JP2006151846A - サイトカラシン誘導体およびその製造方法 - Google Patents

Abstract

【課題】 種々のキャリアタンパクと複合体を形成し得るサイトカラシン誘導体の提供。
【解決手段】 下記一般式（１）または（２）で表わされることを特徴とするサイトカラシン誘導体。

【選択図】 なし

Description

本発明は、サイトカラシン誘導体およびその製造方法に関する。

植物の根に寄生して自ら分泌する毒素により植物を衰弱・枯死させる土壌微生物が存在する。その中でも近年白紋羽菌（Rosellinia necatrix Prillieux）が果樹木に感染して被害をもたらす場合が多く見受けられ、これによる経済的被害は年々深刻化している。農園などで一本の樹木が感染した場合、土壌を介して他の樹木へと感染が拡大する可能性が高く、そうした事態に陥らないよう早期に感染を発見し対策を施すことが必要となる。白紋羽感染木は外観調査で異常が認められた場合には、すでに感染がかなり進行しており手遅れであるとされている。

従って感染の早期発見のためには、この白紋羽菌が産生し樹木内に吸収された毒素（Cytochalasin E）を感染初期の段階で検出する手法の確立が強く望まれる。
免疫学的測定（immunoassay）は感度、特異性が高く、その特異抗体が得られれば迅速かつ低コストに多検体を検査することができる。しかしながら、通常、Cytochalasin Eのような低分子化合物を免疫してもその特異抗体を得ることはできない。このため低分子化合物（ハプテン）をキャリアタンパク分子へ共有結合させることで複合体を合成し、この複合体を用いて免疫として特異抗原を得る必要がある。そこで本発明の課題は、Cytochalasin Eの迅速・簡便な検出技術の開発を目的とし、Cytochalasin Eと種々のキャリアタンパクとの複合体を合成し得るサイトカラシン誘導体を提供することである。
Ed Harlow et al,Antibodies-A LABORATORY MANUAL,Cold-Harbor-Laboratory,pp75-85(l988). Satoko Kanematsu et al,Ann Phytopathol.Soc.Jpn.,63,425-431(1997).

上記課題は以下の本発明によって達成される。
１．下記一般式（１）または（２）で表わされることを特徴とするサイトカラシン誘導体。

（上記式中のＲ₁は、水素原子、炭化水素基またはスクシノイル基を表わし、Ｒ₂は水素原子またはメトキシ基を表わす。）

２．下記一般式（３）で表わされるサイトカラシンに、そのラクタムと反応する化合物を反応させることを特徴とする前記１に記載の一般式（１）または（２）で表わされるサイトカラシン誘導体の製造方法。

（上記式中のＲ₂は水素原子またはメトキシ基を表わす。）

本発明のサイトカラシン誘導体は種々のキャリアタンパクと複合体を形成し得るので、この複合体を用いてモノクローナルおよびポリクローナル抗体を作製することができ、抗体活性評価に必要な酵素免疫測定が可能になる。

次に発明を実施するための最良の形態を挙げて本発明をさらに詳細に説明する。
前記一般式（３）で表わされるCytochalasin EおよびPhenochalasin Bはそれ自体は公知の物質であり、試薬として入手可能であり、本発明の誘導体の開発は試薬を用いて行なった。Cytochalasin EおよびPhenochalasin Bは光安定性が低い化合物であるため随時遮光して使用することが好ましい。前記一般式（１）または（２）で表わされる化合物は、以下の製造方法で製造することができる。
［製造方法１］

上記反応で使用する酸無水物としては、無水マロン酸、無水コハク酸、無水グルタル酸、無水アジピン酸などが挙げられ、特に好ましい酸無水物は無水コハク酸である。反応に際して使用する酸無水物はCytochalasin Eの１モル当たり、約０．３〜５モルの使用量が好ましい。上記反応で使用する塩基としては、有機塩基としてｎ−ＢｕＬｉ（ノルマルブチルリチウム）、ＬＤＡ（リチウムジイソプロピルアミド）、Ｅｔ₃Ｎ（トリエチルアミン）、ピリジン、ＤＢＵ（１，８−ジアザビシクロ〔５．４．０〕ウンデカ−７−エン）などが挙げられ、無機塩基としてはカリウムｔ−ブトキシド、水素化ナトリウム、炭酸カリウム、炭酸水素カリウム、炭酸ナトリウム、炭酸水素ナトリウム、水酸化リチウム、水酸化ナトリウム、水酸化カリウムなどが挙げられる。
反応に使用する溶媒としては、ＴＨＦ（テトラヒドロフラン）、ジオキサン、Ｅｔ₂Ｏ（ジエチルエーテル）、ＩＰＥ（イソプロピルエーテル）、ＤＭＥ（１，２−ジメトキシエタン）などエーテル系溶媒、ジクロロメタン、クロロホルム、四塩化炭素、ジクロロエタンなどのハロゲン系溶媒、ベンゼン、トルエン、キシレン、クロロベンゼンなどのベンゼン系溶媒、ペンタン、ヘキサン、ヘプタンなどの炭化水素系溶媒が挙げられる。反応温度は、−７８〜１００℃であり、反応時間は０．５〜２４時間である。

［製造方法２］

上記反応で使用するジカルボン酸ハロゲン化物としては、例えば、シュウ酸ジクロリド、マロン酸ジクロリド、コハク酸ジクロリド、グルタル酸ジクロリド、アジピン酸ジクロリド、シュウ酸ジブロミド、マロン酸ジブロミド、コハク酸ジブロミド、グルタル酸ジブロミド、アジピン酸ジブロミドなどが挙げられ、特に好ましいジカルボン酸ハロゲン化物は、コハク酸ジクロリドである。
反応に際して使用するジカルボン酸ハロゲン化物はCytochalasin Eの１モル当たり、約０．３〜５モルの使用量が好ましい。上記反応で使用する塩基、溶媒、反応温度および反応時間は前記製造方法１と同様である。反応後の加水分解（ハロゲンの脱離）は、極めて容易であり、水、酸またはアルカリ水の存在下で容易に生じる。

［製造方法３］

上記反応で使用するハロゲン化脂肪酸エステルとしては、例えば、クロロ酢酸エチルエステル、クロロプロピオン酸エチルエステル、クロロ酪酸エチルエステル、ブロモ酢酸エチルエステル、ブロモプロピオン酸エチルエステル、ブロモ酪酸エチルエステル、クロロ酢酸メチルエステル、クロロプロピオン酸メチルエステル、クロロ酪酸メチルエステルなどが挙げられ、特に好ましいハロゲン化脂肪酸エステルは、ブロモ酢酸エチルエステルである。反応に際して使用するハロゲン化脂肪酸エステルはCytochalasin Eの１モル当たり、約０．３〜５モルの使用量が好ましい。上記反応で使用する塩基、溶媒、反応温度および反応時間は前記製造方法１と同様である。反応後のエステル結合の加水分解は、チオラートによる加水分解、ヨードトリメチルシランなどによる加水分解が好ましい。

［製造方法４］

上記反応で使用するＮ−ヒドロキシスクシンイミドは一般式（１）の化合物（Ｒ₁＝Ｈ）の１モル当たり、約０．３〜５モルの使用量が好ましい。上記反応で使用する脱水剤としては、例えば、ＤＣＣ（ジシクロヘキシルカルボジイミド）、ＤＩＰＣ（ジイソプロピルカルボジイミド）、ＥＤＣ（Ｎ−エチル−Ｎ’−３−ジメチルアミノプロピルカルボジイミド）およびその塩酸塩、ＢＯＰ（ベンゾトリアゾール−１−イル−トリス（ジメチルアミノ）ホスホニウムヘキサフルオロリン化物塩）、ＤＰＰＡ（ジフェニルホスホリルアジド）などが挙げられ、特に好ましい脱水剤はＥＤＣ（Ｎ−エチル−Ｎ’−３−ジメチルアミノプロピルカルボジイミド）塩酸塩である。反応に際して使用する脱水剤はCytochalasin Eの１モル当たり、約０．３〜５モルの使用量が好ましい。上記反応で使用する溶媒としては、ＤＭＦ（ジメチルホルムアミド）、ＤＭＳＯ（ジメチルスルホキサイド）、ＤＭＡＣ（ジメチルアセトアミド）、ＡｃＯＥｔ（酢酸エチル）、ＣＨ₃ＣＮ（アセトニトリル）、ＴＨＦ（テトラヒドロフラン）、ジオキサン、Ｅｔ₂Ｏ（ジエチルエーテル）、ＩＰＥ（イソプロピルエーテル）、ＤＭＥ（１，２−ジメトキシエタン）などのエーテル溶媒、ジクロロメタン、クロロホルム、四塩化炭素、ジクロロエタンなどのハロゲン溶媒、ベンゼン、トルエン、キシレン、クロロベンゼンなどのベンゼン系溶媒、ペンタン、ヘキサン、ヘプタンなどの炭化水素系溶媒が挙げられる。反応温度は、−２０〜５０℃であり、反応時間は０．５〜２４時間である。

以下に実施例を挙げて本発明を詳しく説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。ＮＭＲはＪＮＭ−ＡＬ３００（日本電子データム（株）製）を用いて測定した。

［実施例１］（4-(6,7-epoxy-10-phenyl-5,6,16,18-tetramethyl-21,23-dioxa-[13]cytochalas-13,19-diene-17,22-dione-2-yl)-4-oxo-butyric acidの合成）

窒素雰囲気下、水素化ナトリウム（７ｍｇ、０．３ｍｍｏｌ：脱水ヘキサンにて洗浄処理を施したものを使用）を脱水テトラヒドロフラン（３ｍｌ）に懸濁させ約−７８℃以下まで冷却した。この反応溶液に脱水テトラヒドロフラン（３ｍｌ）に溶解させたCytochalasin E（６５．６ｍｇ、０．１３ｍｍｏｌ）を滴下し、−７８℃以下で約２０分間、０〜５℃下で約１５分反応を行った。再度、−７８℃以下まで冷却した後、この反応溶液に脱水テトラヒドロフラン（３ｍｌ）に溶解させた無水こはく酸（２５ｍｇ、０．２４ｍｍｏｌ）を滴下し、徐々に室温まで昇温した。この反応溶液に飽和塩化アンモニウム溶液（２ｍｌ）、水（２ｍｌ）を加えて酢酸エチル（３ｍｌ×５回）にて抽出をし、次いで無水硫酸ナトリウム上で乾燥後、ろ別し減圧下濃縮した。得られた油状物をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（ヘキサン：アセトン＝２：１）にて精製し、表題化合物（１０．１ｍｇ）を白色結晶として収率１５％で得た。得られた化合物について同定を行なった結果を下記に示す。

¹Ｈ−ＮＭＲスペクトル（３００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ₃）δ ｐｐｍ：７．３０〜７．００（５Ｈ，ｍ）、６．２６（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝１１．６Ｈｚ）、５．７０〜５．６０（１Ｈ，ｍ）、５．５８（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝１１．６Ｈｚ）、５．２０（１Ｈ，ｄｄｄ，Ｊ＝１４．９，１１．３，３．８Ｈｚ）、４．５３（１Ｈ，ｍ）、４．３８（１Ｈ，ｂｓ）、３．２３（２Ｈ，ｔ，Ｊ＝６．０Ｈｚ）、３．０４（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝５．２，１．９Ｈｚ）、３．００〜２．８０（４Ｈ，ｍ）、２．７５〜２．５５（３Ｈ，ｍ）、２．５０（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝５．１Ｈｚ）、２．１０〜２．００（２Ｈ，ｍ）、１．４９（３Ｈ，ｓ）、１．１６（３Ｈ，ｄ，Ｊ＝６．８Ｈｚ）、１．１１（３Ｈ，ｓ）、０．９０（３Ｈ，ｄ，Ｊ＝７．０Ｈｚ）

¹³Ｃ−ＮＭＲスペクトル（７５．５ＭＨｚ，ＣＤＣｌ₃）δ ｐｐｍ：２１１．６、１７２．３×２、１６８．９、１４８．８、１４１．９、１３５．０、１３２．１、１３０．４×２、１２８．７×２、１２７．９、１２７．２、１２０．７、８６．０、７６．７、６０．２、５７．３、５５．６、４５．７、４２．６、４０．８、４０．７、３９．２、３５．８、３２．３、２７．６、２４．４、２０．０、１８．８、１２．６

［実施例２］（6,7-epoxy-10-phenyl-5,6,16,18-tetramethyl-21,23-dioxa-[13]cytochalas-13,19-diene-17,22-dione-2-yl)-acetic acid ethyl esterの合成）

窒素雰囲気下、水素化ナトリウム（０．６ｍｇ、０．０２ｍｍｏｌ：脱水ヘキサンにて洗浄処理を施したものを使用）を脱水テトラヒドロフラン（０．５ｍｌ）に懸濁させ約−７８℃以下まで冷却した。この反応溶液に脱水テトラヒドロフラン（０．５ｍｌ）に溶解させたCytochalasin E（１０ｍｇ、０．０２ｍｍｏｌ）を滴下し、−７８℃以下で約２０分間、０〜５℃下で約１５分反応を行った。再度、−７８℃以下まで冷却した後、この反応溶液にブロモ酢酸エチル（３μｌ、０．０２ｍｍｏｌ）を滴下し、徐々に室温まで昇温した。この反応溶液に飽和塩化アンモニウム溶液（１ｍｌ）、水（１ｍｌ）を加えて酢酸エチル（３ｍｌ×５回）にて抽出をし、次いで無水硫酸ナトリウム上で乾燥後、ろ別し減圧下濃縮した。得られた油状物をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（ヘキサン：酢酸エチル＝１：１）にて精製し表題化合物（５．２ｍｇ）を白色結晶として収率４５％で得た。得られた化合物について同定を行なった結果を下記に示す。

¹Ｈ−ＮＭＲスペクトル（３００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ₃）δ ｐｐｍ：７．３０〜７．００（５Ｈ，ｍ）、６．２９（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝１１．７Ｈｚ）、５．８８（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝１４．９，１０．５Ｈｚ）、５．５４（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝１１．７Ｈｚ）、５．１６（１Ｈ，ｄｄｄ，Ｊ＝１４．９，１０．５，３．７Ｈｚ）、４．６３（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝１７．５Ｈｚ）、４．４１（１Ｈ，ｂｓ）、４．１８（２Ｈ，ｑ，Ｊ＝７．２Ｈｚ）、４．０１（１Ｈ，ｍ）、３．６９（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝１７．５Ｈｚ）、３．０２（１Ｈ，ｍ）、２．９１（２Ｈ，ｍ）、２．７０〜２．５０（４Ｈ，ｍ）、２．２８（１Ｈ，ｍ）、２．１３（１Ｈ，ｍ）、１．４７（３Ｈ，ｓ）、１．３３（３Ｈ，ｓ）、１．２８（３Ｈ，ｔ，Ｊ＝７．２Ｈｚ）、１．１５（３Ｈ，ｄ，Ｊ＝６．６Ｈｚ）、１．０２（３Ｈ，ｄ，Ｊ＝７．３Ｈｚ）、また４．０１ｐｐｍと３．６９ｐｍにＮＯＥを観測

¹³Ｃ−ＮＭＲスペクトル（７５．５ＭＨｚ，ＣＤＣｌ₃）δ ｐｐｍ：２１１．５、１６８．４、１６７．６、１４９．０、１４１．９、１３４．９、１３１．１、１３０．０×２、１２８．８、１２８．７×２、１２７．３、１２０．３、８６．８、７７．３、６１．６、６０．７、５７．８、５７．２、４６．１、４４．７、４２．８、４０．８、４０．１、３９．１、３５．７、２４．４、２０．０、１９．４、１４．２、１３．２

［実施例３］（4-[6,7-epoxy-10-(4-methoxyphenyl)-5,6,16,18-tetramethyl-21,23-dioxa-[13]cytochalas-13,19-diene-17,22-dione-2-yl]-4-oxo-butyric acidの合成）

窒素雰囲気下、水素化ナトリウム（２．４ｍｇ、０．１ｍｍｏｌ：脱水ヘキサンにて洗浄処理を施したものを使用）を脱水テトラヒドロフラン（３ｍｌ）に懸濁させ約−７８℃以下まで冷却した。この反応溶液に脱水テトラヒドロフラン（３ｍｌ）に溶解させたPhenochalasin B（２０．０ｍｇ、０．０４ｍｍｏｌ）を滴下し、−７８℃以下で約２０分間、０〜５℃下で約１５分反応を行った。再度、−７８℃以下まで冷却した後、この反応溶液に脱水テトラヒドロフラン（３ｍｌ）に溶解させた無水こはく酸（１０ｍｇ、０．１ｍｍｏｌ）を滴下し、徐々に室温まで昇温した。この反応溶液に飽和塩化アンモニウム溶液（２ｍｌ）、水（２ｍｌ）を加えて酢酸エチル（３ｍｌ×５回）にて抽出をし、次いで無水硫酸ナトリウム上で乾燥後、ろ別し減圧下濃縮した。得られた油状物をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（ヘキサン：アセトン＝２：１）にて精製し表題化合物（４．５ｍｇ）を白色結晶として収率１９％で得た。得られた化合物について同定を行なった結果を下記に示す。

¹Ｈ−ＮＭＲスペクトル（３００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ₃）δ ｐｐｍ：７．１０〜７．００（２Ｈ，ｍ）、６．７０〜６．６０（２Ｈ，ｍ）、６．２５（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝１１．６Ｈｚ）、５．７０〜５．６０（１Ｈ，ｍ）、５．５７（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝１１．６Ｈｚ）、５．１９（１Ｈ，ｄｄｄ，Ｊ＝１４．９，１１．３，３．８Ｈｚ）、４．５２（１Ｈ，ｍ）、４．３７（１Ｈ，ｂｓ）、３．７３（３Ｈ，ｓ）、３．２２（２Ｈ，ｔ，Ｊ＝６．０Ｈｚ）、３．０５（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝５．２，１．９Ｈｚ）、３．００〜２．８０（４Ｈ，ｍ）、２．７５〜２．５５（３Ｈ，ｍ）、２．４９（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝５．１Ｈｚ）、２．１０〜２．００（２Ｈ，ｍ）、１．４９（３Ｈ，ｓ）、１．１６（３Ｈ，ｄ，Ｊ＝６．８Ｈｚ）、１．０９（３Ｈ，ｓ）、０．９１（３Ｈ，ｄ，Ｊ＝７．０Ｈｚ）

¹³Ｃ−ＮＭＲスペクトル（７５．５ＭＨｚ，ＣＤＣｌ₃）δ ｐｐｍ：２１１．１、１７２．３×２、１６８．９、１５９．２、１４８．８、１４１．９、１３２．１、１３１．７、１２９．３×２、１２８．９、１２０．７、１１３．９×２、８６．２、７７．７、６０．１、５７．３、５６．０、５５．５、４５．７、４２．５、４０．８、４０．７、３９．１、３５．８、３２．３、２７．７、２４．４、２０．１、１８．８、１２．５

［実施例４］（[6,7-epoxy-10-(4-methoxyphenyl)-5,6,16,18-tetramethyl-21,23-dioxa-[13]cytochalas-13,19-diene-17,22-dione-2-yl]-acetic acid ethyl esterの合成）

窒素雰囲気下、水素化ナトリウム（０．６ｍｇ、０．０２ｍｍｏｌ：脱水ヘキサンにて洗浄処理を施したものを使用）を脱水テトラヒドロフラン（０．５ｍｌ）に懸濁させ約−７８℃以下まで冷却した。この反応溶液に脱水テトラヒドロフラン（０．５ｍｌ）に溶解させたPhenochalasin B（１０ｍｇ、０．０２ｍｍｏｌ）を滴下し、−７８℃以下で約２０分間、０〜５℃下で約１５分反応を行った。再度、−７８℃以下まで冷却した後、この反応溶液にブロモ酢酸エチル（３μｌ、０．０２ｍｍｏｌ）を滴下し、徐々に室温まで昇温した。この反応溶液に飽和塩化アンモニウム溶液（１ｍｌ）、水（１ｍｌ）を加えて酢酸エチル（３ｍｌ×５回）にて抽出をし、次いで無水硫酸ナトリウム上で乾燥後、ろ別し減圧下濃縮した。得られた油状物をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（ヘキサン：酢酸エチル＝１：１）にて精製し表題化合物（４．５ｍｇ）を白色結晶として収率３９％で得た。得られた化合物について同定を行なった結果を下記に示す。

¹Ｈ−ＮＭＲスペクトル（３００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ₃）δ ｐｐｍ：７．１０〜７．００（２Ｈ，ｍ）、６．８０〜６．７０（２Ｈ，ｍ）、６．３０（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝１１．７Ｈｚ）、５．８９（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝１４．９，１０．５Ｈｚ）、５．５５（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝１１．７Ｈｚ）、５．１８（１Ｈ，ｄｄｄ，Ｊ＝１４．９，１０．５，３．７Ｈｚ）、４．６６（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝１７．５Ｈｚ）、４．３９（１Ｈ，ｂｓ）、４．１７（２Ｈ，ｑ，Ｊ＝７．２Ｈｚ）、４．０１（１Ｈ，ｍ）、３．７３（３Ｈ，ｓ）、３．６９（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝１７．５Ｈｚ）、３．００（１Ｈ，ｍ）、２．９１（２Ｈ，ｍ）、２．７０〜２．５０（４Ｈ，ｍ）、２．２５（１Ｈ，ｍ）、２．１３（１Ｈ，ｍ）、１．４６（３Ｈ，ｓ）、１．３１（３Ｈ，ｓ）、１．２８（３Ｈ，ｔ，Ｊ＝７．２Ｈｚ）、１．１５（３Ｈ，ｄ，Ｊ＝６．６Ｈｚ）、１．０２（３Ｈ，ｄ，Ｊ＝７．３Ｈｚ）、また４．０１ｐｐｍと３．６９ｐｍにＮＯＥを観測

¹³Ｃ−ＮＭＲスペクトル（７５．５ＭＨｚ，ＣＤＣｌ₃）δ ｐｐｍ：２１１．３、１６８．４、１６７．６、１５９．２、１４９．１、１４１．９、１３１．７、１３１．１、１２９．３×２、１２７．３、１２０．３、１１３．９×２、８６．８、７７．７、６１．７、６０．７、５７．８、５７．２、５６．０、４６．１、４４．７、４２．５、４０．８、４０．５、３９．３、３５．７、２４．４、２０．１、１９．４、１４．２、１３．５

本発明のサイトカラシン誘導体は種々のキャリアタンパクと複合体を形成し得るので、この複合体を用いてモノクローナルおよびポリクローナル抗体を作製することができ、抗体活性評価に必要な酵素免疫測定法が可能になる。また、サイトカラシン誘導体には細胞増殖抑制作用、細胞死誘導作用など、種々の薬理活性が知られているところである。本発明のサイトカラシン誘導体も同様に医薬用途試験検査薬としても有用である。

Claims (2)

1. 下記一般式（１）または（２）で表わされることを特徴とするサイトカラシン誘導体。
   

   

   （上記式中のＲ₁は、水素原子、炭化水素基またはスクシノイル基を表わし、Ｒ₂は水素原子またはメトキシ基を表わす。）
2. 下記一般式（３）で表わされるサイトカラシンに、そのラクタムと反応する化合物を反応させることを特徴とする請求項１に記載の一般式（１）または（２）で表わされるサイトカラシン誘導体の製造方法。
   

   

   （上記式中のＲ₂は水素原子またはメトキシ基を表わす。）