JP2006501847A - 下垂体腫瘍形質転換遺伝子（ｐｔｔｇ）発現ベクターでトランスフェクションしたトランスジェニック細胞およびその使用 - Google Patents
下垂体腫瘍形質転換遺伝子（ｐｔｔｇ）発現ベクターでトランスフェクションしたトランスジェニック細胞およびその使用 Download PDFInfo
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Abstract
下垂体腫瘍形質転換遺伝子（ＰＴＴＧ）を含有する発現ベクターでトランスフェクションしたトランスジェニック細胞およびその使用を開示する。制御および発現配列を任意に与えられ、そして／または宿主細胞によって運ばれるベクターに、核酸を操作的に結合しうる。１つの態様において、宿主細胞は、機能ＰＴＴＧをコードするＤＮＡセグメントを含んで成る発現ベクターでトランスフェクションされた甲状腺刺激ホルモン（ＴＳＨ）感受性細胞であり、該細胞はＴＨＳに反応してＰＴＴＧを過剰発現する。哺乳動物細胞におけるＰＴＴＧによって仲介される遺伝的調節の研究用のインビトロ細胞モデルも開示し、該細胞モデルにおいて、ＴＳＨまたはエストロゲンへの細胞の曝露によって、ＰＴＴＧ発現を調節しうる。１つの態様において、ＮＩＳ発現におけるＰＴＴＧ発現の作用を研究するか、またはＮＩＳ発現を調節するために、細胞モデルを使用する。
Description
本発明は、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈによって付与された授与番号ＣＡ−７５９７９の下に、米国政府の助成を少なくとも部分的に受けてなされた。米国政府は、本発明において一定の権利を有しうる。
本出願は、２００１年５月１１日に出願された第０９／８５４３２６号の一部継続出願であり、その出願は２００１年２月５日出願された第０９／７７７４２２号の一部継続出願であり、その出願は２０００年１２月４日に出願された第０９／７３０４６９号の一部継続出願であり、その出願は２０００年１０月１３日に出願された第０９／６８７９１１号の一部継続出願であり、その出願は２０００年５月１２日に出願された米国特許出願第０９／５６９９５６号の一部継続出願であり、その出願は１９９９年７月２３日に出願された米国特許出願第０８／８９４２５１号の一部継続出願であり、その出願は２００２年９月２４日に米国特許第６４５５３０５ Ｂ１として公布され、そしてその出願は１９９７年１１月２１日に出願された第ＰＣＴ／ＵＳ９７／２１４６３号および１９９６年１１月２１日に出願された米国暫定特許出願第６０／０３１３３８号の出願日の優先権を主張する。
（発明の背景）
本明細書を通して、種々の発行物を括弧に記載する。本発明が関連している技術の現状をより詳しく記載するために、これらの発行物に開示の内容は全て参照として本明細書に組み入れられる。
本明細書を通して、種々の発行物を括弧に記載する。本発明が関連している技術の現状をより詳しく記載するために、これらの発行物に開示の内容は全て参照として本明細書に組み入れられる。
（１．発明の分野）
本発明は、生物医学分野、特に生物工学に関する。
本発明は、生物医学分野、特に生物工学に関する。
（２．関連技術の考察）
下垂体腫瘍−形質転換遺伝子（ＰＴＴＧ）は、ディファレンシャルディスプレイによって下垂体腫瘍増殖ホルモン分泌細胞から単離された、最近記載されたオンコジーンである（Ｐｅｉ，Ｌ．，ｅｔ ａｌ．，Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ ａｎｄ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ａ ｐｉｔｕｉｔａｒｙ ｔｕｍｏｒ−ｔｒａｎｓｆｏｒｍｉｎｇ ｇｅｎｅ（ＰＴＴＧ），Ｍｏｌ．Ｅｎｄｏ．１１：４３３−４４１［１９９７］）。ＰＴＴＧは、セクリン蛋白であると考えられ、Ｘｅｎｏｐｕｓセクリンとの４４．６％アミノ酸同一性を有する（Ｚｏｕ，Ｈ．，ｅｔ ａｌ．，Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ａ ｖｅｒｔｅｂｒａｔｅ ｓｉｓｔｅｒ−ｃｈｒｏｍａｔｉｄ ｓｅｐａｒａｔｉｏｎ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ ｉｎｖｏｌｖｅｄ ｉｎ ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ ａｎｄ ｔｕｍｏｒｉｇｅｎｅｓｉｓ，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２８５：４１８−４２２［１９９９］；Ｍｅｉ，Ｊ．，Ｈｕａｎｇ，Ｘ．，ａｎｄ Ｚｈａｎｇ，Ｐ．，Ｓｅｃｕｒｉｎ ｉｓ ｎｏｔ ｒｅｑｕｉｒｅｄ ｆｏｒ ｃｅｌｌｕｌａｒ ｖｉａｂｉｌｉｔｙ，ｂｕｔ ｉｓ ｒｅｑｕｉｒｅｄ ｆｏｒ ｎｏｒｍａｌ ｇｒｏｗｔｈ ｏｆ ｍｏｕｓｅ ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔｓ，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｂｉｏｌｏｇｙ １１：１１９７−１２０１［２００１］）。
下垂体腫瘍−形質転換遺伝子（ＰＴＴＧ）は、ディファレンシャルディスプレイによって下垂体腫瘍増殖ホルモン分泌細胞から単離された、最近記載されたオンコジーンである（Ｐｅｉ，Ｌ．，ｅｔ ａｌ．，Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ ａｎｄ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ａ ｐｉｔｕｉｔａｒｙ ｔｕｍｏｒ−ｔｒａｎｓｆｏｒｍｉｎｇ ｇｅｎｅ（ＰＴＴＧ），Ｍｏｌ．Ｅｎｄｏ．１１：４３３−４４１［１９９７］）。ＰＴＴＧは、セクリン蛋白であると考えられ、Ｘｅｎｏｐｕｓセクリンとの４４．６％アミノ酸同一性を有する（Ｚｏｕ，Ｈ．，ｅｔ ａｌ．，Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ａ ｖｅｒｔｅｂｒａｔｅ ｓｉｓｔｅｒ−ｃｈｒｏｍａｔｉｄ ｓｅｐａｒａｔｉｏｎ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ ｉｎｖｏｌｖｅｄ ｉｎ ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ ａｎｄ ｔｕｍｏｒｉｇｅｎｅｓｉｓ，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２８５：４１８−４２２［１９９９］；Ｍｅｉ，Ｊ．，Ｈｕａｎｇ，Ｘ．，ａｎｄ Ｚｈａｎｇ，Ｐ．，Ｓｅｃｕｒｉｎ ｉｓ ｎｏｔ ｒｅｑｕｉｒｅｄ ｆｏｒ ｃｅｌｌｕｌａｒ ｖｉａｂｉｌｉｔｙ，ｂｕｔ ｉｓ ｒｅｑｕｉｒｅｄ ｆｏｒ ｎｏｒｍａｌ ｇｒｏｗｔｈ ｏｆ ｍｏｕｓｅ ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔｓ，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｂｉｏｌｏｇｙ １１：１１９７−１２０１［２００１］）。
ＰＴＴＧは、ラット、マウスおよびヒト細胞において同定されている（ｅ．ｇ．，ＰＣＴ／ＵＳ９７／２１４６３；Ｗａｎｇ，Ｚ．，ｅｔ ａｌ．，Ｐｉｔｕｉｔａｒｙ ｔｕｍｏｒ ｔｒａｎｓｆｏｒｍｉｎｇ ｇｅｎｅ（ＰＴＴＧ）ｔｒａｎｓｆｏｒｍｉｎｇ ａｎｄ ｔｒａｎｓａｃｔｉｖａｔｉｏｎ ａｃｔｉｖｉｔｙ，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７５：７４５９−７４６１［２０００］）。ヒトＰＴＴＧファミリーは、少なくとも４つの相同遺伝子から成り、そのうちのＰＴＴＧ１は染色体５ｑ３３に存在している（Ｐｒｅｚａｎｔ，Ｔ．Ｒ．，ｅｔ ａｌ．，Ａｎ ｉｎｔｒｏｎｌｅｓｓ ｈｏｍｏｌｏｇ ｏｆ ｈｕｍａｎ ｐｒｏｔｏ−ｏｎｃｏｇｅｎｅ ｈＰＴＴＧ ｉｓ ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ ｉｎ ｐｉｔｕｉｔａｒｙ ｔｕｍｏｒｓ：ｅｖｉｄｅｎｃｅ ｆｏｒ ｈＰＴＴＧ ｆａｍｉｌｙ，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．Ｍｅｔａｂ．８４：１１４９−１１５２［１９９９］）。
ＰＴＴＧは、塩基性線維芽細胞増殖因子分泌を上方調節し（Ｚｈａｎｇ，Ｘ．ｅｔ ａｌ．，Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ，ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ，ａｎｄ ｆｕｎｃｔｉｏｎ ｏｆ ｈｕｍａｎ ｐｉｔｕｉｔａｒｙ ｔｕｍｏｒ−ｔｒａｎｓｆｏｒｍｉｎｇ ｇｅｎｅ（ＰＴＴＧ），Ｍｏｌ．Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．１３：１５６−６６［１９９９ａ］）、ＤＮＡ転写を転写促進することが示されている（Ｄｏｍｉｎｇｕｅｚ，Ａ．ｅｔ ａｌ．［１９９８］；Ｗａｎｇ，Ｚ．ｅｔ ａｌ．，Ｐｉｔｕｉｔａｒｙ ｔｕｍｏｒ ｔｒａｎｓｆｏｒｍｉｎｇ ｇｅｎｅ（ＰＴＴＧ）ｔｒａｎｓａｃｔｉｖａｔｉｎｇ ａｎｄ ｔｒａｎｓｆｏｒｍｉｎｇ ａｃｔｉｖｉｔｙ，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７５：７４５９−６１［２０００］）。
ヒトＰＴＴＧ１は、大部分の正常ヒト組織において低レベルで発現される（Ｃｈｅｎ，Ｌ．ｅｔ ａｌ．，Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｈｕｍａｎ ｐｉｔｕｉｔａｒｙ ｔｕｍｏｒ ｔｒａｎｓｆｏｒｍｉｎｇ ｇｅｎｅ（ｈＰＴＴＧ）ｆａｍｉｌｙ：ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ，ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ，ａｎｄ ｃｈｒｏｍｏｓｏｍａｌ ｌｏｃａｌｉｚａｔｉｏｎ，Ｇｅｎｅ．２４８：４１−５０［２０００］；Ｈｅａｎｅｙ，Ａ．Ｐ．ｅｔ ａｌ．［２０００］）。ＰＴＴＧは、正常精巣および胸腺においてのみ豊富である（Ｗａｎｇ，Ｚ．，ｅｔ ａｌ．，Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｍｕｒｉｎｅ ｐｉｔｕｉｔａｒｙ ｔｕｍｏｒ ｔｒａｎｓｆｏｒｍｉｎｇ ｇｅｎｅ（ＰＴＴＧ）ａｎｄ ｉｔｓ ｐｒｏｍｏｔｏｒ，Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ １４１：７６３−７７１［２０００］）。正常レベルで発現された場合、ＰＴＴＧはプロモータ転写活性を仲介する（Ｗａｎｇ，Ｚ．ｅｔ ａｌ．，Ｐｉｔｕｉｔａｒｙ ｔｕｍｏｒ ｔｒａｎｓｆｏｒｍｉｎｇ ｇｅｎｅ（ＰＴＴＧ）ｔｒａｎｓｆｏｒｍｉｎｇ ａｎｄ ｔｒａｎｓａｃｔｉｖａｔｉｏｎ ａｃｔｉｖｉｔｙ，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７５：７４５９−７４６１［２０００］）。染色分体分離の調節異常によって、ＰＴＴＧ過剰発現が、異数性、即ち、正常染色体数より１個または数個多いかまたは少ない染色体を有する細胞、をも生じさせる（Ｚｏｕ ｅｔ ａｌ．［１９９９］；Ｙｕ，Ｒ．，ｅｔ ａｌ．，Ｐｉｔｕｉｔａｒｙ ｔｕｍｏｒ ｔｒａｎｓｆｏｒｍｉｎｇ ｇｅｎｅ（ＰＴＴＧ）ｒｅｇｕｌａｔｅｓ ｐｌａｃｅｎｔａｌ ＪＥＧ−３ ｃｅｌｌ ｄｉｖｉｓｉｏｎ ａｎｄ ｓｕｒｖｉｖａｌ：ｅｖｉｄｅｎｃｅ ｆｒｏｍ ｌｉｖｅ ｃｅｌｌ ｉｍａｇｉｎｇ，Ｍｏｌ．Ｅｎｄｏ．１４：１１３７−１１４６［２０００］）。分裂中期の終わりに、セクリンが後期促進複合体によって分解し、セパリンの硬直阻害（ｔｏｎｉｃ ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ）を解放し、これが次に、娘染色分体を結合するタンパク質コヘシンの分解を仲介する。非分解性ＰＴＴＧの過剰発現は、娘染色分体の分離を阻害し（Ｚｏｕ ｅｔ ａｌ．［１９９９］）、ＰＴＴＧの過剰発現は、アポトーシスを生じ、有糸分裂を阻害する（Ｙｕ，Ｒ．ｅｔ ａｌ．［２０００］）。ＰＴＴＧのセクリン機能は、ＰＴＴＧが正常増殖細胞においても発現しうることを示している。成人において、ＰＴＴＧ１ ｍＲＮＡは、急速増殖生殖体を含有する器官である精巣において最も豊富である（Ｚｈａｎｇ，Ｘ．ｅｔ ａｌ．（１９９９ａ）；Ｗａｎｇ，Ｚ ｅｔ ａｌ．（２０００））。
これに対して、ＰＴＴＧ１は、ヒト腫瘍において多く発現され、エストロゲン導入に反応性である（Ｚｈａｎｇ，Ｘ．ｅｔ ａｌ．，Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ，ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ，ａｎｄ ｆｕｎｃｔｉｏｎ ｏｆ ｈｕｍａｎ ｐｉｔｕｉｔａｒｙ ｔｕｍｏｒ−ｔｒａｎｓｆｏｒｍｉｎｇ ｇｅｎｅ（ＰＴＴＧ），Ｍｏｌ．Ｅｎｄｏ．１３：１５６−１６６［１９９９ａ］；Ｈｅａｎｅｙ，Ａ．Ｐ．，ｅｔ ａｌ．，Ｅａｒｌｙ ｉｎｖｏｌｖｅｍｅｎｔ ｏｆ ｅｓｔｒｏｇｅｎ−ｉｎｄｕｃｅｄ ｐｉｔｕｉｔａｒｙ ｔｕｍｏｒ ｔｒａｎｓｆｏｒｍｉｎｇ ｇｅｎｅ ａｎｄ ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｉｎ ｐｒｏｌａｃｔｉｎｏｍａ ｐａｔｈｏｇｅｎｅｓｉｓ，Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｄ．５：１３１７−１３２１［１９９９］）。実際に、ＰＴＴＧは下垂体腫瘍ならびに造血系および結腸からの新生物において多く発現され、ＮＩＨ３Ｔ３細胞におけるＰＴＴＧ過剰発現が細胞形質転換および生体内腫瘍形成を誘発するので、ＰＴＴＧはプロトオンコジーンであると考えられる（Ｐｅｉ，Ｌ．，ｅｔ ａｌ．，Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ ａｎｄ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ａ ｐｉｔｕｉｔａｒｙ ｔｕｍｏｒ−ｔｒａｎｓｆｏｒｍｉｎｇ ｇｅｎｅ（ＰＴＴＧ），Ｍｏｌ．Ｅｎｄｏ．１１：４３３−４４１［１９９７］；Ｚｈａｎｇ，Ｘ．ｅｔ ａｌ．［１９９９ａ］； Ｚｈａｎｇ，Ｘ．ｅｔ ａｌ．Ｐｉｔｕｉｔａｒｙ ｔｕｍｏｒ ｔｒａｎｓｆｏｒｍｉｎｇ ｇｅｎｅ（ＰＴＴＧ） ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｉｎ ｐｉｔｕｉｔａｒｙ ａｄｅｎｏｍａｓ，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．Ｍｅｔａｂ．８４：７６１−６７［１９９９ｂ］；Ｈｅａｎｅｙ，Ａ．Ｐ．ｅｔ ａｌ．，Ｐｉｔｕｉｔａｒｙ ｔｕｍｏｒ ｔｒａｎｓｏｒｍｉｎｇ ｇｅｎ ｉｎ ｃｏｌｏｒｅｃｔａｌ ｔｕｍｏｒｓ，Ｌａｎｃｅｔ ３５５：７１２−１５［２０００］；Ｄｏｍｉｎｇｕｅｚ，Ａ．ｅｔ ａｌ．，ｈＰＴＴＧ，ａ ｈｕｍａｎ ｈｏｍｏｌｏｇｕｅ ｏｆ ｒａｔ ｐｔｔｇ，ｉｓ ｏｖｅｒｅｘｐｒｅｓｓｅｄ ｉｎ ｈｅｍａｔｏｐｏｉｅｔｉｃ ｎｅｏｐｌａｓｍｓ．Ｅｖｉｄｅｎｃｅ ｆｏｒ ａ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌ ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ ｆｕｎｃｔｉｏｎ ｏｆ ｈＰＴＴＧ，Ｏｎｃｏｇｅｎｅ １７：２１８７−９３［１９９８］；Ｓａｅｚ，Ｃ．ｅｔ ａｌ．，ｈＰＴＴＧ ｉｓ ｏｖｅｒ−ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ ｉｎ ｐｉｔｕｉｔａｒｙ ａｄｅｎｏｍａｓ ａｎｄ ｏｔｈｅｒ ｐｒｉｍａｒｙ ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ ｎｅｏｐｌａｓｉａｓ，Ｏｎｃｏｇｅｎｅ １８：５４７３−６［１９９９］）。それに加えて、ラットＦＲＴＬ５甲状腺細胞およびヒト甲状腺培養細胞におけるＰＴＴＧ１過剰発現は、インビトロでの形質転換を生じ、脱分化新生物表現型を生じることが最近観察された（Ｈｅａｎｅｙ，ｅｔ ａｌ．，Ｔｒａｎｓｆｏｒｍｉｎｇ ｅｖｅｎｔｓ ｉｎ ｔｈｙｒｏｉｄ ｔｕｍｏｒｉｇｅｎｅｓｉｓ ａｎｄ ｔｈｅｉｒ ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ ｗｉｔｈ ｆｏｌｌｉｃｕｌａｒ ｌｅｓｉｏｎｓ，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．Ｍｅｔａｂ．８６（１０）：５０２５−５０３２［２００１］）。
ヒトＰＴＴＧ１との高配列相同性を有しているヒトＰＴＴＧ遺伝子２の最近の発見は、ＰＴＴＧ遺伝子ファミリーの存在を意味している（Ｐｒｅｚａｎｔ，Ｔ．Ｒ．，ｅｔ ａｌ．，Ａｎ ｉｎｔｒｏｎｌｅｓｓ ｈｏｍｏｌｏｇ ｏｆ ｈｕｍａｎ ｐｒｏｔｏ−ｏｎｃｏｇｅｎｅ ｈＰＴＴＧ ｉｓ ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ ｉｎ ｐｉｔｕｉｔａｒｙ ｔｕｍｏｒｓ：ｅｖｉｄｅｎｃｅ ｆｏｒ ｈＰＴＴＧ ｆａｍｉｌｙ，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．Ｍｅｔａｂ．８４：１１４９−１１５２［１９９９］）。ネズミＰＴＴＧは、ヒトＰＴＴＧ１との６６％ヌクレオチド塩基配列相同性を有し、形質転換能力をも示す（Ｗｈａｎｇ，Ｚ．ａｎｄ Ｍｅｌｍｅｄ，Ｓ．，Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｍｕｒｉｎｅ ｐｉｔｕｉｔａｒｙ ｔｕｍｏｒ ｔｒａｎｓｆｏｒｍｉｎｇ ｇｏｎｅ（ＰＴＴＧ）ａｎｄ ｉｔｓ ｐｒｏｍｏｔｅｒ，Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ［Ｉｎ Ｐｒｅｓｓ；２０００］）。点変異をプロリンリッチ領域に導入した際の、インビトロ形質転換、生体内腫瘍形成、および転写促進における阻害作用によって示されるように、プロリンリッチ領域が、ＰＴＴＧ１の形質転換活性に重要なタンパク質Ｃ−末端の近くに確認された（Ｚｈａｎｇ，Ｘ．ｅｔ ａｌ．［１９９９ａ］）。プロリンリッチドメインは、タンパク質−チロシンキナーゼのシグナルトランスダクションを仲介するＳＨ３結合部位として機能しうる（Ｐａｗｓｏｎ，Ｔ．，Ｐｒｏｔｅｉｎ ｍｏｄｕｌｅｓ ａｎｄ ｓｉｇｎａｌｉｎｇ ｎｅｔｗｏｒｋｓ，Ｎａｔｕｒｅ ３７３：５７３−５８０［１９９５］；Ｋｕｒｉｙａｎ，Ｊ．，ａｎｄ Ｃｏｗｂｕｒｎ，Ｄ．，Ｍｏｄｕｌａｒ ｐｅｐｔｉｄｅ ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ ｄｏｍａｉｎｓ ｉｎ ｅｕｋａｒｙｏｔｉｃ ｓｉｇｎａｌｉｎｇ，Ａｎｎｕ，Ｒｅｖ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｂｉｏｍｏｌ．Ｓｔｒｕｃｔ．２６：２５９−２８８［１９９７］）。
ＰＴＴＧの形質転換活性は、下垂体および甲状腺を含む種々の組織および器官の腫瘍形成におけるその役割の研究に、大きな関心を集めている。さらに、性ステロイド発現と腫瘍形成との相関も大きな関心を集めている。一般に、両性および悪性腫瘍の初期に検出されるｒａｓ変異、ＴＳＨ受容体の活性化、およびＧｓα−サブユニット変異を包含する甲状腺腫瘍形成において生じる種々の明確な分子事象（Ｆｅｒｉｄ，Ｎ．Ｒ．，ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｂａｓｉｓ ｏｆ ｔｈｙｒｏｉｄ ｃａｎｃｅｒ，Ｅｎｄｏｃｒ．Ｒｅｖ．１５：２０２−２３２［１９９４］）が、いくつかの濾胞癌腫において報告されている（Ｓｕｒｅｚ Ｈ．Ｇ．，ｅｔ ａｌ．，ｇｓｐ ｍｕｔａｔｉｏｎｓ ｉｎ ｈｕｍａｎ ｔｈｙｒｏｉｄ ｔｕｍｏｒｓ，Ｏｎｃｏｇｅｎｅ ６：６７７−６７９［１９９１］）。
ＴＳＨは重要な甲状腺成長因子であり、ＴＳＨおよび性ステロイドによる甲状腺細胞増殖の共同的調節は、動物試験および疫学的分析によって支持されている（Ｃｌａｒｋ，Ｏ．Ｈ．，ｅｔ ａｌ．，Ｅｓｔｒｏｇｅｎ ａｎｄ ｔｈｙｒｏｉｄ−ｓｔｉｍｕｌａｔｉｎｇ ｈｏｒｍｏｎｅ（ＴＳＨ）ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ ｉｎ ｎｅｏｐｌａｓｔｉｃ ａｎｄ ｎｏｎｎｅｏｐｌａｓｔｉｃ ｈｕｍａｎ ｔｈｙｒｏｉｄ ｔｉｓｓｕｅｓ，Ｊ．Ｓｕｒｇ．Ｒｅｓ．３８：８９−９６［１９８５］；Ｍｏｒｉ Ｍ，ｅｔ ａｌ．，Ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ ｓｅｘ ｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅ，ｇｏｎａｄｅｃｔｏｍｙ， ａｎｄ ｅｓｔｒｏｇｅｎ ｏｎ Ｎ−ｍｅｔｈｙｌ−Ｎ−ｎｉｔｒｏｓｏｕｒｅａ ｉｎｄｕｃｅｄ ｒａｔ ｔｈｙｒｏｉｄ ｔｕｍｏｒｓ，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ ５０（２３）：７６６２−７［１９９０］）。
さらに、下垂体細胞におけるＰＴＴＧ発現の誘発に加えて、エストロゲン投与が、雌ラットの下垂体および甲状腺における平均血清ＴＳＨレベルを増加させることも報告されている（Ｍｏｒｉ Ｍ，ｅｔ ａｌ．，Ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ ｓｅｘ ｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅ，ｇｏｎａｄｅｃｔｏｍｙ，ａｎｄ ｅｓｔｒｏｇｅｎ ｏｎ Ｎ−ｍｅｔｈｙｌ−Ｎ−ｎｉｔｒｏｓｏｕｒｅａ ｉｎｄｕｃｅｄ ｒａｔ ｔｈｙｒｏｉｄ ｔｕｍｏｒｓ，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ ５０（２３）：７６６２−７［１９９０］）。この研究は、甲状腺細胞増殖における性ステロイドとＴＳＨとの複雑な相互作用も示しており、該研究において、雄および雌ラットの両方が、ＴＳＨ刺激の存在下の放射線誘発甲状腺腫瘍に罹患しやすく、一方、卵巣摘出または去勢は甲状腺腫瘍の発生を減少させた。ＴＳＨとＰＴＴＧとの複雑な相互作用も示された。即ち、最近の研究において、ラットＦＲＴＬ５細胞または一次ヒト甲状腺細胞のＴＳＨ処理が、インビトロでのＰＴＴＧ発現を誘発し、ラットへのエストロゲン投与が、ラット甲状腺ＰＴＴＧ発現を誘発することが観察された（Ｈｅａｎｅｙ，ｅｔ ａｌ．，Ｔｒａｎｓｆｏｒｍｉｎｇ ｅｖｅｎｔｓ ｉｎ ｔｈｙｒｏｉｄ ｔｕｍｏｒｉｇｅｎｅｓｉｓ ａｎｄ ｔｈｅｉｒ ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ ｗｉｔｈ ｆｏｌｌｉｃｕｌａｒ ｌｅｓｉｏｎｓ，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．Ｍｅｔａｂ．８６（１０）：５０２５−５０３２［２００１］）。
種々の癌の原因についての研究に関心が集まると共に、種々の治療法の開発が行なわれている。例えば、沃素が甲状腺細胞増殖を阻害することが示されており、その取込みは、甲状腺小胞細胞またはＦＲＴＬ５細胞におけるナトリウム／ヨウ化物シンポータ（ＮＩＳ）によって促進されると考えられる。さらに、沃素の放射性同位体、例えば１２５Ｉおよび１３１Ｉは、高ＮＩＳ遺伝子発現を有する腫瘍細胞を標的するのに使用されている。
ＴＳＨは、用量依存的にヨウ化物取込みを増加させうることも既知であり、この作用はＮＩＳ遺伝子発現の急速な増加と相互に関係している。エストラジオールは、ＴＳＨ−誘発ナトリウム／ヨウ化物シンポータ（ＮＩＳ）発現を遮断することが示されており、エストラジオールとエストロゲン受容体拮抗物質とを併用した細胞の処理は、ＴＳＨ誘発ＮＩＳ発現を正常レベルに回復させた（Ｆｕｒｌａｎｅｔｔｏ，Ｔ．Ｗ．，ｅｔ ａｌ．，Ｅｓｔｒａｄｉｏｌ Ｉｎｃｒｅａｓｅｓ Ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ ａｎｄ Ｄｏｗｎ−Ｒｅｇｕｌａｔｅｓ ｔｈｅ Ｓｏｄｉｕｍ／Ｉｏｄｉｄｅ Ｓｙｍｐｏｒｔｅｒ Ｇｅｎｅ ｉｎ ＦＲＴＬ−５ Ｃｅｌｌｓ１，Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ １４０（１２）：５７０５−５７１１［１９９９］；Ｆｕｒｌａｎｅｔｔｏ，Ｔ．Ｗ．，ｅｔ ａｌ．，Ｅｓｔｒａｄｉｏｌ ｄｅｃｒｅａｓｅｓ ｉｏｄｉｄｅ ｕｐｔａｋｅ ｂｙ ｒａｔ ｔｈｙｒｏｉｄ ｆｏｌｌｉｃｕｌａｒ ＦＲＴＬ−５ ｃｅｌｌｓ，Ｂｒａｚ Ｊ Ｍｅｄ Ｂｉｏｌ Ｒｅｓ ３４（２）２５９−２６３［２００１］）。これに対して、最近の研究は、インビトロ正常ヒト甲状腺細胞およびラットＦＲＴＬ５細胞における野生型ＰＴＴＧ１の過剰発現が、対照と比較して減少した１２５Ｉ取込みを示したことを報告している（Ｈｅａｎｅｙ，ｅｔ ａｌ．，Ｔｒａｎｓｆｏｒｍｉｎｇ ｅｖｅｎｔｓ ｉｎ ｔｈｙｒｏｉｄ ｔｕｍｏｒｉｇｅｎｅｓｉｓ ａｎｄ ｔｈｅｉｒ ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ ｗｉｔｈ ｆｏｌｌｉｃｕｌａｒ ｌｅｓｉｏｎｓ，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．Ｍｅｔａｂ．８６（１０）：５０２５−５０３２［２００１］）。
これまで、種々の程度のＰＴＴＧ発現の結果を研究するための適切な細胞モデルの開発は限られていた。従って、遺伝子生成物の中でも特にＰＴＴＧの発現を調節でき、得られる結果を研究しうる細胞モデルが当分野において必要とされている。
（発明の要旨）
本発明は、機能ＰＴＴＧペプチドをコードするＤＮＡセグメントを含んで成る発現ベクターでトランスフェクションした甲状腺刺激ホルモン（ＴＳＨ）感受性細胞であって、ＴＳＨに反応してＰＴＴＧを過剰発現する細胞を提供する。本発明の甲状腺刺激ホルモン（ＴＳＨ）感受性細胞は、配列番号２、配列番号４または配列番号５のアミノ酸配列を有する機能ＰＴＴＧペプチドをコードするか、または配列番号２、配列番号４または配列番号５の機能ペプチドフラグメント（該フラグメントはプロリンリッチ領域を含む）をコードする、ポリヌクレオチド配列を有するＤＮＡセグメントを含有する発現ベクターによって、トランスフェクションされ、該細胞はＴＳＨに反応して機能ＰＴＴＧを過剰発現する。
本発明は、機能ＰＴＴＧペプチドをコードするＤＮＡセグメントを含んで成る発現ベクターでトランスフェクションした甲状腺刺激ホルモン（ＴＳＨ）感受性細胞であって、ＴＳＨに反応してＰＴＴＧを過剰発現する細胞を提供する。本発明の甲状腺刺激ホルモン（ＴＳＨ）感受性細胞は、配列番号２、配列番号４または配列番号５のアミノ酸配列を有する機能ＰＴＴＧペプチドをコードするか、または配列番号２、配列番号４または配列番号５の機能ペプチドフラグメント（該フラグメントはプロリンリッチ領域を含む）をコードする、ポリヌクレオチド配列を有するＤＮＡセグメントを含有する発現ベクターによって、トランスフェクションされ、該細胞はＴＳＨに反応して機能ＰＴＴＧを過剰発現する。
本発明は、哺乳動物細胞においてＰＴＴＧによって仲介される遺伝子調節の研究用のインビトロ細胞モデルであって、本発明の甲状腺刺激ホルモン（ＴＳＨ）感受性細胞を含んで成る細胞モデルも提供する。その細胞をＴＳＨに曝露することによって、発現ベクターからのＰＴＴＧの発現が誘発される。
本発明の細胞モデルは、ＮＩＳにおけるＰＴＴＧ発現およびチログロブリン発現の作用の研究に有用である。本発明の細胞モデルを使用して、ＮＩＳ、サイログロプリンおよびＰＴＴＧ発現を調節して生理学的および／または分子生物学的作用を研究することができる。例えば、本発明の細胞モデルを使用して、甲状腺またはＦＲＴＬ５細胞におけるヨウ化物取込み（例えば、一般に１２５Ｉ−または１３１Ｉ−ＮａＩで検出される）における、ＰＴＴＧ発現の作用を研究することができる。さらに、本発明の細胞モデルは、ＰＴＴＧ異常発現、ＰＴＴＧ過剰発現、およびＰＴＴＧ過小発現の生理学的および分子生物学的作用の研究にも有用である。
２００１年５月１１日に出願された米国特許出願第０９／８５４３２６号；２００１年２月５日に出願された米国特許出願第０９／７７７４２２号；２０００年１２月４日に出願された米国特許出願第０９／７３０４６９号；２０００年１０月１３日に出願された米国特許出願第０９／６８７９１１号；２０００年５月１２日に出願された米国特許出願第０９／５６９９５６号；１９９９年７月２３日に出願された米国特許出願第０８／８９４２５１号（この出願は２００２年９月２４日に米国特許第６４５５３０５ Ｂ１号として公布された）；および１９９７年１１月２１日に出願されたＰＣＴ／ＵＳ９７／２１４６３号（これらの出願は全て、全体として、参照として本明細書に組み入れられる）の開示によって、および本明細書に含まれている図面および好ましい態様の詳細な説明によって、本発明をさらに詳しく説明する。
（本発明の好ましい態様の説明）
本発明によれば、機能ＰＴＴＧをコードするＤＮＡセグメントを含んで成る発現ベクターでトランスフェクションした甲状腺刺激ホルモン（ＴＳＨ）感受性細胞、および哺乳動物細胞におけるＰＴＴＧによって仲介される遺伝子調節の研究用のインビトロ細胞モデルを提供する。
本発明によれば、機能ＰＴＴＧをコードするＤＮＡセグメントを含んで成る発現ベクターでトランスフェクションした甲状腺刺激ホルモン（ＴＳＨ）感受性細胞、および哺乳動物細胞におけるＰＴＴＧによって仲介される遺伝子調節の研究用のインビトロ細胞モデルを提供する。
本明細書において使用される「ＰＴＴＧ」という用語は、組織培養における細胞（例えば、ＮＩＨ ３Ｔ３細胞等）を形質転換しうる単離したおよび／または実質的に純粋なタンパク質の哺乳動物ファミリー、例えばヒト（即ち、ｈＰＴＴＧ１）を意味し、ＰＴＴＧの自然発生対立遺伝子変異体および人工誘発変異によって生じた変異体を包含する。本明細書に記載するＰＴＴＧタンパク質は、一次転写体の選択的スプライシングによって産生された ｍＲＮＡによってコードされたその自然発生対立遺伝子変異体を包含し、さらに、少なくとも１つの天然生物学的活性、例えば免疫原性を保有しているフラグメントも包含する。
本明細書に記載する機能ＰＴＴＧペプチドは、ＰＴＴＧタンパク質を特異的に認識するかまたは結合する抗ＰＴＴＧ抗体によって特異的に認識されるポリペプチドであり、配列番号２、配列番号４および配列番号５に示される配列、および約５〜約１５０、約５〜約５０、約２５〜約１００、および約５０〜約７５のアミノ酸の長さの、プロリンリッチ領域を含むそれらのいずれかのフラグメントを有する。
ＰＴＴＧは、精巣において検出される低レベルの発現と共に、下垂体腫瘍細胞において主に発現されることをさらに特徴とする。下垂体腫瘍細胞における転写体は、ノザンブロットアッセイによって観測されるように、約１．３ｋｂのサイズであり、精巣における転写体は約１ｋｂである。従って、タンパク質のＰＴＴＧファミリーをコードするスプライス変異ｃＤＮＡ転写体は、本発明によって明らかに推測される。
本発明によれば、機能ＰＴＴＧペプチドは、ＰＸＸＰモチーフ［プロリン（Ｐ）残基の間のＸは、プロリンを包含する任意のアミノ酸残基を表す］を有するペプチドセグメントである少なくとも１つのプロリンリッチ領域を含有する。ＰＴＴＧペプチドのプロリンリッチ領域は、潜在的ＳＨ３結合部位である。例えば、ヒトＰＴＴＧ１において、プロリンリッチ領域は、配列番号４のアミノ酸残基１６３〜１６７および１７０〜１７３に見出される。同様に、ラットＰＴＴＧにおいて、配列番号２のアミノ酸残基１６０〜１６３、１６７〜１７０、および１７７〜１８０において３つのプロリンリッチ領域が存在する。マウスＰＴＴＧペプチドは、配列番号５のアミノ酸残基１５７〜１６０においてプロリンリッチ領域を有する。
甲状腺刺激ホルモン（ＴＳＨ）は、視床下部からの信号に反応して下垂体によって産生されるホルモンである。その名が示すように、ＴＳＨは、頚部における甲状腺の成長を促進し、それを刺激して、より多くの甲状腺ホルモンを産生する。チロトロピンとしても知られるＴＳＨは、１１２アミノ酸のβ鎖および８９アミノ酸のα鎖から成る糖タンパク質である。ＴＳＨは、甲状腺の細胞における膜結合ＴＳＨ受容体（ＴＳＨ−Ｒ）に結合する。この受容体はＴＳＨに特異性であるだけでなく、グレーヴス病の患者において産生されるＴＳＨ−Ｒ抗体にも特異的である。ＴＳＨ−Ｒは膜内外蛋白であり、Ｇ蛋白結合シグナル形質導入経路を使用する。
本明細書に使用される「ＴＳＨ感受性細胞」とは、少なくとも１つの膜結合ＴＳＨ受容体を含有するか、そうでなければ、ＴＳＨへの曝露によって誘発されてその細胞において１つまたはそれ以上の遺伝子の転写を開始する細胞である。
目的とするベクターの標的細胞への挿入（「トランスフェクション」とも言う）は、当分野で既知の種々の方法、例えば、電気穿孔法、微粒子衝撃、顕微注入、ウイルス導入、および燐酸カルシウム処理（前記Ｌｏｖｅｌｌ−Ｂａｄｇｅ、Ｒｏｂｅｒｔｓｏｎ編参照）を使用して行なうことができる。他の有用な生体内挿入法は、電気穿孔法である。
ＰＴＴＧ遺伝子が環状ベクターに予め挿入されている場合は、細胞にトランスフェクションされるＰＴＴＧ含有ベクターを先ず線状化することができる。ベクター配列内だけを切断し、挿入されたＰＴＴＧ配列内を切断しないように選択された好適な制限エンドヌクレアーゼを使用してＤＮＡを加水分解することによって、線状化を行なうことができる。
好適な発現ベクターは、当分野でよく知られており、ＤＮＡの発現を調節しうるプロモータ領域のような調節塩基配列に操作的に結合させたＤＮＡを発現しうるベクターを包含する。従って、発現ベクターは、適切な宿主細胞に導入した際に、挿入されたＤＮＡの発現を生じるプラスミド、ファージ、組換えウイルスまたは他のベクターのような組換えＤＮＡまたはＲＮＡ構造物を意味する。適切な発現ベクターは当業者によく知られており、真核細胞および／または原核細胞において複製可能な発現ベクター、およびエピソーム性を維持する発現ベクターまたは宿主細胞ゲノムに組み込まれる発現ベクターを包含する。さらに、ベクターは、多くのウイルスビリオン、例えば、レトロウイルス、ヘルペスウイルス、アデノウイルスでベクターが充填されるようにしうる適切な充填シグナルを含有してよく、それによって「ウイルスベクター」が形成される。
細胞を電気穿孔する場合、電気穿孔機を使用し、製造会社の使用指針に従って、細胞およびベクターＤＮＡを電気パルスに曝露する。電気穿孔した後、一般に、細胞を好適な培養条件下に回復させる。次に、細胞を、目的とするベクターの存在についてスクリーニングする。
トランスフェクションされた細胞のスクリーニングは、種々の方法を使用して行なうことができるが、一般に、ベクターの選択可能マーカー配列部分の存在についてスクリーニングする。選択可能マーカー配列が抗生物質耐性遺伝子である場合、細胞を、それ以外に対しては致死濃度の抗生物質の存在下に培養することができる。生き残っている細胞は、目的とするベクターを組み込んでいると考えられる。選択可能マーカー配列が抗生物質耐性遺伝子でない場合、マーカー配列だけにハイブリダイズするように設計したＤＮＡ配列を使用して、細胞ゲノムＤＮＡのサザンブロットを探査することができる。選択可能マーカー配列が、その活性を検出しうる酵素（例えば、β−ガラクトシダーゼ）をコードする遺伝子である場合、好適な条件下に酵素基質を細胞に添加して、選択可能マーカー配列の酵素活性を分析することができる。
ＤＮＡ、ＲＮＡ、ポリペプチドまたはタンパク質の修飾語としての、本発明の明細書および特許請求の範囲における「単離した」および／または「精製した」という用語の使用は、そのように称されるＤＮＡ、ＲＮＡ、ポリペプチドまたはタンパク質が、人の手によってそのような形態に作製され、従って、生体内細胞環境においてそれらの天然物質から分離されることを意味する。このような人の介入の結果として、本発明の組換えＤＮＡ、ＲＮＡ、ポリペプチドおよびタンパク質は、自然発生のＤＮＡ、ＲＮＡ、ポリペプチドまたはタンパク質が有効でない本明細書に記載されている事象において有用である。
本明細書に使用される「哺乳動物」または「哺乳動物の」という用語は、哺乳網に属する温血脊椎動物を意味し、毛を有し、授乳する全ての動物、例えば、人、ラット、マウス、ウサギ、サル、ヒヒ、ウシ、ブタ、ヒツジ、イヌ、ネコ等である。本明細書に使用される「哺乳動物細胞」は、インビトロまたは生体内全動物における、体細胞または生殖細胞系を意味する。そのような細胞は、誘導、採取、単離、選択、除去、抽出またはその他のあらゆる手段によって動物から得ることができる。
ＰＴＴＧは、下垂体腫瘍形成に関与している遺伝子である。ゲンバンクおよびタンパク質プロフィール分析の調査（ＢＬＡＳＴ Ｐｒｏｇｒａｍ ｓｅａｒｃｈ ｏｆ ｄａｔａｂａｓｅｓ ｏｆ ｔｈｅ ｎａｔｉｏｎａｌ ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ）は、ＰＴＴＧが既知の配列との相同性を有さず、そのコードされたタンパク質が高親水性であることを示した。
現在の好ましいＰＴＴＧタンパク質は、配列番号２、配列番号４または配列番号５のアミノ酸配列と実質的に同じアミノ酸配列、および前記の配列のフラグメント、ならびに生物学的に活性なそれらの修飾形態を有する。当業者は、得られる受容体種の生物学的活性を実質的に変化させずに、前記の配列の多くの残基を、他の化学的、立体的および／または電子的に類似した残基で置換しうることを認識している。さらに、配列番号２、配列番号４または配列番号５と実質的に同じ配列を含有するより大きいポリペプチド配列（例えば、スプライス変異体）も推測される。
本明細書に使用される「実質的に同じアミノ酸配列」という用語は、基準アミノ酸配列に対して少なくとも約７０％の同一性を有し、そして、基準アミノ酸配列によって規定されるタンパク質に比較しうる機能的および生物学的活性特性を保有しているアミノ酸配列を意味する。好ましくは、「実質的に同じアミノ酸配列」を有するタンパク質は、基準アミノ酸配列に対して少なくとも約８０％、より好ましくは９０％のアミノ酸同一性を有し、約９５％より大のアミノ酸配列同一性が特に好ましい。しかし、スプライス変異体として生じる前記レベル未満の配列同一性を有するか、または保存的（ｃｏｎｓｅｒｖａｔｉｖｅ）アミノ酸置換または縮重（ｄｅｇｅｎｅｒａｔｅ）コドンの置換によって修飾されたポリペプチド（または前記の核酸）も、本発明に含まれるものと理解される。
本発明の目的のために、「生物学的活性」または「機能性」という用語は、全長ＰＴＴＧタンパク質またはそのポリペプチドフラグメントの修飾語として本明細書に使用される場合、ＰＴＴＧに起因する機能特性の少なくとも１つを示すペプチドを意味する。例えば、ＰＴＴＧの１つの生物学的活性は、インビトロにおいて細胞（例えば、ＮＩＨ ３Ｔ３細胞等）を形質転換する能力である。ＰＴＴＧの他の機能または生物学的活性は、ヌードマウスにおいて腫瘍形成を誘発する能力である（例えば、ＮＩＨ ３Ｔ３細胞等にトランスフェクションした場合）。他の生物学的活性は、哺乳動物Ｔ−リンパ球の活性を調節する能力である。ＰＴＴＧの他の生物学的活性は、有糸分裂の際に核におけるセパリン活性を阻害する能力である。ＰＴＴＧのさらに他の機能または生物学的活性は、ＴＳＨまたはエストロゲンに反応してその発現が誘発されるかまたは刺激されることである。
本発明のペプチドを製造する方法の例は、好適な宿主細胞において既知の組換えＤＮＡ技術を使用し、例えば、細菌細胞、酵母細胞、両生類動物細胞（即ち、卵母細胞）、または哺乳動物細胞において当分野でよく知られている方法を使用して、ＰＴＴＧをコードする核酸を発現し、そして、これもまたよく知られている方法を使用して、発現されたポリペプチドを回収する方法である。本発明のＰＴＴＧポリペプチドは、本明細書に記載した発現ベクターで形質転換した細胞から直接単離しうる。本発明のポリペプチド、生物学的に活性なそのフラグメント、およびその機能等価物を、化学合成によって製造することもできる。例えば、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．Ｍｏｄｅｌ ４３０Ａまたは４３１Ａ自動ペプチド合成装置（Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ，ＣＡ）を使用して、製造会社によって提供される化学的作用によって、合成ポリペプチドを製造することができる。
本明細書に使用されている、発現または発現するとは、ポリ核酸をｍＲＮＡに転写し、ペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質に翻訳する過程を意味する。ポリ核酸がゲノムＤＮＡに由来する場合、適切な真核宿主細胞または有機体が選択されれば、発現はｍＲＮＡのスプライシングを含みうる。
ＰＴＴＧという用語は、そのポリペプチドフラグメントまたはポリペプチド類似体も包含する。「ポリペプチド類似体」という用語は、本明細書に特に示す配列と実質的に同じアミノ酸残基配列を有し、１つまたはそれ以上の残基が官能的に類似した残基で保存的に置換され、本明細書に記載のＰＴＴＧによく似た能力を示すあらゆるポリペプチドを包含する。保存的置換の例は、下記のような置換を包含する：イソロイシン、バリン、ロイシンまたはメチオニンのような１つの非極性（疎水性）残基の別のものに代わる置換；１つの極性（親水性）残基の別のものに代わる置換、例えば、アルギニンとリジン、グルタミンとアスパラギン、グリシンとセリンとの置換；リジン、アルギニンまたはヒスチジンのような１つの塩基性残基の別のものに代わる置換；または、アスパラギン酸またはグルタミン酸のような酸性残基の別のものに代わる置換。「保存的置換」という用語は、非誘導残基の代わりに化学的誘導残基を使用することも包含し、但し、そのようなポリペプチドが、必要とされる結合活性を示すことを条件とする。
「化学誘導体」は、官能性側基の反応によって化学的に誘導された１個またはそれ以上の置換基を有する本発明のポリペプチドを意味する。そのような誘導分子は、例えば、遊離アミノ基が誘導されて、塩酸アミン、ｐ−トルエンスルホニル基、カルボベンゾキシ基、ｔ−ブチルオキシカルボニル基、クロロアセチル基またはホルミル基を形成する分子を包含する。遊離カルボキシル基を誘導して、塩、メチルおよびエチルエステルまたは他のタイプのエステルまたはヒドラジドを形成しうる。遊離ヒドロキシル基を誘導して、Ｏ−アシルまたはＯ−アルキル誘導体を形成しうる。ヒスチジンのイミダゾール窒素を誘導して、Ｎ−ｉｍ−ベンジルヒスチジンを形成しうる。２０個の標準アミノ酸の１個またはそれ以上の天然アミノ酸誘導体を含有するポリペプチドも化学誘導体に包含される。例えば、４−ヒドロキシプロリンがプロリンに代わって置換されていてよく；５−ヒドロキシリジンがリジンに代わって置換されていてよく；３−メチルヒスチジンがヒスチジンに代わって置換されていてよく；ホモセリンがセリンに代わって置換されていてよく；オルニチンがリジンに代わって置換されていてよい。本発明のポリペプチドは、必要とされる活性を維持する限りは、本明細書にその配列を示したポリペプチドの配列に対して１個またはそれ以上の残基の付加および／または欠失を有するあらゆるポリペプチドも包含する。
「核酸」（ポリヌクレオチドとも称す）という用語は、リボ核酸（ＲＮＡ）またはデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）、プローブ、オリゴヌクレオチドおよびプライマーを包含する。ＤＮＡは、相補ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）またはゲノムＤＮＡ、例えばＰＴＴＧタンパク質をコードする遺伝子であってよい。ＰＴＴＧポリペプチドをコードする核酸を単離する１つの方法は、当分野でよく知られている方法を使用して、天然または人工的に設計したＤＮＡプローブを使用して、哺乳動物ゲノムライブラリーを探査する方法である。ＰＴＴＧ遺伝子に由来するＤＮＡプローブがこの目的に特に有用である。ＰＴＴＧポリペプチドをコードするＤＮＡおよびｃＤＮＡ分子を使用して、哺乳動物（例えば、ヒト、マウス、ラット、ウサギ、ブタ等）または他の動物源から相補ゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡまたはＲＮＡを得ることができ、または下記に詳しく説明する方法によって、ｃＤＮＡまたはゲノムライブラリーをスクリーニングすることによって関連ｃＤＮＡまたはゲノムクローンを単離することができる。核酸の例は、ＰＴＴＧポリペプチドをコードするＲＮＡ、ｃＤＮＡまたは単離ゲノムＤＮＡである。そのような核酸は、下記のものを包含するがそれらに限定されない：配列番号１、配列番号３または配列番号６、それらの対立遺伝子、好ましくは配列番号１（全長ラットＰＴＴＧの配列をコードする）の少なくともヌクレオチド２９３〜８８９、配列番号３（即ち、全長ヒトＰＴＴＧ１の配列をコードする）の少なくともヌクレオチド９５〜７００、または配列番号６（即ち、全長マウスＰＴＴＧの配列をコードする）の少なくともヌクレオチド３０４〜８９１、またはそれらのスプライス変異ｃＤＮＡ配列を含んで成る核酸。
本明細書に使用される「スプライス変異」または「選択的にスプライシングされた」という語句は、本発明の受容体をコードする特定のヌクレオチド配列を記載するために使用される場合、よく知られた真核細胞ＲＮＡスプライシング法から得られるｃＤＮＡ配列を意味する。ＲＮＡスプライシング法は、細胞形質の成熟ＲＮＡ分子を形成するための真核細胞一次ＲＮＡ転写体からのイントロンの除去およびエキソンの付着を含む。スプライス変異ヌクレオチド配列を単離する方法は、当分野でよく知られている。例えば、当業者は、配列番号１、配列番号３または配列番号６、その対立遺伝子、そのスプライス変異体、または約１０〜約１５０、約２５〜約７５、または約５０〜約１００ヌクレオチド長さのそのフラグメント、およびそれらのアンチセンス核酸のＰＴＴＧコードＤＮＡに由来するヌクレオチドプローブを使用して、本明細書に記載したのと同じかまたは他の種のｃＤＮＡまたはゲノムライブラリーをスクリーニングしうる。
本発明の１つの態様において、本発明のＰＴＴＧタンパク質をコードするＤＮＡは、配列番号１、配列番号３または配列番号６、その対立遺伝子、そのスプライス変異体、および約１５〜約１５０、約２５〜約７５、または約５０〜約１００ヌクレオチド長さのそのフラグメント、およびそのアンチセンス核酸を含んで成る。本発明の他の態様において、本発明のタンパク質をコードするＤＮＡ分子は、配列番号１のヌクレオチド２９３〜８８９、その対立遺伝子、そのスプライス変異体、および約１０〜約１５０、約２５〜約７５、または約５０〜約１００ヌクレオチド長さのそのフラグメントを含んで成る。さらに他の態様において、該ＤＮＡは、配列番号３のヌクレオチド９５〜７００、その対立遺伝子、そのスプライス変異体、および約１０〜約１５０、約２５〜約７５、または約５０〜約１００ヌクレオチド長さのそのフラグメントを含んで成る。さらに他の態様において、該ＤＮＡは、配列番号６、配列番号３のヌクレオチド３０４〜８９１、その対立遺伝子、そのスプライス変異体、および約１０〜約１５０、約２５〜約７５、または約５０〜約１００ヌクレオチド長さのそのフラグメントを含んで成る。
本明細書に使用される「実質的に同じヌクレオチド配列」という語句は、基準ポリヌクレオチドに対して充分な同一性を有するＤＮＡを意味し、従って、中等度厳密（ｍｏｄｅｒａｔｅｌｙ ｓｔｒｉｎｇｅｎｔ）ハイブリダイゼーション条件下に基準ヌクレオチドにハイブリダイズする。１つの態様において、基準ヌクレオチド配列と実質的に同じヌクレオチド配列を有するＤＮＡは、配列番号２、配列番号４、配列番号５と実質的に同じアミノ酸配列、または配列番号２、配列番号４または配列番号５を含むより大きいアミノ酸配列をコードする。他の態様において、基準ヌクレオチド配列と「実質的に同じヌクレオチド配列」を有するＤＮＡは、基準ヌクレオチド配列に対して少なくとも６０％の同一性を有する。基準ヌクレオチド配列に対して少なくとも７０％、より好ましくは少なくとも９０％、さらに好ましくは少なくとも９５％の同一性を有するＤＮＡが好ましい。
本発明は、配列番号１、配列番号３または配列番号６で示される核酸と異なるが、同じ表現型を有する核酸も包含する。表現型的に類似した核酸は、「機能的の等価の核酸」とも称される。本明細書において使用される「機能的に等価の核酸」という語句は、軽微および非−重大配列変異を特徴とし、本明細書に開示されている核酸と実質的に同じように機能して同じタンパク質生成物を生成する核酸を包含する。特に、機能的に等価の核酸は、本明細書に開示されるものと同じかまたは保存的アミノ酸変異を有するポリペプチド、または配列番号２、配列番号４または配列番号５を含むより大きいポリペプチドをコードする。例えば、保存的変異は、非極性残基の他の非極性残基での置換、または荷電残基の同様に荷電した残基での置換を包含する。これらの変異は、タンパク質の三次構造を実質的に変化させない変異として当業者に認識される変異を包含する。
ＰＴＴＧポリペプチドをコードする核酸は、遺伝暗号の縮重により、特定のハイブリダイゼーション条件下に、配列番号１、配列番号３および／または配列番号６に示される核酸に必ずしもハイブリダイズしない。本発明のＰＴＴＧポリペプチドをコードする好ましい核酸は、配列番号１、配列番号３、配列番号６、および約５〜約１５０、約５〜約５０、約２５〜７５、または約５０〜約１００アミノ酸長さのそのフラグメントをコードするヌクレオチドを含んで成る。本発明のＰＴＴＧタンパク質をコードする例示的核酸は、下記から選択しうる：
（ａ） 配列番号２、配列番号４または配列番号５に示されるアミノ酸配列をコードするＤＮＡ；
（ｂ） 中等度厳密条件下に（ａ）のＤＮＡにハイブリダイズするＤＮＡであって、生物学的に活性なＰＴＴＧをコードするＤＮＡ；または
（ｃ） 前記の（ａ）または（ｂ）に対して縮重したＤＮＡであって、生物学的に活性なＰＴＴＧをコードするＤＮＡ。
（ａ） 配列番号２、配列番号４または配列番号５に示されるアミノ酸配列をコードするＤＮＡ；
（ｂ） 中等度厳密条件下に（ａ）のＤＮＡにハイブリダイズするＤＮＡであって、生物学的に活性なＰＴＴＧをコードするＤＮＡ；または
（ｃ） 前記の（ａ）または（ｂ）に対して縮重したＤＮＡであって、生物学的に活性なＰＴＴＧをコードするＤＮＡ。
ハイブリダイゼーションとは、染色体ＤＮＡにおいて自然発生する結合に類似した水素結合による、核酸の相補鎖（即ち、センス：アンチセンス鎖またはプローブ：標的ＤＮＡ）の相互の結合を意味する。所定プローブを標的ＤＮＡにハイブリダイズするのに使用される厳密レベルは、当業者によって容易に変化させることができる。
「厳密ハイブリダイゼーション」という語句は、ポリ核酸ハイブリッドが安定である条件を意味する。当業者に既知であるように、ハイブリッドの安定性は、ハイブリッド融解温度（Ｔｍ）に反映される。一般に、ハイブリッドの安定性は、ナトリウムイオン濃度および温度と相関関係がある。一般に、ハイブリダイゼーション反応は、より低い厳密条件下に行なわれ、次に、変化した、より高い厳密条件での洗浄を行なう。ハイビリダイゼーション厳密条件は、そのような洗浄条件に関係している。
本明細書に使用される「中等度厳密ハイブリダイゼーション」という用語は、標的ＤＮＡに対して約６０％の同一性、好ましくは約７５％の同一性、より好ましくは約８５％の同一性を有する相補核酸に、標的ＤＮＡを結合させる条件を意味し、標的ＤＮＡに対して約９０％より大の同一性が特に好ましい。好ましくは、中等度厳密条件は、５０％ホルムアミド、５ｘＤｅｎｈａｒｔ溶液、５ｘＳＳＰＥ、０．２％ＳＤＳ、４２ＥＣにおけるハイブリダイゼーション、次に、０．２ｘＳＳＰＥ、０．２％ＳＤＳ、６５ＥＣにおける洗浄に相当する条件である。
「高厳密ハイブリダイゼーション」という用語は、０．０１８Ｍ ＮａＣｌ、６５ＥＣにおいて安定なハイブリッドを形成する核酸配列だけのハイブリダイゼーションを可能にする条件を意味する（即ち、ハイブリッドが０．０１８Ｍ ＮａＣｌ、６５ＥＣにおいて安定でなければ、本発明において意図する高厳密条件において安定でない）。高厳密条件は、例えば、５０％ホルムアミド、５ｘＤｅｎｈａｒｔ溶液、５ｘＳＳＰＥ、０．２％ＳＤＳ、４２ＥＣにおけるハイブリダイゼーション、次に、０．１ｘＳＳＰＥ、０．１％ＳＤＳ、６５ＥＣにおける洗浄によって得ることができる。
「低厳密ハイブリダイゼーション」という用語は、１０％ホルムアミド、５ｘＤｅｎｈａｒｔ溶液、６ｘＳＳＰＥ、０．２％ＳＤＳ、４２ＥＣにおけるハイブリダイゼーション、次に、１ｘＳＳＰＥ、０．２％ＳＤＳ、５０ＥＣにおける洗浄に相当する条件を意味する。Ｄｅｎｈａｒｔ溶液およびＳＳＰＥ（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，１９８９参照）は、他の好適なハイブリダイゼーション緩衝剤と同様に当業者によく知られている。
本明細書に使用されている「縮重」という用語は、少なくとも１個のヌクレオチドが、基準核酸、例えば、配列番号１、配列番号３または配列番号６と異なるが、基準核酸と同じアミノ酸をコードするコドンを意味する。例えば、トリプレット「ＵＣＵ」、「ＵＣＣ」、「ＵＣＡ」および「ＵＣＧ」によって特定されるコドンは、これらの４つの全てのコドンがアミノ酸セリンをコードするので、相互に縮重している。
本発明のポリペプチドをコードする好ましい核酸は、中等度厳密、好ましくは高厳密条件下に、配列番号１、配列番号３または配列番号６の、実質的に全配列、または実質的部分、即ち、一般に少なくとも１５〜３０ヌクレオチド（より長いフラグメントも予想される）にハイブリッドする。
変異ＰＴＴＧ ｃＤＮＡは、ＰＴＴＧ ｃＤＮＡのいずれかの領域の欠失および特定部位変異誘発を包含する当分野でよく知られている種々の方法によって製造できる。例えば、Ｐｆｕポリメラーゼおよび５％ＤＭＳＯを使用し、外部センスプライマーおよびアンチセンスプライマーを使用して、オーバーラップ伸長法ＰＣＲ（Ａ．Ａｉｙａｒら、Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．５７：１７７−９１［１９９６］）によって、変異を導入することができる。内部変異誘発プライマーを使用して、特定ヌクレオチドの欠失を生じさせることができる。次に、ゲル精製ＰＣＲ生成物および原テンプレートを、適切な制限エンドヌクレアーゼで切断することができ、得られたフラグメントを精製し、変異フラグメントを、トランスフェクションのためにベクターに再連結する。特定部位変異誘発のために、Ｔｒａｎｓｆｏｒｍｅｒ Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ Ｋｉｔ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈから入手可能）を使用して、種々のミスセンスおよび／またはナンセンス変異をＰＴＴＧ ｃＤＮＡに構成することができる。当業者は、特定部位変異誘発に好適な方法、例えばＤｅｎｇ ａｎｄ Ｎｉｃｋｏｌｏｆｆ法（Ｗ．Ｐ．ＤｅｎｇおよびＪ．Ａ．Ｎｉｃｋｏｌｏｆｆ，Ａｎａｌｙｔ，Ｂｉｏｃｈｅｍ．２００：８１−８８［１９９２］）を認識しており、商業的特定部位変異誘発キット、例えばＴｒａｎｓｆｏｒｍｅｒ（登録商標）特定部位変異誘発キット（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）が入手可能である。
本発明の核酸は、当分野でよく知られている種々の方法、例えば本明細書に記載の方法によって、配列番号１または配列番号３または配列番号６等の好適な領域からのオリゴヌクレオチドプライマーを用いるＰＣＲ増幅を使用して生成することができる。
本発明によれば、任意に標識したＰＴＴＧコードｃＤＮＡ、またはそのフラグメントを使用して、関連する新規哺乳動物ＰＴＴＧタンパク質をコードする付加的核酸配列について、ライブラリー（例えば、ｃＤＮＡ、ゲノム等）を探査することができる。哺乳動物ｃＤＮＡおよびゲノムライブラリー、好ましくはヒトライブラリーの構成は、当分野でよく知られている。そのようなｃＤＮＡまたはゲノムライブラリーのスクリーニングが約４２ＥＣ未満の温度、約５０％未満のホルムアミド濃度、および中等度〜低度の塩濃度を含む低厳密条件において初めに実施される。
プローブに基づくスクリーニング条件は、約３７℃の温度、約２０％のホルムアミド濃度、および約５ｘ標準サリンシトレート（ｓａｌｉｎｅ ｃｉｔｒａｔｅ）（ＳＳＣ；２０ｘＳＳＣは３Ｍ 塩化ナトリウム、０．３Ｍ クエン酸ナトリウムを含有、ｐＨ７．０）の塩濃度を含んで成ることができる。そのような条件は、完全な相同性を必要とせず、プローブ配列との実質程度の類似性を有する配列の同定を可能にする。「実質的類似性」という用語は、少なくとも５０％の相同性を有する配列を意味する。ある場合には、プローブとの少なくとも７０％の相同性を有する配列の同定を可能にし、プローブとのより低い程度の相同性を有する配列を区別するハイブリダイゼーション条件が選択される。その結果、本発明の核酸のコード領域と実質的に同じ、即ち類似した配列、好ましくは、配列番号１のヌクレオチド２９３〜８８９、配列番号３のヌクレオチド９５〜７００、または配列番号６の３０４〜８９１を有する核酸が得られる。
そのような核酸は、配列番号１、配列番号３または配列番号６、その対立遺伝子、好ましくは配列番号１の少なくともヌクレオチド２９３〜８８９、配列番号３の少なくともヌクレオチド９５〜７００、または配列番号６の少なくともヌクレオチド３０４〜８９１、またはそのスプライス変異ｃＤＮＡ配列を含んで成る核酸を包含するがそれらに限定されない。
本明細書に使用される核酸「プローブ」は、配列番号１、配列番号３または配列番号６のいずれかに示されるいずれか１４個またはそれ以上の連続した塩基と同じ（または相補的）である、少なくとも１４個、好ましくは少なくとも２０個、より好ましくは少なくとも５０個の連続した塩基を含有するヌクレオチドの配列を有する一本鎖ＤＮＡまたはＲＮＡまたはその類似体である。プローブを構成するのに好ましい領域は、配列番号１、配列番号３または配列番号６の５’および／または３’コード領域を包含する。さらに、本発明のＰＴＴＧタンパク質の全ｃＤＮＡコード領域、または配列番号１に対応する全配列を、プローブとして使用しうる。プローブは、下記に示すような当分野でよく知られている方法によって標識でき、種々の診断キットに使用しうる。
種々の文法形で本明細書に使用される「標識」および「指示手段」という用語は、検出可能なシグナルの産生に直接的または間接的に関与している単一原子および分子を意味する。あらゆる標識または指示手段を、本発明の核酸プローブ、発現タンパク質、ポリペプチドフラグメントまたは抗体分子に結合させることができる。これらの原子または分子は、単独で、または付加的試薬と共に、使用することができる。そのようなラベルはそれ自体、臨床診断化学においてよく知られている。
標識手段は、変性せずに抗体または抗原に化学的に結合して、有用な免疫蛍光トレーサーである蛍光色素（染料）を形成する蛍光標識剤であってよい。免疫蛍光分析法の説明は、参照として本明細書に組み入れられるＤｅＬｕｃａ、「Ｉｍｍｕｎｏｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ」、Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ａｓ ａ Ｔｏｏｌ，Ｍａｒｃｈａｌｏｎｉｓら編、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，Ｌｔｄ．，ｐ．１８９−２３１（１９８２）に見られる。
１つの態様において、指示基は、ホースラディッシュペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）、グルコースオキシダーゼ等のような酵素である。他の態様において、放射性元素を標識剤として使用する。基質への標識の結合、即ち、核酸プローブ、抗体、ポリペプチドおよびタンパク質の標識化は、当分野においてよく知られている。例えば、本発明の抗体を、培地において提供される放射性標識アミノ酸の代謝導入によって標識することができる。例えば、Ｇａｌｆｒｅら、Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．，７３：３−４６（１９８１）参照。活性化官能基によるタンパク質の接合または連結の従来法を特に適用しうる。例えば、Ａｕｒａｍｅａｓら、Ｓｃａｎｄ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，Ｖｏｌ．８，Ｓｕｐｐｌ．７：７−２３（１９７８），Ｒｏｄｗｅｌｌら、Ｂｉｏｔｅｃｈ．，３：８８９−８９４（１９８４）および米国特許第４４９３７９５号を参照。
本発明は、機能ＰＴＴＧをコードするＤＮＡセグメントを含んで成る発現ベクターでトランスフェクションしたＴＳＨ感受性細胞において、ＰＴＴＧポリペプチドの発現レベルを調節する手段を提供する。本明細書において使用される「調節」という用語は、細胞において、該細胞を刺激に曝露することによって、特定ポリペプチドをコードする特定ポリヌクレオチドの発現を調整するかまたは変更することを意味する。例えば、該細胞をＴＳＨに曝露することによって、ＴＳＨ感受性細胞におけるＰＴＴＧ発現を調節することができる。
本発明のさらに他の態様によって、好適な宿主細胞において前記の核酸配列を発現させることによって、本発明のＰＴＴＧタンパク質を組換え産生する方法を提供する。本明細書に開示するＰＴＴＧタンパク質を産生するのに好適な組換えＤＮＡ発現系は、当分野でよく知られている。例えば、前記のヌクレオチド配列を、さらなる操作のためにベクターに組み込むことができる。本明細書において使用されるベクター（またはプラスミド）とは、異種ＤＮＡを、その発現または複製のために、細胞に導入するために使用される分離要素を意味する。
本明細書において使用されるプロモータ領域とは、ＤＮＡに操作的に結合させた、ＤＮＡの転写を調節するＤＮＡのセグメントを意味する。プロモータ領域は、ＲＮＡポリメラーゼ認識、結合および転写開始に充分な特定の配列を有する。さらに、プロモータ領域は、ＲＮＡポリメラーゼのこの認識、結合および転写開始活性を調節する配列も有する。これらの配列は、シス活性であってもよく、またはトランス活性因子に反応性であってもよい。プロモータは、調節の性質に依存して、構成的であってもよく調節されてもよい。本発明の実施において使用しうる例示的プロモータは、ＴＳＨまたはエストロゲン誘発に反応してＰＴＴＧの過剰発現を誘発するプロモータ、例えば、ヒトＰＴＴＧ１、ラットＰＴＴＧまたはマウスＰＴＴＧプロモータ等を包含する。
本明細書において使用される「過剰発現する」および「過剰発現」という用語は、特性細胞型の野生型細胞において核酸が一般に発現されるレベルを超えたレベルでの、特定細胞型における特定核酸の発現を意味する。本明細書において使用される「過小発現する」および「過小発現」という用語は、特性細胞型の野生型細胞において核酸が一般に発現されるレベルより低いレベルでの、特定細胞型における特定核酸の発現を意味する。
本明細書において使用される「操作的に結合させた」という用語は、ＤＮＡと調節およびエフェクターヌクレオチド配列、例えば、プロモータ、エンハンサー、転写および翻訳停止部位、および他のシグナル配列との機能的関係を意味する。例えば、プロモータへのＤＮＡの操作的結合は、ＤＮＡとプロモータとの物理的および機能的関係を意味し、それによって、ＤＮＡを特異的に認識し、結合し、転写するＲＮＡポリメラーゼによって、そのようなＤＮＡの転写がプロモータから開始される。
原核細胞形質転換ベクターは、当分野でよく知られており、ｐＣｉＮｅｏ等を包含する。
例示的な真核細胞形質転換ベクターは、クローン化ウシパピローマウイルスゲノム、マウスレトロウイルスのクローン化ゲノム、および真核細胞カセットを包含し、例えば、形質転換真核細胞系において目的とするタンパク質の少なくともいくらかの発現を実質的に確実にするｐＳＶ−２ ｇｐｔ系（ＭｕｌｌｉｇａｎおよびＢｅｒｇ，１９７９，Ｎａｔｕｒｅ Ｖｏｌ．２７７：１０８−１１４に記載）、Ｏｋａｙａｍａ−Ｂｅｒｇクローニング系（Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．Ｖｏｌ．２：１６１−１７０，１９８２）、およびＧｅｎｅｔｉｃｓ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ（Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｖｏｌ．２２８：８１０−８１５，１９８５）によって記載された発現クローニングベクタが入手可能である。
特に好ましいベースベクター（ｂａｓｅ ｖｅｃｔｏｒ）は、哺乳動物細胞のトランスフェクション用の本発明のＰＴＴＧコードＤＮＡに結合させることができる調節要素を含有し、それによって正のトランスフェクタント（ｔｒａｎｓｆｅｃｔａｎｔｓ）を当分野で既知の方法によって同定または検出することができる。
本発明の他の態様によって、本発明の核酸分子（即ち、ＤＮＡまたはｍＲＮＡ）を含有する「組換え細胞」を提供する。好適な宿主細胞、好ましくはＦＲＴＬ５細胞を形質転換する方法、ならびに該細胞の培養に適用しうる方法は、当分野において一般に既知である。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ： Ａ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（第２版）、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ＵＳＡ（１９８９）参照。
形質導入組換え細胞を作製するために、本発明の核酸を含有する発現ベクターを宿主細胞に導入する（形質導入する）例示的方法は、当分野でよく知られている（例えば、概観のために、Ｆｒｉｅｄｍａｎｎ，１９８９，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４４：１２７５−１２８１；Ｍｕｌｌｉｇａｎ，１９９３，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２６０：９２６−９３２参照；それぞれ全体として、参照として本明細書に組み入れられる）。形質導入の例示的方法は、例えば下記の方法である：ウイルスベクターを使用する感染（例えば、米国特許第４４０５７１２号および第４６５０７６４号参照）、燐酸カルシウムトランスフェクション（米国特許第４３９９２１６号および第４６３４６６５号）、硫酸デキストラントランスフェクション、電気穿孔法、リポフェクション（例えば、米国特許第４３９４４４８号および第４６１９７９４号参照）、サイトフェクション（ｃｙｔｏｆｅｃｔｉｏｎ）、粒子ビーズ衝撃等。異種核酸は、その染色体外（即ち、エピソーム）維持を可能にする配列を任意に含有することができ、または異種ＤＮＡを宿主のゲノムに組み込むこともできる（宿主における安定維持を確実にする代替法）。
本発明の実施に使用しうる宿主生体は、トランスフェクションされたポリヌクレオチドによってコードされたタンパク質の組換え産生が行なわれた生体を包含する。そのような宿主生体の例は、哺乳動物細胞（例えば、ＦＲＴＬ５細胞）等を包含する。現在好ましい宿主生体は、哺乳動物甲状腺刺激ホルモン感受性またはエストロゲン感受性細胞である。
本発明の他の態様によれば、本発明のＰＴＴＧポリペプチドを組換え的に発現する形質転換宿主細胞を、被験化合物に接触させ、次に、被験化合物の存在および不存在下のＰＴＴＧ仲介反応（例えば、リポーター遺伝子発現による）を比較するか、または被験細胞または対照細胞（即ち、ＰＴＴＧポリペプチドを発現しない細胞）の化合物の存在に対する反応を比較することによって、その調節作用を評価することができる。
本明細書に使用される本発明のＰＴＴＧポリペプチドの「活性を調節する」化合物またはシグナルとは、本発明のＰＴＴＧポリペプチドの活性が化合物またはシグナルの存在下と化合物またはシグナルの不存在とで異なるように、ＰＴＴＧポリペプチドの活性を変化させる化合物またはシグナルを意味する。特に、そのような化合物またはシグナルは、アゴニストおよびアンタゴニストを包含する。アゴニストは、ＰＴＴＣタンパク質機能を活性化する化合物およびシグナルを包含する。アゴニストは、エストロゲンおよびＴＳＨを包含する。または、アンタゴニストは、ＰＴＴＧタンパク質機能を阻害する化合物またはシグナルを包含する。一般に、アンタゴニストの作用は、アゴニスト誘発タンパク質活性の遮断として観察される。アンタゴニストは、競合的および非競合的アンタゴニストを包含する。競合的アンタゴニスト（または競合的遮断薬）は、アゴニスト結合に特異的な部位またはその近くで相互作用する。非競合的アンタゴニストまたは遮断薬は、アゴニスト相互作用部位と異なる部位と相互作用することによって、ポリペプチドの機能を不活性化する。
当業者に理解されるように、ＰＴＴＧ活性を調節する化合物を同定するアッセイ方法は、対照との比較を一般に必要とする。「対照」の１つのタイプは、化合物に曝露される被験細胞または被験培養細胞と実質的に同様に処理され、但し、「対照」細胞または培養細胞は化合物に曝露されない。例えば、電圧固定電気生理学的方法を使用する方法において、細胞を漬けている外部溶液を交換するだけで、同じ細胞を化合物の存在または不存在において試験することができる。他のタイプの「対照」細胞または培養細胞は、トランスフェクションした細胞と同じ細胞または培養細胞であってよく、但し、「対照」細胞または培養細胞は天然タンパク質を発現しない。従って、トランスフェクションした細胞の化合物に対する反応を、同じ反応条件における同じ化合物への「対照」細胞または培養細胞の反応（または無反応）と比較する。
本発明のさらに他の態様において、ＰＴＴＧポリペプチドの活性化を、前記のバイオアッセイによって同定した少なくとも１つの化合物の有効量にポリペプチドを接触させることによって、調節することができる。
本明細書に記載する全ての米国特許および全ての発行物は全体として、参照として本明細書に組み入れられる。本発明を、下記の非制限的実施例に関してさらに詳しく記載する。
特に記載されていなければ、例えば下記に記載されている標準法を使用して、本発明を実施した：Ｍａｎｉａｔｉｓ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ＵＳＡ（１９８２）；Ａａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（２ ｅｄ．）， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ＵＳＡ（１９８９）；Ｄａｖｉｓ ｅｔ ａｌ．，Ｂａｓｉｃ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｅｌｓｅｖｉｅｒ
Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ＵＳＡ（１９８６）；ｏｒ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ：Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｔａｃｈｎｉｑｕｅｓ Ｖｏｌ．１５２，Ｓ．Ｌ．Ｂｅｒｇｅｒ ａｎｄ Ａ．Ｒ．Ｋｉｍｍｅｒｌ Ｅｄｓ．，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ Ｉｎｃ．，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＵＳＡ（１９８７）。
Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ＵＳＡ（１９８６）；ｏｒ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ：Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｔａｃｈｎｉｑｕｅｓ Ｖｏｌ．１５２，Ｓ．Ｌ．Ｂｅｒｇｅｒ ａｎｄ Ａ．Ｒ．Ｋｉｍｍｅｒｌ Ｅｄｓ．，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ Ｉｎｃ．，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＵＳＡ（１９８７）。
（実施例１：材料および方法）
（患者および組織）
甲状腺腫瘍の試料（甲状腺過形成、ｎ＝１５；小胞状腺腫、ｎ＝９；濾胞癌腫、ｎ＝２；乳頭癌腫、ｎ＝８；橋本病、ｎ＝３；表１）を、外科的切除後の４６人の連続任意抽出患者（ｃｏｎｓｅｃｕｔｉｖｅ ｕｎｓｅｌｅｃｔｅｄ ｐａｔｉｅｎｔｓ）から得た。好適な質の非分解ＲＮＡを、４６組織試料の内の３７から得、次の分析に使用した。正常な隣接甲状腺組織を、甲状腺腫瘍を有する３７分析試料の内の２９から得、死後正常甲状腺組織を、追加の５試料から得た（Ｂｒａｉｎ ａｎｄ Ｔｉｓｓｕｅ Ｂａｎｋｓ ｆｏｒ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌ Ｄｉｓｏｒｄｅｒｓ，Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｍａｒｙｌａｎｄ，Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ，ＭＤ）。試料アリコートを、分析にかけるまで、液体窒素に浸して−７０℃で保存するか、または１０％ホルマリンにおいて固定した。
（患者および組織）
甲状腺腫瘍の試料（甲状腺過形成、ｎ＝１５；小胞状腺腫、ｎ＝９；濾胞癌腫、ｎ＝２；乳頭癌腫、ｎ＝８；橋本病、ｎ＝３；表１）を、外科的切除後の４６人の連続任意抽出患者（ｃｏｎｓｅｃｕｔｉｖｅ ｕｎｓｅｌｅｃｔｅｄ ｐａｔｉｅｎｔｓ）から得た。好適な質の非分解ＲＮＡを、４６組織試料の内の３７から得、次の分析に使用した。正常な隣接甲状腺組織を、甲状腺腫瘍を有する３７分析試料の内の２９から得、死後正常甲状腺組織を、追加の５試料から得た（Ｂｒａｉｎ ａｎｄ Ｔｉｓｓｕｅ Ｂａｎｋｓ ｆｏｒ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌ Ｄｉｓｏｒｄｅｒｓ，Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｍａｒｙｌａｎｄ，Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ，ＭＤ）。試料アリコートを、分析にかけるまで、液体窒素に浸して−７０℃で保存するか、または１０％ホルマリンにおいて固定した。
ＴＲＩｚｏｌ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．，Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，ＭＤ）を使用して、培養細胞（約３ｘ１０７細胞／群）および切除組織（組織均質化の後）から全ＲＮＡを抽出した。ＪＥＧ３絨毛癌細胞またはラット精巣に由来するＲＮＡを、ＰＴＴＧ１発現についての正の対照として使用した。電気泳動にかけたＲＮＡを、Ｈｙｂｏｎｄ−Ｎナイロン膜（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ，Ｌｉｔｔｌｅ Ｃｈａｌｆｏｎｔ，ＵＫ）に移行させた。膜を架橋し、予備ハイブリダイズし（１時間）、そして１００μｇ／ｍＬサケ精子ＤＮＡ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ，Ｌａ Ｊｏｌｌａ，ＣＡ）の存在下に６８℃でヒトＰＴＴＧ ｃＤＮＡにハイブリダイズした（２時間）。全コード領域に及ぶ９００−ｂｐヒトＰＴＴＧ１ ｃＤＮＡフラグメントを、Ｋｌｅｎｏｗ酵素（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．）を使用して［α−３２Ｐ］デオキシ−ＣＴＰで標識した。ヨウ化ナトリウムシンポータ（ＮＩＳ）ｃＤＮＡは、Ｎａｎｃｙ Ｃａｒｒａｓｃｏ（Ａｌｂｅｒｔ Ｅｉｎｓｔｅｉｎ Ｃｏｌｌｅｇｅ ｏｆ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ＮＹ）から寄贈された。後ハイブリダイゼーション洗浄を行なった後に、空気乾燥し、オートラジオグラフィーにかけた。走査デンシトメトリーを使用してＰＴＴＧ１ ｍＲＮＡ発現を定量化し、１８Ｓ ｒＲＮＡ発現に対して標準化し、隣接正常甲状腺組織（３７の内の２９）におけるＰＴＴＧ１／１８Ｓ ｒＲＮＡ比率、または３２正常甲状腺組織において測定した平均ＰＴＴＧ１／１８Ｓ ｒＲＮＡ比率（平均±２標準偏差）と比較した倍増加（ｆｏｌｄ ｉｎｃｒｅａｓｅ）として表した。正常甲状腺組織における平均±標準誤差ＰＴＴＧ１／１８Ｓ ｒＲＮＡ比率は、０．５６±０．０４任意単位であった。
（ウエスタンブロット分析）
酵素阻害剤のカクテル（１ｍＭフェニルメチルスルホニルフルオリド、２μｇ／ｍＬアプロチニンおよび２００μｇ／ｍＬロイペプチン）を含有するＲＩＰＡ緩衝液（１００ｍＭ ＮａＣｌ、０．１％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００、および５０ｍＭ Ｔｒｉｓ、ｐＨ８．３）を使用して、タンパク質を甲状腺組織および細胞から調製し、負荷緩衝液中で変性させた（２分間、１００℃）。ＢＳＡを標準として使用するＢｒａｄｆｏｒｄアッセイによってタンパク質濃度を測定した。可溶性タンパク質（５０μｇ）を、１２％ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルにおいて電気泳動によって分離し、ポリビニリデンジフルオリド膜（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ）に移行させ、ＰＢＳ−０．０５％Ｔｗｅｅｎ溶液中の５％脱脂乳において培養し、次に、ＰＴＴＧに対する抗体（１：５０００）と共に４℃で２４時間、または増殖細胞質核抗原（ＰＣＮＡ）と共に室温で２時間培養した。ＰＢＳ−０．０５％Ｔｗｅｅｎ（６回、各１０分間）で洗浄した後に、ブロットを適切なホースラディシュペルオキシダーゼ接合抗ＩｇＧと共に室温で１時間培養した。さらに洗浄した後、抗原−抗体複合体をＥＣＬ化学発光検出装置によってＨｙｐｅｒｆｉｌｍ ＥＣＬ（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ）上に視覚化した。
酵素阻害剤のカクテル（１ｍＭフェニルメチルスルホニルフルオリド、２μｇ／ｍＬアプロチニンおよび２００μｇ／ｍＬロイペプチン）を含有するＲＩＰＡ緩衝液（１００ｍＭ ＮａＣｌ、０．１％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００、および５０ｍＭ Ｔｒｉｓ、ｐＨ８．３）を使用して、タンパク質を甲状腺組織および細胞から調製し、負荷緩衝液中で変性させた（２分間、１００℃）。ＢＳＡを標準として使用するＢｒａｄｆｏｒｄアッセイによってタンパク質濃度を測定した。可溶性タンパク質（５０μｇ）を、１２％ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルにおいて電気泳動によって分離し、ポリビニリデンジフルオリド膜（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ）に移行させ、ＰＢＳ−０．０５％Ｔｗｅｅｎ溶液中の５％脱脂乳において培養し、次に、ＰＴＴＧに対する抗体（１：５０００）と共に４℃で２４時間、または増殖細胞質核抗原（ＰＣＮＡ）と共に室温で２時間培養した。ＰＢＳ−０．０５％Ｔｗｅｅｎ（６回、各１０分間）で洗浄した後に、ブロットを適切なホースラディシュペルオキシダーゼ接合抗ＩｇＧと共に室温で１時間培養した。さらに洗浄した後、抗原−抗体複合体をＥＣＬ化学発光検出装置によってＨｙｐｅｒｆｉｌｍ ＥＣＬ（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ）上に視覚化した。
（統計的分析）
結果を平均±標準誤差として表し、統計的分析をＡＮＯＶＡ（Ｂｏｎｆｅｒｒｏｎｉの多重比較試験）を使用して行い、Ｐ＜０．０５を有意とした。
結果を平均±標準誤差として表し、統計的分析をＡＮＯＶＡ（Ｂｏｎｆｅｒｒｏｎｉの多重比較試験）を使用して行い、Ｐ＜０．０５を有意とした。
（細胞培養）
抗生物質（例えば、ペニシリン、ストレプトマイシンおよびフンガゾン）、５％子ウシ血清、および以前に記載された６つの増殖因子を補充したＣｏｏｎ修飾Ｆ−１２（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．）において、ラットＦＲＴＬ５細胞（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ，Ｍａｎａｓｓａｓ，ＶＡ）を維持した。（Ａｍｂｅｓｉ−Ｉｍｐｏｍｂｉａｔｏ，Ｆ．Ｓ．ら、Ｔｈｙｒｏｉｄ ｃｅｌｌｓ ｉｎ ｃｕｌｔｕｒｅ，Ｉｎｔ．Ｒｅｖ．Ｃｙｔｏｌ．１０：１６３−１７２［１９７９］）。ＴＳＨ誘発試験の前に、ＴＳＨを一晩オミットした（ｏｍｉｔｔｅｄ）。一次甲状腺培養について、手術で得た正常甲状腺組織を機械的に切り刻み、１０ｍｇコラーゲナーゼ、１ｍｇヒアルロニダーゼ、および１ｍｇデオキシリボヌクレアーゼＩ（Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）を使用して１０ｍＬ Ｆ−１２培地中で３７℃で３時間消化した。次に、一過性トランスフェクション試験（下記）の前に、２４時間、細胞を前記Ｃｏｏｎ修飾培地で４８時間培養した。
抗生物質（例えば、ペニシリン、ストレプトマイシンおよびフンガゾン）、５％子ウシ血清、および以前に記載された６つの増殖因子を補充したＣｏｏｎ修飾Ｆ−１２（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．）において、ラットＦＲＴＬ５細胞（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ，Ｍａｎａｓｓａｓ，ＶＡ）を維持した。（Ａｍｂｅｓｉ−Ｉｍｐｏｍｂｉａｔｏ，Ｆ．Ｓ．ら、Ｔｈｙｒｏｉｄ ｃｅｌｌｓ ｉｎ ｃｕｌｔｕｒｅ，Ｉｎｔ．Ｒｅｖ．Ｃｙｔｏｌ．１０：１６３−１７２［１９７９］）。ＴＳＨ誘発試験の前に、ＴＳＨを一晩オミットした（ｏｍｉｔｔｅｄ）。一次甲状腺培養について、手術で得た正常甲状腺組織を機械的に切り刻み、１０ｍｇコラーゲナーゼ、１ｍｇヒアルロニダーゼ、および１ｍｇデオキシリボヌクレアーゼＩ（Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）を使用して１０ｍＬ Ｆ−１２培地中で３７℃で３時間消化した。次に、一過性トランスフェクション試験（下記）の前に、２４時間、細胞を前記Ｃｏｏｎ修飾培地で４８時間培養した。
（細胞トランスフェクション）
Ｅｆｆｅｃｔｅｎｅ（ＱＩＡＧＥＮ，Ｃｈａｔｓｗｏｒｔｈ，ＣＡ）を使用して、哺乳動物発現ベクターｐＣｉＮｅｏ（Ｐｒｏｍｅｇａ Ｃｏｒｐ．，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）に枠内（ｉｎ−ｆｒａｍｅ）サブクローニングした野生型（Ｗｔ）および変異ヒトＰＴＴＧ ｃＤＮＡ（Ｚｈａｎｇ，Ｘら、Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ，ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ａｎｄ ｆｕｎｃｔｉｏｎ ｏｆ ｈｕｍａｎ ｐｉｔｕｉｔａｒｙ ｔｒａｎｓｆｏｒｍｉｎｇ ｇｅｎｅ（ＰＴＴＧ），Ｍｏｌ．Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．１３：１５６−１６６［１９９９］）で、ＦＲＴＬ５細胞をトランスフェクションし、トランスフェクションした細胞を選択し、Ｇ４１８（Ｇｅｎｅｔｉｃｉｎ，Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．；１ｍｇ／ｍＬ）を補充した培地に維持し、次に、ｍＲＮＡおよびタンパク質発現についてスクリーニングした。原ｐＣｉＮｅｏベクターでトランスフェクションしたＦＲＴＬ５細胞を対照として使用し、全ての実験を２０継代以内で行って、ＦＲＴＬ５細胞の老化の作用を最小限にした。ＰＳＶβ−ガラクトシダーゼ発現ベクターと共に、Ｗｔ−ＰＴＴＧまたはベクターだけを使用して、初期培養から４８時間後に、Ｅｆｆｅｃｔｅｎｅ（ＱＩＡＧＥＮ，Ｓｔａｎｆｏｒｄ，Ｖａｌｅｎｃｉａ，ＣＡ）を使用して、一次甲状腺培養細胞を一時的にトランスフェクションした。β−ガラクトシダーゼ発現の測定によって、ベクタ−およびＷｔ−ＰＴＴＧトランスフェクタントにおける同等のトランスフェクション有効性を確認した。
Ｅｆｆｅｃｔｅｎｅ（ＱＩＡＧＥＮ，Ｃｈａｔｓｗｏｒｔｈ，ＣＡ）を使用して、哺乳動物発現ベクターｐＣｉＮｅｏ（Ｐｒｏｍｅｇａ Ｃｏｒｐ．，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）に枠内（ｉｎ−ｆｒａｍｅ）サブクローニングした野生型（Ｗｔ）および変異ヒトＰＴＴＧ ｃＤＮＡ（Ｚｈａｎｇ，Ｘら、Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ，ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ａｎｄ ｆｕｎｃｔｉｏｎ ｏｆ ｈｕｍａｎ ｐｉｔｕｉｔａｒｙ ｔｒａｎｓｆｏｒｍｉｎｇ ｇｅｎｅ（ＰＴＴＧ），Ｍｏｌ．Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．１３：１５６−１６６［１９９９］）で、ＦＲＴＬ５細胞をトランスフェクションし、トランスフェクションした細胞を選択し、Ｇ４１８（Ｇｅｎｅｔｉｃｉｎ，Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．；１ｍｇ／ｍＬ）を補充した培地に維持し、次に、ｍＲＮＡおよびタンパク質発現についてスクリーニングした。原ｐＣｉＮｅｏベクターでトランスフェクションしたＦＲＴＬ５細胞を対照として使用し、全ての実験を２０継代以内で行って、ＦＲＴＬ５細胞の老化の作用を最小限にした。ＰＳＶβ−ガラクトシダーゼ発現ベクターと共に、Ｗｔ−ＰＴＴＧまたはベクターだけを使用して、初期培養から４８時間後に、Ｅｆｆｅｃｔｅｎｅ（ＱＩＡＧＥＮ，Ｓｔａｎｆｏｒｄ，Ｖａｌｅｎｃｉａ，ＣＡ）を使用して、一次甲状腺培養細胞を一時的にトランスフェクションした。β−ガラクトシダーゼ発現の測定によって、ベクタ−およびＷｔ−ＰＴＴＧトランスフェクタントにおける同等のトランスフェクション有効性を確認した。
（インビトロＰＴＴＧ形質転換）
軟寒天アッセイにおいて、６０ｍｍ組織培養皿を、軟寒天５ｍＬ（２０％２ｘＦ−１２、５０％Ｆ−１２、１０％ＦＢＳ、および２０％ ２．５％寒天）で被覆した。培地に懸濁させた細胞２ｍＬを寒天混合物４ｍＬと合わし、１．５ｍＬを各皿に添加した。細胞を接種し（１０４／皿）、１４日間培養し、大きいコロニー（＞２０細胞）を数えた。
軟寒天アッセイにおいて、６０ｍｍ組織培養皿を、軟寒天５ｍＬ（２０％２ｘＦ−１２、５０％Ｆ−１２、１０％ＦＢＳ、および２０％ ２．５％寒天）で被覆した。培地に懸濁させた細胞２ｍＬを寒天混合物４ｍＬと合わし、１．５ｍＬを各皿に添加した。細胞を接種し（１０４／皿）、１４日間培養し、大きいコロニー（＞２０細胞）を数えた。
（細胞増殖アッセイ）
ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ９６ ３−［４，５−ジメチルチアゾール−２−イル］−２，５−ジフェニルテトラゾリウムブロミド非放射性細胞増殖アッセイを使用して、製造会社（Ｐｒｏｍｅｇａ Ｃｏｒｐ．）のプロトコルに従って、細胞増殖を測定した。これは、テトラゾリウム塩の媒質可溶性ホルマザンへの細胞変換に基づいて、生存細胞数を測定する比色アッセイである。１４ｎｍにおける吸光度は、培養細胞における生存細胞数に正比例する。細胞（ｎ＝５０００）を９６穴皿（各アッセイにおいて、各クローンにつき８穴）に接種し、３７℃で２４〜７２時間培養した。各時点で、染料（２０μＬ）を穴に添加し、３７℃でさらに培養（４時間）した後、ＥＬＩＳＡ読み取り装置を使用して吸光度を４９０ｎｍで記録した。
ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ９６ ３−［４，５−ジメチルチアゾール−２−イル］−２，５−ジフェニルテトラゾリウムブロミド非放射性細胞増殖アッセイを使用して、製造会社（Ｐｒｏｍｅｇａ Ｃｏｒｐ．）のプロトコルに従って、細胞増殖を測定した。これは、テトラゾリウム塩の媒質可溶性ホルマザンへの細胞変換に基づいて、生存細胞数を測定する比色アッセイである。１４ｎｍにおける吸光度は、培養細胞における生存細胞数に正比例する。細胞（ｎ＝５０００）を９６穴皿（各アッセイにおいて、各クローンにつき８穴）に接種し、３７℃で２４〜７２時間培養した。各時点で、染料（２０μＬ）を穴に添加し、３７℃でさらに培養（４時間）した後、ＥＬＩＳＡ読み取り装置を使用して吸光度を４９０ｎｍで記録した。
（免疫細胞学）
１００ｍｍ皿中の顕微鏡スライドガラス上で培養した細胞を、４％パラホルムアルデヒドにおいて固定し、ＰＣＮＡに対するモノクローナル抗体（クローンＰＣ１０、ＤＡＫＯ Ｃｏｒｐ．，Ｃａｒｐｉｎｔｅｒｉａ，ＣＡ）、次に、ビオチニル化二次抗体およびストレプトアビジンホースラディッシュペルオキシダーゼと共に培養した。抗体限局を、３，３’−ジアミノベンジデンテトラクロリドを使用して行なった。適切な正および負の対照を使用した。
１００ｍｍ皿中の顕微鏡スライドガラス上で培養した細胞を、４％パラホルムアルデヒドにおいて固定し、ＰＣＮＡに対するモノクローナル抗体（クローンＰＣ１０、ＤＡＫＯ Ｃｏｒｐ．，Ｃａｒｐｉｎｔｅｒｉａ，ＣＡ）、次に、ビオチニル化二次抗体およびストレプトアビジンホースラディッシュペルオキシダーゼと共に培養した。抗体限局を、３，３’−ジアミノベンジデンテトラクロリドを使用して行なった。適切な正および負の対照を使用した。
（ヨウ化物取込みアッセイ）
１２５Ｉ−ヨウ化物取込みを、少し変更を加えて以前に記載されたように測定した（Ｗｅｉｓｓ，Ｓ．Ｊ．ら、Ｉｏｄｉｄｅ ｔｒａｎｓｐｏｒｔ ｉｎ ａ ｃｏｎｔｉｎｕｏｕｓ ｌｉｎｅ ｏｆ ｃｕｌｔｕｒｅｄ ｃｅｌｌｓ ｆｒｏｍ ｒａｔ ｔｈｙｒｏｉｄ，Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ １１４：１０９０−１０９８［１９８４］）。ＦＲＴＬ５細胞（２ｘ１０５）を２４穴組織培養皿（Ｃｏｓｔｒａ，Ｃａｍｂｒｉｄｅ，ＭＡ）に接種した。Ｗｔ−ＰＴＴＧまたはベクター対照でトランスフェクションしてから２４時間後（一次ヒト甲状腺培養物：ｎ＝３）、または接種から２〜３日後（ＦＲＴＬ５細胞）、培地を吸引し、細胞を１ｍＬ ＨＢＳＳで洗浄した。０．１μＣｉ無担体［１２５Ｉ］−ＮａＩおよび１０μｍ／Ｌヨウ化ナトリウムを含有する５００μＬ ＨＢＳＳを３７℃で６０分間にわたって添加することによって、ヨウ化物取込みを開始させた。放射性培地の吸引によってアッセイを終了し、１ｍＬ氷冷ＨＢＳＳで洗浄し；１．０ｍＬ ９５％エタノールを各穴に１時間にわたって添加し、次に、バイアルに移して、γ計数器で計数した。各穴のＤＮＡ含有量を測定し、結果を、計数／分／μｇ ＤＮＡとして表した。全ての実験を、２つ別々の場合について多重で行なった（各ＦＲＴＬ５クローンについては８穴、一次ヒト甲状腺培養物については３穴）。
１２５Ｉ−ヨウ化物取込みを、少し変更を加えて以前に記載されたように測定した（Ｗｅｉｓｓ，Ｓ．Ｊ．ら、Ｉｏｄｉｄｅ ｔｒａｎｓｐｏｒｔ ｉｎ ａ ｃｏｎｔｉｎｕｏｕｓ ｌｉｎｅ ｏｆ ｃｕｌｔｕｒｅｄ ｃｅｌｌｓ ｆｒｏｍ ｒａｔ ｔｈｙｒｏｉｄ，Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ １１４：１０９０−１０９８［１９８４］）。ＦＲＴＬ５細胞（２ｘ１０５）を２４穴組織培養皿（Ｃｏｓｔｒａ，Ｃａｍｂｒｉｄｅ，ＭＡ）に接種した。Ｗｔ−ＰＴＴＧまたはベクター対照でトランスフェクションしてから２４時間後（一次ヒト甲状腺培養物：ｎ＝３）、または接種から２〜３日後（ＦＲＴＬ５細胞）、培地を吸引し、細胞を１ｍＬ ＨＢＳＳで洗浄した。０．１μＣｉ無担体［１２５Ｉ］−ＮａＩおよび１０μｍ／Ｌヨウ化ナトリウムを含有する５００μＬ ＨＢＳＳを３７℃で６０分間にわたって添加することによって、ヨウ化物取込みを開始させた。放射性培地の吸引によってアッセイを終了し、１ｍＬ氷冷ＨＢＳＳで洗浄し；１．０ｍＬ ９５％エタノールを各穴に１時間にわたって添加し、次に、バイアルに移して、γ計数器で計数した。各穴のＤＮＡ含有量を測定し、結果を、計数／分／μｇ ＤＮＡとして表した。全ての実験を、２つ別々の場合について多重で行なった（各ＦＲＴＬ５クローンについては８穴、一次ヒト甲状腺培養物については３穴）。
（動物）
卵巣摘出したＦｉｓｃｈｅｒ３４４ラット（１４０〜１５０ｇ；Ｈａｒｌａｎ Ｓｐｒａｇｕｅ Ｄａｗｌｅｙ，Ｉｎｃ．，Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ，ＩＮ）を、餌および水を自由に与えて、管理環境（照明、０６００〜１８００時間；２２±１℃）に収容した。ラットの使用は、ｉｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌ ａｎｉｍａｌ ｃａｒｅ ａｎｄ ｕｓｅ ｃｏｍｍｉｔｔｅｅによって承認された。９０％ポリエチレングリコール／１０％エタノール溶液中の１７β−エストロゲン−２（１〜１０００ｎｇ）または４−ヒドロキシタモキシフェン（８６０μｇ）を含有する皮下埋め込み浸透圧ポンプ（１００μＬ；Ａｌｚｅｔ，Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ，ＣＡ）を使用して、エストロゲンおよび／または抗エストロゲンを投与した（Ｈｅａｎｅｙ，Ａ．Ｐ．，ｅｔ ａｌ．，Ｅａｒｌｙ ｉｎｖｏｌｖｅｍｅｎｔ ｏｆ ｅｓｔｒｏｇｅｎ−ｉｎｄｕｃｅｄ ｐｉｔｕｉｔａｒｙ ｔｕｍｏｒ ｔｒａｎｓｆｏｒｍｉｎｇ ｇｅｎｅ（ＰＴＴＧ１）ａｎｄ ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ（ｂＦＧＦ）ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｉｎ ｐｒｏｌａｃｔｉｎｏｍａ ｐａｔｈｏｇｅｎｅｓｉｓ，Ｎａｔ．Ｍｅｄ．５：１３１７−１３２１［１９９９］）。ラットをＣＯ２吸入によって安楽死させ、甲状腺組織を液体Ｎ２に浸し、ＲＮＡおよび／またはタンパク質の抽出のために−８０℃で保存し、エストロゲン−２およびプロゲステロンアッセイのために血清を採集した（Ｌａｐｏｌｔ，Ｐ．Ｓ．，ｅｔ ａｌ．， Ｔｈｅ ｒｅｌａｔｉｏｎ ｏｆ ｏｖａｒｉａｎ ｓｔｅｒｏｉｄ ｌｅｖｅｌｓ ｉｎ ｙｏｕｎｇ ｆｅｍａｌｅ ｒａｔｓ ｔｏ ｓｕｂｓｅｑｕｅｎｔ ｅｓｔｒｏｕｓ ｃｙｃｌｉｃｉｔｙ ａｎｄ ｒｅｐｒｏｄｕｃｔｉｖｅ ｆｕｎｃｔｉｏｎ ｄｕｒｉｎｇ ａｇｉｎｇ，Ｂｉｏｌ．Ｒｅｐｒｏｄ．３５：１１３１−１１３９［１９８６］）。
卵巣摘出したＦｉｓｃｈｅｒ３４４ラット（１４０〜１５０ｇ；Ｈａｒｌａｎ Ｓｐｒａｇｕｅ Ｄａｗｌｅｙ，Ｉｎｃ．，Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ，ＩＮ）を、餌および水を自由に与えて、管理環境（照明、０６００〜１８００時間；２２±１℃）に収容した。ラットの使用は、ｉｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌ ａｎｉｍａｌ ｃａｒｅ ａｎｄ ｕｓｅ ｃｏｍｍｉｔｔｅｅによって承認された。９０％ポリエチレングリコール／１０％エタノール溶液中の１７β−エストロゲン−２（１〜１０００ｎｇ）または４−ヒドロキシタモキシフェン（８６０μｇ）を含有する皮下埋め込み浸透圧ポンプ（１００μＬ；Ａｌｚｅｔ，Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ，ＣＡ）を使用して、エストロゲンおよび／または抗エストロゲンを投与した（Ｈｅａｎｅｙ，Ａ．Ｐ．，ｅｔ ａｌ．，Ｅａｒｌｙ ｉｎｖｏｌｖｅｍｅｎｔ ｏｆ ｅｓｔｒｏｇｅｎ−ｉｎｄｕｃｅｄ ｐｉｔｕｉｔａｒｙ ｔｕｍｏｒ ｔｒａｎｓｆｏｒｍｉｎｇ ｇｅｎｅ（ＰＴＴＧ１）ａｎｄ ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ（ｂＦＧＦ）ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｉｎ ｐｒｏｌａｃｔｉｎｏｍａ ｐａｔｈｏｇｅｎｅｓｉｓ，Ｎａｔ．Ｍｅｄ．５：１３１７−１３２１［１９９９］）。ラットをＣＯ２吸入によって安楽死させ、甲状腺組織を液体Ｎ２に浸し、ＲＮＡおよび／またはタンパク質の抽出のために−８０℃で保存し、エストロゲン−２およびプロゲステロンアッセイのために血清を採集した（Ｌａｐｏｌｔ，Ｐ．Ｓ．，ｅｔ ａｌ．， Ｔｈｅ ｒｅｌａｔｉｏｎ ｏｆ ｏｖａｒｉａｎ ｓｔｅｒｏｉｄ ｌｅｖｅｌｓ ｉｎ ｙｏｕｎｇ ｆｅｍａｌｅ ｒａｔｓ ｔｏ ｓｕｂｓｅｑｕｅｎｔ ｅｓｔｒｏｕｓ ｃｙｃｌｉｃｉｔｙ ａｎｄ ｒｅｐｒｏｄｕｃｔｉｖｅ ｆｕｎｃｔｉｏｎ ｄｕｒｉｎｇ ａｇｉｎｇ，Ｂｉｏｌ．Ｒｅｐｒｏｄ．３５：１１３１−１１３９［１９８６］）。
（実施例２：結果）
（ＰＴＴＧ過剰発現は小胞病変に関係している）
増加したＰＴＴＧ１ ｍＲＮＡ発現は、甲状腺過形成１５のうち１０（平均±標準誤差：ＰＴＴＧ１ ｍＲＮＡ、１．７±０．５倍増加；Ｐ＜０．０１、ＡＮＯＶＡによる）、小胞状腺腫９のうち７（ＰＴＴＧ１ ｍＲＮＡ、１．９±０．９倍増加；Ｐ＜０．０１）、低侵襲濾胞癌腫２のうち２（ＰＴＴＧ１ ｍＲＮＡ、２．０±０．４倍増加）において観察された。３２正常甲状腺組織における平均±２標準偏差 ＰＴＴＧ１ ｍＲＮＡ発現と比較して、少ないＰＴＴＧ増加が、乳頭癌腫８のうち４（ＰＴＴＧ１ ｍＲＮＡ、０．８４±０．１５倍増加；Ｐ＝ＮＳ：表１および図１Ａおよび図１Ｂ）に観察された。
最も高い発現（最大７．２倍のＰＰＴＧ１ ｍＲＮＡ増加）が、甲状腺過形成、小胞状腺腫、および２つの濾胞癌腫のサブセットに観察された（表１）。橋本病３のうち３におけるＰＴＴＧ１ ｍＲＮＡ発現は、正常甲状腺組織で観察されたのと同程度であった。
（ＰＴＴＧ過剰発現は小胞病変に関係している）
増加したＰＴＴＧ１ ｍＲＮＡ発現は、甲状腺過形成１５のうち１０（平均±標準誤差：ＰＴＴＧ１ ｍＲＮＡ、１．７±０．５倍増加；Ｐ＜０．０１、ＡＮＯＶＡによる）、小胞状腺腫９のうち７（ＰＴＴＧ１ ｍＲＮＡ、１．９±０．９倍増加；Ｐ＜０．０１）、低侵襲濾胞癌腫２のうち２（ＰＴＴＧ１ ｍＲＮＡ、２．０±０．４倍増加）において観察された。３２正常甲状腺組織における平均±２標準偏差 ＰＴＴＧ１ ｍＲＮＡ発現と比較して、少ないＰＴＴＧ増加が、乳頭癌腫８のうち４（ＰＴＴＧ１ ｍＲＮＡ、０．８４±０．１５倍増加；Ｐ＝ＮＳ：表１および図１Ａおよび図１Ｂ）に観察された。
最も高い発現（最大７．２倍のＰＰＴＧ１ ｍＲＮＡ増加）が、甲状腺過形成、小胞状腺腫、および２つの濾胞癌腫のサブセットに観察された（表１）。橋本病３のうち３におけるＰＴＴＧ１ ｍＲＮＡ発現は、正常甲状腺組織で観察されたのと同程度であった。
（ＰＴＴＧはインビトロでの甲状腺細胞形質転換を誘発する）
ＰＴＴＧは、ＰＴＴＧタンパク質のＣ末端近くにＰＸＸＰモチーフを含有するプロリンリッチ領域を有することが既知である（Ｆａｒｉｄ Ｎ．Ｒ．ら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｂａｓｉｓ ｏｆ ｔｈｙｒｏｉｄ ｃａｎｃｅｒ，Ｅｎｄｏｃｒ．Ｒｅｖ．１５：２０２−２３２［１９９４］）。ＰＴＴＧ媒介作用におけるこの潜在的ＳＨ３結合モチーフの重要性は以前に記載されており、このプロリンリッチ（Ｐ１６３Ａ、Ｐ１７０Ｌ、Ｐ１７２Ａ、Ｐ１７３Ｌ）モチーフの変異が、ＰＴＴＧ媒介細胞作用を排除することが示されている（Ｆａｒｉｄ Ｎ．Ｒ．ら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｂａｓｉｓ ｏｆ ｔｈｙｒｏｉｄ ｃａｎｃｅｒ，Ｅｎｄｏｃｒ．Ｒｅｖ．１５：２０２−２３２［１９９４］）。甲状腺腫瘍形成におけるＰＴＴＧの役割を調査するために、サイトメガロウイルスプロモータの制御下に哺乳動物発現ベクターにクローン化された変異および野生型ＰＴＴＧ ｃＤＮＡを、ラットＦＲＴＬ５細胞に安定にトランスフェクションした。
ＰＴＴＧは、ＰＴＴＧタンパク質のＣ末端近くにＰＸＸＰモチーフを含有するプロリンリッチ領域を有することが既知である（Ｆａｒｉｄ Ｎ．Ｒ．ら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｂａｓｉｓ ｏｆ ｔｈｙｒｏｉｄ ｃａｎｃｅｒ，Ｅｎｄｏｃｒ．Ｒｅｖ．１５：２０２−２３２［１９９４］）。ＰＴＴＧ媒介作用におけるこの潜在的ＳＨ３結合モチーフの重要性は以前に記載されており、このプロリンリッチ（Ｐ１６３Ａ、Ｐ１７０Ｌ、Ｐ１７２Ａ、Ｐ１７３Ｌ）モチーフの変異が、ＰＴＴＧ媒介細胞作用を排除することが示されている（Ｆａｒｉｄ Ｎ．Ｒ．ら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｂａｓｉｓ ｏｆ ｔｈｙｒｏｉｄ ｃａｎｃｅｒ，Ｅｎｄｏｃｒ．Ｒｅｖ．１５：２０２−２３２［１９９４］）。甲状腺腫瘍形成におけるＰＴＴＧの役割を調査するために、サイトメガロウイルスプロモータの制御下に哺乳動物発現ベクターにクローン化された変異および野生型ＰＴＴＧ ｃＤＮＡを、ラットＦＲＴＬ５細胞に安定にトランスフェクションした。
トランスフェクションしたクローンにおける野生型および変異ＰＴＴＧの過剰発現を、ノザン（図２Ａ）およびウエスタン（図２Ｂ）ブロット分析によって確認した。Ｗｔ−ＰＴＴＧ安定甲状腺細胞トランスフェクタントは、ベクターまたは変異−ＰＴＴＧトランスフェクタントと比較して、増加した塩基性線維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦ）発現を示し（図２Ｃ）、３Ｔ３線維芽細胞における我々の以前の観察を確認した（Ｚｈａｎｇ，Ｘら、Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ，ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ａｎｄ ｆｕｎｃｔｉｏｎ ｏｆ ｈｕｍａｎ ｐｉｔｕｉｔａｒｙ ｔｒａｎｓｏｒｍｉｎｇ ｇｅｎｅ （ＰＴＴＧ），Ｍｏｌ．Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．１３：１５６−１６６［１９９９］）。これらの細胞の形質転換を受ける能力を、足場−非依存性増殖アッセイにおいて試験した。野生型ＰＴＴＧを過剰発現するＦＲＴＬ５細胞は、ベクターだけでトランスフェクションしたＦＲＴＬ５細胞（図２Ｄおよび図２Ｅ；７１〜１３±１コロニー／皿；Ｐ＜０．００１）と比較して、多くの大きいコロニー（４４±６〜７２±６コロニー／皿、平均±標準誤差）を軟寒天において形成した。変異ＰＴＴＧを発現するＦＲＴＬ５細胞は、野生型ＰＴＴＧを過剰発現する細胞より少ないコロニーを形成し、ベクターだけでトランスフェクションした細胞について観察されコロニーと類似していた（２±０．３〜１９±１コロニー／皿；Ｐ＜０．００１）。これらの結果は、ヒトＰＴＴＧのインビトロ形質転換活性を示し、ＳＨ３ドメインを含有するシグナルタンパク質が、ＰＴＴＧ形質転換作用を仲介するという我々の以前の報告を裏付けるものである。
（ＰＴＴＧ過剰発現は脱分化表現型に関係している）
野生型ＰＴＴＧでトランスフェクションしたＦＲＴＬ５細胞は、ベクターだけでトランスフェクションした細胞と比較して、増加した増殖率示した（図３Ａおよび図３Ｂ；Ｐ＜０．００１）。プロリンリッチ領域に変異を有するＰＴＴＧ構造物でトランスフェクションした細胞は、ベクターだけでトランスフェクションした対照より高い中等度増殖率を示した（図３Ａ；Ｐ＜０．００１）。これらの細胞の増加した増殖と一致して、ウエスタンブロットは、野生型ＰＴＴＧトランスフェクタントにおける増加したＰＣＮＡ発現を示し（図３Ｂ）、免疫組織化学は、いくつかの細胞が濃いＰＣＮＡ免疫染色を示すことを確認した（図３Ｃ）。ＰＣＮＡは細胞増殖の発生の付加的指標であり、それによって、ベクターだけでトランスフェクションした細胞と比較して、野生型ＰＴＴＧでトランスフェクションした細胞の増加した増殖率をさらに立証している。我々は、ＰＴＴＧでトランスフェクションされた細胞におけるチログロブリン（Ｔｇ）レベルを、分化した甲状腺細胞のマーカーとして調査した（Ｍａｌｔｈｉｅｒｙ，Ｙ．，ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｉｍａｒｙ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ｏｆ ｈｕｍａｎ ｔｈｙｒｏｇｌｏｂｌｕｉｎ ｄｅｄｕｃｅｄ ｆｒｏｍ ｔｈｅ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｏｆ ｉｔｓ ８４４８−ｂａｓｅ ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｙ ＤＮＡ，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏ−Ｃｈｅｍ．１６５：４９１−４９８［１９８７］）。野生型ＰＴＴＧを過剰発現するラット甲状腺細胞は、変異ＰＴＴＧまたはベクターだけでトランスフェクションした甲状腺細胞より低いＴｇレベルを示した（図３Ｄ）。
野生型ＰＴＴＧでトランスフェクションしたＦＲＴＬ５細胞は、ベクターだけでトランスフェクションした細胞と比較して、増加した増殖率示した（図３Ａおよび図３Ｂ；Ｐ＜０．００１）。プロリンリッチ領域に変異を有するＰＴＴＧ構造物でトランスフェクションした細胞は、ベクターだけでトランスフェクションした対照より高い中等度増殖率を示した（図３Ａ；Ｐ＜０．００１）。これらの細胞の増加した増殖と一致して、ウエスタンブロットは、野生型ＰＴＴＧトランスフェクタントにおける増加したＰＣＮＡ発現を示し（図３Ｂ）、免疫組織化学は、いくつかの細胞が濃いＰＣＮＡ免疫染色を示すことを確認した（図３Ｃ）。ＰＣＮＡは細胞増殖の発生の付加的指標であり、それによって、ベクターだけでトランスフェクションした細胞と比較して、野生型ＰＴＴＧでトランスフェクションした細胞の増加した増殖率をさらに立証している。我々は、ＰＴＴＧでトランスフェクションされた細胞におけるチログロブリン（Ｔｇ）レベルを、分化した甲状腺細胞のマーカーとして調査した（Ｍａｌｔｈｉｅｒｙ，Ｙ．，ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｉｍａｒｙ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ｏｆ ｈｕｍａｎ ｔｈｙｒｏｇｌｏｂｌｕｉｎ ｄｅｄｕｃｅｄ ｆｒｏｍ ｔｈｅ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｏｆ ｉｔｓ ８４４８−ｂａｓｅ ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｙ ＤＮＡ，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏ−Ｃｈｅｍ．１６５：４９１−４９８［１９８７］）。野生型ＰＴＴＧを過剰発現するラット甲状腺細胞は、変異ＰＴＴＧまたはベクターだけでトランスフェクションした甲状腺細胞より低いＴｇレベルを示した（図３Ｄ）。
（甲状腺ＰＴＴＧ過剰発現は減少したヨウ化物取込みを生じる）
野生型ＰＴＴＧ１を過剰発現するラットＦＲＴＬ５細胞は、ベクターでトランスフェクションした対照と比較して、減少した１２５Ｉ取込みを示した（図４Ａ；Ｐ＜０．００１）。これらの細胞におけるナトリウム／ヨウ化物シンポータ（ＮＩＳ）発現をノザンブロット分析によって調査し、野生型ＰＴＴＧ１を過剰発現する甲状腺細胞は、ベクターでトランスフェクションした対照と比較して、減少したＮＩＳ発現を有し（図４Ｂ）、減少した１２５Ｉ取込みのメカニズムを与えることが見出された。親７／１／２００２ １０：０７ＡＭまたはベクターでトランスフェクションしたＦＲＴＬ５細胞のｂＦＧＦ（５〜１０ｎｇ／ｍＬ）での４８時間の処理は、ＰＴＴＧでトランスフェクションした細胞と同様の１２５Ｉ取込みの５０％減少を生じ（図４Ｃ；Ｐ＜０．００１）、これは、観察されたＰＴＴＧ媒介表現型変更が、パラクリン／オートクライン的に作用する分泌ｂＦＧＦによることを示している。インビトロでの正常ヒト甲状腺細胞におけるＷｔ−ＰＴＴＧの一過性過剰発現は、１２５Ｉ取込みを１０％減少させ（図４Ｄ；Ｐ＝０．０２）、これは、安定にトランスフェクションしたＦＲＴＬ５細胞における我々の観察を、拡大し、確認するものである。
野生型ＰＴＴＧ１を過剰発現するラットＦＲＴＬ５細胞は、ベクターでトランスフェクションした対照と比較して、減少した１２５Ｉ取込みを示した（図４Ａ；Ｐ＜０．００１）。これらの細胞におけるナトリウム／ヨウ化物シンポータ（ＮＩＳ）発現をノザンブロット分析によって調査し、野生型ＰＴＴＧ１を過剰発現する甲状腺細胞は、ベクターでトランスフェクションした対照と比較して、減少したＮＩＳ発現を有し（図４Ｂ）、減少した１２５Ｉ取込みのメカニズムを与えることが見出された。親７／１／２００２ １０：０７ＡＭまたはベクターでトランスフェクションしたＦＲＴＬ５細胞のｂＦＧＦ（５〜１０ｎｇ／ｍＬ）での４８時間の処理は、ＰＴＴＧでトランスフェクションした細胞と同様の１２５Ｉ取込みの５０％減少を生じ（図４Ｃ；Ｐ＜０．００１）、これは、観察されたＰＴＴＧ媒介表現型変更が、パラクリン／オートクライン的に作用する分泌ｂＦＧＦによることを示している。インビトロでの正常ヒト甲状腺細胞におけるＷｔ−ＰＴＴＧの一過性過剰発現は、１２５Ｉ取込みを１０％減少させ（図４Ｄ；Ｐ＝０．０２）、これは、安定にトランスフェクションしたＦＲＴＬ５細胞における我々の観察を、拡大し、確認するものである。
（ＰＴＴＧは甲状腺増殖因子によって誘発される）
培養ラットＦＲＴＬ５細胞または一次ヒト甲状腺細胞のＴＳＨ処理（５〜２５μ／ｍＬ）は、インビトロでのｐｔｔｇ発現を誘発した（ｐｔｔｇ増加、それぞれ５．９倍および２．４倍；Ｐ＝０．０１；図５Ａおよび図５Ｂ）。
培養ラットＦＲＴＬ５細胞または一次ヒト甲状腺細胞のＴＳＨ処理（５〜２５μ／ｍＬ）は、インビトロでのｐｔｔｇ発現を誘発した（ｐｔｔｇ増加、それぞれ５．９倍および２．４倍；Ｐ＝０．０１；図５Ａおよび図５Ｂ）。
小型浸透圧ポンプ輸液によるＦｉｓｃｈｅｒ ３４４ラット（各群につきｎ＝３）へのエストロゲン（１０００ｎｇ／４８時間）の投与は、ラット甲状腺ｐｔｔｇを誘発した（図５Ｃ；ｐｔｔｇ増加、５．３倍）。エストラジオール媒介甲状腺ｐｔｔｇ誘発は、抗エストラジオール４−ヒドロキシタモキシフェン（８６０μｇ／４８時間；ｐｔｔｇ増加、２．４倍）の同時投与によって排除された。
本発明をいくつかの好ましい態様に関して詳しく記載したが、記載した態様および例示的開示の変更および変型は、本明細書に開示し請求の範囲に記載した本発明の意図および範囲に含まれるものと当業者は理解すべきである。
Claims (15)
- 発現ベクターでトランスフェクションした甲状腺刺激ホルモン（ＴＳＨ）感受性細胞であって、該発現ベクターは、以下：
配列番号２、配列番号４および配列番号５からなる群から選択されるアミノ酸配列を有する機能ＰＴＴＧペプチドをコードするか、または配列番号２、配列番号４または配列番号５の機能ペプチドフラグメントをコードする、ポリヌクレオチド配列を有するＤＮＡセグメント
を含み、該フラグメントは、プロリンリッチ領域を含み；該細胞は、ＴＳＨに反応して機能ＰＴＴＧを過剰発現する、甲状腺刺激ホルモン（ＴＳＨ）感受性細胞。 - 前記細胞が、ＦＲＴＬ５細胞である、請求項１に記載の甲状腺刺激ホルモン（ＴＳＨ）感受性細胞。
- 前記発現ベクターが、ｐＣｉＮｅｏである、請求項１に記載の甲状腺刺激ホルモン（ＴＳＨ）感受性細胞。
- 前記細胞が、エストロゲンに反応してＰＴＴＧをさらに過剰発現する、請求項１に記載の甲状腺刺激ホルモン（ＴＳＨ）感受性細胞。
- 哺乳動物細胞におけるＰＴＴＧによって仲介される遺伝的調節の研究用のインビトロ細胞モデルであって、請求項１に記載の甲状腺刺激ホルモン（ＴＳＨ）感受性細胞を含む、インビトロ細胞モデル。
- エストロゲンへの前記細胞の曝露がまた、前記発現ベクターからのＰＴＴＧ発現を誘発する、請求項５に記載のインビトロ細胞モデル。
- 前記細胞モデルが、ＮＩＳ発現に対するＰＴＴＧ発現の効果を研究するために使用される請求項５に記載のインビトロ細胞モデル。
- 前記細胞モデルが、ＮＩＳ発現を調節するために使用される、請求項５に記載のインビトロ細胞モデル。
- 前記細胞モデルが、甲状腺またはＦＲＴＬ５細胞でのヨウ化物取込みに対するＰＴＴＧ発現の効果を研究するために使用される、請求項５に記載のインビトロ細胞モデル。
- 前記細胞モデルが、チログロブリン発現に対するＰＴＴＧ発現の効果を研究するために使用される、請求項５に記載のインビトロ細胞モデル。
- 前記細胞モデルが、チログロブリン発現を調節するために使用される、請求項５に記載のインビトロ細胞モデル。
- 前記細胞モデルが、ＰＴＴＧ発現を調節するために使用される、請求項５に記載のインビトロ細胞モデル。
- 前記細胞モデルが、異常ＰＴＴＧ発現の作用を研究するために使用される、請求項５に記載のインビトロ細胞モデル。
- 前記細胞モデルが、ＰＴＴＧ過剰発現の効果を研究するために使用される、請求項５に記載のインビトロ細胞モデル。
- 前記細胞モデルが、ＰＴＴＧ過小発現の効果を研究するために使用される、請求項５に記載のインビトロ細胞モデル。
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