CN103054812B - 一种具有温敏开关的生长因子控释微球及其制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及药物控释领域，公开了一种具有温敏开关的生长因子控释微球及其制备方法、以及具有温敏开关的生长因子控释微球制剂及其制备方法。该具有温敏开关的生长因子控释微球可应用于牙科。该具有温敏开关的生长因子控释微球，其特征在于，包含骨形态发生蛋白-2、重均分子量为100-105kDa的甲基丙烯酸缩水甘油酯右旋糖酐、重均分子量为100kDa的明胶、重均分子量为17kDa聚丙基丙烯酰胺，以及助溶剂、乳化剂和稳定剂。

Description

一种具有温敏开关的生长因子控释微球及其制备方法

技术领域

本发明涉及药物控释领域，尤其涉及一种具有温敏开关的生长因子控释微球及其制备方法，该具有温敏开关的生长因子控释微球应用于牙科。

背景技术

牙周炎是世界范围内慢性炎症性疾病，是人类口腔健康的“头号杀手”，并与心血管疾病、糖尿病等全身疾病的发病密切相关。牙周炎导致的牙周组织缺损是成人牙齿丧失的主要原因。传统牙周治疗如洁/刮治术、翻瓣术等虽然在一定程度上控制了牙周炎症的进一步发展和牙周支持组织的进一步丧失，却不能使丧失的牙周组织获得良好的再生；牙周骨移植、引导组织再生和引导骨再生技术的广泛开展和临床应用，大大提高了牙周病治疗的临床疗效，但在恢复牙周组织的生理结构和功能上远未达到所期望的目标。

近年来，干细胞生物学和组织工程研究取得了突飞猛进的发展，利用干细胞治疗结合组织工程的原理、技术和方法促进牙周组织再生的研究正引起越来越广泛的重视和关注，并日益成为牙周再生研究的重点和核心。然而，利用体外培养的（干）细胞，通过组织工程、基因工程手段实现牙周组织再生还停留在实验室研究阶段，离真正的临床应用还有较远的距离；这是由于围绕干细胞治疗、基因治疗的临床转化还有很多“瓶颈”问题没有得到根本解决。最近研究表明，机体干细胞龛中的干细胞在一定条件下可以参与多种组织创伤的修复过程，实现内源性组织再生（endogenous tissueregeneration）。因此，刺激和增强机体自我修复创伤的能力，募集机体内源性干细胞促进牙周组织再生具有重要临床意义，可以加速临床转化。

外源性高效生物活性因子作为一种有效的治疗工具，在一定程度上可以激发机体组织自我修复再生的潜能，实现内源性牙周组织再生。牙周组织具有复杂的生理结构和功能，至少涉及到牙槽骨、牙周膜和牙骨质三种完全不同的组织，是组织再生研究领域的难点，因此牙周缺损可以作为模型缺损用于再生策略研究从而为多种组织缺损修复提供经验。多种生长因子在牙周组织修复再生过程中起到的关键作用已经引起了广泛关注，研究表明不同生长因子可以调节牙周相关细胞的增殖、趋化、分化和细胞外基质的生物合成，能明显促进牙周组织的再生和修复。骨形态发生蛋白（BMP）-2在动物实验和临床应用中均显示出良好的促进牙周及骨组织再生的潜能。但外源性生长因子价格昂贵、半衰期短，局部使用很快被稀释和代谢，或因体内生物酶降解作用而失活；因此，只有借助合适的载体/缓释系统才能使生长因子在组织缺损局部持续高效发挥作用，更好地促进组织再生。实际上，生长因子缓/控释系统的研制与开发已经成为再生医学特别是内源性再生医学研究领域的重要研究内容之一。

生长因子载体与缓/控释系统可以避免生长因子在体内被组织液稀释、代谢或因酶的降解而失活；同时借助缓/控释系统也可以使活性因子向缺损组织定位、持续释放，极大刺激缺损区域组织自身的修复再生潜能。生长因子与多种支架材料直接复合后，虽然可以取得比单纯支架好的效果，但这种简单复合（add-on或absorb-in）不能实现生长因子的生物缓释，只有借助缓释系统的作用，才有望实现良好的组织再生。发明人认为，天然生物材料微球生长因子缓释系统，具有传统缓释载体无与伦比的优良性能，主要包括：微球结构可以保护药物免受外界环境的破坏，将不可混合的多种药物隔离，使不同类的材料具有良好的亲和性；可以通过制备工艺改变，调节微球系统的释药性能；生物相容性好，在生物体内易吸收、易游走；稳定性好，易功能化，制备简单；同时微载体可以进行体外释药的动态观察研究，根据不同需要制备具有不同释药效能的缓释系统，从而适应不同组织再生的要求。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的在于利用纯天然材料，提供一种具有温敏开关的生长因子控释微球的材料配方和相应制备方法、以及具有温敏开关的生长因子控释微球制剂和相应制备方法。

为了达到上述目的，本发明采用以下技术方案予以实现。

技术方案一：

一种具有温敏开关的生长因子控释微球，其特征在于，包含骨形态发生蛋白-2、重均分子量为100-105kDa的甲基丙烯酸缩水甘油酯右旋糖酐、重均分子量为100kDa的明胶、重均分子量为17kDa聚丙基丙烯酰胺，以及助溶剂、乳化剂和稳定剂。

上述技术方案的特点和进一步改进在于：

优选地，所述骨形态发生蛋白-2、甲基丙烯酸缩水甘油酯右旋糖酐、明胶和聚丙基丙烯酰胺的质量比为（0.8-1.2）：（1.8×10⁴-2.2×10⁴）：（1.2×10⁴-1.8×10⁴）：（2.4×10³-3.6×10³）。

优选地，所述助溶剂包含磷酸盐缓冲液；所述乳化剂包含体积比为（2-4）:1的二氯甲烷和丙酮混合溶剂；所述稳定剂包含重均分子量为40-60kDa的海藻酸钠。更优选地，磷酸盐缓冲溶液的pH值为7.1-7.3；乳化剂也可选自二氯甲烷、氯仿、乙酸乙酯、二氧六环、丙酮、四氢呋喃、冰醋酸、苯、甲苯中的一种或两者以上的混合物。

优选地，所述甲基丙烯酸缩水甘油酯右旋糖酐中，右旋糖酐分子量为37-39.6kDa，甲基丙烯酸缩水甘油酯和右旋糖酐的聚合比例为1：（80-120）；所述甲基丙烯酸缩水甘油酯右旋糖酐、明胶和聚丙基丙烯酰胺的聚合比例为1：（0.6-1.2）：（0.05-0.09）。

优选地，所述生长因子控释微球的平均粒径为5.9-21.5μm。

技术方案二：

上述具有温敏开关的生长因子控释微球的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

步骤1：称取质量为8.0×10⁴-1.2×10⁵份的磷酸盐缓冲液，将质量为0.8-1.2份的骨形态发生蛋白-2溶于磷酸盐缓冲液中，制成质量浓度为6.7×10^-4-1.5×10^-3％的水相溶液；

步骤2：将质量为1.8×10⁴-2.2×10⁴份的重均分子量为100-105kDa的甲基丙烯酸缩水甘油酯右旋糖酐、1.2×10⁴-1.8×10⁴份的重均分子量为100kDa的明胶、2.4×10³-3.6×10³份的重均分子量为17kDa聚丙基丙烯酰胺依次溶于8.0×10⁵-1.2×10⁶份的体积比为（2-4）:1的二氯甲烷和丙酮混合溶剂中，冰浴超声分散0.8-1.2min，制成质量浓度为2％-4.5％的油相溶液；

步骤3：将所述水相溶液和所述油相溶液制备成油包水型乳液，将质量为4.0×10⁴份的重均分子量为4-6万的海藻酸钠溶于剩余质量份的磷酸缓冲液中，与所述油包水型乳液混合后冰浴超声分散0.8-1.2min，制成微乳液；

步骤4：将所述微乳液在室温下低速搅拌3-5min，自然挥发或抽提去除二氯甲烷，制得所述具有温敏开关的生长因子控释微球。

技术方案三：

技术方案一或技术方案二所述的制备方法制得的具有温敏开关的生长因子控释微球在治疗牙周炎药物中的应用。

技术方案四：

一种具有温敏开关的生长因子控释微球制剂，其特征在于，包括具有温敏开关的生长因子控释微球以及药学上可接受的辅料。优选地，所述药学上可接受的辅料为聚氧乙烯聚氧丙烯醚。

技术方案五：

技术方案四所述的具有温敏开关的生长因子控释微球制剂的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：在低于20℃的温度下，将技术方案二所述的制备方法制得的具有温敏开关的生长因子控释微球边搅拌边加入6.0×10³-9.0×10³重量份的聚氧乙烯聚氧丙烯醚，溶解后制得具有温敏开关的生长因子控释微球制剂。

本发明采用含“温敏”开关的聚丙基丙烯酰胺（PNIPAM）的甲基丙烯酸缩水甘油酯右旋糖酐（Dex-GMA）/明胶（gelatin）凝胶微球包封骨形态发生蛋白-2后制成生长因子控释微球，可以控制药物仅在低临界温度（LCST）（37.2℃）以一定的速度释放，延长药物的生理活性，提高药物的稳定性和靶向性；将“温敏”开关的聚丙基丙烯酰胺（PNIPAM）加入到生长因子微球中制得的生长因子控释微球凝胶制剂具有温敏控释的优点，可有效发挥药理活性。

多聚体类生物材料有良好的生物相容性和降解能力，降解产物无毒、可吸收，因此聚乳酸（PLA）、聚乙醇酸（PGA）以及它们的共聚物（PLGA）是报道最多的用来制备微球药物输送系统（drug delivery system,DDS）的生物原材料。尽管这些人工合成的多聚体生物材料有很多优良性能，但作为蛋白类活性药物的载体，却有一定的局限性。首先，多聚体生物材料制备微球DDS过程中，有机溶剂的使用会造成部分药物活性丧失；其次，多聚体生物材料降解过程中产酸，酸性产物也会造成其携带的药物进一步失活；同时，药物从多聚体生物材料DDS中释放的可控性也较差。虽然近年来通过改性、复合其它生物材料、增加功能基团的方法，很多研究已经克服了这些材料的缺点，但工艺复杂，离临床应用还十分遥远。

而胶原、多糖基水凝胶等天然生物材料来源广泛，具有良好的生物相容性，且大多是美国食品和药物管理局FDA允许临床应用、有些甚至已经应用于临床的生物材料（如：胶原、右旋糖酐）；其作为制备生长因子DDS原材料，制备方便（可以制备不同的剂型）、工艺简单、反应条件温和，是较为理想的用来制备生长因子等活性药物DDS的原材料，具有广阔的临床应用前景。

明胶（gelatin,Gtn）是来源于动物胶原的一种天然生物材料，其等电点可以通过制备工艺进行调节，从而制备成酸性明胶和碱性明胶。不同等电点的明胶会与荷电相反的信号分子通过离子间的相互作用而结合，因此酸性明胶可以与碱性生长因子（bFGF、TGF-β、IGF等）结合，而碱性明胶可以与酸性生长因子（BMP、VEGF等）结合，这种结合可以使生长因子的释放得到有效的延长，由此可见明胶基生物材料可以作为不同生长因子的载体。然而水性环境中，单纯明胶的快速增溶（rapid solubilization）作用会破坏这种静电吸附，仍然导致生长因子产生极为明显的“突释”效应，体外24h内释药甚至可达70%以上，达不到预期的缓释效果，这在我们的前期实验中已经得到证实。

右旋糖酐（Dextran,Dex）是一种天然多糖材料，作为血浆替代品很早就已经应用于临床。右旋糖酐基水凝胶作为抗癌药物、蛋白、脂质体载体国内外学者已经积累大量的研究经验，制备方法包括结晶化、物理交联、化学交联、辐射交联共聚合等等，其制备工艺简单；可以制备不同粒径的微球或者微囊，载药量大、包封率高；其降解依赖生物酶（葡聚糖酶，dextranase）的作用，交联度（degree of substitution,DS）可以通过制备工艺进行调节，水解增溶作用小；改良后的右旋糖酐基水凝胶载体材料，可以赋予其温度敏感、pH敏感特性，对周围环境变化具有可“感知”能力，具有智能给药的材料基础，有望达到智能控释给药的目的。然而作为生长因子载体，右旋糖酐基生物材料缺乏与明胶相似的与生长因子的静电作用，只能形成一种物理的包封与吸附，药物极易通过“扩散、渗透作用”而快速释放，因此“突释”效应也非常明显。

但是，利用明胶对生长因子的静电吸附作用和右旋糖酐基水凝胶的酶降解特征，通过物理或化学的方法将这两种材料进行耦合，目标产物的药物释放就会大大延长。材料降解控制释药，包封葡聚糖酶控制降解，为减少药物的初期“突释”、实现生长因子的长时间释放提供了新的契机。我们在前期的实验中，利用甲基丙烯酸缩水甘油酯-右旋糖酐（Dex-GMA）和明胶（Gtn）在水成溶液PEG中的不混溶性和甲基丙烯酸激进分子与明胶的交联耦合作用，在反应促进剂的存在的条件下成功制备了Dex-GMA/Gtn凝胶微球，避免了有机溶剂的使用，不同的BMP包封方法均达到了对生长因子的生物缓释作用。我们取得的实验结果主要包括：①首先成功对右旋糖酐基生物材料进行改性，枝接激进分子；②实现了明胶与右旋糖酐基生物材料的有机结合，其释药主要由材料降解决定；③在国外学者研究的基础上，建立了避免有机溶剂参与的完全水性环境（All-aqueous enviroment）中合成生长因子微载体的方法；④在一定程度上实现了生长因子的生物缓/控释。

本发明将智能给药的经验引入活性生长因子的控制释放，制备生长因子控释微球，成为外源性生长因子开发和利用的得力手段，将为组织再生、组织工程、器官移植等多领域的研究提供更为广阔的空间。温敏型智能载体由于在应用过程中很容易实现，是目前控释给药研究的重点。由于微球系统的“突释效应”主要是由于其表面的膜孔在释药早期广泛开放引起的，因此采用膜孔内接枝温敏“开关”堵塞部分药物释放通道，不仅可以较好地减小“突释效应”，而且可以通过温度控制微囊膜内接枝链的膨胀/收缩特性从而达到生长因子的可控释放。因此我们在前面的实验基础上，将温敏“开关”聚丙基丙烯酰胺（PNIPAM）接枝到微凝胶缓释系统（微球）的膜孔中，在解决药物的“突释效应”的同时，又可以通过温度的改变控制生长因子的释放，是生长因子智能化控释的一种全新的尝试。温敏型药物载体的低临界温度（LCST）是其实现药物可控释放的关键：温度在LCST以下，药物载体释药减慢甚至不释药；而温度达到或超过LCST，释药则明显加快。正是利用这个原理，我们制备的生长因子控释系统的LCST在37℃左右。这样体外低于37℃情况下，药物释放很少，只有在植入体内时，药物才真正释放，从而实现我们牙周的智能化控释给药。

本发明利用智能化微球包裹技术，以天然生物材料为载体的控释微球不但可以控制药物以一定的速度释放，而且可以通过合适的释药途径延长药物的生理活性，提高药物的稳定性，而且具有一定的靶向性，从而使药物的药理活性达到较理想的效果。本发明中采用的天然包埋材料甲基丙烯酸缩水甘油酯右旋糖酐（Dex-GMA）/明胶（gelatin），由甲基丙烯酸缩水甘油酯右旋糖酐（Dex-GMA）和明胶（gelatin）按一定比例通过交联聚合得到，为无定型聚合物，共聚物具有更大的亲水性，可用于药物控释载体和组织工程细胞培养支架，具有组织相容性好，对人体安全无害等特点。骨形态发生蛋白-2通过含“温敏”开关的聚丙基丙烯酰胺（PNIPAM）的甲基丙烯酸缩水甘油酯右旋糖酐（Dex-GMA）/明胶（gelatin）凝胶微球包封后制成的控释微球具有长时间和温敏控释特点。

本发明采用的明胶（gelatin,Gtn）是来源于动物胶原的一种天然生物材料，化学性质比较稳定，无毒，具有吸湿性，绝大多数都易溶于水，可溶于乙醇、丙酮、氯仿等多数有机溶剂，通常情况下不活泼、不水解、耐热，可用热压灭菌。在室温条件下，分子量在100以下的明胶通常为无色或几乎无色的透明澄清粘稠液体，分子量在2000以上的为固体。明胶水溶液pH值成微酸性或微碱性，其分子链上两段的羟基都具有反应活性，能发生所有脂肪族羟基所能进行的化学反应。明胶目前应用极为广泛，它可应用于医药、卫生、食品、化工等综合能更多领域，具有以下优点：首先明胶是无毒和低免疫原性亲水聚合物，具有良好的生物相容性；其次，明胶是种两亲性物质，既可以溶解于水，又可以溶解于绝大多数的有机溶剂，明胶具有化学惰性，对绝大多数化学反应稳定，但在其羟基火化后又易于跟含有氨基等化合物进行键合，把许多优良性质转移到结合物中；除此以外，明胶价格相对低廉，适宜规模化生产。

本发明采用的右旋糖酐（Dextran,Dex）对人体无毒无害，是经美国FDA批准用作血浆代替品的材料，具有良好的生物可降解性，使用后能被自然界中微生物完全降解，最终生成二氧化碳和水，不污染环境，是公认的环境友好材料。

本发明采用的甲基丙烯酸缩水甘油酯右旋糖酐由右旋糖酐与甲基丙烯酸缩水甘油酯按一定比例通过共聚得到，为无定型聚合物，玻璃化转变温度为40-55℃，粘度IV（dl/g）范围：0.10～1.0。作为优选，甲基丙烯酸缩水甘油酯右旋糖酐（Dex-GMA）中，右旋糖酐（Dextran T40）分子量为37-39.6kDa，甲基丙烯酸缩水甘油酯和右旋糖酐的聚合比例为1：80-120。甲基丙烯酸缩水甘油酯右旋糖酐（Dex-GMA）、明胶和聚丙基丙烯酰胺的聚合比例为1：（0.6-1.2）：（0.05-0.09）。

本发明优选稳定剂采用重均分子量为4-6万的海藻酸钠，分子式为（C6H7O8Na）n，主要由海藻酸的钠盐组成，由a-L-甘露糖醛酸（M单元）与b-D-古罗糖醛酸（G单元）依靠1,4-糖苷键连接并由不同GGGMMM片段组成的共聚物。海藻酸钠是一种天然多糖，具有药物制剂辅料所需的稳定性、溶解性、粘性和安全性。

本发明在具有温敏开关的生长因子控释微球制剂中，包括具有温敏开关的生长因子控释微球以及药学上可接受的辅料；优选药学上可接受的辅料为聚氧乙烯聚氧丙烯醚。其中，聚氧乙烯聚氧丙烯醚（泊洛沙姆）是一种高分子非离子型表面活性剂，为美国国家处方集新增加的药物辅助材料，具有在低温下（4-5℃）为液体，体温下为凝胶的独特性质。凝胶具有黏附性能好，不易在骨创伤组织脱落和挥发的优点。本发明提供的具有温敏开关的生长因子控释微球制剂在4-5℃为可流动的胶体，20-38℃为凝胶。

附图说明

下面结合附图和具体实施例，对本发明作进一步详细说明。

图1为本发明的具有温敏开关的生长因子控释微球的扫描电镜图，其中，（A）微球胶体溶液电镜图；（B）单个微球电镜放大图；（C）（D）（E）均为温敏开关电镜放大图。

图2为本发明的具有温敏开关的生长因子控释微球粒径分布图。

图3为本发明的具有温敏开关的生长因子控释微球中不同温度下生长因子体外释药曲线图。

具体实施方式

本发明中，右旋糖酐购自夏斯生物科技公司；甲基丙烯酸缩水甘油酯购自百灵威科技有限公司，明胶、海藻酸钠、骨形态发生蛋白-2和骨形态发生蛋白-2Elisa试剂盒购自SIGMA公司；磷酸盐缓冲液，购自西安化学试剂厂；聚氧乙烯聚氧丙烯醚（泊洛沙姆），购自上海医药公司。

实施例1：制备具有温敏开关的生长因子控释微球（胶体溶液）

称取5μg骨形态发生蛋白-2药物溶于0.5g磷酸盐缓冲液中，待其全部溶解后作为水相；称取150mg甲基丙烯酸缩水甘油酯右旋糖酐和明胶（甲基丙烯酸缩水甘油酯右旋糖酐的重均分子量为100-105kDa，明胶的重均分子量为100kDa，聚丙基丙烯酰胺的重均分子量为17kDa，甲基丙烯酸缩水甘油酯右旋糖酐（Dex-GMA）、明胶和聚丙基丙烯酰胺的聚合比例为1：0.6：0.05）溶于5g有机溶剂中（二氯甲烷：丙酮＝6：2）作为油相；将上述水相、油相混合，超声分散1min制备乳剂，备用。将上述乳剂缓慢加入20g磷酸盐缓冲液（磷酸盐缓冲液中含200mg海藻酸钠），超声分散1min，并继续在室温低速搅拌3h，除去有机溶剂，即得制得具有温敏开关的生长因子控释微球。

实施例2：制备具有温敏开关的生长因子控释微球（胶体溶液）

称取10μg骨形态发生蛋白-2药物溶于1g磷酸盐缓冲液中，待其全部溶解后作为水相；称取300mg甲基丙烯酸缩水甘油酯右旋糖酐和明胶（甲基丙烯酸缩水甘油酯右旋糖酐的重均分子量为100-105kDa，明胶的重均分子量为100kDa，聚丙基丙烯酰胺的重均分子量为17kDa，甲基丙烯酸缩水甘油酯右旋糖酐（Dex-GMA）、明胶和聚丙基丙烯酰胺的聚合比例为1：1：0.07）溶于10g有机溶剂中（二氯甲烷：丙酮＝6：2）作为油相；将上述水相、油相混合，超声分散1min制备乳剂，备用。将上述乳剂缓慢加入40g磷酸盐缓冲液（磷酸盐缓冲液中含400mg海藻酸钠），超声分散1min，并继续在室温低速搅拌5h，除去有机溶剂，即得制得具有温敏开关的生长因子控释微球。

实施例3：制备具有温敏开关的生长因子控释微球（胶体溶液）

称取20μg骨形态发生蛋白-2药物溶于2g磷酸盐缓冲液中，待其全部溶解后作为水相；称取600mg甲基丙烯酸缩水甘油酯右旋糖酐和明胶（甲基丙烯酸缩水甘油酯右旋糖酐的重均分子量为100-105kDa，明胶的重均分子量为100kDa，聚丙基丙烯酰胺的重均分子量为17kDa，甲基丙烯酸缩水甘油酯右旋糖酐（Dex-GMA）、明胶和聚丙基丙烯酰胺的聚合比例为1：1.2：0.09）溶于20g有机溶剂中（二氯甲烷：丙酮＝6：2）作为油相；将上述水相、油相混合，超声分散1min制备乳剂，备用。将上述乳剂缓慢加入80g磷酸盐缓冲液（磷酸盐缓冲液中含800mg海藻酸钠），超声分散1min，并继续在室温低速搅拌4h，除去有机溶剂，即得制得具有温敏开关的生长因子控释微球。

实施例4：制备具有温敏开关的生长因子控释微球（胶体溶液）

称取4μg骨形态发生蛋白-2药物溶于0.6g磷酸盐缓冲液中，待其全部溶解后作为水相；称取120mg甲基丙烯酸缩水甘油酯右旋糖酐和明胶（甲基丙烯酸缩水甘油酯右旋糖酐的重均分子量为100-105kDa，明胶的重均分子量为100kDa，聚丙基丙烯酰胺的重均分子量为17kDa，甲基丙烯酸缩水甘油酯右旋糖酐（Dex-GMA）、明胶和聚丙基丙烯酰胺的聚合比例为1：1：0.09）溶于6g有机溶剂中（二氯甲烷：丙酮＝6：2）作为油相；将上述水相、油相混合，超声分散1.2min制备乳剂，备用。将上述乳剂缓慢加入16g磷酸盐缓冲液（磷酸盐缓冲液中含160mg海藻酸钠），超声分散0.8min，并继续在室温低速搅拌3h，除去有机溶剂，即得制得具有温敏开关的生长因子控释微球。

实施例5：制备具有温敏开关的生长因子控释微球（胶体溶液）

称取6μg骨形态发生蛋白-2药物溶于0.4g磷酸盐缓冲液中，待其全部溶解后作为水相；称取150mg甲基丙烯酸缩水甘油酯右旋糖酐和明胶（甲基丙烯酸缩水甘油酯右旋糖酐的重均分子量为100-105kDa，明胶的重均分子量为100kDa，聚丙基丙烯酰胺的重均分子量为17kDa，甲基丙烯酸缩水甘油酯右旋糖酐（Dex-GMA）、明胶和聚丙基丙烯酰胺的聚合比例为1：1.2：0.07）溶于4g有机溶剂中（二氯甲烷：丙酮＝6：2）作为油相；将上述水相、油相混合，超声分散0.8min制备乳剂，备用。将上述乳剂缓慢加入24g磷酸盐缓冲液（磷酸盐缓冲液中含240mg海藻酸钠），超声分散1.2min，并继续在室温低速搅拌5h，除去有机溶剂，即得即得制得具有温敏开关的生长因子控释微球。

实施例6：制备具有温敏开关的生长因子控释微球制剂

在实施例1制备的骨形态发生蛋白-2控释微球胶体溶液中，在低温（温度低于20℃）搅拌下，少量多次加入3.75g聚氧乙烯聚氧丙烯醚，使之完全溶解即得。

实施例7：制备具有温敏开关的生长因子控释微球制剂

在实施例2制备的骨形态发生蛋白-2控释微球胶体溶液中，在低温（温度低于20℃）搅拌下，少量多次加入7.5g聚氧乙烯聚氧丙烯醚，使之完全溶解即得。

实施例8：制备具有温敏开关的生长因子控释微球制剂

在实施例3制备的骨形态发生蛋白-2控释微球胶体溶液中，在低温（温度低于20℃）搅拌下，少量多次加入15g聚氧乙烯聚氧丙烯醚，使之完全溶解即得。

实施例9：制备具有温敏开关的生长因子控释微球制剂

在实施例4制备的骨形态发生蛋白-2控释微球胶体溶液中，在低温（温度低于20℃）搅拌下，少量多次加入3.0g聚氧乙烯聚氧丙烯醚，使之完全溶解即得。

实施例10：制备具有温敏开关的生长因子控释微球制剂

在实施例5制备的骨形态发生蛋白-2控释微球胶体溶液中，在低温（温度低于20℃）搅拌下，少量多次加入4.5g聚氧乙烯聚氧丙烯醚，使之完全溶解即得。

实施例11

分别取实施例1至5中制备的生长因子控释微球胶体溶液各10μL，共5份样本，用光学显微镜观察微球的表面形态，微球表面光滑圆整，球体大小较均匀。将微球置于载玻片上，尽量对微球进行分散后，在显微镜下随机选取1个视野进行拍照，以照片上的标尺为依据对每一个微球的直径进行测量。每5μm为单位，直径±2.5μm的全部计入，平均粒径为5.9-21.5μm，粒径分布范围较窄。

实施例12

取骨形态发生蛋白-2对照品约10mg，精密称重，置于100g量瓶中，加水溶解并稀释至刻度，摇匀，依次稀释，使实际配置的对照品溶液浓度分别为0.1，0.2，0.5，1，5，10，20，50ng/L，加入到微量反应板的微孔中。按照SIGMA公司提供的操作程序，采用酶联免疫吸附法（ELISA）在HTS7000紫外荧光高效分析仪测定标准样品在在490nm波长的吸光度（OD）。以OD值为纵坐标，标准的骨形态发生蛋白-2浓度C进行对数直线回归，绘制标准曲线。回归方程为：A=0.48899+0.08602C n=7，r=0.9973，由图像分析可知，在1-600nm范围内为线性关系较好的直线方程，骨形态发生蛋白-2浓度的对数与吸收度有定量关系。

将实施例1制备的生长因子控释微球的胶体溶液在4℃、40000rpm条件下离心，2h后分离样品中上清液，测定骨形态发生蛋白-2浓度，分别计算骨形态发生蛋白-2的载药量和包封率。其中,

载药量公式：

包封率公式为：

取实施例1制备的20mg生长因子控释微球，置于透析袋中，加入3mL PBS缓冲液（pH=7.4）,密封后置于盛有300mL PBS的大烧杯中，模拟聚丙基丙烯酰胺低临界温度（LCST）以上（37.2℃，20rpm）和聚丙基丙烯酰胺低临界温度（LCST）以下（36℃，20rpm）环境在水浴箱中恒速振荡。分别于1-32d定时（11am）取样，测定不同时点样品上清液含量。以累计释放量和时间拟合方程，制作生长因子控释微球体外释药曲线。生长因子微球的体外释药曲线显示:本发明提供的生长因子控释微球体外能够持续释药，具有明显的控释作用。在低临界温度（LCST）以上时，释药32天可达90%左右，而低临界温度（LCST）以下时，释药32天低于30%，显示明显的温控释药。

常规测定本发明实施例1-5提供的生长因子控释微球的包封率和载药量分别为（82.3±3.25）％和[(2.86±0.13)×10^-5]%。微球在32d内，不仅一直持续释放骨形态发生蛋白-2，而且所释放出的骨形态发生蛋白-2浓度可以保持在一定的水平：(52.53-73.89)fmol/μL，平均浓度为(64.32±10.96)fmol/μL。经检测表明，本发明提供的生长因子控释微球的在聚丙基丙烯酰胺低临界温度（LCST）以上时，突释期仅为13.25％，32d后释放度达90.30％。以累积释放率和时间进行拟合，生长因子控释微球的体外释药规律符合Higuichi方程:Ｑ=27.7636ｔ^1/2-13.4247,ｒ=09975（ｎ=3）。

实施例13：骨损伤的治疗效果验证

试验用杂种犬32只，每只约10-12kg，分为3组，对照组、空白组、和试验组1至6各4只动物，实验室饲养一周。试验用犬均经速眠新液（1ml/kg）麻醉后仰卧固定。手术选取左侧上下颌第2、3前磨牙为实验牙。常规消毒后无菌条件下切开实验牙牙龈，翻开黏骨膜瓣，用金刚砂车针在冷水连续喷注下制作III度根分叉缺损（缺损底部至根分叉顶端距离为5mm，贯穿颊舌侧骨板），刮除根面牙骨质。分别按照设计，对照组植入不含温敏开关的微球（课题组前期制备、已经发表），空白组不含微球，实验组分别植入不同实例微球，缺损血液充满后拉拢牙龈黏骨膜瓣，严密缝合。术后常规注射青霉素钠20万U，1次/日，共3日。试验组缺损按照如下方法处理：试验组1至3分别植入本发明实施例1至3提供的生长因子控释微球；试验组4-6分别植入本发明实施例6-8提供的生长因子控释微球制剂。

试验组、对照组及空白组动物分别于术后4周、8周（每组2只8颗实验牙齿，上下颌各4颗）行4%多聚甲醛左侧颈总动脉灌注处死，在冷水连续喷注下，取实验侧实验牙相应部位颌骨，去尽软组织后置入4%多聚甲醛固定液4℃固定24h，10%EDTA（pH=7.2）脱钙液中脱钙10天，至针头轻易扎穿骨皮质后，梯度乙醇脱水，二甲苯置换、石蜡包埋，标本沿骨折方向连续切片，厚度为5um，置于多聚赖氨酸处理的载玻片上。术后观察：所有动物全部成活，无一例切口红肿、破溃等感染发生，伤口甲级愈合。试验结果见表1。

表1牙周根分叉组织缺损疗效验证结果

统计学分析表明，在试验动物治疗后4周，各试验组疗效均明显优于空白组（P＜0.05），但与对照组无显著差异（P＞0.05）。治疗后8周，实验组和对照组显著好于空白组（P＜0.05），且因药物的温敏控释效应，试验组疗效好于对照组（P＜0.01）。综合上述试验结果，生长因子控释微球及其制剂对牙周缺损具有较好的治疗效果，且生长因子控释微球及其制剂在体内的温敏控释效应，可较长时间释放生长因子，从而促进缺失牙周组织再生。

本发明采用含“温敏”开关的聚丙基丙烯酰胺（PNIPAM）的甲基丙烯酸缩水甘油酯右旋糖酐（Dex-GMA）/明胶（gelatin）凝胶微球包封骨形态发生蛋白-2后制成生长因子控释微球，平均粒径为5.9-21.5μm，制作生长因子控释微球浓度对数与吸光度的标准曲线，回归方程为：A=0.48899+0.08602Cn=7，r=0.9973，由图像分析可知，在1-600nm范围内为线性关系较好的直线方程，表明骨形态发生蛋白-2浓度的对数与吸收度有定量关系。本发明提供的生长因子控释微球的包封率和载药量分别为（82.3±3.25）％和[(2.86±0.13)×10^-5]%。微球在30d内，不仅一直持续释放骨形态发生蛋白-2，而且所释放出的骨形态发生蛋白-2浓度可以保持在一定的水平：(52.53-73.89)fmol/μL，平均浓度为(64.32±10.96)fmol/μL。经检测表明，本发明提供的生长因子控释微球在聚丙基丙烯酰胺低临界温度（LCST）以上的突释期仅为13.25％，32d后释放度达90.3％。以累积释放率和时间进行拟合，骨形态发生蛋白-2控释微球的体外释药规律符合Higuichi方程:Ｑ=27.7636ｔ^1/2-13.4247,ｒ=09975（ｎ=3）。生长因子控释微球的体外释药曲线也显示:本发明提供的生长因子控释微球体外能够持续释药，具有明显的控释作用，可以控制药物以一定的速度释放，延长药物的生理活性，提高药物的稳定性和靶向性；将聚氧乙烯聚氧丙烯醚加入到生长因子控释微球中制得的生长因子控释微球制剂具有粘附性能好的优点，不易在牙周缺损区域损失和挥发，有效发挥药理活性。牙周组织缺损动物试验结果表明，在试验动物治疗后4周，各试验组疗效均明显优于对照组（单纯生长因子组）和空白组（无生长因子组）（P<0.05）。综合上述试验结果，生长因子控释微球及其制剂对牙周缺损有较好的治疗效果。

本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现,或不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。特别需要指出的是，上述所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明保护范围内。

Claims (10)

1.一种具有温敏开关的生长因子控释微球，其特征在于，由以下组分组成：骨形态发生蛋白-2、重均分子量为100-105kDa的甲基丙烯酸缩水甘油酯右旋糖酐、重均分子量为100kDa的明胶、重均分子量为17kDa聚丙基丙烯酰胺，以及助溶剂、乳化剂和稳定剂。 

2.如权利要求1所述的具有温敏开关的生长因子控释微球，其特征在于，所述骨形态发生蛋白-2、甲基丙烯酸缩水甘油酯右旋糖酐、明胶和聚丙基丙烯酰胺的质量比为（0.8-1.2）：（1.8×10⁴-2.2×10⁴）：（1.2×10⁴-1.8×10⁴）：（2.4×10³-3.6×10³）。 

3.如权利要求1所述的具有温敏开关的生长因子控释微球，其特征在于，其特征在于，所述助溶剂包含磷酸盐缓冲液；所述乳化剂包含体积比为（2-4）:1的二氯甲烷和丙酮混合溶剂；所述稳定剂包含重均分子量为40-60kDa的海藻酸钠。 

4.如权利要求1所述的具有温敏开关的生长因子控释微球，其特征在于，所述甲基丙烯酸缩水甘油酯右旋糖酐中，右旋糖酐分子量为37-39.6kDa，甲基丙烯酸缩水甘油酯和右旋糖酐的聚合比例为1：（80-120）；所述甲基丙烯酸缩水甘油酯右旋糖酐、明胶和聚丙基丙烯酰胺的聚合比例为1：（0.6-1.2）：（0.05-0.09）。 

5.如权利要求1所述的具有温敏开关的生长因子控释微球，其特征在于，所述生长因子控释微球的平均粒径为5.9-21.5μm。 

6.如权利要求1所述的具有温敏开关的生长因子控释微球的制备方法，其特征在于，包括以下步骤： 

步骤1：称取质量为8.0×10⁴-1.2×10⁵份的磷酸盐缓冲液，将质量为0.8-1.2份的骨形态发生蛋白-2溶于磷酸盐缓冲液中，制成质量浓度为6.7×10^-4-1.5×10^-3％的水相溶液，并得剩余质量份的磷酸盐缓冲液； 

步骤2：将质量为1.8×10⁴-2.2×10⁴份的重均分子量为100-105kDa的甲基丙烯酸缩水甘油酯右旋糖酐、1.2×10⁴-1.8×10⁴份的重均分子量为100kDa的明胶、2.4×10³-3.6×10³份的重均分子量为17kDa聚丙基丙烯酰胺依次溶于8.0×10⁵-1.2×10⁶份的体积比为（2-4）:1的二氯甲烷和丙酮混合溶剂中，冰浴超声分散0.8-1.2min，制成质量浓度为2％-4.5％的油相溶液； 

步骤3：将所述水相溶液和所述油相溶液制备成油包水型乳液，将质量为4.0×10⁴份的重均分子量为4-6万的海藻酸钠溶于剩余质量份的磷酸缓冲液中，与所述油包水型乳液混合后冰浴超声分散0.8-1.2min，制成微乳液； 

步骤4：将所述微乳液在室温下低速搅拌3-5min，自然挥发或抽提除去二氯甲烷，制得所述具有温敏开关的生长因子控释微球。 

7.一种具有温敏开关的生长因子控释微球制剂，其特征在于，包括权利要求1至5任一项所述具有温敏开关的生长因子控释微球以及药学上可接受的辅料。 

8.一种具有温敏开关的生长因子控释微球制剂，其特征在于，包括权利要求6所述的制备方法制得的具有温敏开关的生长因子控释微球以及药学上可接受的辅料。 

9.如权利要求7或8所述的具有温敏开关的生长因子控释微球制剂，其特征在于，所述药学上可接受的辅料为聚氧乙烯聚氧丙烯醚。 

10.一种具有温敏开关的生长因子控释微球制剂的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：在低于20℃的温度下，将权利要求6所述的制备方法制得的具有温敏开关的生长因子控释微球边搅拌边加入6.0×10³-9.0×10³重量份的聚氧乙烯聚氧丙烯醚，溶解后制得具有温敏开关的生长因子控释微球制剂。 

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