JP2006208400A - 質量標識結合ハイブリダイゼーションプローブ - Google Patents
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Abstract
【解決手段】 その各々が所定の鎖長の既知の塩基配列に結合された質量標識を有し、アレイの各々の質量標識を、必要に応じて既知の塩基配列と共に、質量分析法によりその塩基配列と関連づけることが可能である、ハイブリダイゼーションプローブアレイ。
【選択図】 なし
Description
組み合わせ化学(この分野の文献2参照)により、分子を間接的に分析する必要性が多くなっている。現在、固相合成法を使用して、組み合わせ的にかなり多数の関連分子を生成する種々の方法が存在する。ほとんどの系はビーズ上に個々の分子を生成するので、望ましい特性についてこれらをスクリーニングすることができる。しかし、被スクリーニング分子が直接回収不可能である、または他の理由のために直接分析することが困難であるので、ビーズを間接的に標識することがしばしばあり、そのようなビーズ上の間接標識分子が1つの解決法として提案されている。組み合わせライブラリーを「コードする」(文献3参照)ほとんどの方法は、ある意味で「配列決定」することが可能である標識を使用することを含むと思われ(文献4参照)、例えば、アミノ酸および核酸分子を配列決定する方法は日常的に実施されており、今日では質量分析計でも実施される分析法であるように、短鎖ペプチドおよびオリゴヌクレオチドでは比較的短時間であるので、アミノ酸および核酸分子を使用してライブラリーをコードすることが多い。ハロゲン化ベンゼンおよび第2級アミドなどの他の有機物質が配列決定可能であり、このような目的に使用することができる(文献5および6参照)。
(a)プローブを標的核酸にハイブリダイゼーションさせる条件下において、 標的核酸と、所定の鎖長の既知の塩基配列に結合された質量標識を有するハイブリダイゼーションプローブアレイとを接触させるステップと、必要に応じてハイブリダイゼーションしていない材料を除去するステップと、
(b)ハイブリダイゼーションしたプローブを質量分析法により同定するステップと、
を含む方法を提供する。
(a)プローブを標的核酸にハイブリダイゼーションさせる条件下において、 標的核酸と、アレイの各々のハイブリダイゼーションプローブとを接触させるステップであって各プローブが所定の鎖長の既知の塩基配列に結合された質量標識を有するステップと、必要に応じてハイブリダイゼーションしていない材料を除去するステップと、
(b)ハイブリダイゼーションしたプローブを質量分析法により同定するステップと、
を含む方法を提供する。
標識分子を分析するための質量分析法
分子、特に生物分子を、分子同定指標としての「質量」で標識することが可能である。分子の質量を分子の同定と関連づけるコードは、作成が容易であり、例えば同定することが望ましい1組の分子を考えると、別個の各被同定分子に対して漸増する質量を選択するだけでよい。明らかに、多数の分子は質量だけに基づいて同定することができ、標識は不要であると思われるかもしれない。所与の組の分子は独特ではあっても、質量は非常に近接しており、多様にイオン化することがあるので、質量分析計内での分離が困難になることにより、質量標識が使用されるということができる。同重体であることが多いが、依然別個である核酸では特にこのことがいえ、例えば配列TATAはTTAA、TAAT等とは別個であるが、質量分析計では分離が困難であると思われる。さらに、分子は検出可能であるとともに所与の機能を果たすと同定されることが望ましいと思われ、これは直接的な検出が不可能であるかもしれないことを意味する。従って、独立に検出することができる脱離可能な標識は、有用性が高い。このことにより、非常に類似していてもよい大多数の分子を大規模なスクリーニングで同時に分析することが可能になる。
質量標識法の適用
生物学的な分析に日常的に使用される2種類の主要な質量分析法のイオン化法が存在する。これらは、エレクトロスプレー質量分析法(ESMS)およびMALDI TOF質量分析法である。ESMSは、本質的に液相から気相にイオン化することが可能な方法であり、MALDI法は、固相から気相にイオン化することが可能な方法である。分子生物学の多くは、液相中で実施されるか、またはそれを通じて試薬を添加し固相支持体に固定した分子から試薬を除去することができる液体媒体中の固相化学を使用している。ある意味では、これら2つの方法は、相補的であり、固相成分および液相成分の両方を分析することができる。
遺伝子プロファイリングのための質量標識アダプター分子の使用
文献8に記載されている遺伝子プロファイリング技術は、その細胞の集団内から各cDNAを採取することにより、細胞内での遺伝子発現パターンを分析するための方法を提供している。この特許出願によると、cDNAを特徴づけるための方法が提供されている。その方法は、(a)1種以上のcDNA集団または単離されたその断片を有し、その各々がポリA鎖などのcDNAの一方の末端を有する試料を第1の試料作成用エンドヌクレアーゼでcDNAの末端に近接する基準部位から既知の距離ずれた位置にある第1の試料作成部位で切断して、各cDNAまたは単離されたその断片から第1および第2の小断片を作成するステップであって、第1および第2の小断片の各々が所定の鎖長の突出末端配列と未知の配列とを有し、第1の小断片がcDNAの末端を有するステップと、
(b)第1または第2の小断片のどちらかをそれらの突出末端配列により小集団に分類し、各小集団の突出末端配列を第1の突出末端と記録するステップと、
(c)各小集団の小断片を、第1の試料作成エンドヌクレアーゼと同じまたは異なる第2の試料作成エンドヌクレアーゼで第1の試料作成部位から既知の距離ずれた位置にある第2の試料作成部位で切断して、所定の鎖長の第2の突出末端配列と未知の配列とを有するさらに小断片を各小断片から形成するステップと、
(d)第2の各突出末端配列を決定するステップと
を含み、
各小断片の第1および第2の突出末端配列を合わせた鎖長が6〜10であり、
基準部位ならびに第1および第2の突出末端の配列および相対位置が1つまたは各cDNAを特徴づける。
質量分析計に基づいたオリゴヌクレオチドチップ読み取り装置(MALDI)
オリゴヌクレオチドアレイ
スライドガラスのような平坦な固相基材上に合成されたオリゴヌクレオチドアレイを使用して、種々の核酸アッセイを実施することができる。このようなアレイは、一般に、スライドを別個のゾーンまたは領域に分割し、各領域が1種だけのオリゴヌクレオチドを有するように、構築される。各領域のアレイの標識核酸シグナルを測定することにより、アレイに対する標識核酸のハイブリダイゼーションを測定する。mRNA濃度の測定は数多くの方法で実施することができる。逆転写を使用して、容易にポリA産生mRNAをcDNAに変換することができる。逆転写酵素PCR(RTPCR)法により、1本鎖RNAの量を測定することが可能であるが、精度は比較的低い。オリゴヌクレオチドアレイは核酸分析の比較的新規な方法であり、変異分析、ハイブリダイゼーションによる配列決定およびmRNA発現分析を可能にする。このようなアレイを構築する方法が開発されており(例えば、参照文献9、10、11)、さらに別の方法が考えられている。
液体クロマトグラフィー質量分析法を使用した遺伝子プロファイリング
遺伝子プロファイリング過程は、シグネチャの分子分類、次いで分類したシグネチャにライゲーションされたプローブ分子の分析の2つの段階過程で実施される。MALDI方法は、オリゴヌクレオチドアレイを使用してシグネチャの分類を実施する。アレイ使用に代わる方法は、アフィニティークロマトグラフィーである。シグネチャを分類するためのアフィニティーカラムは、所定の鎖長の不明瞭な突出末端に基づいている。不明瞭な突出末端の4bpを用いてシグネチャを分類するためには、HPLCフォーマットに使用するために適当なビーズを突出末端の256の可能なテトラマーで誘導することができる。このようなカラムに、誘導体化したビーズ上のテトラマーにハイブリダイゼーションしやすいように、緩衝液に溶解したシグネチャを添加することができる。こうすることにより、ハイブリダイゼーション平衡をハイブリダイゼーションが生じやすいように向けられる。次いで、ハイブリダイゼーションを阻害する漸増濃度の緩衝液で洗浄することができる。AAAAまたはTTTT突出末端で停止するシグネチャが最初に放出されるが、GGGGおよびCCCCシグネチャは、最後に放出される。互いに相補的であるシグネチャの分離を確実にするためには、シグネチャのグアニンのビーズ上のシトシンに対するハイブリダイゼーション親和性がビーズ上のグアノシンに対するシグネチャ突出末端のシトシンのハイブリダイゼーションと異なるようにビーズを塩基類似物で誘導体化することができる。さらに、各テトラマーがどの他のテトラマーに対しても異なる相対濃度でビーズ上に確実に存在させることができる。
このようなアフィニティーカラムにより、シグネチャの集団はその突出末端と思われる配列により256の分画に分類することができるはずである。次いで、このような分画を、分析のためにエレクトロスプレー質量分析計に直接添加することができる。
DNAを配列決定するための質量標識アダプター分子の使用
スクリーニング技術が文献13に記載されており、
(a)各断片が独自の量で存在し、一方の末端に所定の鎖長の突出末端配列と未知の配列とを有する核酸断片を含む標的核酸集団を入手するステップと、(b)各断片の他方の末端を保護するステップと、
(c)(i)断片とアダプターオリゴヌクレオチドアレイとをサイクルで接触させるステップであって、各アダプターオリゴヌクレオチドが標識と配列決定酵素認識部位と、突出末端配列と同じ所定の鎖長の独自の塩基配列とを有し、アレイがその所定の鎖長の全ての可能な塩基配列を有し、サイクルが、リガーゼが存在するハイブリダイゼーション条件下においてアレイの各アダプターオリゴヌクレオチドと断片とを連続的に接触させるステップと、ライゲーションした任意のアダプターオリゴヌクレオチドを取り出すステップと、標識を検出することによってライゲーションした任意のアダプターオリゴヌクレオチドの量を記録するステップとを含み、アレイのアダプターの全てが試験されるまでサイクルを反復するステップと、
(ii)ライゲーションされたアダプターオリゴヌクレオチドと、認識部位に結合し、断片を切断して、以前の突出末端配列と隣接または重複する新たな突出末端配列とを露出させる塩基配列決定酵素とを接触させるステップと、
(iii)十分な回数、ステップ(i)および(ii)を繰り返し実施し、各突出末端配列について記録された量を比較することにより断片の配列を決定するステップと、
により断片の各々を塩基配列決定するステップと、
を含む、核酸を塩基配列するための方法が提供されている。
ハイブリダイゼーションアッセイ
文献14は、RNAの四次構造において、オリゴヌクレオチドに接近しやすい部位を同定するための方法であって、オリゴヌクレオチドの増幅またはいかなるの形態の電気泳動も必要としない方法を開示している。短鎖オリゴヌクレオチドプローブ、好ましくはテトラマーとmRNAとの結合を検出し、結合パターンをmRNAの一次構造に相関させる。接近しやすい領域は、大きい親和性でmRNAと結合する数多くのプローブを有し、それらのプローブの配列は、その接近し易い領域において一次配列と相補的であるはずである。プローブの配列は、重複していてもよい。上記の特許出願では、mRNAまたはプローブを固相基材に固定し、標識プローブまたはmRNAをそれぞれ捕獲した核酸にハイブリダイゼーションさせる。文献14に開示されている好ましい標識方法は、蛍光標識であるが、質量標識核酸が代わりに使用されてもよいことは明らかである。
ハイブリダイゼーションに基づいた数多くのアッセイが当技術分野では周知であるが、試料中に特定の配列が存在するかどうかを検出するサザンブロット法および他の方法が特に重要である。質量標識ハイブリダイゼーションプローブの利点は多数の独自に質量標識した核酸ハイブリダイゼーションプローブを用いて多数の配列を同時にプローブ付けすることができることである。
質量標識核酸の質量分析法による分析
質量分析計の本質的な特徴は以下のようである。注入システム→イオン源→質量分析装置→イオン検出装置→データ捕獲システム。この出願では、質量標識核酸プローブである生物分子を分析するためには、重要な特徴は、注入システムとイオン源である。生物学的分析のために重要な他の特徴は質量分析装置/検出装置の感度および分析物分子を定量する能力である。
イオン化法
多数の生物学的質量分析法の適用では、いわゆる「ソフトな」イオン化法が使用される。これにより、タンパク質および核酸などの大分子が本質的にフラグメント化することなく、イオン化される。液相法により、大きい生物分子を穏やかなpHおよび低濃度の溶液で質量分析計に注入することができる。エレクトロスプレーイオン化、高速原子衝撃およびマトリックス支援型レーザー脱離イオン化(MALDI)を含むがこれらに限定されない数多くの方法が本発明に使用するために理想的である。
エレクトロスプレーイオン化
エレクトロスプレーイオン化は、生物分子の希薄な溶液を分析計内に噴霧すること、すなわち細かいスプレーとして注入されることが必要である。例えば、乾燥窒素気流により、静電場の影響下で毛細管の先端から溶液を噴霧することができる。イオン化の機序は十分には理解されていないが、広義には以下のように考えられている。窒素気流中で溶媒が蒸発する。液滴がより小さくなると、生物分子の濃度は増加する。噴霧条件下において、ほとんどの生物分子は正味の正電荷または正味の負電荷を有し、溶解した生物分子間の静電反発を増す。溶媒の蒸発が進行すると、この反発は、液滴の表面張力より大きくなり、液滴はより小さい液滴に「破裂する」。静電場は、液滴の表面張力をさらに越える助けをし、噴霧過程の助力となる。より小さい液滴からの蒸発が進行し、全ての溶媒のように、本質的に生物分子が気相に存在するまで繰り返し破裂する。集団の内部エネルギー分布が狭い範囲に入る傾向があるように、非常に少量の余剰内部エネルギーをイオンに与えるという点において、この方法は、質量標識を使用するために特に重要である。
マトリックス支援型レーザー脱離イオン化(MALDI)
MALDIは、生物分子が大過剰モルの光活性「マトリックス」に埋設されることが必要である。適当な周波数のレーザー光線(ニコチン酸では266nm)を適用することにより、マトリックスが励起され、埋設した生物分子の励起およびイオン化が生じる。この方法は、イオンに多量の変換エネルギーを与えるが、過剰なフラグメント化は誘発しない傾向がある。この方法でも電場を使用してフラグメント化を制御することができる。MALDI方法は、2つの方法で使用することができる。質量標識DNAがマトリックスに埋設されると、標識自体は、レーザーによって本質的に励起されないか、またはレーザー励起を可能にする必要な基を含有するように標識を構成することができるだろう。後者の方法は、質量分析法を実施する前に標識をマトリックスに埋設する必要がないことを意味する。このような基にはニコチン酸部分、シナピン酸部分またはケイ皮酸部分が含まれる。標識のMALDIによる開裂は、MALDI質量分析法を実施する前に開裂ステップを生じないので、おそらく光開裂可能なリンカーには最も有効であるだろう。種々の励起可能なイオン化剤は異なる励起周波数を有するので、光切断可能なリンカーを開裂するために使用する周波数とは異なる周波数を、イオン化の誘発に選択することができる。これらの励起可能な部分は有機化学において標準的な合成技法を使用して誘導化して、ある範囲の質量を有する種々の標識を得ることができるだろう。この範囲は、組み合わせ法で構築することができるだろう。
高速原子衝撃
高速原子衝突は、比較的不揮発性分子を気化およびイオン化するための種々の方法を記載するようになってきた。これらの方法の本質的な原則は、試料と、加速原子またはイオン、通常キセノン原子またはセシウムイオンとの衝突により試料が表面から脱離される。試料は、MALDIに関しては固相表面に被覆されるが、複雑なマトリックスは必要としない。これらの方法も液相注入系に適合性があり、細管電気泳動注入口または高圧液体クロマトグラフから溶出する液体がフリットを通過し、本質的にはフリットの表面を分析溶液で被覆し、原子衝突によりフリット面からイオン化させることができる。
定量および質量分析法
大抵、多数の生化学アッセイおよび分子生物学アッセイは定量的である。質量分析計は、定量には簡単な装置ではないが、適当な機器を使用することにより、高感度が得られる。質量分析計の検出器に到達するイオンの数は、イオン源での正確な分子数の直接的な測定値ではない。イオン数と最初の生物分子の濃度の関係はイオン化の挙動の複雑な関数となる。質量スペクトルを走査し、走査した各質量/電荷比でイオンを計数することにより定量を実施することができる。計数値を積分して所定の時間にわたるスペクトルの各点の総計数値を得る。これらの計数値を試料中の原料分子の元の定量値と関連させることができる。イオン計数または電流を原料分子の定量値と関連させるための方法はいろいろある。未知の試料を測定する前に試料分子の挙動を測定する外部標準は1つの方法である。使用する機器構造体に供給されるとき、試料分子の連続希釈液のイオン電流を測定することにより、各試料分子の較正曲線を測定することができる。
質量分析装置ジオメトリー
質量分析法は、原理が非常に多様であり、数多くの分析装置構造が存在し、種々のジオメトリーで組み合わせて複雑な有機分子の分析を可能にすることができる。一般的な1段階質量分析装置は、四重極型または飛行時間型機器で、共に本発明に適合性がある。セクター機器も適用可能である。
直交型TOF質量分析計
生物学的に適用するためには、試料の感度および定量性が非常に重要である。
感度がアレイジオメトリーに匹敵する方法は、直交型飛行時間型質量分析計である。このようなジオメトリーにより、イオンビームのサンプリングが非常に高速となり、次に全てのイオン種の瞬間的に近い検出が可能になる。線源、おそらく多くの生物学的適用のためのエレクトロスプレー線源から出るイオン電流はビームに垂直に配置された平坦な電極を通過する。この電極が本質的に電気的なゲートとなる。パルス型電位は、飛行時間型質量分析装置ではイオンビームの一部を「直角に」偏向する。イオンをTOF分析装置に偏向するために電気的なゲートが閉じられたとき、タイマーが誘発される。偏向されたイオンの飛行時間が記録され、これは質量/電荷比を測定するのに十分である。ゲートは一般に短いパルスのイオンを常にTOF分析装置に送るだけである。全てのイオンの到達が記録され、TOF分離は極めて高速なので、質量スペクトル全体が同時に効果的に測定される。さらに、ゲート電極は極めて高い頻度でイオンビームをサンプリングすることができるので、非常に短い時間間隔のうちに多数のスペクトルを蓄積することができる。イオン源の試料濃度が低い場合、またはごく短い時間しか持続しない場合には、これは重要である。直交型のTOFジオメトリーは、非常に感度が高い。
タンデム型質量分析法による質量標識核酸分析
タンデム型質量分析法は、試料のイオンが質量/電荷比に基づいて第1の質量分析装置により選択され、さらに選択されたイオンのフラグメント化の誘発により分析される数多くの方法を記載している。フラグメント化生成物は、第2の質量分析装置によって分析される。タンデム型機器の第1の質量分析装置は、被調査イオンを選択する際のフィルターとして作用する。選択されたイオンは、第1の質量分析装置を出ると、中性ガスを含む衝突室を通過し、一部がフラグメント化する。
イオン源→MS1→衝突セル→MS2→イオン検出装置
質量標識の開裂の誘発
構造研究に使用するためのイオンのフラグメント化を促進するため、およびフラグメント化の「指紋」に基づいて分子を確定的に同定するために、種々の分析法が数年にわたって開発されている。ほとんどのイオン化法は、いくぶんかのフラグメント化を生ずるが、ソフトなイオン化方法は、フラグメントイオンをあまり形成しない。しかし、例えば、化学的イオン化法の変法を使用してフラグメント化を助けることができる。同様に、より多くの試料分子をイオン化するように、または分子イオンのフラグメント化を増加するために、コロナ放電電極を含むフラグメント化を促進するように、エレクトロスプレーイオン化をわずかに改良することができる。
イオントラップ
イオントラップ型質量分析計は、四重極型分析計と同系統である。イオントラップは一般に「ドーナツ型」電極と腔(イオントラップ)を形成する両側の「キャップ型」電極の3つの電極構成物を有する。正弦波無線周波数電位を円筒電極に適用し、同時にキャップ型電極をDCまたはAC電位で偏向する。円筒電極の電場を振動することにより、腔に注入されるイオンを安定な円形軌道に収束させる。しかし、所定の振幅の発振電位では、所与のイオンは不安定な軌道を有し、トラップから排出される。トラップに注入されるイオン試料は、発振無線周波数電位を変更することにより、質量/電荷比により連続的にトラップから排出される。排出されたイオンは、次いで検出され、質量スペクトルの形成を可能にする。
フーリエ変換イオンサイクロトロン共鳴質量分析法(FTICR MS)
イオン試料が腔内に保持されるという点において、FTICR質量分析法はイオントラップと同様の特徴を有するが、FTICR MSでは交差電磁場によりイオンが高真空室(ICRセル)にトラップされる。箱の2つの面を形成する1対の平板電極によって電場が形成される。箱は、磁場内に配置され、2枚の平板(トラップ用平板)と合わせて、入射されたイオンに円形軌道をとらせる。無線周波数パルスを2枚の「送信平板(transmitterplate)」に適用することにより、イオンを動力学的に励起してより大きい円軌道をとらせることができる。「受信平板(receiver plate)」を含む、箱の残りの2つの対向面(平板)の電場に対応してイオンの円形の動きが生じる。励起パルスは動力学的にイオンを励起してより大きい軌道をとらせるが、これは中性ガス分子との衝突によりイオンのコヒーレント運動がなくなると衰える。受信平板によって検出される対応シグナルは、フーリエ変換解析により質量スペクトルに変換される。
質量標識ハイブリダイゼーションプローブ
質量標識の必要な挙動を得るためには、所与の化学的特性が望ましい。これらは、数多くの方法で質量標識に導入することができる特定の分子基または部分で表される。
質量標識ハイブリダイゼーションプローブの構造
質量標識ハイブリダイゼーションプローブは、以下の基本構造を有してもよい。
Nu−M
Nu−L−M
ここで、Nuは、核酸プローブを表し、Lは、核酸プローブを質量標識Mに結合するリンカーを表す。リンカー(L)は、必要に応じたものであり、質量標識は、それに導入される必要なリンカー特徴を有してもよい。開裂可能な質量標識ハイブリダイゼーションプローブが必要でない場合には、リンカーは必要でない。核酸は、ヌクレオチドの直鎖ポリマーであり、中には比較的少数の天然に存在する種もあるが、化学的に合成された類似体の数が増えており、数多くの位置でリンカーと結合することができる。
リンカー
リンカーは、以下の構造的な特徴を有してもよい。
ハンドル1−[開裂可能な基]−ハンドル2
ハンドル1および2は、化学基を表し、リンカーの一方の端を核酸に結合させ、他方の端を質量標識に結合させる。質量標識を結合した核酸プローブから制御して脱離させるためには、ハンドルの間に、またはハンドルの一部として少なくとも1つの開裂可能な基が必要である。
質量標識
質量標識は以下の構造を有してもよい。
ハンドル−質量標識
ここで、ハンドルは質量標識を対応する核酸プローブまたは質量標識と核酸プローブの間のリンカーに結合させる基である。
質量標識の特性
本発明の質量分析技法を使用して最高の性能を得るためには。2000〜3000単位までの質量/電荷比がこのような質量標識には好適である。なぜなら、一方に荷電したイオンを最も高い感度で信頼して検出できる範囲にこれは対応するからである。しかし、どのような質量スペクトルでも質量が低い方の端は溶媒分子、小分子不純物、多重イオン化ピークおよびフラグメント化ピークによって占められる傾向があるので、200〜300ダルトンより小さい質量標識は理想的ではない。さらに、各標識は、炭素、窒素および酸素の同位体ピークと重ならないようにするために隣りから最低約4ダルトン離れているべきである。
核酸プローブからの質量標識のイオン化および分離
DNAおよび他の核酸は、質量分析計内で広範にフラグメント化する傾向がある。得られた質量スペクトル上のDNAフラグメントピークが質量標識から生じるピークを不明瞭にしないことが望ましい。開裂後に核酸プローブフラグメントが質量標識から分離されることが望ましい。この目的のためには、イオン化の結果陰イオンを形成し、陰イオン分析計で分離することができる質量標識を使用することができる。核酸は、陰荷電骨格を持っていても、イオン化の結果、特にエレクトロスプレーおよび関連する液−気相イオン化技法によってプロトン化する傾向を有する。これは、質量分析計が陰イオン分析法のために構成される場合には、陰電荷質量標識だけが質量スペクトル上に出現するはずであることを意味する。ほとんどの核酸フラグメントは、検出器まで到達しない。
質量分析計内でのフラグメント化
フラグメント化は、質量分析計の非常に重要な特徴である。本発明に関しては、質量標識がどのように同定される予定であるかどうかを考慮することが重要である。1つの例では、フラグメント化に対する抵抗性が大きく、質量スペクトル上に標識の分子イオンが出現することにより標識が同定されるように、質量標識を設計することができる。このような場合では、独自の分子イオンを有する標識ファミリーを設計する必要があるだろう。別の例では、特徴の大きいフラグメント化パターンを有する質量標識を、このパターンが質量標識を同定するように設計してもよい。この場合では、重ならないパターンを有する標識ファミリーまたは各標識について少なくとも1つの独自のフラグメント化種を有する標識ファミリーを設計しなければならない。フラグメント化は、最初の分子およびそれからイオンを形成するために使用されるイオン化法の特性である。異なる方法は最初に形成されたイオンに異なる量のエネルギーを与え、イオンの化学的環境はかなり異なる。従って、1つの質量分析法に適当な標識が別の方法では不適当であることがある。好ましい方法は、フラグメント化に抵抗する分子を設計することであるが、フラグメントが必須であるものある。これは、分子イオンまたは容易に形成される1つのフラグメントイオンのどちらであってもよい1つの主要な種を用いて分子を同定する助けをすることを意味する。
質量分析計内での結合の安定性の測定
中性分子では、結合の強さを考慮することによって、分子がフラグメント化に抵抗性であるかどうかを測定することが簡単である。しかし、分子をイオンかする場合、結合強さは予測することが困難である方法で増加または減少する。例えば、非イオン化形態の所定の結合X−Yは
X-Y→X*+Y*および、
∴D(X−Y)=ΔH(X0)+ΔH(Y0)−ΔH(X-Y)
(式中、Dは好適な単位の結合解離エネルギーを示す)。
しかし、イオン化種(この場合は陽イオン)は、
D(X−Y)+=ΔH(X+)+ΔH(Y0)−ΔH(X-Y+)
∴D(X−Y)−D(X−Y)+=ΔH(X0)−ΔH(X+)−ΔH(X−Y)−ΔH(X−Y+)
なぜなら、I(X0)=ΔH(X+)−ΔH(X0)(式中、Iは、イオン化エネルギーである)、
I(X−Y)=ΔH(X−Y+)−ΔH(X−Y)
および、∴D(X−Y)−D(X−Y)+=I(X−Y)−I(X0)
これは、I(X−Y)>I(XO)である場合には、D(X−Y)−D(X−Y)+>Oであるが、同様に、I(X−Y)<I(XO)である場合には、D(X−Y)−D(X−Y)+<Oである。
なぜなら、I(X−Y)およびI(XO)は共に正であり、I(X−Y)<I(XO)である場合には、より強い結合が生じ、I(X−Y)>I(XO)のイオンではより弱い結合が生じる。
I(NH2 *)=11.14電子ボルト(eV)で、I(C6H5NH2)=7.7eVである。
∴I(C6H5NH2)<I(NH2 0)3.44eVだけ。
I(C6H5 0)=9.35eVで、I(C6H5NH2)=7.7eV
∴I(C6H5NH2)<I(C6H5)1.65eVだけ。
I(OH0)=13eVで、I(C6H5OH)=8.47eVであり、
∴I(C6H5OH)<I(OHO)4.53eVだけ。
この結合の別の開裂はI(C6H5 0)=9.35eVで、I(C6H5OH)=8.47eVであり、
∴I(C6H5OH)<I(C6H5 0)0.88eVだけ。
C-O結合の開裂はフェノールの正の分子イオンでは観察されていない。
リンカーの特性
結合した核酸プローブからの核酸標識の制御可能な放出は、種々の方法で実施することができる。
・光開裂
・化学的開裂
・熱開裂
・質量分析計内でのフラグメント化の誘発
光開裂可能なリンカーおよび化学的に開裂可能なリンカーは、記載した用途のために容易に開発することができる。図5は、一連の例示的な光開裂可能なリンカーを示す。
質量分析計内での質量標識の開裂
好ましい開裂方法は、イオン化過程を使用して標識のフラグメント化を誘発する。結合する分子が質量分析計内でイオン化されるとリンカーが開裂するように、リンカーはイオン化過程においてかなり不安定であるように設計することができる。この方法を使用して開裂を制御する際には、考慮すべき2つの要因が存在する。(1)イオン化過程中にどれくらい過剰のエネルギーがイオンに与えられるか、および(2)この過剰量は、イオン中の結合エネルギーのいずれかに勝るほど十分であるかどうか、である。与えられるエネルギーの過剰さは、使用するイオン化法によって主に決定される。与えられたエネルギーが結合の開裂を実施するためには、エネルギーは振動/回転モードで、結合の解離エネルギーに勝るほど十分でなければならない。結合エネルギーは、分析する分子の化学構造によって明らかに決定される。結合エネルギーについては、後に考察する。概略すると、エネルギーは、イオン化過程中に電子エネルギー、振動エネルギー、回転エネルギーおよび変換エネルギーとして与えられる。非常に短時間のイオン化では、この過剰の内部エネルギーのほとんどは、系間および状態間交雑により、振動および回転エネルギーに変換される。内部の振動エネルギーの過剰は、結合を切断してもしなくてもよい。より多くの内部振動エネルギーを移動中のイオンに与えるためには、イオンをバスガスと衝突させてイオンをフラグメント化させることができる。エレクトロスプレー源では、バスガスと気化した溶媒とが存在する。イオンは、電場により加速されて、バスガスとの衝突エネルギーを増す。加速は、イオンに動力学的なエネルギーを与える。十分な動力学エネルギーがイオンに与えられると、バスガスとの衝突によりイオンがフラグメント化するだろう。必要な動力学的エネルギーの量は、イオンの結合の強さに依存するが、与えられるエネルギーの量は、加速電位を調節することにより制御可能である。
核酸プローブ
核酸とのリンカー
質量標識およびそれらのリンカーは数多くの位置において核酸に結合することができる。従来の固相合成では、リボース糖の5’ヒドロキシルは最も容易に誘導体化される。修飾するための他の好ましい位置は、ピリミジンの5’位並びにプリンの7’および8’の塩基である。これらは、開裂可能な質量標識および開裂不可能な質量標識を結合するための好ましい位置であるだろう。
ハイブリダイゼーションプローブ
用途に応じて、ハイブリダイゼーション挙動が変更された数多くの異なる類似物を有する、修飾核酸を使用することが望まれている。ハイブリダイゼーションプローブの基を同時に使用する場合には、これは特に重要である。正しくハイブリダイゼーションしたプローブの融点が閾値に非常に近いまたは少なくとも閾値を上回るように、プローブの基のハイブリダイゼーション挙動を変更することが望ましいこともある。好ましくは、正しくなくハイブリダイゼーションしたプローブの融点は、この閾値より低い。これにより、ハイブリダイゼーション反応のストリンジェンシーを確実にしながら、プローブ群を同時に使用することが可能になる。
塩基修飾
標準的なワトソン−クリック塩基に数多くの修飾を実施することができる。以下は塩基対形成エネルギーをある程度正常化することができる修飾の例であるが、それらは限定的なものではない。
・アデニン類似物(アナログ)、2,6−ジアミノプリン2つではなく3つの水素結合をチミンと形成するので、より安定な塩基対を形成する。
・チミン類似物(アナログ)、5−プロピニルデオキシウリジンはアデニンとより安定な塩基対を形成する。
・グアニン類似物(アナログ)、ハイポキサインチンはシトシンと3つではなく2つの水素結合を形成するので、安定性の低い塩基対を形成する。
骨格修飾
ヌクレオチドは、リン酸塩部分が容易に修飾される。低塩濃度などの所与の条件下において、メチルホスホネート、トリエステルおよびホスホルアミデートなどの類似物は2重らせんの安定性を増すことが示されている。このような修飾もヌクレアーゼ抵抗性を増している。さらに、リン酸塩修飾には、ホスホジチレートおよびボラノホスフェートが含まれるが、その各々は、エキソヌクレアーゼに対するオリゴヌクレオチドの安定性を増す。
糖修飾
糖部分の2’位の種々の修飾を実施することができる(参照文献20および21を参照のこと)。糖は、ヘキソースなどの異なる糖で置換することができるし、または糖リン酸骨格全体をペプチド核酸(PNA)におけるものなどの新規な構造で全体を置換することができる。考察は、文献22を参照のこと。PNAは、これまでに発見された類似体の中で熱安定性の最も大きい任意の2重らせんを形成する。
疎水性修飾
オリゴヌクレオチドの3’および5’末端に疎水性基を導入することも、塩基から水を排除することにより、複合物の「相互作用」を低下することによって2重らせんの安定性を増す。すなわち、疎水性基は、末端塩基の溶媒和を減少する。
人工的なミスマッチ
ハイブリダイゼーション反応の誤りの1つの主要な原因は、標的配列および未知の塩基とのプライマーのハイブリダイゼーションのストリンジェンシーである。標的のために設計されたプライマーが1つの人工的に導入されたミスマッチを有する場合、系の識別はずっと高くなる(文献23参照)。完全に相補的なプライマーが使用される場合、追加のミスマッチは、1つのミスマッチと同じ程度には許容できない。一般に、1つのミスマッチを有する2重らせんと、2つのミスマッチを有する2重らせんとの融点の差は、正しくハイブリダイゼーションした2重らせんと、1つのミスマッチを有する2重らせんとの差よりも大きいことが見出されている。従って、これは本願に開示されるハイブリダイゼーションプローブの重要な特徴であると期待されるだろう。核酸プローブが重要な塩基を有する場合には、すなわち1ヌクレオチド多形を検出するためには、プローブ部位に第2のミスマッチが存在する場合には、重要な塩基から1らせん回転離れて導入された人工的なミスマッチは2重らせんをかなり不安定にする。
ハイブリダイゼーションプロトコール
ハイブリダイゼーション条件に対する影響の詳細、特に核酸プローブに対する緩衝液および温度の影響は、文献24〜26に見出すことができる。
オリゴヌクレオチドの合成
オリゴヌクレオチドを合成する方法は、当技術分野上周知である(文献27および28参照)。
質量標識の合成
実際上または商業上有用な系では、できるだけ少量の試薬およびできるだけ少ない処理段階を使用して、標識の構築ができるだけ簡単であることが重要である。一連のモノマー分子単位を利用して互いに多数の組み合わせに使用する組み合わせ方法が、理想的であると思われる。
アミノ酸
グリシン、アラニンおよびロイシンなどの少数のアミノ酸を用いて、当技術分野上周知の標準的なペプチド合成法を使用して、質量が異なる小ペプチドを多数合成することができる。より多くのアミノ酸を用いればより多くの標識を合成できる。天然のアミノ酸に限定する必要はない。どちらのキラル体も許容可能であり、天然ではない異なる側鎖も許容可能である。(文献31参照)
材料
BSA(2−スルホ安息香酸環状酸無水物)−100mg、0.54mmolベンジルアルコール−2ml炭酸ナトリウム−1.1当量、63mg。
方法
炭酸塩とBSAとを一緒に溶解し、ベンジルアルコールを添加する。加温して反応を開始する(CO2放出)。発泡が止むまで攪拌する。ろ過し、ジエチルエーテルを添加して生成物を沈殿させる。10分間攪拌して、生成物をろ別する。生成物は白色固体である。この分子はAG/1/75と呼ぶ。(図11参照)。
質量分析法:陰イオンモード
以前に合成した分子AG/1/75の陰イオン質量スペクトルを図11に示す。このスペクトルは10ng/μlの濃度で存在する分子により形成された。溶媒はメタノールと水(比1:1)であった。スペクトルは走査型四重極質量分析計にエレクトロスプレー導入システムを連結したものを用いて作成した。挿入図はm/z291ダルトンの1電荷陰イオンである、AG/1/75分子のアニオン[M-Na]-に相当する質量ピークを示す。疑分子イオンピークから約3ダルトン大きい側の同位体ピークが重要であることに注意すること。
以下は、一連のチミジンヌクレオチドのアリールエーテルのプロトコールである。これらの化合物の構造を図24および図25に示す。
FT9(図24参照)
5’−O−(4,4’−ジメトキシトリチル)−3’−スクシノイルチミジン(161mg、0.25mmol)のジクロロメタン(4mL)溶液をN−メチルモルホリン(27μL、0.25mmol)および2−クロロ−4,6−ジメトキシトリアジン(44mg、0.25mmol)で処理し、全体を室温で1時間攪拌した。次いで、4−フェノキシフェノール(51mg、0.27mmol)を添加して、5日間攪拌した。反応混合物をジクロロメタンで希釈して、クエン酸水溶液(10%w/v)で洗浄し、水で2回洗浄した。有機相を乾燥し(Na2SO4)、溶媒を減圧下で除去した。溶出液として1%トリエチルアミンを含有する酢酸エチル/n−ヘキサン(2:1)を使用したフラッシュクロマトグラフィーで残渣を精製し、86mg(収率42%)のFT9を無色の泡状物として得た。1HNMR(CDCl3):δ1.39(3H,m);2.46(2H,m);2.75(2H,m);2.86(2H,m);3.48(2H,m);3,78(6H,s);4.14(1H,m);5.52(1H,m);6.44(1H,m);6.75−7.45(22H,m);7.60(1H,d)−MS(FAB),m/z812(M+). C47H44N2O11の計算値:C69.44;H5.46;N3.46%測定値:C69.66;H5.53;N3.24%.
FT17(図24参照)
5’−O−(tert−ブチルジメチルシリル)−3’−スクシノイルチミジン(288mg、0.5mmol)のジクロロメタン(3mL)溶液を3滴のピリジンで処理し、次いで塩化オキサリル(2M;0.3mL、0.6mmol)のジクロロメタン溶液を滴下した。反応混合物を室温で90分間攪拌した。このように形成した酸塩化物の溶液を4−フェノキシフェノール(110mg、0.59mmol)とピリジン(0.3mL)のジクロロメタン(3mL)溶液の氷冷液に滴下した。30分後、4−フェノキシフェノール(35mg、0.19mmol)のジクロロメタン(0.7mL)溶液の一部をさらに添加し、4時間攪拌した。反応混合物をジクロロメタンで希釈して、NaHCO3(5%w/v)水溶液で洗浄し、水で2回洗浄した。有機相を乾燥し(Na2SO4)、溶媒を減圧下で除去した。溶出液として酢酸エチル/n−ヘキサン(1:1)を使用したフラッシュクロマトグラフィーで残渣を精製し、145mg(収率47%)のFT17を無色の泡状物として得た。1HNMR(CDCl3):δ0.12(6H);0.92(9H);1.92(3H,s);2.12(1H,m);2.40(1H,m);2.77(2H,m);2.89(2H);3.90(2H,d);4.11(1H,d);5.30(1H,d);6.36(1H,dd)7.00−7.27(9H,m);7.54(1H,d);8.28(1H,br s).MS(FAB)m/z625[M+H]+. C32H40N2O9Siの計算値:C61.52;H6.45;N4.48%,測定値:C61.60;H
6.45;N4.45.
FT18/1(図25参照)
4−フェノキシフェニルグルタレート(180mg、0.6mmol)のジクロロメタン(3mL)溶液を3滴のピリジンで処理し、次いで塩化オキサリル(2M;0.35mL、0.7mmol)のジクロロメタン溶液を滴下した。反応混合物を室温で90分間攪拌した。このように形成した酸塩化物の溶液を5’−O−(tert−ブチルジメチルシリル)−3’−スクシノイルチミジン(288mg、0.5mmol)とピリジン(0.3mL)のジクロロメタン(3mL)溶液の氷冷液に滴下した。室温で5時間攪拌した。反応混合物をジクロロメタンで希釈して、NaHCO3(5%w/v)水溶液で洗浄し、水で2回洗浄した。有機相を乾燥し(Na2SO4)、溶媒を減圧下で除去した。溶出液として酢酸エチル/n−ヘキサン(1:1)を使用したフラッシュクロマトグラフィーで残渣を精製し、111mg(収率35%)のFT18/1を無色の油状物として得た。1HNMR(CDCl3):δ0.12(6H);0.92(9H,s);1.92(3H,s);2.02−2.30(3H,m);2.35−2.75(5H,m);3.92(2H,d);4.10(1H,d);5.29(1H,d);6.36(1H,dd);6.97−7.37(9H,m);7.54(1H,d);8.65(1H,br s).MS(FAB),M/z639[M+H]+. C33H42N2O9Siの計算値(H2O:C60.35;H6.75;N4.26%;,測定値:C60.57;H6.60;N4.18%.
F23(図25参照)
5’−O−(tert−ブチルジメチルシリル)−3’−スクシノイルチミジン(288mg、0.5mmol)のジクロロメタン(3mL)溶液を3滴のピリジンで処理し、次いで塩化オキサリル(2M;0.3mL、0.6mmol)のジクロロメタン溶液を滴下した。反応混合物を室温で90分間攪拌した。このように形成した酸塩化物の溶液を(4’−フェノキシ)−4−フェノキシベンジルアルコール(146mg、0.5mmol)とピリジン(0.3mL)のジクロロメタン(3mL)溶液の氷冷液に滴下した。室温で4時間攪拌した。反応混合物を酢酸エチルで希釈して、NaHCO3(5%w/v)水溶液で洗浄し、水で2回洗浄した。有機相を乾燥し(Na2SO4)、溶媒を減圧下で除去した。溶出液として酢酸エチル/n−ヘキサン(1:1)を使用したフラッシュクロマトグラフィーで残渣を精製し、73mg(収率20%)のFT23を得た。1HNMR(CDCl3):δ0.13(6H,s);0.92(9H,s);1.92(3H,s);2.11(1H,m);2.39(1H,m);2.68(4H,s);3.90(2H,d);4.06(1H,d);5.11(2H,s);5.27(1H,d);6.34(1H,m);6.95−7.37(13H,m);7.35(1H,d);8.27(1H,br s).MS(FAB),M/z713[M+H]+. C39H49N2O10Siの計算値:
C64.08;H6.34;N3.85%−,測定値:C64.32;H6.38;N3.79%.
質量標識塩基FT23の質量分析法
オリゴヌクレオチドバックグラウンドの存在下および非存在下において質量標識塩基の挙動モデルとしてFT23について質量分析法による検討を実施した。
これらの検討の結果を図20〜23に示す。各図は、プラットホーム−LC四重極走査型質量分析計(マイクロマス(Micromass)、英国)にエレクトロスプレーイオン源と45Vのコーン電圧を使用することによって作成した質量スペクトルを示す。各場合において、FT23は4pmol/μlの濃度で存在した。図20は、陰イオンモードの質量スペクトルを示し、729.3の突出ピークは[M-H]-に相当する。図21は、陽イオンモードの対応する質量スペクトルを示す。数多くの突出ピークが見られる。
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図の要点
図1の要点
ステップ1:例えば、ビオチン化ポリ−Tプライマーを使用して、固相支持体に固定したcDNAを形成する。
図2aの要点
ステップ1:アビジン標識ビーズに結合したビオチン標識ポリ−Tを有するマトリックスを通過させる。
図2bの要点
ステップ6:「試料作成酵素」を添加する。
図3aの要点
ステップ1:アビジン標識ビーズに結合したビオチン標識ポリ−Tを有するマトリックスを通過させる。
図3bの要点
ステップ6:「試料作成酵素」を添加する。
図4の要点
A イオン源
B イオン電流
C 電気的ゲート
D 反射物
E 検出器
(1)、(2)好ましい光開裂可能なリンカー
図8の要点
(1)〜(3)好ましい質量標識構造であり、ここでn≧0である。
(4)質量標識を有する質量欠損であり、ここでn≧0およびm≧0であり、xは、好ましくはFまたはHである。
図9の要点
(1)好ましい末端の変化すなわち質量シリーズ修飾基。
(2)好ましい内部の変化すなわち質量シリーズ修飾基であり、ここでn≧0であり、Rは、任意の基であってもよい。質量シリーズ修飾基のためには、R基は、好ましくはイオン化またはフラグメント化すべきではない。イオン化基は別の図に示す。
図10の要点
(1)陰イオンモード基
(2)陽イオンモード基
図11の要点
説明:試料AG/1/75、10ng/μL、1:1 MeOH:水,CV=45VLIVER01 1(0.997)Sm(SG,2x0.60),スキャンES-1.79e8ここで、AG/1/75はである。
説明:AG/1/75、5x10-7M20ul/分 MeOH/H2O 1:1溶液で注入LPOOL3 13(0.496)Cm(9:13),
スキャンES+1.89e6
図13の要点
説明:AG/1/75,10ng/AL,1:1 MeOH-水,CV=75V LIVER02 1(0.998)Sm(SG,2x0.60),スキャンES-4,37e7ここで、AG/1/75は、である。
説明:DNA 1:5D MeOH:H2O+0.2%FORMIC 45V+/-SWITCHING
(1):LPOOL5 9(0.628)Cm(2:13),1:スキャンES-4.56e3
(2):LPOOL5 3(0.243)Cm(3:10),2:スキャンES+1.13e5
図15の要点
説明:DNA 1:5D MeOH:H2O+0.2%アンモニア45V+/-SWITCHING
(1):LPOOL6 11(0.761)Cm(4:12),I:Scan ES-1.37e4
(2)LPOOL6 10(0.726)Cm(2:11),2:スキャンES+8.13e4
図16の要点
説明:DNA+AG/1/75+0.2%FORMIC LOOPINJ+/-ES
(1):LPOOL9 14(0.800)CM(11:18),2:スキャンES+1.04e6
(2):LPOOL914(0.771)Cm(12:18),1:スキャンES-4.20e3
図17の要点
説明:DNA+AG/1/75+0.2%FORMIC LOOP INJ+/-ES
(1):LPOOL10 13(0.747)Cm(11:17),2:スキャンES+1.86e6
(2):LPOOL10 11(0.608)Cm(11:17),1:スキャンES-3.23e3
図18の要点
説明:DNA+AG/1/75+0.20-.FORMIC LOOP INJ+I-ES
(1):LPOOL9 14(0.800)Cm(13:15-(22:29+4:7)),2:スキャンES+1.02e6,(バックグラウンドを差し引く)
(2):LPOOL9 16(0.881)Cm(16:19-(23:29+9:13)),1:スキャンES-2.70e3,(バックグラウンドを差し引く)
図19の要点
説明:DNA+AG/1/75+0.2%AMMONIA LOOP INJ+/-ES
(1):LPOOLIO 13(0.747)Cm(13:14-(6:8+22:25)),2:スキャンES+2.93e6,(バックグラウンドを差し引く)
(2):LPOOL10 11(0.608)Cm(11:16-(8+26)),1:スキャンES-1.03e3,(バックグラウンドを差し引く)
図20の要点
説明:FT23(単独)(-veion)4pmol/ul,LPOOL2 3(0.266)Cm(2:24),2:スキャンES-7.35e5
図21の要点
説明:FT23(単独)(+ve ion)4pmol/ul,LPOOL2 5(0.381)Cm(2:24),I:スキャンES+3.G8e6
図22の要点
説明:F23/OLIGO(-ve ion)4pmol/ul,LPOOL1 18(1.405)Cm(3:25),(オリゴヌクレオチド分子量=3,000),2.スキャンES-3.2leS
図23の要点
説明F23/OLIGO(+ve ion)4pmol/ul,LPOOL1 11(0.830)Cm(4:26),(オリゴヌクレオチド分子量=3,000),1:スキャンES+2.03e6
Claims (52)
- ハイブリダイゼーションプローブアレイであって、その各々が所定の鎖長の既知の塩基配列に結合された質量標識を有し、アレイの各々の質量標識が質量分析法によりその塩基配列と関連づけることが可能であり、各々の質量標識が光励起基を有する、ハイブリダイゼーションプローブアレイ。
- 各質量標識が、アレイの全ての他の質量標識に対して一義的に識別可能である、請求項1に記載のアレイ。
- 塩基配列の所定の鎖長が2〜25である、請求項1または請求項2に記載のアレイ。
- 各質量標識がそのそれぞれの既知の塩基配列に開裂可能であるように結合され、そのそれぞれの既知の塩基配列から放出されたとき、質量分析法によりその塩基配列と関連づけることが可能である、請求項1乃至3のいずれか1項に記載のアレイ。
- 各質量標識が、衝突開裂可能な結合、光開裂可能な結合、化学的に開裂可能な結合または熱的に開裂可能な結合によって既知の塩基配列に開裂可能であるように結合される、請求項4に記載のアレイ。
- 各質量標識が、質量分析計内にあるとき開裂する結合によって既知の塩基配列に開裂可能であるように結合される、請求項4または請求項5に記載のアレイ。
- 各質量標識がイオン化条件下において負に荷電される、請求項4乃至6のいずれか1項に記載のアレイ。
- 既知の塩基配列が、認識部位から所定分ずれた位置を切断する制限エンドヌクレアーゼの認識部位を有するアダプターオリゴヌクレオチドの突出末端を有する、請求項1から7のいずれか1項に記載のアレイ。
- 既知の塩基配列が複数の同一の質量標識に結合される、請求項1から8のいずれか1項に記載のアレイ。
- 前記光励起基が励起可能なイオン化剤であり、マトリックス支援型レーザー脱離イオン化を行うのに好適である、請求項1から9のいずれか1項に記載のアレイ。
- 前記光励起基がニコチン酸、シナピン酸またはケイ皮酸から選択される、請求項1から10のいずれか1項に記載のアレイ。
- 質量標識の質量分析法によりプローブのハイブリダイゼーションを測定する方法における、請求項1から11のいずれか1項に記載のハイブリダイゼーションプローブアレイの使用。
- 質量標識の質量分析法によりプローブのハイブリダイゼーションを測定する方法における、所定の鎖長の既知の塩基配列に結合された質量標識を有するハイブリダイゼーションプローブの使用であって、前記質量標識が光励起基を有する使用。
- 塩基配列の所定の鎖長が2〜25である、請求項13に記載の使用。
- 質量標識が既知の塩基配列に開裂可能であるように結合される、請求項13または請求項14に記載の使用。
- 質量標識が衝突開裂可能な結合、光開裂可能な結合、化学的に開裂可能な結合または熱的に開裂可能な結合によって既知の塩基配列に開裂可能であるように結合される、請求項15に記載の使用。
- 質量標識が、質量分析計内にあるとき開裂する結合によって既知の塩基配列に開裂可能であるように結合される、請求項15または請求項16に記載の使用。
- 質量標識がイオン化条件下において負に荷電される、請求項15乃至17のいずれか1項に記載の使用。
- 質量標識が質量分析計内において既知の塩基配列から分離可能である、請求項15乃至18のいずれか1項に記載の使用。
- 既知の塩基配列が、認識部位から所定分ずれた位置を切断する制限エンドヌクレアーゼの認識部位を有するアダプターオリゴヌクレオチドの突出末端を有する、請求項13乃至19のいずれか1項に記載の使用。
- ポリメラーゼ連鎖反応またはリガーゼ連鎖反応中にプローブのハイブリダイゼーションを測定するための、請求項13乃至20のいずれか1項に記載の使用。
- 既知の塩基配列が複数の同一の質量標識に結合される、請求項13乃至21のいずれか1項に記載の使用。
- 前記光励起基が励起可能なイオン化剤であり、マトリックス支援型レーザー脱離イオン化を行うのに好適である、請求項13乃至22のいずれか1つに記載の使用。
- 前記光励起基がニコチン酸、シナピン酸またはケイ皮酸から選択される、請求項13乃至23のいずれか1つに記載の使用。
- 本発明の方法が専らオンラインで実施される、請求項12乃至24のいずれか1項に記載の使用。
- プローブアレイと標的核酸とのハイブリダイゼーションを測定するための方法であって、(a)プローブを標的核酸にハイブリダイゼーションさせる条件下において、 標的核酸と、アレイの各々のハイブリダイゼーションプローブとを接触させるステップであって各プローブが所定の鎖長の既知の塩基配列に結合された質量標識を有し、各質量標識は光励起基を有するステップと、(b)質量分析法によりハイブリダイゼーションしたプローブを同定するステップと、を含む方法。
- 各質量標識がそのそれぞれの既知の塩基配列に開裂可能であるように結合され、ハイブリダイゼーションした各プローブが開裂されて質量標識を放出し、放出された標識が質量分析計を使用して同定される、請求項26に記載の方法。
- プローブと標的核酸とのハイブリダイゼーションを測定するための方法であって、(a)プローブを標的核酸にハイブリダイゼーションさせる条件下において、 標的核酸と、所定の鎖長の既知の塩基配列に結合された質量標識を有し、質量標識は光励起基を有する、ハイブリダイゼーションプローブとを接触させるステップと、(b)質量分析法によりハイブリダイゼーションしたプローブを同定するステップと、を含む方法。
- 質量標識が、そのそれぞれの既知の塩基配列に開裂可能であるように結合され、ハイブリダイゼーションしたプローブが開裂されて質量標識を放出し、放出された標識が質量分析計を使用して同定される、請求項28に記載の方法。
- 1つの試料または各試料が、マトリックス支援型レーザー脱離イオン化質量分析によって分析される、請求項26乃至29のいずれか1項に記載の方法。
- 塩基配列の所定の鎖長が2〜25である、請求項26乃至30のいずれか1項に記載の方法。
- 1つまたは各質量標識が、衝突開裂可能な結合、光開裂可能な結合、化学的に開裂可能な結合または熱的に開裂可能な結合によって既知の塩基配列に開裂可能であるように結合される、請求項26乃至31のいずれか1項に記載の方法。
- 結合が、質量分析計中で開裂される、請求項27または請求項29乃至32のいずれか1項に記載の方法。
- 結合の開裂が、レーザー光開裂によって誘発される、請求項33に記載の方法。
- 結合の開裂が、衝突によって誘発される、請求項33に記載の方法。
- 各質量標識がイオン化条件下において負に荷電される、請求項27または請求項29乃至35のいずれか1項に記載の方法。
- 質量標識および既知の塩基配列が、質量分析計内に導入される前に分離しない、請求項27または請求項29乃至36のいずれか1項に記載の方法。
- 既知の塩基配列が、認識部位から所定分ずれた位置を切断する制限エンドヌクレアーゼの認識部位を有するアダプターオリゴヌクレオチドの突出末端を有する、請求項26乃至37のいずれか1項に記載の方法。
- 既知の塩基配列が複数の同一の質量標識に結合される、請求項26乃至38のいずれか1項に記載の方法。
- 前記光励起基が励起可能なイオン化剤であり、マトリックス支援型レーザー脱離イオン化を行うのに好適である、請求項26乃至39のいずれか1項に記載の方法。
- 前記光励起基がニコチン酸、シナピン酸またはケイ皮酸から選択される、請求項26乃至40のいずれか1項に記載の方法。
- オンラインで実施される、請求項26乃至41のいずれか1項に記載の方法。
- オリゴヌクレオチドチップを読みとるための、請求項1乃至11のいずれか1項に記載のアレイの使用。
- オリゴヌクレオチド結合試薬を同定するための競合的結合アッセイにおける、請求項1乃至11のいずれか1項に記載のアレイの使用。
- 所定の配列のプローブに対するポリメラーゼ連鎖反応またはリガーゼ連鎖反応における請求項1乃至11のいずれか1項に記載のアレイの使用。
- cDNAを特徴づけるための方法であって、
(a)1種以上のcDNA集団を有する試料を制限エンドヌクレアーゼで切断し、cDNAの一方の末端を形成する断片であってその制限部位がcDNAの末端に近接する基準部位にある断片を単離するステップと、
(b)単離された断片を第1の試料作成エンドヌクレアーゼで基準部位から既知の距離ずれた位置にある第1の試料作成部位で切断して、第1および第2の小断片を形成するステップであって、第1および第2の小断片の各々が所定の鎖長の突出末端配列と未知の配列とを有し、第1の小断片がcDNAの末端を有するステップと、
(c)第1または第2の小断片のどちらかをそれらの突出末端配列により小集団に分類し、各小集団の突出末端配列を第1の突出末端と記録するステップと、
(d)各小集団の小断片を、第1の試料作成エンドヌクレアーゼと同じまたは異なる第2の試料作成エンドヌクレアーゼで第1の試料作成部位から既知の距離ずれた位置にある第2の試料作成部位で切断して、所定の鎖長の第2の突出末端配列と未知の配列とを有するさらに小断片を各小断片から形成するステップと、
(e)第2の各突出末端配列を決定するステップとを含み、
各小断片の第1および第2の突出末端配列を合わせた鎖長が6〜10であり、基準部位ならびに第1および第2の突出末端の配列および相対位置が1つまたは各cDNAを特徴づけ、第1の試料作成エンドヌクレアーゼが第1の認識部位に結合して制限エンドヌクレアーゼの制限部位から所定分ずれた位置にある第1の試料作成部位で切断し、第1および/または第2の認識部位が請求項8に記載のアレイから第1および/または第2のアダプターオリゴヌクレオチドに提供されて、単離された断片の制限部位にハイブリダイゼーションされる方法。 - 核酸を配列決定するための方法であって、
(a)各断片が独自の量で存在し、一方の末端に所定の鎖長の突出末端配列と未知の配列とを形成する核酸断片を有する標的核酸集団を入手するステップと、
(b)各断片の他方の末端を保護するステップと、
(c)(i)リガーゼが存在するハイブリダイゼーション条件下において、断片と、塩基配列が突出末端配列と同じ所定の鎖長を有し、その所定の鎖長の全ての可能な塩基配列を有する請求項8に記載のアレイとを接触させ、任意のライゲーションされたアダプターオリゴヌクレオチドを取り出し、質量標識を放出させて質量分析計により放出された質量標識を同定することによって任意のライゲーションされたアダプターオリゴヌクレオチドの量を記録するステップと、
(ii)ライゲーションされたアダプターオリゴヌクレオチドと、認識部位に結合し、断片を切断して、以前の突出末端配列と隣接または重複する新たな突出末端配列を露出させる塩基配列決定酵素とを接触させるステップと、
(iii)十分な回数ステップ(i)および(ii)を繰り返し実施し、各突出末端配列について記録された量を比較することにより断片の配列を決定するステップと
により断片の各々を塩基配列決定するステップと
を含む方法。 - ハイブリダイゼーションプローブアレイであって、その各々が所定の鎖長の既知の塩基配列に結合された質量標識を有し、アレイの各々の質量標識を既知の塩基配列と共に質量分析法によりその塩基配列と関連づけることが可能であり、各々の質量標識が光励起基を有する、ハイブリダイゼーションプローブアレイ。
- 質量標識を、質量標識のそれぞれの既知の塩基配列と共に質量分析することによりプローブのハイブリダイゼーションを測定する方法における、請求項1から11のいずれか1項に記載のハイブリダイゼーションプローブアレイの使用。
- 質量標識を既知の塩基配列と共に質量分析することによりプローブのハイブリダイゼーションを測定する方法における、所定の鎖長の既知の塩基配列に結合された質量標識を有するハイブリダイゼーションプローブの使用であって、前記質量標識が光励起基を有する使用。
- プローブアレイと標的核酸とのハイブリダイゼーションを測定するための方法であって、(a)プローブを標的核酸にハイブリダイゼーションさせる条件下において、 標的核酸と、アレイの各々のハイブリダイゼーションプローブとを接触させるステップであって各プローブが所定の鎖長の既知の塩基配列に結合された質量標識を有し、各質量標識は光励起基を有するステップと、ハイブリダイゼーションしていない材料を除去するステップと、(b)質量分析法によりハイブリダイゼーションしたプローブを同定するステップと、を含む方法。
- プローブと標的核酸とのハイブリダイゼーションを測定するための方法であって、(a)プローブを標的核酸にハイブリダイゼーションさせる条件下において、 標的核酸と、所定の鎖長の既知の塩基配列に結合された質量標識を有し、質量標識は光励起基を有する、ハイブリダイゼーションプローブとを接触させるステップと、ハイブリダイゼーションしていない材料を除去するステップと、(b)質量分析法によりハイブリダイゼーションしたプローブを同定するステップと、を含む方法。
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