JP2006153499A - 癌の骨転移のリスクの予測方法 - Google Patents
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Abstract
【解決手段】 被検動物における癌の骨転移のリスクを予測する方法であって、被検動物から得た生物学的試料におけるγ−グルタミルトランスペプチダーゼ(γ−GTP)レベルを測定し、このγ−GTPレベルが、癌の骨転移のある動物の生物学的試料におけるγ−GTPレベルを参照して予め設定された閾値よりも高い場合に、癌の骨転移のリスクが高いと予測することを特徴とする方法が提供される。
【選択図】 図2
Description
本発明は、γ−グルタミルトランスペプチダーゼ(γ−GTP)を指標とする、癌の骨転移のリスクを予測する方法に関する。
近年、生活習慣の欧米化に伴い、日本においても乳癌および前立腺癌などが急激に増加している。これらの癌は、肺癌などと同様に、骨への転移の頻度が極めて高い。そして、骨転移は、癌患者における病状および死亡率を左右する要因となっている。
したがって、本発明は、癌の骨転移リスクの予測方法およびその診断用キットの提供を目的としている。
γ−GTPレベルの測定法としては、γ−GTPレベルを測定するという目的が達成できればいづれの方法でもよく、例えば、生物学的試料におけるγ−GTPレベルを直接的に、またはγ−GTPの酵素活性などを利用して間接的に測定する方法、癌細胞などの生物学的試料から発現されるγ−GTPをセカンドメッセンジャーなどを介して間接的に測定する方法などが挙げられ、より具体的には、γ−GTPに対する特異的抗体を用いた免疫学的測定法(酵素免疫測定法(EIA)、放射性免疫測定法(RIA)、蛍光免疫測定法(FIA)、エライザ法(ELISA)、ウェスタン・ブロッティング法、免疫組織化学染色法など)、高速液体クロマトグラフィー(HPLC)定量法、生物学的試料におけるγ−GTPの酵素活性を測定する方法(酵素法)、ノーザン・ブロッティング法、またはRT−PCRなどが挙げられる。したがって、本発明の好ましい態様によれば、γ−GTPの測定は、EIA、RIA、FIA、ELISA、免疫組織化学染色法、HPLC定量法、酵素法、ウェスタン・ブロッティング法、ノーザン・ブロッティング法、またはRT−PCRにより行われる。これらの方法により、γ−GTPレベルを定性的および/または定量的に測定することができる。また、生物学的試料が尿である場合、γ−GTPレベルは必要であれば尿中クレアチニン値による補正を行う。また、これらの方法において、γ−GTPの測定に通常用いられる自動分析装置を用いれば、短時間でも大量の検体の処理が可能となる。
また、本発明における被検動物は、好ましくは非ヒト動物またはヒトであり、より好ましくは非ヒト哺乳動物またはヒトである。
また、本発明の別の態様によれば、γ−GTPの癌の骨転移マーカーとしての使用が提供される。
このようなγ−GTP測定用試薬としては、例えば、免疫学的測定方法に用いる抗γ−GTP抗体またはγ−GTP活性測定用基質などが挙げられる。したがって、本発明の好ましい態様によれば、γ−GTP測定用試薬は抗γ−GTP抗体またはγ−GTP活性測定用基質である。
乳癌患者36人を対象に尿中γ−GTPレベル(IU/g Cr)を同意のもとに測定した。この測定は AU5232型自動分析装置(Olympus社製)を用いて酵素法により行った。ここで、尿中γ−GTPレベル(IU/g Cr)は、尿中に排泄されるクレアチニン1g当たりのγ−GTP排泄量として表示した。また、対照の骨吸収マーカーとして尿中のI型コラーゲンN末端テロペプチド断片(NTx)を測定した。この測定は、ELISA法により行った(測定試薬:Osteomark(登録商標)、OSTEX社製)。そして、NTx値(nmoL BCE(Bone Collargen Equivalents)/mmoL Cr)もまた、クレアチニン補正値として表示した。また、患者における癌の骨転移の有無はシンチグラフィーによって診断し、CTまたはMRIにて確認した。なお、尿サンプルは測定まで室温にて保存した。
骨転移のある乳癌患者における、尿中γ−GTPレベルおよび尿中NTxレベルの相関は図1に示される通りであり、正の相関(R2=0.1675)を示した。
また、乳癌患者において、骨転移のある患者および骨転移のない患者の尿中γ−GTPレベルは図2に示される通りであった。尿中γ−GTPレベルの測定値(平均値±標準偏差)は、骨転移のある患者では52.5±18.9(IU/g Cr)であり、骨転移のない患者では37.1±6.9(IU/g Cr)であった。
また、乳癌患者において、骨転移のある患者および骨転移のない患者の尿中NTxレベルは図3に示される通りであった。尿中NTxレベルの測定値(平均値±標準偏差)は、骨転移のある患者では138.3±115.6(IU/g Cr)であり、骨転移のない患者では49.9±4.9(IU/g Cr)であった。
また、乳癌患者における尿中γ−GTPレベルおよび癌の骨転移の有無に関するROC分析を行った。骨転移を有する場合を陽性とした場合、感度および特異度から得られた尿中γ−GTPのカットオフ値は40〜50(IU/g Cr)程度であった。
(1)γ−GTPcDNAの単離
Mus musculus γ-GTP (NCBI U30509) のN末端にkozac配列を配置し、更にその両端にMfe1 siteを配置したプライマーを設計した。各プライマーの塩基配列を次に示す。
Mfe1-GGT 5’ : 5’-ccgcaattgccaccatgaagaataggtttatgg-3’(配列番号:1)
Mfe1-GGT 3’ : 5’-ggcggggaacctgctggctactgacaattg-3’(配列番号:2)
C57BL6/crslcマウス(8週齢、オス)の両側腎臓を採取し、Trizol Reagent (商標)(Invitrogen)を用いて total RNAを抽出した。このtotal RNAからRT−PCRにより約1.7kbpのγ-GTP cDNAフラグメント(配列番号3に記載のCDSの161−1867に相当)を得た。
CMV-IE enhancer + chicken β-actin promoterの下流にEcoR1 site + rabbit β-globin polyAが配置されているプラスミドベクターを常法に従って構築した。次に、このベクターをEcoR1にて切断し、(1)にて得られたγ−GTP cDNAフラグメントを挿入し、得られたベクターを以下の骨転移能評価に用いた。
ヒト乳癌細胞株MDA−MB−231細胞に、(2)にて得られたγ−GTP cDNAフラグメントを挿入したベクターをリポフェクション法にてトランスフェクトし、この細胞をヌードマウス (Balb/c nu/nu、8週齢、10匹、メス、日本エスエルシー社製)の心臓に移植し、4週間経過後、骨転移を評価した。対照としては、空のベクターをトランスフェクトした細胞を用いた。癌の骨転移は大腿骨および脛骨の軟線レントゲン撮影にて確認した。
結果は、図4に示される通りであった。γ−GTP cDNAを遺伝子導入した細胞を移植したマウスでは癌の骨転移巣がより多く形成されていた(検定法: Unpaired student t-test)。
実施例2において用いたγ−GTPを遺伝子導入した細胞またはコントロール細胞を、ヌードマウスの皮下に移植し、4週間経過後、これらの細胞の細胞重量を比較した。
結果は図5に示される通りであった。両者の細胞重量に有意差はなく、腫瘍の発育についてγ−GTPの影響は認められなかった(検定法: Unpaired student t-test)。
Claims (15)
- 被検動物における癌の骨転移のリスクを予測する方法であって、
前記被検動物から得た生物学的試料におけるγ−グルタミルトランスペプチダーゼ(γ−GTP)レベルを測定し、
該γ−GTPレベルが、癌の骨転移のある動物の生物学的試料におけるγ−GTPレベルを参照して予め設定された閾値よりも高い場合に、癌の骨転移のリスクが高いと予測することを特徴とする、方法。 - 前記生物学的試料が尿である、請求項1に記載の方法。
- 前記生物学的試料が癌細胞である、請求項1に記載の方法。
- 前記γ−GTPレベルの測定が、酵素免疫測定法(EIA)、放射性免疫測定法(RIA)、蛍光免疫測定法(FIA)、エライザ法(ELISA)、免疫組織化学染色法、高速液体クロマトグラフィー定量法、酵素法、ウェスタン・ブロッティング法、ノーザン・ブロッティング法、またはRT−PCRにより行われる、請求項1に記載の方法。
- 前記癌が、乳癌、肺癌、前立腺癌、または胃癌である、請求項1に記載の方法。
- 前記閾値がROC分析により設定される、請求項1に記載の方法。
- 癌と診断された動物において、癌の骨転移をモニタリングする方法であって、
前記動物から得た生物学的試料におけるγ−GTPレベルを測定することを含んでなり、
前記γ−GTPレベルが経時的に上昇したときに癌の骨転移のリスクが増加したとする、方法。 - 前記生物学的試料が尿である、請求項7に記載の方法。
- 前記生物学的試料が癌細胞である、請求項7に記載の方法。
- γ−GTPの癌の骨転移マーカーとしての使用。
- 前記γ−GTPが尿中γ−GTPである、請求項10に記載の使用。
- 前記γ−GTPが癌細胞から発現されるものである、請求項10に記載の使用。
- 少なくともγ−GTPレベル測定用試薬を含んでなる、癌の骨転移のリスクの診断用キット。
- 前記γ−GTPレベル測定用試薬が、抗γ−GTP抗体またはγ−GTP活性測定用基質である、請求項13に記載の診断用キット。
- 前記γ−GTPレベル測定用試薬が、抗γ−GTPモノクローナル抗体、L−γ−グルタミル−p−ニトロアニリド、L−γ−グルタミル−3−カルボキシ−4−ニトロアニリド、L−γ−グルタミル−3−カルボキシ−4−ヒドロキシアニリド、L−γ−グルタミル−p−N−エチル−N−ヒドロキシエチルアミノアニリド、L−γ−グルタミル−3,5−ジブロモ−4−ヒドロキシアニリド、L−γ−グルタミル−α−ナフチルアミン、またはL−γ−グルタミル−3−カルボキシ−1,4−フェニレンジアミンから選択される、請求項13に記載の診断用キット。
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