JP2006296431A - 初乳由来の血清アミロイドaアイソフォーム - Google Patents
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Abstract
【解決手段】特定のアミノ酸配列で示される単離かつ精製された初乳関連血清アミロイドA(SAA)タンパク質、または該アミノ酸配列において1または数個のアミノ酸が置換、付加及び/もしくは欠失されており、かつムチン3(MUC−3)産生を刺激できる当該SAAタンパク質のサイレント変異体であって、当該タンパク質のN末端領域に存在する配列TFLKをさらに特徴とするタンパク質を提供する。
【選択図】なし
Description
本発明の一局面によれば、哺乳類初乳から単離および精製され、そして乳腺の管状上皮細胞により産生される血清アミロイド(SAA)タンパク質が提供される。一実施態様では、SAAは、ウマ初乳から単離および精製される。好ましくはウマ初乳SAAは、(配列番号3)または(配列番号4)、ならびに(配列番号5)、(配列番号6)、(配列番号7)および(配列番号8)から成る群から選択される1つまたはそれ以上の配列を含む(図1参照)。
本発明の組成物および方法に関する種々の用語は、前記の本明細書中で、そして明細書全体および特許請求の範囲でも用いられる。
1)アラニン(A)、セリン(S)、トレオニン(T);
2)アスパラギン酸(D)、グルタミン酸(E);
3)アスパラギン(N)、グルタミン(Q);
4)アルギニン(R)、リシン(K);
5)イソロイシン(I)、ロイシン(L)、メチオニン(M)、バリン(V);および
6)フェニルアラニン(F)、チロシン(Y)、トリプトファン(W)。
Creighton (1984) Proteins W.H.Freeman and Companyも参照されたい。
血清アミロイドA(SAA)は、肝臓で産生される急性期タンパク質であり、組織損傷または感染に関連した炎症応答の一部として哺乳類の血清中に高レベルで生じる。初乳中に非常に高レベルで生じるSAAの独特のアイソフォームを、本発明人等は発見した。健常ウシにおける初乳SAA増大は、仔ウシ出産後4日以内に牛乳中に見出されるバックグラウンドレベルに戻る。初乳中では急性期SAA(A−SAA)の血中濃度とは無関係に生じるので、初乳SAAは局所的に(即ち、乳房管状上皮細胞に)産生されると考えられる(5匹の被験ウシから採取した初乳、乳漿および血清の試料中では、血清SAAは15μg/ml、no範囲であることが判明したが、一方初乳では、SAAは300μg/mlの平均範囲のレベルに増大した)。
ウシ(配列番号1): MWXTFLKEAGQGAKDMWRAY
ヒツジ(配列番号2): WLLTFLKEAG
ウマ(配列番号3): RELKTFLKEAGQG
滑膜繊維芽細胞:
ウサギSAA3(配列番号9の一部): REWLTFLKEAGQGAKDMWRAYSDMKEA
初乳由来SAAは、アミノ末端(またはN末端)TFLK(TFLKモチーフ)での独特のアミノ酸配列を共有する。TFLKモチーフは任意の哺乳類からの血清由来SAAのいずれからも見出されないが、しかしウサギ滑膜繊維芽細胞により産生されるSAA3との相同を共有する。ヒトSAA3偽遺伝子(血清または組織中で発現されない)も、TFLK配列モチーフを含有する推定アミノ酸配列を含む。
(配列番号5) EANYIGADKYFH
(配列番号6) GNYDAAQRGPGGA
(配列番号7) VTDLFK
(配列番号8) SGKDPNHFRPHGLPDKY
図1では、5つのウマ初乳SAAトリプシン断片配列(配列番号3〜8)、ならびにウシおよびヒツジからのN末端配列、ならびにウマ初乳SAA(配列番号1〜3)が、ウサギからの滑膜繊維芽細胞(配列番号9)、ウマ血清SAA(配列番号10)およびミンクからの血清SAA1(配列番号11)の完全アミノ酸配列とともにアラインメントで示されている。アラインメントから判るように、ウマ初乳SAAは、ウサギ滑膜繊維芽細胞SAA3、ウマ血清SAAおよびミンク血清SAA1の各々との類似性の領域を共有し、さらにこれらのタンパク質の各々と互いに異なる。
1.タンパク質および抗体
初乳SAAは、血清からSAAを精製するために開発された種々の方法にしたがって、種々の方向で調製され得る。このような方法の1つが、実施例3に記述されている。疎水性クロマトグラフィーマトリックス計および溶離剤の変動、例えばSmith等(Protein Expression & Purification 2: 158-161, 1991)により記載されたものも用いられ得る。
一旦配列情報が得られれば、初乳SAAをコードする核酸分子は、2つの一般的方法により調製され得る:即ち、(1)それらは適切なヌクレオチド三リン酸塩から合成され得る、または(2)それらは生物学的供給源から単離され得る。両方法は、当業界で周知のプロトコールを利用する。
Tm=81.5℃+16.6Log[Na+]+0.4(G+C%)−0.63(ホルムアミド%)−600/二重鎖中bp数
前式の説明のように,[N+]=[0.368]および50%ホルムアミドを用いて、42%のGC含量および200塩基の平均プローブサイズで、Tmは57℃である。DNA二重鎖のTmは、相同性が1%低減する毎に1〜1.5℃低減する。したがって約75%より大きい配列同一性を有する標的が、42℃のハイブリダイゼーション温度を用いて観察される。好ましい実施態様では、ハイブリダイゼーションは37℃で、最終洗浄は42℃であり、さらに好ましい実施態様では、ハイブリダイゼーションは42℃で、最終洗浄は50℃であり、最も好ましい実施態様では、ハイブリダイゼーションは42℃で、最終洗浄は65℃であって、前記のハイブリダイゼーションおよび洗浄溶液を用いる。
1.タンパク質および抗体
精製初乳SAAまたはその断片を用いて、培養細胞または組織中および無傷生物体中のタンパク質の存在および蓄積に関する高感度検出試薬として役立ち得るポリクローナルまたはモノクローナル抗体を生成し得る。組換え技術は、選定初乳SAAの一部または全部を含有する融合タンパク質の発現を可能にする。全長タンパク質またはタンパク質の断片を用いて、タンパク質の種々のエピトープに特異的なモノクローナルまたはポリクローナル抗体のアレイを生成するのを促し、それによりタンパク質の検出のためのより大きい感度をさえ提供し得る。好ましい実施態様では、初乳SAAを血清SAAと識別する初乳SAAの断片は、エピトープ特異的抗体を生成するために利用される。
初乳SAAコード核酸は、本発明にしたがって種々の目的のために用いられ得る。DNA、RNAまたはそれらの断片は、遺伝子の存在および/または発現を検出するためのプローブとして用いられ得る。初乳SAAコード核酸がこのような検定のためのプローブとして利用され得る方法としては、(1)in situハイブリダイゼーション、(2)サザンハイブリダイゼーション、(3)ノーザンハイブリダイゼーション、ならびに(4)類別(アソーティド)増幅反応、例えばポリメラーゼ連鎖反応(PCR)および逆転写酵素−PCR(RT−PCR)が挙げられるが、これらに限定されない。
原核生物および真核生物系はともに、初乳関連SAAコード配列を発現するために用いられ得る。原核生物宿主は、もちろん、クローニング手法には最も便利である。原核生物は最も高頻度に、大腸菌の種々の菌株により代表される。しかしながらその他の微生物株も用いられ得る。複製部位、選択可能マーカーおよび宿主と比較可能な種に由来する対象配列を含有するプラスミドベクターが用いられる。例えば大腸菌は、典型的には、Bolivar, et al., Gene (1977) 2:95により大腸菌種から得られたプラスミドであるpBR322の誘導体を用いて形質転換される。pBR322は、アンピシリンおよびテトラサイクリン耐性に関する遺伝子を含有し、したがって所望のベクターの構築に際して保持または破壊され得る多重選択可能マーカーを提供する。転写開始のためのプロモーターを含み、任意にオペレーターを、リボソーム結合部位配列と共に含むよう本明細書中で定義された一般的に用いられる原核生物制御配列としては、β−ラクターゼ(ペニシリナーゼ)およびラクトーゼ(lac)プロモーター系(Chang, et al., Nature(1977))およびトリプトファン(trp)プロモーター系(Goeddel, et al., Nucleic Acids Res(1980) 8:4057)、ならびにラムダ由来PLプロモーターおよびN−遺伝子リボース結合部位(Shimatake, et al., Nature (1981) 292:128)といったような一般的に用いられるプロモーターが挙げられる。
用いられる宿主細胞によって、このような細胞に適切な標準技法を用いて形質転換が実行される。Cohen, S.N., Pro. Natl. Acad. Sci. (USA) 1972, 69: 2110により記載されたような塩化カルシウムを用いるカルシウム処理、あるいはManiatis, et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual (1982) Cold Spring Harbor Press, p.254およびHanahan, D., J Mol Biol (1983) 166: 557-580に記載されたrbC12法が、原核生物または実質的細胞壁バリアを含有するその他の細胞のために用いられ得る。このような細胞壁を有さない哺乳類細胞に関しては、任意にWigler, M., et al., Cell (1979) 16: 777-785により修正されるようなGraham and van der Eb, Virology (1978) 52:546のリン酸カルシウム沈降法が用いられ得る。酵母中での形質転換は、Beggs, J.D. Nature (1978) 275:104-109またはHinnen, A., et al., Pro. Natl. Acad. Sci.(USA)(1978) 75:1929の方法にしたがって実行され得る。
所望のコードおよび制御配列を含有する適切なベクターの構築は、当業界で十分理解されている標準結繋および制限技法を用いる。単離プラスミド、DNA配列または合成オリゴヌクレオチドは、切断され、仕立てられ、そして所望の形態に再結繋される。
プラスミド構築のための的確な結繋は、M.Casadaban博士(Casadaban, M., et al., J Mol Biol (1980) 138:179-207)から入手した大腸菌MC1061株またはその他の適切な宿主を結繋混合物で先ず形質転換することにより確証され得る。当業界で理解されているように、プラスミド構築の様式によって、その他のマーカーを用いることにより、アンピシリン、テトラサイクリンまたはその他の抗生物質により、うまくいった形質転換体を選択する。次に、形質転換体からのプラスミドを、Clewell, D.B., et al., Pro. Natl. Acad. Sci.(USA) (1969) 62:1159の方法により、任意にクロラムフェニコール増幅(Clewell, D.B. J Bacteriol (1972) 110:667)後に、調製する。いくつかのミニDNA標本は、一般的に用いられる(例えば、Holmes, D.S., et al., Anal Biochem Acids Res (1979)7:1513-1523)。単離DNAは、制限により分析されおよび/または、Messing, et al., Nucleic Acids Res (1981) 9:309によりさらに記載されているようにSanger, F., et al., Pro. Natl. Acad. Sci.(USA) (1977) 74:5463のジデオキシヌクレオチド法により、あるいはMaxam, et al., Methods in Enzymology (1980) 65:499の方法により、シーケンシングされる。
本明細書中のクローニングおよび原核生物発現に用いられる宿主下部は、以下の通りである:
クローニングおよびシーケンシングのために、およびほとんどの細菌プロモーターの制御下での構築の発現のために、大腸菌株、例えばMC1061、DH1、RR1、C600hfl、K803、HB101、JA221およびJM101が用いられ得る。
初乳中の特定の構成的発現形態のSAAの発見は、生物学的流体(例えば初乳および乳)の混合物を含有する試料中の初乳の存在を検出する新規の方法を可能にする。例えばSAAは、正常乳腺組織からの初乳中では上昇し、乳中では上昇しないため、乳試料中の測定初乳SAAを用いて、乳から初乳を弁別し得る。したがって、初乳を含有する乳を有するのが望ましくない場合(いくつかの国はこの実行のための法律を有する)、前記のような免疫学的またはハイブリダイゼーション検定を用いて、初乳汚染乳を検出し得る。したがって、初乳を含有する乳を有するのが望ましくない場合には、前記のような免疫学的またはハイブリダイゼーション検定を用いて、初乳汚染乳を検出し得る。
本発明によって、本発明の初乳関連SAA、特にその活性部位(TFLKモチーフ)が小腸におけるムチン産生を刺激することを、出願人は発見した。これは、ムチンが腸感染の予防および治療に重要な役割を有することが示されているので有意であり、そして多数の共生物質がムチン産生の誘導により作用する(Mack et al., “Probiotics inhibit enteropathogenic Esherechia coli adherence in vitro by induding intestinal mucin gene expression”, 1999, Am J Physiol, 4Part 1 G941-950参照)(この記載内容は、参照により本明細書中に含まれる)。したがって本発明は、初乳関連SAAを含む動物のための医薬製剤も包含する。製剤組成物の用量および投与スケジュールが投薬等よりむしろ動物の年齢、健康状態、性別および体重によって変化する、と医学業界の当業者は容易に理解する。これらのパラメーターは、十分確立された手法および例えばI、IIおよびIII期における分析により各系に関して確定され得る。
血清、初乳および乳漿中のSAAの比較分析
この試験の目的は、乳腺炎無症候性および症候性ウシにおいて、初乳および乳漿中のSAAレベルが血清SAAレベルに対応するか否かを確定することであった。
ワクチン接種−無臨床症状(NC)
NCウシA
NCウシB
NCウシC
NCウシD
NCウシE
ワクチン接種−臨床症状(C)
CウシA
CウシB
CウシC
CウシD
乳漿/初乳試料は、臨床症状を示す1/4から得た。
表1:ウシ乳腺炎血清、乳漿および初乳SAA値の比較
初乳およびその後の連続牛乳サンプリング中のSAAの評価
この試験の目的は、初乳およびその後の連続牛乳サンプリングを評価して、SAA含量を確定することであった。試料は、ネブラスカ大学Lincoln Dairy Research Facilityのホルスタイン酪農牛から得た。出産時に初乳の試料を採取し、その後の牛乳試料は週2回、3週間採取した。乳房四分円の4つすべてからの試料をプールした。結果を表2に示す。
初乳からのSAAの精製
下記の手法は、任意の動物種からの血清、血漿、乳または初乳からのSAAの精製のために用い得る。本手法は、2つの基本段階からなる:疎水性クロマトグラフィーによりSAAを約20%純度に精製する。次に、SDS−PAGEおよび電子ブロッティングにより、さらに約95%純度に精製する。
初乳関連SAAcDNAの単離
RNA単離:メーカー推奨にしたがってTRIZOL(Gibco BRL)を用いて、逆転写−ポリメラーゼ連鎖反応(RT−PCR)用の全RNAを哺乳類乳腺上皮細胞から単離した。1%(重量/容量)アガロースゲル上での分別およびその後の臭化H時有無染色により、RNAの完全性を調べた。
ウシMAC−T乳腺上皮細胞による初乳SAA産生
ウシMAC−T乳腺上皮細胞をATCC(CRL-10274)から入手して、推奨条件にしたがって培養した(Turner, JD and Huynh H.Immortalized bovine mammary epithelial cell line。米国特許第5,227,301号(1993年7月13日))。10%ウシ胎仔血清(FCS)、5μg/mlインスリン、1μg/mlヒドロコルチゾンおよびフンジゾンを補充したダルベッコの変法培地(DMEM)上で、MAC−T細胞を培養した。5%CO2を用いて37℃で細胞をインキュベートした。初乳SAA産生のために、細胞をI型コラーゲン被覆プレート上に植え付けた。14時間インキュベーション後、細胞をダルベッコのリン酸塩緩衝食塩水(DPBS)で2回洗浄し、初乳SAA産生刺激のためにヒツジ上皮小体からのプロラクチン(5μg/ml)を補充した培地(DMEM,5μg/mlインスリン、1μg/mlヒドロコルチゾンおよび2.5%FCS)中でインキュベートした。およそ半分の培地を毎日プロラクチン補充培地と取り替えた。SAAの定量のための標準ELISA(図3)を用いて、初乳SAAの存在に関して、異なる日に収集した増殖培地のアリコートを検定した。
初乳SAAの機能的役割
ヒトの生理学の顕著な特徴は、腸管を裏打ちする粘膜上皮細胞が膨大な数の微生物を接触し、さらに感染および炎症性合併症の発症率が低いということである。これは、局所的宿主防御メカニズムが非常に有効な、広範囲の非炎症性抗菌防御を包含することを示唆する。後天性免疫系が有効応答を生じ、それは数日または数週間という期間に亘っているが、乳児においては、後天性免疫系は未熟で、十分に機能しない。対照して、腸管の固有の免疫系は継続的であり、あるいは腸管に導入される多数の考え得る病原体に対して直ちに誘導可能であって、粘膜上皮細胞と出生時の機能の非常に密接な近似性に気づかされる。腸固有免疫としては、単一無機分子、例えば一酸化窒素からナチュラルキラー細胞までの範囲の最前線宿主防御素子が挙げられる。固有免疫系のエフェクターアームを含む上皮細胞により産生される多数の分子も存在する。これらの例としては、相対的に小型の抗菌性ペプチドおよびより複雑な糖タンパク質分子、例えばムチンが挙げられる。
作用:初乳SAA濃度
作用:初乳SAAペプチド
作用:初乳SAAペプチド
Claims (40)
- 単離および精製初乳関連血清アミロイドA(SAA)タンパク質であって、前記タンパク質のN末端領域に存在する配列TFLKをさらに特徴とするタンパク質。
- ウマ初乳から単離および精製される請求項1記載のSAA。
- (配列番号3)または(配列番号4)、ならびに(配列番号5)、(配列番号6)、(配列番号7)および(配列番号8)から成る群から選択される1つまたはそれ以上の配列を含む請求項2記載のSAA。
- ウシ初乳から単離および精製される請求項1記載のSAA。
- アミノ酸(配列番号1)を含む請求項4記載のSAA。
- ヒツジ初乳から単離および精製される請求項1記載のSAA。
- アミノ酸(配列番号2)を含む請求項6記載のSAA。
- 請求項1記載の初乳関連SAAをコードする精製および単離核酸分子。
- (配列番号12)と93%またはそれ以上の配列同一性を有する配列を含む請求項8記載の核酸分子。
- (配列番号12)を含む請求項9記載の核酸分子。
- プロモーター領域と作用可能式に連結される請求項8記載の核酸分子を含む発現カセット。
- 請求項11記載の発現カセットを含むクローニングまたは発現ベクター。
- 請求項12記載のベクターで形質転換される真核生物または原核生物宿主細胞。
- 1つまたはそれ以上の(配列番号1〜8)あるいはそれらの保存的修飾化変異体をコードする配列を含む請求項8記載の核酸分子。
- 1つまたはそれ以上のアミノ酸配列番号1〜8を逆翻訳することによって得られる配列を有し、初乳SAAをコードする遺伝子またはcDNAと特異的にハイブリダイズする合成オリゴヌクレオチドの集団。
- 請求項1記載の初乳SAAの1つまたはそれ以上のエピトープに対して免疫学的に特異的な抗体。
- ポリクローナルである請求項16記載の抗体。
- モノクローナルである請求項16記載の抗体。
- 初乳SAAを血清SAAと識別する請求項1記載の初乳SAAの少なくとも1つのエピトープに対して免疫学的に特異的である請求項16記載の抗体。
- 哺乳類からの初乳関連SAAの生成方法であって、以下の:
a)哺乳類からの初乳の試料を提供し、そして
b)試料中に含有されるSAAを試料中に含有される他の物質から分離し、それにより哺乳類からのSAAを生成する
過程を包含する方法。 - 哺乳類がウシ、ウマ、ブタ、ヒツジおよびヒトから成る群から選択される請求項20記載の方法。
- 請求項20記載の方法により製造されるSAA。
- 有効量の初乳関連血清アミロイドAタンパク質であって、N末端TFLK領域を含むタンパク質、ならびに製薬上許容可能な担体を含む製剤組成物。
- 前記タンパク質が配列番号1〜8またはそれらの保存的修飾化変異体を含む請求項23記載の製剤組成物。
- 前記タンパク質が(配列番号13)を含む請求項23記載の製剤組成物。
- 前記担体が水である請求項23記載の製剤組成物。
- 前記担体が食塩水である請求項23記載の製剤組成物。
- 賦形剤をさらに含む請求項23記載の製剤組成物。
- 前記賦形剤がラクトース、スクロース、マンニトールおよびソルビトールから成る群から選択される充填剤である請求項28記載の製剤組成物。
- 経口投与形態である請求項23記載の製剤組成物。
- 動物における腸病原体に関連した疾患の治療および予防方法であって、TFLKモチーフN末端配列を含む有効量のタンパク質であって、MUC3上皮細胞を誘導し得るタンパク質、ならびに製薬上許容可能な担体を前記動物に導入することを包含する方法。
- 前記配列が粘膜上皮細胞においてMUC3産生を刺激し得る請求項31記載の方法。
- 前記タンパク質が初乳関連血清アミロイドAタンパク質である請求項31記載の方法。
- 前記タンパク質が(配列番号17)である請求項31記載の方法。
- 前記N末端アミノ酸配列が(配列番号30)またはその保存的修飾化変異体である請求項31記載の方法。
- 前記腸病原体が大腸菌である請求項31記載の方法。
- 前記疾患が旅行者下痢、壊死性腸炎および尿路感染から成る群から選択される請求項31記載の方法。
- (配列番号30)またはその保存的修飾化変異体を含む有効量のタンパク質を用いる乳児処方箋を包含する乳児処方箋製剤。
- 初乳関連SAAタンパク質コードヌクレオチド配列の同定方法であって、ストリンジェント条件下で(配列番号12)またはその7〜10連続塩基とハイブリダイズする配列に関してDNAの試料を検定することを包含する方法。
- 単離および精製初乳血清アミロイドAタンパク質であって、初乳中に存在し、ラット抗SAA(ヒト)モノクローナル抗体であって、ウシSAAアイソフォームと反応する抗体と反応するタンパク質。
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