JP2009536355A - 診断指標または予測指標としての細胞内局在プロフィールの使用 - Google Patents
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Abstract
Description
受容体チロシンキナーゼのシグナル伝達、および他の受容体介在シグナル伝達経路は典型的に、リガンド結合、受容体活性化、シグナルを増幅またはネットワーク化する細胞質中のシグナル伝達中間タンパク質のリン酸化、シグナル伝達タンパク質のサブセットの核への転座を含む経路を介して進行した後、転座されたタンパク質または他の核の補因子のいずれかによって転写が活性化される。
定義
便宜上、本発明を詳細な説明を行う前に、本明細書、実施例、および添付の特許請求の範囲で使用される特定の用語をここで定義する。単数形(「a」「an」、および「the」)は、文脈で特に明記されない限り、複数の言及を含む。
本発明は、免疫組織化学法により、組織切片中の受容体シグナル伝達経路中の受容体分子および1つ以上の下流エフェクター分子をアッセイすることで、経路の活性化状態を測定し、予後情報を得ることができるという発見に基づくものである。より具体的には、本発明は、組織切片中のシグナル伝達経路の活性化を測定する免疫組織化学法であって、
1)細胞受容体タンパク質を検出するための試薬で組織切片を染色する手順と;
2)細胞受容体タンパク質のシグナル伝達経路の一員であるエフェクター分子を検出するための第2の試薬で組織切片を染色する手順と;
3)顕微鏡を使用して、組織切片中の染色細胞受容体タンパク質ならびに組織切片中の染色エフェクター分子の高解像度デジタル画像を得る手順と;
4)デジタル画像を分析して、組織切片中に存在する細胞受容体タンパク質の量および組織切片中に存在するエフェクター分子量を定量化する手順と、
を含み、
それによって組織切片中のシグナル伝達活性を測定する方法に関する。
材料および方法
組織マイクロアレイ設計および処理
エール大学病理部のアーカイブから入手できる、非小細胞肺癌の213症例からパラフィン包埋ホルマリン固定検体(1996〜2003年)を得た。in situ病変および正常上皮から離れた各腫瘍試料の浸潤癌領域をマーキングし、0.6mmのコアを2個採取した。各コアを、1mm間隔のグリッドのレシピエントブロックに配列し、厚さ5ミクロンの切片を既述の通り切断および処理した(Kononen,J.et al.1998 Tissue microarrays for high‐throughput molecular profiling of tumor specimens.Nature Medicine.4,844‐847)。
簡潔に言うと、事前に切断し、パラフィンでコーティングした組織マイクロアレイスライドを、プロテイナーゼK(EGFR、PharmDxキット、DAKO、米国カリフォルニア州カーピンテリア)、またはpH6.0のクエン酸塩中での10分間の圧力調理(その他すべての1次抗体については、以下を参照)によって、脱パラフィン化および抗原回収した。スライドを、0.1Mトリス緩衝食塩水(pH8.0)(BSA/TBS)中で室温にて60分間、0.3%のウシ血清アルブミンで事前にインキュベートした。次いで、スライドを、EGFR(PharmDxキット、原液を使用;DAKO、米国カリフォルニア州カーピンテリア)、Aktl(マウスモノクローナル、クローン2H10、1:200で希釈;Cell Signaling Technology、米国マサチューセッツ州デンバー)、Erk1/2(マウスポリクローナル、1:100で希釈;Cell Signaling Technology、米国マサチューセッツ州デンバー)、またはStat3(ウサギのモノクローナル、クローン124H6、1:500で希釈;Cell Signaling Technology、米国マサチューセッツ州デンバー)、および4℃にて一晩BSA/TBS中で希釈したパンサイトケラチン(マウスまたはウサギのポリクローナル、1:100で希釈、DAKO、米国カリフォルニア州カーピンテリア)に対する1次抗体でインキュベートした。スライドを、3×10分間、0.05%のTween‐20を含む1X TBSで洗浄した。対応する2次抗体を、室温にて1時間BSA/TBSに加えた。これらは、抗サイトケラチン(Alexa 488に結合したヤギ抗ウサギ;1:100、Molecular Probes、米国オレゴン州ユージーン)に対するフルオロフォアに直接結合するおよび/または抗チミジル酸シンターゼ(DAKO、米国カリフォルニア州カーピンテリア)に対するホースラディッシュペルオキシダーゼ(HRP)に結合する抗体のいずれかまたは両方を含んだ。スライドを、3×10分間、0.05%のTween‐20を含むTBSで再度洗浄した。スライドを、DABと同様に、HRPにより活性化され、HRPにより結合した2次抗体に直ちに隣接する多くの共有結合したCy‐5染料が沈着する蛍光性クロマジェン(Cy‐5‐チラミド、NEN Life Science Products、米国マサチューセッツ州ボストン)でインキュベートした。放出ピークが、組織自己蛍光の緑色からオレンジ色のスペクトルのかなり外側にあることから、Cy‐5(赤)を使用した。自動分析用のスライドに、Antifade DAPI含有封入剤(ProLong Gold、Molecular Probes、米国オレゴン州ユージーン)を使用してカバースリップを被せた。
画像収集は既述の通りに行った(Camp RL et al.2002 Automated subcellular localization and quantification of protein expression in tissue microarrays.Nature Medicine.8(11):1323‐1327)。すなわち、自動xyzステージ動作を備えたTE200倒立蛍光顕微鏡にNikon Super‐Fluor10倍レンズを介して付属の水冷式Photometries series 300カメラを取り付けた、Deltavisionプラットフォームおよびソフトウェア(SoftWorx2.5;Applied Precision、米国ワシントン州イサクアー)を使用して、マイクロアレイ画像を得た。マイクロアレイの低出力画像を、約7ミクロンの解像度で、マイクロアレイの複数(約1500)の低解像度画像(64×64ピクセル)を使用し、一緒にステッチした。DAPLのシグナルを使用して、検体コア(ヒストスポット)を同定した。次いで、各ヒストスポットの座標を記録した。その後、各ヒストスポットの単色の高解像度(1024×1024ピクセル、0.5ミクロンの解像度)画像を、焦点面、およびヒストスポットから8ミクロン下方の両方で取得し、画像スタックにビットマップとして記録した。0〜1024のダイナミックレンジを使用して画像を得たが、0〜255のダイナミックレンジを有する8ビットのtiff画像として、保存および分析した。
AQUA(登録商標)分析(RESA/PLACEアルゴリズム)
AQUA(登録商標)分析は既述の通りに行った(Camp RL et al. 2002 Automated subcellular localization and quantification of protein expression in tissue microarrays. Nature Medicine.8(11):1323‐1327)。すなわち、腫瘍を周囲の基質および/または白血球と区別するマーカー(サイトケラチン)の画像を閾値化することにより、腫瘍に特異的なマスクを作成した。これにより二元性マスクが作成される(各ピクセルは「オン」または「オフ」のいずれかである)。閾値レベルを数枚の画像の抜取検査により検証した後、残りの画像については自動化した。その後のすべての画像操作には、マスク領域から得た画像情報のみが含まれる。次いで、区画に特異的な標識と標的マーカーから、2つの画像(1つは焦点画像、もう1つは遠距離画像)を撮影する。焦点外画像の割合を、2つの画像のピクセル毎の分析に基づいて、焦点画像から減算する。全体の減算度は、各細胞内区画に対するユーザ定義の割合に基づく。ほとんどの用途の場合、これは実験的に全シグナルの40%に設定され、全マイクロアレイから得た画像では一定のままとなる。したがって、RESAはすべての焦点外情報を削除する。このアルゴリズムは、高染色度領域と低染色度の隣接域との間でインターフェースが増強するという追加の利点を有し、隣接区画のピクセルのより正確な配置を可能にする。区画に特異的な標識とは対照的に、標的シグナルのRESA減算は一定で、全体の画像強度には基づいていない。これにより、同量の減算が全検体の標的シグナルにより生じるようになる。最後に、PLACEアルゴリズムは、画像中の各ピクセルを特異的な細胞内区画に割り当てる。ユーザ定義の信頼度(通常95%)の範囲内までの区画に正確に割り当てることができないピクセルは破棄する。これは、1つの区画から別の区画へのマーカーのスピルオーバーを最小限にする、2個の区画に特異的なマーカーから得たシグナル比を測定することにより、反復的に達成される。核および細胞膜ピクセル強度が類似しすぎるために正確に割り当てることができないピクセルは無効にする(通常、全ピクセルの8%未満を含む)。第3区画(細胞質)は、排除(非細胞膜、非核)により定義することができる。各ピクセルを細胞内区画に割り当てる(または上述の通りに排除する)と、各位置中のシグナルが合算される。このデータを保管し、その後、全シグナルの割合として、あるいは区画領域当たりの平均シグナル強度として表すことができる。スコアは1〜1000のスケールで表す。
マスク領域(自動化)別といった、10%未満の腫瘍を含むヒストスポットを、次の解析から排除した。本発明者等の以前の研究では、2つのヒストスポットの平均から得たスコアが、全組織切片から得たスコアと95%を超える確率で一致することが実証されている(Camp,RL et al.2002 Validation of tissue microarray technology in breast carcinoma.Lab.Invest 80:1943‐1949)。各患者の腫瘍を、これらの分析の2つの独立した組織コアで表し、その後、各患者のAQUA(登録商標)スコアを平均化した。さらに、発現の不均一性(ピアソンのR値0.4未満は実験誤差と考えられ、0.4〜0.7は不均一な発現と考えられ、0.7超は均一な発現と考えられる)だけでなく、実験の再現性の基準として調査した各マーカーの回帰分析を行った。各バイオマーカーのピアソンのR値は、以下の通りである:EGFR、0.78;Aktl、0.44;Erkl/2、0.55、およびStat3、0.69。独立した生存率解析を行うために、既述の通りにX‐tile(登録商標)を使用して最適な切点を選択した(Camp,RL et al.2004,X‐tile:a new bio‐informatics tool for biomarker assessment and outcome‐based cut‐point optimization.Clinical Cancer Research 10(21):7252‐7259)。Mantel‐Coxのlog‐rankスコアは最適な切点の選択に統計的に十分厳密ではないことから、Monte‐carloシミュレーションを使用した。さらに統計的に厳密にするために、最適な切点をコホートの3分の1(訓練群)に特定し、コホートの残りの3分の2(検証群)に適用した。非監視および監視下での階層的クラスター分析は、Cluster Softwareを使用して行い、クラスターの可視化にTreeView Softwareを使用して表示した(スタンフォード大学Eisen研究室)。その後、生存率解析を、SPSS vl4.01(SPSS,Inc.、米国イリノイ州シカゴ)およびR(GNU、米国マサチューセッツ州ボストン)を使用して行った。
生存率解析
AQUA(登録商標)分析によるEGFR発現試験では、EGFRを発現するNSCLC腫瘍の上位25%(相対的なAQUA(登録商標)スコア12に相当;ヒストグラム(挿入紙、図1)を参照)に、疾患特異的3年生存率の統計的に有意な25%の減少が見られることが明らかになった(図1)。
上流受容体EGFR機能として個々の下流エフェクターの予側力を評価するため、EGFR発現により検体をグループ化し、主要な下流エフェクター(Aktl、Erk1/2、およびStat3)の核/細胞質比における傾向を調査することにより、監視下による階層的クラスター分析を行った。図2Aから明らかなように、4つの主要な腫瘍群が認められた(図2A)。第1群の腫瘍は、下流エフェクターの高核/細胞質比を伴う低EGFR発現を有した。第2群は、高核/細胞質比を伴う高EGFR発現を有した。第3群の腫瘍は、低核/細胞質比を伴う低EGFR発現を有し、第4群は、低核/細胞質比を伴う高EGFR発現を有した。Kaplan‐Meier生存率解析では、これらの群間で生存率に有意差が見られなかったことが実証された(図2B)。
階層的クラスター分析で認められた4群は、1)最適な切点(図3A)、ならびに2)EGFR発現の平均(Z‐スコア=0;図4A)切点、および下流エフェクター分子の平均核/細胞質比(「シグナル伝達指数」と呼ぶ)に基づくより厳密なグループ化に基づいて、分析を促進した。図3Bおよび図4Bは、シグナル伝達指数だけでは、全体生存率との間に有意な相関関係が見られないことを示している。しかし、EGFR発現をシグナル伝達指数と組み合わせることにより、最適な切点分析に基づいた全4群間での疾患特異的3年生存率に有意差が認められ(図3C;p=0.008)、「シグナル伝達指数」が低く、高いEGFRを表す群(C群)が全体生存率が最も低かった。中間値が切点として使用された別の分析(図4C)では、群間で全体生存率に有意差が見られ(p=0.028)、C群(高EGFR、低シグナル伝達指数)が他の群に比べて、全体生存率の減少とより有意な相関関係があることが示された(p=0.004)。
国立バイオテクノロジー情報センター(NCBI)の公開データベース(www.ncbi.nlm.nih.gov)から得た、本明細書で言及するいずれかのポリヌクレオチドまたはポリペプチド配列に対応する受託番号は、全体が参考として援用される。本出願全体を通じて引用される全引用文献の内容は、参考として本明細書で明示的に援用される。
Claims (30)
- 組織切片中のシグナル伝達経路活性を測定する免疫組織化学法であって、
a)細胞受容体タンパク質を検出するための試薬で前記組織切片を染色する手順と;
b)前記細胞受容体タンパク質に関連する前記シグナル伝達経路の一員であるエフェクター分子を検出するための第2の試薬で前記組織切片を染色する手順と;
c)光学顕微鏡を使用して、前記組織切片中の前記染色細胞受容体タンパク質、および前記組織切片中の前記染色エフェクター分子の高解像度デジタル画像を得る手順と;
d)前記デジタル画像を分析して、前記組織切片中に存在する前記細胞受容体タンパク質量、および前記組織切片中に存在するエフェクター分子量を定量化する手順と、
を含み、
それによって前記組織切片中の前記シグナル伝達活性を測定する、方法。 - 前記組織切片が癌の疑いのある1または複数の細胞を含む、請求項1に記載の方法。
- 前記組織切片が固定される、請求項1に記載の方法。
- 前記組織切片を顕微鏡スライドに付着させる、請求項1に記載の方法。
- 前記細胞受容体タンパク質が上皮成長因子受容体である、請求項1に記載の方法。
- 前記細胞受容体タンパク質がEGFRである、請求項5に記載の方法。
- 前記エフェクター分子が、Grb2、Ras、ERK、AKT、pAKT、GSK3、pGSK3、eIF2B、NFkB、CREB、JAK、およびSTATからなる群から選択される、請求項6に記載の方法。
- 前記エフェクター分子が、AKT、ERK、およびSTATからなる群から選択される、請求項7に記載の方法。
- 前記第2の試薬が全エフェクター分子発現量を検出する、請求項1に記載の方法。
- 前記第2の試薬がリン酸化エフェクター分子発現量を検出する、請求項1に記載の方法。
- 前記エフェクター分子がエンドエフェクターである、請求項1に記載の方法。
- 細胞内区画中の前記エフェクター分子を定量化する手順もさらに含む、請求項1に記載の方法。
- 前記細胞内区画が、細胞核および細胞質からなる群から選択される、請求項12に記載の方法。
- 前記シグナル伝達活性が、特異的な予後転帰について測定したシグナル伝達活性ともさらに相関関係にある、請求項1に記載の方法。
- 前記シグナル伝達活性が、特異的な治療転帰について測定したシグナル伝達活性ともさらに相関関係にある、請求項1に記載の方法。
- 組織切片中のシグナル伝達経路活性を測定する免疫組織化学法であって、
a)細胞受容体タンパク質を検出するための試薬で前記組織切片を染色する手順と;
b)前記細胞受容体タンパク質に関連する前記シグナル伝達経路の一員であるエフェクター分子を検出するための第2の試薬で前記組織切片を染色する手順と;
c)細胞内区画を標識化するための第3の試薬で前記組織切片を染色する手順と;
d)顕微鏡を使用して、
i)前記組織切片中の染色細胞受容体タンパク質;
ii)前記組織切片中の前記染色エフェクター分子;および
iii)前記標識化細胞内区画
の高解像度デジタル画像を得る手順;
e)前記デジタル画像を分析して、
i)前記組織切片中に存在する前記細胞受容体タンパク質;
ii)前記組織切片中の前記エフェクター分子;および
iii)前記細胞内区画中に存在する前記エフェクター分子
の定量的量を測定する手順と;
f)互いに関連性のある前記細胞受容体、前記エフェクター分子および前記細胞内区画中の前記エフェクター分子の前記定量的量を分析する手順と、
を含み、
それによって前記組織切片中の前記シグナル伝達活性を測定する、方法。 - 前記細胞内区画が、核および細胞質からなる群から選択される、請求項16に記載の方法。
- 手順6が、核中のエフェクター分子量に対する細胞質中のエフェクター分子量の比を測定する手順を含む、請求項16に記載の方法。
- 組織切片中のシグナル伝達経路活性を測定する免疫組織化学法であって、
a)細胞受容体タンパク質を検出するための試薬で前記組織切片を染色する手順と;
b)それぞれが前記細胞受容体タンパク質に関連する前記シグナル伝達経路の一員である複数のエフェクター分子の1つ以上を検出するための1つ以上の追加の試薬で前記組織切片を染色する手順と;
c)細胞内区画を定義するための標識で前記組織切片を染色する手順と;
d)光学顕微鏡を使用して、
i)前記組織切片中の前記染色細胞受容体タンパク質;
ii)前記組織切片中の1つ以上の前記染色エフェクター分子;および
iii)前記標識化細胞内区画
の高解像度デジタル画像または複数の高解像度デジタル画像を得る手順と;
e)前記デジタル画像を分析して、
i)前記組織切片中に存在する前記細胞受容体タンパク質;
ii)前記組織切片中に存在する1つ以上の前記エフェクター分子;および
iii)前記細胞内区画中に存在する1つ以上の前記エフェクター分子
の定量的量を測定する手順と;
f)互いに関連性のある前記細胞受容体、1つ以上の前記エフェクター分子、および前記細胞内区画中の1つ以上の前記エフェクター分子の前記定量的量を分析する手順と、
を含み、
それによって前記組織切片中の前記シグナル伝達活性を測定する、方法。 - 2つ以上のエフェクター分子が染色および分析される、請求項19に記載の方法。
- 3つ以上のエフェクター分子が染色および分析される、請求項19に記載の方法。
- 手順6が、核中のエフェクター分子量に対する、細胞質中の各エフェクター分子量の比を測定する手順を含む、請求項19に記載の方法。
- 複数のエフェクター分子の比が、受容体タンパク質との関連において組み合わされる、請求項22に記載の方法。
- 組織切片のEGFRシグナル伝達プロファイルを測定する方法であって、
(a)(i)EGFRを検出するための試薬;
(ii)EGFRエフェクター分子を検出するための第2の試薬;および
(iii)細胞内区画を検出するための第3の試薬
で前記組織切片を染色する手順と;
(b)顕微鏡を使用して、
(i)EGFR;
(ii)EGFRエフェクター分子;および
(iii)細胞内区画
の高解像度デジタル画像を得る手順と;
(c)前記デジタル画像を分析して、
(i)EGFR;
(ii)前記細胞内区画中に存在するEGFRエフェクター分子;および
(iii)前記細胞内区画外に存在するEGFRエフェクター分子
の量を定量化する手順と;
(d)手順c(ii)で測定した量に対する、手順c(iii)で測定した量のエフェクター比を測定する手順と;
(e)前記EGFR量と対照検体の発現レベルとを比較する手順と;
(f)手順(d)の比と対照検体中の同手順の比とを比較する手順と、
を含む、方法。 - EGFR発現腫瘍の予後状態を測定する方法であって、請求項1に記載の方法を含み、(i)高いEGFRレベルと、対照エフェクター比よりも低い比とを有する腫瘍が、予後不良を示し;(ii)高いEGFRレベルと、対照エフェクター比よりも高い比を有する腫瘍が、より予後良好であることを示し;(iii)低いEGFRレベルと、対照エフェクター比よりも低い比を有する腫瘍が、予後良好を示す、方法。
- 前記細胞内区画が核であり、前記細胞内区画外の領域が細胞質である、請求項24に記載の方法。
- 少なくとも2つのEGFR下流エフェクター分子のエフェクター比を定量化し、前記比を平均化して前記シグナル伝達指数を得る、請求項25に記載の方法。
- 前記EGFR下流エフェクター分子が、Aktl、Erk、およびStat3からなる群から選択される、請求項26に記載の方法。
- Aktl、ERK、およびSTAT3を含む3つのEGFRエフェクター分子のエフェクター比を定量化し、前記比を平均化して前記シグナル伝達指数を得る、請求項25に記載の方法。
- EGFRを発現する腫瘍の予後状態を測定する方法であって、請求項28に記載の方法を含み、(i)高いEGFRレベルと、対照シグナル伝達指数よりも低い指数を有する腫瘍が、より予後不良であることを示し;(ii)高いEGFRレベルと、対照シグナル伝達指数より高い指数を有する腫瘍が、より予後良好であることを示す、方法。
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