（関連出願）
本出願は、米国特許法第１１９条（ｅ）に基づき、２００２年１１月５日に出願された米国仮特許出願第６０／４２３，７７７号の利益を主張するものであり、その内容は参照として本明細書に取り込まれる。

本発明は、癌等の病理において、制御されていないことが示される生化学的な経路を試験するための方法及びこれらの方法を実行するのに適応した試薬を提供する。

癌は米国における主な死因の２番目にあたり、年間４５０，０００人もの死者を出している。米国人の３人に１人は癌になり、５人に１人は癌で死ぬことになる。癌が起こりうる環境的及び遺伝的な原因のいくつかの同定が実質的に進行している一方で、癌及びそれに関連する疾患や障害を標的とした更なる診断や治療の様相が必要とされている。とりわけ、制御されていない増殖等に関連する病理学的な一連の徴候を同定し治療するための改良された診断及び治療方法の開発を可能にする、癌等の制御されていない細胞増殖に関与する様々な生化学的経路のより深い理解が必要とされる。

癌等の病理で特に興味が持たれている生化学的な経路はＰＩ３Ｋ／Ａｋｔ及びＲａｓ／ＭＡＰＫ経路である。特に、ＰＩ３Ｋ／Ａｋｔ及びＲａｓ／ＭＡＰＫ経路の調節不全（deregulation）は、膠芽腫（ＧＢＭ）を含む（例えばＶｉｖａｎｃｏら、Ｎａｔ Ｒｅｖ Ｃａｎｃｅｒ．２：４８９−５０１，２００２、Ｆｅｌｄｋａｍｐ ｅｔ ａｌ．，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｎｅｕｒｏｏｎｃｏｌｏｇｙ ３５：２２３−２４８，１９９７、Ｍｉｓｃｈｅｌら、Ｂｒａｉｎ Ｐａｔｈｏｌｏｇｙ，Ｊａｎ；１３（１）：５２−６１ ２００３参照）多くの種類の癌で起こるものである（例えばＶｉｖａｎｃｏら、Ｎａｔ Ｒｅｖ Ｃａｎｃｅｒ．２：４８９−５０１．，２００２参照）。構造的に活性化された情報伝達カスケードは生物学的挙動を直接調節するので、癌治療への分子からの新たなアプローチがこれらの経路の阻害に向けられており（例えばＳａｗｙｅｒｓら、Ｃｕｒｒ Ｏｐｉｎ Ｇｅｎｅｔ Ｄｅｖ．１２：１１１−５，２００２、Ｄｒｕｋｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｃｅｌｌ．１：３１−６．， ２００２、Ｋｉｌｉｃ ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．６０：５１４３−５０，２０００、Ｎｅｓｈａｔら、Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ． ９８：１０３１４−９，２００１参照）、患者の生検でこれらを検出することは重大なことである。従来、ウエスタンブロット及びインビトロでのキナーゼアッセイ等の生化学的なアプローチがこれらの経路の活性化を評価するのに必要とされてきた（例えばＮｅｓｈａｔら、Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ．９８：１０３１４−９，２００１、Ｅｒｍｏｉａｎら、Ｃｌｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．８：１１００−６．，２００２参照）。しかしながら、これらの手法はホルマリン固定されパラフィン包埋された患者生検試料等の通常の手順で処理された組織には適していない。これまでのところ、患者の生検材料で経路の活性化を同定するための手段は十分に開発されていなかった。このようなの手段の開発は、これらの経路の活性化が予後兆候の有意性を示すのかの決定、及び、分子を標的とした治療のために患者を分類する上で重要である。

多形性膠芽腫（ＧＢＭ）は、成人において最も一般的な悪性脳腫瘍であり（あらゆる癌のなかで最も致死的な癌の１つ）、本発明のアプローチに非常に適合している。ＧＢＭｓは、結果として生じる情報伝達経路の崩壊を伴う一連の特徴付けられた分子の病変を有している。腫瘍抑制遺伝子ＰＴＥＮはＧＢＭｓの３０−４０％で改変されている（例えばＬｉｕら、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．５７：５２５４−７．，１９９７、Ｓｃｈｍｉｄｔら、Ｊ Ｎｅｕｒｏｐａｔｈｏｌ Ｅｘｐ Ｎｅｕｒｏｌ．５８：１１７０−８３．，１９９９、Ｓｍｉｔｈら、Ｊ Ｎａｔｌ Ｃａｎｃｅｒ Ｉｎｓｔ．９３：１２４６−５６．，２００１参照）。ＰＴＥＮ脂質ホスファターゼの活性はＡｋｔ経路及びその下流の作用因子であるｍＴＯＲ、ＦＫＨＲ、及びＳ６を抑制的に調節するので（例えばＶｉｖａｎｃｏら、Ｎａｔ Ｒｅｖ Ｃａｎｃｅｒ．２：４８９−５０１．，２００２参照）、ＰＴＥＮタンパク質欠失ＧＢＭｓはこの経路の調和された活性化を示す可能性がある。初期のＧＢＭｓ（新たに生じた悪性度ＩＶの腫瘍）は同様に、ＲＡＳ／ＭＡＰＫ及びＰＩ３Ｋ／Ａｋｔ経路の両者を経由して情報伝達を活性化する腫瘍遺伝子ＥＧＦＲ及びその変異体ＥＧＦＲｖＩＩＩを一般に過剰発現する。それ故に、ＥＧＦＲ及びＥＧＦＲｖＩＩＩを発現しているＧＢＭｓはＥＲＫ及びＡｋｔ経路の調和された活性化を示す可能性がある。しかしながら現在までのところ、このような多様な経路間の関係は詳細に示されていない。

研究者らが癌等の病理に関与する多様な遺伝子や経路を同定してきた一方で、制御されていない細胞増殖に必要とされる調節過程の解析を容易にする更なる手段が当該技術分野で求められている。さらに、制御されていない細胞増殖に関与する遺伝子産物がより広範な状況下でどのように相互作用しているのか理解することは、制御されていない増殖に関連する病理学的な一連の徴候を同定し治療するための改良された診断及び治療方法の開発に必要とされる。とりわけ、多形性膠芽腫（ＧＢＭ）を制御している情報伝達で起こる事象を同定する必要性、及び、ＧＢＭの進行又は阻害を評価するために有用なマーカーを同定する必要性は残されたままである。本明細書で開示する方法及び試薬はこの必要性を満足させるものである。

（発明の要約）
ＰＩ３Ｋ／Ａｋｔ経路の制御されていない活性化は多形性膠芽腫（ＧＢＭ）を含む癌で一般に見られる。従って、この経路を評価することは標的とされたキナーゼ阻害剤治療について患者を分類するのに重要である。本明細書の開示は、ＰＩ３Ｋ／Ａｋｔ経路の活性化異常（deregulated activation）に関連する一連のバイオマーカーを同定すると同時に、これらのマーカーを試験するために最適化された方法を提供する。従って、本明細書が提供する開示は、多形性膠芽腫等の癌においてこの経路の試験を可能にする。さらに重要なことには、これらのマーカーを試験するための開示された方法は、ホルマリン固定されパラフィン包埋された生検試料を含む幅広い種類の組織サンプルにおいて有用である。この開示の多様な側面はＣｈｏｅら、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．２００３ Ｊｕｎ １；６３（１１）：２７４２−６に記載されている。

本明細書に開示されるように、多形性膠芽腫等の癌に関連する一連のＰＩ３Ｋ／Ａｋｔ経路のバイオマーカーが、例えばリン酸特異的な抗体等の一連の抗体を用いて試験することが可能である。一般的な方法では、ホルマリン固定されパラフィン包埋された多形性膠芽腫の生検試料に由来する細胞等の哺乳類細胞が、リン酸化されたＳ６（配列番号１）、リン酸化されたｍＴＯＲポリペプチド（配列番号２）、リン酸化されたＦＫＨＲポリペプチド（配列番号３）、リン酸化されたＡＫＴポリペプチド（配列番号４）、リン酸化されたＥＲＫポリペプチド（配列番号８）の存在又はＰＴＥＮポリペプチド（配列番号５）発現レベルの減少について、この細胞を含む組織試料を試験することによって、ＰＩ３Ｋ／Ａｋｔ経路の活性化の証拠について試験可能である。ここで、リン酸化されたＳ６、ｍＴＯＲ、ＦＫＨＲ、ＡＫＴ或いはＥＲＫポリペプチドの存在又はＰＴＥＮポリペプチド発現レベルの減少は膠芽腫の細胞内でＡｋｔ経路が活性化した証拠を提供する。必要に応じて、細胞は、リン酸化されたＳ６ポリペプチド（配列番号１）及びＰＴＥＮポリペプチド（配列番号５）発現レベルの減少等の複数の特徴の存在について試験可能である。本発明の態様は更なる方法の工程、すなわち、ラパマイシン或いはその類似化合物等のｍＴＯＲ阻害剤又はＺＤ−１８３９或いはその類似化合物等のＥＧＦＲ阻害剤の膠芽腫の癌細胞に対する効果を評価するために試験の結果を用いる工程等の膠芽腫を治療するのに使用される可能性のある治療薬を同定及び／又は評価するために試験の結果を用いる工程を包含する。

本発明の好ましい態様は、ＥＧＦＲポリペプチド（配列番号７）阻害剤又はｍＴＯＲポリペプチド（配列番号２）阻害剤に対して応答する可能性がある又は応答性である哺乳類の神経膠腫を同定するための方法であり、その方法はＰＴＥＮポリペプチド（配列番号５）の発現、及び、リン酸化されたＳ６リリボソームポリペプチド（配列番号１）、ＥＧＦＲポリペプチド（配列番号７）、リン酸化されたＡＫＴポリペプチド（配列番号４）及びリン酸化されたＥＲＫポリペプチド（配列番号８）のうち少なくとも１つの発現について腫瘍から得られた試料を試験することを包含する。ここで、対照と比較して試料中でＳ６リリボソームポリペプチドのリン酸化の減少と共にＰＴＥＮポリペプチドの発現の減少は神経膠腫をｍＴＯＲ阻害剤に対して応答する可能性がある又は応答性である腫瘍として同定し、対照と比較して試料中でＳ６リリボソームポリペプチドの正常なリン酸化と共にＰＴＥＮポリペプチドの発現の減少は神経膠腫をｍＴＯＲ阻害剤に対して応答する可能性がない又は非応答性である腫瘍として同定し、ＡＫＴのリン酸化及び／又はＥＲＫのリン酸化の増加と共にＰＴＥＮの正常な発現又は発現の増加及びＥＧＦＲの発現及び／又は活性化の増加は神経膠腫をＥＧＦＲ阻害剤に対して応答する可能性がない及び／又は非応答性である腫瘍として同定する。

本発明の別の態様は哺乳類の神経膠腫又はその細胞を特徴付けるためのキットであり、そのキットはＰＴＥＮ（配列番号５）に結合する抗体及び／又はリン酸化されたＳ６リリボソームポリペプチド（配列番号１）に結合する抗体及び／又はＥＧＦＲ（配列番号７）に結合する抗体及び／又はリン酸化されたＡＫＴ（配列番号４）に結合する抗体及び／又はリン酸化されたＥＲＫ（配列番号８）に結合する抗体を包含する。必要に応じて、当該キットは更にＫｉ−６７ポリペプチド（配列番号９）及び／又はｐ−Ｈ３ヒストンポリペプチド（配列番号１０）及び／又はカスパーゼ−３ポリペプチド（配列番号１１）に結合する抗体を含む。一般的にキットは更に、これらのポリペプチドに対する一次抗体の１つに結合する二次抗体を包含する。必要に応じて、キットは様々なポリペプチドに結合する複数の抗体を包含する。

（発明の詳細な説明）
別の方法で定義されない限り、本明細書で用いられる技術、表記及びその他科学用語の全ての専門用語は本発明が属する分野の当業者に一般に理解される意味を有することを意図する。いくつかの例では一般に理解される意味を持つ専門用語が、明確に及び／又は用意された参照文献によって本明細書で定義される。本明細書にこのような定義を含むことは、当該技術分野で一般的に理解されるものとは必ずしも実質的に相違するものだとは解釈されるべきではない。本明細書で記載されている又は参照されている技術や手順は、一般的によく理解され共通に使用されており、例えばＡｕｓｕｂｅｌら、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｗｉｌｅｙ Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，（１９９５）に記載の幅広く利用される分子クローニング方法論のように当業者に従来からの方法論として使用されている。適切に、商業的に入手できるキット及び試薬の使用を含む手順は、特に記載がない限り、製造者の定義するプロトコール及び／又はパラメーターに従って一般的に実施した。

処理又は治療の目的である「哺乳動物」は、ヒト、及び、イヌ、ウマ、ネコ、ウシ等の家庭及び農園の動物及び動物園、競技用又はペットの動物を含む、哺乳動物に分類される如何なる動物も指す。好ましくは、哺乳動物はヒトである。

「癌」「癌の」又は「悪性の」という用語は、異常な（unregulated）細胞増殖によって一般的に特徴付けられている哺乳動物の病理学的状態を示す又は記述する。癌の例は星状細胞腫、芽細胞腫、癌腫、膠芽腫、白血病、リンパ腫及び肉腫を含むがそれに制限されない。このような癌のより具体的な例は、乳癌、卵巣癌、結腸癌、結腸直腸癌、直腸癌、扁平上皮癌、小細胞肺癌、非小細胞肺癌、ホジキン及び非ホジキンリンパ腫、睾丸癌、食道癌、胃腸癌、腎癌、膵臓癌、膠芽腫、子宮頸癌、神経膠腫、肝臓癌（hepatoma）、膀胱癌、肝細胞癌、子宮内膜癌、唾液腺癌、腎臓癌、肝臓癌（liver cancer）、前立腺癌、外陰癌、甲状腺癌、肝癌（hepatic carcinoma）及び様々なタイプの頭部及び頚部の癌を包含する。

本明細書で用いられる、「増殖阻害」はインビトロ及び／又はインビボでの細胞の増殖阻害を示す。細胞増殖の阻害は当該技術分野で公知の広範な方法によって測定できる。本明細書で用いられる、「増殖阻害剤」とはインビトロ及び／又はインビボで細胞の増殖を阻害する化合物又は組成物を示す。このように、増殖阻害剤はＳ期にある細胞の割合を顕著に減少させる薬剤であってもよい。増殖阻害剤の例は、Ｇ１阻止及びＭ期阻止を誘導する薬剤等の細胞周期の進行を（Ｓ期以外の部位で）遮る薬剤を含む。一般的なＭ期遮断薬は、ツルニチニチソウ（ビンクリスチン及びビンブラスチン ）、ＴＡＸＯＬ（登録商標）及びドキソルビシン、エピルビシン、ダウノルビシン、エトポシド及びブレオマイシン等のトポＩＩ阻害剤を含む。Ｇ１を阻止する薬剤はまたＳ期阻止、例えばタモキシフェン、プレドニゾン、ダカーバジン、メクロレタミン、シスプラチン、メトトレキサート、５−フルオロウラシル及びアラ−Ｃ等のＤＮＡアルキル化剤へと広がる。さらにこのような薬剤は、ＰＩ３Ｋ／Ａｋｔ経路等の制御されていない細胞増殖に関連する細胞内経路の阻害剤を含む。更なる情報をＴｈｅ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂａｓｉｓ ｏｆ Ｃａｎｃｅｒ，Ｍｅｎｄｅｌｓｏｈｎ ａｎｄ Ｉｓｒａｅｌ，ｅｄｓ．，Ｃｈａｐｔｅｒ １，ｅｎｔｉｔｌｅｄ“Ｃｅｌｌ ｃｙｃｌｅ ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ，ｏｎｃｏｇｅｎｅｓ，ａｎｄ ａｎｔｉｎｅｏｐｌａｓｔｉｃ ｄｒｕｇｓ”ｂｙ Ｍｕｒａｋａｍｉ ｅｔ ａｌ（ＷＢ Ｓａｕｎｄｅｒｓ： Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ，１９９５） に見出すことができる。

「処理」又は「治療」は治療上の処理及び予防又は防止的な手段の両者を示す。「治療上効果的な量」という用語は、哺乳動物で疾患又は障害を処理するのに効果的な薬の量を示す。癌の場合、薬の治療上効果的な量とは、癌細胞数の減少、腫瘍サイズの減少、癌細胞の周辺臓器への浸潤の阻害（すなわちある程度遅らせること及び好ましくは停止）、腫瘍転移の阻害（すなわちある程度遅らせること及び好ましくは停止）、ある程度の腫瘍増殖の阻害及び／又は１つ又はそれ以上の障害に関連する症状の緩和を起こし得る。薬は、存在する癌細胞の増殖を妨げる及び／又は殺す可能性のある量で、細胞増殖抑制及び／又は細胞毒性を示すかもしれない。癌の治療にとって、例えば、インビボでの効力は腫瘍の負担や容積の評価、疾患の進行にかかる時間（ＴＴＰ）及び／又は応答割合（ＲＲ）の測定によって測ることができる。

「抗体」という用語は、最も広い意味で用いられ、単一のモノクローナル抗体及び多数のエピトープ特異性を有する抗体混合物（例えば、ポリクローナル抗体）だけでなく、標的となるポリペプチドのエピトープを免疫学的特異性により認識する能力を維持する限り抗体フラグメントも本質的に包含する。

本明細書で用いられる、「モノクローナル抗体」という用語は、実質的に均一な抗体の集団から得られる抗体、すなわち、集団を形成する個々の抗体が、少数存在するかもしれない自然に起こる可能性のある突然変異体を除き、同一であることを示す。モノクローナル抗体は特異性が高く、単一の抗原部位を認識する。さらに、異なる決定基（エピトープ）を認識する異なる抗体を一般的に含む従来の（ポリクローナルな）抗体調製物に対して、それぞれのモノクローナル抗体は抗原上の単一の決定基を認識する。それらの特異性に加えて、モノクローナル抗体は、他の免疫グロブリンで汚染されることなく、ハイブリドーマの培養によって合成されるという利点を有する。修正された「モノクローナル」は、実質的に均質な（homogenous）抗体の集団から得られるという抗体の特徴を示すもので、特別な方法での抗体の産生を必要とするものではない。例えば、本発明に従って使用されるモノクローナル抗体は、Ｋｏｈｌｅｒら、Ｎａｔｕｒｅ，２５６：４９５（１９７５）によって初めて記述されたハイブリドーマ法で生産されてもよく、又組換えＤＮＡ法（米国特許第４，８１６，５６７号）で生産されてもよい。「モノクローナル抗体」はまた、例えば、Ｃｌａｃｋｓｏｎら、Ｎａｔｕｒｅ，３５２：６２４−６２８（１９９１）及びＭａｒｋｓ ｅｔ ａｌｓｏ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２２２：５８１−５９７（１９９１）に記載されている技術を用いてファージ抗体ライブラリーから分離されてもよい。

本明細書で用いられるように、「ポリヌクレオチド」という用語は、少なくとも１０塩基又は塩基対の長さの、リボヌクレオチド、デオキシヌクレオチド又はいずれかのタイプのヌクレオチドの修飾体からなるヌクレオチドの重合体を意味し、一本鎖及び二本鎖のＤＮＡ及び／又はＲＮＡを包含しなければならない。当該技術分野では、この用語はしばしば「オリゴヌクレオチド」と互換性をもって使用される。ポリヌクレオチドは、本明細書で開示されるヌクレオチド配列を包含できる。そこでは、チミジン（Ｔ）はまたウラシル（Ｕ）でもよく、この定義はＤＮＡとＲＮＡの化学構造の相違、とりわけＲＮＡの主要な４つの塩基のうちの１つがチミジン（Ｔ）の代わりにウラシル（Ｕ）であるという観察によるものである。

本明細書で用いられるように、「ポリペプチド」という用語は、少なくとも１０アミノ酸のポリマーを意味する。明細書を通して、標準の３文字又は１文字表記が使用される。当該技術分野では、この用語はしばしば「タンパク質」と互換性をもって使用される。

本明細書で用いられるように、「阻害剤」という用語は、ｍＴＯＲ及び／又はＥＧＦＲポリペプチド等の標的分子の生物学的活性の１つ又はそれ以上を阻害できる分子を包含する。実例となる阻害剤は、アンチセンスポリヌクレオチド及びｓｉＲＮＡ等の当該技術分野で公知の他の阻害剤と同様に、本明細書で開示される標的とされた小分子阻害剤及び抗体阻害剤を包含する。従って、当業者は、これらの阻害剤が、ポリペプチドの合成及び／又は機能を阻害する分子（例えばｍＴＯＲ等の標的ポリペプチドのリン酸化及びそれによる活性化を遮る分子）と同様に、ポリヌクレオチドの合成及び／又は機能の両者を阻害する分子（例えばアンチセンスポリヌクレオチド分子）を包含することを正しく認識する。

本発明に関連する生理学的な処理
本明細書で提供される開示は、神経膠腫等の癌に共通して見られるＰＩ３Ｋ／Ａｋｔ経路の異常な活性化に関連した一連のバイオマーカーを同定する。本明細書で提供される開示はさらに、これらのバイオマーカーを試験するための最適化された方法も提供する。従って、開示は、多形性膠芽腫等の癌で、これらのバイオマーカーの活性化状態を試験することを可能にする。さらに重要なことに、これらのバイオマーカーを試験するための開示された方法は、ホルマリン固定されパラフィン包埋された生検試料を含む幅広い種類の組織試料に有用である。本明細書で開示されるように、これらのマーカーはリン酸特異的抗体等のパネル抗体を用いて試験され得る。これらの方法で、ホルマリン固定されパラフィン包埋された多形性膠芽腫の生検試料に由来する細胞等の哺乳動物の細胞を、リン酸化ポリペプチドを含む本明細書で開示される多様な標的分子の存在について、この細胞を含む組織試料を試験することによって、Ａｋｔ経路の活性化の証拠について調べることができる。本発明の特定の態様では、ラパマイシン或いはその類似物又はＺＤ−１８３９等のＥＧＦＲ阻害剤或いはその類似物等の膠芽腫を処理するのに用いることができる治療剤を同定及び／又は評価する。

上記のように、本明細書で開示される本発明は、膠芽腫生検試料等の臨床試料でＰＩ３Ｋ／Ａｋｔ情報伝達経路の活性化状態を同定するのに使用し得る方法及び免疫組織化学の試薬を提供する。これらの方法と試薬は、ＰＴＥＮ癌抑制遺伝子の消失に応答してＡｋｔ／ｍＴＯＲ情報伝達経路の調和した制御を同定する。この経路を標的とする特異的なキナーゼ阻害剤が現在開発され（例えばＮｅｓｈａｔら、Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ．９８：１０３１４−９，２００１参照）、さらにこの変異体が膠芽腫及び前立腺癌で共通しているので、この開示は、治療に適した患者を選択するのに臨床上重要な手段を提供する。これに関連して、通常の手順で処理された患者生検試料の免疫組織化学的な解析を行うことによって、本発明は実施され得る。これらの解析の結果は、臨床試験に含まれる基準として、及び、この経路が異常である患者で結果として生じる相違を評価するために使用できる。

本明細書に開示される方法及び試薬は、通常の手順で処理された患者の生検試料（例えば膠芽腫の試料）上にＡｋｔ及びｍＴＯＲ、ＥＲＫ、Ｆｏｒｋｈｅａｄ、Ｓ６−キナーゼ等の下流の作用因子のようなバイオマーカーポリペプチドの活性化状態を決定するのに使用でき、この情報は、標的とされた経路の阻害剤を用いた治療について患者を選択するのに使用できる。本明細書で開示されるように、本発明は膠芽腫の患者４８人から得られた生検由来の組織マイクロアレイで試験された。その結果は、Ａｋｔ、ｍＴＯＲ、ｆｏｒｋｈｅａｄ及びＳ６−キナーゼの明らかに調和した制御と、それらとＰＴＥＮ消失との関連を示している。本発明に直接関係のあるバイオマーカーと病理学的過程の詳細な考察は以下に提供される。

成長因子の伝達によるＰＩ３Ｋの活性化は、ホスファチジルイノシトール２リン酸（ＰＩＰ２）にリン酸基が付加することによりホスファチジルイノシトール３リン酸（ＰＩＰ３）の形成を引き起こす。ＰＩＰ３はＡｋｔキナーゼ（そしてその下流の作用因子ｍＴＯＲ、ｆｏｒｋｈｅａｄ及びＳ６−キナーゼ）の活性化を引き起し、その活性化は細胞増殖と生存を促進する。ＰＴＥＮ癌抑制遺伝子はＰＩＰ３からリン酸基を取り去るホスファターゼをコードし、それによってこの経路の活性化状態を制御している。ＰＴＥＮの消失はＰＩＰ３を介した構造性の情報伝達を生じ、それ故にＡｋｔ経路の無秩序な（unregulated）活性化を導く。

ＰＴＥＮは膠芽腫及び前立腺癌を含む多くの種類の癌で欠失している。加えて、Ａｋｔ経路は他の多くの癌で制御不可能となっている。ＰＴＥＮ欠損癌細胞は、非癌細胞を含むＰＴＥＮ野生型細胞と比べて、ｍＴＯＲレベルでＡｋｔ経路の阻害により大きな感受性がある（例えばＮｅｓｈａｔら、Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ．９８：１０３１４−９，２００１参照）。それ故に、ｍＴＯＲ阻害剤はＰＴＥＮを欠失しＡｋｔ経路が活性化した腫瘍を有する患者に対して高度に選択的で効果的な治療となり得る。ＰＴＥＮ／ＰＩ３Ｋ／Ａｋｔ経路に関する以前の知識は全て生化学的なデータと遺伝的な解析に基づいており、臨床的なスクリーニング手段には適していない。現在のところ、通常の手順で処理されたホルマリン固定されパラフィン包埋された患者生検試料でこの経路の活性化状態の検出方法はない。従って、このような臨床試料でこの経路の活性化状態を同定でき、その阻害剤に対して患者を選択できる能力は、価値のある診断手段である。これはこの経路を標的とした阻害剤の解析についても価値のある手段である。

本明細書で特に開示するように、我々はＰＩ３’Ｋ／Ａｋｔ経路の活性化が通常の手順で処理されたＧＢＭ患者生検で検出され得ることを示す。我々はＰＴＥＮの消失がＡｋｔ活性化と有意に相関していること、そのＡｋｔ活性化は下流の作用因子ｍＴＯＲ、Ｓ６及びＦＫＨＲの活性化と有意に関連していることを示す。我々はまたＰＴＥＮ消失がＰＩ３’Ｋ／Ａｋｔ経路活性化の唯一のメカニズムではないことを明らかにし、ＥＧＦＲ及びＥＧＦＲｖＩＩＩの共発現がこの経路の活性化と有意に関連していることを示している。最後に、我々は、ＰＩ３Ｋ／Ａｋｔ及びＥｒｋ経路の活性化がＧＢＭ患者の進行と生存に重大な影響力を有することを示す。これらのデータは、この一連の手段が標的とされた分子治療に対してＧＢＭ患者を分類するのに使用できる証拠を提供する。

上皮成長因子受容体はヒト膠芽腫の悪性表現型に寄与する（例えばＴｈｏｍａｓら、Ｉｎｔ Ｊ Ｃａｎｃｅｒ．２００３ Ｍａｒ １０；１０４（１）：１９−２７参照）。ＳＫＭＧ−３細胞、すなわちインビトロでＥＧＦＲ遺伝子増幅を維持するＧＢＭ細胞系での研究によれば、ＥＧＦ処理は、下流の作用因子Ｅｒｋ、ＡＫＴ１、ｓｔａｔ３及びｃ−Ｃｂｌと同様にＥＧＦＲのリン酸化を刺激した。最小の成長条件下で、刺激されていないＳＫＭＧ−３細胞は構造的にリン酸化されたＥｒｋ及びＡＫＴ１を含む。ＥＧＦＲキナーゼ阻害剤ＰＤ１５８７８０はその受容体とＥｒｋの構造的なリン酸化を減少させるが、ＡＫＴ１のリン酸化は減少させない。対照的に、ホスファチジルイノシトール−３−キナーゼ（ＰＩ３Ｋ）の阻害はＥｒｋ及びＡＫＴ−１の構造的なリン酸化を遮るがＥＧＦＲはそうではない。その結果は、過剰発現したＥＧＦＲからのシグナルがＥｒｋの構造的なリン酸化に寄与する証拠を提供するが、これらのシグナルはＰＩ３Ｋ又はＡＫＴ１の構造的活性化には必要とされないかもしれない。例えばＴｈｏｍａｓら、Ｉｎｔ Ｊ Ｃａｎｃｅｒ．２００３ Ｍａｒ １０；１０４（１）：１９−２７参照。

さらに、例えば生物学的活性を評価するために一連の生検が処理前後に採取された転移性の結腸直腸癌患者でのＥＧＦＲチロシンキナーゼ阻害剤ＺＤ１８３９の研究によって示されるように（例えばＤａｎｅｓｈｍａｎｄ Ｃｌｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．２００３ Ｊｕｌ；９（７）：２４５７−６４参照）、結腸直腸癌の病因にＥＧＦＲは重要な役割を果たしているように思われる。これらの研究では、対になった生検が処理の前後に直腸結腸癌患者から得られた。処理後の試料は癌細胞の増殖が統計的に有意な減少を示した。全ての処理前試料がＥＧＦＲの強い染色を示した一方、処理後の何人かの患者で癌細胞中の活性化したＥＧＦＲ、リン酸化されたＡｋｔ及びリン酸化されたＥＲＫに対する免疫組織化学的な染色の消失が観察された。例えばＤａｎｅｓｈｍａｎｄ Ｃｌｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．２００３ Ｊｕｌ；９（７）：２４５７−６４参照。

ＰＩ３’Ｋ／Ａｋｔ経路はＧＢＭｓで一般に異常である（deregulated）が、通常の手順で処理された生検でのそれらの同定は課題を提示している。この経路を標的とした新たなキナーゼ阻害剤に直面し、治療について患者を分類するのに使用できるアッセイに対する必要性が重大になってきている。本明細書で開示されるように、我々はＰＩ３’Ｋ／Ａｋｔ経路の活性化はリン酸特異的抗体のパネルを用いて免疫組織化学によって検出され得ることを示す。我々は、未処理の初期ＧＢＭｓの３８％がＰＴＥＮタンパク質の消失の証拠を示し、これが有意にＡｋｔ活性化と関連していることを明らかにする。我々はさらに、Ａｋｔのリン酸化が下流の作用因子ｍＴＯＲ、ＦＫＨＲ及びＳ６のリン酸化と有意に相関していることを示す。我々は、ＰＴＥＮの消失がＡｋｔ経路の活性化を引き起こす唯一のメカニズムではないことを示し、Ａｋｔ、ｍＴＯＲ、Ｓ６及びＦＫＨＲのリン酸化はＥＧＦＲ及びその構造的な活性変異体ＥＧＦＲｖＩＩＩの共発現とも関連していることを示す。最後に、我々はＰＩ３’Ｋ／Ａｋｔ及びＥｒｋ経路の活性化がＧＢＭ患者において進行時間をより短くし、生存期間を減少させることに関連していることを示す。

本明細書で提供される開示は、ＰＩ３’Ｋ／Ａｋｔ経路の活性化がパラフィン包埋された生検試料で検出され得ることを示し、初期のＧＢＭｓでＰＴＥＮの消失がＡｋｔ経路の活性化と高く相関しているという証拠を提供する。これらの結果はまた、ＥＧＦＲとＥＧＦＲｖＩＩＩの共発現が正常なＰＴＥＮの免疫組織化学的な発現を示すＧＢＭｓでＰＩ３Ｋ経路を活性化できるという証拠を提供する。これらの結果はさらに、これらの情報伝達経路の活性化がＧＢＭ患者の進行と生存に少なからぬ影響力を有しているという証拠を提供する。

本明細書で提供される開示は、ＰＩ３’Ｋ／Ａｋｔ経路の活性化が通常の手順で処理された患者生検でリン酸特異的抗体を用いて検出できることを、特に示している。我々は、ＰＴＥＮ欠損ＧＢＭｓがＡｋｔ経路及びその下流の作用因子ｍＴＯＲ、ＦＫＨＲ及びＳ６の協調した活性化を有していることを示す。我々はまた、ＥＧＦＲとＥＧＦＲｖＩＩＩを共発現しているＧＢＭｓがＰＩ３’Ｋ／Ａｋｔ及びＥｒｋ情報伝達経路の活性化を有していることを示す。最後に、我々は、これらの情報伝達経路が予後の重要性を有していることを示す。例えば、腫瘍がＡｋｔの下流、すなわちＥＲＫのレベルで活性化されている初期ＧＢＭ患者は、有意に短い時間で癌へ進行し、生存期間が有意に減少する。これらの結果は、ＧＢＭｓの分子上のサブタイプを定義し、標的とされた分子治療について患者を分類するのに使用できるかもしれない。

以下に詳細に開示するように、実例となる分析方法で、我々は４５の未処理の初期ＧＢＭ患者生検から組織マイクロアレイを作製し、ｐ−Ｅｒｋと同様にｐ−Ａｋｔ及び下流の作用因子ｐ−ｍＴＯＲ、ｐ−ＦＫＨＲ及びｐ−Ｓ６の免疫組織化学的な発現を解析した。ＥＧＦＲ、ＥＧＦＲｖＩＩＩの発現及びＰＴＥＮの消失、それら全てはＰＩ３’Ｋ／Ａｋｔ経路の活性化を促進できるが、それらも解析され、ＰＩ３’Ｋ／Ａｋｔ及びＥｒｋ経路活性化との関連が決定された。ＰＩ３’Ｋ／Ａｋｔ及びＥｒｋ経路活性化の予後との密接な関係も解析された。

我々の解析で、ＰＴＥＮの免疫組織化学上の発現の消失はＧＢＭｓの３８％で検出された。減少したＰＴＥＮタンパク質の発現は、Ａｋｔ（ｐ＜０．００００１）及びその下流の作用因子ｍＴＯＲ（ｐ＝０．０４）、ＦＫＨＲ（ｐ＝０．００６）及びＳ６（ｐ＝０．００１）のリン酸化と有意に関連した。ＰＴＥＮタンパク質の消失はＥｒｋの活性化、それはＰＩ３’Ｋ／Ａｋｔ情報伝達とは独立しているが、それとは関連しなかった。ＰＴＥＮタンパク質の消失はＰＩ３’Ｋ／Ａｋｔ経路活性化の唯一の道筋ではなく、ＥＧＦＲ及びＥＧＦＲｖＩＩＩの共発現が、正常にＰＴＥＮタンパク質を発現しているＧＢＭｓでｐ−Ａｋｔ（ｐ＝０．０６）、ｐ−ｍＴＯＲ（ｐ＝０．００１）、ｐ−ＦＫＨＲ（ｐ＝０．００２）及びｐ−Ｓ６（ｐ＝０．００１）の発現と有意に相関した。ＥＧＦＲ及びＥＧＦＲｖＩＩＩの共発現はまたＥｒｋの活性化（ｐ＝０．００７）とも関連した。ｍＴＯＲ、ＦＫＨＲ及びＳ６の一致したリン酸化は、Ｅｒｋの活性化（ｐ＝０．０４）と同様に、進行時間の短縮（ｐ＝０．００２）及び生存期間の減少（ｐ＝０．０２）と有意に関連した。

上記のように、本明細書で開示される方法は免疫組織化学的な解析を一般的に用いる。免疫組織化学的な解析は病理学者による主観的な決定を必要とする。プロテオミクスによるアプローチはより客観的で感度の高い方法である可能性があり、将来臨床的に適した方法となるかもしれない（例えばＬｉｏｔｔａ ｅｔ ａｌ，Ｊａｍａ．２８６：２２１１−４．，２００１、Ｌｉｏｔｔａら、Ｂｒｅａｓｔ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．２：１３−４，２０００、Ｐｅｔｒｉｃｏｉｎら、Ｌａｎｃｅｔ．３５９：５７２−７．，２００２、Ｐｅｔｒｉｃｏｉｎら、Ｎａｔ Ｒｅｖ ＤｒｕｇＤｉｓｃｏｖ．１：６８３−９５．，２００２参照）。しかしながら、標的とされた治療について患者を分類し、実験的に標的とされた薬剤への応答と分子の相関性を評価するための現在の必要性は、我々に現在入手できる方法を用いて通常の手順で処理された生検試料に適用できるアッセイの開発を迫っている。活性化されたＡｋｔを患者生検で行われた免疫組織化学により検出することができ、それは生物学的なまたは予後との密接な関係を有している可能性が示唆されてきた（例えばＧｕｐｔａら、Ｃｌｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．８：８８５−９２．，２００２、Ｍａｌｉｋら、Ｃｌｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．８：１１６８−７１．，２００２参照）。以前の研究に補足して、我々は本明細書に、ＰＩ３’Ｋ／Ａｋｔ経路活性化の全体像を描くために、リン酸特異的抗体のパネルがｐ−Ａｋｔ及びその下流の作用因子を検出するのに用いることができることを示す。下流の作用因子の活性化とＡｋｔリン酸化の間の高いレベルの関連は、我々がこの経路を的確に評価してきた証拠を提供する。さらにＰＩ３’Ｋ／Ａｋｔ経路活性化がＰＴＥＮタンパク質の消失（例えばＮｅｓｈａｔら、Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ．９８：１０３１４−９．，２００１、Ｅｒｍｏｉａｎら、Ｃｌｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．８：１１００−６．，２００２参照）又はＥＧＦＲ／ＥＧＦＲｖＩＩＩ情報伝達と関連しているという我々のデータは、ＰＴＥＮタンパク質のレベルがＧＢＭ患者生検でＡｋｔ活性化と逆の相関にある（例えばＥｒｍｏｉａｎら、Ｃｌｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．８：１１００−６．，２００２参照）という最近の生化学的な証明を含む、最近のインビトロ及び動物モデルでのデータ（例えばＤａｖｉｅｓら、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．５９：２５５１−６．，１９９９、Ｄａｖｉｅｓら、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．５８：５２８５−９０．，１９９８、Ｌｏｒｉｍｅｒら、Ｂｉｏｃｈｉｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ａｃｔａ．１５３８：１−９．，２００１、Ｍｏｓｃａｔｅｌｌｏら、Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ．２７３：２００−６．，１９９８参照）と高い相関を示している。

ＥＲＫ及びＰＩ３’Ｋ／Ａｋｔ経路の活性化が進行時間の短縮及び生存期間の減少に関連したという我々の知見は、経路の活性化がＧＢＭ患者の予後に影響力持つかもしれないという最初の証明である。本明細書に提示されるデータは経路の活性化状態が重要な予後の情報を示唆しているという証拠を提供する。ｍＴＯＲ、Ｓ６及びＦＫＨＲレベルの下流での活性化が進行又は生存に有意に相関したのに対して、Ａｋｔの活性化が相関しなかったことは驚くべきことである。この結果は２つの可能性を生じる。一つは、ｐ−Ａｋｔ抗体は下流のリン酸特異的抗体のパネルに比べてＰＩ３’Ｋ／Ａｋｔ経路の活性化を検出するには感受性が劣る手段である。あるいは、Ａｋｔによるか又はＡｋｔとは独立した様式で下流のｍＴＯＲ、ＦＫＨＲ及びＳ６に集中して情報が伝わることが、ＧＢＭｓの生物学的挙動を調節するのに重要な役割を果たしているかもしれない。後者の立場では、同時に起こるＥｒｋ及びＡｋｔの仲介する情報伝達がｐ７０ Ｓ６キナーゼの最適な活性化及びｐ−Ｓ６の形成に必要とされるのかもしれない（例えばＩｉｊｉｍａら、Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ．２７７：２３０６５−７５．，２００２、Ｓｈｉら、Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ．２７７：１５７１２−２０．，２００２参照）。同様に、Ａｋｔとは独立したｍＴＯＲ及びＦＫＨＲのリン酸化のメカニズムが示されてきた（例えばＧｉｎｇｒａｓら、Ｇｅｎｅｓ ａｎｄ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ．１５：８０７−８２６．，２００１、Ｂｕｒｇｅｒｉｎｇら、Ｔｒｅｎｄｓ Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｓｃｉ．２７：３５２−６０．，２００２参照）。本明細書で提供される開示と当該技術分野で一般的に使用される方法を用いて、これらの更なる情報の入力が調節されているＧＢＭの挙動において役割を果たしているか否か決定することができる。ＥＧＦＲ及びＡｋｔ活性化とそれらの阻害剤、例えばＢｉａｎｃｏら、Ｏｎｃｏｇｅｎｅ，２００３ Ｍａｙ ８；２２（１８）：２８１２−２２、Ｙａｋｅｓら、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．２００２ Ｊｕｌ １５；６２（１４）：４１３２−４１及びＳｈｅら、Ｃｌｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．２００３ Ｏｃｔ １；９（１２）：４３４０−６参照、に関するさらなる考察のために、それらの内容は参照として本明細書に取り込まれる。

４５患者という試料の数はあまり大きくはないが、ＰＴＥＮの消失とＰＩ３’Ｋ／Ａｋｔ経路の活性化の間の確固とした関連を提供するには十分な大きさである。未処理の初期ＧＢＭ患者のみがこの研究に含まれた。処理自体がＥｒｋ及びＰＩ３’Ｋ／Ａｋｔ経路の活性化を調節する可能性があるので、この研究計画は我々に経路の活性化と上流の分子で起きたこととの関連についてより良い評価手段を与えた。本明細書で提供される開示と当該技術分野で一般的に使用される方法を用いて、経路の活性化と予後の密接な関係をより定量化し、治療に対する応答と分子の相関関係を同定するために、遡及的及び予測的な（処理及び未処理の）ＧＢＭ患者の解析を行うことができる。

免疫組織化学的な解析の主観性の問題に取り組むために、全ての免疫染色は２人の神経病理学者によって別の機会に独立して解釈され、全ての染色において評価者間及びそれぞれの評価者で意見がよく一致していた。このことはこれらのリン酸特異的抗体の解釈は独立した病理学者間で再現性があるであろうという証拠を提供する。将来、プロテオミクス解析等のより客観的な方法がこの手段にとってかわり得る（例えばＬｉｏｔｔａら、Ｊａｍａ．２８６：２２１１−４．，２００１、Ｐｅｔｒｉｃｏｉｎら、Ｎａｔ Ｒｅｖ Ｄｒｕｇ Ｄｉｓｃｏｖ．１：６８３−９５．，２００２参照）。それでもなお、本明細書で提示されるデータは、我々が現在入手できる方法を使ってこれらの経路を正確に評価できるという証拠を提供し、治療について患者を分類できるという証拠を提供する。

ＧＢＭｓは、以前から示されているように（例えばＣｈｅｎｇら、Ｊ Ｎｅｕｒｏｐａｔｈｏｌ Ｅｘｐ Ｎｅｕｒｏｌ．５８：１２０−８．，１９９９、Ｊｕｎｇら、Ｊ Ｎｅｕｒｏｐａｔｈｏｌ Ｅｘｐ Ｎｅｕｒｏｌ．５８：９９３−９．，１９９９参照）最も不均質な癌の一つである。これは、標的にされた阻害剤による治療のために患者を分類することと同様に、ＧＢＭｓ患者において分子の変化を評価するという問題を抱えている。本明細書で提供される開示と当該技術分野で一般的に使用される方法を用いて、腫瘍内でのＰＴＥＮ、ＥＧＦＲ及びＥＧＦＲｖＩＩＩといった分子の不均質性の程度を直接決定でき、それが経路の活性化、予後及び治療への応答へ与える影響力を評価できる。

本発明の方法は、ＰＩ３Ｋ／Ａｋｔ経路が制御されていないことと、同時に起きている細胞増殖が制御されていないこととが関連している、幅広い種類の癌に適用できる。上記のように、本発明の一般的な態様においては「神経膠腫」と呼ばれる系統の腫瘍で、細胞内経路を試験する。簡単に言うと、脳は２つの主な細胞種、ニューロンとグリアを含んでいる。グリア細胞は「神経膠腫」と呼ばれる系統の腫瘍の起源となる。この神経膠腫グループにはいくつかの異なる種類の腫瘍が存在する。これらはきわめて良性で成長の遅い腫瘍から急速に大きくなる非常に悪性の癌の種類まで変化し得る。神経膠腫の系統でもっとも多く発生する腫瘍は星状細胞腫、乏突起細胞腫及び上位細胞腫である。さらに、何人かの患者は雑多な様相を示した腫瘍を有している場合がある。星状細胞腫は最も一般的な種類の神経膠腫である。これらは、脳組織それ自体に起こる腫瘍である。すべての神経膠腫のように、星状細胞腫は脳内の表層部又は深層部に局在し重要な構造に影響を与え得る。それらが（脳の支持要素として働く）星状細胞から生じるので、星状細胞腫は本来は一般的に浸潤性である。

以下に詳細に考察するように、世界保健機関（ＷＨＯ）の等級付けがこのグループの腫瘍を特徴付けるのに用いられる。簡単に言うと、世界保健機関の格付けシステムでは、グレードＩの腫瘍は最も悪性度が低い。これらの腫瘍は成長が遅く、顕微鏡下でもほぼ正常に見え、手術のみが効果的かもしれない。グレードＩの腫瘍はしばしば長期の生存に関連する。グレードＩＩの腫瘍は、グレードＩの腫瘍に比べるとわずかに速く成長し、わずかに異常な顕微鏡下での外観を有している。
これらの腫瘍は周囲の正常組織に侵入し、グレードＩＩ又はそれ以上の腫瘍として再発するかもしれない。
グレードＩＩＩの腫瘍は悪性である。これらの腫瘍は活発に再生する異常な細胞を含み、
周囲の正常組織へ侵入する。グレードＩＩＩの腫瘍は、グレードＩＶの腫瘍と同様に頻繁に再発する。グレードＩＶの腫瘍は、最も悪性でかつ、周辺の正常組織に広範囲に侵潤する。これらの腫瘍は急速に再生し、顕微鏡下で非常に変わった外観を示し、中心部では壊死性（死んだ細胞を有している）である。グレードＩＶの腫瘍は急速な成長を維持するために新たな血管形成を引き起こす。多形性膠芽腫はグレードＩＶの腫瘍の最も一般的なものである。さらなる情報は、以下を参照されたい。例えば、Ｔａｔｔｅｒ ＳＢ，Ｗｉｌｓｏｎ ＣＢ，Ｈａｒｓｈ ＧＲ ＩＶ．Ｎｅｕｒｏｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ ｔｕｍｏｒｓ ｏｆ ｔｈｅ ａｄｕｌｔ ｂｒａｉｎ．Ｉｎ Ｙｏｕｍａｎｓ ＪＲ，ｅｄ．Ｎｅｕｒｏｌｏｇｉｃａｌ Ｓｕｒｇｅｒｙ，Ｆｏｕｒｔｈ Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｖｏｌ．４：Ｔｕｍｏｒｓ．Ｗ．Ｂ．Ｓａｕｎｄｅｒｓ Ｃｏ．，Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ，ｐｐ．２６１２−２６８４，１９９５、Ｋｌｅｉｈｕｅｓ Ｐ，Ｂｕｒｇｅｒ ＰＣ，Ｓｃｈｅｉｔｈａｕｅｒ ＢＷ．Ｔｈｅ ｎｅｗ ＷＨＯ ｃｌａｓｓｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｂｒａｉｎ ｔｕｍｏｕｒｓ．Ｂｒａｉｎ Ｐａｔｈｏｌｏｇｙ ３：２５５−６８，１９９３、Ｌｏｐｅｓ ＭＢＳ，ＶａｎｄｅｎＢｅｒｇ ＳＲ，Ｓｃｈｅｉｔｈａｕｅｒ ＢＷ；Ｔｈｅ Ｗｏｒｌｄ Ｈｅａｌｔｈ Ｏｒｇａｎｉｚａｔｉｏｎ ｃｌａｓｓｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｎｅｒｖｏｕｓ ｓｙｓｔｅｍ ｔｕｍｏｒｓ ｉｎ ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ ｎｅｕｒｏ−ｏｎｃｏｌｏｇｙ．Ｉｎ ＡＪ．Ｌｅｖｉｎｅ ａｎｄ Ｈ．Ｈ．Ｓｃｈｍｉｄｅｋ，ｅｄｓ．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ｏｆ Ｎｅｒｖｏｕｓ Ｓｙｓｔｅｍ Ｔｕｍｏｒｓ Ｗｉｌｅｙ−Ｌｉｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ｐｐ．１−３６，１９９３。

低グレードの星状細胞腫（グレードＩ／ＩＶ又はＩＩ／ＩＶ）は良性と呼ばれ、子供や若い成人で一般的に発生する。これらの腫瘍はより高いグレードの星状細胞腫に比べてより良い予後を示す。これらの低グレードの星状細胞腫の管理は議論のあるところかもしれないが、これらの腫瘍は外科的に接近可能であれば通常切除される。成人の低グレード星状細胞腫で心配されることの１つは、それらが悪性に形質転換し、より高いグレードすなわち悪性腫瘍へと変化し得ることである。本発明の方法は、これらの形質転換をモニターするのに使用することができる。グレードＩの星状細胞腫で正常な核型が最も多く観察されるが、異常な核型を伴う場合では、最も多い染色体異常はＸ及びＹ性染色体の欠失であり、２２ｑの欠失は星状細胞腫の２０−３０％で見られ、その他低グレードの腫瘍で観察される異常は８ｑ、１０ｐ及び１２ｐ染色体上の過剰及び１ｐ、４ｑ、９ｐ、１１ｐ、１６ｐ、１８及び１９染色体上の欠失を含む。

未分化の星状細胞腫（グレードＩＩＩ／ＩＶ）はより攻撃的な腫瘍であり、それ自体はより根治的な方法で通常処理される。未分化の星状細胞腫では、染色体の過剰又は欠失はしばしば見られ、トリソミー７（最も高頻度）、染色体１０の欠失、染色体２２の欠失、９ｐ、１３ｑの欠失、より低い頻度で記載されている他の異常は染色体１ｑ、１１ｑ、１９、２０及びＸｑの過剰である。

多形性膠芽腫（グレードＩＶ／ＩＶ）は星状細胞腫のうち最も悪性の形態である。これらの腫瘍はほぼ全ての年齢で発生し得るが、発生率のピークは５０歳から７０歳の間である。多形性膠芽腫（ＧＢＭ）は高グレード神経膠腫とも呼ばれ、グレードＩＶ／ＩＶ星状細胞腫として病理学者に格付けされる。これらの腫瘍は主に成人で発生し発生率のピークは５０歳から７０歳の間である。一般に発症から診断までにかかる時間は比較的短く、通常数週間である。膠芽腫は一般的にいくつかの染色体変化を示し、高頻度の順によれば、染色体７の過剰（膠芽腫の５０−８０％）、２倍微小染色体、膠芽腫の進行において後期の段階に関連する染色体１０の完全又は部分モノソミー（腫瘍の７０％）、９ｐの部分欠失はしばしば見られ（腫瘍の６４％）、９ｐｔｅｒ−２３、２２ｑ１３における２２ｑの部分欠失がしばしば報告され、染色体１３の欠失又は消失、１３ｑ１４−ｑ３１がいくつかの膠芽腫で見出され、トリソミー１９が細胞遺伝学及び比較ゲノムハイブリダイゼーション（ＣＧＨ）解析によって膠芽腫で報告され、１９ｑ１３．２−ｑｔｅｒにおける１９ｑの欠失がヘテロ接合性の消失（ＬＯＨ）の研究によって膠芽腫で検出され、４ｑ染色体の欠失、染色体２０の完全又は部分的な過剰が記載され、１２ｑ１４−ｑ２１の過剰又は増幅が報告され、他のクローンの異常に加えてそれが発生するとき染色体Ｙの消失が考えられてきた。

乏突起細胞腫は通常若い成人に発生する良性の成長が遅い腫瘍である。しばしば、これらは安全で完全な手術による切除が可能である前頭葉に局在する。多くの乏突起細胞腫はＣＴスキャンで最もよく見えるカルシウム（骨の小さな粒）を含んでいる。

本発明の特定の態様においては、ヒトで膠芽腫等の癌を処理するための治療剤を同定するために用いられる情報を得るための方法を含んでいる。例えば、本発明の方法は、癌細胞がラパマイシン又はラパマイシン類似物にどのように応答するかという情報を得るために、あるポリペプチド（例えばＰＴＥＮ）のレベル及び／又はあるポリペプチド（例えばＳ６）のリン酸化状態を試験する。ラパマイシン（シロリムス又はｒａｐａｍｍｕｎｅとしても知られる）は、さまざまなヒト腫瘍細胞系及び腫瘍の異種移植モデルで免疫抑制の性質と抗増殖活性を持つサイクロスポリンに関連のあるマクロライドの１つである。ＳＤＺ−ＲＡＤ、ＣＣＩ−７７９、ＲＡＤ００１、エベロリムス（サーティカン）及びＡＰ２３５７３等のより好ましい薬剤特性を持ったラパマイシン又はラパマイシン類似物の両者が特異性の高いｍＴＯＲの阻害剤である。本明細書に記載するように、ラパマイシン（ｍＴＯＲ）の哺乳動物での標的は、細胞の生存と増殖を仲介するので抗癌治療開発の標的とされる、ホスファチジルイノシトール３−キナーゼ（ＰＩ３Ｋ）／Ａｋｔ（プロテインキナーゼＢ）情報伝達経路の下流作用因子である。重要なことに、ラパマイシン又はラパマイシン類似物はイムノフィリンＦＫ５０６結合タンパク質１２に結合することによって機能を獲得し、結果として生じた複合体がｍＴＯＲの活性を阻害する。ｍＴＯＲは４０Ｓリボゾーマルタンパク質Ｓ６キナーゼ（ｐ７０ｓ６ｋ）及び真核生物の開始因子４Ｅ−結合タンパク質−１の両者を活性化するので、ラパマイシン様化合物はこれら下流の伝達要素の働きを遮断し、その結果細胞周期はＧ１期で停止する。ラパマイシンとその類似物はまた、サイクリン依存性キナーゼ（ＣＤＫ）活性化を妨げ、網膜芽細胞腫のタンパク質リン酸化を阻害し、サイクリンＤ１の代謝を促進することにより活性型ＣＤＫ４／サイクリンＤ１複合体の欠乏を引き起こすが、それらは全て、細胞周期のＧ１／Ｓ境界線でラパマイシンの顕著な阻害効果に潜在的に寄与している。ラパマイシンとその類似物は、広範囲にわたるヒトの癌で顕著な成長阻害効果が示されてきた。
例えば、本明細書に記載するように、ラパマイシン（ｍＴＯＲ）の哺乳動物での標的は、多形性膠芽腫の制御されていない増殖を促進する重要な情報伝達経路を調節する。
これに関連して、本発明の方法はＰＩ３Ｋ／Ａｋｔ経路の試験、及び、制御されていないＰＩ３Ｋ／Ａｋｔ経路を有する細胞で適した治療剤（例えばラパマイシン）の選択に使用することができる。ラパマイシンとその類似物についての考察は以下を参照されたい。例えば、Ｍｉｔａら、Ｃｌｉｎ Ｂｒｅａｓｔ Ｃａｎｃｅｒ ２００３ Ｊｕｎ；４（２）：１２６−３７、Ｈｏｓｏｉら、Ｍｏｌ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．１９９８ Ｎｏｖ；５４（５）：８１５−２４、Ｈｉｄａｌｇｏら、Ｏｎｃｏｇｅｎｅ．２０００ Ｄｅｃ ２７；１９（５６）：６６８０−６、Ａｌｅｘａｎｄｒｅら、Ｂｕｌｌ Ｃａｎｃｅｒ．１９９９ Ｏｃｔ；８６（１０）：８０８−１１及びＥｓｈｌｅｍａｎら、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．２００２ Ｄｅｃ １５；６２（２４）：７２９１−７。

上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ）の過剰発現は、神経膠腫等の幅広い種類の癌でも観察され、予後の悪さとしばしば相関しており、そのためＥＧＦＲを標的とした新たな癌治療を開発しようという努力を刺激している。ＥＧＦＲを特異的な標的としたモノクローナル抗体及びチロシンキナーゼ阻害剤が最もよく研究され、実質的な成功が約束されている。ＥＧＦＲを標的としたモノクローナル抗体及びチロシンキナーゼ阻害剤のいくつかの化合物が研究されてきており、これらの標的化戦略の安全性と効力を確かめるために様々な癌で現在臨床試験が行われている。ＥＧＦＲの細胞外リガンド結合領域を標的とした化合物はＣｅｔｕｘｉｍａｂ（Ｅｒｂｉｔｕｘ又はＩＭＣ−Ｃ２２５としても知られる）等の抗体を含んでいる。ＥＧＦＲの細胞内ドメインを標的としたチロシンキナーゼ等の他の化合物はＺＤ−１８３９（ｇｅｆｉｔｉｎｉｂ又はＩｒｅｓｓａとしても知られる）、ＯＳＩ−７７４（Ｅｒｌｏｔｉｎｉｂｏｒ又はＴａｒｃｅｖａとしても知られる）、ＰＤ−１５３０５３、ＰＤ−１６８３９３及びＣＩ−１０３３を含み、単独で又は放射線又は化学療法と組み合わせて臨床上の設定が研究されてきた。さらに、ｈ−Ｒ３、ＡＢＸ−ＥＧＦ、ＥＭＤ−５５９００及びＩＣＲ−６２等の化合物は単独で又は従来の治療と組み合わせて標的である悪性細胞に効果的であることが証明されてきた。ＺＤ１８３９（Ｉｒｅｓｓａ）の効果は、多形性膠芽腫の患者に対して現在臨床試験で研究されている。これに関連して、本発明の方法はＰＩ３Ｋ／Ａｋｔ経路を試験し、制御されていないＰＩ３Ｋ／Ａｋｔ経路を有しない細胞に適した治療剤（例えばＥＧＦＲ阻害剤）を選択するために使用することができる。ＥＧＦＲ阻害剤についての考察は以下を参照されたい。例えば、Ｋｈａｌｉｌら、Ｅｘｐｅｒｔ Ｒｅｖ ＡｎｔｉｃａｎｃｅｒＴｈｅｒ．２００３ Ｊｕｎ；３（３）：３６７−８０、Ｃｈａｋｒａｖａｒｔｉら、Ｉｎｔ Ｊ Ｒａｄｉａｔ Ｏｎｃｏｌ Ｂｉｏｌ Ｐｈｙｓ．２００３ Ｏｃｔ １；５７ （２ Ｓｕｐｐｌ）：Ｓ３２９、Ｗｉｓｓｎｅｒら、Ｂｉｏｏｒｇ Ｍｅｄ Ｃｈｅｍ Ｌｅｔｔ．２００２ Ｏｃｔ ２１；１２（２０）：２８９３−７、Ｃｉａｒｄｉｅｌｌｏら、Ｅｘｐｅｒｔ ＯｐｉｎＩｎｖｅｓｔｉｇ Ｄｒｕｇｓ，２００２ Ｊｕｎ；１１（６）：７５５−６８、 Ｄｅ Ｂｏｎｏら、Ｔｒｅｎｄｓ Ｍｏｌ Ｍｅｄ．２００２；８（４ Ｓｕｐｐｌ）：Ｓ１９−２６及びＣｏｈｅｎ，Ｃｌｉｎ Ｃｏｌｏｒｅｃｔａｌ Ｃａｎｃｅｒ．２００３ Ｆｅｂ；２（４）：２４６−５１。

本発明に於ける一般的な方法
本明細書に開示される本発明は多くの態様を有している。本発明の例示的な態様はホルマリン固定されパラフィン包埋された多形性膠芽腫生検試料等の腫瘍試料をＰＩ３Ｋ／Ａｋｔ経路の制御されていない活性化の証拠について試験する方法を含んでいる。これらの方法は、膠芽腫の処理に有用であるかもしれない治療剤を同定及び／又は評価するために、この経路と関連のある開示されたバイオマーカーの存在及び／又はリン酸化状態を試験することを包含する。本明細書の開示のように、開示されたバイオマーカーの存在及び／又はリン酸化状態は経路活性化のマーカー又は代用品として働く。

本発明の方法は一般的に、ｍＴＯＲ阻害剤又はＥＧＦＲ阻害剤と接触したときに神経膠腫等の腫瘍が応答しそうか（すなわち成長阻害を示しそうか）否かを評価する際に、用いることができる。このような態様では、経路の活性化に関連するバイオマーカーポリペプチド（例えば、リン酸化Ｓ６リリボソームポリペプチド（配列番号１））の存在及び／又はリン酸化状態が、経路がその腫瘍において制御されていない状態か、それ故にその経路を標的とすることが知られる阻害剤による阻害の影響を受け易いか否かを決定するために、試験される。このような態様においては、腫瘍は阻害剤にさらされる前に試験される。その他には、方法は、神経膠腫等の腫瘍がｍＴＯＲ阻害剤又はＥＧＦＲ阻害剤に応答性であるか（すなわち成長阻害を示すか）否かを評価する。このような態様においては、経路の活性化に関連するバイオマーカーポリペプチド（例えば、リン酸化Ｓ６リリボソームポリペプチド（配列番号１））の活性は、経路内のバイオマーカーが阻害剤にさらされたことに応答するかどうかを決定するために、腫瘍が阻害剤にさらされた後に試験される。

本発明のこのような態様の一つに、応答する可能性がある哺乳動物の神経膠腫（例えば、多形性膠芽腫）が、ＥＧＦＲポリペプチド（配列番号７）阻害剤又はｍＴＯＲポリペプチド（配列番号２）阻害剤に応答性であるか同定するための方法があり、この方法は腫瘍から得られた試料を、ＰＴＥＮポリペプチド（配列番号５）の発現、及び、リン酸化Ｓ６リリボソームポリペプチド（配列番号１）、ＥＧＦＲポリペプチド（配列番号７）、リン酸化ＡＫＴポリペプチド（配列番号４）及びリン酸化ＥＲＫポリペプチド（配列番号８）のうち少なくとも１つの存在について試験することを包含し、そこでは、ＰＴＥＮポリペプチドの発現が、対照と比較して、試料中のＳ６リリボソームポリペプチドのリン酸化の減少を伴って減少している場合は、神経膠腫はｍＴＯＲ阻害剤に応答しそうか又は応答性であると同定され、ＰＴＥＮの発現が、対照と比較して、試料中のＳ６リリボソームポリペプチドの正常なリン酸化を伴って減少している場合は、神経膠腫はｍＴＯＲ阻害剤に応答する可能性がないか又は非応答性であると同定され、ＡＫＴリン酸化及び／又はＥＲＫリン酸化の増加を伴って、ＰＴＥＮの発現が正常又は増加し、ＥＧＦＲの発現及び／又は活性化が増加している場合は、神経膠腫はＥＧＦＲ阻害剤に応答する可能性がないか及び／又は非応答性であると同定される。必要に応じて、Ｓ６リリボソームポリペプチドのリン酸化は腫瘍又は試料をｍＴＯＲ阻害剤に接触させた後に測定され、及び／又は、ＡＫＴ及び／又はＥＲＫのリン酸化は腫瘍又は試料をＥＧＦＲ阻害剤に接触させた後に測定される。例示的な態様においては、ｍＴＯＲ阻害剤はラパマイシン、ＳＤＺ−ＲＡＤ、ＣＣＩ−７７９、ＲＡＤ００１又はＡＰ２３５７３であり、ＥＧＦＲ阻害剤は、ＺＤ−１８３９、ＯＳＩ−７７４、ＰＤ−１５３０５３、ＰＤ−１６８３９３、ＩＭＣ−Ｃ２２５又はＣＩ−１０３３である。

一般的な方法では、バイオマーカーポリペプチドの発現は、配列番号１の２３５位でリン酸化されたセリン残基を含むエピトープに結合する抗体、配列番号４の４７３位でリン酸化されたセリン残基を含むエピトープに結合する抗体、又は配列番号８の２０２位でリン酸化されたスレオニン残基及び２０４位のチロシンを含むエピトープに結合する抗体等の抗体を用いて試験される。必要に応じて、試料はパラフィン包埋された生検試料である。

本発明の別の態様は、ＰＴＥＮポリペプチド（配列番号５）を発現しておらず、ｍＴＯＲポリペプチド（配列番号２）活性の阻害剤に応答する可能性がないか又は非応答性である哺乳動物の神経膠腫を同定する方法であり、当該方法は腫瘍から得られた試料を、腫瘍又は試料を阻害剤に接触させた後にリン酸化Ｓ６リリボソームポリペプチド（配列番号１）の存在について試験することを包含し、そこでは、阻害剤と接触させていない対照と比較して、試料中のリン酸化Ｓ６リリボソームポリペプチドの減少が観察された場合には、神経膠腫は阻害剤に応答しそうか又は応答性であると同定され、対照と比較して試料中のリン酸化Ｓ６リリボソームポリペプチドの減少が観察されない場合には、神経膠腫は阻害剤に応答する可能性がないか又は非応答性であると同定される。

本発明のさらに別の態様は、ＰＴＥＮポリペプチド（配列番号５）を発現しており、ＥＧＦＲポリペプチド（配列番号７）活性の阻害剤に応答する可能性がないか又は非応答性である哺乳動物の神経膠腫を同定する方法であり、当該方法は腫瘍から得られた試料を、腫瘍又は試料を阻害剤に接触させた後にＥＧＦＲ（配列番号７）の存在及びリン酸化ＡＫＴポリペプチド（配列番号４）の存在又はリン酸化ＥＲＫポリペプチド（配列番号８）の存在について試験することを包含し、そこでＥＧＦＲポリペプチドレベル及びリン酸化ＡＫＴポリペプチド又はリン酸化ＥＲＫポリペプチドのレベルが増加した場合は、神経膠腫は阻害剤に応答する可能性がないか又は非応答性であると同定される。必要に応じて、腫瘍から得られた試料は、リン酸化ＡＫＴポリペプチド（配列番号４）の存在及びリン酸化ＥＲＫポリペプチド（配列番号８）の存在について試験される。

上記のように、本発明の特定の態様は、ポリペプチドの発現又はポリペプチドのリン酸化についての試験を包含する。当該技術分野で公知であるように、細胞又は組織試料でのこれらのポリペプチド発現及びポリペプチドリン酸化状態の試験は、対照すなわちポリペプチドの発現又はリン酸化のレベルが定義された又はあらかじめ測定された対照細胞及び／又は組織試料と比較して、一般的に評価される。ポリペプチドリン酸化の例では、対照は、ポリペプチドが一般的にリン酸化されていないことが観察されている正常組織（例えば、非癌神経膠細胞）であり得る。ポリペプチド発現の例では、実施例３及び図２が、このような対照、特に対照として血管内皮細胞を用いる分野で知られるＰＴＥＮ発現の格付けシステムを使用した本発明の方法の実例を提供した。特に（ＰＴＥＮの発現と直接相関している）ＰＴＥＮ免疫組織化学染色は、０−２の確立された単位に従って評価され、そこでは血管内皮細胞（スコアー２）が内部対照として働いている。腫瘍細胞の染色強度が血管内皮細胞のそれと同じであれば腫瘍細胞は２として格付けされ、血管内皮細胞と比べて減少していれば１、腫瘍細胞で検出されず血管内皮細胞に存在していれば０となる。この格付けシステムは、（本明細書で開示されるような）神経膠腫及び乳、卵巣、膵臓及び結腸の癌を含む異なる癌細胞の種類の間で高い相関を示してきており、そのシステムは、ホルマリン固定されパラフィン包埋された生検試料等の試料でＰＴＥＮポリペプチドの発現レベルを技術者が容易に試験することを可能にする。

本発明のさらなるの態様は、ＰＴＥＮポリペプチド（配列番号５）を発現しておらず、ｍＴＯＲポリペプチド（配列番号２）活性の阻害剤に接触した際に増殖阻害を示しそうな哺乳動物の多形性膠芽腫の癌細胞を同定する方法であり、当該方法は癌細胞を、癌細胞を阻害剤に接触させた後にリン酸化Ｓ６リリボソームポリペプチド（配列番号１）の存在について試験することを包含し、そこでは、阻害剤と接触させていない対照となる哺乳動物の多形性膠芽腫の癌細胞と比較して、試料中のリン酸化Ｓ６リリボソームポリペプチドの減少が観察された場合には、癌細胞は阻害剤に接触した際に成長阻害を示しそうであると同定され、さらに、対照となる哺乳動物の細胞と比較して、試料中のリン酸化Ｓ６リリボソームポリペプチドの減少が観察されない場合には、癌細胞は阻害剤に接触した際に成長阻害を示しそうにないと同定される。これらの方法で、ｍＴＯＲポリペプチド活性の阻害剤は、必要に応じて、ラパマイシン、ＣＣＩ−７７９、ＲＡＤ００１又はＡＰ２３５７３である。一般的に、ＰＴＥＮポリペプチドの発現又はリン酸化Ｓ６リリボソームポリペプチドの発現はＰＴＥＮポリペプチド又はリン酸化Ｓ６リリボソームポリペプチドに結合する抗体（例えば、配列番号１の２３５位でリン酸化されたセリン残基を含むエピトープに結合する抗体）を用いて試験される。好ましくは、哺乳動物の多形性膠芽腫の癌細胞はパラフィン包埋された生検試料から得られる。

本発明の別の態様は、ＰＴＥＮポリペプチド（配列番号５）を発現しており、ＥＧＦＲポリペプチド（配列番号７）活性の阻害剤に接触した際に増殖阻害を示しそうにない哺乳動物の多形性膠芽腫の癌細胞を同定する方法であり、当該方法は癌細胞を、ＥＧＦＲ（配列番号７）の存在、リン酸化ＡＫＴポリペプチド（配列番号４）の存在又はリン酸化ＥＲＫポリペプチド（配列番号８）の存在について試験することを包含し、そこで、ＥＧＦＲポリペプチドのレベル及びリン酸化ＡＫＴポリペプチド又はリン酸化ＥＲＫポリペプチドのレベルが増加した場合は、癌細胞はＥＧＦＲポリペプチド阻害剤に接触した際に成長阻害を示しそうにないと同定される。これらの方法で、ＥＧＦＲ活性の阻害剤は、必要に応じて、ＺＤ−１８３９、ＯＳＩ−７７４、ＰＤ−１５３０５３、ＰＤ−１６８３９３又はＣＩ−１０３３である。一般的に、ＰＴＥＮポリペプチドの発現又はＥＧＦＲポリペプチドの存在はＰＴＥＮポリペプチド又はＥＧＦＲポリペプチドに結合する抗体を用いて試験される。必要に応じて、リン酸化ＡＫＴの存在が配列番号４の４７３位でリン酸化されたセリン残基を含むエピトープに結合する抗体を用いて試験され、リン酸化ＥＲＫの存在が配列番号８の２０２位でリン酸化されたスレオニン残基又は２０４位でリン酸化されたチロシン残基を含むエピトープに結合する抗体を用いて試験される。実例となる方法では、哺乳動物の多形性膠芽腫の癌細胞はパラフィン包埋された生検試料から得られる。

本発明の別の態様は、ＥＧＦＲポリペプチド（配列番号７）阻害剤又はｍＴＯＲポリペプチド（配列番号２）阻害剤からなるグループから選ばれた増殖阻害剤に対する哺乳動物の神経膠腫細胞の応答を決定するための方法であり、当該方法は、神経膠腫細胞をリン酸化されたセリン、スレオニン又はチロシン残基を有するＳ６ポリペプチド（配列番号１）、リン酸化されたセリン、スレオニン又はチロシン残基を有するｍＴＯＲポリペプチド（配列番号２）、リン酸化されたセリン、スレオニン又はチロシン残基を有するＦＫＨＲポリペプチド（配列番号３）、リン酸化されたセリン、スレオニン又はチロシン残基を有するＡＫＴポリペプチド（配列番号４）、リン酸化されたセリン、スレオニン又はチロシン残基を有するＥＲＫポリペプチド（配列番号８）の存在又はＰＴＥＮポリペプチド（配列番号５）の発現について試験することを包含し、そこで、対照である哺乳動物の血管内皮細胞と比較して、膠芽腫の細胞でのリン酸化されたＳ６、ｍＴＯＲ、ＦＫＨＲ、ＡＫＴ又はＥＲＫポリペプチドの存在又はＰＴＥＮポリペプチドの発現レベルの減少は、増殖阻害剤に対する哺乳動物の膠芽腫細胞の応答を決定する。これらの方法において、必要に応じて、膠芽腫細胞は増殖阻害剤と接触している。あるいは、膠芽腫細胞は増殖阻害剤と接触していない。

本発明のさらに別の態様は、ヒトで膠芽腫を処理するための治療剤を同定するために使用される情報を得る方法であり、当該方法はヒトから得られた膠芽腫細胞をリン酸化されたセリン、スレオニン又はチロシン残基を有するＳ６ポリペプチド（配列番号１）、リン酸化されたセリン、スレオニン又はチロシン残基を有するｍＴＯＲポリペプチド（配列番号２）、リン酸化されたセリン、スレオニン又はチロシン残基を有するＦＫＨＲポリペプチド（配列番号３）、リン酸化されたセリン、スレオニン又はチロシン残基を有するＡＫＴポリペプチド（配列番号４）の存在又はＰＴＥＮポリペプチド（配列番号５）発現レベルの減少について試験することを包含し、そこで、膠芽腫の細胞でリン酸化されたＳ６、ｍＴＯＲ、ＦＫＨＲ又はＡＫＴポリペプチドの存在又はＰＴＥＮポリペプチドの発現レベルの減少は、ヒトで膠芽腫を処理するための治療剤を同定するのに用いられる情報を提供する。この方法では、必要に応じて、膠芽腫の細胞は多数のこれら特徴の存在について試験される。このような態様の一つにおいては、膠芽腫の細胞はリン酸化されたセリン、スレオニン又はチロシン残基を有するＳ６ポリペプチド（配列番号１）の存在及びＰＴＥＮポリペプチド（配列番号５）発現レベルの減少について試験される。必要に応じて、膠芽腫の細胞はパラフィン包埋された生検試料である。

上記のように、本発明の態様は一般的に、リン酸化されたポリペプチド、すなわち、リン酸化されたセリン、スレオニン又はチロシン残基を有するポリペプチドに特異的に結合する抗体を利用する。これに関連して、開示はリン酸化残基（例えば、配列番号２で２４８１位のセリン）を含む特異的なエピトープに結合する抗体を提供する。リン酸化残基を含むエピトープに結合する（すなわちリン酸特異的抗体）が同じポリペプチドのリン酸化されていない形には結合しない抗体を利用することで、これらのリン酸特異的抗体は、活性化が一つかそれ以上の明記された残基のリン酸化に関連している経路において活性化状態を試験するのに使用され得る。本発明の特定の態様においては、情報伝達経路の複数の構成員（例えばＳ６及びｍＴＯＲ）のリン酸化状態及び／又は発現レベルが、経路に関連した情報伝達カスケードの確認的な評価として試験される。

本発明の特定の態様においてはホルマリン固定されパラフィン包埋された生検試料で使用される。特に、本明細書で提供される開示によれば、リン酸特異的抗体等の抗体はこの方法で処理された抗原試料で使用され得ることが示される。意味あることに、さらに本明細書で提供される開示によれば、これらの試料を用いた方法はこれらの試料における経路の生理学的な状態の正確な描写を提供する。それゆえに、本明細書で提供される開示は、本発明の方法が広く入手できる臨床試料での使用にどのようによく適合しているのかを示している。

本発明の実例となる態様の１つにおいては、リン酸化されたセリン、スレオニン又はチロシン残基を有するＳ６ポリペプチド（配列番号１）の存在が、配列番号１の２３５位でリン酸化されたセリン残基を含むエピトープに結合する抗体を用いて試験される。本発明の別の例示的態様においては、リン酸化されたセリン、スレオニン又はチロシン残基を有するｍＴＯＲポリペプチド（配列番号２）の存在が、配列番号２の２４８１位でリン酸化されたセリン残基を含むエピトープに結合する抗体を用いて試験される。本発明の別の例示的態様においては、リン酸化されたセリン、スレオニン又はチロシン残基を有するＦＫＨＲポリペプチド（配列番号３）の存在が、配列番号３の２４位でリン酸化されたスレオニン残基を含むエピトープに結合する抗体を用いて試験される。本発明の別の例示的態様においては、リン酸化されたセリン、スレオニン又はチロシン残基を有するＡＫＴポリペプチド（配列番号４）の存在が、配列番号４の４７３位でリン酸化されたセリン残基を含むエピトープに結合する抗体を用いて試験される。さらなるポリペプチドマーカーの存在レベル及び／又はリン酸化も同様に試験され得る。これらさらなるマーカーの実例はＫｉ−６７（配列番号９）及びｐ−Ｈ３ヒストンＨ３（配列番号１０）を包含する。

本発明のさらに別の態様は、哺乳動物の細胞を配列番号１の２３５位でリン酸化されたセリン残基を有するＳ６ポリペプチド（配列番号１）、配列番号２の２４８１位でリン酸化されたセリン残基を有するｍＴＯＲポリペプチド（配列番号２）、配列番号３の２４位でリン酸化されたスレオニン残基を有するＦＫＨＲポリペプチド（配列番号３）、配列番号４の４７３位でリン酸化されたセリン残基を有するＡＫＴポリペプチド（配列番号４）の存在、又は、ＰＴＥＮポリペプチド（配列番号５）発現レベルの減少について試験することを含む、哺乳動物の細胞をＡｋｔ経路活性化の証拠について試験する方法であり、そこで、リン酸化されたＳ６、ｍＴＯＲ、ＦＫＨＲ又はＡＫＴポリペプチドの存在、又は、ＰＴＥＮポリペプチドの発現レベルの減少は、哺乳動物の細胞でＡｋｔ経路が活性化したことを証明する。必要に応じて、哺乳動物の細胞は配列番号１の２３５位でリン酸化されたセリン残基を有するＳ６ポリペプチド（配列番号１）及びＰＴＥＮポリペプチド（配列番号５）発現レベルの減少等の多数の特徴の存在について試験される。この方法では一般的に哺乳動物の細胞は膠芽腫系統の癌細胞等の癌細胞である。

本発明の特定の態様は、さらに、例えば、腫瘍の進行について予後を決定するのに試験の結果を用いること及び／又は最初の診断から患者の死に至るまでの時間が短いことによって特徴付けられる膠芽腫の存在を同定するために試験の結果を用いること等の方法上の工程を包含する。必要に応じて、さらなる方法上の工程は、膠芽腫細胞に対するラパマイシンの効果を評価するために試験の結果を用いる工程等の膠芽腫を処理するための治療剤を同定するために試験の結果を用いる段階を包含する。必要に応じて、哺乳動物の細胞はパラフィン包埋された生検試料中にある。

本発明の好ましい態様は、ｍＴＯＲ、ＦＫＨＲ又はＳ６からなるグループから選ばれる哺乳動物細胞中のリン酸化タンパク質の存在について細胞を試験するためにリン酸特異的抗体を用いることを包含する、哺乳動物細胞をＡｋｔ経路の活性化の証拠について試験する方法であり、そこでは、哺乳動物細胞中でリン酸化ｍＴＯＲ、ＦＫＨＲ又はＳ６の存在はＡｋｔ経路の活性化の証拠を提供する。より好ましい態様では、細胞はｍＴＯＲ、ＦＫＨＲ、Ｓ６タンパク質の同時リン酸化について試験される。このような方法は一般的に、哺乳動物細胞中でＡｋｔタンパク質のリン酸化の証拠について細胞を試験するために、リン酸特異的抗体を使用する任意の工程を包含する。このような方法では、哺乳動物の細胞は一般的にパラフィン包埋された生検試料中に存在する癌細胞である。本発明のより好ましい態様では、癌細胞は膠芽腫系統である。

本発明のさらに別の態様は、細胞中のｐ−４４／４２ＭＡＰキナーゼタンパク質の存在について細胞を試験するためにリン酸特異的抗体を用いることを包含する、哺乳動物細胞をＥｒｋ経路の活性化の証拠について試験する方法であり、そこでは、哺乳動物細胞中でリン酸化されたｐ−４４／４２ＭＡＰキナーゼタンパク質の存在はＥｒｋ経路の活性化の証拠を提供する。好ましい態様では、哺乳動物細胞は、膠芽腫に罹っていることが疑われる個体から得られたパラフィン包埋された生検試料中に存在する。

本発明の別の態様は、腫瘍へより短い時間で進行することによって特徴付けられる表現型を有する哺乳動物の膠芽腫細胞の存在について組織試料を試験する方法であり、細胞内にリン酸化したｍＴＯＲ、ＦＫＨＲ及びＳ６タンパク質が存在するか調べるためにリン酸特異的抗体を使用することを包含し、そこでは、哺乳動物細胞内にリン酸化したｍＴＯＲ、ＦＫＨＲ及びＳ６タンパク質が存在することは、その表現型の証拠を提供する。本発明の関連した態様は、最初の診断から患者の死までの時間が短いことによって特徴付けられる表現型を有する哺乳動物の膠芽腫細胞の存在について組織試料を試験する方法であり、細胞内にリン酸化したｍＴＯＲ、ＦＫＨＲ及びＳ６タンパク質が存在するか調べるためにリン酸特異的抗体を使用することを包含し、そこでは、哺乳動物細胞内にリン酸化したｍＴＯＲ、ＦＫＨＲ及びＳ６タンパク質が存在することは、その表現型の証拠を提供する。

別の態様は、腫瘍へより短い時間で進行することによって特徴付けられる表現型を有する哺乳動物の膠芽腫細胞の存在について組織試料を試験する方法であり、細胞内にリン酸化したＥｒｋタンパク質が存在するか調べるためにリン酸特異的抗体を使用することを包含し、そこでは、哺乳動物細胞内にリン酸化したＥｒｋタンパク質が存在することは、その表現型の証拠を提供する。本発明の関連した態様は、最初の診断から患者の死までの時間が短いことによって特徴付けられる表現型を有する哺乳動物の膠芽腫細胞の存在について組織試料を試験する方法であり、細胞内にリン酸化したｐ−４４／４２ＭＡＰキナーゼタンパク質が存在するか調べるためにリン酸特異的抗体を使用することを包含し、そこでは、哺乳動物細胞内にリン酸化したｐ−４４／４２ＭＡＰキナーゼタンパク質が存在することは、その表現型の証拠を提供する。

本発明のさらに別の態様は、膠芽腫に罹っている個体を処理するために用いられる適当な治療剤を同定するのに有用な情報を得る方法であり、ｍＴＯＲ、ＦＫＨＲ及びＳ６からなるグループから選択されたリン酸化タンパク質を有する膠芽腫細胞の存在について患者からの組織試料を試験することを包含し、そこでは、哺乳動物細胞内にリン酸化されたｍＴＯＲ、ＦＫＨＲ又はＳ６タンパク質が存在することは、膠芽腫に罹っている個体を処理するために用いられる適当な治療剤を同定するのに有用な情報を提供する。本発明のさらに好ましい態様では、哺乳動物細胞はｍＴＯＲ、ＦＫＨＲ及びＳ６からなるグループから選択された少なくとも２つ、より好ましくは３つのリン酸化タンパク質の存在について試験される。一般的に治療剤はＡｋｔ経路のキナーゼ阻害剤である。

本発明の別の態様は、膠芽腫に罹っている個体を処理するために用いられる適当な治療剤を同定するのに有用な情報を得る方法であり、リン酸化されたＥｒｋタンパク質を有する膠芽腫細胞の存在について患者からの組織試料を試験することを包含し、そこでは、哺乳動物細胞内にリン酸化されたＥｒｋタンパク質が存在することは、膠芽腫に罹っている個体を処理するために用いられる適当な治療剤を同定するのに使用し得る情報を提供する。

発明の別の態様は、Ａｋｔ経路活性化の証拠について哺乳動物細胞を試験する方法であり、ＥＧＦＲ及びＥＧＦＲｖＩＩＩタンパク質の発現について細胞を試験することを包含し、そこでは、細胞内でＥＧＦＲ及びＥＧＦＲｖＩＩＩタンパク質の共発現はＡｋｔ経路活性化の証拠を提供する。本発明の関連した態様は、Ｅｒｋ経路活性化の証拠について哺乳動物細胞を試験する方法であり、ＥＧＦＲ及びＥＧＦＲｖＩＩＩタンパク質の発現について細胞を試験することを包含し、そこでは、細胞内でＥＧＦＲ及びＥＧＦＲｖＩＩＩタンパク質の共発現はＥｒｋ経路活性化の証拠を提供する。本発明のさらに別の態様は、Ａｋｔ経路活性化の証拠について哺乳動物の膠芽腫細胞を試験する方法であり、そこでは、哺乳動物の膠芽腫細胞はパラフィン包埋された生検試料から得られ、当該試験方法は、ＰＴＥＮタンパク質の発現減少について細胞を試験することを包含し、そこでは、ＰＴＥＮタンパク質発現の減少はＡｋｔ経路活性化の証拠を提供する。

本発明の製品
本発明の態様は、本発明の方法を容易に実施できるよう設計された製品及び／又はキットも包含する。一般的に、このようなキットはその中に本発明の方法に従った要素の使用についての説明書を含む。このようなキットはバイアル、チューブ等の１又はそれ以上の容器手段を狭い場所に受け入れるために区画分けされている運搬手段を含むことができ、それぞれの容器手段は方法で使用される分離された要素の１つを含んでいる。例えば、容器手段の１つは、検出可能なようにマーカーで標識されているか又はされ得る本明細書で開示された抗体（例えば抗Ｓ６抗体）を１つ又はそれ以上包含し得る。キットが、これらの方法のための緩衝液を含む容器及び／又は発色団又は放射性分子等のレポーター手段で標識された抗体を含む容器も有するのは、キットが標的タンパク質を検出するために免疫学的方法（例えば免疫組織化学及びウエスタンブロッティング）を利用するからである。加えて、アポトーシスについてカスパーゼ−３アッセイ又はｔｕｎｅｌアッセイ等のさらなる方法を利用するキットについては、これらの手法に関連したさらなる試薬がさらにキットに含まれ得る。

本発明の一般的な態様では、上述された開示の試験に有用である材料を含んだ製品の物品が提供される。製品の物品は容器及びラベルを含む。適当な容器は、例えばボトル、バイアル、シリンジ及びテストチューブを含む。容器はガラス又はプラスチック等の様々な材料から形成されても良い。容器は哺乳動物の細胞（例えば、膠芽腫細胞）を試験するのに効果的な組成物（例えば、抗体組成物）を保持し得る。容器上の又は容器に関連したラベルは、組成物が細胞のポリペプチドを試験するのに用いられることを指示している。製品中の物品は、リン酸緩衝生理食塩水、リンガー溶液及びブドウ糖溶液等の緩衝液を含んだ第２の容器をさらに含んでいても良い。それはさらに、他の緩衝液、希釈液、フィルター、針、シリンジ及び使用説明が記載されたパッケージ挿入物を含む、商用及び使用者の立場から見て望ましい他の材料を含んでいても良い。

本発明のこのような態様の１つは、以下の抗体、Ｓ６ポリペプチド（配列番号１）に結合する抗体、そこでは抗体が結合するＳ６ポリペプチドエピトープはリン酸化されたセリン、スレオニン又はチロシン残基を含んでおり、ｍＴＯＲポリペプチド（配列番号２）に結合する抗体、そこでは抗体が結合するｍＴＯＲポリペプチドエピトープはリン酸化されたセリン、スレオニン又はチロシン残基を含んでおり、ＦＫＨＲポリペプチド（配列番号３）に結合する抗体、そこでは抗体が結合するＦＫＨＲポリペプチドエピトープはリン酸化されたセリン、スレオニン又はチロシン残基を含んでおり、ＡＫＴポリペプチド（配列番号４）に結合する抗体、そこでは抗体が結合するＡＫＴポリペプチドエピトープはリン酸化されたセリン、スレオニン又はチロシン残基を含んでおり、からなるグループから選ばれる少なくとも１つの抗体を含んだキットであり、そこではキットはさらにＡＫＴ経路活性化の証拠について哺乳動物の細胞を試験することに関する抗体の使用説明を含んでいる。必要に応じて、キットはさらに、ＰＴＥＮポリペプチド（配列番号５）に結合する抗体を含んでいる。本発明のキットはさらに、Ｋｉ−６７（配列番号９）及びｐ−Ｈ３ヒストンＨ３（配列番号１０）等のさらなるポリペプチドに対する抗体を含むこともできる。

本発明の別の態様は、リン酸化されたＡｋｔ、ｍＴＯＲ、ＦＫＨＲ及びＳ６タンパク質からなるグループから選択された哺乳動物細胞中のリン酸化タンパク質に免疫特異的に結合することができる抗体及びＡＫＴ経路活性化の証拠について哺乳動物の細胞を試験することに対しての抗体の使用説明を含むキットである。好ましい方法では、キットは異なる抗体を含んでおり、その抗体はそれぞれ、リン酸化されたＡｋｔ、ｍＴＯＲ、ＦＫＨＲ及びＳ６タンパク質からなるグループから選択された哺乳動物細胞中の２、３又は４つのリン酸化タンパク質に免疫特異的に結合することができる。本発明の別の態様は、パラフィン包埋された生検試料に存在する哺乳動物の膠芽腫細胞中のリン酸化ｐ−４４／４２ＭＡＰキナーゼタンパク質に免疫特異的に結合することができる抗体及びＥｒｋ経路活性化の証拠について哺乳動物の細胞を試験することに関する抗体の使用説明を含むキットである。

本発明のさらに別の態様は、哺乳動物の膠芽腫（ＧＢＭ）の腫瘍又は細胞を特徴付けるためのキットであり、当該キットはＰＴＥＮ（配列番号５）に結合する抗体及び以下の抗体、リン酸化されたＳ６リボゾーマルタンパク質（配列番号１）に結合する抗体、ＥＦＧＲ（配列番号７）に結合する抗体、リン酸化されたＡＫＴ（配列番号４）に結合する抗体及び／又はリン酸化されたＥＲＫ（配列番号８）に結合する抗体、のうち少なくとも１つ、そして、上記の一次抗体に結合する少なくとも１つの二次抗体を含んでいる。必要に応じて、キットは多数のこれらの抗体を含んでいる。特有の態様では、キットは、配列番号１の２３５位でリン酸化されたセリン残基を有するＳ６リボゾーマルタンパク質（配列番号１）に対して特異的な抗体、配列番号４の４７３位でリン酸化されたセリン残基を有するＡＫＴ（配列番号４）に対して特異的な抗体又は配列番号８の２０２位でリン酸化されたスレオニン残基又は２０４位でリン酸化されたチロシン残基を有するＥＲＫ（配列番号８）に対して特異的な抗体を含んでいる。

本発明の別の態様は、哺乳動物の神経膠腫又はその細胞を特徴付けるためのキットであり、当該キットはＰＴＥＮ（配列番号５）に結合する抗体、リン酸化されたＳ６リリボソームポリペプチド（配列番号１）に結合する抗体、ＥＦＧＲ（配列番号７）に結合する抗体、リン酸化されたＡＫＴ（配列番号４）に結合する抗体、リン酸化されたＥＲＫ（配列番号８）に結合する抗体を含んでいる。一般的に、キットはさらに、これらのポリペプチドに対する一次抗体の１つに結合する二次抗体を含んでいる。必要に応じて、キットは、配列番号１の２３５位でリン酸化されたセリン残基を有するＳ６リリボソームポリペプチド（配列番号１）に対して特異的な抗体、配列番号４の４７３位でリン酸化されたセリン残基を有するＡＫＴ（配列番号４）に対して特異的な抗体又は配列番号８の２０２位でリン酸化されたスレオニン残基及び２０４位のチロシン残基を有するＥＲＫに対して特異的な抗体等の多数の抗体を含んでいる。必要に応じて、キットはさらに、Ｋｉ−６７ポリペプチド（配列番号９）、ｐ−Ｈ３ヒストンポリペプチド（配列番号１０）又はカスパーゼ−３ポリペプチド（配列番号１１）に結合する抗体を含んでいる。

本発明の実施に有用な一般的な実験計画
本発明の方法は、一般的にＰＩ３Ｋ／Ａｋｔ経路のポリペプチドに対する抗体を利用する。本発明で有用な実例となる抗体組成物は、ＰＩ３Ｋ／Ａｋｔ経路に関連するポリペプチドのリン酸化型に特異的に免疫反応する抗体分子を含んでいることを特徴とする抗リン酸化タンパク質抗体である。ポリペプチドは、例えば、Ｓ６、ｍＴＯＲ、ＦＫＨＲ、ＡＫＴ又はＰＴＥＮであっても良い。「特異的に免疫反応する」に関して言えば、それは、抗体がポリペプチドのリン酸化型に結合し（すなわちリン酸特異的）、同じポリペプチドの非リン酸化型には結合しないことを意味している。従って、経路の活性化に関連するリン酸化はこれらの抗体で試験し得る。それゆえに、本発明の抗体は、ＰＩ３Ｋ／Ａｋｔ経路に関連するポリペプチドのリン酸化型及び非リン酸化型を区別し得る。従って、経路活性化に関連するリン酸化はこれらの抗体で試験し得る。一般的に、本発明のアッセイは本明細書で開示される抗体を使用する免疫組織化学的な手法を包含する。例えば、試料は配列番号８の２０２位でリン酸化されたスレオニン残基及び２０４位のチロシン残基を含むエピトープに結合する抗体を使用することによってリン酸化ＥＲＫ等の生化学的な経路に関連するリン酸化ポリペプチドの存在について試験され得る。

１．抗体
本発明で有用な抗体はポリクローナル抗体、例えばアフィニティー精製されたポリクローナル抗体を包含しても良い。ポリクローナル抗体を調製する方法は熟練した技術者に公知である。ポリクローナル抗体は、例えば免疫原及び望まれるならばアジュバントを１回又はそれ以上注入することによって、哺乳動物で生じさせることができる。一般的に、免疫原及び／又はアジュバントは複数の皮下又は腹腔内注入によって哺乳動物に注入されるであろう。免疫原は適当なポリペプチドエピトープ（例えば、リン酸化されたセリン、スレオニン又はチロシン残基を有するＳ６ポリペプチド（配列番号１）、リン酸化されたセリン、スレオニン又はチロシン残基を有するｍＴＯＲポリペプチド（配列番号２）、リン酸化されたセリン、スレオニン又はチロシン残基を有するＦＫＨＲポリペプチド（配列番号３）、リン酸化されたセリン、スレオニン又はチロシン残基を有するＥＲＫポリペプチド（配列番号８）、リン酸化されたセリン、スレオニン又はチロシン残基を有するＡＫＴポリペプチド（配列番号４）又はＰＴＥＮポリペプチド）又はそれらの融合タンパク質を含んでいても良い。

さらに、免疫原を、免疫されるのに適した哺乳動物で免疫原性があることが知られているタンパク質に結合させることが有用であるかもしれない。このような免疫原性タンパク質の例は、キーホールリンペットヘモシニアン、血清アルブミン、ウシサイログロブリン及びダイズトリプシン阻害因子を含むがそれらに制限されない。使用されるかもしれないアジュバントの例はフロイント完全アジュバント及びＭＰＬ−ＴＤＭアジュバント（モノホスホリルリピドＡ、合成トレハロースジコリノミコレート）を含む。免疫化の実験計画は過度の実験を行うことなしに当業者によって選択される得る。

あるいは、抗体はモノクローナル抗体であっても良い。モノクローナル抗体はＫｏｈｌｅｒ ａｎｄ Ｍｉｌｓｔｅｉｎ，Ｎａｔｕｒｅ，２５６：４９５（１９７５）によって記載されるようなハイブリドーマ法を用いて調製されても良い。ハイブリドーマ法では、マウス、ハムスター又は他の適当な宿主動物が、一般的に、免疫原に特異的に結合するはずの抗体を産生するか又は産生できるリンパ球を顕在化するために免疫原で免疫される。あるいは、リンパ球はインビトロで免疫されても良い。

免疫原は一般的にリン酸化されたＳ６、ｍＴＯＲ、ＦＫＨＲ、ＥＲＫ又はＡＫＴポリペプチド又はＰＴＥＮポリペプチド、又はそれらの融合タンパク質を含むであろう。一般的に、末梢血リンパ球（ＰＢＬ）はヒト起源の細胞が望まれる場合に使用され、脾臓細胞又はリンパ節は非ヒト哺乳動物源が望まれる場合に使用される。リンパ球はそれからポリエチレングリコール等の適当な融合剤を用いて不滅化された細胞系と融合され、ハイブリドーマ細胞を形成する（Ｇｏｄｉｎｇ，Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，（１９８６）ｐｐ．５９−１０３）。不滅化された細胞系は、通常、形質転換された哺乳動物細胞、特にネズミ、ウシ及びヒト起源のミエローマ細胞である。通常、ラット又はマウスミエローマ細胞系が使用される。ハイブリドーマ細胞は、好ましくは融合していない不滅化細胞の成長や生存を阻害する物質を１つ又はそれ以上含む適当な培地で培養されても良い。例えば、親の細胞がヒポキサンチングアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（ＨＧＰＲＴ又はＨＰＲＴ）酵素を欠いているならば、ハイブリドーマ用の培養培地は一般的にヒポキサンチン、アミノプテリン及びチミジン、それらの物質はＨＧＰＲＴ欠失細胞の成長を妨げるが、それらを含んでいるだろう（「ＨＡＴ培地」）。

好ましい不滅化細胞系は、効率よく融合し、選択された抗体産生細胞による抗体の安定した高い発現レベルを維持し、ＨＡＴ培地等の培地に感受性のある細胞系である。より好ましい不滅化細胞系は、マウスミエローマ系であり、それは例えばｔｈｅ Ｓａｌｋ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ Ｃｅｌｌ Ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ Ｃｅｎｔｅｒ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ及びｔｈｅ Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ，Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，Ｍａｒｙｌａｎｄから入手することができる。ヒトミエローマ及びマウス−ヒトヘテロミエローマ細胞系もヒトモノクローナル抗体の産生について記述されている（Ｋｏｚｂｏｒ，，Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１３３：３００１（１９８４）、Ｂｒｏｄｅｕｒら、Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，（１９８７）ｐｐ．５１−６３）。

その後ハイブリドーマが培養される培養培地はリン酸化されたＳ６、ｍＴＯＲ、ＦＫＨＲ、ＥＲＫ又はＡＫＴポリペプチド、又は、ＰＴＥＮ及びＥＧＦＲポリペプチドに対するモノクローナル抗体の存在についてアッセイされ得る。好ましくは、ハイブリドーマ細胞によって産生されるモノクローナル抗体の結合特異性は、免疫沈降によって又は放射免疫測定法（ＲＩＡ）又は酵素免疫抗体法（ＥＬＩＳＡ）等のインビトロ結合アッセイによって、決定される。これらの手法及びアッセイは当該技術分野で公知である。モノクローナル抗体の結合親和性はＭｕｎｓｏｎ ａｎｄ Ｐｏｌｌａｒｄ，Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１０７：２２０（１９８０）のスキャッチャードアッセイによって決定され得る。

望まれるハイブリドーマ細胞が同定された後、クローンは限界希釈法によってサブクローニングされ標準の方法によって成育される（Ｇｏｄｉｎｇ，上記）。この目的に適した培養培地は例えばダルベッコ改変イーグル培地及びＲＰＭＩ−１６４０培地を含む。あるいは、ハイブリドーマ細胞は哺乳動物の腹水等のインビボで成育されても良い。サブクローンから分泌されるモノクローナル抗体は、例えばプロテインＡ−セファロース、ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィー、ゲル電気泳動、透析又はアフィニティークロマトグラフィー等の従来から用いられている免疫グロブリン精製法によって培養培地又は腹水から同定又は精製されても良い。

モノクローナル抗体は、また、米国特許第４，８１６，５６７号に記述されているような組換えＤＮＡ法によって生産されても良い。本発明のモノクローナル抗体をコードするＤＮＡは従来法を用いて（例えばマウス抗体の重鎖及び軽鎖をコードする遺伝子に特異的に結合することができるオリゴヌクレオチドプローブを用いることによって）容易に同定され配列決定され得る。本発明のハイブリドーマ細胞はこのようなＤＮＡの好ましい供給源として役立つ。ひとたび分離されればＤＮＡは発現ベクター中に配置され、それから、組換え宿主細胞中でモノクローナル抗体の合成を達成するために、サルＣＯＳ細胞、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、又は、別の方法では免疫グロブリンタンパク質を産生しないミエローマ細胞等の宿主細胞に形質移入されるかもしれない。ＤＮＡは例えば、マウス相同配列の場所をヒトの重鎖及び軽鎖定常ドメインをコードする配列で置換すること（米国特許第４，８１６，５６７号、Ｍｏｒｒｉｓｏｎら、上記）によって、又は非免疫グロブリンポリペプチドをコードする配列の全て又は部分を免疫グロブリンコード配列に共有結合で結合させることによって、修飾されていても良い。このような非免疫グロブリンポリペプチドは本発明の抗体定常ドメインの代わりとすることもできるし、キメラ二価抗体を造るために本発明の抗体の抗原結合部位の１つである可変ドメインの代わりとすることもできる。

抗体は一価抗体であっても良い。一価抗体の調製法は当該技術分野で周知である。例えば、１つの方法は免疫グロブリン軽鎖及び修飾された重鎖の組換え発現に関する。一般に、重鎖が架橋されるのを防ぐために、Ｆｃ領域のいずれかの場所で重鎖は短くされる。あるいは、架橋を防ぐために、関連したシステイン残基が他のアミノ酸残基で置換されるか欠失される。

インビトロ法も一価抗体の調製に適している。抗体フラグメント、特にＦａｂフラグメントを製造するための抗体の消化は、当該技術分野で公知の決まりきった手法を用いて達成することができる。

抗体と同種のタンパク質との反応性は、ウエスタンブロット、免疫沈降、ＥＬＩＳＡ及びＦＡＣＳ解析を含む多くのよく知られた手段で確立され得る。抗体又はそのフラグメントは検出可能なマーカーで標識されるか第２の分子に結合され得る。適した検出可能なマーカーは放射性同位体、蛍光化合物、生物発光化合物、化学発光化合物、金属キレート化剤又は酵素を含むがそれらに限定されない。

２．アッセイ
本発明は制御されていない細胞増殖に関連する細胞経路を試験するためのアッセイを提供する。本発明の特定の態様は、組織内のリン酸化されたＳ６、ｍＴＯＲ、ＦＫＨＲ、ＡＫＴ又はＥＲＫポリペプチド、又は、ＰＴＥＮ及びＥＧＦＲポリペプチドの存在を検出する工程を包含する。これらのポリペプチドを検出する方法はよく知られ、例えば免疫沈降、免疫組織化学解析、ウエスタンブロット解析、分子結合アッセイ、ＥＬＩＳＡ、ＥＬＩＦＡ等を含む。

一般的に、本発明のアッセイは免疫組織化学的な手法を包含する。本明細書で用いられる免疫組織化学的な手法は細胞特異的なマーカーを検出する試薬の使用を包含し、このような試薬は例えば抗体を含む。モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体及びそのフラグメントを含む抗体は、試料中の所定のタンパク質又はポリペプチドを同定するのにしばしば用いられる。多くの手法が、免疫組織化学的な手法に従って所定の対象を標識するのに利用される。このような手法はＣｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｕｎｉｔ １４ ｅｔ ｓｅｑ．，ｅｄｓ．Ａｕｓｕｂｅｌら、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，１９９５で考察され、その開示は参照として本明細書に取り込まれる。一般的な実験計画は、従来法（例えば米国特許６，６３１，２０３号を参照）に従って調製されたパラフィン包埋された組織切片を染色することを包含する。

本発明の特定の態様は、アポトーシスのマーカーであるｔｕｎｅｌアッセイを包含する。一般的に、ＴＵＮＥＬアッセイは、本質的に以下のように実施される。製造者の指示に従って（例えばＰｈｏｅｎｉｘ Ｆｌｏｗ Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｐｈｏｅｎｉｘ，ＡＺ参照）、ｔｈｅ ＡＰＯ−ＢＲＤＵ ｔｅｒｍｉｎａｌ ｄｅｏｘｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｙｌ ｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ（ＴｄＴ）−ｍｅｄｉａｔｅｄ ｄＵＴＰ−ｂｉｏｔｉｎ ｎｉｃｋ ｅｎｄ−ｌａｂｅｌｉｎｇ ａｓｓａｙ（例えばＧａｖｒｉｅｌｉら、Ｊ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．１１９：４９３−５０１参照）によってアポトーシス細胞の割合を検出する。本発明の方法に有用なＴＵＮＥＬアッセイのさらなる考察についてはＰｒｏｃｈａｚｋｏｖａら、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ２００３ Ｓｅｐ；３５（３）：５２８−３４、Ｄｕａｎら、Ｊ Ｐａｔｈｏｌ．２００３ Ｆｅｂ；１９９（２）：２２１−８及びＷａｌｋｅｒら、Ｊ Ｐａｔｈｏｌ．２００１ Ｏｃｔ；１９５（３）：２７５−６を参照されたい。

本発明の特定の態様はカスパーゼ−３アッセイを包含する。カスパーゼ−３アッセイで、死を誘導するアポトーシスの初期の重要な兆候であるカスパーゼ−３酵素の活性化（米国特許出願第２００２０１５９９９６及び米国特許第６，３４６，６０７号）を測定することは当業者であれば認識しているところである。本発明の方法に有用なＴＵＮＥＬアッセイのさらなる考察については、Ｄｕａｎら、Ｊ Ｐａｔｈｏｌ．２００３ Ｆｅｂ；１９９（２）：２２１−８及びＷａｌｋｅｒら、Ｊ Ｐａｔｈｏｌ．２００１ Ｏｃｔ；１９５（３）：２７５−６を参照されたい。

当該出願に於いては、様々な刊行物が引用されているが、これらの刊行物における開示は、すべて本明細書に参照として取り込まれる。
（実施例）

患者の選択と組織マイクロアッセイの構成
この研究に参加する全ての患者は、ＵＣＬＡ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌ Ｒｅｖｉｅｗ Ｂｏａｒｄ Ｐｏｌｉｃｉｅｓに従って、手術前にインフォームドコンセントを与えた。ホルマリン固定されパラフィン包埋された組織片を、初期の外科的な切除で膠芽腫と診断され、ＵＣＬＡの神経腫瘍学者によって治療された４５患者から得た。診断は少なくとも２人の神経病理学者によって独立に行われた。腫瘍を切除する前に治療された患者はいなかった。３つの代表的な０．６ｍｍの円筒形標本を、それぞれ初期ＧＢＭ患者から採取した組織片の診断領域から得た。２つを腫瘍の部位的に異なる領域から得、１つを可能であれば（約２／３の場合が可能）は正常な脳組織の領域から入手した。円筒形標本は組織アレイヤーを用いてパラフィンブロック中に格子状に挿入された。５ミクロンの切片を組織アレイから切り出し免疫組織化学的に分析した。組織アレイからの連続切片を免疫組織化学解析に使用した。４つの腫瘍がＰＴＥＮ、ＥＧＦＲ及びＥＧＦＲｖＩＩＩ解析に対して組織アレイ上に十分な材料を有していたが、ｐ−Ａｋｔ、ｐ−ｍＴＯＲ、ｐ−Ｓ６、ｐ−ＦＫＨＲ及びｐ−Ｅｒｋの解析に対しては十分な材料を有してはいなかった。

免疫組織化学染色
組織マイクロアレイからの切片をＰＴＥＮ（クローン６Ｈ２．１，Ｃａｓｃａｄｅ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ，Ｗｉｎｃｈｅｓｔｅｒ ＭＡ）、ＥＧＦＲ（クローン３１Ｇ７，Ｚｙｍｅｄ，Ｓａｎ Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ，ＣＡ）、ＥＧＦＲｖＩＩＩ（クローンＬ８Ａ４，Ｄｒ．Ｄａｒｒｅｌｌ Ｂｉｇｎｅｒより分与）それぞれに対するモノクローナル抗体、及び、ｐ−Ａｋｔ（セリン４７３）、ｐ−ＦＫＨＲ（スレオニン２４）／ｐ−ＦＫＨＲＬ１（スレオニン３２）、ｐ−ｍＴＯＲ（セリン２４８１）、ｐ−Ｓ６リボゾーマルタンパク質（セリン２３５／２３６）及びｐ−４４／４２ＭＡＰキナーゼ（ｐ−Ｅｒｋ）（スレオニン２０２／チロシン２０４）（Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｂｅｖｅｒｌｙ，ＭＡ）それぞれに対するリン酸化特異的抗体で染色した。切片を６０℃で焼き、キシレンで脱パラフィン処理し、エタノールまで徐々に変化させた。熱で誘導される抗原の修正を以下のように用いた。ｐ−Ｅｒｋ、ｐ−Ａｋｔ、ｐ−ｍＴＯＲ、ｐ−ＦＫＨＲ／ＦＫＨＲＬ１及びｐ−ｓ６に対しては０．０１Ｍクエン酸緩衝液、ｐＨ６、圧力釜で２５分間、ＰＴＥＮに対しては０．０１Ｍクエン酸緩衝液、ｐＨ６、電子レンジでで１６分間、ＥＧＦＲ、プロナーゼ（０．０３ｇ／ｍｌ ０ｆ ０．０５Ｍ トリス緩衝液、ｐＨ７．４）３７℃で８分間、ＥＧＦＲｖＩＩＩに対しては０．０１Ｍクエン酸緩衝液、ｐＨ６、野菜蒸し器で２５分間。内在性のペルオキシダーゼ活性をメタノール中３％過酸化水素で失活させた。一次抗体（ＰＴＥＮ １：４００、ＥＧＦＲ １：１５０、ＥＧＦＲｖＩＩＩ １：４００、ｐ−Ａｋｔ １：５０、ｐ−ｍＴＯＲ １：５０、ｐ−ＦＫＨＲ／ＦＫＨＲＬ１ １：５０、ｐＳ６ １：５０、ｐ−Ｅｒｋ １：５０）を０．１％Ｔｗｅｅｎトリス緩衝生理食塩水で希釈し、４℃で１６時間接触させ、１：１００希釈した抗マウス又は抗ウサギビオチン化免疫グロブリン（Ｖｅｃｔｏｒ）でさらに１時間接触させ、最後にアビジン−ビオチン複合体（Ｅｌｉｔｅ ＡＢＣ， Ｖｅｃｔｏｒ）で１時間接触させた。陰性対照スライドは正常マウス血清（ＤＡＣＯ）を一次抗体として用いた。ＰＴＥＮ、ＥＧＦＲ及びＥＧＦＲｖＩＩＩに対する特異的抗体の局在を可視化するために、ジアミノベンジジン四塩酸塩を酵素の基質として使用し、Ｖｅｃｔｏｒ ＮｏｖａＲｅｄ（Ｖｅｃｔｏｒ）をリン酸特異的抗体に対して使用した。スライドをハリスヘマトキシリンで対比染色した。

免疫組織化学の評価と解釈
ＰＴＥＮ−ＰＴＥＮ染色をこれまでに確立されている０−２の単位に従って評価したが、その単位では血管内皮細胞（スコアー２）が内部標準として働く（例えばＰｅｒｒｅｎら、Ａｍ Ｊ Ｐａｔｈｏｌ．１５７：１０９７−１０３．，２０００、Ｐｅｒｒｅｎら、Ａｍ Ｊ Ｐａｔｈｏｌ．１５５：１２５３−６０．，１９９９、Ｚｈｏｕら、Ａｍ Ｊ Ｐａｔｈｏｌ．１６１：４３９−４７．，２００２；Ｇｉｍｍら、Ａｍ Ｊ Ｐａｔｈｏｌ．１５６：１６９３−７００．，２０００参照）。腫瘍細胞の染色強度が血管内皮細胞のそれと同じであれば腫瘍細胞は２として格付けされ、血管内皮細胞と比べて減少していれば１、腫瘍細胞で検出されず血管内皮細胞に存在していれば０となる（例えばＺｈｏｕら、Ａｍ Ｊ Ｐａｔｈｏｌ．１６１：４３９−４７．，２００２参照）。この格付けシステムは、乳（例えばＰｅｒｒｅｎら、Ａｍ Ｊ Ｐａｔｈｏｌ．１５５：１２５３−６０．，１９９９参照）、卵巣（例えばＭｕｔｔｅｒら、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．６１：４３１１−４３１４．，２００１参照）、膵臓（例えばＰｅｒｒｅｎら、Ａｍ Ｊ Ｐａｔｈｏｌ．１５７：１０９７−１０３．，２０００参照）及び結腸（例えばＺｈｏｕら、Ａｍ Ｊ Ｐａｔｈｏｌ．１６１：４３９−４７．，２００２参照）を含む異なる癌の細胞種間で高い相関を示してきている。２人の神経病理学者がそれぞれ独立して腫瘍を評価した。さらに、神経病理学者の１人が独立した２回の機会に腫瘍を評価した。評価者内及び評価者間の意見は９０％以上一致した。

ＥＧＦＲ及びＥＧＦＲｖＩＩＩ−腫瘍細胞の２０％以上で強いＥＧＦＲ免疫染色陽性を示す腫瘍を陽性であると見なし（例えばＬｉｏｔｔａら、Ｊａｍａ．２８６．２２１１−４．，２００１参照）、ＥＧＦＲｖＩＩＩへの強い免疫反応に対して少なくとも適度な焦点を示す腫瘍を、以前の報告（例えばＣｈｏｅら、Ｃｌｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．８：２８９４−９０１．，２００２参照）のように陽性と見なした。ＥＧＦＲ及びＥＧＦＲｖＩＩＩに対する評価者内及び評価者間の意見の一致は＞９０％であった。

リン酸化特異的抗体−リン酸−Ａｋｔ、ｍＴＯＲ、Ｓ６及びＦＫＨＲを０−２の単位で評価した（０は染色なし、１＋＝弱い強度の細胞質染色及び２＋＝強い細胞質染色、１＋及び２＋を陽性と見なした）。独立した評価において同一評価者がそうであったように、評価者間の意見の一致はｐ−Ａｋｔで８０％であった。リン酸化ｍＴＯＲ、Ｓ６及びＦＫＨＲではより高く、ｍＴＯＲの８７％からＳ６の１００％の範囲にわたっていた。リン酸−ＥＲＫについては、陽性核染色を５％以上集中的に含んでいる腫瘍を以前の報告（例えばＣｈｏｅら、Ｃｌｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．８：２８９４−９０１．，２００２参照）のように陽性と見なした。評価者間及び独立した評価における同じ評価者での意見の一致は＞８５％であった。

統計的な解析
マーカー間の関連をフィッシャーの正確検定を用いて解析した。ソフトウェアは「ｈｏｍｅ．ｃｌａｒａ．ｎｅｔ」という用語を用いてインターネット検索で同定できるｔｈｅ Ｓｉｍｐｌｅ Ｉｎｔｅｒａｃｔｉｖｅ Ｓｔａｔｉｓｔｉｃａｌ Ｗｅｂｓｉｔｅで入手できる（ｈｔｔｐ：／／ｈｏｍｅ．ｃｌａｒａ．ｎｅｔ／ｓｉｓａ／ｉｎｄｅｘ．ｈｔｍ）。予後要素の解析のために、我々は手術以外の治療を受けていない１３患者を除外した。これらの患者は診断の時点で状態が悪く、さらなる治療を受けないので選択された。他の全ての患者は、領域分割放射線治療を含む少なくとも標準的な治療を受けていた。最初の診断から画像処理や臨床像によって進行の証拠が得られるまでの時間（腫瘍進行までの時間）及び最初の診断から死までの時間（全体の生存期間）と変量との関係を評価するために、カプラン−マイヤー曲線を作製した。腫瘍進行までの時間及び全体の生存期間において統計上有意な相違点を同定するために、ウィルコクソン二標本検定を用いた。

ＩＨＣによるＰＴＥＮ／Ａｋｔ経路の評価
我々は未処理の初期ＧＢＭ患者４５人から得た試料からなる組織マイクロアレイを構築した（表１）。全ての腫瘍はｄｅ ｎｏｖｏでグレードＩＶ腫瘍（初期ＧＢＭｓ）として存在した（例えばＫｌｅｉｈｕｅｓら、Ｎｅｕｒｏ−ｏｎｃｏｌ．ｌ：４４−５１．，１９９９参照）。いずれの患者も外科的切除の前にいかなる放射線又は化学療法も受けていなかった。我々が初期ＧＢＭｓに焦点を当てたのは、それらが高い確率でＰＴＥＮ変異及びＥＧＦＲ過剰発現を有しており（例えばＫｌｅｉｈｕｅｓら、Ｎｅｕｒｏ−ｏｎｃｏｌ．ｌ：４４−５１．，１９９９参照）、このことが以前に治療されていない状態でのＰＩ３’Ｋ／Ａｋｔ経路の活性化を解析することを可能にしたからである。患者は平均年齢５８歳で２８歳から８８歳まで及んでおり（表１）、全ての患者は少なくとも２人の独立した神経病理学者によって生検でＧＢＭであると診断された。

ＰＴＥＮタンパク質の発現が１７／４５のＧＢＭｓ（３８％）で減少又は消失した（図１、表２）。このことは３０−４０％のＧＢＭｓでＰＴＥＮの消失を検出したＤＮＡに基づく方法を用いた以前の研究（例えばＬｉｕら、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．５７：５２５４−７．，１９９７、Ｓｃｈｍｉｄｔら、Ｊ Ｎｅｕｒｏｐａｔｈｏｌ Ｅｘｐ Ｎｅｕｒｏｌ．５８：１１７０−８３．，１９９９、Ｓｍｉｔｈら、Ｊ Ｎａｔｌ Ｃａｎｃｅｒ Ｉｎｓｔ．９３：１２４６−５６．，２００１参照）と一致する。Ａｋｔリン酸化はＰＴＥＮの免疫組織化学的な発現の減少と有意に関連した（ｐ＜０．００００１）（図１、表２）。ＰＴＥＮの消失は、その活性化がＰＩ３’Ｋ／Ａｋｔ情報伝達から独立しているｐ−Ｅｒｋの発現とは有意な相関はなかった（表２）。Ａｋｔ活性化が下流の作用因子の同時活性化に相関するか否か決定するために、我々はｍＴＯＲ、ＦＫＨＲ及びＳ６に対するリン酸化特異的抗体を用いた。ｍＴＯＲ及びＦＫＨＲはＡｋｔによって直接リン酸化され（例えばＶｉｖａｎｃｏら、Ｎａｔ Ｒｅｖ Ｃａｎｃｅｒ．２：４８９−５０１．，２００２、Ｈｉｄａｌｇｏら、Ｏｎｃｏｇｅｎｅ．１９：６６８０−６６８６．，２０００参照）、Ｓ６はＡｋｔの標的であるｐ７０ Ｓ６キナーゼによってリン酸化される（例えばＢｌｕｍｅ−Ｊｅｎｓｅｎら、Ｎａｔｕｒｅ．４１１：３５５−３６５．，２００１参照）。Ａｋｔ活性化はｐ−ｍＴＯＲ（ｐ＝０．０４）及びｐ−ＦＫＨＲ（ｐ＝０．００６）の発現に有意に関連する（表３）。より弱いＳ６リン酸化（１＋）もＡｋｔ−陰性腫瘍でも検出されるが、Ａｋｔ活性化は強度のＳ６リン酸化（２＋）（ｐ＝０．００１）とも相関する（表３）。後者の結果は、Ｓ６がＰＩ３’Ｋ／Ａｋｔとは独立した様式でＥｒｋによって活性化され得ることを考慮すれば（例えばＩｉｊｉｍａら、Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ．２７７：２３０６５−７５．，２００２、Ｓｈｉら、Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ．２７７：１５７１２−２０．，２００２参照）、驚くべきことではない。まとめると、これらの結果は、ＰＩ３’Ｋ／Ａｋｔ経路の活性化が通常の手順で処理されたパラフィン包埋された生検試料で検出され得るという証拠を提供し、ＰＴＥＮタンパク質の消失がＧＢＭｓでＰＩ３’Ｋ／Ａｋｔ経路の活性化に関連することを示している。

ＰＴＥＮタンパク質の消失が見られないＧＢＭｓでのＡｋｔ経路活性化：ＥＧＦＲ／ＥＧＦＲｖＩＩＩが仲介する情報伝達の評価
ＰＴＥＮの消失はＡｋｔ活性化の唯一の経路ではないように思われた。ｐ−Ａｋｔ及び下流の作用因子ｐ−ｍＴＯＲ、ｐ−ＦＫＨＲ及びｐ−Ｓ６の発現は免疫組織化学的なＰＴＥＮの消失が見られないＧＢＭｓの２８％でも検出された（表２）。ＰＩ３’Ｋ／Ａｋｔ経路はＥＧＦＲ情報伝達によって活性化され得るので、我々は正常なＰＴＥＮ免疫組織化学染色の状況下で、ＥＧＦＲ及びＥＧＦＲｖＩＩＩの発現を解析し、それらとＰＩ３’Ｋ／Ａｋｔ経路活性化の関連を評価した。以前の報告と調和して（例えばＳｍｉｔｈら、Ｊ Ｎａｔｌ Ｃａｎｃｅｒ Ｉｎｓｔ．９３：１２４６−５６．，２００１、Ｗａｔａｎａｂｅら、Ｂｒａｉｎ Ｐａｔｈｏｌ．６．２１７−２３；ｄｉｓｃｕｓｓｉｏｎ ２３−４．，１９９６、Ｅｋｓｔｒａｎｄら、Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ．８９：４３０９−１３．，１９９２、Ｆｒｅｄｅｒｉｃｋら、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．６０：１３８３−７．，２０００、Ｈａｙａｓｈｉら、Ｂｒａｉｎ Ｐａｔｈｏｌ．７：８７１−５．，１９９７、Ｎａｇａｎｅら、Ｃａｎｃｅｒ Ｌｅｔｔ．１６２ Ｓｕｐｐｌ： Ｓ１７−Ｓ２１．，２００１、Ｎｉｓｈｉｋａｗａら、Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ．９１：７７２７−３１．，１９９４、Ｗｉｋｓｔｒａｎｄら、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．５７：４１３０−４０．，１９９７参照）ＥＧＦＲ免疫染色陽性をＧＢＭｓの６０％で検出した（図２）。構造的に活性な変異体ＥＧＦＲｖＩＩＩの免疫組織化学的な発現をＥＧＦＲ陽性腫瘍の５６％（腫瘍全体の４４％）で検出した（図２）（Ｓｍｉｔｈら、Ｊ Ｎａｔｌ Ｃａｎｃｅｒ Ｉｎｓｔ．９３：１２４６−５６．，２００１、Ｎａｇａｎｅら、Ｃａｎｃｅｒ Ｌｅｔｔ．１６２ Ｓuｐｐｌ：Ｓ１７−Ｓ２１．，２００１、Ｎｉｓｈｉｋａｗａら、Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ．９１：７７２７−３１．，１９９４、Ｗｉｋｓｔｒａｎｄら、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．５７：４１３０−４０．，１９９７）。ＥＧＦＲ及びＥＧＦＲｖＩＩＩの発現を欠いているが正常なＰＴＥＮの免疫組織化学的な発現を伴っているＧＢＭｓでは、強く活性化されたＡｋｔ（２＋染色）を検出しなかった（表２）。対照的に、ＥＧＦＲ及びＥＧＦＲｖＩＩＩを共発現し、かつ正常なＰＴＥＮの免疫組織化学的な発現を伴っているＧＢＭｓの３６％は活性化されたＡｋｔを強く染色した（ｐ＝０．０６）（表２）。腫瘍のサブセットは小さいが、ＥＧＦＲを伴うＥＧＦＲｖＩＩＩの共発現は強いＡｋｔ活性化（２＋染色）で必要とされているように思われた（表２）。これらの結果は、ＥＧＦＲ及びＥＧＦＲｖＩＩＩの共発現が正常なＰＴＥＮタンパク質の発現を伴うＧＢＭｓでＡｋｔ活性化を促進することができる証拠を提供する。これに一致して、ｍＴＯＲ、ＦＫＨＲ及びＳ６の下流の活性化も有意に、ＥＧＦＲ及びＥＧＦＲｖＩＩＩを共発現している時に正常なＰＴＥＮタンパク質の発現を伴うＧＢＭｓで強く活性化（２＋染色）しているように思われた（ｐ＜０．００２）。

Ａｋｔ経路に加えて、ＥＧＦＲ及びＥＧＦＲｖＩＩＩはＥｒｋも活性化できる。それゆえに、我々は、Ｅｒｋリン酸化がＥＧＦＲ及びＥＧＦＲｖＩＩＩの発現に関連するか調べた。全体的に見て、Ｅｒｋリン酸化をＧＢＭｓの５１％で検出した。より重要なことに、リン酸化Ｅｒｋの発現は有意にＥＧＦＲの発現と関連した（ｐ＝０．００７）（図２、表４）。リン酸化ＥｒｋはＥＧＦＲ＋／ＥＧＦＲｖＩＩＩ陰性ＧＢＭｓの７５％及びＥＧＦＲ＋／ＥＧＦＲｖＩＩＩ陽性ＧＢＭｓの８８％で発現された。

Ａｋｔ及びＥｒｋ経路活性化の予後との密接な関係
以前の研究は、ＧＢＭｓにおけるＰＴＥＮの消失、ＥＧＦＲ過剰発現又はＥＧＦＲｖＩＩＩについて明白な予後との関係を示してきてはいなかった。このことに調和して、我々はＰＴＥＮの消失、ＥＧＦＲ又はＥＧＦＲｖＩＩＩの発現と、進行までの時間又は全体の生存期間のいずれかとの間に統計的に有意な関係がないことを見出した。対照的に、協調した経路の活性化が予後と密接な関係を有しているように思われた。ｐ−Ａｋｔの発現は生存や進行と有意な関連はなかった。対照的に、ｍＴＯＲ、ＦＫＨＲ及びＳ６の同時リン酸化によって検出されるような、下流の経路の活性化は進行へのより短い時間（ｐ＝０．００２）及び減少した全体の生存期間（ｐ＝０．０２）の両者に有意に関連した。この発見は、Ｅｒｋが仲介するＳ６キナーゼの活性化及び栄養分が仲介するｍＴＯＲの活性化等のＡｋｔ下流へのさらなる入力からの寄与を反映しているのかもしれない。あるいは、３つのリン酸特異的抗体のこのパネルは、単独のリン酸−Ａｋｔ抗体のみに比べてＡｋｔ経路活性化を検出するより感受性のある方法であるかもしれない。Ｅｒｋ活性化も、初期のＧＢＭ患者のこのサブセットで、より急速な進行及び減少した全体の生存期間と有意に関連した（＜０．０４）（表５）。これらの発見は経路活性化がＧＢＭ患者の腫瘍進行に影響力を有していることを最初に示すものである。

キナーゼ阻害剤Ａｋｒ及びＥｒｋ経路活性化
図３Ａ及び３Ｂは、ＰＩ３Ｋ／Ａｋｔ経路の構成員とキナーゼ阻害剤との間の相互作用の実例を提供する。

図３Ａはラパマイシンがインビボで膠芽腫のＳ６リン酸化を阻害することを示す。特に、図３Ａはラパマイシンの臨床試験で患者の一団を解析したデータを提供する。このデータは、外科的な切除が行われる前に５日間ラパマイシンで処理された多くの患者の腫瘍で、最初の生検と比較して実質的なＳ６リン酸化の減少が検出されたことを示している。対照である患者は一様に高いレベルのＳ６リン酸化を示した。このデータは、ラパマイシンが膠芽腫の患者の大部分でＳ６リン酸化の段階でｍＴＯＲ伝達を阻害した証拠を提供する。さらに、このデータは、免疫組織化学（ＩＨＣ）による経路活性化の検出がウエスタンブロッティングによる検出とどのように相関するかを説明している。

図３Ｂは、ラパマイシンが仲介するＳ６リン酸化の阻害が減少した腫瘍の増殖と相関することを示す。この図では、ラパマイシンが仲介するＳ６の阻害が腫瘍の成長に効果を有するか否かを評価するために、細胞増殖のマーカーであるＫｉ−６７を使用した。このデータは、ラパマイシンが仲介するｍＴＯＲ情報伝達のＳ６リン酸化レベルでの阻害が、減少した腫瘍細胞の増殖と相関したという証拠を提供する。

本発明は、本明細書に開示される、発明の個々の側面の単なる例示として解釈される態様によって範囲を限定されず、機能的に等価なものはいずれも本発明の範囲内にある。本発明のモデル及び方法に対する様々な修正が、本明細書に記載されるものに加えて、以前の記述や教示から当業者に明らかとなるであろう。そしてそれらは同様に本発明の範囲に含まれるものである。このような修正又は他の態様は本発明の真の範囲及び意図から逸脱することなく実施することができるものである。
（表）

表６
ポリペプチド配列
表６は、便宜上、本明細書で考察されている周知のポリペプチドの配列、受託番号及び例示となる参考文献を提示するものである。表中の特定の配列において、経路の情報伝達時に通常リン酸化される例示的な残基を欧文体の太字（boldface type）で示す。

図１はＧＢＭ腫瘍試料中でのＰＴＥＮ、ｐ−Ａｋｔ、ｐ−ｍＴＯＲ、ｐ−ＦＫＨＲ及びｐ−Ｓ６の免疫組織学的な発現を示す。（Ａ）血管内皮細胞での染色の維持と共に腫瘍細胞でのＰＴＥＮタンパク質の消失（０）、内皮細胞と比較して減少したＰＴＥＮ染色（１）及びＰＴＥＮタンパク質の消失の証拠が見られない（２）を示す代表的な画像。ＮＣは陰性対照。（Ｂ）２（強）、１（弱）及び０（陰性）の尺度で評価したｐ−Ａｋｔ、ｐ−ｍＴＯＲ、ｐ−ＦＫＨＲ及びｐ−Ｓ６に対する染色。ＮＣは陰性対照を表す。 図２はＧＢＭ腫瘍試料中でのＥＧＦＲ、ＥＧＦＲｖＩＩＩ及びｐ−Ｅｒｋの免疫組織学的な発現を示す。（Ａ）散在するＥＧＦＲ、ＥＧＦＲｖＩＩＩ及びｐ−Ｅｒｋの陽性を示す代表的な画像（＋）。ＥＧＦＲ、ＥＧＦＲｖＩＩＩ及びｐ−Ｅｒｋ発現を欠く腫瘍の代表的な画像も示す（−）。ＮＣは陰性対照を表す。 図３はＧＢＭ腫瘍試料中でのＰＩ３Ｋ／Ａｋｔ経路の一員とキナーゼ阻害剤の間の相互作用の図示を提供するものであり、図３Ａはラパマイシンがインビボで膠芽腫のＳ６リン酸化を阻害することを示す。 図３はＧＢＭ腫瘍試料中でのＰＩ３Ｋ／Ａｋｔ経路の一員とキナーゼ阻害剤の間の相互作用の図示を提供するものであり、図３Ｂはラパマイシンが仲介するＳ６リン酸化の阻害が腫瘍増殖の減少と相関することを示す。この図で、Ｋｉ−６７、すなわち細胞増殖のマーカーは、ラパマイシンが仲介するＳ６の阻害が腫瘍の増殖に効果があるか否か評価するために用いられた。

Claims (24)

1. ＥＧＦＲポリペプチド（配列番号７）阻害剤又はｍＴＯＲポリペプチド（配列番号２）阻害剤に応答する可能性がある、又は応答性である哺乳動物の神経膠腫の腫瘍を同定する方法であって、当該方法は腫瘍から得られた試料を
   （ａ）ＰＴＥＮポリペプチド（配列番号５）の発現
   及び以下のうち少なくとも１つの存在、
   （ｂ）リン酸化されたＳ６リボソームポリペプチド（配列番号１）
   （ｃ）ＥＧＦＲポリペプチド（配列番号７）
   （ｄ）リン酸化されたＡＫＴポリペプチド（配列番号４）、及び
   （ｅ）リン酸化されたＥＲＫポリペプチド（配列番号８）
   について試験することを包含し、
   そこで、対照と比較して、試料中でＳ６リリボソームポリペプチドの減少したリン酸化と共にＰＴＥＮポリペプチドの減少した発現は、神経膠腫の腫瘍をｍＴＯＲ阻害剤にに応答する可能性がある又は応答性であると同定し、
   そこで、対照と比較して、試料中でＳ６リリボソームポリペプチドの正常なリン酸化と共にＰＴＥＮの減少した発現は、神経膠腫の腫瘍をｍＴＯＲ阻害剤に応答する可能性がない又は非応答性であると同定し、
   そこで、増加したＡＫＴのリン酸化及び／又はＥＲＫのリン酸化と共にＰＴＥＮの正常又は増加した発現及びＥＧＦＲの増加した発現及び／又は活性化は、神経膠腫の腫瘍をＥＧＦＲ阻害剤に応答する可能性がない及び／又は非応答性であると同定する、方法。
2. Ｓ６リリボソームポリペプチドのリン酸化が、腫瘍又は試料をｍＴＯＲ阻害剤に接触させた後に測定される、請求項１に記載の方法。
3. ＡＫＴ及び／又はＥＲＫのリン酸化が、腫瘍又は試料をＥＧＦＲ阻害剤に接触させた後に測定される、請求項１に記載の方法。
4. ｍＴＯＲ阻害剤がラパマイシン、ＳＤＺ−ＲＡＤ、ＣＣＩ−７７９、ＲＡＤ００１又はＡＰ２３５７３である、請求項１に記載の方法。
5. ＥＧＦＲ阻害剤がＺＤ−１８３９、ＯＳＩ−７７４、ＰＤ−１５３０５３、ＰＤ−１６８３９３、ＩＭＣ−Ｃ２２５又はＣＩ−１０３３である、請求項１に記載の方法。
6. （ａ）−（ｅ）の１又はそれ以上の発現が抗体を使用して試験される、請求項１に記載の方法。
7. リン酸化されたＳ６リリボソームポリペプチド（配列番号１）の存在が、配列番号１の２３５位でリン酸化されたセリン残基を含むエピトープに結合する抗体を使用して試験される、請求項６に記載の方法。
8. ＥＧＦＲ及びＰＴＥＮの存在が、それぞれＥＧＦＲ特異的抗体及びＰＴＥＮ特異的抗体を使用して試験される、請求項６に記載の方法。
9. リン酸化されたＡＫＴ（配列番号４）の存在が、配列番号４の４７３位でリン酸化されたセリン残基を含むエピトープに結合する抗体を使用して試験される、請求項６に記載の方法。
10. リン酸化されたＥＲＫの存在が、配列番号８の２０２位でリン酸化されたスレオニン残基又は２０４位でリン酸化されたチロシン残基を含むエピトープに結合する抗体を使用して試験される、請求項６に記載の方法。
11. 神経膠腫の腫瘍が、多形性膠芽腫の腫瘍である、請求項１に記載の方法。
12. 試料が、パラフィン包埋された生検試料である、請求項１に記載の方法。
13. ＰＴＥＮポリペプチド（配列番号５）を発現しない哺乳動物の神経膠腫の腫瘍であって、ｍＴＯＲポリペプチド（配列番号２）活性の阻害剤にに応答する可能性がある又は応答性である哺乳動物の神経膠腫の腫瘍を同定する方法であって、当該方法は腫瘍から得られた試料を、腫瘍又は試料を阻害剤に接触させた後に、リン酸化されたＳ６リリボソームポリペプチド（配列番号１）の存在について試験することを包含し、
    そこで、阻害剤と接触していない対照と比較して、試料中のリン酸化されたＳ６リリボソームポリペプチドにおいて観察できる減少は、神経膠腫の腫瘍を阻害剤にに応答する可能性がある又は応答性であると同定し、
    そこで、対照と比較して、試料中のリン酸化されたＳ６リリボソームポリペプチドにおいて観察できる減少がないことは、神経膠腫の腫瘍を阻害剤に応答する可能性がない又は非応答性であると同定する、方法。
14. 神経膠腫の腫瘍が、多形性膠芽腫である、請求項１３に記載の方法。
15. 神経膠腫が、ＰＴＥＮポリペプチド（配列番号５）に結合する抗体を使用してＰＴＥＮポリペプチド（配列番号５）を発現しない腫瘍であると同定される、請求項１３に記載の方法。
16. ＰＴＥＮポリペプチド（配列番号５）を発現する哺乳動物の神経膠腫の腫瘍であって、ＥＧＦＲポリペプチド（配列番号７）活性の阻害剤に応答する可能性がない又は非応答性である哺乳動物の神経膠腫の腫瘍を同定する方法であって、当該方法は腫瘍から得られた試料を腫瘍又は試料を阻害剤に接触させた後に、ＥＧＦＲ（配列番号７）の存在及びリン酸化されたＡＫＴポリペプチド（配列番号４）の存在又はリン酸化されたＥＲＫポリペプチド（配列番号８）の存在について試験することを包含し、
    そこで、ＥＧＦＲポリペプチドのレベル及びリン酸化されたＡＫＴポリペプチド又はリン酸化されたＥＲＫポリペプチドのレベルにおける増加が、神経膠腫の腫瘍を阻害剤に応答する可能性がない又は非応答性であると同定する、方法。
17. 腫瘍から得られた試料が、リン酸化されたＡＫＴポリペプチド（配列番号４）の存在及びリン酸化されたＥＲＫポリペプチド（配列番号８）の存在について試験される、請求項１６に記載の方法。
18. 神経膠腫の腫瘍が、多形性膠芽腫である、請求項１６に記載の方法。
19. 神経膠腫が、ＰＴＥＮポリペプチド（配列番号５）に結合する抗体を使用してＰＴＥＮポリペプチド（配列番号５）を発現する腫瘍であると同定される、請求項１６に記載の方法。
20. 哺乳動物の神経膠腫の腫瘍又は細胞を特徴付けるためのキットであって、
    （ａ）ＰＴＥＮ（配列番号５）に結合する抗体
    及び以下のうち１つ又はそれ以上、
    （ｂ）リン酸化されたＳ６リリボソームポリペプチド（配列番号１）に結合する抗体
    （ｃ）ＥＧＦＲ（配列番号７）に結合する抗体
    （ｄ）リン酸化されたＡＫＴ（配列番号４）に結合する抗体、及び
    （ｅ）リン酸化されたＥＲＫ（配列番号８）に結合する抗体
    を包含するキット。
21. キットが、（ｂ）−（ｅ）からなるグループから選択される多数の抗体を包含する、請求項２０に記載のキット。
22. （ｂ）の抗体が、配列番号１の２３５位でリン酸化されたセリン残基を有するＳ６リリボソームポリペプチド（配列番号１）に特異的であり、
    （ｄ）の抗体が、配列番号４の４７３位でリン酸化されたセリン残基を有するＡＫＴ（配列番号４）に特異的であり、及び
    （ｅ）の抗体が、配列番号８の２０２位でリン酸化されたスレオニン残基及び２０４位のチロシンを有するＥＲＫに特異的である、請求項２０に記載のキット。
23. キットが、さらにＫｉ−６７ポリペプチド（配列番号９）、ｐ−Ｈ３ヒストンポリペプチド（配列番号１０）又はカスパーゼ−３ポリペプチド（配列番号１１）に結合する抗体を含む、請求項２０に記載のキット。
24. キットが、さらに抗体（ａ）−（ｅ）に結合する少なくとも１つの二次抗体を含む、請求項２０に記載のキット。

Images