JP2006505284A - 炭疽菌におけるフルオロキノリン耐性についての分子的特徴およびアッセイ - Google Patents

Abstract

ヒト炭疽感染に対する好ましい治療は、フルオロキノロンクラス（特に、シプロフロキサシン（ＣＩＰ））に由来する治療である。本発明は、フルオロキノロン（特にＣＥＰ）作用の分子的原理を開示し、そして、診断アッセイの原理を形成する分子的特徴を提供する。本発明は、さらにＣＩＰ耐性に関連するヌクレオチド特徴が、ＣＩＰ耐性炭疽菌を迅速に同定するためおよびこれら変異株の耐性レベルを推測するための診断テストにおいて有用であることを開示する。本発明に従って、分子的特徴の診断の可能性が、プライマーエクステンションアッセイを用いて記載される。さらに、これらの特徴の検出を可能にするＰＣＲおよびエクステンションプライマーが開示される。

Description

（国内優先権の主張）
本出願は、「炭疽菌におけるフルオロキノリン耐性についての分子的特徴およびアッセイ」という発明の名称である、２００２年１０月１１日にＰａｕｌ Ｓ．Ｋｅｉｍらによって出願された米国仮出願第６０／４１７，８４３号に対する優先権を主張し、本出願は、その全体が本明細書中で参考として援用される。

（発明の分野）
本発明は、概して、炭疽菌株についての分子アッセイに関し、より詳しくは、炭疽菌におけるフルオロキノリン耐性を同定するためのプライマー、方法、およびキットに関する。

（発明の背景）
炭疽菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ａｎｔｈｒａｃｉｓ（Ｂ．ａｎｔｈｒａｃｉｓ））は、家畜および野生有蹄動物に本式に感染し、炭疽という疾患を引き起こす。炭疽菌は、地球規模で分散され、および多くの地域に特有であるけれども、株の間の遺伝的多様性をほとんど示さない。パルスフィールドゲル電気泳動（ＰＦＧＥ）（Ｈａｒｒｅｌｌら、１９９５）、一塩基多型（ＳＮＰ）（Ｐｒｉｃｅら、１９９９；Ｈａｒｒｅｌｌら、１９９５）、増幅断片長多型（ＡＦＬＰ）（Ｋｅｉｍら、２０００）を含む、様々な分析の方法を用いた集団調査すべてから、炭疽菌が高度に単形性であることがわかった。

胞子形成人畜共通感染性である炭疽菌は、時折ヒトに感染し、皮膚性形態、腸性形態、または肺性形態の炭疽を引き起こす（Ｆｒｉｅｄｌａｎｄｅｒ、１９９９）。これら３つのヒト形態はすべて稀であるが、炭疽菌を生物兵器として用いる可能性は、抗生物質耐性の発生を特に関連する問題にする。

ヒト炭疽感染についての好ましい治療は、フルオロキノロン、シプロフロキサシン（ＣＩＰ）である。フルオロキノロン殺菌作用は、ジャイレース−ＤＮＡ複合体およびトポイソメラーゼＩＶ−ＤＮＡ複合体に対し、そこで、薬物結合が、二本鎖ＤＮＡの切れ目の放出の原因となる（ＤｒｌｉｃａおよびＺｈａｏ、１９９７、Ｐｉｄｄｏｃｋ、１９９９）。フルオロキノロン耐性変異体は、ジャイレースのＧｙｒＡサブユニットのキノロン耐性決定領域（ＱＲＤＲ）、およびトポイソメラーゼＩＶのＰａｒＣサブユニットにおいてアミノ酸変化を有する。耐性は、主要促進因子スーパーファミリーの多剤流出ポンプの過剰発現からまた生じ得る。低いレベルの耐性が、ＱＲＤＲ内の単一のミスセンス変異、または流出ポンプの調節領域中の点変異によって得られ得る。しかし、高いレベルの耐性は、変異の組み合わせを必要とする。高いレベルの耐性のため必要とされるＱＲＤＲ変異の段階的な蓄積は、種特異的かつ予測可能な経路に従うようである（Ｎｇら、１９９６；Ｆｅｒｒｅｒｏら、１９９５）。

フルオロキノロン耐性は、多くの他の抗生物質に対する耐性と同様に、いくつかの臨床的に重要な種において蔓延し、これは大部分は、推奨されるフルオロキノロン療法の不履行、およびフルオロキノロン類の阻害濃度を患者の軟部組織中で生じるために不十分である標準的な療法が原因である（Ｂｒｕｎｎｅｒら、１９９９）。臨床的な原因に加えて、食用動物生成におけるフルオロキノロン類の利用は、フルオロキノロン耐性の出現の主要な原因として同定されている（Ｅｎｄｔｚら、１９９０；ｖａｎ ｄｅｎ Ｂｏｇａａｒｄら、２０００；ｖａｎ ｄｅｎ Ｂｏｇａａｒｄら、２００１）。

炭疽サンプルの培養およびその培養物のフルオロキノレン（ｆｌｕｏｒｏｑｕｉｎｏｌｅｎｅ）への暴露は、以前から、炭疽の特定の株が、フルオロキノレン耐性を示すかどうかを決定するために用いられる方法である。しかし、細菌培養物の増殖は、培養物が増殖するために細菌細胞の臨界質量を必要とする。さらに、その株が耐性であるか否かを決定するために、細菌培養物が目に見える大きさまで増殖しなければならないという点で、培養は迅速ではない。

従って、迅速に炭疽を診断し炭疽を処置する治療方法を開発するために、特に、生物テロリズム攻撃において用いられ得る炭疽の耐性株の検出および処置に用いる効果的な手段を開発する際に、確実かつ迅速に少量サンプルから炭疽菌のフルオロキノロン耐性株を決定する手段および方法についての必要性が存在する。さらに、分子に基づく迅速な検出方法が、炭疽感染の疫学研究を行うために必要とされる。

（発明の要旨）
炭疽菌変異体におけるフルオロキノリン耐性と関連する単一ヌクレオチド変化が、炭疽菌ＤＮＡに直接由来する種のフルオロキノリン耐性を検出するための迅速なアッセイの基礎を提供することが発見された。シプロ耐性変異体が、単離され、そして、特徴的なＳＮＰ配列が同定された。これらのＳＮＰ配列を増幅アッセイ（好ましくは、多重）においてアッセイするための、プライマーおよびプライマー対が提示される。炭疽菌株由来のサンプルＤＮＡを多重化するために有用なキットが、与えられる。

単離されたオリゴヌクレオチドは、配列番号１；配列番号２；配列番号３；配列番号４；配列番号５；配列番号６；配列番号７；配列番号８；配列番号９；配列番号１０；配列番号１１；配列番号１２；配列番号１３；配列番号１４；配列番号１５；配列番号１６；配列番号１７；配列番号１８；配列番号１９；配列番号２０；配列番号２１；配列番号２２；配列番号２３；配列番号２４；配列番号２５；配列番号２６；配列番号２７；配列番号２８；配列番号２９；配列番号３０；配列番号３１；配列番号３２；配列番号３３；配列番号３４；配列番号３５；配列番号３６；配列番号３７；配列番号３８；配列番号３９；配列番号４０；配列番号４１；配列番号４２；配列番号４３；配列番号４４；配列番号４５；配列番号４６；配列番号４７；配列番号４８；配列番号４９；配列番号５０；配列番号５１；配列番号５２；および配列番号５３からなる群より選択される核酸配列のうちの少なくとも１２個連続するオリゴヌクレオチドを含んで提供され、そのオリゴヌクレオチドは、炭疽菌におけるフルオロキノリン耐性を示すＤＮＡに選択的に結合可能である。

本発明の特定の好ましい実施形態において、そのオリゴヌクレオチドは、固体表面、クロマトグラフィー表面、例えば、またはナノメートルスケールの診断プレート上に、固定化されている。本発明の他の好ましい実施形態において、上記ヌクレオチドは、観察可能なマーカー（最も好ましくは、蛍光標識または放射性基）をさらに含む。

配列番号１および配列番号２；配列番号３および配列番号４；配列番号５および配列番号６；配列番号７および配列番号８；配列番号９および配列番号１０；配列番号１１および配列番号１２；配列番号１３および配列番号１４；配列番号１５および配列番号１６；配列番号１７および配列番号１８；配列番号１９および配列番号２０；配列番号２１および配列番号２２；配列番号２３および配列番号２４；配列番号２５および配列番号２６；配列番号２７および配列番号２８；配列番号２９および配列番号３０；配列番号３１および配列番号３２；配列番号３３および配列番号３４；配列番号３５および配列番号３６；配列番号３７および配列番号３８；ならびに配列番号３９および配列番号４０からなるオリゴヌクレオチド対の群より選択されるプライマー対が、提示され、そのオリゴヌクレオチドプライマー対は、炭疽菌におけるフルオロキノリン耐性を示すＤＮＡに選択的に結合可能である。

配列番号４１；配列番号４２；配列番号４３；配列番号４４；配列番号４５；配列番号４６；配列番号４７；配列番号４８；配列番号４９；配列番号５０；配列番号５１；配列番号５２；および配列番号５３からなる群より選択される内部オリゴヌクレオチドプライマーが提示され、そのプライマーは、一塩基多型を検出可能であり、この一塩基多型は、炭疽菌におけるフルオロキノリン耐性の特徴である。

上記の内部オリゴヌクレオチドプライマーおよびポリポリヌクレオチドテールを含む単一塩基伸長（ＳＢＥ）プライマーは、ＰＣＲ機器中でのＳＮＰの増幅および単離において用いるためのものであり、このＳＢＥプライマーは、アンプリコンの電気泳動での分離を助けるための誂えた（ｃｕｓｔｏｍｉｚｉｅｄ）アンプリコン長を提供する。

本発明の重要な局面において、炭疽菌におけるフルオロキノロン耐性に関連する複数の選択された標的ＤＮＡ配列が存在するか否かを検出することによりフルオロキノロン耐性炭疽菌株を検出するための方法が、提示される。

炭疽菌のフルオロキノリン耐性株を検出するための特定の好ましい方法は、
ｉ．炭疽菌株由来のＤＮＡサンプルを提供する工程；
ｉｉ．配列番号１および配列番号２；配列番号３および配列番号４；配列番号５および
配列番号６；配列番号７および配列番号８；配列番号９および配列番号１０；配列番号１１および配列番号１２；配列番号１３および配列番号１４；配列番号１５および配列番号１６；配列番号１７および配列番号１８；配列番号１９および配列番号２０；配列番号２１および配列番号２２；配列番号２３および配列番号２４；配列番号２５および配列番号２６；配列番号２７および配列番号２８；配列番号２９および配列番号３０；配列番号３１および配列番号３２；配列番号３３および配列番号３４；配列番号３５および配列番号３６；配列番号３７および配列番号３８；ならびに配列番号３９および配列番号４０からなるオリゴヌクレオチド対の群より選択される１つ以上のプライマー対を提供する工程であって、そのオリゴヌクレオチドプライマーの対は、炭疽菌におけるフルオロキノリン耐性を示すＤＮＡに選択的に結合可能である、工程；
ｉｉｉ．１つ以上の上記プライマー対を用いて上記ＤＮＡを増幅する工程；ならびに
ｉｖ．この多重化工程の結果を、公知のフルオロキノリン耐性株由来のＤＮＡ増幅の結果と比較する工程、
を包含する。

好ましくは、ＤＮＡの増幅は、１つ以上の適切なプライマー対を用いる多重化による。炭疽菌におけるフルオロキノリン耐性を検出するための方法における他の好ましい実施形態は、
ｉ．炭疽菌株由来のＤＮＡサンプルを提供する工程；
ｉｉ．配列番号１；配列番号２；配列番号３；配列番号４；配列番号５；配列番号６；配列番号７；配列番号８；配列番号９；配列番号１０；配列番号１１；配列番号１２；配列番号１３；配列番号１４；配列番号１５；配列番号１６；配列番号１７；配列番号１８；配列番号１９；配列番号２０；配列番号２１；配列番号２２；配列番号２３；配列番号２４；配列番号２５；配列番号２６；配列番号２７；配列番号２８；配列番号２９；配列番号３０；配列番号３１；配列番号３２；配列番号３３；配列番号３４；配列番号３５；配列番号３６；配列番号３７；配列番号３８；配列番号３９；配列番号４０；配列番号４１；配列番号４２；配列番号４３；配列番号４４；配列番号４５；配列番号４６；配列番号４７；配列番号４８；配列番号４９；配列番号５０；配列番号５１；配列番号５２；および配列番号５３からなる群より選択される核酸配列のうち少なくとも１２個連続するヌクレオチドを含む、１つ以上の単離オリゴヌクレオチドを提供する工程であって、そのオリゴヌクレオチドは、炭疽菌におけるフルオロキノリン耐性を示すＤＮＡに選択的に結合可能である、工程；
ｉｉｉ．上記ＤＮＡが上記オリゴヌクレオチドに結合する条件下で、上記オリゴヌクレオチドと上記ＤＮＡとを合わせる工程；および
ｉｖ．結合したオリゴヌクレオチドの存在または非存在を検出する工程であって、結合したオリゴヌクレオチドの存在は、フルオロキノリン耐性炭疽菌株を示す、工程、
を包含する。

好ましくは、この好ましい方法において、上記オリゴヌクレオチドは、観察可能なマーカー（最も好ましくは蛍光性基または放射性基）を含む。炭疽菌のフルオロキノリン耐性株を検出するための本発明の他の好ましい方法は、
ｉ．炭疽菌株由来のＤＮＡサンプルを提供する工程；
ｉｉ．ａ）配列番号１および配列番号２；配列番号３および配列番号４；配列番号５および配列番号６；配列番号７および配列番号８；配列番号９および配列番号１０；配列番号１１および配列番号１２；配列番号１３および配列番号１４；配列番号１５および配列番号１６；配列番号１７および配列番号１８；配列番号１９および配列番号２０；配列番号２１および配列番号２２；配列番号２３および配列番号２４；配列番号２５および配列番号２６；配列番号２７および配列番号２８；配列番号２９および配列番号３０；配列番号３１および配列番号３２；配列番号３３および配列番号３４；配列番号３５および配列番号３６；配列番号３７および配列番号３８；ならびに配列番号３９および配列番号４０からなるオリゴヌクレオチド対の群より選択される一対のオリゴヌクレオチドプライマーであって、このオリゴヌクレオチドプライマーの対は、炭疽菌におけるフルオロキノリン耐性を示すＤＮＡに選択的に結合可能である、オリゴヌクレオチドプライマー対；
ｂ）配列番号４１；配列番号４２；配列番号４３；配列番号４４；配列番号４５；配列番号４６；配列番号４７；配列番号４８；配列番号４９；配列番号５０；配列番号５１；配列番号５２；および配列番号５３からなる群より選択される内部オリゴヌクレオチドプライマーであって、このプライマーは、一塩基多型の検出が可能であり、この一塩基多型は、炭疽菌におけるフルオロキノリン耐性の特徴である、プライマー；または
ｃ）それらの組み合わせ、
から選択される１つ以上のプライマー対を提供する工程；
ｉｉｉ．１つ以上の上記プライマーを用いて、上記ＤＮＡを増幅する工程であって、上記プライマーは、好ましくは観察可能なマーカー（最も好ましくは蛍光性基または放射性基）を含む、工程；および
ｉｖ．この増幅工程の結果を、上記プライマーを用いた公知のフルオロキノリン耐性炭疽菌の増幅の結果と比較する工程、
を包含する。

好ましい方法において、内部オリゴヌクレオチドプライマーを含みかつポリヌクレオチドテールをさらに含む単一塩基伸長（ＳＢＥ）プライマー（表３）は、ＰＣＲ機器中でのＳＮＰの増幅および単離において用いるためのものであり、このＳＢＥプライマーは、電気泳動での分離を助けるための誂えたアンプリコン長を提供する。本発明の別の重要な局面において、熱再利用増幅（好ましくは、多重化）によるフルオロキノロン類耐性炭疽菌を検出するためのキットが、提供される。炭疽菌におけるフルオロキノリン耐性を検出するための好ましいキットは、配列番号１および配列番号２；配列番号３および配列番号４；配列番号５および配列番号６；配列番号７および配列番号８；配列番号９および配列番号１０；配列番号１１および配列番号１２；配列番号１３および配列番号１４；配列番号１５および配列番号１６；配列番号１７および配列番号１８；配列番号１９および配列番号２０；配列番号２１および配列番号２２；配列番号２３および配列番号２４；配列番号２５および配列番号２６；配列番号２７および配列番号２８；配列番号２９および配列番号３０；配列番号３１および配列番号３２；配列番号３３および配列番号３４；配列番号３５および配列番号３６；配列番号３７および配列番号３８；ならびに配列番号３９および配列番号４０からなるオリゴヌクレオチド対の群より選択されるオリゴヌクレオチドプライマー対の１つ以上の対を含み、そのオリゴヌクレオチドプライマーの対は、炭疽菌におけるフルオロキノリン耐性を示す生成物の増幅を引き起こすことが可能である。

最も好ましくは、本発明のキットは、ｔｎｐ（最も好ましくは標識された、例えば、ＡＴＰ、ＴＴＰ、ＧＴＰ、ＣＴＰ、およびＵＴＰ）、ならびにＰＣＲ器具中でのＤＮＡの増幅を引き起こすのに適切なｔａｑポリメラーゼ、塩および緩衝液をさらに含む。特定の他のキットは、配列番号４１；配列番号４２；配列番号４３；配列番号４４；配列番号４５；配列番号４６；配列番号４７；配列番号４８；配列番号４９；配列番号５０；配列番号５１；配列番号５２；および配列番号５３からなる群より選択される１つ以上のオリゴヌクレオチドプライマーを含み、そのプライマーは、一塩基多型の検出が可能であり、この一塩基多型は、炭疽菌におけるフルオロキノリン耐性の特徴である。最も好ましくは、それらのプライマーは、観察可能なマーカー（蛍光性基または放射性基）で標識される。好ましい実施形態においては、そのキットは、ＤＮＡおよびプライマーの結合を引き起こすために適切な塩、および緩衝液をさらに含む。

（詳細な説明）
本発明は、シプロフロキサシン（ＣＩＰ）耐性と関連する一塩基多型（ＳＮＰ）について炭疽菌をスクリーニングするための分子アッセイを開示する。この診断的アプローチは、サンプルの培養が不可能である状況下において、ＣＩＰ耐性についての炭疽菌サンプルの迅速なスクリーニングを提供する。何らかの生物テロリスト活動が生じた場合、この迅速なアッセイは炭疽の故意の蔓延を早期に検出することを可能にすることが予想される。

複数の変異炭疽菌株の研究は、野生型炭疽菌におけるＣＩＰの主要な標的は、ＧｙｒＡであり、第２の標的はＰａｒＣであり、第３の標的はまだ完全には決定されていないことを示した。ＣＩＰの標的順序は、ジャイレースおよびトポイソメラーゼＩＶのサブユニットＱＲＤＲのアミノ酸残基によって決定されているようである。

フルオロキノロン耐性炭疽菌を決定するためのアッセイが提示され、それは６つのｇｙｒＡヌクレオチドおよび３つのｐａｒＣヌクレオチドの変異の状態に基づいている。９つの遺伝子座を増幅する多重化のためのプライマーが、表３および図２で開示される。これら９つの遺伝子座は、最も一般的な変異を表し、本方法を用いて迅速にアッセイされ得る。これら９つの変異は、ＣＩＰ耐性のレベルの決定において非常に重要な役割を果たすので、ＳＮＰの情報は、大発生の初期段階において、適切な抗生物質の治療の戦略を開発する際に用いられ得る。新たに得られた株は、ほんの２〜３時間のうちに遺伝子型を決定され得る。

抗生物質の乱用または悪意のどちらかによって生じたＣＩＰ耐性炭疽菌の株は、開示されるＳＮＰアッセイを用いて迅速に遺伝子型を決定され得る。本アッセイは、ＳＮａＰｓｈｏｔ^ＴＭ技法（ＡＢＩ ＰＲＩＳＭ^ＴＭ Ａｐｐｌｉｅｄ ＢｉｏＳｙｓｔｅｍｓ Ｉｎｃ．）を用いて開発されたが、当該分野で公知の他のＳＮＰアッセイも利用可能であり、用いられ得る。本アッセイにおいて、６つのｇｙｒＡヌクレオチドおよび３つのｐａｒＣヌクレオチドの変異状態は、ＡＢＩ３７７またはＡＢ３１００上の単一レーン中で容易に観察される。

以下の定義が、本明細書中で用いられる：
「ポリメラーゼ連鎖反応」または「ＰＣＲ」は、変性、プライマーとのアニーリング、およびＤＮＡポリメラーゼでの伸長のサイクルが、標的ＤＮＡ配列のコピー数をおよそ１０６倍以上増幅するために用いられる技術である。核酸を増幅するためのポリメラーゼ連鎖反応のプロセスは、米国特許第４，６８３，１９５号、および同第４，６８３，２０２号に記載されている。これらの米国特許は、本明細書中で参考として援用する。

「プライマー」は、プライマーの３’末端がＤＮＡポリメラーゼ酵素を用いて重合の部位として作用し得るような様式で、座のＤＮＡ鎖とハイブリダイズする、一本鎖のオリゴヌクレオチドまたはＤＮＡフラグメントである。

「プライマー対」は、増幅されるＤＮＡ配列の一端の一本鎖にハイブリダイズするプライマー１と、増幅されるＤＮＡ配列の相補鎖上のもう一方の一端にハイブリダイズするプライマー２とを含む、２つのプライマーである。

「プライマー部位」：プライマーがハイブリダイズする標的ＤＮＡの領域。

「多重化」は、熱サイクリング機器での単一アッセイプロセス（ＰＣＲ）における、同時の複数の決定のためのアッセイ系である。あるプロセスにおいてそのような能力を実行するためのプロセスは、「多重化アッセイ」である。いくつかの座を含むシステムは、多重化系と呼ばれ、例えば、Ｓｃｈｕｍｍらに対する米国特許第６，４７９，２３５号、Ｌｅｗｉｓらに対する同第６，２７０，９７３号、およびＣｈａｎｄｌｅｒらに対する同第６，４４９，５６２号に記載されている。

「単離された核酸」は、天然に存在する核酸と同一であってもまたは同一でなくてもよい、核酸である。「単離された核酸」が、プライマーを記載するために用いられる場合、その核酸は、少なくとも遺伝子の長さに広がる天然に存在する核酸の構造と同一ではない。本明細書中のプライマーは、両方の隣接配列を結合するように設計されている。特定のプライマーはまた、目的のＤＮＡ配列に内部で結合し得る。上記プライマーのこれらの隣接配列への結合を損なわないこれらの開示される配列において挿入または欠失を含むプライマー配列もまた、本発明に組み込まれることが意図されることが、理解されるべきである。

（フルオロキノロン類耐性株を検出するための迅速な炭疽菌アッセイの方法）
（ＤＮＡ抽出）
ＤＮＡを、Ｋｅｉｍら、２０００に記載されたように抽出した。手短には、ＤＮＡを、血液寒天プレート由来の約１ｍｇの細胞物質を１５０μｌのヒート−ソーク（ｈｅａｔ−ｓｏａｋ）緩衝液（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、１ｍＭ ＥＤＴＡ、ｐＨ８．０）に懸濁し、８５℃まで３０分間加温することによって、各耐性変異体から抽出した。細胞の破片を、遠心分離によってペレットにし、その上清をＰＣＲ反応のテンプレートとして用いた。

（ＰＣＲ増幅）
すべてのプライマー（表１）を、Ｔｈｅ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｆｏｒ Ｇｅｎｏｍｉｃ Ｒｅｓｅａｒｃｈ、Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ、ＭＤ、ＵＳＡによって一般的に提供されている不完全な炭疽菌ゲノム配列から設計した。ＰＣＲ産物を、５０μｌＰＣＲ反応において増幅し、そして以下のように調製した：１×ＰＣＲ緩衝液（２０ｍＭ Ｔｒｉｓ ｐＨ８．４、５０ｍＭ ＫＣｌ）（Ｇｉｂｃｏ／ＢＲＬ、Ｂｅｔｈｅｓｄａ、ＭＤ、ＵＳＡ）、０．１０ｍＭ ＤＮＴＰ、２ｍＭ ＭｇＣｌ_２、２μｌヒート−ソーク上清（テンプレートとして）、０．０４Ｕ／μｌ Ｔａｑポリメラーゼ（Ｇｉｂｃｏ／ＢＲＬ、Ｂｅｔｈｅｓｄａ、ＭＤ、ＵＳＡ）、０．２μＭ 順方向プライマーおよび逆方向プライマーを、フィルター濾過（０．２μｍ）した１７．８ｍΩ Ｅ−ｐｕｒｅ水で５０μｌに調整した。反応を、９４℃まで５分間加熱し、次に９４℃で２０秒間、６０℃で２０秒間、および７２℃で２０秒間の３５サイクルに供した。この後に、プライマーの伸長を完成するために７２℃まで５分間加熱した。ＰＣＲ産物を、ＥｔＢｒ染色した１．５％ Ｓｙｎｅｒｇｅｌ^ＴＭ（Ｄｉｖｅｒｓｉｆｉｅｄ Ｂｉｏｔｅｃｈ、Ｂｏｓｔｏｎ、ＭＡ、ＵＳＡ）／０．７％アガロース（Ｇｉｂｃｏ／ＢＲＬ、Ｂｅｔｈｅｓｄａ、ＭＤ、ＵＳＡ）上で定量した。定量したＰＣＲ産物を、次のように配列決定した。

（ＤＮＡ配列決定）
ＰＣＲ産物を、１：５で水に希釈し、ＡＢＩ ＰＲＩＳＭ（登録商標）Ｒｅａｄｙ Ｒｅａｃｔｉｏｎ ＢｉｇＤｙｅ^ＴＭ Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ Ｃｙｃｌｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ Ｋｉｔ（ともに、Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ／Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ Ｉｎｃ．、Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ、ＣＡ、ＵＳＡより得た）を用いて、ＡＢＩ３７７蛍光シークエンサー上で配列決定した。必要な場合、連続する遺伝子配列を、個々の配列からＳｅｑＭａｎ^ＴＭソフトウエア（ＤＮＡＳＴＡＲ，ｉｎｃ．、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ、ＵＳＡ）を用いて調製した。連続する配列を、ＭｅｇＡｌｉｇｎ^ＴＭソフトウエア（ＤＮＡＳＴＡＲ，ｉｎｃ．、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ、ＵＳＡ）を用いて野生型配列と整列させた。

（ＳＮＰ多重化アッセイ）
一塩基多型（ＳＮＰ）アッセイを開発して、９つの観察された耐性変異体を迅速に同定した（表２）。隣接プライマー（ｆｌａｎｋｉｎｇ ｐｒｉｍｅｒ）（表３）を、ｇｙｒＡの塩基２０３〜３２３（１２２塩基対生成物）、およびｐａｒＣの塩基１７５〜３２０（１４６塩基対生成物）を増幅するために設計した。ＰＣＲ産物を、最終濃度の１×ＰＣＲ緩衝液（上記）、３ｍＭ ＭｇＣｌ_２、０．１ｍＭ ｄＮＴＰ、順方向プライマーおよび逆方向プライマーの対（０．１μＭ ｇｙｒＡプライマー／０．４μＭ ｐａｒＣプライマー）、１Ｕ Ｐｌａｔｉｎｕｍ（登録商標）Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼ（Ｇｉｂｃｏ／ＢＲＬ、Ｂｅｔｈｅｓｄａ、ＭＤ、ＵＳＡ）、および１μｌのヒート−ソーク上清（テンプレートとして）と共に１０μｌの一重または二重のＰＣＲにおいて増幅した。反応を、９４℃まで５分間加熱し、次に９４℃で２０秒間、６０℃で３０秒間、および７２℃で３０秒間の３０サイクルに供した。手順の残りを、当該分野で公知の方法に従って実行した。ＡＢＩ ＰＲＩＳＭ（商標登録）ＳＮａＰｓｈｏｔ^ＴＭ Ｍｕｌｔｉｐｌｅｘ Ｋｉｔにおいて好ましい指示を与え、ＡＢ３１００ ｇｅｎｅｔｉｃ ａｎａｌｙｚｅｒ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ、ＣＡ、ＵＳＡ）上で実行した。単一塩基伸長（ＳＢＥ）プライマー（表３）を、電気泳動的に分離するようした場合にアンプリコン長を４塩基対間隔に誂えるために、ポリヌクレオチドテール（ポリＣおよび単一Ａ）で設計し、６つのｇｙｒＡ ＳＮＰを５’から３’の変異が見出される順序で検出し、その後３つのｐａｒＣ ＳＮＰを検出した（また、５’から３’の存在順序）。プライマーｇｙｒＡ２６５およびプライマーｇｙｒＡ２５４は、各々１つおよび２つＳＮＰ座が重なっているので、工程３の変異とテンプレート上でアニーリングすることが可能なように、それらを部位２６６および部位２６５にて縮重塩基対を用いて設計した。プライマー縮重にもかかわらず、１３プライマー多重におけるｇｙｒＡ２６５の増幅は、Ｓ３−２変異体において弱かった。従って、テンプレートがＳ３−２変異体であると推測した場合、２つのｇｙｒＡ２６５プライマーのみを含んだ第２のＳＢＥを実行することによって、この座を、個々に標的にした。ＳＢＥ生成物の順序は、ＳＢＥ ＰＣＲの多重化を可能にし、記録を容易にし、サイズ標準物についての必要性を排除した。従って、このアッセイを、５−ダイキャピラリー機器が利用できない場合に、４−ダイＡＢＩ３７７で実行し得る。

（変異炭疽菌株の選択およびフルオロキノロン類耐性部位の同定）
（細菌株）
炭疽菌の非病原性のｐＸ０１−／ｐＸ０２−、Ａｍｅｓ株の選別を行った（Ｉｖｉｎｓら、１９８６）。多様性研究のために用いたすべてのＤＮＡサンプルは、本発明者らの炭疽菌ＤＮＡコレクションに由来した（Ｋｅｉｍら、２０００）。炭疽菌株を、結果として生じる段階的な変異の蓄積を生成するために、増大する漸増ＣＩＰ濃度で連続して選択した。変異株を、６４μｇ ＣＩＰ／ｍｌ程度の高さの（野生型より１０００倍高い）ＭＩＣを用いて単離した。これらの結果を、表２に示した。変異の蓄積が、特有かつ順序付けられた様式で生じた。第１レベルの変異体を、０．２５μｇ ＣＩＰ／ｍｌで選択した。これは、６．６×１０^−１０の割合で発生し、そしてｇｙｒＡ ＱＲＤＲ内の５つの変異のうちの１つを有していた（表２）。これらの変異体のうちの不相応な数（７１％）が、ｇｙｒＡ中にＣ２５４→Ｔのミスセンス変異を有していた（表２）。この変異によって付与される耐性のレベルは、他のＳ１変異の耐性レベルと類似していた。この変異体は、他のＳ１変異を超える選択的優位性を提供しなかったので、炭疽菌ｇｙｒＡのＣ２５４ヌクレオチドを変異多発点と呼ぶことは、妥当である。第２レベルの変異体を、１．５μｇ ＣＩＰ／ｍｌで選択した。これは、１．０×１０^−８の割合で発生し、そしてｐａｒＣ ＱＲＤＲ内の４つの変異のうちの１つを有していた（表２）。Ｓ１変異と同様に、１つのＳ２遺伝子型（Ｃ２４２→Ｔ）は代表が多すぎた（７１％）（表２）。ｐａｒＣのＣ２４２ヌクレオチドが別の変異多発点を表すことが起こりうる一方、代表の多すぎることはまた、上記変異によってその株に付与される不相応な耐性レベルの結果でもあり得た（表２）。第３レベルの変異体を、２４μｇ ＣＩＰ／ｍｌで選択した。これは、４．８×１０^−１０の割合で発生した。２つの第３レベルの変異体を、ｇｙｒＡ ＱＲＤＲ内の新規の変異を用いて同定した（表２）。しかし、他の２１個の第３レベル変異体は、ｇｙｒＡまたはｐａｒＣ ＱＲＤＲのどちらにも、さらなる変化を有さなかった。ｇｙｒＢおよびｐａｒＥにおける潜在的ＱＲＤＲをまた、これらの株由来から配列決定し、そしてこれらの領域においてさらなる変異がないことを明らかにした。標的化された段階的な変異の蓄積（Ｓ１ ｇｙｒＡ→Ｓ２ ｐａｒＣ→Ｓ３ ｇｙｒＡ／？）は、特定のフルオロキノロン類が、種々の細菌種の中の異なる主要なトポイソメラーゼ標的を有するという仮説（Ｆｅｒｒｅｒｏら、１９９５；Ｎｇら、１９９６；ＰａｎおよびＦｉｓｈｅｒら、１９９８）を支持するための、さらなる証拠を提供する。

炭疽菌は、ＣＩＰの存在下における炭疽菌の増殖を可能にする、複数の異なったミスセンス変異を発生する能力を有する。炭疽菌がＣＩＰへの耐性を発生する段階的な表現型の割合（４．８×１０^−１０〜１．０×１０^−８）は、他の種におけるフルオロキノロン耐性について報告された割合と類似している。ヒトの炭疽症例が稀なこと、およびこの病原体の死体依存性伝染サイクルは、患者の不履行によるＣＩＰ耐性炭疽菌の発生および蔓延を起こりそうもないことにする。しかし、抗菌性成長促進剤の農業上での実施は、この潜在的な結果を有する。０．３８μｇ ＣＩＰ／ｍｌ以上の血清濃度および組織濃度を標的としたＣＩＰレジメンは、ＣＩＰ耐性炭疽菌が発生するための機会を減少させる。これは、統計的に起こりそうもないｇｙｒＡおよびｐａｒＣのＱＲＤＲにおいて同時に有利な変異を発生する細菌の事象（６．６×１０^−１８）か、ｇｙｒＡおよびｐａｒＣのＱＲＤＲにおいて同時に有利な変異を発生することを必要とすることによる。家畜において抗菌性成長促進剤として抗生物質を低レベルで供給することから生じる血清濃度および組織濃度は、最大許容濃度（ＭＰＣ）に到達せず、そしておそらく野生型炭疽菌のための最小発育阻止濃度（ＭＩＣ）が不足した。従って、この実行は、特に炭疽菌が地域特有である畜産地域において、耐性株の発生についての潜在的危険性を提示し得た。

（多様性研究）
ｇｙｒＡおよびｐａｒＣのＱＲＤＲを、８つの主要な多様性群から配列決定し、下に記載のように点変異について分析した。８つの株は、３（７４−４２Ｃ−８）、２５（１４１８５）、３９（４６）、４５（２Ｂ８０）、６２（Ｏｃｔ−３２１）、７７（Ｖｏｌｌｕｍ）、８０である。

（段階的な変異体選択）
炭疽菌Ａｍｅｓ−／−株を、凍結ストックから取り、血液寒天プレート上に線引きし、３５℃で一晩増殖させた。単離したコロニー由来の細胞を、５ｍｌのミューラー−ヒントンブロスを含む培養チューブに接種し用いた。培養物を、Ｇ２４ Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ Ｉｎｃｕｂａｔｏｒ Ｓｈａｋｅｒ（Ｎｅｗ Ｂｒｕｎｓｗｉｃｋ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｅｄｉｓｏｎ、ＮＪ、ＵＳＡ）中にて２２５ｒｐｍで振盪して、３７℃にて一晩インキュベートした。これらの培養物の各々（平均ＯＤ_６２５約１．４×１０^８または１．４３×１０^８ＣＦＵ／ｍｌ）を、０．４５μｍニトロセルロースメンブレンフィルター（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、Ｂｅｄｆｏｒｄ、ＭＡ ＵＳＡ）に移した。メンブレンを、０．２５μｇ ＣＩＰ／ｍｌを含むミューラー−ヒントン寒天上に細胞側を上にして配置し、約４０時間インキュベートした。各陽性プレートからの単一コロニー由来の細胞を、血液寒天上に線引きし、３５℃で一晩培養した。これらのプレート由来の細胞を、凍結ストックを調製するため、および配列決定のためのＤＮＡを単離するために、用いた（下記を参照のこと）。最も一般的な独自の遺伝子型であるＳ１−１を、１．５μｇ ＣＩＰ／ｍｌを含むミューラー−ヒントン寒天上での次の回の選択に供した。同様に、この選択からの最も一般的な遺伝子型であるＳ２−１を、２４μｇ ＣＩＰ／ｍｌを含む寒天上での第３回かつ最終回である選択に供した。

（変異率）
工程１、工程２、および工程３のシプロフロキサシン耐性変異体についての変異率を、野生型Ａｍｅｓ−／−、Ｓ１−１、およびＳ２−１の各々の９６個の独立培養物を用いて決定した。出発単離体の単一コロニーを、ＬＢブロス中に懸濁し、およそ１，０００細胞を独立培養物の各々に接種するために用いた。工程１および工程３の変異体について、９６個の１ｍｌ培養物を、４個の２４ウェルプレート（Ｃｏｓｔａｒ）においてＬＢブロス中で培養した。工程２について、９６個の１００μｌ培養物を、１つの９６ウェルプレート（Ｃｏｓｔａｒ）においてＬＢブロス中で培養した。すべてのプレートを、Ｇ２４ Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ Ｉｎｃｕｂａｔｏｒ Ｓｈａｋｅｒ（Ｎｅｗ Ｂｒｕｎｓｗｉｃｋ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｅｄｉｓｏｎ、ＮＪ、ＵＳＡ）中にて２２５ｒｐｍで振盪して、３７℃にて一晩インキュベートした。６つの培養物を各工程についてランダムに選択し、そして各培養物中に存在する細胞の平均の総数を決定するために用いた。残った９０個の培養物を、工程１、工程２、および工程３の各々について、０．２５μｇ ＣＩＰ／ｍｌ、１．５μｇ ＣＩＰ／ｍｌ、および２４μｇ ＣＩＰ／ｍｌの濃度でミューラー−ヒントンシプロフロキサシンプレート上にプレートした。工程２については、１００μｌ培養物を直接プレートした。工程１および工程３について、１ｍｌ培養物を、無菌の１．５ｍｌ微量遠心チューブに移し、３，０００×ｇで５分間遠心分離した。およそ８５０μｌの上清を除き、ペレットを残ったブロス中に再懸濁し、プレートした。プレートのすべてを、３７℃にて約４８時間インキュベートした。４つに至るまで、各陽性プレート由来の推定の４個までの耐性コロニーを、新たな選択培地に移し、そして耐性を確認するために３７℃にて約４８時間インキュベートした。耐性変異体を欠くプレートの数は、ゼロ変異事象を表す。この値を、各工程についての変異率を評価するために位置分布における細胞数とともに用いた。

（感受性テスト）
ＭＩＣを、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ ｆｏｒ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｓｔａｎｄａｒｄｓ（Ｎａｔｉｏｎａｌ ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ、１９９７）の指針に従って、ミューラー−ヒントン寒天希釈法により決定した。Ｅ試験ストリップ（ＡＢ ＢＩＯＤＩＳＫ）を、迅速なスクリーニングのために使用した。これを、図１に示す。

本発明の好ましい実施形態の特定のものは、記載され、特異的に上に例示される一方、本発明がそのような実施形態に限定されることは、意図されない。種々の改変が、添付する特許請求の範囲に示される本発明の範囲および精神から逸脱することなしに、本発明になされ得る。

図１は、異なるシプロフロキサシン濃度に対する変異体の感受性を示す。野生型の親株（Ａ）および３つの連続した段階的な変異株（Ｂ−Ｄ）は、Ｅ−ストリップ（Ｅ−ｓｔｒｉｐ）を用いて、シプロフロキサシン感受性について評価される。段階的な変異株は、（Ｂ）Ｓ１−１、（Ｃ）Ｓ２−３、および（Ｄ）Ｓ３−１である。自然に起こる段階的な変異率（世代あたりの変化）が、矢印で示される。 図２は、ＣＩＰ耐性に関連する変異性の変化についてのＳＮＰアッセイを示す。ＡＢＩ３７７ゲルイメージの図解が、７つの炭疽菌株の間の９つのＳＮＰ座とともに示される（野生型、２つの工程１の変異体、２つの工程２の変異体、および２つの工程３の変異体）。さらに、キャピラリー電気泳動機器（ＡＢ３１００）上で作成される野生型遺伝子型の１つの波形データは、診断基盤全体にわたるアッセイの柔軟性を説明することが示される。変異遺伝子型のＳＮＰは、Ｓ１−１：ｇｙｒＡ２５４（Ｒ）Ｃ→Ｔ；Ｓ１−２：ｇｙｒＡ２６５（Ｒ）Ｇ→Ａ；Ｓ２−１：ｇｒｙＡ２５４（Ｒ）Ｃ→ＴおよびｐａｒＣ２４２ Ｃ→Ｔ；Ｓ２−２：ｇｙｒＡ２５４（Ｒ）Ｃ→ＴおよびｐａｒＣ２４２ Ｃ→Ａ；Ｓ３−１：ｇｙｒＡ２５４（Ｒ）Ｃ→Ｔおよび→２６５（Ｒ）Ｇ→ＡおよびｐａｒＣ２４２ Ｃ→Ｔ；Ｓ３−２：ｇｙｒＡ２５４（Ｒ）Ｃ→ＴおよびｇｙｒＡ２６６（Ｒ）Ａ→ＣおよびｐａｒＣ２４２ Ｃ→Ｔである。

Claims (22)

1. 単離されたオリゴヌクレオチドであって、配列番号１；配列番号２；配列番号３；配列番号４；配列番号５；配列番号６；配列番号７；配列番号８；配列番号９；配列番号１０；配列番号１１；配列番号１２；配列番号１３；配列番号１４；配列番号１５；配列番号１６；配列番号１７；配列番号１８；配列番号１９；配列番号２０；配列番号２１；配列番号２２；配列番号２３；配列番号２４；配列番号２５；配列番号２６；配列番号２７；配列番号２８；配列番号２９；配列番号３０；配列番号３１；配列番号３２；配列番号３３；配列番号３４；配列番号３５；配列番号３６；配列番号３７；配列番号３８；配列番号３９；配列番号４０；配列番号４１；配列番号４２；配列番号４３；配列番号４４；配列番号４５；配列番号４６；配列番号４７；配列番号４８；配列番号４９；配列番号５０；配列番号５１；配列番号５２；および配列番号５３からなる群より選択される核酸配列の少なくとも１２個連続するヌクレオチドを含み、該ヌクレオチドは、炭疽菌におけるフルオロキノリン耐性を示すＤＮＡに選択的に結合可能である、オリゴヌクレオチド。
2. 請求項１に記載のオリゴヌクレオチドであって、固体表面に固定化されている、オリゴヌクレオチド。
3. 請求項１に記載のオリゴヌクレオチドであって、観察可能なマーカーをさらに含む、オリゴヌクレオチド。
4. 請求項３に記載のオリゴヌクレオチドであって、前記観察可能なマーカーが、蛍光標識である、オリゴヌクレオチド。
5. 請求項３に記載のオリゴヌクレオチドであって、前記観察可能なマーカーが、放射性基である、オリゴヌクレオチド。
6. 請求項１に記載のオリゴヌクレオチドであって、前記フルオロキノリンが、シプロフロキサシンである、オリゴヌクレオチド。
7. 一対のオリゴヌクレオチドプライマーであって、配列番号１および配列番号２；配列番号３および配列番号４；配列番号５および配列番号６；配列番号７および配列番号８；配列番号９および配列番号１０；配列番号１１および配列番号１２；配列番号１３および配列番号１４；配列番号１５および配列番号１６；配列番号１７および配列番号１８；配列番号１９および配列番号２０；配列番号２１および配列番号２２；配列番号２３および配列番号２４；配列番号２５および配列番号２６；配列番号２７および配列番号２８；配列番号２９および配列番号３０；配列番号３１および配列番号３２；配列番号３３および配列番号３４；配列番号３５および配列番号３６；配列番号３７および配列番号３８；ならびに配列番号３９および配列番号４０からなるオリゴヌクレオチド対の群より選択され、該対のオリゴヌクレオチドプライマーは、炭疽菌におけるフルオロキノリン耐性を示すＤＮＡに選択的に結合可能である、一対のオリゴヌクレオチドプライマー。
8. 請求項７に記載の一対のオリゴヌクレオチドであって、前記フルオロキノリンが、シプロフロキサシンである、一対のオリゴヌクレオチド。
9. オリゴヌクレオチドプライマーであって、配列番号４１；配列番号４２；配列番号４３；配列番号４４；配列番号４５；配列番号４６；配列番号４７；配列番号４８；配列番号４９；配列番号５０；配列番号５１；配列番号５２；および配列番号５３からなる群より選択され、該プライマーは、一塩基多型を検出可能であり、該一塩基多型は、炭疽菌におけるフルオロキノリン耐性の特徴である、オリゴヌクレオチドプライマー。
10. 請求項９に記載のオリゴヌクレオチドプライマーであって、該プライマーは、誂えたアンプリコン長を生成可能であるポリヌクレオチドテールを含む、プライマー。
11. 炭疽菌におけるフルオロキノリン耐性を検出するための方法であって、
    ｉ．炭疽菌由来のＤＮＡサンプルを提供する工程；
    ｉｉ．請求項７からの１つ以上のプライマー対を提供する工程；
    ｉｉｉ．前記プライマー対を用いて該ＤＮＡを増幅する工程；および
    ｉｖ．該増幅工程の結果を、該プライマー対を用いた公知のフルオロキノリン耐性炭疽菌の増幅の結果と比較する工程、を包含する、方法。
12. 請求項１１に記載の方法であって、前記増幅工程が、多重化する工程をさらに包含する、方法。
13. 炭疽菌におけるフルオロキノリン耐性を検出するための方法であって、
    ｉ．炭疽菌由来のＤＮＡサンプルを提供する工程；
    ｉｉ．請求項１に記載の１つ以上のオリゴヌクレオチドを提供する工程；
    ｉｉｉ．該オリゴヌクレオチドが該ＤＮＡに結合する条件下で、該オリゴヌクレオチド
    と該ＤＮＡとを合わせる工程；および
    ｉｖ．結合したオリゴヌクレオチドの存在または非存在を検出する工程であって、該結
    合したオリゴヌクレオチドの存在は、炭疽菌におけるフルオロキノリン耐性を表す、工
    程、
    を包含する、方法。
14. 請求項１３に記載の方法であって、前記オリゴヌクレオチドが、観察可能なマーカーを含む、方法。
15. 請求項１４に記載の方法であって、前記観察可能なマーカーが、蛍光性基または放射性基である、方法。
16. 炭疽菌におけるフルオロキノリン耐性を検出するための方法であって、
    ｉ．炭疽菌由来のＤＮＡサンプルを提供する工程；
    ｉｉ．請求項７に記載の１つ以上のプライマー対を提供する工程；
    ｉｉｉ．請求項９に記載の１つ以上のプライマーを提供する工程；ならびに
    ｉｖ．該プライマー対および該プライマーを用いて該ＤＮＡを増幅する工程；
    ｖ．該増幅工程の結果を、該プライマーを用いた公知のフルオロキノリン耐性炭疽菌の
    増幅の結果と比較する工程、
    を包含する、方法。
17. ＤＮＡの増幅により炭疽菌株におけるフルオロキノリン耐性の分子検出をするためのキットであって、該キットは、
    請求項１に記載の１つ以上のオリゴヌクレオチドプライマーであって、該オリゴヌクレオチドプライマーは、炭疽菌におけるフルオロキノリン耐性を示すことが可能である、オ
    リゴヌクレオチドプライマー、
    を含む、キット。
18. 請求項１７に記載のキットであって、ＰＣＲ機器中で、前記ＤＮＡの増幅を引き起こすために適切な、ｄＮＴＰ、ｔａｑポリメラーゼ、塩、および緩衝液をさらに含む、キット。
19. 請求項１８に記載のキットであって、前記ｄＮＴＰが、蛍光性基または放射性基で標識されている、キット。
20. ＤＮＡのアッセイにより炭疽菌におけるフルオロキノリン耐性の分子検出をするためのキットであって、該ＤＮＡは、フルオロキノリン耐性に特有であり、該キットが、請求項９に記載の１つ以上のプライマーを含む、キット。
21. 請求項２０に記載のキットであって、前記プライマーが、蛍光性基または放射性基で標識される、キット。
22. 請求項２１に記載のキットであって、前記プライマーへの前記ＤＮＡの結合を引き起こすために適切な、塩および緩衝液をさらに含む、キット。

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