JP2006232734A

JP2006232734A - 新規抗菌剤

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Publication number: JP2006232734A
Application number: JP2005050065A
Authority: JP
Inventors: Mitsuasa Hirayama; 満朝平山; Kaoru Terajima; 薫寺島
Original assignee: Fuji Photo Film Co Ltd
Current assignee: Fujifilm Holdings Corp
Priority date: 2005-02-25
Filing date: 2005-02-25
Publication date: 2006-09-07

Abstract

【課題】高い抗菌効果を有しかつ変異原性が低い抗菌剤の提供。
【解決手段】下記式（I）で表される化合物を有効成分として含有する抗菌剤。
【化１】

［式中、
−X−(CN)_mはシアノ基が置換した炭素数1〜10のアルキル基（１個又は２個以上の水酸基を置換基として有していてもよい）、又はシアノ基が置換した炭素数1〜10のアルコキシ基（１個又は２個以上の水酸基を置換基として有していてもよい）を表し；Wは芳香族化合物の残基を表し；Wで表される芳香族化合物の残基は、ハロゲン原子、水酸基、炭素数1〜20のアルキル基等の置換基を有していてもよく；mは1〜３、nは１〜６の整数である。]

Description

本発明は変異原性の低い抗菌剤に関する。より詳しくはニトリル化合物を含む変異原性の低い抗菌剤に関する。

細菌の増殖により、工業用材料や最終製品の劣化、生産性の低下、及び製品の品質低下等が引き起こされる場合があるため、現在、工業用に多くの抗菌剤が用いられている。工業用の繁用抗菌剤としては、例えば、プラスチックに使われるカルベンダジン、皮革に使われるオルトフェニルフェノール、及び環境衛生目的で使われるグルタルアルデヒド等を挙げることができる。

しかし、これらの抗菌剤を継続して用いると、微生物が抗菌剤に対する耐性を獲得することにより抗菌効果が低下することが多い。使用する抗菌剤を一定期間ごとに代えることにより耐性化を回避して抗菌効果を維持する対応策がとられているが、特に細菌汚染が激しい場合にはこの対応策にも限界がある。既存の抗菌剤は耐性化により抗菌性が低下していくと考えられているので、新規な化学構造を有する化合物を含む既存抗菌剤に耐性化した細菌に対しても効果を有する抗菌剤が常に求められている。

また、工業用の抗菌剤としては、人体、環境等への安全性よりもその抗菌効果に重点が置かれる傾向があり、繁用されている抗菌剤においても毒性が高い化合物を含む抗菌剤が少なくない。特に、人体において腫瘍及び遺伝性疾患等を発生させ、環境生物において生態系を変化させる懸念がある遺伝情報に変化を与える性質、すなわち変異原性を有する化合物が繁用抗菌剤のなかにも含まれている。従って、今後開発される抗菌剤としては、生体及び環境への安全性の確保のため変異原性の低い抗菌剤が望まれている。

抗菌効果を有する化合物のひとつとしてニトリル化合物が知られている。ニトリル化合物に関する抗菌効果については、例えば、例えば、Tellezらは、フェニルアセトニトリルを成分中含む抽出液に、シアノバクテリアに対する抗菌性があることを報告しており（非特許文献１:Phytochemistry,61(2),149-155, 2002）、また、Itohらは、Siを分子中に含む2-aryl-3-(1H-1,2,4-triazol-1-yl) propanenitrileの誘導体に、抗真菌作用があることを報告している（非特許文献２:Chemical and Pharmaceutical Bulletin, 49(7),909-911 (2001)）。しかし、本発明において提示する限定されたニトリル化合物が、高い抗菌効果を有すること、及び変異原性が低いことについての報告例はこれまでなかった。
Phytochemistry,61(2),149-155, 2002 Chemical and Pharmaceutical Bulletin, 49(7),909-911, 2001

本発明は、高い抗菌効果を有しかつ変異原性が低い抗菌剤を提供することを課題としており、より具体的には、高い抗菌効果を有しかつ変異原性が低いニトリル化合物を含む抗菌剤を提供することを課題とする。

本発明者らは、上記の課題の解決のために鋭意努力し、多様なニトリル化合物のうち特定の構造を有するニトリル化合物が充分な抗菌効果を有しかつ変異原性が低いことを発見し、この知見を基にして本発明を完成した。

すなわち本発明は、下記式（Ｉ）で表される化合物：

［式中、
−X−(CN)_mはシアノ基が置換した炭素数1〜10のアルキル基（１個又は２個以上の水酸基を置換基として有していてもよい）、又はシアノ基が置換した炭素数1〜10のアルコキシ基（１個又は２個以上の水酸基を置換基として有していてもよい）を表し；
Wは芳香族化合物の残基（該芳香族化合物は環構成原子としてヘテロ原子を１又は２個以上含んでいてもよい）を表し、それぞれ独立に、下記の群から選ばれる0〜5個の同一又は異なる置換基を有していてもよく：置換基群＝ハロゲン原子、水酸基、炭素数1〜20のアルキル基（１個又は２個以上の水酸基を置換基として有していてもよく、又は末端が該アルキル基の結合する芳香環に結合して架橋アルキレン基となっていてもよい）、炭素数1〜20のアルコキシ基（１個又は２個以上の水酸基を置換基として有していてもよい）、ニトロ基、−N(R¹)(R²)、−COR³、−SO₃M¹、−R⁴-N(R⁵)(R⁶)、−R⁷-COR⁸、−R⁹-SO₃M²、-S-W²、 -CO-W²、及び-O-W²（R¹、R²、R⁵、及びR⁶は、互いに同じであっても異なっていてもよく各々独立に、水素原子又は炭素数1〜20のアルキル基（１個又は２個以上の水酸基を置換基として有していてもよく、又は末端が該アルキル基の結合する芳香環に結合して架橋アルキレン基となっていてもよい）を表し、R³及びR⁸は、互いに同じであっても異なっていてもよく各々独立に、水素原子、−OM³、炭素数1〜20のアルキル基（１個又は２個以上の水酸基を置換基として有していてもよく、又は末端が該アルキル基の結合する芳香環に結合して架橋アルキレン基となっていてもよい）、炭素数1〜20のアルコキシ基（１個又は２個以上の水酸基を置換基として有していてもよい）、又はアミノ基を表し、M¹、M²、及びM³は、互いに同じであっても異なっていてもよく各々独立に、一価のカチオンを形成するのに必要な原子又は分子を表し、R⁴、R⁷、及びR⁹は、互いに同じであっても異なっていてもよく各々独立に炭素数1〜20のアルキレン基を表し、及びW²は芳香族化合物（該芳香族化合物は環構成原子としてヘテロ原子を１又は２個以上含んでいてもよい）の残基を表す）；

ただし、Wで表される芳香族化合物の残基がニトロ基、−NH₂、又は−N(R^1')(R²) （R^1'は炭素数1〜2のアルキル基（１個又は２個以上の水酸基を置換基として有していてもよく、又は末端が該アルキル基の結合する芳香環に結合して架橋アルキレン基となっていてもよい）を表す）のいずれかの置換基を有する場合、該置換基が置換する位置に隣接する２つの位置のいずれか又は両方に−X−(CN)_m、ハロゲン原子、水酸基、炭素数1〜20のアルキル基（１個又は２個以上の水酸基を置換基として有していてもよく、又は末端が該アルキル基の結合する芳香環に結合して架橋アルキレン基となっていてもよい）、炭素数1〜20のアルコキシ基（１個又は２個以上の水酸基を置換基として有していてもよい）、−N(R¹)(R²)（ただし、−NH₂及び−N(R^1')(R²)を除く）、−COR³、−SO₃M¹、−R⁴-N(R⁵)(R⁶)、−R⁷-COR⁸、又は−R⁹-SO₃M²が存在し；
mは1〜３の整数を表し、nは１〜６の整数を表す。] を有効成分として含有する抗菌剤を提供する。

本発明の好ましい態様によれば、−X−(CN)_mが炭素数１〜３のシアノ化アルキル基で、かつｍ及びｎがいずれも２である上記抗菌剤；−X−(CN)_mがジシアノメチル基である上記抗菌剤；Wが、炭素数1〜15のアルキル基（１個又は２個以上の水酸基を置換基として有していてもよく、又は末端が該アルキル基の結合する芳香環に結合して架橋アルキレン基となっていてもよい）、炭素数1〜15のアルコキシ基（１個又は２個以上の水酸基を置換基として有していてもよい）、水酸基、又はハロゲン原子を置換基として有するフェニル基である上記いずれかの抗菌剤；Wが炭素数1〜3のアルキル基（１個又は２個以上の水酸基を置換基として有していてもよい）、又は炭素数1〜3のアルコキシ基（１個又は２個以上の水酸基を置換基として有していてもよい）を置換基として有するフェニル基である上記いずれかの抗菌剤が提供される。
本発明のさらに好ましい態様によれば、工業用抗菌剤である上記いずれかの抗菌剤が提供される。

本発明の別の観点からは、抗菌剤の製造のための上記式（I）で表される化合物の使用；及び微生物の繁殖を阻止する方法であって、上記式（I）で表される化合物を工業用製品又は工業用原材料に添加する工程を含む方法が提供される。

本発明により、高い抗菌効果を有しかつ変異原性が低いニトリル化合物を含む抗菌剤が提供される。

本明細書において、ニトリル化合物とは、分子中にシアノ基を有す化合物を意味する。
本明細書において、芳香族化合物とは、環内に4n+2個のπ電子をもつ環状共役化合物を意味し、例えば、ベンゼン、1,3,5,7,9-デカペンタエン、1,3,5,7,9,11,13-テトラデカペンタエン、ナフタレン、アントラセン、フェナントレン、インデン、テトラリン、アズレン、ペリナフチルなどが挙げられ、好ましくはベンゼン又はナフタレン、より好ましくはベンゼンが挙げられる。W 又はW²で表される芳香族化合物は環構成原子としてヘテロ原子を１又は２個以上含んでいてもよく、このような芳香族化合物としては、ピリジン、ピロール、インドリジン、チオフェン、フラン、シクロペンタジエニルイオン、トロポン、トロポロン、フェロセン、ボラゾール、ケイ素ベンゼンなどが挙げられる。W²で表される残基に含まれる芳香族化合物としてはベンゼンが好ましい。

本明細書において、アルキル基としては、直鎖状、分枝鎖状、環状、又はそれらの組み合わせのいずれでもよい。特に言及しない場合には、本明細書においてアルキル基及びアルキル部分を含む官能基のアルキル部分も同じ意味を有する。)例えば、炭素数1〜10のアルキル基の例としては、メチル基、エチル基、ｎ−プロピル基、イソプロピル基、ｎ−ブチル基、イソブチル基、ｓｅｃ−ブチル基、ｔｅｒｔ−ブチル基、ｎ−ペンチル基、イソペンチル基、ネオペンチル基、１，１−ジメチルプロピル基、ｎ−ヘキシル基、イソヘキシル基、直鎖状又は分枝鎖状のヘプチル基、オクチル基、ノニル基、又はデシル基、シクロプロピル基、シクロブチル基、シクロペンチル基、シクロヘキシル基等を挙げることができる。本明細書において、アルキル基が１個又は２個以上の特定の置換基を有していてもよいという場合には、置換位置は特に限定されず、２個以上の置換基を有する場合には、それらの置換基は同じでも異なっていてもよい。炭素数1〜20のアルキレン基としては、炭素数1〜20の直鎖状、分枝鎖状、環状、又はそれらの組み合わせのアルカンの任意の２個の水素を除いて生じる二価の基が挙げられる。

本明細書において、「シアノ基が置換した」とは、基の任意の位置にシアノ基が置換していることを意味する。
本明細書において、「ハロゲン原子」という場合には、フッ素原子、塩素原子、臭素原子、又はヨウ素原子のいずれでもよい。
一価のカチオンを形成するのに必要な原子又は分子としては、水素原子及びアルカリ金属原子（リチウム、ナトリウム、及びカリウム等）等が挙げられる。

Wで表される芳香族化合物の残基の置換基としては、ハロゲン原子、水酸基、炭素数1〜20のアルキル基（１個又は２個以上の水酸基を置換基として有していてもよく、又は末端が該アルキル基の結合する芳香環に結合して架橋アルキレン基となっていてもよい）、又は炭素数1〜20のアルコキシ基（１個又は２個以上の水酸基を置換基として有していてもよい）が好ましい。ここで、炭素数4以上のアルキル基の場合は、分岐鎖であることが好ましい。Wで表される芳香族化合物の残基がニトロ基、−NH₂、又は−N(R^1')(R²) （R^1'は炭素数1〜2のアルキル基（１個又は２個以上の水酸基を置換基として有していてもよく、又は末端が該アルキル基の結合する芳香環に結合して架橋アルキレン基となっていてもよい）を表す）のいずれかの置換基を有する場合は、該置換基が置換する位置に隣接する２つの位置のいずれか又は両方に、ハロゲン原子、水酸基、炭素数1〜20のアルキル基（１個又は２個以上の水酸基を置換基として有していてもよく、又は末端が該アルキル基の結合する芳香環に結合して架橋アルキレン基となっていてもよい）、炭素数1〜20のアルコキシ基（１個又は２個以上の水酸基を置換基として有していてもよい）、−N(R¹)(R²)（ただし、−NH₂及び−N(R^1')(R²)を除く）、−COR³、−SO₃M¹、−R⁴-N(R⁵)(R⁶)、−R⁷-COR⁸、又は−R⁹-SO₃M²が存在する。ここで「隣接する位置」との用語は、例えば芳香族化合物がベンゼン環である場合オルト位を意味する。

Wで表される芳香族化合物の残基の置換基の数及び置換位置は特に限定されないが、Wがフェニル基で、かつ、置換基の数が1個である場合には、該置換基は−X−(CN)_mの結合位置のパラ位に存在するのが好ましい。
上記式（I）において、好ましくは−X−(CN)_mは、炭素数１〜３のシアノ化アルキル基、かつ、m及びnはいずれも２であり、−X−(CN)_mはより好ましくはジシアノメチル基である。

Wは好ましくは、炭素数1〜15のアルキル基（１個又は２個以上の水酸基を置換基として有していてもよい）、又は炭素数1〜15のアルコキシ基（１個又は２個以上の水酸基を置換基として有していてもよい）、水酸基、又はハロゲン原子を置換基として有するフェニル基である上記いずれかの抗菌剤であり、より好ましくは炭素数1〜３のアルキル基（１個又は２個以上の水酸基を置換基として有していてもよい）、又は炭素数1〜３のアルコキシ基（１個又は２個以上の水酸基を置換基として有していてもよい）を置換基として有するフェニル基である。

−X−(CN)_m及びWで表される芳香族化合物の残基の置換基の位置は任意であるが、Wで表される芳香族化合物の残基がニトロ基、−NH₂、又は−N(R^1')(R²)（R^1'は炭素数1〜2のアルキル基（１個又は２個以上の水酸基を置換基として有していてもよく、又は末端が該アルキル基の結合する芳香環に結合して架橋アルキレン基となっていてもよい）を表す）のいずれかの置換基をもつ場合は、該置換基のオルト位に−X−(CN)_mが存在するか、又は置換基が２以上であって該置換基のオルト位にその他の一つの置換基が存在しかつ該オルト位の置換基はハロゲン原子、水酸基、炭素数1〜10のアルキル基（１個又は２個以上の水酸基を置換基として有していてもよく、又は末端が該アルキル基の結合する芳香環に結合して架橋アルキレン基となっていてもよい）、炭素数1〜10のアルコキシ基（１個又は２個以上の水酸基を置換基として有していてもよい）、−N(R¹)(R²)（ただし、−NH₂及び−N(R^1')(R²)を除く）、−COR³、−SO₃M¹、−R⁴-N(R⁵)(R⁶)、−R⁷-COR⁸、又はR⁹-SO₃M²である。n が２のとき、２つの−X−(CN)_m は互いにパラ位であることが好ましい。

本発明に用いられるニトリル化合物の具体例としては、例えば以下の化合物を挙げることができる。

本発明で用いられるニトリル化合物は、置換基の種類により1個以上の不斉炭素を有する場合がある。１個以上の不斉中心に基づく光学的に純粋な形態の任意の光学異性体、上記の光学異性体の任意の混合物、ラセミ体、2個以上の不斉炭素に基づくジアステレオ異性体、上記のジアステレオ異性体の任意の混合物等を有効成分として含有する抗菌剤は、いずれも本発明の範囲に包含される。上記式（I）の化合物が水和物又は溶媒和物を形成する場合もあるが、このような場合も本発明の範囲に包含される。

好ましい化合物の具体例として、以下の化合物を挙げることができるが、本発明の抗菌剤は上記に例示した化合物群又は特定の化合物に限定されることはない。

上記式（I）で表される化合物は市販品として、和光純薬工業株式会社（大阪府大阪市）等、により入手可能である。
上記の化合物はそのまま抗菌剤として用いてもよいが、適当な担体及び補助剤、例えば界面活性剤、結合剤、安定剤等を配合して、常法によって、粉剤、水和剤、乳剤、液剤、フロアブル剤（ゾル剤）、粒剤、エアゾル剤、固形剤、塗布剤等の形態で抗菌剤として提供してもよい。本発明の抗菌剤は好ましくはヒトへの投与以外の用途、より好ましくはヒト又は哺乳類動物への投与以外の用途に用いられ、さらに好ましくは工業用に用いられる。

本明細書において、工業用とは、ヒト又は哺乳類動物への投与を除く用途を示し、好ましくは、さらに食用や観賞用に供される魚類や植物等の生物への投与を除く用途を示し、さらに好ましくは、さらにヒト又は哺乳類動物による摂食・摂取を目的とした食品（工場等で生産される加工食品を含む）への添加を除く用途を示す。本発明の抗菌剤は好ましくは、工業用原材料又は製品等に添加、塗布、噴霧する等の方法により使用される。また、本発明の抗菌剤は消毒用に用いてもよく、例えばヒトの手の消毒用に用いてもよい。本発明の抗菌剤が適用される工業用原材料又は製品としては、天然及び合成の有機物を含む材料又は製品が好ましく、天然及び合成の高分子化合物を含む材料又は製品が特に好ましい。例えば塗料、インク、接着剤、糊料、布、紙、繊維、パルプ、チップ、木材、プラスチック、ゴム、皮革、金属加工油等が挙げられる。工業製品に塗布、噴霧されるときの抗菌剤中の有効成分である化合物濃度は、０．００００１〜１０％(質量％、以下同じ)の範囲が好ましく、より好ましくは、０．００１〜１０％の範囲である。また、工業製品に添加されるときは、有効成分である化合物濃度が０．００００１〜１０％、好ましくは、０．００１〜１０％の範囲となるように添加することが好ましい。

本発明の抗菌剤に用いることができる担体としては、抗菌剤に含まれる担体として常用されるものであれば、固体又は液体のいずれでもよく、特定の担体に限定されない。例えば、固体担体としては、鉱物性粉末（カオリン、ベントナイト、クレー、モンモリロナイト、珪藻土、雲母、バーミキュライト、石膏、炭酸カルシウム、リン、石灰、ホワイトカーボン、消石灰、珪砂、硫安、尿素等）、植物性粉末（大豆粉、小麦粉、木粉、澱粉、結晶セルロース等）、アルミナ、珪酸塩、糖重合体、高分散性珪酸、ワックス類等が挙げられる。また、液体担体としては、水、アルコール類（メチルアルコール、エチルアルコール、ｎ−プロピルアルコール、イソプロピルアルコール、エチレングリコール、ベンジルアルコール等）、芳香族炭化水素類（ベンゼン、トルエン、キシレン、エチルベンゼン、クロルベンゼン、クメン、メチルナフタレン等）、ハロゲン化炭化水素類（クロロホルム、四塩化炭素、ジクロロメタン、クロロエチレン、トリクロロフルオロメタン、ジクロロジフルオロメタン等）、エーテル類（エチルエーテル、エチレンオキサイド、ジオキサン、テトラヒドロフラン等）、ケトン類（アセトン、メチルエチルケトン、シクロヘキサン、メチルイソブチルケトン等）、エステル類（酢酸エチル、酢酸ブチル、エチレングリコールアセテート、ジオクチルフタレート、酢酸アミル等）、ニトリル類（アセトニトリル、プロピオニトリル、アクリロニトリル等）、スルホキシド類（ジメチルスルホキシド等）、アルコールエーテル類（エチレングリコールモノメチルエーテル、エチレングリコールモノエチルエーテル、１−メトキシ−２−プロパノール等）、アミン類（エチルアミン、ジメチルアミン、トリメチルアミン、イソブチルアミン等）、脂肪族又は脂環族炭化水素類（ｎ−ヘキサン、シクロヘキサン等）、工業用ガソリン（石油エーテル、ソルベントナフサ等）、及び石油留分（パラフィン類、灯油、軽油等）等が挙げられる。

また、本発明の抗菌剤が粉剤、乳剤、水和剤、ゾル（フロアブル剤）、粒剤、エアゾル剤、固形剤、塗布剤等に製剤化される場合には、乳化、分散、可溶化、湿潤、発泡、拡展等の目的のため、界面活性剤を使用するのが好ましい。このような界面活性剤としては、例えば、非イオン型（ポリオキシエチレンアルキルエーテル、ポリオキシエチレンアルキルエステル、ポリオキシエチレンソルビタンアルキルエステル、ソルビタンアルキルエステル等）、陰イオン型（アルキルベンゼンスルホネート、アルキルスルホサクシネート、アルキルサルフェート、ポリオキシエチレンアルキルサルフェート、アリールスルホネート等）、陽イオン型［アルキルアミン塩（ラウリルアミン、ステアリルトリメチルアンモニウムクロライド、アルキルジメチルベンジルアンモニウムクロライド）等］、両性型［カルボン酸（ベタイン型）、硫酸エステル等］が挙げられるが、これらに限定されるものではない。

本発明の抗菌剤にはその他、ポリビニルアルコール（ＰＶＡ）、カルボキシメチルセルロース（ＣＭＣ）、アラビアゴム、ポリビニルアセテート、ゼラチン、カゼイン、アルギン酸ソーダ等の補助剤を添加することができる。さらに必要に応じて、酸化防止剤、紫外線吸収剤等の安定化剤を適量加えることができる。また、本発明の抗菌剤は、他の抗菌剤と混合して用いてもよい。

本発明の抗菌剤中の有効成分である化合物含有量は、単独の化合物あるいは２種以上の化合物を用いる場合はその合計含量として、粉剤、水和剤、乳剤、液剤、フロアブル剤、粒剤の場合は、０．００００１〜１００％（質量％、以下同じ）、好ましくは、０．００１〜１００％である。ただし、１００％の場合とは、有効成分である化合物をそのまま用いることを意味する。本発明の抗菌剤においては、有効成分である化合物を単独又は２種類以上組み合わせて用いることができる。

本発明の抗菌剤は抗菌効果が高く、かつ、変異原性が低いため、次のような用途に使用することができるが、その用途は下記に例示された用途に限定されない。
（１）水性又は油性塗料の製造工程中、貯蔵中及び使用時における細菌の生育による腐敗問題及び塗装後の塗装面における細菌の汚染障害の防止。
（２）カゼイン、ポリビニルアルコール、でんぷん等の接着剤又は糊料等の細菌の生育による腐敗問題及び塗工接着面における細菌の汚染障害の防止。
（３）湿潤パルプ及びチップ等の製紙用原料の保存中における細菌の生育による品質劣化障害の防止。
（４）木材、合板、竹材、皮革、たたみ、目地、タイル等の加工品及び材料等への細菌の生育による汚染及び品質劣化障害の防止。
（５）天然繊維、合成繊維及びこれらの混紡製品、材料等への細菌の生育による汚染及び品質劣化障害の防止。
（６）合成エマルジョン又はエマルジョンワックス等への細菌の生育による品質劣化障害の防止。
（７）界面活性剤使用製剤等における細菌の生育による品質劣化障害の防止。
（８）作動油剤等における細菌の生育による品質劣化障害の防止。
（９）プラスチック、ゴム等における細菌の生育による品質劣化障害の防止又は抗菌。
（１０）抄紙工程中の細菌によるスライム障害のコントロール。

本明細書において抗菌という用語は、微生物の殺滅又は微生物の増殖阻害を意味する。本発明の抗菌剤の対象となる微生物は特に限定されず、細菌（グラム陽性又はグラム陰性細菌、好気性又は嫌気性細菌等にかかわらず全て）、真菌（酵母、糸状菌）等、任意の１又は２以上の微生物の殺菌又は静菌に使用できる。

以下、実施例により本発明をさらに具体的に説明するが、本発明の範囲はこれらの実施例に限定されるものではない。
なお、実施例において用いられているニトリル化合物は市販品としてSigma-Aldrich Co.(St.Louis,MO USA)から入手するか、又は公知の方法により合成した。
（例１）
10mlの培養液(NUTRIENT BROTH No.2,Lot/Ch.-B.:276098,OXOID )をL字管(容量23 ml)
に分注し、凍結保存(-80℃以下)しておいた10 ％ジメチルスルホキシド(以下、DMSO)菌懸濁液(菌濃度：約10⁸CFU/ml)を20μl接種した。試験菌として、Salmonella typhimurium TA100、同TA 98、同TA 1535、同TA 1537 (以上、Prof. Bruce N. Ames, University of California -Berkeley, Div. Biochem. & Molecular Biologyより分譲)及びEscherichia coli WP2 uvrA（国立医薬品食品衛生研究所変異遺伝部より分譲）の5菌株を用いた。

菌を接種した培養液を37℃で10時間振とう培養 (100 spm)後、菌液の吸光度(660 nm)を測定し、あらかじめ求めた菌濃度と吸光度（660 nm）の関係式より、菌濃度が1×10⁹ CFU/mlであることを確認し、菌懸濁液を試験に供した。菌懸濁液は作成後、1時間以内に試験に供した。
被験物質濃度は50 mg/mlを最高用量とし、希釈倍率4倍ずつで最高用量を含め5段階となるようにDMSOで溶解し、被験物質溶液を調製した。この被験物質溶液0.1mlに代謝活性化法による場合は0.5 mlのS9mix（S9（キッコーマン）0.1 ml、MgCl₂8μmol、KCl 33μmol、グルコース-6-リン酸5μmol 、NADPH 4μmol、NADH 4μmol、ナトリウム-リン酸緩衝液100μmol、滅菌蒸留水で計1 mlに調製）を、代謝活性化法によらない場合は0.5 mlの1M ナトリウム-リン酸緩衝液を入れた後、菌懸濁液 0.1 mlを加えた。その後、加温溶解後、50℃に保った寒天溶液（Bacto Agar、BECTONDICKINSON）2 mlを加え、攪拌後、最少グルコース寒天平板培地（クリメディア、オリエンタル酵母工業）に重層し、37℃で 48時間培養した。
被験物質による試験と同時に被験物質溶液の代わりに溶媒(DMSO)のみを加えて陰性対照とし、また、被験物質の代わりに表1に記載した化合物を加えて陽性対照とした。

上記の陽性対照物質であるAF-2（和光特級、純度９９.１％）、NaN₃（化学用、純度９９.８％）、B[a]P（和光特級、純度１００％）及び2-AA（グレード設定なし、純度９６.６％）は、いずれも和光純薬工業(株)より購入した。9-AA（グレード設定なし、純度９８％）は、Aldrich Chemical Co.,Inc.より購入した。

被験物質の抗菌効果の評価は、培養後の平板培地を鏡検し（倍率：100倍）、観察される培地上の微小コロニーが陰性対照に比べて、明らかに少ないと判断した場合の被験物質濃度を最小発育阻止濃度(以下、MIC)として算出することで行った。MICに用いる被験物質濃度は、添加した被験物質重量を重層した寒天量（2 ml）で除した値とした。

被験物質の変異原性の評価は、エイムス試験（細菌を用いる突然変異試験）に従って、被験物質の濃度別に培養後の平板培地上に観察される復帰変異コロニー数を計測することで行った。計測した復帰変異コロニー数が用量依存的に増加し、かつ、復帰変異コロニー数が陰性対照における復帰変異コロニー（自然復帰変異コロニー）の2倍以上である場合に、変異原性陽性とし、一方、復帰変異コロニー数が陰性対照における復帰変異コロニー（自然復帰変異コロニー）の2倍未満の場合を陰性として判定した。復帰変異コロニー数の増加を認めても、用量依存性が認められない場合は、再試験を行い結果の再現性を明らかにして変異原性の判定を行った。

上記方法を用いて、繁用抗菌剤と本発明の抗菌剤について、抗菌性と変異原性を比較するため、繁用抗菌剤であるクレオソート油、オルトフェニルフェノール、及びグルタルアルデヒドと、本発明の抗菌剤として上記の式（II）、（III）、及び（IV）で示される化合物について評価を行った。

その結果、抗菌性については、クレオソート油、オルトフェニルフェノール、及びグルタルアルデヒドのMICは、それぞれ2500、157、及び9.8 ppmだった。これに対して上記の式（II）、（III）及び（IV）で示される化合物のMICは、それぞれ39、39、及び157 ppmで、上記の式（II）、（III）で示される化合物のMICは、オルトフェニルフェノール及びクレオソート油のMICよりも低く、上記の式（IV）で示される化合物のMICは、オルトフェニルフェノールのMICと同等で、クレオソート油のMICよりも低くかった。すなわち、（II）、（III）及び（IV）の化合物は、いずれも比較に用いた繁用抗菌剤に比べて同等、又はより優れた抗菌力を示した。
変異原性については、繁用抗菌剤の中でオルトフェニルフェノール及びグルタルアルデヒドが陽性を示したが、上記の式（II）、（III）、及び（IV）で示される化合物はいずれも陰性だった。

Claims

下記式（Ｉ）で表される化合物を有効成分として含有する抗菌剤。

［式中、
−X−(CN)_mはシアノ基が置換した炭素数1〜10のアルキル基（１個又は２個以上の水酸基を置換基として有していてもよい）、又はシアノ基が置換した炭素数1〜10のアルコキシ基（１個又は２個以上の水酸基を置換基として有していてもよい）を表し；
Wは芳香族化合物の残基（該芳香族化合物は環構成原子としてヘテロ原子を１又は２個以上含んでいてもよい）を表し、それぞれ独立に、下記の群から選ばれる0〜5個の同一又は異なる置換基を有していてもよく：置換基群＝ハロゲン原子、水酸基、炭素数1〜20のアルキル基（１個又は２個以上の水酸基を置換基として有していてもよく、又は末端が該アルキル基の結合する芳香環に結合して架橋アルキレン基となっていてもよい）、炭素数1〜20のアルコキシ基（１個又は２個以上の水酸基を置換基として有していてもよい）、ニトロ基、−N(R¹)(R²)、−COR³、−SO₃M¹、−R⁴-N(R⁵)(R⁶)、−R⁷-COR⁸、−R⁹-SO₃M²、-S-W²、 -CO-W²、及び-O-W²（R¹、R²、R⁵、及びR⁶は、互いに同じであっても異なっていてもよく各々独立に、水素原子又は炭素数1〜20のアルキル基（１個又は２個以上の水酸基を置換基として有していてもよく、又は末端が該アルキル基の結合する芳香環に結合して架橋アルキレン基となっていてもよい）を表し、R³及びR⁸は、互いに同じであっても異なっていてもよく各々独立に、水素原子、−OM³、炭素数1〜20のアルキル基（１個又は２個以上の水酸基を置換基として有していてもよく、又は末端が該アルキル基の結合する芳香環に結合して架橋アルキレン基となっていてもよい）、炭素数1〜20のアルコキシ基（１個又は２個以上の水酸基を置換基として有していてもよい）、又はアミノ基を表し、M¹、M²、及びM³は、互いに同じであっても異なっていてもよく各々独立に、一価のカチオンを形成するのに必要な原子又は分子を表し、R⁴、R⁷、及びR⁹は、互いに同じであっても異なっていてもよく各々独立に炭素数1〜20のアルキレン基を表し、及びW²は芳香族化合物（該芳香族化合物は環構成原子としてヘテロ原子を１又は２個以上含んでいてもよい）の残基を表す）；
ただし、Wで表される芳香族化合物の残基がニトロ基、−NH₂、又は−N(R^1')(R²) （R^1'は炭素数1〜2のアルキル基（１個又は２個以上の水酸基を置換基として有していてもよく、又は末端が該アルキル基の結合する芳香環に結合して架橋アルキレン基となっていてもよい）を表す）のいずれかの置換基を有する場合、該置換基が置換する位置に隣接する２つの位置のいずれか又は両方に−X−(CN)_m、ハロゲン原子、水酸基、炭素数1〜20のアルキル基（１個又は２個以上の水酸基を置換基として有していてもよく、又は末端が該アルキル基の結合する芳香環に結合して架橋アルキレン基となっていてもよい）、炭素数1〜20のアルコキシ基（１個又は２個以上の水酸基を置換基として有していてもよい）、−N(R¹)(R²)（ただし、−NH₂及び−N(R^1')(R²)を除く）、−COR³、−SO₃M¹、−R⁴-N(R⁵)(R⁶)、−R⁷-COR⁸、又は−R⁹-SO₃M²が存在し；
mは1〜３の整数を表し、nは１〜６の整数を表す。]
−X−(CN)_mが炭素数１〜３のシアノ化アルキル基で、かつｍ及びｎがいずれも２である請求項１に記載の抗菌剤。
−X−(CN)_mがジシアノメチル基である請求項１に記載の抗菌剤。
Wが、炭素数1〜15のアルキル基（１個又は２個以上の水酸基を置換基として有していてもよく、又は末端が該アルキル基の結合する芳香環に結合して架橋アルキレン基となっていてもよい）、炭素数1〜15のアルコキシ基（１個又は２個以上の水酸基を置換基として有していてもよい）、水酸基、又はハロゲン原子を置換基として有するフェニル基である請求項１〜３のいずれか一項に記載の抗菌剤。
Wが炭素数1〜3のアルキル基（１個又は２個以上の水酸基を置換基として有していてもよい）、又は炭素数1〜3のアルコキシ基（１個又は２個以上の水酸基を置換基として有していてもよい）を置換基として有するフェニル基である請求項４に記載の抗菌剤。
工業用抗菌剤である請求項1〜５のいずれか一項に記載の抗菌剤。