JP2006500091A - 骨及び軟骨の形成を誘導するために使用する、骨髄細胞、脱塩骨基質、及び各種部位反応性ポリマーを含む組成物 - Google Patents

Abstract

【課題】関節及び／又は頭蓋−顔面−上顎部分の骨の損傷修復の必要な患者に、移植物として、骨髄細胞と脱塩骨基質の混合物を、部位反応性ポリマーとともに、一度の移植手順で、与えること。
【解決手段】部位反応性ポリマーとともに、骨髄細胞(ＢＭＣ)及び脱塩骨基質（ＤＢＭ）又は脱塩歯基質（ＤＴＭ）を含み、さらに任意で、薬学的に受容可能な担体、付加剤、希釈物及び／又は賦形剤を含有する組成物であり、部位反応性ポリマーが生分解可能な少なくとも１つのケイ素含有反応基を含むＴＧポリマーであり、必要とする対象の関節、頭蓋−顔面−上顎骨、下顎及び上顎の歯槽骨、脊柱、骨盤、又は、長骨のいずれか１つへの間葉前駆細胞の移植に使用し、必要とする対象の骨外性骨の建設又は再建に使用し、必要とする対象の関節への又は関節の又は骨への人工的移植物の機械的又は生物学的な支持として使用される。

Description

本発明は、部位反応性ポリマーで補足した、骨髄細胞（ＢＭＣ）及び脱塩骨基質（ＤＢＭ）を含む組成物に関し、また、哺乳動物の新しい骨及び軟骨の形成誘導における、それらの新しい使用に関する。

出生後の哺乳動物で損傷の修復をしたり喪失部分の骨の置換をしたりする場合等において、新しい骨の形成が起こるのは、次の三つの必須構成要素がある場合に限られる。つまり、（i）間葉前駆細胞；（ii）間葉前駆細胞を浸透、定着させるためのコンダクティブな足場；（iii）軟骨形成と骨形成を誘導する活性因子の三つである。また、特定の機械的機能を持った硬組織の損傷の修復又は補充を成功させるためには、組織再生中の機械的力に耐えて、形状の完全性と安定性を備えられるような移植物でなければならない。残念ながら、一般的には、局所的状態は骨形成のための必要条件を満たしておらず、このため、喪失、損傷、又は破壊した骨の置換は自発的には起こらない。

これら三つの構成要素については、ある程度、以前の研究で既に明らかにされている。

骨髄中には、大きな増殖力を持ち、軟骨、骨、腱、筋肉、脂肪などに分化することのできる多能性間葉幹細胞が存在することが示されている。[Caplan, A.I. (1991) J Orthop Res 9:641-650; Prockop J.D.(1997) Science 276:71-74;Pittehger,M.F. et al.(1999) Science 284:143-147; Wakitani, S.W. et al.(1995) Muscle & Nerve 18:1417-1426].

ＤＢＭは、間葉細胞が細胞懸濁液として導入されるときには常に、間葉前駆細胞の植え付けを促進するため、また骨及び軟骨の形成過程において間葉前駆細胞の増殖と分化を促進するために必須の、支持物質あるいは支持構造物としての役割を果たすことが示されている（本発明者の発明者の未公開の実験結果）。ＤＢＭは軟骨及び骨再生のためのコンダクティブな足場として働く一方で、軟骨形成と骨形成の両方を誘導するための自然の源を提供し、このようにして、必要とされる誘導的性質及びコンダクティブな性質の全てを併せ持っている。ＤＢＭには、さらに、簡単に言って次のような利点がある。（i）機械的な柔軟性があり、ゆっくりと生物分解し、ＤＢＭの分解時間が新しい軟骨及び骨形成の期間と適合しており；（ii）新しい骨及び軟骨の形成期間中、少なくとも部分的に、扁平骨及び関節面の生体力学的な特性を与えるのに十分な強度を持っている；（iii）大きな外科的介入なしに局所的に挿入でき、医原性の損傷を避けることのできるような、無定形の粉末の形で使用できる；（iv）異種移植物として使用しても免疫原性の低い材料であり、同種の組み合わせにおいて使用した場合には実用上免疫原性がない[Block, J.E. and Poster, J. (1995) Med Hypotheses 45(1):27-32; Torricelli, P. et al. (1999) Int Orthop 23(3):178-81;Hallfeldt, K.K. et al. (1995) J Surg Res 59(5):614-20]。

最も重要なこととして、ＤＢＭはまた、骨形態発生タンパク質（ＢＭＰ）（骨及び軟骨形成において重要な役割を果たす成長因子）の自然の発生源の一つであることである[Ducy, P. and Karsenty, G. (2000) Kidney Int 57(6):2207-14; Schmitt, J.M. et al.(1999) J Orthop Res 17(2):269-78]。さらに、軟骨及び骨の誘導は、ＤＢＭとともに、ＢＭＰ（ＢＭＰには種特異性もない）[Sampath, T.K. and Reddi, A.H. (1983) Proc Natl Acad Sci USA 80(21): 6591-5;Bessho, K. et al. (1992) J Oral Maxillofac Surg 50(5):496-501]を体外から追加的に供給することによってさらに強化することもできる[Neiderwanger, M. and Urist, M.R. (1996) J Oral Implantol 22(3-4):210-5]。

関節症とは、軟骨の変形性変化、及び関節の縁における骨の肥大によって起き得る慢性進行性関節疾患のグループのことを言う。関節症は、外傷、炎症性疾患（自己免疫疾患又は感染性疾患）、代謝性疾患、神経性疾患に続いて起こることがある。遺伝的要因と器質的要因も、追加的要因として関節症の病因となる場合がある。

損傷性又は変形性の関節症において、健全な関節面を取り戻すには、軟骨及び軟骨下骨の両方を対象とした治療に取り組むことが必要となる。

損傷した軟骨を置換するため、様々な試みが行われてきた。以下に、例をあげる。
1． 繊維性修復組織を形成するための、軟骨下骨からの骨髄の刺激。
2． 骨軟骨の移植（同種移植及び自己移植）。
3． 自己培養軟骨細胞又は間葉細胞の移植。
4． 軟骨細胞と、様々な基質を組み合わせた移植。
5． 機械的関節の人工移植。

これらの方法にはそれぞれ限界と短所があり、また多くは高価で、負担が大きく、非効果的で、どちらかと言えば非実用的である。自己骨軟骨移植片は、2 cm²までの小面積の軟骨損傷に限られ、また、提供部位に不快感、感染症、病的状態を引き起こす可能性がある。同種骨軟骨移植物は免疫原性があり、このため、一生の間、危険で望ましくない免疫抑制剤を使用しなければならず、定常的な整形外科の処置方法としては非実用的であると考えられる。 培養軟骨細胞の移植は二段階の処置を必要とし、負担が大きく、非常に高価でもある。移植後に形成される硝子様組織の生体力学的性質は最善とは言えない [Gilbert, J.E. (1998) Am J Knee Surg 11(1):42-6; Temeno, J. S. and Mikos, A. G. (2000) Biomaterials: Tissue Engineering for Regeneration of Articular Cartilage, 21:431-440; Buckwalter, J.A. and Mankin, H.J. (1998) Instr Course Lect 47:487-504; Stocum, D.L. (1998) Wound Repair Regen. 6(4):276-90]。このため、軟骨の十分な修復という問題を解決するには至っていない。

現在のところ、骨及び軟骨の移植用材料として最も一般的に使用されているのは自己移植物である。 しかし、自己移植物の使用には、提供部位の不快感、感染症、病的状態などの制約があり、また利用可能な移植片のサイズと形状も限られている。たとえ十分な組織が移植されたとしても、移植された分化骨組織の中に存在する高い増殖能力を持つ間葉幹細胞の数の面で、非常に大きな制約がある。

最も有望な方法は、硝子軟骨と軟骨下骨との両方を形成できる細胞と、骨と軟骨の形成と維持を誘導／コンダクト、支持する手段となる基質とを組み合わせて移植することであると考えられる。

細胞と基質を組み合わせた移植物の使用を成功させる方法に関して、以下の基本的必要条件があることが広く認められている。
1. 体重を支持している関節の消耗を連続的に修復するには、軟骨細胞に分化する能力を持った前駆細胞の豊富な源が必要。
2. 細胞接着用のコンダクティブな足場が維持され、硝子軟骨の形成を導かなければならない。
3. コンダクティブな足場は、非免疫原性で毒性がなく、新軟骨の形成にと同時に生分解可能でなければならない。
4. 間葉前駆細胞からの軟骨細胞の形成を促進するための条件が必要。

これまでのところ、細胞と基質の組み合わせ移植物に試された基質のほとんどは、免疫原性があるか生分解性がなく、残る他の基質には、生体力学的に強い軟骨の形成を支持するのに必要なコンダクティブな性質又は誘導性がなかった。細胞と基質の組み合わせ移植物に使用された細胞は、多くの場合、軟骨細胞であったが、軟骨細胞は既に完全に分化した細胞であり、比較的に代謝活性が低く、自己再生能力が限られている。軟骨細胞の増殖力は、健全な軟骨を維持するには十分かもしれないが、大きな面積の硝子軟骨を新たに形成するには、確かに不十分である。間葉前駆細胞の同種移植物は、免疫原性があることに加えて、最適な支持基質と組み合わせて使用されることがなかった。このため, 残念なことに、実施可能な選択肢はいずれも基礎的必要条件の全てを満たすことができず、いずれの選択肢も、信頼できる定常的な臨床応用方法として満足であるとはとても言い難かった。

WO02/070023（参照により、本明細書中に完全に引用したものとする）には、損傷した関節に投与して、予め間葉前駆細胞を培養することなしに、一度の移植手順で硝子軟骨と軟骨下骨をともに置換及び／又は修復できる、ＢＭＣ及びＤＢＭ及び／又はMBMを含む組成物について記載されている。 PCT/IL02/00172 に示されているように、ＢＭＣ とＤＢＭという二つの成分を同時に使用することは、移植部位に新しい骨と軟骨を形成するための必要十分条件である。 この方法は、骨及び軟骨形成の能力を開始及び／又は向上させるために、効果的に使用することができる。この方法は、(i) 関節における損傷した骨軟骨複合組織の修復、(ii)（治療及び美容を目的とする）頭蓋−上顎−顔面部分の骨の修復又は補充に非常に効果的であることがわかっている。この組成物は、移植部位の局所的条件に応じて、新しい骨及び軟骨の形成を誘導した。新組織の形成は分化の道筋に沿って行われ、局所的条件に従って、異なる種類の骨及び軟骨を形成する。こうして、新たに形成された組織は、正確に局所的要求を満たすようになる。

損傷した骨及び軟骨の構造をＢＭＣ-ＤＢＭ組成物の移植によって補充することに関しては、組織再生期間中の機械的作用に耐えながら、移植物の完全性と形状の安定性を保つことができ、一方で、投与の簡便性も維持されることが、成功のための大きな前提条件の一つである。

このため、注射可能で通常比較的非粘性の組成物を、損傷した関節又は骨に投与する際には、組成物が注射部位から移動して無くならないように、骨及び／又は軟骨の誘導が十分に開始され達成されるまでは、患者を安静に動かない姿勢に保つことが必要となると考えられる。この方法を改良するため、本発明の発明者は、改良された組成物を開発した。改良された組成物は、ＢＭＣとＤＢＭに加えて、室温で液体（このため注射可能）、体温でゲル状となる、部位反応性ポリマーを含む。本発明の主要な目的の一つである本組成物は、注射部位に安定した蓄積を形成し、このため、移植物の完全性と形状の安定性を維持することができ、同時に、組織再生期間を通じて、レシピエントの必要条件を一時的に満足するのに必要な機械的性質を与えることができる。

つまり、ＤＢＭとＢＭＣを含む活性な骨及び軟骨再生用の複合物に、ポリマー材料を追加して補うことには、以下のような目的がある。
1. 移植された複合物の完全性と形状を維持する。
2. 移植された複合物に、組織再生期間を通じて、生体の必要条件（物理的、機械的圧力に耐えるなど）を一時的に満足するのに必要な機械的性質を与える。

本発明の発明者は、興味深いことに、生体適合性のある部位反応性ポリマーの追加によって、これらの目的が達成されることを発見した。

このため、ＢＭＣ-ＤＢＭ活性複合物の性質を改良するために、以下の特徴を有する補足物質を補ってもよい。

1. 前記補足物質は、骨及び／又は軟骨の形成過程において、間葉前駆細胞の増殖と分化に適合していなければならない。
2. 前記補足物質は、体液中で、ゆっくりと生分解あるいは溶解可能で、分解時間が、新しい軟骨及び骨の形成期間と適合していなければならい。
3. 前記補足物質は、 非免疫原性でなければならない。
4. 前記補足物質は、活性複合物（ＤＢＭ及びＢＭＣ）の成分と混合できるような形状（状態）で提供されなければならない。
5. 前記補足物質は、活性複合物との混合後は、新組織形成期間中、複合物の完全性と形状が維持され、移植物に生体力学的特性が付与されるよう、複合物を十分な強度にすることができなければならない。

本発明の発明者は、今回、部位反応性ポリマー（補足物質としては、可逆熱ゲル化ポリマー（ＲＴＧ）でも、水の存在下で、不活性で安定なSi-O-Si結合を形成することのできる反応性のケイ素系骨格を有する改質されたポリマーでもよい）を使用すると、これらの必要条件を満足することができ、以下の例に記載したような大変目覚しい結果が導かれることを発見した。

生体材料とは、人体にとっては異物であるが、人体の臓器、組織、体液と直接接触して使用できる材料である。生体材料には、ポリマー、セラミック、生体物質、金属、及び、それらの複合材料と組み合わせ等が含まれる。ポリマー生体材料の主要な必要条件は、注射できること、つまり、外科的処置を必要とせずに移植するのに適していることである。注射可能ポリマーは、注射段階における（室温での）低粘性と、その後体内で出現する（体温での）ゲルあるいは固体としての硬さを併せ持っている。注射可能な生体ポリマーにおいては、注射可能性が、最も重要な利点である。何故なら、注射可能性のおかげで、そのような生体ポリマーを、低侵襲性技術を使用して体内に導入できるからである。さらに、そのような生体ポリマーは、注射時に低粘度で十分な流動性を持っていることにより、他の方法ではアクセス不可能なスペースに到達してそのスペースを満たすことができ、また、移植部位における組織への接着性と適合性も一層良好である。一方、これらの材料が物理的あるいは機械的機能を実現できるためには、粘度の急激な増加が基本的必要条件である。高粘度であることは決定的な役割を果たしており、この性質のおかげで、形成注射材料は、いったん移植部位に注射されると、薬の放出速度を制御したり、細胞増殖のため、また、組織の足場となるのための、基質として機能したりすることができる。また、生分解性も、これらの材料の一部にとって重要な必要条件の一つとなることは、明らかである。

US 5,939,485 は、温度、ｐＨ 、イオン強度といった様々な環境の刺激の変化によって引き起こされる可逆的ゲル化特性を示す、反応性ポリマーネットワークについて開示している。US 6,201,065は、水溶液中でゲル化することができ、共有架橋結合によって生体内の組織表面上にゲルを形成することのできる、ＰＥＯ‐ＰＰＯ-ＰＥＯトリブロックコポリマーなどのような、架橋結合可能ポリオールをベースとする熱反応性のマクロマーについて開示している。これらのゲルは、ドラッグ・デリバリ等、様々な医療の用途に有益である。

「感熱性」という用語は、ポリマーシステムが、わずかな温度差によって著しい化学的、機械的、あるいは物理的変化を遂げる能力を指す。観血的外科手術を避けるためには、熱反応性材料は、注射段階での低粘度と後に体内で出現するゲル又は固体としての硬さを併せ持ち、注射容易でなければならない。

可逆熱反応現象は、一般に、可逆熱ゲル化（ＲＴＧ）としてしられている。ＲＴＧ材料の水溶液は、室温では低粘度を呈し、また、非常に狭い温度範囲内での温度上昇によって急激な粘度の上昇を示し、いったん体温に達すると半固体状のゲルとなる。ポリ（N-イソプロピルアクリルアミド）（PNIPAAｍ）等、いくつかのポリマーが、ＲＴＧを呈するポリマーとして知られている(US 5,403,893他)。 残念ながら、N-イソプロピルアクリルアミドには毒性があり、さらに、ポリ（N-イソプロピルアクリルアミド）は非分解性であり、この結果、生分解性が必要とされる場所には適さない。

ＲＴＧを呈す材料の内で最も重要なものの一つに、ポリ（エチレンオキシド）／ポリ（プロピレンオキシド）／ポリ（エチレンオキシド）(ＰＥＯ-ＰＰＯ-ＰＥＯ)トリブロックコポリマーの仲間で、プルロニック（登録商標） として市販されているものがある(US 4,188,373)。ポリマーの濃度を調節することによって、所望の液−ゲル遷移が得られるが、とは言うものの、比較的高濃度のトリブロックコポリマー（一般的には15〜20％より高濃度）が必要である。室温では液体で、ほぼ体温まで温まったときに半固体になるものとして知られているもう一つのポリマー系がUS 5,252,318に開示されている。このポリマーシステムは、エチレンジアミンと縮合したポリオキシプロピレン及びポリオキシエチレンの四官能基性ブロックポリマーからなる（テトロニック（登録商標）として市販されている）。

しかしながら、既知のＲＴＧポリマーのほとんどは、37℃まで加熱されたときに著しい粘度の上昇を示すとは言うものの、得られる粘度レベルは、多くの臨床応用にとって十分高いとは言えない。この基本的制約のために、これらのシステムは満足な機械的性質を呈さず、また移植／注射部位における滞留時間も許容不可能なほど短い。さらに、これらの性質が原因で、これらのゲルは透過性が高く、このため、これらのゲルは薬の放出速度が速く、ドラッグ・デリバリの用途には適さない。臨床応用の可能性にも関わらず、これらの材料は、重大な性能上の制限のため、臨床での使用に成功することがなかった[Steinleitner et al., Obstetrics and Gynecology, 77, 48 (1991); Esposito et al., Int. J. Pharm. 142, 9 (1996)]。

生分解性は、様々な機器、移植物、人工器官において独特の役割を果たす。生分解性ポリマーは、体から取り除く必要がなく、生物活性分子放出用の基質として役立つことができ、結果として、治癒と組織再生過程の向上につながる。α−ヒドロキシ酸（乳酸、グリコール酸など）のポリエステルなどの生分解性ポリマーは、吸収性外科用縫合糸及びステープル、いくつかの整形外科用及び歯科用装置、ドラッグ・デリバリ・システムや、さらに進んだ用途として、選択的生分解性のある血管移植片の吸収性構成要素や、組織工学用の一時的足場など、様々な用途に使用されている。不安定なバックボーン連鎖をもった生分解性のポリ無水物、ポリオルトエステルも、開発されている。ポリアミノ酸など、天然の物質に分解するポリマーも合成されている。ラクタイド、グリコライド、ε-カプロラクトンの共重合によって生成された分解性ポリマーについては、開示がなされている。親水性を高め、分解速度を上げるために、ラクタイド、グリコライド、又はε-カプロラクトンをポリエチレン・グリコール（「ＰＥＧ」）などのポリエーテルと共重合させたポリエステルエーテルが作られている。

残念ながら、今日臨床利用可能な少数の吸収性ポリマーはいずれも、硬い疎水性の固体であり、このため、注射可能性が基本的必要条件であるような、非侵襲性又は低侵襲性の外科処置には、明らかに適していない。これらのポリマーで外科処置を避けるための唯一の方法は、これらのポリマーを、マイクロもしくはナノ粒子又はカプセルとして（通常、これらの中に放出するべき薬を入れる）にして注射する方法である。一例を挙げると、水溶性粘性ポリマーゲルに入れたリン酸カルシウム粒子を含む注射可能移植物が、US 5,204,382の中で、最初に提案された。これらのポリマー中にセラミックを成分として入れても一般的には毒性がないと考えられえているが、非吸収性の粒子状材料を使用することは、移植部位だけでなく、粒子の経時的移動により、移植部位と離れた部位でも、異物反応の誘因となると考えられる。

もう一つの方法は、US 4,938,763に記載されている体内析出法である。この方法では、ポリマーを溶解できる水溶性の有機溶媒を使用する。いったん、このシステムが注射されると、有機溶媒が徐々に水性の生体媒質中に溶け出していき、後には徐々に濃度の高くなったポリマー溶液が残され、ついにはポリマーが析出して体内で固体状移植物となる。

注射可能なポリマー系を作るのに使用される他の重要な技術としては、他に、体内での重合又は架橋結合がある。例えば、US 5,410,016 には、少なくとも二つの重合基を持ち、移植部位に注射された後、化学的に、また好ましくはそのシステムをＵＶ又は可視光に曝すことによって、その場で重合又は架橋結合するような、水溶性で低分子の前駆物質について記載されている。Langer他のグループは、ＵＶ光を使用した前駆物質の経皮的重合に基づいて、注射可能なポリマーシステムを開発した[Biomaterials, 21, 259-265 (2000)]。その他の方法としては、US 5,824,333 に、軟組織の修復に適した、疎水性生体吸収性液体コポリマーの注射に基づく方法が開示されている。

プルロニック（登録商標）のような既知のＲＴＧポリマーを、本発明で使用するＢＭＣ-ＤＢＭ複合物の補足として使用することもできるが、本発明の発明者は、従来技術のポリマーや方法の短所の多くを克服することのできる新たなＲＴＧポリマーについても開発した。これらの新しいポリマーを骨及び軟骨の誘導及び再生に使用することもまた、本発明の目的の一つである。これらのポリマーについては、本明細書中で、後に詳述することとする。ＲＴＧポリマーに加え、本発明の発明者は、有機・無機環境によって、又は部位によって反応性を示すような、反応性「ポリマーシステム」を開発した。このポリマーシステムは、本明細書中で後に詳述するが、ケイ素を含む反応基を含み、ＲＴＧ又はその他の方法で環境的誘因に反応し得るような、少なくとも一つのポリマー成分を有することを特徴とする。このポリマーシステムを含む組成物もまた、本発明の目的の一つである。

ケイ素又は金属アルコキシドの単量体前駆物質から無機ネットワークを形成するゾル・ゲル法は、ガラス、セラミック分野など、様々な分野で広く使用されている。一般的に、ゾル・ゲル法では、三つの反応、つまり、加水分解、アルコール縮合及び水縮合が、関係している。この方法の主な長所の一つは、化学的耐久性、硬さ、光透過性、適当な気孔率、耐熱性などの、有利な性質を持った均質の無機酸化物材料を室温で生成できることである。これは、従来の無機ガラスの生成にずっと高い温度が必要とされるのと対照的である。

最も広く使用されている材料はテトラメトキシシラン（ＴＭＯＳ）、テトラエトキシシラン（ＴＥＯＳ）などのアルコキシシランである。ある種のゾル・ゲル無機ネットワークの特徴と性質に著しい影響を及ぼす要因が数多くある。中でも特に重要な要因として、温度とｐＨがあり、また、触媒の種類と濃度、水／ケイ素のモル比がある。

アルコキシド基(OR)の加水分解の結果、アルコキシド基が水酸基（OH）で置換される。それに続く、シラノール基(Si-OH)の関係する縮合反応では、シロキサン結合(Si-O-Si)と、副生成物の水又はアルコールが生成する。加水分解と縮合反応の相対的な反応速度を見ると、ほとんどの条件の下では、加水分解が完了する前に、縮合反応が開始される。縮合段階が開始される前に加水分解反応を完了させるためには、システムのｐＨやH₂O/Si のモル比、触媒の種類など様々な実験パラメータを微調整することが必要である。

重合過程は、ｐＨ=2未満、ｐＨ=2 とｐＨ=7の間、７より大きいｐＨ、の三つの異なるｐＨ領域で実施することができる。全過程は、以下の三段階で起こる。(i) まず、前駆物質の重合によって粒子が形成される。(ii) 次に、粒子が成長する。(iii) 最後に、粒子どうしが結合して、まずは鎖を形成し、その後、液状媒質全体に広がるネットワークを形成して、ゲル状に固まっていく。

加水分解反応の速度と程度は、酸又は塩基触媒の強度と濃度の両方に大きな影響を受けることが観察されている。ｐＨ値が5未満か又は7より大きいときには、反応速度が速いことが報告されている[Bourges X. et al., Biopolymers, 63, 232 (2002)]。H₂O/Si のモル比が大きいと、通常は、予想通り、加水分解が促進される。縮合反応の副産物として水が生成されるため、含水量が多いとシロキサン結合加水分解が促進されることも、強調しておくべきである。

媒質のｐＨは、縮合段階でも重要な役割をはたす。ｐＨ値が6から7の間では、反応は最も遅いペースとなり、一方、2から６のｐＨ領域及び７より大きいｐＨ領域では、反応は同様に早くなる。また、触媒がなくても縮合段階は進行し得るが、触媒の使用が有効である。酸触媒による縮合メカニズムは次の通りである。シラノール種のプロトン化の結果、ケイ素がより電子と結合しやすい状態となり、求核攻撃への感受性が高まる。塩基触媒による縮合反応として最も広く受け入れられているメカニズムは、脱プロトン化された求核性シラノールによる、中性なケイ酸の攻撃である。

得られる材料の構造について見ると、反応が酸性条件下で行われる場合には、ゾル・ゲル法によって生成された酸化ケイ素ネットワークは、主に線状又は不規則に枝分かれしたポリマーを含み、それらのポリマーが絡まり、枝が増えることによって、結果的にゲル化しているということができる。他方、塩基触媒条件の下で得られた酸化ケイ素ネットワークは、より高次に枝分かれしたクラスタを生成し、それらのクラスタは、ゲル化前にクラスタどうし互いに貫通し合うことはなく、独立したクラスタとしてふるまう。

無機・有機のテレケリックポリマーを作り出す目的で、いくつかの研究が行われてきた。例えば、 Bunel他のグループは、低分子量ポリブタジエン鎖をとトリエトキシシランとともに機能化し、それらを20℃から 80℃の範囲の温度で 30日間架橋結合させる方法について記載している[Polymer, 39, 965 and 973 (1998)]。Seppala他のグループは、ポリ乳酸の改質について報告している[Polymer, 42, 3345 (2001)]。架橋結合は、温度60℃から120℃で、触媒として硝酸を用いるという過酷な条件下で行われた。 Osaka他のグループは、ゾル・ゲル処理によって、ゼラチンと3-（グリシドキシプロピル）トリメトキシシランを組み込んだ複合材料を作成した[J. Sol-Gel Sci. Tech., 21, 115 (2001)]。Zhu他のグループは、ブチリルキトサンをシステムに組み込む有機種として使用し、シリカブチリルキトサン複合膜を作成した。ゾル・ゲル処理は、塩化水素酸とメタノール中で、室温で数日間、80℃で2時間加熱して行われた[J. Mat. Sci. Mat.Med., 14, 27(2003)]。

骨再生の目的で、リン酸カルシウム(CaP)の誘導体（アパタイト及びヒドロキシアパタイトなど）の生成と沈殿を誘起するためにシリカを使用する方法の研究も行われた。例えば、Li他のグループは、900から1000℃で焼結したシリカゲルによって、準安定リン酸カルシウム溶液から、溶液の表面にアパタイトの結晶を生ずるのを促すことができることを報告している[J. Biomed. Mat. Res., 29, 325 (1995)]。Varma他のグループは、綿繊維をテトラエトキシシランとともに機能化し、その上でのCaPの成長について研究を行った[J. Mat. Sci. Mat. Med., 12, 767 (2001)]。 Lopatin他のグループは、HAとリン酸三カルシウムを成長させるため、シリコン基板を使用した [J. Mat. Sci. Mat. Med., 12, 767 (2001)]。最後に、Nakamura他のグループは、酸化カルシウム含有ガラスを作り出し、体液を模擬した溶液と接触した際のアパタイトの形成について評価した[Biomaterials, 24, 1349 (2003)]。

体温に対して反応性のあるＲＴＧポリマーや 他の環境的誘因に反応して粘度を増すポリマーなど、環境要因に対して反応性のあるポリマーの、本発明で提案する使用は、特に整形外科及び関節治療の分野で、大きな効果があると考えられる。

このため、本発明の主要目的は、特に関節及び／又は頭蓋−顔面−上顎部分の骨の損傷修復の必要な患者に、移植物として、骨髄細胞と脱塩骨基質の混合物を、部位反応性ポリマーとともに、一度の移植手順で、与えることにある。本発明のこの目的及びその他の目的について、以下の説明の中で詳述することとする。

発明の要約
本発明は、骨髄細胞（ＢＭＣ）と脱塩骨基質又は脱塩歯基質（それぞれ、ＤＢＭ又はＤＴＭ）との混合物と、さらに部位反応性ポリマーとを含む組成物に関係し、また、（骨の形成を誘導する骨が無い場合に、）関節及び頭蓋−顔面−上顎部分に間葉前駆細胞を移植する際の、前記組成物の新たな用法に関係している。

つまり、第一の態様では、本発明は、骨髄細胞(ＢＭＣ) と脱塩骨基質（ＤＢＭ）とさらに部位反応性ポリマーを含む組成物に関係している。

第二の態様では、ＢＭＣ とＤＢＭ、さらに部位反応性ポリマーを含む前記組成物は、骨髄中に存在する間葉前駆細胞を、移植を必要とする対象の関節又は頭蓋−顔面−上顎部分に移植する用途を意図されている。ここで、前記対象とは、哺乳動物であり、好ましくは人間である。

第一の実施形態では、本発明の組成物に含まれるＤＢＭは脊椎動物由来のものであり、人間由来のものでもよい。

第二の実施形態では、本発明の組成物に含まれるＤＢＭは粉末又は粒子状である。ＤＢＭの粒子サイズは、約50μから2500μであればよい。好ましくは、前記粒子サイズは、約250μから500μである。最も好ましい粒子サイズは、個々のケースの具体的な必要性によって決まることになる。他の形式として、ＤＢＭは特に腱の再建のためにはひも状でもよく、また、大きな範囲の骨を再建するためには、より大きなＤＢＭ粒子やスライス状のＤＢＭでもよい。スライス又は大粒子は、間葉幹細胞とよく馴染むように、穴を開けてもよい。

別の実施形態では、本発明の組成物は、新しい硝子軟骨及び／又は軟骨下骨構造の形成の促進及び／又は修復を目的としている。

さらに別の実施形態では、本発明の組成物は、遺伝的又は後天的な骨の異常、遺伝的又は後天的な軟骨の異常、骨又は軟骨の悪性疾患、骨又は軟骨の変形に関係する状態、パジェット病、のいずれかを患う患者の治療を意図するものである。また、本発明は、複雑骨折の矯正、骨の置換、形成手術又は性的手術における新しい骨の形成の、いずれかを必要とする患者の治療を意図するものである。

またさらに別の実施形態では、本発明の組成物には、さらに任意で、薬学的に受容可能な担体または希釈剤、及び、追加的な活性剤が含まれてもよい。

別の態様では、本発明は、ＢＭＣとＤＢＭ及び部位反応性ポリマー、さらに任意で、薬学的に受容可能な担体又は希釈財を含む混合物を、移植の必要な対象の関節及び／又は頭蓋−顔面−上顎骨部分に移植するための方法に関係している。ここで、前記方法は、前記関節又は骨に、本発明の組成物を導入することを含む。

本発明の前記方法の第一の実施形態では、混合物は、注射、低侵襲性の関節内視鏡による処置、又は外科的関節形成術のいずれかの処置によって、移植部位へ投与される。ここで、前述の方法は、先天的又は後天的な関節及び頭蓋−顔面‐上顎骨の異常を支持又は矯正する目的、歯列矯正処置の目的、手術、外傷、又はその他の先天的・後天的異常にともなう骨又は関節骨の置換の目的、及び、その他の筋骨格移植物（特に人工的な合成移植物）を支持する目的で使用される。

このため、さらに別の態様では、本発明は、哺乳動物の軟骨及び／又は軟骨下骨の奇形及び／又は機能障害に関係する損傷性又は変形性の関節症を治療する方法に関係している。前記哺乳動物とは、その哺乳動物の患部の関節又は骨に、ＢＭＣと ＤＢＭと部位反応性ポリマーを含む混合物を投与するという治療を必要としている哺乳動物をいう。前記混合物には、任意で、さらに薬学的に受容可能な担体、希釈剤、及び／又は追加的な活性剤を含めてもよい。

実施形態の一つでは、投与される混合物中のＢＭＣ は、前記哺乳動物自身のものであるか、又は同種のものである。

別の実施形態では、投与される混合物中のＤＢＭは、粉末、ゲル、半固体、又は固体状で、ポリマー材料又は生分解性材料に埋め込まれるか、又はカプセル化されている。

またさらに別の態様では、本発明は、移植の必要な対象の関節又は頭蓋−顔面−上顎骨部分に移植物を導入することを含む、関節の移植物その他の筋骨格移植物を支持するための非侵襲性（注射による）、低侵襲性（関節内視鏡による）、又は外科的移植方法に関係する。ここで、前記移植物は、ＢＭＣとＤＢＭ、及びSＲＴＧポリマーの混合物を含む。

またさらに別の態様では、本発明は、ＢＭＣとＤＢＭ、さらにポリマーを含む組成物を、哺乳動物に移植するための間葉細胞及び／又は間葉前駆細胞の移植物として使用することに関係する。ここで言う哺乳動物とは、好ましくは人間である。移植は、新しい骨及び／又は軟骨の形成を目的として、関節又は頭蓋−顔面−上顎骨部分の中に行われるものとする。

さらに、前記移植に使用される組成物は、遺伝的又は後天的な骨の異常、遺伝的又は後天的な軟骨の異常、骨又は軟骨の悪性疾患、骨又は軟骨の変形に関係する状態、パジェット病の、いずれかを患う患者の治療を意図するものである。また、前記組成物は、複雑骨折の矯正、骨の置換、形成手術又は性手術における新しい骨の形成の、いずれかの必要な患者の治療を意図するものである。

実施形態の一つでは、本発明で使用される組成物には、さらに追加的な活性剤が含まれる。

別の実施形態では、本発明の組成物に含まれるＤＢＭは脊椎動物由来であり、人間由来であってもよい。形状は、好ましくは粉末状である。

別の態様では、本発明は、骨又は軟骨の異常の治療のための移植物を作成する際に、ＢＭＣとＤＢＭの混合物をポリマーとともに使用することに関係している。

最後に、本発明では、関節への、又は頭蓋−顔面−上顎骨部分、長骨、骨盤、脊椎の再建のための、又は上顎と下顎の歯槽骨の増加による歯の支持のための、又は哺乳動物の人工的造血髄作成のための、ＤＢＭ及び部位反応性ポリマーと混合したＢＭＣ移植実施用のキットを提供する。ここで、前記キットには以下のものが含まれる。

(a) 粉末状、又は成型されたＤＢＭ (例えば、腱の再建用にはひも状、大きな部分の骨の再建用にはより大きなＤＢＭ粒子など)。
(b) 部位反応性ポリマー。
(c) ＢＭ吸引用針。
(d) 骨内骨穿孔用バー。
(e) 骨髄-ＤＢＭ-部位反応性ポリマーの粘性の混合物を注入するための内腔の大きい針。
(f) ＢＭＣをＤＢＭ及び部位反応性ポリマー及び希釈剤と同時に混合するための、二方向内腔コネクタ。
(g) ＢＭＣを維持するための媒質。
さらに、任意で以下のものが含まれる。
(h) 骨形成を促す追加的要素。
(i) ＢＭＣ又はＢＭＣとＤＢＭを、取り扱い、維持するための低温手段。

本発明のキットに含まれる部位反応性ポリマー溶液は、投与部位で所望の粘度変化を起こし、その場で蓄積を形成するように調整されたものであれば、ＲＴＧポリマーでも、その他の方式で反応するポリマーであってもよいと解されるべきである。

本発明のキットは、さらに任意で、ＢＭＣ及びＤＢＭ及び部位反応性ポリマーの混合物用の担体及び／又は希釈剤を含んでもよい。

本発明の組成物には、既知のポリマーであるプルロニック F127、F108など、適する部位反応性ポリマーであれば何を使用してもよいが、中でも好ましいポリマーがいくつかある。特に好ましいポリマーとしては、「非侵襲的外科処置のための新しい感熱性ブロックコポリマー」の表題のイスラエル出願No. 151588（2002年8月15日出願）の目的である新規のポリマー、及び、本発明の発明者の公表した新規のポリマーである[Cohn D. and Sosnik A., J. Mat. Sci. Mater. Med. 2003; 14:175-180]。これらの内容は、参照することによって、本明細書中に完全に引用したものとする。これらの、特別に設計された生分解性可逆熱反応性ポリマーは、人体への移植、特に組織修復のための一時的足場提供のために効果的であり、従来技術のポリマーの欠点の多くを克服している。これらのポリマーは、共有結合によって、疎水性セグメントと親水性セグメントを結合させている。所望の可逆熱ゲル化（ＲＴＧ）の挙動を得るためには、分子内でのそのようなセグメントのバランスが支配的役割を果たす。

本発明の組成物として最も好ましいのは、「可逆熱ゲル化」現象の特異性を最大限に活用してオーダーメードで作られた組成物である。ここで起こる吸熱相転移は、ポリマー骨格中の疎水基に結合した水分子の分離によって得られたエントロピーによって促進される。このため、分子量の要素や鎖の移動度のパラメータに加えて、分子中の親水部と疎水部の間のバランスが決定的な役割を果たすことが明らかである。この結果として、様々な成分の基本的な化学的性質、組成、分子量の違いを利用し、様々な材料の性質の調節、調和を行った。

より具体的には、好ましい実施形態の一つでは、本発明の組成物又は方法に使用可能なＲＴＧポリマーは以下のような一般化学式を持つポリマーからなるグループの中から選択される。
(a) [-X_n-A-X_n-E-B-E-]_m ：本明細書中では化学式 Iaとして定義する。
(b) [-X_n-B-X_n-E-A-E-]_m ：本明細書中では化学式 Ibとして定義する。
(c) M-X_n-E-B-E-X_n-M ：本明細書中では化学式IIaとして定義する。
(d) N-X_n-E-A-E-X_n-N ：本明細書中では化学式IIbとして定義する。
(e) [-X_n-A(X_n)_y(E)_y(B)_y-X_n-E-B-E-]_m：本明細書中では化学式IIIaとして定義する。
(f) [-Xn-B(Xn)y(E)y(A)y-Xn-E-A- E-]m ：本明細書中では化学式IIIb として定義する。

ここで、Aは二官能性、三官能性、多官能性の親水セグメント、Mは単官能性の親水セグメント、Bは二官能性、三官能性、多官能性の疎水セグメント、Nは単官能性の疎水セグメント、Xは二官能性の分解性セグメント、Eは二、三、多官能性の鎖展延剤又は結合剤、nとmはそれぞれの重合度、ｙは対応するセグメントの追加官能性（ここでは、y>2である）を示す。

特に好ましい実施形態の一つでは、Aは、-OH、-SH、-COOH、-NH₂、-CN又は‐NCO基のような官能基を持つ、ポリオキシエチレン又はポリエチレングリコール（ＰＥＧ）の単位(O-CH₂-CH₂)_y [yは重合度を示す]によって与えられる。この結果、Aは、ポリ（オキシエチレントリオール）、ポリ（オキシエチレントリアミン）、ポリ（オキシエチレントリアカルボン酸）、エトキシル化トリメチロルプロパン、又は他の多官能性親水セグメントを表してもよい。

特に好ましい実施形態の一つでは、Bは、-OH、-SH、-COOH、-NH₂、-CN、又は-NCO基のような官能基を持った、ポリ（プロピレングリコール）（PPG）の単位[-O-CH(CH₃)-CH₂]_y[ここで、yは重合度を示す]のような、ポリオキシアルキレン（ここでは、アルキレンは3個以上のC原子を含む）によって与えられる。この結果、Bは、ポリオキシプロピレンジアミン(登録商標Jeffamine)、又はポリテトラメチレングリコール(PTMG)、又は、ポリ（カプロラクトン）、ポリ（乳酸）、ポリ（グリコール酸）、又はそれらの結合もしくはコポリマーからなるグループから選択されるポリエステル、又はポリアミド、又はポリ無水物、又は適当な官能基を持つ他のいずれかの二官能基性の疎水セグメントを表してもよい。三官能性の疎水セグメントは、ポリ（オキシプロピレントリオール）、ポリ（オキシプロピレントリアミン）、ポリ（オキシプロピレントリアカルボン酸）、又は他の三官能性の疎水セグメントからなるグループから選択できる。

Eは、好ましくは、二官能基性の反応性分子に由来する、鎖展延剤又は結合用セグメントであり、好ましくは、フォスゲン、脂肪族又は芳香族のジカルボン酸、又はそれらの反応性誘導体の塩化オキサリル、塩化マロニル、塩化スクシニル、塩化グルタリル、塩化フマリル、塩化アジポイル、塩化スベロイル、塩化ピメロイル、塩化セバコイル、塩化テレフタロイル、塩化イソフタロイル、塩化フタロイル及び／又はそれらの混合物からなるグループから選択される。Eはさらに、グリシン、アラニン、バリン、フェニルアラニン、ロイシン、イソロイシンなどのアミノ酸、RGD (Arg-Gly-Asp)、 RGD(S) (Arg-Gly-Asp(-Ser))などのオリゴペプチド、エチレンジアミン、プロピレンジアミン、ブチレンジアミンなどの脂肪族又は芳香族のジアミン、エチレンジオール、プロパンジオール、ブチレンジオールなどの脂肪族又は芳香族のジオール、ヘキサメチレンジイソシアナート、メチレンビスフェニルジイソシアナート、メチレンビスシクロヘキサンジイソシアナート、トリレンジイソシアナート、イソフォロンジイソシアナートなどの脂肪族又は芳香族のジイソシアナートによって与えられてもよい。三官能基性の反応性分子は、塩化シアヌル、トリイソシアナート、トリアミン、トリオールでもよく、リシン、セリン、トレオニン、メチオニン、アスパラギン、グルタミン酸塩、グルタミン、ヒスチジン、オリゴペプチドなどの三官能基性のアミノ酸でもよい。Eはまた、同一分子中に、上述の官能基の組み合わせを含んでもよい。反応生成物は、ポリ（エーテルカルボネート）、ポリ（エーテルエステル）、ポリ（エーテルウレタン）、又はクロロトリアジンの誘導体であり、最も好ましくは、ポリ（エーテルカルボネート）、ポリ（エーテルエステル）、ポリ（エーテルウレタン）、ポリイミド、ポリウレア、及びそれらの組み合わせである。

好ましい実施例の一つでは、Mは、-OH、-SH、-COOH、-NH₂、-CN 又は-NCO基などの官能基を持つ、親水性のポリオキシエチレン又はポリエチレングリコール（ＰＥＧ）の単位(O-CH₂-CH₂)_y-OCH₃ [ここでは、yは重合度を示す]のいずれかのモノメチルエーテルによって与えられる。

好ましい実施例の一つでは、Nは、-OH、-SH、-COOH、-NH₂、-CN 又は-NCO基などの官能基を持つ、疎水性のポリ（プロピレングリコール）（PPG）の単位[-O-CH(CH₃)-CH₂]_y-OCH₃ [ここでは、yは重合度を示す]のいずれかのモノメチルエーテルによって与えられる。

本発明の組成物及び方法に使用可能なＲＴＧポリマー中の生分解性Xセグメントは、好ましくは、加水分解に対して不安定であり、また、脂肪族又は芳香族のエステル、アミド、及び、アルファヒドロキシカルボン酸単位から作られるそれらの無水物誘導体、又はそれらそれぞれのラクトンであることを特徴とする。

本発明に関しては、使用すべき最も好ましいＲＴＧポリマーは、疎水性と親水性の両方の基本セグメントの結合によって得られた両親媒性物質を含む。この基本セグメントは、個々のセグメントとしては何ら臨床的に意味のある粘度変化を示さないが、所定の体内部位と水性ベース溶媒において成立する誘因に反応して、急激な粘度上昇につながるような遷移を起こすことができるものである。ここで、前記ポリマー成分の粘度は、所定の誘因に曝されたときに、少なくとも2倍に上昇するものとする。

より具体的には、本発明で使用される最も好ましいポリマーは、所定の体内部位での温度変化に反応して、急激な粘度上昇につながるような転移を起こすことができるものである。ここで、前述のポリマー成分は、少なくとも二つの官能基を持つ少なくとも一つの鎖展延剤又は結合剤によって、そのポリマー成分内で共有結合によって結合した親水性と疎水性のセグメントを含む。またここで、親水性セグメントと疎水性セグメントは、それ自体では、臨床的に意味のある温度においては可逆熱ゲル化のふるまいを示さず、また、前記ポリマー成分の粘度は、所定の誘因にさらしたときに少なくとも2倍に上昇するものとする。

本発明のさらに好ましい実施形態においては、前記反応性成分は、ポリエチレンオキシド（ＰＥＯ）及びポリプロピレンオキシド（ＰＰＯ）鎖を含む、セグメント化ブロックコポリマーである。ここで、前述のＰＥＯ及びＰＰＯ鎖は、鎖展延剤によって結合されており、前記鎖展延剤は、二官能基性、三官能基性、多官能基性の分子であり、次の内のいずれかである。つまり、フォスゲン、脂肪族又は芳香族のジカルボン酸、塩化アシルと無水アシルなどの、それらの反応性誘導体、ジアミン、ジオール、アミノ酸、オリゴペププチド、ポリペプチド、塩化シアヌル、又は他の二官能基性、三官能基性、多官能基性の結合剤、又は他の分子で、合成又は生物に由来し、一、二、三、又は多官能基性の-OH、-SH、-COOH、-NH₂、-CN又は-NCO基を端末に持つ疎水性及び親水性の成分と反応できるもの、又は、他の二官能基又は三官能基性のセグメント、及び／又はそれらの組み合わせ、のいずれかである。

（発明の詳細な説明）
次の略語が本明細書を通して用いられている。
・ＢＭ：骨髄（bone marrow）
・ＢＭＣ：骨髄細胞（bone marrow cell(s)）
・ＢＭＰ：骨形態発生タンパク質（bone morphogenetic protein）
・ＤＢＭ：脱塩骨基質（demineralized bone matrix）
・ＤＴＭ：脱塩歯基質（ＤＢＭとＤＴＭは交互に用いられている）（demineralized tooth matrix (ＤＢＭ and ＤＴＭ are used herein interchangingly)）
・ＬＣＭ：レーザー顕微解剖（Laser Capture Microdissection）
・ＭＢＭ：石灰化した骨基質（mineralized bone matrix）
・ＰＣＲ：ポリメラーゼ連鎖反応（polymerase chain reaction）
・ＰＩＣ：ピクリン酸インジゴカルミン、組織染色に用いられる染料（Picroindigocarmin, a dye used in histological staining.）
・ＲＴＧ：可逆熱ゲル化（ポリマー）（Reverse thermogelating(polymer)）.

ＢＭＣ（骨髄細胞）とＤＢＭ（脱塩骨基質）を含む組成物を移植物として用いることによって、関節及び頭蓋-顔面-上顎骨部分における損傷した骨軟骨複合組織の再生を向上させることを研究する過程で、本発明の発明者は、ＢＭＣ（骨髄細胞）とＤＢＭ（脱塩骨基質）を含む組成物にたいする高粘性ポリマーの添加によって、注射部位に蓄積が形成され、移植部位から前記ＢＭＣとＤＢＭの混合物が移動してなくなることを防止することを見出した。さらに、本発明の発明者は、興味深いことに、単なる高粘性ポリマー（室温で注射不可能である可能性がある）の使用ではなく、部位反応性ポリマー、例えば熱ゲル化の性質を備えたポリマー（室温温度で液体であるため注射可能であり、さらに体温でゲル化し、所望の蓄積を形成する）を提案する。所望の蓄積の形成は、組織再生期間中、一時的にレシピエントの要求を満たすのに必要な機械的性質を提供し、移植物の形状の完全性と安定性の維持を可能にする。本明細書中で使用される体温という用語は、３５℃と４２℃の間の温度、好ましくは３７℃前後、特に好ましくは３７℃を意味している。例えばＲＴＧポリマー等の部位反応性ポリマーの添加は、局所的条件に従って様々な種類の骨及び軟骨を生成する分化の道筋に従って起こる新組織形成に悪影響を及ぼすことはない。このように、新しく形成された組織は局所的な要求に正確に合致する。

本発明は、ＢＭＣ（骨髄細胞）とＤＢＭ（脱塩骨基質）と部位反応性ポリマーの混合物を含む組成物、及び、関節と頭蓋-顔面-上顎骨への間葉前駆細胞の移植における前記組成物の新規な使用に関するものである。

最初の態様において、本発明は、ＢＭＣ（骨髄細胞）とＤＢＭ（脱塩骨基質）と生体適合性のある部位反応性ポリマーを含む組成物に関する。

ＤＢＭは、間葉前駆細胞用の優れた担体であるために必要なすべての要素を併せ持つという有利な能力の点で、本発明の組成物における必須の要素である。ＤＢＭの性質は次のように要約される。
１．ＤＢＭは、骨及び軟骨の形成過程において、間葉前駆細胞の植付け、増殖及び分化をコンダクトするのに必須の、足場となり得る。
２．ＤＢＭは、骨軟骨形成を促すように作用するＢＭＰの天然の発生源であり、このため、誘導機能をも実行する。
３．ＤＢＭはゆっくりと生分解され、分解時間が、新しい骨及び軟骨形成期間と適合する。
４．ＤＢＭは、異種移植物として使用されるときは、非常に低い免疫原性を示し、同種の組合せにおいて使用されるときには、実用上非免疫原性である。

部位反応性ポリマーは、可逆熱ゲル化ポリマー（ＲＴＧpolymer）であるか、又は、例えば、ペーハー(ｐＨ)やイオン強度等の体温以外の要因に反応するポリマー、又は体温に加えてペーハー(ｐＨ)やイオン強度等の要因に反応するポリマーであってもよい。特殊な実施形態の一つとして、部位反応性ポリマーは、少なくとも１つのケイ素含有反応基を含むポリマーシステムでもよい。このシステムのポリマー成分は、ＲＴＧポリマーか他の反応性ポリマー、又はそれらの組合せでもよい。

本発明の組成物に使用される部位反応性ポリマーは、主として、骨及び軟骨形成過程における間葉前駆細胞の増殖と分化との優れた適合性、免疫原性の欠如、活性複合物の成分（ＤＢＭとＢＭＣ）と混合できるような室温での液体状態と注射可能性、及び、投与部位で、例えば体温、ペーハー、イオン強度等の要因に反応して粘性を増加させる能力、を備えている。

ポリマー補足物は、活性な複合物と混合すると、複合物を十分に強くすることができ、移植の際に複合物が完全性と形状を維持できるようになり、また、新組織形成期間中、機械的な力に耐えて、移植物に生体力学的な特性を与えることが可能である。

ＲＴＧポリマーはランダム[-PEG6000-O-CO-(CH₂)₄-CO-O-PPG3000-]_nポリ（エーテル−エステル）、又は、他の交互[-PEG6000-O-CO-O-PPG3000-]_nポリ（エーテル−カルボネート）であってよい。

他の実施形態においては、本発明は、改質したポリマー、特に、低侵襲性又は非侵襲性の外科処置による配置時に低粘度を示し、所定の体内部位で、生理学的条件の湿度と温度において縮合反応を起こし得るような、単官能基性、二官能基性又は三官能基性のケイ素含有反応基（アルコキシシラン基又はシラノール基が最も重要である）を含むＲＴＧ、あるいは他の部位反応性シラン系ポリマー、を使用できる。これによって、重合及び／又は架橋結合の効力により、これらポリマーの分子量が増加する。このようなポリマーは、２００３年５月１２日に提出されたイスラエル特許出願番号１５５８６６に詳細に説明されており、参照によって本明細書中に完全に取り込んだものとみなすこととする。

これらのポリマーは、本発明の組成物に含まれたＲＴＧあるいは他の反応性成分として使用された、環境あるいは部位に反応するポリマーシステムの成分である。このシステムは、主に所定の身体位置で水の存在下で安定で不活性なSi-O-Si結合を生み出す可能性がある反応性のケイ素系部分を含むポリマー成分を含み、この結果、ポリマーシステムの分子量の増加が起こり、システムの流動学的特性と機械的特性が変化する。いくつかの例において、これらの物質はシリコンリッチ領域を発生させる。

より具体的には、このポリマーシステムは、水の存在と体温、適切なペーハー(ｐＨ)の下で、主に所定の身体位置で縮合反応することのできる、１つかそれ以上のケイ素含有反応基を含む。ここで前記反応は、ポリマー化及び／又は架橋結合によるポリマーシステムの分子量増加という結果を生じ、前記ポリマーシステムの流動学的特性及び機械的特性に、少なくとも部分的な変化を生み出す。

好ましい実施形態の一つにおいては、ポリマーシステムは、生分解性あるいは選択的生分解性がある。これによって、前記システムは、所定の時間の後、投与部位から消えてなくなるか又は、本質的にポリマー化していない、もしくは非架橋の状態に戻る。

ポリマーシステムはまた、様々な相互貫通ネットワーク（ＩＰＮ'ｓ)を形成するような、ヒドロキシル、カルボキシル、チオール、アミン、イソシアネート、チオイソシアネート、又はフリーラジカルポリマー化によりポリマー化可能な不飽和部分のような追加の反応基やそれらの組合せを含んでもよい。

ポリマーシステムは、所定の身体位置で、異なる成分間の共有結合を形成するか、又は、物理的混合、貫通もしくは擬似貫通ネットワーク及びそれらの組合せを生み出すような２つ以上の成分を含むことが可能である。

さらに好ましい実施形態において、本発明の組成物は、反応性ポリマーシステムやポリマーとＢＭＣ、ＤＢＭに加えて、エラスチン、コラーゲン物質、アルブミン、線維素性物質、成長因子、酵素、ホルモン、内皮細胞のような生細胞、肝細胞、星状細胞、造骨細胞、軟骨細胞、線維芽細胞、ミオサイト、及びそれらの組合せような、身体に投与するための少なくとも１つの追加の生体分子を含んでもよい。

前記さらに好ましい実施形態においては、本発明の組成物はまた、ポリマー、セラミック材料、金属、カーボン、生体物質、及びそれらの組合せなどの、マクロ、ミクロ、又はナノサイズの固形成分を含む。前記固形成分は、粒子、球形、カプセル、棒、厚板、繊維、網、リボン、織布、不織布構造、織物、不定形格子構造、フィラメント巻構造、ハチの巣状のもの、編み上げ構造、及びそれらの組合せのような様々な違った形状を持つ。前記固形成分は中空、多孔性、固体、及びそれらの組合せでもよい。

前記さらに好ましい実施形態においては、固形成分は、前記反応性ポリマーシステムに存在するシリコン含有反応基と反応可能な反応部を持っている。

本発明の組成物中に含まれる反応性ポリマーシステムは、線状ポリマー、移植ポリマー、ハチの巣状ポリマー、星型ポリマー、架橋結合ポリマー及びそれらの組合せからなるグループから選ばれたポリマーを生成するものでもよい。

加えて、前記反応性ポリマーシステムは、ヒドロキシル、カルボキシル、チオール、アミン、イソシアネート、チオイソシアネート、二重結合含有反応基及びそれらの組合せからなるグループから選ばれた追加の反応基をも含む。

さらに好ましい実施形態において、反応性ポリマーシステムは、低侵襲性技術によって所定の身体部分に配置可能な、ポリオキシアルキレン、ポリエステル、ポリウレタン、ポリアミド、ポリカーボネート、ポリ無水物、ポリオルソエステル、ポリ尿素、ポリペプチド、ポリアルキレン、多糖類及びそれらの組合せのような低分子量ポリマーである。

さらに好ましい実施形態において、反応性ポリマーシステムはまた、所定の身体部分において、温度、ペーハー、イオン強度のような所定の誘因に反応して、前記反応性ポリマーシステムの粘度が少なくとも約２倍に上昇するような、急激な粘度上昇を起こす遷移を起こすことが可能である。前記遷移は、化学的誘発反応の前、及び／又は間、及び／又は後に起こる。

さらに好ましい実施形態において、反応性ポリマーシステムは、エタノール、イソプロピルアルコールのような水又は水性溶媒を含む。

特に好ましい実施形態において、反応性ポリマーシステムは、ポリオキシアルキレンポリマーであり、ジブロック、トリブロック、マルチブロックからなるグループから選ばれたポリエチレンオキサイド(ＰＥＯ)ポリプロピレンオキサイド(ＰＰＯ)を含むブロックコポリマーであり、ポリエチレンオキサイド(ＰＥＯ)とポリプロピレンオキシド(ＰＰＯ)の連鎖を含むセグメント化されたブロックコポリマーである。ここで、前記ＰＥＯとＰＰＯの鎖は、鎖展延剤、化学式R-(OCH₂CH)_n-OHであるポリ（アルキル−コ−オキシアルキレン）コポリマーを介して接続され、その式においてＲはポリ（テトラメチレングリコール）、ポリ（カプロラクトン）、ポリ（乳酸）、ポリ（シロキサン）及びそれらの組合せよりなるグループから選ばれた疎水性単官能基性セグメントである。ポリ（アルキル−コ−オキシアルキレン）コポリマーは、化学式[-R’-(OCH₂CH)_n-O]pHであり、Ｒは二官能基又は多官能基性の疎水性部、ポリ（Ｎ-アルキル置換アクリルアミド）、好ましくはポリ（Ｎ-イソプロピルアクリルアミド）、セルロース及びセルロース誘導体、アルギン酸塩及びその誘導体、ヒアルロン酸及びその誘導体、コラーゲン、ゼラチン、キトサン及びその誘導体、アガロース、水溶性合成物質、半合成物質、天然オリゴマー及びオリゴHEMA、ポリアクリル酸、ポリビニルアルコール、グリセロール、ポリエチレン酸化物、TMPO、オリゴ、多糖類、オリゴペプチド、ペプチド、タンパク質、酵素、成長因子、ホルモン、薬剤及びそれらの組合せからなるグループから選ばれたポリマーである。

好ましくは、前記鎖展延剤は、フォスゲン、脂肪族又は芳香族のジカルボン酸、又は塩化アシルや無水物のようなそれらの反応性誘導体、又はジシクロヘキシルカルボジイミド(ＤＣＣ)のようなＰＥＯとＰＰＯの連鎖の末端のＯＨ基と反応可能な他の分子、ヘキサメチレン・ジイソシアネート(ＨＤＩ)又はメチレン・ビスフェニル・ジイソシアネート(ＭＤＩ)又は塩化シアヌル又はその他二官能基性又は多官能基のセグメント、及び／又はそれらの組合せのような脂肪族又は芳香族のジイソシアネートである。

さらに好ましい実施形態において、反応性ポリマーシステムは、温度、ペーハー、イオン強度、電場及び磁場、超音波放射、流体、生物学上の種、及びそれらの組合せからなるグループから選ばれた他の刺激に反応する他のポリマーを含む。

本発明の成分に含まれる生物学的及び／又は薬理学的に活性な成分、より具体的にはＤＢＭ、ＤＴＭ、ＢＭＣは、所定の身体位置で、ポリマーシステムの分子量、流動学的特性及び機械的特性が変化するのに従って、単一モード又は多モードの時間依存性の放出速度に従って、身体にデリバーされることができる。

身体にデリバーされる生物学的又は薬理学的に活性な分子は、均一的に分布した貯蔵所を提供しながら、ケイ素グループと共有結合することもある。

さらに好ましい実施形態において、反応性成分はシーラントとして、塗布剤及び潤滑剤として、外科処置後の癒着の予防のための一時的な仕切りとして、所望の組織工学用生物学的活性薬剤の放出を単一モード又は多モードに制御する基質として使用できる。

さらに好ましい実施形態において、ケイ素部分は、所定の身体位置で、骨再生を誘導するために、様々な物質の、好ましくはヒドロキシアパタイトや他のカルシウムリン酸誘導体の、沈殿や結晶化のための核として働く。

本発明の組成物に使用される新しいオーダーメードのポリマーシステムは、以下の性質を利用することによって、従来技術では達成できなかった有利な特性を示す。ここで利用する性質とは、特異で有利な方法による、投与時におけるポリマーシステムの低粘度と、追加の添加剤又はイニシエーター／触媒システムあり又はなしで、体内において分子量が増加する及び／又は架橋結合をする性質とである。

本発明に関する組成物は、人体に用いるのに適しており、好ましくは、一方で、投与の簡易性と強化された初期の流動性、及びこれによる注射可能性が、他方で、移植後の高粘度とすぐれた機械的特性が、併せて必要とさせるような用法に適している。

本発明の組成物に含まれる反応性ポリマーシステムは、広範囲の機械的特性をカバーするように設計されており、例えば、非侵襲性外科処置、外科処置後の癒着の防止、細胞工学分野などにおける、種々の重要な生物医学的適用にとって重要な利点を備えている。生分解性システムの場合においては、これらの材料は、種々の分解動力学を示すように設計されている。

本発明のポリマーシステムはポリマーバックボーンに沿って加水分解性の不安定セグメントを含むことが可能で、これによって、システム全体の安定性と流動学的特性をコントロールすると同時にポリマー分子の分解率を微調整することができる。これらの組成物は、物理的に（生体分子をポリマーシステムに混合することによって）、あるいは化学的に（生体分子をポリマーに共有結合させることによって）、様々なタイプの生体分子を組み込むことによって、特有の生物学的な機能を備え得る。これら材料に、様々なタイプの細胞を組み込むことも、本発明の目的の一つである。それらは、細胞の増殖及び組織の足場となるためのＲＴＧ呈示基質として機能する。

第二の態様において、ＢＭＣとＤＢＭと部位反応性ポリマーを含む前記組成物は、移植を必要とする対象の関節及び／又は頭蓋-顔面‐上顎骨部分への間葉細胞及び／又は間葉前駆細胞の移植に用いられる。ここで、前記対象は、哺乳動物であり、好ましくは人間である。

硝子軟骨と骨の置換及び／又は修復（移植されたＢＭＣに存在する間葉前駆細胞から作りだされる）を目的として、損傷した関節及び／又は頭蓋−顔面−上顎骨部分へのＢＭＣの移植を行うために、前記組成物を提供することは、本発明の目的の一つである。

本発明の組成物に含まれるＤＢＭは、好ましくは、脊椎動物由来であり、人間由来であってもよい。

本発明の組成物に含まれるＤＢＭは、好ましくは粉末である。ＤＢＭの粒子サイズは約50から2500μであればよく、好ましくは、250〜500μである。最も好ましい粒子サイズは各々のケースの特定のニーズによってかわる。

他の実施形態において、本発明の組成物は、新しい硝子軟骨と骨の構造の回復及び／又は形成を促すことを目的とする。

WO02／070023に記載の通り、ＤＢＭとＢＭＣの混合物を投与することの基となっている思想は、ＢＭＣが骨形成及び軟骨形成を誘導することができる、間葉幹細胞の供給源となる可能性があることである。この結果、前記用法において前述した通り、ＤＢＭ粉末と混合したＢＭＣ懸濁液が、前記骨−軟骨複合組織（osteo-chondral complex）の中の損傷をかかえる関節、又は、動物頭蓋の前記頭頂骨の部分的骨欠損のいずれかに、直接的に投与すると、著しい回復が生じた。

本発明の基となる思想は、ＢＭＣ及びＤＢＭの活性組成物を、体温で高粘度を示す及び／又は、例えばペーハー（ｐＨ）又はイオン強度のような患者の体内での他の環境的誘因に反応して高粘度を示す、ポリマー材料で補足することである。この結果、移植された複合物の形状及び完全性（integrity）を維持する能力が改善される。また一方で、組織再生期間を通して、生体の要求事項(例えば、物理的圧力に耐える等)を一時的に満たすために必要とされる機械的特性が提供される。

このため、後の具体例で述べる通り、部位反応性ポリマー材料と混合した状態のＢＭＣ懸濁液及びＤＢＭ粉末の混合物を、骨−軟骨複合組織の損傷した関節中、又は、臨界的サイズの骨欠損を伴う動物頭蓋中のいずれかに直接的に投与すると、著しい回復が生じた。治療対象のレシピエントは、関節固定の必要も無く、移動することができ、治療対象の関節の解剖構造の充分な回復が達成された。移植後の長い休養期間の必要が解消されることから、これは、本発明の組成物の主要な利点の一つである。同様に、頭蓋骨中の外科的に除去された頭頂骨を置換する、新たに再建された頭頂骨は、正常なリモデリングを示した。損傷した関節の中では、軟骨下骨構造及び硝子軟骨の形成がされ、頭蓋の欠損においては、新たな扁平骨が形成された。

本組成物は、前述のＢＭＣ-ＤＢＭ複合物の適用において必要な、生物的な言わば固定及び／又は強化を使用する必要を無くす。更に、本組成物は、移植の位置によって望みの形状及び構造を形作るための、足場（scaffold）と型板（template）として機能する。そのような足場は、治療を受けるレシピエントの固定の必要を最小にするような即時の機械的支持を提供する。追加として、関節への前記混合物の注射の可能性は、観血的外科手術の必要を回避し得るものであり、この結果、医原性損傷、不快、固定の必要性、傷跡形成及び感染のおそれが最小となる。

更に別の実施形態では、本発明の組成物は、遺伝的又は後天的骨疾患、遺伝的又は後天的軟骨疾患、悪性の骨又は軟骨疾患、代謝性骨病、骨感染、骨又は軟骨変形に関係する状態、及びパジェット病のいずれか１つを患う患者の治療を意図するものである。前記疾患の詳細は表1にリストされる。更に、本発明は、また、複雑骨折の矯正、骨置換、損傷性又は変形性関節症の治療、及び形成又は性的外科手術における新骨の形成のいずれか１つが必要な患者の治療を意図するものである。

更に別の実施形態では、本発明の組成物は、前記した通り、任意で、追加的活性剤のみならず、薬学的に受容可能な担体又は希釈剤を含むことも可能である。

薬学的に受容可能(又は生理学的に受容可能)な付加剤（additive）、担体及び／又は希釈剤とは、レシピエントに対して採用された投薬量及び濃度において非治療的かつ無毒であり、また、前記活性剤の薬学的又は生理学的活性度に影響しないような、付加剤（additive）、担体又は希釈剤を意味するものである。

前記薬学的組成物の作成については、周知技術であり、多数の参考文献及びテキストブックに記載されている。例えば、Remington’s Pharmaceutical Sciences, Gennaro A. R. ed., Mack Publishing Company, Easton, Pennsylvania, 1990, ans especially pages 1521 -1712を参照されたい。

特に興味のある活性剤は、成長因子のような、組織の成長と浸透とを促進するものである。例えば、１つの具体例は、ＢＭＰであり、これは本発明の組成物の活性を高める場合もある。この目的のための他の模範的な成長因子としては、表皮成長因子(ＥＧＦ)、骨形成成長ペプチド(ＯＧＰ)、繊維芽球成長因子(ＦＧＦ)、血小板誘導成長因子(ＰＤＧＦ)、変形成長因子(ＴＧＦｓ)、副甲状腺ホルモン(ＰＴＨ)、白血病抑制因子(ＬＩＦ)、インシュリン類似成長因子(ＩＧＦｓ)、及び成長ホルモンが含まれる。例えば前記したＢＭＰ、オステオゲニン[Sampath et al. (1987) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84：7109-13]及びフッ化ナトリウム[Tencer et al. (1989) J. Biomed. Mat. Res. 23： 571-89]のような、骨の成長を促進させる他の薬剤もまた好ましい。

他の活性剤は、例えば免疫抑制薬又は免疫調節薬として、拒絶反応抑制又は耐性誘導剤となり得る。このことは、骨髄の同種移植物又は異種移植物の移植の成功のために重要である。

他の選択肢として、前記活性剤は、例えば、移植部位における感染を治療及び／又は防止するために与えられる抗生物質であってもよい。前記と同じ理由によって、移植部位における炎症の治療及び／又は防止のため、炎症抑制剤を本発明の組成物に追加することもできる。前記炎症は、例えば関節リウマチ、又は他の状態の結果であってもよい。

前記部位反応性ポリマーに追加して、本発明の組成物は、他のポリマー又は生分解性材料を含んでもよい。そして、それらは、薬学的に受容可能な担体及び希釈剤である。生分解性フィルム、基質、半−固体ゲル又は足場は、硫酸カルシウム、リン酸三カルシウム、ヒドロキシアパタイト、ポリ乳酸、ポリ無水物、骨、又は皮膚コラーゲン、線維素塊、及び他の生物グルー、純正タンパク質、細胞外基質成分、及びそれらの組み合わせを含む。そのような生分解性材料は、追加的で望ましい、機械的な、化粧の、又は組織の、又は基質の、接合（interface）特性を提供するために、非生分解性材料と組み合わせて使用してもよい。

好ましい実施形態において、本発明の組成物は、ＢＭＣ-ＤＢＭ混合物及びポリマー材料を、比率5：1〜1：5、好ましくは3：1〜1：2、最も好ましくは、流体状態のポリマー材料1に対して、ＢＭＣ-ＤＢＭ混合物2の比率(容積：容積)で含有する。ＢＭＣの絶対数及びＤＢＭとポリマー材料の容積は、再生する関節の大きさ又は置換される骨の大きさ(表面、形状及び厚さ)に依存する。一方、ＢＭＣ懸濁液の細胞濃度の範囲は、1x10⁶／ml〜1x10⁸／mlであり、ＤＢＭは、比率が1：1〜20：1、好ましくは、2：1〜9：1であり、最も好ましくは、本発明の組成物は、粉末形状のＤＢＭ1に対して、ＢＭＣ濃縮液4の比率(容積：容積)である。

注射後に望ましい粘度を得るため、本発明の組成物中のポリマー濃度は、注意深く調整されるべきである。最適な濃度は、粘度vs濃度の較正曲線を使用することにより達成される。本明細書中に示す実験結果により、ポリマー濃度を最適化するべできあることと、一般的に、非常に高い濃度は回避されるべきであることがわかる。なぜなら、これによって生物学的栄養分及び分子の好ましい流れを妨げ、その結果、誘導過程に悪影響を及ぼすからである。

他の態様として、本発明は、ＤＢＭ及び部位反応性ポリマーを伴うＢＭＣを含み、任意で、更に、薬学的に受容可能な担体又は希釈剤を含む混合物の、移植を必要とする対象の関節及び／又は頭蓋−顔面−上顎骨領域への移植の方法に関するものである。ここで、前記方法は、本発明の組成物を前記関節又は骨に導入することを含む。

本発明の組成物は、移植される場所はどこであっても、局所的な骨の形成を達成するための本質的特徴を備えており、全ての種類の骨修復又は取り換えに、特に、間葉幹細胞が欠如している又は乏しい場所において、効率的に適用できる。このような意味で、最も問題のある場所は、関節、頭蓋−顔面−上顎骨領域及び様々な種類のセグメント骨質欠損である。このように、本発明は、全ての必要な要素を含み、損傷領域への移植が、除去され、損傷し又は破壊された軟骨及び／又は骨の再生又は置換に充分であるような、複合移植物として説明することができる。

本発明の方法の第１実施形態では、注射、低侵襲性の関節内視鏡による処置又は外科的関節形成術のうちのいずれか１つの手法により、前記混合物を移植部位に投与する。ここで、前記方法は、外科手術、外傷又は他の先天的又は後天的異常に伴う、先天的又は後天的関節異常、頭蓋−顔面−上顎骨、歯科矯正手術、骨、又は関節骨置換についての支持又は矯正、また、その他の筋肉骨格移植物、特に、人工及び合成移植物の支持を目的とするものである。

このように、更なる態様として、本発明は、前記部位反応性ポリマーとともに、ＢＭＣとＤＢＭを含む混合物を、哺乳動物の冒された関節又は骨に投与することを含むような治療の必要な、哺乳動物の軟骨及び／又は軟骨下骨の奇形及び／又は機能障害に関連する損傷性又は変形性関節の治療に、関係する。前記混合物は、任意で、薬学的に受容可能な担体又は希釈剤及び／又は追加の活性剤を含む。

後の具体例に示す通り、ＲＴＧポリマーの追加は、混合物が移転された場所ではどこでも、ＢＭＣ／ＤＢＭ(ＤＴＭ)／ＲＴＧ混合物中に存在する間葉前駆細胞の誘導形成(つまり、増殖及び分化)によって骨と軟骨の形成が完成するのに対して、悪い影響を及ぼすことは無かった。本明細書に記載した発見事項は、ＲＴＧがない場合同様、本発明の組成物の関節の損傷領域への投与が、関節軟骨及び軟骨下骨からなる新たな骨軟骨複合組織の生成という結果を生じることを示している。実験用に作った頭頂骨欠損に投与した場合、本発明の組成物により、移植部位において、完全な膜内骨形成の生成がみられた。新組織形成は分化過程をたどり、局所条件に依存して、様々な種類の骨及び軟骨を生じる。このようにして、新たに形成される組織は、局所的要求に正確に適合する。

損傷した関節又は頭蓋領域への本発明の組成物の適用手順は次のステップを含む。
1. ＢＭＣのための源を選択する。ドナーは同種のものであればよく、又はＢＭＣは同じ治療の対象(自己移植)から得てもよい。
2． ＤＢＭのための源を選択する。前記ＤＢＭは市販のものを使用することができる。ＤＢＭは免疫原性ではないので、特定のドナーに対する制限はない。ＤＢＭは粉末、顆粒、又はスライス形状でもよい。前記ＤＢＭの粒子大きさは、約50〜2500μ、好ましくは、前記粒子の大きさは約250〜500μであればよく、最も好ましい粒子の大きさは、各ケースの特定の必要性に依存する。
3. 細胞濃度の範囲が1x10⁶／ml〜4x10¹⁰／mlのＢＭＣ懸濁液を含む組成物を作成し、それを、ＤＢＭと、1：1〜20：1、好ましくは2：1〜9：1で混合する。最も好ましくは、本発明の組成物は、粉末形状のＤＢＭ 1に対して、ＢＭＣ濃縮液4の比率(容積：容積)で混合する。ＤＢＭの代わりにMBMを使用してもよい。それが望ましければ、任意で、前記組成物に、ＢＭＰが含まれてもよい。
4． 使用される部位反応性ポリマーのための最適濃度で、前記ステップ３で得られた組成物に、部位反応性ポリマーを追加する。
5. シリンジ(非侵襲性注射)、非観血的関節内視鏡又は観血的外科手術手順のいずれかを介して、必要とする対象に対して、ステップ４で得られた組成物を投与する。他の選択肢として、前記組成物は、正常な組織膜内にカプセル化して投与してもよい。更に他の選択肢としては、前記組成物は選択的生体互換性膜から製造される膜装置に含まれてもよい。この選択的生体互換性膜は、前記装置に、細胞、栄養分、サイトカイン及びそれらの類似物を浸透させると同時に、前記装置内に前記ＤＢＭアーティクルを保持する。そのような膜装置、骨ストリップ又は追加的足場は、好ましくは、外科手術で導入される。

更に別の態様として、本発明は、非侵襲移植方法であり、必要とする対象の関節又は頭蓋−顔面−上顎骨への移植物を導入することを含み、前記移植物は、部位反応性ポリマーとともに、ＢＭＣ及びＤＢＭの混合物を含む。

本明細書中に示す具体例(後記具体例を参照)において、本発明の発明者は、本発明の組成物(例えば、ＤＢＭ及び部位反応性ポリマーと、ＢＭＣとの混合物、具体例３参照)の関節の損傷領域への投与は、移植部位における関節軟骨及び軟骨下骨からなる、新たな骨軟骨複合物の生成に充分で必須であることを示している。前記新たに形成されるドナー由来の骨軟骨複合物は、例えば、動き及び重量支持のような関節表面の特定の機能を実施するのみならず、長期間のメンテナンス、リモデリング及び自己更新を可能とする。

更に異なる態様として、本発明は、哺乳動物好ましくは人間への移植のための間葉及び／又は間葉前駆細胞の移植物として、ＢＭＣ及びＤＢＭとともに部位反応性ポリマーを含む組成物の使用に関する。前記移植は、新たな骨及び／又は軟骨の形成のため、関節又は頭蓋−顔面−上顎骨へ実施されるものである。前記移植の移植物は、また、歯科矯正手術、老化又は先天的、後天的又は変形性のプロセスを原因とする骨の増加のための支持をするためのものである。

さらに、前記移植に使用される前記組成物は、遺伝的又は後天的骨疾患、遺伝的又は後天的軟骨疾患、悪性の骨又は軟骨疾患、骨又は軟骨変形に関係する状態、及びパジェット病のうちのいずれか１つを患う患者の治療に意図されるものである。更に、前記組成物は、複雑骨折の矯正、骨置換、損傷性は変形性関節症の治療、及び形成又は性外科手術における新たな骨の形成のいずれか一つの必要のある患者の治療に意図されるものである。

本発明の方法はまた、治療及び美容の目的で、損傷した頭蓋−顔面−上顎骨領域における骨再生の効率を改善するため使用することもできる。

１つの実施形態において、本発明に使用される組成物は、更に追加活性剤を含む。

他の実施形態において、本発明に使用される組成物に含まれるＤＢＭは、脊椎動物由来であり、人間由来であってもよい。さらに、前記ＤＢＭは、好ましくは、粉末形状である。

追加の態様として、本発明は、時間と共に緩くなる可能性のある金属移植物、関節等を強化するための、又は、そのような非生物学的移植物を支持する“生体足場”の連続的適合を提供するための足場として筋肉外骨格移植物を支持するための、及び／又は、骨又は軟骨疾患の治療のための、移植物を作成するにあたっての、ＢＭＣとＤＢＭと部位反応性ポリマーとの混合物の使用に関するものである。他の選択肢として、本発明は、特に関節／骨接合において、リム移植の支持に適用される。

最後に、本発明は、ＢＭＣとＤＢＭと部位反応性ポリマーの混合物のキットであり、関節への移植、頭蓋−顔面−上顎骨領域、長骨、骨盤、脊柱の再建、又は、上顎及び下顎骨の歯槽骨の増加による歯の支持、哺乳動物の人工造血骨の生成のためのものである。ここで前記キットは次を含む：
(a) 粉末又は圧縮形状のＤＢＭ(例えば、腱の再建のためのひも、又は、大骨領域の再建のためのＤＢＭの大きな粒子);
(b) 部位反応性ポリマー;
(c) ＢＭ吸引用針;
(d) 骨内骨穿孔バー（burr）;
(e) 粘性の骨髄-ＤＢＭ-部位反応性ポリマーの混合物を注入するための大きい内腔をもった針;
(f) ＢＭＣと、ＤＢＭ及び部位反応性ポリマー及び希釈剤とを同時に混合する２方向の内腔コネクタ;
(g) ＢＭＣを維持する媒質;及び任意で、
(h) 骨生成を刺激する追加要素
(i) ＢＭＣ又はＢＭＣとＤＢＭとを取り扱うと共に維持する低温手段。

本発明の前記キットは、更に任意で、ＢＭＣ及びＤＢＭの混合物のための、また更に前記部位反応性ポリマーのための、担体及び／又は希釈剤を含んでもよい。

本発明の発明者は、[PCT／IL02／00172]において、関節症における健康な関節又は頭蓋−顔面−上顎骨構造のリモデリングと回復のためには、分化した骨又は軟骨細胞ではなく、多能性の間葉幹細胞の移植が特に重要であることを、次の理由から、以前に結論づけた。

(1) 骨移植内に移転した細胞が既に完全に分化しているだけではなく、軟骨細胞は、比較的に、代謝性活動能が低く、また、自己更新能力が限られており、健康な軟骨又は骨を維持するには十分ではあるが、確かに、骨の大きな領域又は新しい硝子軟骨の形成のためには不十分である。
(2) 関節では、軟骨及び軟骨下骨の両方が損傷していることが、最も多い。このため、成功裏に新たな硝子軟骨が進展したとしても、もし、軟骨下骨が損傷したままであるとしたら、長い間、維持されることは、ほとんどない。これらの発見を基礎として、後の具体例において観察される通り、骨髄中に存在する間葉幹細胞を適切な条件の元で移植すると、自己支持型骨軟骨複合組織が生成され、健康な関節表面が提供される。

前記ＤＢＭの影響下において、何が、多能性間葉幹細胞に、骨形成と軟骨形成とで、どちらかの分化の道筋を選ばせるのかは、未だ明確ではない。しかしながら、骨生成に対する軟骨の割合は、特に、局部的条件（例えば、間葉細胞及び血液供給の局部的源[Reddi, A.H. and Huggins, C.H. (1973) P.S.E.B.M. 143：634-637]など）に自然に影響を受けるＤＢＭ移植の部位に依存する[Inoue, T. et al. (1986) J Dent Res 65(1)：12-22]ことが報告されている。低酸素圧が軟骨の形成に好ましい[Bassett, C.A.L. (1962) J bone Joint Surg 44A：1217]。これは、血管発達が少ない軟骨においては酸素圧が低いためであると考えるのが最も妥当である[Sledge, C.B. and Dingle, J.T. (1965) Nature (London) 205： 140]。興味深いことに、脱塩皮質骨基質により前十字靱帯(ACL)の置換が成功したことが、やぎモデルで報告された[Jackson, D.W. et al. (1996) Amer J Sports Medicine 24(4)：405-414]。リモデリング過程は、骨のトンネルの基質内及び関節外トンネル連結（interface）で進展する靭帯類似遷移領域内での、新たな骨形成を含む[Jackson, D.W. et al. (1996) id ibid.]。硝子軟骨が、関節の中でのみ自然的に形成し維持され、関節が、滑膜との接触及び滑液による潤滑が利用でき、また、おそらく必須であるような場所であることを考慮に入れると、関節中の環境的条件が、軟骨形成を高める主要な役割を演じていると推定される。

後の具体例で、本発明の発明者は、部位反応性ポリマーとともにＤＢＭ及び骨髄細胞から構成される移植物を、損傷した関節又は頭蓋骨に移植すると、損傷した軟骨及び軟骨下骨の置換に成功することを示した。これは、骨と接触する側の骨形成と自由関節表面上の軟骨形成の結果であり、このようにして、生理学的環境条件が、骨形成又は軟骨の形成に対して、それぞれに有利に作用した。部位反応性ポリマーとともにＤＢＭ及び骨髄細胞から構成される同じ種類の移植物を、頭蓋の頭頂骨に実験用に形成された部分的骨欠損に移植すると、除去された部分の骨の置換に成功した。このようにして、新組織の形成は分化経路に従って起こり、局部条件に依存する異なるタイプの骨及び軟骨を生成する。このため、新たに形成される組織は、局部的要求を正確に充足する。

したがって、部位反応性ポリマーの、作成したＢＭＣ／ＤＢＭへの追加は、次のような組成物を生じる。つまり、前記組成物は、室温で注射可能であるが体温で高い粘性であり、このため、注射により蓄積（depot）を形成する。前記組成物は、非侵襲技術又は低侵襲技術に使用することができ、前記生体活性組成物が、注射部位から離れて移動するのを避けることができる。

この応用を通して、多数の刊行物が参照されている。これら参考書の内容は参照によって完全に本明細書中に取り込んだものとする。

本明細書及び前記特許請求の範囲を通して、文脈がそうでないことを要求しない限り、字句“comprise”、及びその変形、例えば、“comprises”及び“comprising”は、記載された完全なもの又はステップ又は完全なもののグループ又は複数のステップを含み、他のどのような完全なもの又はステップ又は完全なもののグループ又は複数のステップを排除するものではないこと理解するものとする。

本明細書及び前記添付の特許請求の範囲において使用されるように、内容が明らかにそうでないと指図しない限り、単数形“a”、“an”及び“the”は、複数形の対象物も含むものであることに注意すべきである。

次の具体例は、本発明の態様を実施するに当たって、本発明の発明者により採用された技術の代表例である。これら技術は本発明の実施のための好ましい実施形態の例示であること、また、本技術分野に属する者は、本発明の開示に鑑みて、本発明の精神及び意図された要旨から離れることなく多数の修正が可能であることを認識できることが、諒解されるべきである。

具体例
実験過程
1. 動物
骨(基質作成のためのもの)及びＢＭＣのドナーとしては、体重180−200gで生後8週間のC57BL／6雄マウス及びルイス雄ラットを使用した。移植物レシピエントとしては、同じバッチの動物を使用した。

2. 脱塩骨基質(ＤＢＭ)の作成
脱塩骨基質(ＤＢＭ)は、記述に従い[Reddi and Huggins (1973) id ibid.]、本発明の発明者の修正を加えて作成した。ルイスラットからの骨幹皮質骨シリンダを骨髄及び周囲の軟組織から取り除いた後、砕いて、磁気撹拌機能のついたジャーの中に入れた。骨チップは、2-3 時間、蒸留水中で洗浄処理した後、純エタノールに1 時間及びジエチルエーテル中に0.5 時間置いた。その後、 骨チップを、層流の中で乾燥し、乳鉢の中で液体窒素とともに砕き、篩にかけて400から1,000μの粒子を選別した。得られた粒子を、0.6M HCl中で一晩中脱塩し、酸を取り除くために何度か洗浄した後、純エタノール及びジエチルエーテル中で脱水し、乾燥した。
乾燥ステップを除き、前記過程の全ステップは、内因性タンパク質分解酵素による骨形態発生タンパク質（ＢＭＰ）の分解を防ぐため、4°C で行われた。前記基質は、-20°Cで保存された。

3. 移植材料の作成
移植用ドナーＢＭＣ懸濁液の作成：
ドナーのマウス又はラットの大腿骨から、筋肉を取り除いた。前記大腿部導管から、マンドリンによって、骨髄栓を、機械的に押し出した。高濃度に濃縮されたＢＭＣの単一細胞懸濁液の作成は、4-5個の大腿部の骨髄栓を100 μl のRPMI 1640剤に溶解し(Biological Industries, Beit Haemek, Israel)、細胞を何度か針を通過させることによって、骨髄細胞組織を単一細胞懸濁液中に溶解することによって行った。大腿部骨髄栓一個当たりの有核細胞の数は比較的安定している（生後8週間の雄のC57BL／6 マウスでは、約 10⁷ 細胞／骨髄栓）。移植用に単一細胞懸濁液の形で作成されたＢＭＣは、約3x10⁸細胞／mlの濃度の細胞を含むことが、再現性のある検査によって示されている。

4. ポリマー材料の作成.
ポリマー N2
本材料は、市販のプルロニック F-127シグマである(カタログNo. P-2443 )。

ポリマー N4
ランダム[-PEG6000-O-CO-(CH ₂ ) ₄ -CO-O-PPG3000-] _n ポリ(エーテル-エステル)
15.3 グラム(0.003 mol) の乾燥ＰＥＧ6000 (分子量 6,000) 及び 7.4 g (0.003 mol) のPPG3000を、250 mlのフラスコ中で 30 mlの乾燥クロロホルム に溶解した。3.2 gのピリジンを前記反応混合物に加えた。その後、20 mlの乾燥クロロホルムに溶解した2.2 gの塩化アジオポイルを、40^oCで、磁気撹拌しながら、30分かけて滴状に追加した。その後、温度を60^oCまで上昇させ、さらに1時間半、反応を継続させた。生成したポリマーを、反応混合物を約600mlの石油エーテル 40-60に加えることによって、反応混合物から分離した。生成した二相システムの下相を分離して、室温で乾燥した。最後に、ポリマーを少量の石油エーテルで洗浄し、乾燥すると、脆性で水溶性の淡黄色の粉末が得られた。

ポリマー N7
交互 [-PEG6000-O-CO-O-PPG3000-] _n ポリ（エーテル−カルボネート）
i) フォスゲンの合成とそのクロロホルム溶液の作成
フォスゲンは、三塩化アルミニウム(30 g)を触媒として、1,3,5 トリオキサン(15 g)を四塩化炭素(100 g)と反応させることによって生成された。前記フォスゲン蒸気の気泡を、重量測定したクロロホルムに通し、重量の差（9%から11%)によってフォスゲン濃度 (w／w)を計算した。フォスゲンの高い毒性のため、前記溶液の取り扱いには非常な注意を払い、全ての作業は適したフードの下で実施した。

ii） PEG6000ジクロロホルマート(ClCO-O-PEG6000-O-COCl)の合成
30.3 グラムの乾燥ＰＥＧ6000 (分子量 6,000) を250 mlのフラスコ中で、50 mlの乾燥クロロホルムに溶解した。3% w／w のクロロホルム溶液66グラム(ＰＥＧに対し100% モル過剰)をＰＥＧに加え、この混合物を、磁気撹拌しながら、また溶媒とフォスゲンの蒸発を防ぐために凝縮装置をつけながら、60^oCで4時間反応させた。反応フラスコは、反応中に放出される可能性のあるフォスゲンを捕捉するために、NaOH(水／エタノール 1：1中の20% w／w 溶液)トラップ に接続された。反応完了後、システムを、室温まで放熱し、過剰なフォスゲンは真空に引いて除去した。FT-IR分析により、クロロホルマート基の振動に属する1777 cm^-1 の特性ピークが示された。

iii） 交互[-PEG6000-O-CO-O-PPG3000-] _n ポリ（エーテル−カルボネート）の合成
15.2グラムの乾燥PPG3000 (分子量 3,000) を、室温で、a）で生成されたClCO-PEG6000-COCl に加えた。この混合物を、氷浴中で 5^oCまで冷却し、20 ml クロロホルムに溶解した6.3グラムのピリジンを、15分かけて、滴状に加えた。その後、温度が室温まで上昇するのを許し、さらに45分間、反応を継続させた。その後、温度を35^oC まで上昇させ、さらに1時間反応を継続させた。生成したポリマーは、反応混合物を約 600 mlの石油エーテル40-60に加えることによって、反応混合物から分離した。生成した二相システムの下相を分離し、室温で乾燥させた。最後に、このポリマーを少量の石油エーテルで洗浄し、乾燥すると、脆性で水溶性の淡黄色の粉末が得られた。この材料は53.5^oC で溶融吸熱を示し、また、FT-IR分析により、1746 cm^-1の場所にカルボネート基の特性ピークが示された。生成された前記ポリマーの分子量は、GPCにより、M_n 36,400 (M_w／M_n= 1.28)と決定された。

プルロニックF127 ジ-(3-イソシアナトプロピル)トリエトキシシラン (F127 ジ-IPTS)の合成
25.2 g (0.002 mol)の プルロニックF127 (分子量 12,600)を３首フラスコ中に注ぎ、真空にして120^oC で2時間乾燥させた。その後、1.2 g (0.005 mol)の IPTS と 0.1 g (3.10^-4 mol)の SnOct₂ を前記反応混合物に加え、乾燥窒素雰囲気の中で、機械的に撹拌しながら（160 rpm）、80°Cで1時間反応させた。生成したポリマーは、クロロホルム(30 ml) に溶かし、石油エーテル40-60 (400 ml)中で沈殿させた。最後に、このF127 誘導体を、繰り返し少量の石油エーテルで洗浄し、室温で真空にして乾燥させた。この合成については、スキーム1に示した。

以下の具体例では、#21、#22 及び #23として指定された、濃度の異なるF127ジ-IPTSを含む三の組成物を使用した(図11参照)。 体温(37°C)にさらされた場合、前記組成物のポリマー化過程には、二つの段階が含まれる。第一段階にはエトキシシラン基のシラノール基への加水分解が含まれ、第二段階には、生成したシラノール基のSi-O-Si結合への縮合が含まれる。

プルロニックF38ジ-(3-イソシアナトプロピル)トリエトキシシラン (F38 ジ-IPTS)の合成
20.1 g (0.004 mol)の プルロニック F38 (分子量 4,600)を３首フラスコ中に注ぎ、真空にして120 ^oCで2時間乾燥させた。その後、2.6 g (0.01 mol)の IPTS と 0.2 g (3.10^-4 mol)の SnOct₂ を前記反応混合物に加え、乾燥窒素雰囲気の中で、機械的に撹拌しながら（160 rpm）、80 ^oCで1時間反応させた。生成したポリマーは、クロロホルム(30 ml) に溶かし、石油エーテル40-60 (400 ml)中で沈殿させた。最後に、このF38 誘導体を、繰り返し少量の石油エーテルで洗浄し、室温で真空にして乾燥させた。

ポリ(エチレングリコール) MW=400 ジ-(3-イソシアナトプロピル)トリエトキシシラン (PEG400 ジ-IPTS)
5.1 g (0.013 mol)の ＰＥＧ400を３首フラスコ中に注ぎ、真空にして120 ^oCで1時間乾燥させた。その後、7.6 g (0.019 mol)の IPTS と 1.5 g (0.004 mol)の SnOct₂ を前記反応混合物に加え、乾燥窒素雰囲気の中で、機械的に撹拌しながら（160 rpm）、80^oCで1時間反応させた。生成したポリマーは、クロロホルム(30 ml) に溶かし、石油エーテル40-60 (400 ml)中で沈殿させた。最後に、このＰＥＧ400 ジ‐IPTSを、繰り返し少量の石油エーテルで洗浄し、室温で真空にして乾燥させた。この材料は37^oCで液体であったが、37^oCでインキュベートすると、脆性の透明フィルムが形成された。

ポリ（エチレングリコール） MW=600 ジ-(3-イソシアナトプロピル)トリエトキシシラン (PEG600 ジ-IPTS)
20.1 g (0.034 mol)の ＰＥＧ600を３首フラスコ中に注ぎ、真空にして120 ^oCで1時間乾燥させた。その後、18.3 g (0.007 mol)の IPTS と 1.5 g (0.004 mol)のSnOct₂を前記反応混合物に加え、乾燥窒素雰囲気の中で、機械的に撹拌しながら（160 rpm）、80^oCで1時間反応させた。生成したポリマーは、クロロホルム(30 ml) に溶かし、石油エーテル40-60 (400 ml)中で沈殿させた。最後に、このＰＥＧ600 ジ‐IPTSを、繰り返し少量の石油エーテルで洗浄し、室温で真空にして乾燥させた。この材料は37^oCで液体であったが、37^oCでインキュベートすると、脆性の透明フィルムが形成された。

ポリ(エチレングリコール) MW=1000 ジ-(3-イソシアナトプロピル)トリエトキシシラン (PEG1000 ジ-IPTS)
10.2 g (0.010 mol)の ＰＥＧ1000を３首フラスコ中に注ぎ、真空にして120 ^oCで1時間乾燥させた。その後、5.4 g (0.022 mol)の IPTS と 0.5g(0.001 mol)の SnOct₂ を前記反応混合物に加え、乾燥窒素雰囲気の中で、機械的に撹拌しながら（160 rpm）、80^oCで1時間反応させた。生成したポリマーは、クロロホルム(30 ml) に溶かし、石油エーテル40-60 (400 ml)中で沈殿させた。最後に、このＰＥＧ1000 ジ‐IPTSを、繰り返し少量の石油エーテルで洗浄し、室温で真空にして乾燥させた。この材料は37^oCでペーストであったが、37^oCでインキュベートすると、脆性の透明フィルムが形成された。

ポリカプロラクトン MW=530 ジ-(3-イソシアナトプロピル)トリエトキシシラン (PCL530 ジ-IPTS)
a) PCL530 ジ-IPTSの合成
20.2 g のPCL530を真空にして120^oCで1時間乾燥させた。その後、温度を80^oCで一定に保ち、1.9 gの触媒と22.4 g (0.09 mol) のIPTSを加えた。この温度で、N₂ 雰囲気中で1時間、反応を継続させた。最後に、前記反応混合物を室温まで冷却し、50 mlの石油エーテル40-60で洗浄し、真空にして、24時間、室温で乾燥させた。この材料は、室温でわずかに黄色を帯びた液体だった。

b) PCL530 ジ-IPTSの架橋結合
a)で合成した5 gのPCL530 ジ-IPTSを25 mlのガラス瓶（直径30 mm）に注ぎ、37^oCで加熱した。その後、1 mlのＰＢＳ(ｐＨ 7.4 0.1 M)をこの材料中に加えた。このシステムを37^oCでインキュベートした。生成された材料は、黄色で透明であった。

ポリカプロラクトン MW=2000 ジ-(3-イソシアナトプロピル)トリエトキシシラン (PCL2000 ジ-IPTS)
a) PCL2000 ジ-IPTSの合成
10.2 g のPCL2000 (0.005 mol)を100 mlフラスコ中に注いで80^oC に加熱し、0.25 g の触媒と3.1 g (0.09 mol)のIPTSを加えた。乾燥N₂ 雰囲気の中で、この温度で1時間、反応を継続させた。最後に、前記反応混合物を室温まで冷却し、50 mlの石油エーテル40-60で洗浄し、真空にして、24時間、室温で乾燥させた。この材料は、室温で白色のワックス状だった。

b) PCL2000 ジ-IPTSの架橋結合
a)で合成した5 gのPCL2000 ジ-IPTSを70^oCに加熱し、25 mlのガラス瓶（直径30 mm）に注いで、37 ^oCで加熱した。その後、1 mlのPBS(ｐＨ 7.4 0.1 M)をこの材料中に加えた。このシステムを37 ^oCでインキュベートした。生成された材料は、白色で硬い生成物であった。

トリメチロルプロパンエトキシレートMW=1014 トリ-(3-イソシアナトプロピル)トリエトキシシラン (TMPE1014 トリ-IPTS)
a) TMPE1014 トリ-IPTSの合成
5.1 g (0.005 mol)のTMPE1014を、真空にして120^oC で1時間乾燥させた。その後、80^oCで温度を一定に保ち、0.4 gの触媒と4.4 g (0.02 mol)のIPTSを加えた。この温度で1時間、反応を継続させた。最後に、前記反応混合物を室温まで冷却し、50 mlの石油エーテル40-60で洗浄し、真空にして、24時間、室温で乾燥させた。この材料は、室温で液体だった。

b) TMPE1014 トリ-IPTSの架橋結合
a)で合成した5 gのTMPE1014 トリ-IPTSを25 mlのガラス瓶（直径30 mm）に注ぎ、37 ^oCで加熱した。その後、1 mlのPBS(ｐＨ 7.4 0.1 M)をこの材料中に加えた。このシステムを37 ^oCでインキュベートした。生成された材料は、透明な生成物であった。

PCL530 ジ-IPTS／ PCL2000 ジ-IPTS 架橋結合コポリマー
PCL530 ジ-IPTS とPCL530 ジ-IPTSの合成については前述の通りである。PCL530 ジ-IPTS／ PCL2000 ジ-IPTSの比率の異なる材料5gを、25 mlのガラス瓶(直径30 mm)に入れ、37 ^oCで加熱した。その後、1 mlの PBS (ｐＨ 7.4 0.1 M)を前記材料中に追加した。 このシステムを37 ^oCでインキュベートした。

プルロニックF127基質内のPCL530 ジ-IPTS架橋結合骨格
PCL530 ジ-IPTSの合成については前述の通りである。 0.8 g のF127を、4^oC で、3.2 gの PBS (ｐＨ=7.4, 0.1 M)に溶解させた。その後、1 gのPCL530 ジ-IPTSを加え、この混合物を均質化して、37^oC でインキュベートした。

F127 ジ-IPTS／ PCL530 ジ-IPTS 架橋結合コポリマー
F127 ジ-IPTS 及び PCL530 ジ-IPTSの合成については前述の通りである。 0.8g F127 ジ-IPTSを、4^oCで、3.2 g PBS (ｐＨ=7.4, 0.1 M)に溶解させた。その後、1 gのPCL530 ジ-IPTSを加え、この混合物を均質化して、37^oC でインキュベートした。

プルロニックF127 基質内のPTMG2000 ジ-IPTS 架橋結合骨格
PTMG2000 CL ジ-IPTSの合成については前述の通りである。 0.8 g のF127を、4^oCで、3.2 gのPBS (ｐＨ=7.4, 0.1 M)に溶解した。その後、1 g のPTMG2000 ジ-IPTSを加え、この混合物を均質化して、37^oC でインキュベートした。
F127 ジ-IPTS／ PTMG2000 CL ジ-IPTS 架橋結合コポリマー
F127 ジ-IPTS 及び PCL530 ジ-IPTSの合成については前述の通りである。0.8 gのF127 ジ-IPTSを、4^oCで、3.2 g PBS (ｐＨ=7.4, 0.1 M)に溶解した。その後、1 g のPTMG2000 CLジ-IPTSを加え、この混合物を均質化して、37^oC でインキュベートした。

5. 移植物の組成：
移植物は、異なる組み合わせにした次の材料から構成される。：
1. 10 μlのＢＭＣ 懸濁液 (濃度 3x10⁸ 細胞／ml);
2. 4 mgのＤＢＭ (又は MBM、又は ＤＴＭ);
3. 10 μl のポリマー材料溶液。

6. 腎臓の被膜下スペースへの移植
麻酔をかけたラット又はマウスを、レシピエントとして使用した。 腎臓被膜に小さな切込みを入れた後、凹みのあるスパチュラを使用して、移植材料を挿入した。前記移植物は、ＲＴＧポリマー材料の補足あり又は補足なしで、ＤＢＭ粉末と混合した ＢＭＣ懸濁液からなる。対照として、ポリマー材料と混合したＢＭＣ、又はＲＴＧポリマー材料だけを、腎臓被膜下に挿入した。皮膚をステンレスのクリップで閉じた。

7. 膝関節の関節軟骨における局所的損傷部への、ＢＭＣ、ＤＢＭ 及び ポリマー材料の混合物の移植
ラットの膝関節の関節軟骨及び軟骨下骨の標準的人工損傷は、次のようにして生じさせた。麻酔後、中間パラ膝蓋切開により膝関節にアクセスし、膝蓋を一時的に横方向へ移動させた。直径1.5mm、深さ2.0mmのマイクロフラクチャー穴（全厚の欠損）を、大腿骨の顆間部に作った。

前記欠損を、上記のようにして作成された、ポリマー材料の補足あり又は補足なしのＤＢＭ 粉末とＢＭＣ 懸濁液の混合物で満たした。対照として、ポリマー材料と混合したＢＭＣ、又はポリマー材料だけを、損傷部に挿入した。膝蓋を元の位置に戻し、切開を吸収性縫合糸で縫合した。皮膚をステンレスのクリップで閉じた。

8. 実験用に作られた頭蓋冠の欠損への、ＢＭＣ、ＤＢＭ及びポリマー材料の混合物の移植
ケタミンの腹腔内注射により、ルイスラットに麻酔をかけた。ラットの頭蓋の前頭部に切開を行った。頭頂骨部分から筋肉フラップを取り除き、歯科用バーを使用して矢状縫合の横に骨の欠損(6 x 6mm²)を作った。前記欠損を、ポリマー材料の補足あり又は補足なしで、上記のようにして作成されたＤＢＭ 粉末とＢＭＣ 懸濁液の混合物で満たした。対照として、ポリマー材料と混合したＢＭＣ、又はポリマー材料だけを、損傷部に挿入した。皮膚を、ステンレスのクリップで閉じた。

9. 組織学的評価
部検材料を4%の中性緩衝ホルムアルデヒド中で固定し、石灰質を除去し、一連のエタノールグレード及びキシレン中を通し、その後、パラフィン中に埋め込んだ。連続切片（厚さ5-7 ミクロン）が得られた。各試料の代表的連続切片の一組をヘマトキシリン＆イオシン(H&E)で染色し、もう一組をピクロインディゴカルミン(PIC)で染色した。

具体例 1
マウスの腎臓の被膜下スペース中に移植したＢＭＣ-ＤＢＭ組成物の骨形成特性に及ぼす各種ポリマー材料の影響に関する研究

以下の具体例は、本発明の組成物の進展に関する実験である。高粘度を有するいくつかのポリマー材料は、ＤＢＭ又はＤＴＭとともに肝臓の被膜下スペース中に移植された骨髄（BM）中に存在する間葉幹細胞による骨の誘導形成過程と非常によく適合することがわかった。

腎臓被膜下のスペースを移植部位として選定したのは、ここには、少なくとも2-3ヶ月の間に骨形成に誘導されて骨を形成することのできるような細胞が、存在しないことが以前から示されており、骨形成過程研究のための生体内試験管として使用できるからである。[Gurevitch, O.A. et al. (1989) Hematol Transfusiol 34：43-45 (in Russian)].

ラット及びマウスで実施された数組の実験では、各種部位反応性ポリマー材料を腎臓被膜下に移植し、各種部位反応性ポリマー材料の上述の基準への適合性について調査した。移植物は、ＲＴＧ又はケイ素系ポリマー材料の補足ありか又は補足なしで、ＤＢＭ又はＤＴＭ粉末と混合したＢＭＣ 懸濁液からなるものだった。対照として、ポリマー材料を混合したＢＭＣ又はポリマー材料だけを、腎臓の被膜下スペースに挿入した。1グループにつき、5例以上の移植を実施した。

ＲＴＧ ポリマー(N2, N4, N7)とともにＢＭＣ+ＤＴＭを移植した1ヶ月後には、いずれの場合も、新たに形成された皮質骨と骨梁、よく発達した骨髄腔、及び機能的に活性な骨髄が見られる。(図1A-J)。

図1Kから1Rは、改質プルロニック F-127 ＲＴＧバイオポリマーが、ＢＭＣ+ ＤＴＭ／ＤＢＭ+バイオポリマー#21 (図1L及び1P)、#22 (図 1M及び1Q)及び#23 (図1N及び1R)を含む混合物の移植によって誘導された骨造血部の形成に及ぼす影響を示している。移植部位は、マウス(図1Kから1N)又はラット(図1Oから1R)の腎臓被膜とした。

部位反応性ポリマー#21、#22及び#23とともに ＢＭＣ+ＤＢＭ (ラット)又は ＢＭＣ+ＤＴＭ (マウス)を移植した1ヶ月後、新たな皮質骨と骨梁が、よく発達した骨髄腔及び機能的に活性な骨髄(図1Kから1R)とともに誘導された。ＲＴＧポリマーを補足した場合も補足しなかった場合も、移植されたＤＴＭ-ＢＭＣ 複合物によって生じた異所性小骨の形成レベルには差異は見られなかった。これら3種類のポリマーは、水中のポリマー濃度が、それぞれ、15、17 及び 20% である。これらの濃度では、副作用は見られなかった。ポリマーが高濃度であることが、移植物の機械的特性を改善するのに有効であることは、注目すべき重要点である。

ＤＢＭ／ＤＴＭ なしで、上述の各ＲＴＧポリマーだけを補足してＢＭＣを移植した場合には、たいていの場合、ＢＭＣを移植した場合と同様の小さな小骨が生じた。ＢＭＣはその場にまとまったままで、移植部位から移動して出て行くのは防ぐことができた(図1)。骨を誘導及びコンダクトするＤＢＭの効果が無い場合には、間葉幹細胞は効果的に骨形成へと誘導され得ず、移植されたＢＭＣに存在する未分化の（骨−軟骨形成に限定された）前駆細胞だけが、骨形成に関わると考えるのが最も妥当であろう。

前述のポリマー材料だけを腎臓被膜下に移植した場合は、移植部位に何の痕跡も残らず、骨の形成もなければ炎症などの副作用も全く見られなかった。

これらの実験により、少なくとも本明細書中で使用した範囲の濃度では、骨−軟骨形成過程が、部位反応性ポリマーの濃度の違いに依存しないことがわかる。このことは、移植処置にとって有利である。なぜなら、移植処置の時間的制限によって濃度を選択できるからである。この結果、より長い蓄積形成用期間が推奨される又は望まれるときは、移植部位で蓄積を形成するのにより長時間かかるような、より濃度の低い部位反応性ポリマー を含んだ混合物の使用が便利であると考えられる。逆に、ポリマー化のための時間として、より短時間が望まれる場合には、より濃度の高いポリマーを含んだ混合物をつかうことになるだろう。

具体例 2
実験用に作った頭蓋冠の欠損をＢＭＣ-ＤＢＭ組成物の移植によって誘導、矯正する際の各種ＲＴＧ ポリマー材料の影響に関する研究
前述の実験の組で、ＤＢＭとともに移植されたBMの間葉幹細胞による骨の誘導形成過程との高い適合性と、粘度とによって選ばれたポリマー材料が、実験用に作った頭蓋冠欠損の矯正を向上させることができるかどうか試験するための実験を行った。

ＢＭＣ、ＤＢＭ及び選ばれた各ＲＴＧ ポリマー材料を含む本発明の組成物を、実験用に作った前記頭蓋冠の欠陥に移植すると、骨の膜内進展を開始させ、完成させることができるのがわかった。実験結果を図3から5に示す。結果から、本方法は、顔−上顎欠損の治療にも拡大できるものと考えられる。

麻酔をかけたルイスラット(生後8-12)の頭蓋の前頭部に切開を行い、皮膚フラップを脇へよけた。筋肉フラップを頭頂骨部分から取り除き、歯科用バーを使用して矢状縫合の横に骨の欠損を作った。頭頂骨の全厚の切片(6 x 6mm²)を取り除いた。欠損部を、ＲＴＧポリマー材料の補足あり又はなしでＤＢＭ粉末と混合したＢＭＣ懸濁液で満たした。対照として、ポリマー材料と混合したＢＭＣ又はポリマー材料だけを、実験用に作った頭蓋の欠損に挿入した。皮膚フラップを元の場所に戻し、ステンレスのクリップで固定した。1グループにつき5例以上の移植を行った。

非治癒性の頭蓋欠損を使用することにより、治癒過程における骨をコンダクトする要素と骨を誘導する要素の両方を観察することができる。このように、非治癒性の頭蓋欠損は、本発明の組成物が頭蓋の損傷部に移植されたときに、膜内骨形成を完成させる能力を評価するための、適切なモデルであると言える。

除去された骨の場所を、調査対象の各ＲＴＧポリマー材料と混合したＢＭＣで満たした場合には、手術の30日後には、骨の再生は全く見られなかった。このことは、X線写真及び拡大写真に明確に示され、組織学的調査によって確認することができた(図5)。つまり、前記欠損のサイズが十分に大きく、非治癒性の頭蓋欠陥の定義にあっていることを示している。

実験用の頭蓋欠損をポリマー材料だけで満たした場合には、移植部位には何の痕跡も残らず、骨形成もなければ、炎症などの副作用もなかった。

上記ＲＴＧ ポリマー材料の一つを補足したＢＭＣ-ＤＢＭ活性組成物を実験用頭蓋欠損の場所に移植した場合には、大規模な移植ＤＢＭ粒子のリモデリング及び新骨形成領域が観察された。早くも移植後1ヵ月後には、頭頂骨の切り口と周囲の新しい骨組織とをほとんど区別できなくなった。欠損領域は、新たに形成した骨の連続層（X線写真及び拡大写真中に明確に見られ、組織学的調査によって確認することができた）で完全に再生された(図3 及び 4)。

大規模な移植ＤＢＭ粒子のリモデリングと活発な新骨形成が、欠損領域全域で均質に示されたことは特に強調に値し、ＢＭＣ（骨形成に誘導及びコンダクトされることのできる間葉前駆細胞を含む）とＤＢＭ粒子とからなる、利用可能な活性複合物の量が、欠損領域内で均一に維持されたことを示している。

これらの結果は、実験用に作った頭蓋冠欠損への移植用に、ＢＭＣ及びＤＢＭからなる活性な複合物を前記ＲＴＧポリマー材料で補足すること、つまり、本発明の組成物（この場合は、ＢＭＣと前記ポリマー材料を混合したＤＢＭ）を、実験用に作った頭蓋欠損への移植用に使用することは、移植物の分散を防ぎ、移植物を、形状を維持しながら適切な部位に維持し、移植部位に活発で完全な膜内骨形成を生じるのに十分であったことを示している。 本方法は、顔−上顎部分の欠損の治療にも拡大できると考えられる。

ＢＭＣ-ＤＢＭ複合物を、ポリマー材料を使用せずに、実験用に作った頭蓋冠の欠損に移植した場合には、非均一な骨形成という結果となった。これは、移植物が一部分散し、初期の形状を維持できなかったことを示しており、強調に値する。

ＢＭＣを、ＤＢＭとではなくMBMと組み合わせて使用した パイロット実験では、良好な結果が示された。ＤＢＭの使用とMBMの使用との間の違いは、主に、MBMでは骨の形成が遅れることにある。また、MBM粒子はＤＢＭ粒子と比べてずっと高密度で硬いことから、移植物に、体重支持や形状保持の必要がある場合には、MBMの方が優れている。ＤＢＭとMBMの二つの混合物をＢＭＣとともに移植すれば、両方の利点を最大限に利用することができると考えられる。つまり、(a)（ＤＢＭが早く作用し、MBMが時間遅れをともなって作用するため、）骨形成作用の期間が著しく長くなり、(b)全新組織形成期間を通じて、移植物の形状維持が向上する。

具体例3
膝関節の関節軟骨中の局所的損傷領域に移植したＢＭＣ-ＤＢＭ組成物の骨形成特性に及ぼす各種ＲＴＧ ポリマー材料の影響に関する研究。

前述の実験の組で、ＤＢＭとともに移植されたBMの間葉幹細胞による骨の誘導形成過程との高い適合性と、粘度とによって選ばれたポリマー材料が、実験用に損傷させた膝関節の骨軟骨複合組織の矯正を向上させることができるかどうか試験するための実験を行った。

ＢＭＣ、ＤＢＭ及び選ばれたＲＴＧ ポリマー材料のいくつかを含む本発明の組成物を、実験用に損傷させた膝関節の骨軟骨複合組織に移植すると、骨と軟骨の形成過程を開始させ、完成させることができるのがわかった。実験結果を図6から5に示す。本方法は、関節の骨軟骨複合組織の欠損の治療にも拡大できるものと考えられる。

雄のルイスラットに、ケタミンの腹腔内注射によって麻酔をかけた。大腿骨顆間部の関節軟骨と軟骨下骨に、マイクロフラクチャー穴（全厚の欠損）を開けた。欠損部分を、ＲＴＧ ポリマー材料の補足あり又はなしでＤＢＭ粉末と混合したＢＭＣ懸濁液で満たした。対照として、ポリマー材料と混合したＢＭＣ又はポリマー材料だけを、実験用に作った膝関節の損傷部に挿入した。膝蓋を元の場所に戻し、切開を吸収性縫合糸で縫合した。皮膚をステンレスのクリップで閉じた。1グループにつき5例以上の移植を実施した。

膝関節の骨-軟骨の欠損部位を、調査対象の各ＲＴＧポリマー材料と混合したＤＢＭ-ＢＭＣ複合物で満たした1ケ月後には、軟骨下骨と造血髄腔の活発な再生、血管形成、及びＤＢＭ粒子の部分的分解とリモデリングが見られた。

しかしながら、損傷した表面部分の再生の仕方には、追加したポリマー材料の違いによって、劇的な差異が観察された。ＤＢＭ-ＢＭＣ複合物をＲＴＧポリマーN7とともに損傷部に移植した場合には、再生表面は、若い硝子軟骨の厚い層から作られた。一方、ＤＢＭ-ＢＭＣ活性複合物をＲＴＧポリマーN2又はN4で補足して移植した場合には、軟骨形成は観察されず、再生表面は結合組織から作られた。

ＢＭＣ を、上述のＲＴＧポリマー材料とともに、膝関節の損傷した骨-軟骨複合組織に移植した場合は、再生は、同じ一般的パターンに従った。全てのＲＴＧポリマーで、軟骨下骨と造血髄腔の活発な再生が見られた。しかしながら、ＢＭＣをＲＴＧポリマーN2又はN4と混合した場合には、再生表面は結合組織だけから作られ、ＢＭＣをＲＴＧポリマーN7で補足した場合には、損傷部の再生表面は、結合組織と軟骨細胞の混合が含まれた。

興味深いことに、ＲＴＧポリマー材料N2及びN4は、膝関節の骨軟骨損傷部にＤＢＭ-ＢＭＣ活性複合物を移植することによって誘導される軟骨形成過程を選択的に妨げ、一方で、同じ部位において、骨誘導形成過程との適合性があることがわかった。

各種ＲＴＧポリマー材料で補足したＤＢＭ-ＢＭＣ活性組成物を移植した後2ヶ月間、損傷した骨軟骨複合組織の再生パターンを観察することにより、１ヶ月後に得られた結果を、完全に確認することができた。(図8及び9)。

本発明の組成物(この場合は前記ポリマー材料を補足したＢＭＣ及びＤＢＭ)を、実験用に作った膝関節の骨軟骨複合組織中の全厚の損傷の中に移植すると、欠損部に、関節の完全な再生のために特に重要となる、滑らかで均質な再生表面を維持できたことは、強調に値する。

これらの結果は、膝関節の骨軟骨複合組織に実験用に作られた欠損への移植用に本発明の組成物（この場合はＢＭＣ及び前記ＲＴＧポリマー材料を混合したＤＢＭ）を使用することが、移植物の分散を防ぎ、ＤＢＭ粒子が移植部位から出て関節面の中に入り込まないように移植物を適切な部位に保ち、完全に形成された骨軟骨複合組織と硝子軟骨の滑らかな再生表面を形成するために十分であったことを示している。本方法は、関節の骨軟骨欠損の治療に拡大できると考えられる。

実験用に作った膝関節の骨軟骨複合組織の欠損に、ポリマー材料の補足なしでＢＭＣ-ＤＢＭ複合物を移植した場合、移植物の部分的分散とＤＢＭ粒子の移植部位から関節の関節面への侵入によって、非均質な再生表面の形成という結果となったことは、指摘しておかなければならない(図10)。

脱塩歯基質と骨髄細胞を、各種ポリマーととともに、又はポリマーなしで、被膜下移植した後の、マウスの腎臓断面の顕微鏡写真 ＢＭＣ+ＤＢＭをＲＴＧポリマーN2（図1A、1B）、N4 (図1C、1D)及びN7 (図 1E、1F)とともに移植した一ヵ月後には、新たに形成された皮質骨と骨梁、よく発達した骨髄腔と機能的に活性な骨髄が見られる。 ＲＴＧポリマーなしで、ＤＢＭ-ＢＭＣ複合物を移植後、1ヶ月。ＲＴＧポリマーとともに移植されたＤＢＭ-ＢＭＣ複合物(図1Aから1F)によって生じた異所性小骨にも、ＲＴＧポリマーなしに移植されたＤＢＭ-ＢＭＣ複合物 (図1G、1H)によって生じた異所性小骨にも、形成のレベルには差異が見られなかった。 ＤＢＭなしで、前述のＲＴＧポリマーの一つだけを補って移植されたＢＭＣでは、たいていの場合、小さな小骨が生じた。これは、ＲＴＧポリマーが、移植されたＢＭＣをまとまったままにすることに成功し、移植部位から移動して出て行くのを防いだことを意味する。前述のＲＴＧポリマーだけを腎臓被膜下に移植した場合は、移植部位には何の痕跡も残らなかった。（骨形成もなく、また、炎症などの副作用もなかった。） ＤＴＭ-ＢＭＣ複合物を、本発明に記載するシラン系の部位反応性ポリマーと組み合わせてマウスに使用した場合を示す。 ＤＢＭ-ＢＭＣ複合物を、本発明に記載するシラン系の部位反応性ポリマーと組み合わせてラットに使用した場合を示す。 ＤＴＭ+ＢＭＣ ＤＴＭ+ＢＭＣ+シラン系の部位反応性ポリマー（バイオポリマー#21：15%の改質プルロニック F-127水溶液） 。 ＤＴＭ+ＢＭＣ+シラン系の部位反応性ポリマー（バイオポリマー#22：17%の改質プルロニック F-127水溶液） 。 ＤＴＭ+ＢＭＣ+シラン系の部位反応性ポリマー（バイオポリマー#23：20%の改質プルロニック F-127水溶液）。 ＤＢＭ+ＢＭＣ ＤＢＭ+ＢＭＣ+シラン系の部位反応性ポリマー（バイオポリマー#21：15%の改質プルロニック F-127水溶液） 。 ＤＢＭ+ＢＭＣ+シランをベースとする部位反応性ポリマー（バイオポリマー#22：17%の改質プルロニック F-127水溶液） 。 ＤＢＭ+ＢＭＣ+シランをベースとする部位反応性ポリマー（バイオポリマー#23：20%の改質プルロニック F-127水溶液） 。 ＢＭＣ+ＤＢＭ (ラットの場合) 又は ＢＭＣ+ＤＴＭ（マウスの場合）をシラン系の部位反応性ポリマー（NN 21、22及び23）とともに移植した1ヶ月には、新たに形成された皮質骨と骨梁、よく発達した骨髄腔と機能的に活性な骨髄が見られる。シラン系の部位反応性ポリマーがあってもなくても、移植されたＤＴＭ-ＢＭＣ混合物によって生じた異所性小骨の形成レベルには差異が見られなかった。 ラットの頭蓋冠の頭頂部及び膝関節の骨軟骨複合組織において人工的に作られた欠損の実験モデルついて示した、拡大写真及び顕微鏡写真。 は、一般的な膝関節を、図2Bは骨軟骨複合組織を、図2Cは、正常な軟骨を示している。図2D(x5)には、大腿骨顆間部の、関節軟骨及び軟骨下骨における、標準的な人工的損傷（実験用に作られたマイクロフラクチャー穴）の、損傷直後の様子が示されている。 は、正常なラットの頭蓋を示す。6x6 mm²で全厚の骨切片を取り除いた直後の頭頂骨の欠損部分の様子が、拡大写真（図2F）及びX線写真（図2G）によって示されている。欠損部分全体の拡大断面を図2H(x5)に示す。略語： NCは正常な軟骨（normal cartilage）、DAは欠損部分（defect area）を表す。 実験用に作られた頭蓋冠の欠損を、脱塩骨基質（ＤＢＭ）と骨髄細胞（ＢＭＣ）の移植によって矯正する際の、ＲＴＧポリマー(N2とN4)の影響。 ＤＢＭ-ＢＭＣ複合物を、ＲＴＧポリマー材料N2(図3A(1)、3A(2))及びN4（図3B(1)、3B(2)）で補足して、実験用に作られた頭蓋冠の欠損に移植した後1ヶ月の、ラットの頭蓋冠のＸ線写真(図3A(1)、3B(1))及び拡大写真(図3A(2)、3B(2))は、骨の完全な再生を示している。 実験用に作った頭蓋冠の欠損に、ＲＴＧポリマー材料N2（図3A(3)及び3A(4)）及びN4(図3B(3)及び3B(4))を補ったＤＢＭ-ＢＭＣ 複合物を移植した後30日後の頭蓋断面の顕微鏡写真(x10)は、造血部分をともない新しく形成された骨組織の連続層と、移植されたＤＢＭ粒子の活発なリモデリングを示している。骨の切り口は、ほとんど見られない。略語：D Aは欠損部分（defect area）、CEは切り口（cut edge）を表す。 実験用に作られた頭蓋冠の欠損を、脱塩骨基質（ＤＢＭ）と骨髄細胞（ＢＭＣ）の移植によって矯正する際の、ＲＴＧポリマーN7の影響。 ＤＢＭ-ＢＭＣ複合物を、ＲＴＧポリマー材料N7で補助して、実験用に作られた頭蓋冠の欠損部分に移植した後1ヶ月の、ラットの頭蓋冠のＸ線写真(図4A)及び拡大写真(図4B)は 、骨の完全な再生を示している。 実験用に作った頭蓋冠の欠損に、ＲＴＧポリマー物質N7を補ったＤＢＭ-ＢＭＣ複合物を移植した後30日後の頭蓋断面の顕微鏡写真(x10)は、造血部分をともない新しく形成された骨組織の連続層と、移植されたＤＢＭ粒子の活発なリモデリングを示している。略語：D Aは欠損部分（defect area）、CEは切り口（cut edge）を表す。 実験用に作られた頭蓋冠の欠損を、骨髄細胞（ＢＭＣ）の移植によって矯正する際の、各種ＲＴＧポリマーの影響。 実験用に作った頭蓋冠の欠損部分に、ＲＴＧポリマー材料N2（図5A(1)、5A(2)）又はN7 (図5B(1)、5B(2))だけを補ってＢＭＣを移植した後1ヶ月後のラットの頭蓋冠のX線写真（図5A(1)、5B(1)）及び拡大写真(図5A(2)、5B(2))は、骨の再生が起こらないことを示している。 実験用に作った頭蓋冠の欠損に、ＲＴＧポリマー材料N2 (図5A(3)、5A(4))又はN7 (図5C(3)、5C(4))だけを補ってＢＭＣを移植した後30日後の頭蓋断面の顕微鏡写真(x10) では、骨の形成の無いことが確認できる。略語：D Aは欠損部分（defect area）、CEは切り口（cut edge）を表す。 実験用に作ったマイクロフラクチャー穴欠損に、ＲＴＧポリマーN2及びN4とともに脱塩骨基質と骨髄細胞を移植後1ヶ月の、矢上方向の膝関節断面の顕微鏡写真。 ＲＴＧポリマーN2を補ったＤＢＭ粒子とＢＭＣの混合物を、欠損部分に移植した(x10及びx20)。活発な血管形成と、ＤＢＭ粒子の部分的分解及びリモデリングが見られる。軟骨の形成は見られず、結合組織から再生表面が作られている。 ＲＴＧポリマーN2を補ったＢＭＣを欠損部分に移植した(x10及びx20)。軟骨下骨及び造血髄腔は再生されているが、軟骨の形成は無く、結合組織から再生表面が作られている。 ＲＴＧポリマーN4を補ったＤＢＭ粒子とＢＭＣの混合物を、欠損部分に移植した(x10及びx20)。ＤＢＭ粒子の部分的分解とリモデリング、及び造血髄腔の形成が見られる。軟骨形成は見られず、結合組織から再生表面が作られている。 ＲＴＧポリマーN4を補ったＢＭＣを欠損部分に移植した(x10及びx20)。軟骨下骨と造血髄は再生されているが、軟骨の形成は無く、結合組織から再生表面が作られている。 実験用に作ったマイクロフラクチャー穴欠損に、ＲＴＧポリマーN7とともに脱塩骨基質と骨髄細胞を移植後4週間後の、矢状方向の膝関節断面の顕微鏡写真。 ＲＴＧポリマーN7を補ったＤＢＭ粒子とＢＭＣの混合物を、欠損部分に移植した(x10及びx20)。大いに形成されつつある硝子軟骨と、かなり分解したＤＢＭ粒子が見られる。再生表面は、厚い硝子軟骨の層から作られている。 ＲＴＧポリマーN7を補ったＢＭＣを、欠損部分に移植した(x10及びx20)。軟骨下骨は完全に再生されている。損傷部分の表面は、結合組織と軟骨細胞の混合を含んでいる。 実験用に作ったマイクロフラクチャー穴欠損に、ＲＴＧポリマーN2及びN4とともに脱塩骨基質と骨髄細胞を移植後二ヶ月後の、矢状方向の膝関節断面の顕微鏡写真。 ＲＴＧポリマーN2を補ったＤＢＭ粒子とＢＭＣの混合物を、欠損部分に移植した(x10及びx20)。軟骨下骨の完全な再生が見られる。軟骨形成は見られず、結合組織から再生表面が作られている。 ＲＴＧポリマーN2を補ったＢＭＣを、欠損部分に移植した(x10及びx20)。軟骨下骨と造血髄腔は再生されているが、軟骨形成は無く、結合組織から再生表面が作られている。 ＲＴＧポリマーN4を補ったＤＢＭ粒子とＢＭＣの混合物を、欠損部分に移植した(x10及びx20)。ほとんど分解したＤＢＭ粒子とともに、よく発達した軟骨下骨と造血髄腔が見られる。軟骨形成は無く、結合組織から再生表面が作られている。 ＲＴＧポリマーN4を補ったＢＭＣを、欠損部分に移植した(x10及びx20)。軟骨下骨と骨髄腔は再生されているが、軟骨形成は無く、結合組織から再生表面が作られている。 実験用に作ったマイクロフラクチャー穴欠損に、ＲＴＧポリマーN7とともに脱塩骨基質及び骨髄細胞を移植後2ヶ月後の、矢状方向の膝関節断面の顕微鏡写真。 ＲＴＧポリマーN7を補ったＤＢＭ粒子とＢＭＣの混合物を、欠損部分に移植した(x10及びx20)。若い硝子軟骨の連続層とともに、軟骨下骨の完全な再生が見られる。かなり分解したＤＢＭ粒子も見られる。 ＲＴＧポリマーN7を補ったＢＭＣを、欠損部分に移植した(x10及びx20)。軟骨下骨は完全に再生している。損傷部分の表面は、結合組織と軟骨細胞の混合を含んでいる。 実験用に作ったマイクロフラクチャー穴欠損に、ポリマー材料の追加なしに脱塩骨基質及び骨髄細胞を移植した1ヶ月後の、矢状方向の膝関節断面の顕微鏡写真。 図には、ＤＢＭとＢＭＣを含む活性組成物だけを、ポリマー材料による十分な固定なしに使用し、ラットの膝関節における損傷骨軟骨複合組織の修復が不完全となったケースが示されている。 ＢＭＣの殆どが、移植部位流出した。その結果、移植部分はリモデリングしていないＤＢＭ粒子で満たされ、新しい骨の形成は殆ど見られなかった。 軟骨下骨と表面硝子軟骨の部分的再生が見られるが、ＤＢＭ粒子の一部が関節面に入り込み、連続的な軟骨層の形成を妨げている。 軟骨下骨と造血髄は完全に再生しているが、表面はＤＢＭで占められている。 ＤＢＭとＢＭＣを含む活性組成物が損傷部分から流出し、その結果、再生部位はほとんど結合組織で満たされた。

Claims (50)

1. 部位反応性ポリマーとともに、骨髄細胞(ＢＭＣ)及び脱塩骨基質（ＤＢＭ）又は脱塩歯基質（ＤＴＭ）を含み、さらに任意で、薬学的に受容可能な担体、付加剤、希釈物及び／又は賦形剤を含有する組成物。
2. 前記部位反応性ポリマーがＲＴＧポリマーである、請求項１の組成物。
3. 前記ＲＴＧポリマーが生分解可能なものである、請求項２の組成物。
4. 前記部位反応性ポリマーが、少なくとも１つのケイ素含有反応基を含むポリマーシステム又はＲＴＧポリマーである、請求項１又は２の組成物。
5. 前記部位反応性ポリマーが生分解可能である、請求項４の組成物。
6. 必要とする対象の関節、頭蓋−顔面−上顎骨、下顎及び上顎の歯槽骨、脊柱、骨盤、又は、長骨のいずれか１つへの間葉前駆細胞の移植に使用する、請求項１ないし５のいずれかの組成物。
7. 必要とする対象の骨外性骨の建設又は再建に使用する、請求項１ないし６のいずれかの組成物。
8. 必要とする対象の関節への又は関節の又は骨への人工的移植物の機械的又は生物学的な支持として使用される、請求項１ないし７のいずれかの組成物。
9. 活性剤、好ましくは骨形態発生タンパク質(ＢＭＰs)、免疫抑制剤、免疫調整剤、抗生物質及び抗炎症性薬品の群から選択されるものをさらに含む、請求項１ないし８のいずれかの組成物。
10. 前記ＲＴＧポリマーが、少なくとも２つの官能基を含む少なくとも１つの鎖展延剤又は結合剤によって共有結合された親水性及び疎水性セグメントを含み、前記親水性及び疎水性セグメントはそれ自体では体温での可逆熱ゲル化（Reverse Thermal Gelation）挙動を示さず、また、前記ポリマー成分の粘度が、所定の誘因に曝されることによって少なくとも約２倍に増加する、請求項１〜３、６〜９のいずれかの組成物。
11. 前記 ＲＴＧポリマーが、ポリエチレンオキサイド (ＰＥＯ)及びポリプロピレンオキサイド (ＰＰＯ)連鎖を含むセグメント化されたブロックコポリマーであり、前記ＰＥＯ及びＰＰＯ連鎖は、鎖展延剤を介して結合されており、該鎖展延剤は、フォスゲン、脂肪族又は芳香族のジカルボン酸、その反応性誘導体で塩化アシル及び無水物、ジアミン、ジオール、アミノ酸、オリゴペプチド、ポリペプチド、又は、塩化シアヌルなど、からなるグループから選択された、二官能基性、三官能基性又は多官能基性の分子、又は他の二官能基性、三官能基性は多官能基性の結合剤、又は他の分子であり、合成又は生物由来で、単、二、三、又は多官能基性の-OH、-SH、-COOH、-NH₂、-CN 又は‐NCO基で終わる疎水性及び親水性構成要素又は他の二官能基性又は多官能基性のセグメント及び／又はそれらの組み合わせと反応可能なものであるような、、請求項１〜３、６〜９のいずれかの組成物。
12. 前記 ＲＴＧ ポリマーが、プルロニック（登録商標）、好ましくはプルロニックF127（登録商標）又はF108（登録商標）である、請求項１〜３、６〜９のいずれかの組成物。
13. 前記ＲＴＧポリマーが、ランダム[-PEG6000-O-CO-(CH₂)₄-CO-O-PPG3000-]_n、ポリ（エーテル−エステル）、又は、交互[-PEG6000-O-CO-O-PPG3000-]_n ポリ(エーテル-カーボネート) である請求項１〜３、６〜９のいずれかの組成物。
14. 前記ケイ素含有反応基は、主に、所定の身体部位で、水の存在下で及び体温で起こる縮合反応が可能であり、前記反応が、重合及び／又は架橋結合によってポリマーシステムの分子量を増加させる結果となり、前記システムの流動学的及び機械的特性において少なくとも部分的な変化を生じさせる、請求項１、４〜９のいずれかの組成物。
15. 前記反応性ポリマーシステムは、主に、所定の身体部位で、水の存在下で起こる加水分解−縮合反応が可能な１以上のアルコキシシラン基を含み、前記反応がポリマーシステムの分子量を増加させ、前記システムの流動学的及び機械的特性に変化を生じさせる、請求項１、４〜９のいずれかの組成物。
16. 前記反応性ポリマーシステムが、単、二、又は三官能基性である少なくとも１つのケイ素含有反応基を含む、請求項１、４〜９のいずれかの組成物。
17. 前記反応性ポリマーシステムが、線状ポリマー、グラフトポリマー、櫛形ポリマー、星状ポリマー、架橋結合ポリマー及びそれらの組み合わせからなるグループから選択されるポリマーを生成する、請求項１、４〜９のいずれかの組成物。
18. 前記反応性ポリマーシステムが、また、ヒドロキシル、カルボキシル、チオール、アミン、イソシアネート、チオイソシアネート及び二重結合含有活性基及びそれらの組み合わせからなるグループから選択される追加の反応基を含む、請求項１、４〜９のいずれかの組成物。
19. 前記反応性ポリマーシステムが、また、固形成分を含む、請求項１、４〜９のいずれかの組成物。
20. 前記固形成分が、生分解性材料である、請求項１９の組成物。
21. 前記固形成分が、前記反応性ポリマーシステムに化学的又は物理的に結合された、請求項１９の組成物。
22. 前記反応性ポリマーシステムが、ポリオキシアルキレン、ポリエステル、ポリウレタン、ポリアミド、ポリカーボネート、アクリル及びメタクリルポリマー、ポリ無水物、ポリオルトエステル、ポリ尿素、ポリペプチド、ポリアルキレン、多糖類、及びそれらの組み合わせからなるグループから選択される、シリコン含有単量体、オリゴマー又は低分子量ポリマーである、請求項１、４〜９のいずれかの組成物。
23. 前記反応性ポリマーシステムが、ポリオキシアルキレンポリマー、鎖展延剤を介して結合されたポリエチレンオキサイド(ＰＥＯ)及び ポリプロピレンオキサイド (ＰＰＯ)連鎖を含むジブロック、トリブロック又は多重ブロック、セグメント化されたブロックコポリマーからなるグループから選択されたポリエチレンオキサイド(ＰＥＯ)及びポリプロピレンオキサイド (ＰＰＯ)を含むブロックコポリマー、化学式R-(OCH₂CH)_n-OHを持つポリ（アルキル−コ−オキシアルキレン）コポリマー（ここでは、Rは、ポリ（テトラメチレン グリコール）、ポリ（カプロラクトン）、ポリ（乳酸）、ポリ（シロキサン）、及びそれらの組み合わせからなるグループから選択された疎水性単官能基性セグメント）、化学式[-R’-(OCH₂CH)_n-O]_pHを持つポリ（アルキル−コ−オキシアルキレン）コポリマー（ここで、Rは、二官能基性又は多官能基性の疎水性セグメント）、ポリ（Ｎ−アルキル 置換アクリルアミド）、好ましくは、ポリ（Ｎ−イソプロピル アクリルアミド、セルロース及びセルロース誘導体、及びそれらの組み合わせからなるグループから選択されたものである、請求項１、４〜９のいずれかの組成物。
24. 前記反応性ポリマーシステムが、ポリエチレンオキサイド (ＰＥＯ) 及び ポリプロピレンオキサイド(ＰＰＯ)連鎖を含むセグメント化されたブロックコポリマーであり、前記ＰＥＯ及びＰＰＯ連鎖が鎖展延剤を介して結合され、前記鎖展延剤が、フォスゲン、脂肪族又は芳香族のジカルボキシ酸又は塩化アシル及び無水物などのそれらの反応性誘導体、又は、ＰＥＯ及びＰＰＯ連鎖のOH末端基と反応可能なジシクロヘキシルカルボジイミド(ＤＣＣ)のような他の分子、ヘキサメチレンジイソシアネート（ＨＤＩ）又はメチレンビスフェニルジイソシアネート（ＭＤＩ）からなるグループから選択される脂肪族又は芳香族のジイソシアネート、または塩化シアヌル、又は他の二官能基性又は多官能基性のセグメント及びそれらの組み合わせからなるグループから選択される、請求項１、４〜９のいずれかの組成物。
25. 前記ポリ（Ｎ−アルキル 置換アクリルアミド）が、アルコキシラン含有のビニル単量体を含むコポリマーである、請求項２３の組成物。
26. 前記反応性ポリマーシステムが、アルジネートとその誘導体、ヒアルロン酸とその誘導体、コラーゲン、ゼラチン、キトサンとその誘導体、アガロース、セルロースとその誘導体、及び、水溶性の合成、半合成又は天然のオリゴマー及びポリマーからなるグループから選択され、前記水溶性の合成、半合成又は天然のオリゴマー及びポリマーが、オリゴＨＥＭＡ、ポリアクリル酸、ポリビニルアルコール、グリセロール、ポリエチレンオキシド、TMPO、少糖類、多糖類、オリゴペプチド、ペプチド、蛋白質、酵素、成長因子、ホルモン、薬剤及びそれらの組み合わせからなるグループから選択される、請求項１、４〜９のいずれかの組成物。
27. 前記対象が、哺乳動物、好ましくは人間である、請求項６〜２６の組成物。
28. 前記ＤＢＭが、脊椎動物由来である、請求項１〜２７のいずれかの組成物。
29. 前記ＤＢＭが、人間由来である、請求項２８の組成物。
30. 前記ＤＢＭが、粉末状、粒子状、ひも状、又はスライスされた形状である、請求項１〜２９のいずれかの組成物。
31. 前記ＤＭＢが、粉末状又は粒子状であり、前記ＤＢＭの粒子サイズが、約５０〜２，５００μ、好ましくは、約２５０〜５００μである、請求項３０の組成物。
32. 前記ＢＭＣとＤＢＭの比率が、１：１〜２０：１(容積：容積)、 好ましくは、２：１〜９：１(容積：容積)、特に、４：１(容積：容積)である、請求項１〜３１のいずれかの組成物。
33. 前記組成物が、５：１〜１：５のあいだ、好ましくは３：１〜１：２のあいだの比率で、特に好ましくは、ＢＭＣ−ＤＢＭ混合物2に対し液体状のＲＴＧポリマー材料1(容積：容積)の比率で、ＢＭＣ−ＤＢＭ混合物とＲＴＧポリマーを含有する、請求項１〜３２のいずれかの組成物。
34. 新硝子軟骨及び/又は軟骨下骨構造を回復する及び/又は形成を向上させる請求項１〜３３のいずれかの組成物。
35. 遺伝的又は後天的骨異常、遺伝的又は後天的軟骨異常、原発性悪性骨又は軟骨異常、転移による骨欠陥又は造血器悪性腫瘍による骨病変、特に多発性骨髄腫、代謝性骨疾患、骨感染症、先天的又は後天的骨又は軟骨変形に伴う病気及びパジェット病のいずれかを患う患者を治療するための、請求項１〜３４のいずれかの組成物。
36. 複雑骨折の矯正、骨置換及び、又は性外科手術における新生骨の形成のいずれかが必要な患者を治療するための、請求項１〜３７のいずれかの組成物。
37. 前記組成物内における骨髄細胞の数が約10⁶〜4x10¹⁰ 細胞／mlである、請求項３３〜３６のいずれかの組成物。
38. 関節、頭蓋−顔面−上顎骨、上顎及び下顎の歯槽骨、脊柱、骨盤及び長骨のいずれかひとつへの、又は、必要とする対象の関節への又は関節の又は骨への人工的移植物の機械的又は生物学的支持の目的を含む骨外性骨の建設又は再建の目的での、部位反応性ポリマーとともにＤＢＭを備えたＢＭＣを含み、さらに任意で、薬学的に受容可能な担体又は希釈剤及び／又は追加の活性剤を含む混合物の移植方法であり、請求項1〜３７のいずれかに規定される組成物を前記関節又は骨に導入することを含む移植方法。
39. 前記混合物が、非侵襲的に、注射、関節内視鏡手術によって、又は観血的手術によって移植部位へ投与される、請求項３８に記載の方法。
40. 哺乳動物、好ましくは該当する治療を必要とする人間の、軟骨及び／又は軟骨下骨の奇形及び／又は機能障害に関係する、関節損傷、外傷後の、炎症性の、自己免疫性の、感染性の又は変形性の病因の治療方法であって、前記哺乳動物の患部関節又は骨への請求項１〜３７のいずれかの組成物の投与を含む治療方法。
41. 前記組成物に含まれるＢＭＣが、同種のもの又は前記哺乳動物自身のもののいずれかである、請求項４０の方法。
42. 必要とする対象の関節又は頭蓋−顔面−上顎骨への移植物の導入を含む、関節移植物又は他の筋肉骨格移植物の支持のための非侵襲的移植方法であって、前記移植物が、請求項１〜３７いずれかの組成物を含む、非侵襲的移植方法。
43. 哺乳動物、好ましくは人間へ移植するための間葉細胞及び／又は間葉前駆細胞の移植物としての、請求項１〜３７のいずれかの組成物の使用。
44. 前記移植が前記哺乳動物の関節又は頭蓋−顔面−上顎骨へ行われる、請求項４３の使用。
45. 前記移植が、新しい骨及び／又は軟骨の形成を目的とする、請求項４３、４４のいずれかの使用。
46. 遺伝的又は後天的骨異常、遺伝的又は後天的軟骨異常、原発性又は二次性悪性骨又は軟骨異常、代謝性骨病、骨感染、外傷性、感染性、炎症性、自己免疫性の病因に起因する骨又は軟骨の奇形に関係する状態、及びパジェット病のいずれかの患者を治療するのに使用される、請求項１〜３７のいずれかの組成物。
47. 複雑骨折の矯正、骨置換、及び形成又は性外科手術における新生骨の形成、のいずれかを必要とする患者を治療するのに使用される請求項１〜３７のいずれかの組成物。
48. 骨又は軟骨異常の治療のための移植物の作成における、部位反応性ポリマーとともに用いる、ＢＭＣとＤＢＭの混合物の使用。
49. 関節、頭蓋−顔面−上顎骨、上顎及び下顎の歯槽骨、脊柱、骨盤及び長骨のいずれかひとつへの、又は、哺乳動物の関節への又は関節の又は骨への人工移植物の機械的又は生物学的支持の目的を含む骨外性骨の建設又は再建を目的とする、ＤＢＭ及び部位反応性ポリマーを混合したＢＭＣの移植を実施するキットであり、前記キットが次のものを含むこと：
    (a) 粉末状、粒子状、ひも状、又はスライス形状のＤＢＭ；
    (b) 部位反応性ポリマー；
    (c) BM吸引用針；
    (d) 内骨穿孔バー；
    (e) 粘性の骨髄-ＤＢＭ部位反応性ポリマー混合物を注入するための内腔の大きい針；
    (f) ＢＭＣ をＤＢＭ及び部位反応性ポリマー及び希釈剤と同時に混合するための、二方向内腔コネクタ；
    (g) ＢＭＣを維持するための媒質；及び、任意で、
    (h) 骨形成を促進する追加の要素；及び
    (i)ＢＭＣ又はＤＢＭと混合したＢＭＣを、取り扱い、維持する低温手段
50. 任意でさらに、前記ＢＭＣ及びＤＢＭの混合物用、及び前記部位反応性ポリマー用の担体及び／又は希釈剤を含む、請求項４９のキット。

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