JP2006254867A - D−乳酸デヒドロゲナーゼ活性を有する新規耐熱性タンパク質 - Google Patents
D−乳酸デヒドロゲナーゼ活性を有する新規耐熱性タンパク質 Download PDFInfo
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Abstract
【課題】 D−乳酸デヒドロゲナーゼ活性を有する新規耐熱性タンパク質を提供する。
【解決手段】 特定のアミノ酸配列からなるタンパク質は、D−乳酸デヒドロゲナーゼ活性を有する。このタンパク質は、超好熱性古細菌であって、好気性hyperthermophilic archaeonの1種であるアエロパイラム・ペルニックス(Aeropyrum pernix)種K1(JCM9820)の遺伝子配列から、D−乳酸デヒドロゲナーゼ活性を有するタンパク質をコードすると推定される特定の遺伝子をクローニングし、これを、大腸菌を用いて発現させることにより得たものである。図1は、前記タンパク質のSDS−PAGE写真である。
【選択図】 図1
【解決手段】 特定のアミノ酸配列からなるタンパク質は、D−乳酸デヒドロゲナーゼ活性を有する。このタンパク質は、超好熱性古細菌であって、好気性hyperthermophilic archaeonの1種であるアエロパイラム・ペルニックス(Aeropyrum pernix)種K1(JCM9820)の遺伝子配列から、D−乳酸デヒドロゲナーゼ活性を有するタンパク質をコードすると推定される特定の遺伝子をクローニングし、これを、大腸菌を用いて発現させることにより得たものである。図1は、前記タンパク質のSDS−PAGE写真である。
【選択図】 図1
Description
本発明は、D−乳酸デヒドロゲナーゼ活性を有する新規耐熱性タンパク質に関する。なお、本出願は、国の委託に係る成果の出願である。
D−乳酸デヒドロゲナーゼは、FADを水素受容体として、(R)−乳酸の脱水素反応によりピルビン酸を生成する機能を有する。この機能を利用して、D−乳酸デヒドロゲナーゼは、例えば、血清中のD−乳酸の測定や、それを用いたバイオセンサーの等の様々な用途に使用されている(例えば、非特許文献1および非特許文献2参照)。その他には、血中のホスホグリセリン酸ムターゼ濃度を測定することにより、痴呆症の患者のアルツハイマー型痴呆症と血管性痴呆症とを識別するための診断薬(例えば、特許文献1参照)や、インスリン依存性糖尿病の診断薬(例えば、特許文献2参照)、ACE阻害剤を調製するための中間体として使用可能な、R−またはS−2−ヒドロキシ−4−フェニル酪酸の調製に使用することが提案されている(例えば、特許文献3参照)。
D−乳酸デヒドロゲナーゼとしては、様々な生物由来のものが知られているが、その中でも、耐熱性菌由来のものが知られている。前記耐熱性菌としては、好熱性硫黄細菌であるアルカエグロブス・フルジダス(Archaeoglobus fulgidus)があげられる(例えば、非特許文献3参照)。このような耐熱性菌由来のD−乳酸デヒドロゲナーゼは、工業的用途を広げるものと期待されているが、前記1種類の菌由来のものだけでは、いまだ不十分である。
他方、超好熱性古細菌(非特許文献4参照)についての研究があり、アエロパイラム属細菌の1種であるアエロパイラム・ペルニックス(Aeropyrum pernix)(JCM9820)(非特許文献5参照)は、その遺伝子が既に解析されている(非特許文献6参照)。したがって、この超好熱古細菌が、エノラーゼを産生するとすれば、それは優れた耐熱性を有すると予想され、これによって工業的用途がさらに広がる可能性がある。
本発明は、このような事情に鑑みなされたものであり、D−乳酸デヒドロゲナーゼ活性を持つ新規耐熱性タンパク質の提供を、その目的とする。
前記目的を達成するために、超好熱性古細菌であるアエロパイラム・ペルニックス(Aeropyrum pernix)(JCM9820)のゲノム情報について調べたところ、この細菌が、D−乳酸デヒドロゲナーゼを産生する可能性があることを突き止めた。この知見に基づき、さらに研究を重ねたところ、この細菌の遺伝子から、D−乳酸デヒドロゲナーゼ活性を持つ新規耐熱性タンパク質を発現させることに成功し、本発明に到達した。
すなわち本発明のタンパク質は、下記の(a)または(b)の耐熱性タンパク質である。
(a) 配列番号1のアミノ酸配列からなる耐熱性タンパク質。
(b) 配列番号1のアミノ酸配列において、1つ若しくは数個のアミノ酸残基が、欠失、置換、付加若しくは挿入されたアミノ酸配列からなり、D−乳酸デヒドロゲナーゼ活性を有する耐熱性タンパク質。
(a) 配列番号1のアミノ酸配列からなる耐熱性タンパク質。
(b) 配列番号1のアミノ酸配列において、1つ若しくは数個のアミノ酸残基が、欠失、置換、付加若しくは挿入されたアミノ酸配列からなり、D−乳酸デヒドロゲナーゼ活性を有する耐熱性タンパク質。
なお、アエロパイラム・ペルニックス(Aeropyrum pernix)(JCM9820)は、理化学研究所生物基盤研究部微生物系統保存施設に保存されており、第三者の要求により分譲可能である。
アエロパイラム・ペルニックス(Aeropyrum pernix)(JCM9820)の最適生育温度は90〜95℃であり、生育限界温度が100℃であるから、本発明のタンパク質は、90〜100℃の高温であっても活性がある。したがって、本発明のタンパク質は、高温下で使用することができ、工業的用途の拡大が可能となる。
前記D−乳酸デヒドロゲナーゼ活性は、FAD存在下で、(R)−乳酸に作用して、ピルビン酸を生成する機能である。
前述のように、本発明の新規耐熱性タンパク質は、超好熱性古細菌由来であり、具体的には、アエロパイラム・ペルニックス(Aeropyrum pernix)(JCM9820)由来である。但し、本発明のタンパク質は、この菌が産生するものに限定されず、遺伝子工学的手法により、他の生物が産生するものであってもよい。
つぎに、本発明の発現ベクターは、前記本発明のタンパク質をコードするDNAまたは配列番号2に記載のDNAを含むベクターである。
つぎに、本発明の形質転換体は、前記本発明のベクターにより形質転換された形質転換体である。なお、宿主は特に制限されず、例えば、大腸菌等がある。
つぎに、本発明のタンパク質の製造方法は、前記本発明の形質転換体を培養する工程と、前記培養工程において発現した前記タンパク質を回収する工程とを含む製造方法である。
以下、本発明について、さらに詳細に説明する。
本発明者らは、子宝島の海岸の硫気孔から採取された超好熱性古細菌であって、好気性hyperthermophilic archaeonの1種であるアエロパイラム・ペルニックス(Aeropyrum pernix)種K1(JCM9820)の遺伝子配列からD−乳酸デヒドロゲナーゼ活性を示すと推定される遺伝子(配列番号2)をクローニングし、これを、大腸菌を用いて発現させることにより、本発明の新規耐熱性タンパク質を得るに至った。遺伝子のクローニング方法は、後述する実施例1に記載した通り実施した。クローニングされた遺伝子の塩基配列は配列番号2に示す通りであり、また、その推定アミノ酸配列は配列番号1に示す通りである。なお、本発明の新規耐熱性タンパク質は、D−乳酸デヒドロゲナーゼ活性を有していれば、配列番号1のアミノ酸配列において、一つ若しくは数個のアミノ酸残基が、欠質、置換、付加若しくは挿入されていてもよい。このアミノ酸配列における「アミノ酸の欠失、置換、付加若しくは挿入」は、当業者に公知の方法(例えば、突然変異誘発法)に従って実施することができる。
本発明のタンパク質は、前述の本発明のタンパク質の製造方法により製造可能であるが、これに限定されず、他の製造方法で製造されてもよい。例えば、配列番号1に示すように、そのアミノ酸配列が決定されているタンパク質については、その配列を元に当業者に公知の手法、例えば、個々のアミノ酸を化学的に重合してタンパク質を合成する方法に従って調製することができる。
本発明のタンパク質をコードする遺伝子の一例としては、配列番号2に示す遺伝子がある。前記遺伝子は、例えば、後述する実施例2に示すように超好熱性古細菌アエロパイラム・ペルニックス(Aeropyrum pernix)(JCM9820)のゲノムから、例えば配列番号2で示される塩基配列の一部をプライマーとして用いるPCR法あるいは該DNA断片をプローブとして用いるハイブリダイゼーション法により調製することができる。また、その塩基配列をもとに、当業者に公知である核酸化学合成法等に従って前記遺伝子を得ることもできるが、本発明は、これらに限定されない。
本発明の発現ベクターは、前記遺伝子もしくは配列番号2のDNAを適当なベクターに挿入することによって得ることができる。本発明の遺伝子を挿入するためのベクターは、宿主中で複製可能なものであれば、特に制限されるものではなく、例えば、プラスミドDNA、ファージDNA、AcMNPVなどのバキュロウイルスなどが挙げられる。プラスミドDNAは、大腸菌やアグロバクテリウムからアルカリ抽出法またはその変法などにより調製することができる。また、市販プラスミドとして、例えばpET-11a(Novagen社製)あるいはバチルス属の宿主を用いた分泌型のプラスミドなどを用いてもよい。これらのプラスミドは、アンピシリン耐性遺伝子、カナマイシン耐性遺伝子、クロラムフェニコール耐性遺伝子などが含まれていてもよい。
ベクターへの遺伝子等の挿入は、例えば、精製された遺伝子の塩基配列を適当な制限酵素で切断し、適当なベクターDNAの制限酵素部位またはマルチクローニングサイトに挿入してベクターに連結する方法などを用いることができるが、これらに限定されない。また、本発明の遺伝子の機能が発揮されるように、本発明の発現ベクターには本発明の遺伝子のほか、プロモーター、ターミネーター、リボソーム結合配列などを組み込んでいてもよい。さらに、本発明の遺伝子も他のタンパク質のコードする配列を融合したものを挿入してもよい。
前記発現ベクターで宿主生物を形質転換すれば、本発明の形質転換体が得られる。宿主生物としては、本発明の遺伝子を発現できるものであれば、特に制限されるものではなく、例えば、大腸菌などの原核細胞が挙げられるが、これらに限定されない。形質転換法としては、既に公知である塩化カルシウム法などを使用することができるが、これらの方法に限定されない。
本発明のタンパク質の製造方法は、前記形質転換体を培養する工程と、前記培養工程において発現した前記タンパク質を回収する工程とを含む製造方法である。前記培養する方法は、宿主細胞の培養に用いられる通常の方法に従って行われる。大腸菌等の微生物を宿主とした形質転換体を培養する培地としては、微生物が資化し得る炭素源、窒素源、無機塩類などを含有し、形質転換体の培養を効率的に行えるものであれば、天然培地、合成培地などのいずれを用いてもよい。本発明のタンパク質の回収は、特に制限されない。前記タンパク質が菌体内または細胞内に生産される場合には、菌体または細胞を破砕することによって前記タンパク質を回収する。また、本発明の前記タンパク質が菌体外または細胞外に生産される場合には、培養液をそのまま使用するか、遠心分離などにより菌体または細胞を除去した後、タンパク質の単離精製に用いられる一般的な生化学的方法、例えば、硫酸アンモニウム沈殿、ゲルクロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィーなどを単独でまたは適宜組み合わせて用いることにより、培養物中から本発明のタンパク質を単離精製することができる。なお、培養液をそのまま使用する場合、熱処理をすることにより、他のタンパク質が失活するので、実質上、本発明のタンパク質のみの酵素液として使用できる。
以下に実施例により本発明をさらに詳細に説明するが、本発明はこれらにより限定されない。
染色体DNAの調製
アエロパイラム・ペルニックス(Aeropyrum pernix)(JCM9820)をL培地中で37℃にて一晩培養して集菌したものに、SSC溶液(0.15M NaCl、0.015M クエン酸ナトリウム)を10mL、0.5M EDTAを0.2mL、100mg/mL ニワトリ卵白リゾチームを0.1mLおよび10%非イオン性界面活性剤Brij-58を0.5mL加え、0℃で30分間放置した後、プロテイナーゼK(Merck社製)5mgを0.2mLの10%SDSに溶かした溶液を加え、37℃で2、3日間放置した。この溶液に水飽和フェノール、クロロホルム、イソアミルアルコールの混合溶液を加えて、37℃で1時間放置した後、水層を分取し、そこへエタノールを加えてDNAを沈殿濃縮した。このDNAの沈殿をTE溶液(10mM Tris-HCl(pH7.5)、1mM EDTA(pH8.0))10mLに溶解し、リボヌクレアーゼ0.25mL(最終濃度0.25mg/mL)を加えて、37℃で一晩放置した後、エタノールで沈殿させた。次いで、DNAをTE溶液5mLに溶解した後、260nmの吸光度より、DNA濃度を決定した(Clarke,L. & Carbon,J. (1979) Methods Enzymol. 68, 396-408)。
アエロパイラム・ペルニックス(Aeropyrum pernix)(JCM9820)をL培地中で37℃にて一晩培養して集菌したものに、SSC溶液(0.15M NaCl、0.015M クエン酸ナトリウム)を10mL、0.5M EDTAを0.2mL、100mg/mL ニワトリ卵白リゾチームを0.1mLおよび10%非イオン性界面活性剤Brij-58を0.5mL加え、0℃で30分間放置した後、プロテイナーゼK(Merck社製)5mgを0.2mLの10%SDSに溶かした溶液を加え、37℃で2、3日間放置した。この溶液に水飽和フェノール、クロロホルム、イソアミルアルコールの混合溶液を加えて、37℃で1時間放置した後、水層を分取し、そこへエタノールを加えてDNAを沈殿濃縮した。このDNAの沈殿をTE溶液(10mM Tris-HCl(pH7.5)、1mM EDTA(pH8.0))10mLに溶解し、リボヌクレアーゼ0.25mL(最終濃度0.25mg/mL)を加えて、37℃で一晩放置した後、エタノールで沈殿させた。次いで、DNAをTE溶液5mLに溶解した後、260nmの吸光度より、DNA濃度を決定した(Clarke,L. & Carbon,J. (1979) Methods Enzymol. 68, 396-408)。
発現プラスミドの構築と遺伝子発現
1.発現プラスミドの構築
耐熱性D−乳酸デヒドロゲナーゼ遺伝子の翻訳領域の前後に制限酵素NdeI、BamHIおよびNotIサイトを含むDNAを構築する目的で下記のDNAプライマーを合成し、このプライマーを用いたPCRで耐熱性D−乳酸デヒドロゲナーゼ遺伝子の翻訳領域の前後に制限酵素サイトを導入した。DNAポリメラーゼとして、KOD Dash(東洋紡社製)を使用した。
Forward primer(配列番号3):5'- ATATCATATGGCTCGTATCGCTGAAGAGCTTGAGAAGATT -3'
Reverse primer(配列番号4):5'- ATATGGATCCGCGGCCGCTTATTACTCAGCCGCTACAACCTT -3'
PCR反応後、Ex Taq(宝酒造社製)を用いて増幅断片の3’末端側にデオキシアデノシンを付加した後、pGEM−T Easy Vector(Promega社製)とT4リガーゼで15℃、30分間反応させ連結した。連結したDNAを大腸菌DH5αのコンピテントセルに導入し、形質転換体のコロニーを得た。得られた形質転換体を、アンピシリンを含むLB培地(18mL)で24時間培養し、その培養液からプラスミドを改変アルカリSDS法で精製した。プラスミド中に期待される大きさのインサートが存在することを、アガロース電気泳動で確認した。精製プラスミドのインサートの塩基配列は、BigDye Terminator kit(登録商標:Applied Biosystems社製)とABI PRISM 3700 DNA Analyzer(登録商標:Applied Biosystems社製)を用いて決定し、インサートの塩基配列が耐熱性D−乳酸デヒドロゲナーゼ遺伝子の正しい配列であることを確認した。正しい配列を有するプラスミドの一部を制限酵素NdeIとBamHIで完全分解(37℃で2時間)した後、アガロース電気泳動により、耐熱性D−乳酸デヒドロゲナーゼ遺伝子を精製した。pET-11a(Novagen社製)を制限酵素NdeIとBamHIで切断・精製した後、T4リガーゼで反応させ、上記の構造遺伝子と連結した。連結したDNAの一部を大腸菌DH5αのコンピテントセルに導入し、アンピシリンを含むLB寒天プレートに適量まき、37℃で一晩培養し、形質転換体のコロニーを得た。得られた形質転換体を、アンピシリンを含むLB培地(18mL)で24時間培養し、その培養液から発現プラスミドを改変アルカリSDS法で精製した。
1.発現プラスミドの構築
耐熱性D−乳酸デヒドロゲナーゼ遺伝子の翻訳領域の前後に制限酵素NdeI、BamHIおよびNotIサイトを含むDNAを構築する目的で下記のDNAプライマーを合成し、このプライマーを用いたPCRで耐熱性D−乳酸デヒドロゲナーゼ遺伝子の翻訳領域の前後に制限酵素サイトを導入した。DNAポリメラーゼとして、KOD Dash(東洋紡社製)を使用した。
Forward primer(配列番号3):5'- ATATCATATGGCTCGTATCGCTGAAGAGCTTGAGAAGATT -3'
Reverse primer(配列番号4):5'- ATATGGATCCGCGGCCGCTTATTACTCAGCCGCTACAACCTT -3'
PCR反応後、Ex Taq(宝酒造社製)を用いて増幅断片の3’末端側にデオキシアデノシンを付加した後、pGEM−T Easy Vector(Promega社製)とT4リガーゼで15℃、30分間反応させ連結した。連結したDNAを大腸菌DH5αのコンピテントセルに導入し、形質転換体のコロニーを得た。得られた形質転換体を、アンピシリンを含むLB培地(18mL)で24時間培養し、その培養液からプラスミドを改変アルカリSDS法で精製した。プラスミド中に期待される大きさのインサートが存在することを、アガロース電気泳動で確認した。精製プラスミドのインサートの塩基配列は、BigDye Terminator kit(登録商標:Applied Biosystems社製)とABI PRISM 3700 DNA Analyzer(登録商標:Applied Biosystems社製)を用いて決定し、インサートの塩基配列が耐熱性D−乳酸デヒドロゲナーゼ遺伝子の正しい配列であることを確認した。正しい配列を有するプラスミドの一部を制限酵素NdeIとBamHIで完全分解(37℃で2時間)した後、アガロース電気泳動により、耐熱性D−乳酸デヒドロゲナーゼ遺伝子を精製した。pET-11a(Novagen社製)を制限酵素NdeIとBamHIで切断・精製した後、T4リガーゼで反応させ、上記の構造遺伝子と連結した。連結したDNAの一部を大腸菌DH5αのコンピテントセルに導入し、アンピシリンを含むLB寒天プレートに適量まき、37℃で一晩培養し、形質転換体のコロニーを得た。得られた形質転換体を、アンピシリンを含むLB培地(18mL)で24時間培養し、その培養液から発現プラスミドを改変アルカリSDS法で精製した。
2.組換え遺伝子の発現
大腸菌Rosetta-gami(DE3)(Novagen社製)のコンピテントセルを融解して、ファルコンチューブに0.1mL移した。その中に上記1.の精製発現プラスミドの溶液0.002mLを加え氷中に20分間放置した後、42℃でヒートショックを90秒間行い、氷中に1分間放置した後、クロラムフェニコールとアンピシリンを含むLB寒天プレートに適量まき、37℃で一晩培養し、形質転換体を得た。得られた形質転換体を、アンピシリンを含むLB培地(5mL)で18時間培養し、耐熱性D−乳酸デヒドロゲナーゼ遺伝子を発現した。培養後、遠心分離(13,000G、10分)で集菌した。
大腸菌Rosetta-gami(DE3)(Novagen社製)のコンピテントセルを融解して、ファルコンチューブに0.1mL移した。その中に上記1.の精製発現プラスミドの溶液0.002mLを加え氷中に20分間放置した後、42℃でヒートショックを90秒間行い、氷中に1分間放置した後、クロラムフェニコールとアンピシリンを含むLB寒天プレートに適量まき、37℃で一晩培養し、形質転換体を得た。得られた形質転換体を、アンピシリンを含むLB培地(5mL)で18時間培養し、耐熱性D−乳酸デヒドロゲナーゼ遺伝子を発現した。培養後、遠心分離(13,000G、10分)で集菌した。
集菌した菌体に、破砕液(20mM Tris-HCl、100mM KCl、pH7.5)を0.2mL加え、超音波発生器で細胞を破砕し、その懸濁液を0.1mLずつ2本のサンプルチューブに分けた。一方のサンプルチューブは遠心分離(13,000G、10分)して上清と沈殿に分け、沈殿は破砕液0.1mLで懸濁した。もう一方のサンプルチューブは、熱処理(80℃、10分)を施した後、遠心分離(13,000G、10分)して上清と沈殿に分け、沈殿は破砕液0.1mLで懸濁した。これらの試料の一部をSDS−ポリアクリルアミドゲル電気泳動(PAGE)で分析し、発現を確認できた。この結果を図1のSDS−PAGE写真に示す。
耐熱性D−乳酸デヒドロゲナーゼの発現が見られた試料についてSDSポリアクリルアミドゲル電気泳動を行った後、エレクトロブロッティングによってPVDF膜に転写し、染色によって可視化された目的組換えタンパク質である耐熱性D−乳酸デヒドロゲナーゼのバンドを切り出し、プロテインシーケンサーModel492Procise(Applied Biosystems社製)を用いて、アミノ末端配列を解析した結果、配列番号5に示すように7残基のアミノ末端配列が決定できた。この配列により、発現タンパク質が耐熱性D−乳酸デヒドロゲナーゼであることを確認できた。この発現タンパク質は、473アミノ酸残基より構成されており、その推定分子量は52.2kDaであり、図1の結果とほぼ一致した。
本発明により、D−乳酸デヒドロゲナーゼ活性を有する新規耐熱性タンパク質が提供できる。本発明のタンパク質は、高温下で使用することが可能であり、工業的用途が広がると共に、基質濃度の増加、反応効率の向上、混入微生物の除去、保存期間および耐用期間の延長などの多くの利点がもたらされる。
配列番号1:耐熱性D−乳酸デヒドロゲナーゼのアミノ酸配列
配列番号2:耐熱性D−乳酸デヒドロゲナーゼのアミノ酸配列をコードする塩基配列
配列番号3:耐熱性D−乳酸デヒドロゲナーゼの構造遺伝子の末端に制限酵素部位NdeI、BamHIおよびNotIを導入するための順方向プライマー
配列番号4:耐熱性D−乳酸デヒドロゲナーゼの構造遺伝子の末端に制限酵素部位NdeI、BamHIおよびNotIを導入するための逆方向プライマー
配列番号5:N末端アミノ酸配列
配列番号2:耐熱性D−乳酸デヒドロゲナーゼのアミノ酸配列をコードする塩基配列
配列番号3:耐熱性D−乳酸デヒドロゲナーゼの構造遺伝子の末端に制限酵素部位NdeI、BamHIおよびNotIを導入するための順方向プライマー
配列番号4:耐熱性D−乳酸デヒドロゲナーゼの構造遺伝子の末端に制限酵素部位NdeI、BamHIおよびNotIを導入するための逆方向プライマー
配列番号5:N末端アミノ酸配列
Claims (7)
- 下記の(a)または(b)の耐熱性タンパク質。
(a) 配列番号1のアミノ酸配列からなる耐熱性タンパク質。
(b) 配列番号1のアミノ酸配列において、1つ若しくは数個のアミノ酸残基が、欠失、置換、付加若しくは挿入されたアミノ酸配列からなり、D−乳酸デヒドロゲナーゼ活性を有する耐熱性タンパク質。 - 前記D−乳酸デヒドロゲナーゼ活性が、FAD存在下で、(R)−乳酸に作用してピルビン酸を生成する機能である請求項1記載のタンパク質。
- 超好熱性古細菌由来である請求項1または2記載のタンパク質。
- 超好熱性古細菌が、アエロパイラム・ペルニックス(Aeropyrum pernix)(JCM9820)である請求項3記載のタンパク質。
- 請求項1から4のいずれかに記載のタンパク質をコードするDNAまたは配列番号2に記載のDNAを含むベクター。
- 請求項5記載のベクターにより形質転換された形質転換体。
- 請求項1から4のいずれかに記載のタンパク質の製造方法であって、請求項6記載の形質転換体を培養する工程と、前記培養工程において発現した前記タンパク質を回収する工程とを含む製造方法。
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