JP2006149333A - アルカロイドの生産性制御因子 - Google Patents
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Abstract
【解決手段】アルカロイド生合性能力の高いオウレン培養細胞から単離した特定の塩基配列のポリヌクレオチドを含む遺伝子。
【選択図】図5
Description
(a)配列番号2で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質、
(b)配列番号2で表されるアミノ酸配列において1もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつイソキノリンアルカロイド生合成系遺伝子発現を誘導する転写因子として作用するタンパク質、
を提供する。
ここで、形質転換植物は、植物体、植物器官、植物組織または植物培養細胞のいずれであってもよい。
本発明に係る遺伝子について
本発明は、イソキノリンアルカロイド生合成酵素発現を促す転写因子をコードする遺伝子を提供する。
配列番号1に示す塩基配列は、キンポウゲ科のセリバオウレン(Coptis japonica)の培養細胞から得られたcDNAライブラリーに含まれるEST(expression sequence tag:発現している遺伝子断片)として、本願発明者によって配列決定されたものである。そして、かかる塩基配列を有するESTは、データベース上の配列情報に基づいた相同性の解析から、イソキノリンアルカロイドの生合成を調節する転写因子をコードする遺伝子であることが示唆された。
本発明に係る遺伝子は、オウレン培養細胞由来のイソキノリンアルカロイド生合成系を制御する転写因子をコードする遺伝子のESTであるため、それを用いて、オウレン属植物(オウレン培養細胞を含む)、あるいはその他の植物から上記イソキノリンアルカロイド生合成系転写因子をコードする遺伝子の全長cDNAをクローニングすることが可能である。この場合のクローニング方法としても、従来公知の方法を利用することが可能であり、特に限定されるものではない。
本発明の遺伝子を発現する形質転換植物を作製する場合には、本発明のタンパク質をコードする遺伝子を適当なベクターに挿入して、これを植物細胞に導入し、これにより得られた形質転換植物細胞を再生させる。
本発明者は、本発明以前に単離・同定されたアルカロイド生合成関連遺伝子を用いて、ハナビシソウのアルカロイド生合成活性を分子変換できること、あるいは、オウレンによるベルベリンの生合成活性を向上できること(Sato F et al. Proc Natl Acad Sci (USA) 98: 367-372(2001))を示している。
本発明に係るタンパク質は、上記遺伝子によってコードされる配列番号2で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質あるいは、配列番号2で表されるアミノ酸配列において1もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつイソキノリンアルカロイド生合成系遺伝子発現を誘導する転写因子として作用するタンパク質、もしくは、配列番号2で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質とアミノ酸レベルで60%以上の相同性を示し、かつ、イソキノリンアルカロイド生合成系遺伝子発現を誘導する転写因子として作用するタンパク質である。
以下、本発明を実施例によりさらに詳細に説明するが、本発明はこれら実施例に制限されるものではない。
特開2004-121233号に記載のように行った。以下にこれを簡単に説明する。
(1)ESTの単離と網羅的塩基配列決定
京都大学大学院生命科学研究科全能性統御機構学研究室で確立され、長年維持培養されてきたオウレン(Coptis japonica)培養細胞のベルベリン高生産株156-1株(選抜株)から、従来文献(Choi, et al., J. Biol. Chem, 277:830-835, 2002)に記載の方法によってmRNAを抽出した。
EST解析に用いたクローンをPCR増幅した後、Biomek 2000ロボットを用いて0.38mm間隔で、Biodyne ATM(Pall)膜にブロットしたものをマクロアレーとした。マクロアレーに対して、異なるアルカロイド生産性を有するオウレン培養細胞株(高生産株として156-1SMT、低生産株としてCjY及びCj8)から抽出したmRNAをSuperscript II reverse transcriptase(Gibco BRL)によって、逆転写し、32P標識したものをプローブとしてそれぞれの細胞における遺伝子発現量を定量化した。
マクロアレー解析の結果、156-1SMT及びCj8において高い発現を示し、CjYにおいて発現の低い遺伝子がベルベリン生合成関連遺伝子としての可能性が高いと判断した。
ベルベリン生産性の異なる培養細胞株(SMT:ベルベリン高生産株、Cj8:SMT株の高生産性は低いが生合成酵素遺伝子の発現が高い株、CjY:ベルベリン低生産株)の継代1週間目の細胞より抽出したトータルRNAをホルムアルデヒドを含むゲルで電気泳動し、Biodyne ATM(Pall)メンブレンにブロッティングした。相同性検索によってベルベリン生合成系の転写因子であることが推定されたクローン48の機能を確認するために、該3種のオウレン株におけるクローン48の発現レベルおよびベルベリン生合成遺伝子の1つである4'OMT((S)-3'-ヒドロキシ-N-メチルコクラウリン-4'-O-メチルトランスフェラーゼ)のmRNAの細胞における発現を、従来文献(Hibi N., Higashiguchi S., Hashimoto T., Yamada Y., 1994, Plant Cell 6: 723-735)に記載の方法に従って確認した。RNAの抽出は、TRIzolを用いたTIGR植物RNA抽出法(http://www.powow.com/akatlab/tigr.html)に従って行った。
クローン48の発現レベルを測定した結果が図3である。クローン48のmRNAの発現レベルは明らかに、ベルベリン生合成系の酵素発現とよい相関を示した。
4'OMTの発現レベルを測定した結果が図4である。図3および図4から、クローン48の発現レベルとベルベリン生合成系酵素である4'OMTの発現レベルは明らかな正の相関を示した。即ち、クローン48のタンパク発現レベルの高い株SMT、中程度の株Cj8、低生産株CjYの4'OMTの転写レベルはそれぞれ、高レベル、中程度そして低レベルであった。
クローン48の発現を抑制することによって、ベルベリン生合成系の遺伝子の発現にどのような影響が及ぼされるかを調べるために一過性RNAi法を用いた実験を行った。
従来から用いられているdsRNAを細胞内で発現するDNAコンストラクト(Inverted repeat structure)を作成し、これを細胞に導入して細胞内でdsRNAを発現させるRNAiプロトコールは非常に時間および手間のかかるものである。したがって本研究においては、インビトロで合成したdsRNAを用いる一過性RNAi法を用いた。オウレンベルベリン高生産株156-1を標的に用いた。
dsRNAのインビトロ調製はR. Carthew and J. Kennerdell.(http://www.bioexchange.com/tools/protocol_detail. cfm? protocol_id=31#MMB101.
)によるプロトコールにしたがった。簡単に説明すると、以下のPCRプライマー(図5の破線部を参照)を用いてクローン48dsRNAをインビトロで作製した:
5'側:T7プロモーター配列+クローン48遺伝子特異的領域(小文字はT7プロモーター配列)
(5'-5'-taatacgactcactatagggagaccacGCACC AATAGATGCA CGAGA-3')(配列番号3)、
3'側:T7プロモーター配列+クローン48遺伝子特異的領域
(5'-taatacgactcactatagggagaccac GCAGAAGGTTCAGGAGCAAC-3')(配列番号4)
dsRNAのインビトロ合成にはRibomax Express kit (Promega)を用いた。dsRNAをフェノール-クロロホルム-イソプロパノール抽出によって精製し、RNAse-フリー水に溶解した。
オウレンプロトプラストを継代3週目のSMT細胞から、細胞壁消化用溶液(0.4% オノズカセルラーゼ R10 (Yakult Pharmaceutical Ind. Co.), 0.2% Macerozyme R10 (Yakult Pharmaceutical Ind. Co.), 0.01% Pectolyase, 0.6 M ソルビトール, 20 mM MES (pH 5.5)および 5 mM MgCl2を含有)を用いて調製した。約1gの細胞を10 mlの該溶液中で一晩28℃でインキュベートしてプロトプラストを得た。
約2〜7μgのトータルRNAを3〜4 x 105 のオウレンプロトプラストからRNeasy kit (Qiagen)を用いて製造業者の指示に従って抽出した。DNAse Iで処理した後、10 μlのアリコットをSuperscript III (Invitrogen)を用いた逆転写に供した。逆転写は42℃で行った。
SMT; (GGATTTCTTTCAGTATGCTGG およびTCTCTATCCGTCTCCCAATC), (配列番号5および6)
4'OMT; (ATGTTCTGGACATCAAAGCTCおよびACCAACATCAACAAGTGAGTC), (配列番号7および8)
6OMT; (GCAGTGCAACTTGATCTAGCCおよびAGCTGGTTTTTCTCAGGGTGC), (配列番号9および10)
CNMT; (GCAACAGAGGTTGAGACCTTG およびGCTGCTAGTCCTTTCTGGATG) (配列番号11および12)。
転写産物の量は、DyNAmoHS SybrGreen qPCRキットならびにMJ Research CFD-0200LCXを用いたリアルタイムPCRにより定量を行った。結果を図6および図7に示す。
Claims (22)
- 配列番号1で表される塩基配列の第86〜772塩基からなるポリヌクレオチドを含む遺伝子。
- 配列番号1で表される塩基配列の第86〜772塩基からなるポリヌクレオチドにおいて1もしくは数個の塩基または塩基対が欠失、置換もしくは付加された塩基配列からなり、かつイソキノリンアルカロイド生合成系遺伝子発現を誘導する転写因子をコードするポリヌクレオチドを含む遺伝子。
- 配列番号1で表される塩基配列の第86〜772塩基からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、イソキノリンアルカロイド生合成系遺伝子発現を誘導する転写因子をコードするポリヌクレオチドを含む遺伝子。
- 配列番号1で表される塩基配列の第86〜772塩基からなるポリヌクレオチドとヌクレオチドレベルで60%以上の相同性を示し、かつ、イソキノリンアルカロイド生合成系遺伝子発現を誘導する転写因子をコードするポリヌクレオチドを含む遺伝子。
- 以下の(a)または(b)のタンパク質をコードする遺伝子:
(a)配列番号2で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質、
(b)配列番号2で表されるアミノ酸配列において1もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつイソキノリンアルカロイド生合成系遺伝子発現を誘導する転写因子として作用するタンパク質。 - イソキノリンアルカロイド産生植物由来である請求項1から5のいずれかの遺伝子。
- オウレン由来である請求項6の遺伝子。
- 以下の(c)または(d)のタンパク質:
(c)配列番号2で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質、
(d)配列番号2で表されるアミノ酸配列において1もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつイソキノリンアルカロイド生合成系遺伝子発現を誘導する転写因子として作用するタンパク質。 - 以下の(e)または(f)のタンパク質:
(e)配列番号2で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質、
(f)配列番号2で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質とアミノ酸レベルで60%以上の相同性を示し、かつ、イソキノリンアルカロイド生合成系遺伝子発現を誘導する転写因子として作用するタンパク質。 - 請求項1から7のいずれかの遺伝子によってコードされるタンパク質。
- 請求項1から7のいずれかの遺伝子を含む組換えベクター。
- 請求項11の組換えベクターを含む形質転換植物細胞。
- イソキノリンアルカロイド産生植物細胞である請求項12の形質転換植物細胞。
- オウレン細胞である請求項13の形質転換植物細胞。
- 請求項12から14のいずれかの形質転換植物細胞を培養し、細胞内でイソキノリンアルカロイド生合成系遺伝子発現を誘導する転写因子を過剰発現させる工程、および、得られる培養物からイソキノリンアルカロイドを採取する工程を含む、イソキノリンアルカロイドの生産方法。
- イソキノリンアルカロイドがベルベリンである請求項15の方法。
- 請求項12から14のいずれかの形質転換植物細胞を含む形質転換植物。
- 形質転換植物が植物体、植物器官、植物組織または植物培養細胞である請求項17の形質転換植物。
- 請求項17または18の形質転換植物を培養または栽培する工程を含むイソキノリンアルカロイド生産性植物の製造方法。
- 請求項1から7のいずれかの遺伝子を含むポリヌクレオチドで植物細胞を形質転換する工程、および、該形質転換した植物を再分化させて植物体を得る工程を含むイソキノリンアルカロイド生産性植物の製造方法。
- 請求項1から7のいずれかの遺伝子の発現を阻害する工程を含む、植物においてイソキノリンアルカロイド生合成を阻害する方法。
- 発現の阻害をRNAi法により行う請求項21の方法。
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