JP2006138860A - 光学的微細プローベ及び材料のスペクトル分析方法 - Google Patents

Abstract

【課題】小さい容積素子に観察される応答を空間的に限定して標本を分析する方法および装置を提供する。
【解決手段】放射を発生する放射部１２と、第１の光制限部１４と、指向（対物）光学系１６と（これらは集合的に照射光学系という）を含み、光制限部を通過して形成されたビームが試料１８を照射する。収集光学系２０は照射された試料１８からの放射を収集し検出し、これが第２の光制限部２２を通る。制限部２６を含み、照射および収集光学系またはその一部に連結されて、照射が指向される位置を調節し、選択された容積素子からの応答を収集する。
【選択図】図１

Description

（発明の分野）
本発明は試験片との電磁的放射の相互的作用の結果を分析することによって試験片からの空間的微分解析情報を得る方法および装置に関し、特にこのような装置に生ずるデータを使用して該試験片からの生物体内の診断的情報を得る新規かつ有用な装置および方法に関する。このことは探索用電磁的ビームを空間的に制限することによって小さい容積素子内に最大動力密度を達成し、検知される受領応答を実質的に同一容積素子に制限することによって達成される。

（発明の背景）
例えば癌、病気その他損傷した組織の迅速な診断を自動的に与えることができる装置について強い要望がある。特に、癌の成長又はその他の損傷した組織の大きさと段階とを正確に診断可能な機器について要望がある。現在、医学の分野においては目視的解析および生検法によって生物学的組織を解析して特定の病理および異常を一般的に決定している。各種の生化学的映像が使用され、各種の病理の光学的反応が生化学的組織を特定するために使用される。しかし、これら従来技術は重大な欠点を有する。

例えば、組織の生検を行って取り出した組織を研究室で解析するためには多くの時間が必要である。さらに、生検は組織から取り出された代表的な標本について特性を決定するに過ぎない。従って、完全な標本を得るためには多数の切除を日常的に行う必要がある。さらに、生検は標本採取および診断に誤りを伴うものである。磁気的同調映像は良い結果を与えるが、高価であり、重要な欠点として発生の初期段階で小さい病理症状を検出できない。

医学の分野で組織分析に使用される技術として蛍光技術がある。レーザ誘導蛍光は特定の波長に同調したレーザを使用して組織を励起して２次的波長の蛍光を発生せしめ、これが組織の特性を診断するために使用される。蛍光は通常組織内に存在する分子、または識別分子として組織内に導入された分子のいづれかから発生する。

生物学的組織のＵＶ励起による蛍光反応の機構は完全には解明されていないけれども、腫瘍形成の蛍光特性は生化学的変化および形態学的変化の両者を反映するようである。例えば自動的蛍光スペクトル監視器は生物の生化学的変化、例えばニコチンアミド・アデニン・ダイ・ヌクレオチド（ＮＡＤＨ）およびフラビンの相対的濃度の変化を反映する。粘液性濃度増加および毛細管作用の変化はスペクトル記録に変化を与える代表的なものである。

３３７ｎｍの近紫外線励起に応答する蛍光放射に寄与する生物学的組織の主要分子は、トリプトファン（３９０ｎｍ放射）、エラスチン（４１０ｎｍ）およびコラーゲン（３００ｎｍ）の発色要素、ＮＡＤＨ（４７０ｎｍ）、フラビン（５２０ｎｍ）およびメラニン（５４０ｎｍ）がある。しかし、組織内においては純粋化合物に対してピーク位置の移動および全体波形の変化が存在する。従って、試料に対するＵＶビームの放射は充分に短い波長で行い、上述列挙した波長で記録される応答から組織に対する寄与の存在を決定する。

ヘモグロビンは吸収のピークが４００ないし５４０ｎｍであり、オキシヘモグロビンもヘモグロビンも６００ｎｍ以上で強い光吸収性を有する。血液の流れもエラスチン、コラーゲン、ＮＡＤ、ＮＡＤＨの観測される放射スペクトルに影響を与える。組織内に存在し、放射光を吸収し検知される放射スペクトルの形状を変化させる別の化合物として、ミオグロビン、ポルフィリン、ダイニュークレオタイド・コエンチームがある。

別の一般的背景として、ネオプラシアはその変形経路が主として嫌気性であるから高レベルのＮＡＤＨを有する。細胞がその（ＮＡＤ＋／ＮＡＤＨ）比を集合時に高めることができないことが、その生長制御の欠点に関連する変形細胞の特性である。（ＮＡＤＨ−／ＮＡＤＨ）の比の値は細胞の代謝能力の指示値で、例えば解糖作用と糖新生作用との比の指示値となる。表面蛍光はＮＡＤＨの生物体外および生物体内の双方における相対的な値を測定するために使用されてきた。個々の筋細胞から得られた放出スペクトラムはミトコンドリアの酸化フラビン蛋白質から発生するものと考えられ、青色蛍光はミトコンドリアによるＮＡＤＨと一致する。

コラーゲン、ＮＡＤＨおよびフラビン・アデニン・ディヌクレオチッドは大腸組織の主蛍光測定法であると考えられ、蛍光スペクトラムをスペクトル分析するために使用されている。適正値と測定値との間の誤差は酸化および還元ヘモグロビンの混合物の吸収スペクトルと類似しており、残差は血液の存在による。

米国特許４，９３０，５１６号明細書には、蛍光を利用して癌と正常組織との区別を行うことを示しており、癌と正常組織とからの目視可能な発光スペクトルの形状が実質的に相違し、詳細には癌組織は強度ピークの位置が異なり、ブルー側にずれている。例えば、該明細書には既知の健全な組織と問題の組織との区別は健全な組織と問題の組織とのスペクトルを比較することによって達成されることを示している。該明細書によれば、組織のスペクトルは、組織を実質的に単色の放射で励起することによって発生せしめられ、少なくとも２つの波長について発生した蛍光を比較する。

米国特許５，０４２，４９４号明細書には、励起波長を変更して目視可能な蛍光スペクトルの形状の差を観察することによって正常組織と癌組織とを区別することを示している。米国特許５，１３１，３９８号明細書には、癌を正常な又は温和な組織から区別するために（ａ）目視可能なバンド以下の単一または実質的に単一色の約３１５ｎｍ詳細には約２１５〜３１５ｎｍ、特定的には３００ｎｍの蛍光を使用し、（ｂ）得られた蛍光を約３４０および４４０ｎｍの２つの波長で比較することを示している。重い腫瘍組織における明確な色の差は診断的に有用であるが、この方法は正常、悪性、良性、腫瘍、異形、異常増殖、炎症、感染症組織を区別できない。診断におけるこれら難解な区別ができないことは、適切な処置の選択をほとんど不可能とする。該特許明細書における簡単な比例、相違および比較解析は癌研究の有用な手段としての発展を約束し組織状態の指示装置を刺激するものであるが、正確で頑丈な診療器具が要望されている。

上述から明らかのように生物学的組織から得られるスペクトルは著しく複雑であり、標準的なピーク比較プログラム、スペクトル回旋解析または比較スペクトル分析などによって解明することは困難である。さらに、スペクトル偏位はスペクトル分析を複雑にするだけである。最後に、レーザ蛍光その他の組織からの光学的反応は通常深度解析ができないが、これはこれら光学的または電子的機器は対象組織からの信号を全体の組織容積を通して総合することによる。

米国特許４，０１７，１９２号明細書には癌を含む異常を多細胞生医学標本において決定する技術を示しており、これは生体組織の複雑なスペクトル応答に関連する問題点を克服する。該明細書には生体組織からの光学的（伝達又は反射）応答データの決定を多数標本について及び多数波長について行い、これらの光学的応答の相関関係から数個の検査波長を定め相関方程式を形成する一連の定数を選択する。相関方程式を選択された波長における光学的応答に関連して通常の組織について求め、この組織の状態を予測する。しかし、良好な堅実な相関関係を得るために、該明細書においては、組織を励起して下方組織の光学的特性を含まない均一な試料を求める。従って、該明細書の方法は本発明に対比して生物体内に適用することができない。

フォトメディスン社（Photomedicine）のウェルマン（Wellman）研究所での単一ファイバ深さプローベを使用する研究において、ショマッカー（Schomacker）は生体内の人体結腸ポリープの特徴の自動蛍光は４つの異なる状態、すなわち、正常、良性腫瘍、前癌状態および悪性新生物の指示を与えることを発見した。参照文献：ショマッカー等著，レーザ手術および薬（１２，６３−７８）；１９９２年；ガストロエントクロロジー（Gastroentcrology:102，1155-1160(1992)がある。さらにショマッカーはデータの多数変形線形回帰分析を腫瘍が新生物か否かを区別するために使用することを示している。しかし、この技術を使用する粘膜異常の観察は実質的に粘膜下からの信号によって損なわれるが、これは正常の大腸組織において観察される蛍光の８７％は粘膜下コラーゲンによることによっている。発生源の深さを識別する装置があれば性能が向上する。

従って、試験片、特に生体試験片を試験して該試験片内の限定された容積素子からの識別された信号を得ることができる有効かつ正確な装置を得ることについて要望があり、さらに、これらデータを自動的に処理して容積素子に関する簡単な診断情報を自動的に与える方法についても要望がある。

本発明の主目的は電磁放射と限定された制御可能の局部的な容積素子との間に相互作用を誘発せしめ該小さい容積素子に観察される応答を空間的に限定して標本を分析する方法および装置を提供するにある。

本発明の目的は分析される試験片の隣接平面または表面の下方に存在する材料の容積素子、または該平面の上方に存在して干渉信号を発する材料が存在する場合などのように、弱い又は空間的に覆われた信号を発する材料の容積素子を分析する手段を得るにある。

本発明の付加的な目的は、生物学的組織の特性および又は病理学的状態を励起ビームに対する組織内の非関連性の容積素子の応答を測定し、該応答を既知の病理学の応答に関連せしめて自動的に決定し、又は病理学的応答と外部的医学データとを総合する手段を提供するにある。

本発明のさらに別の目的は直接に目視可能な、又は直接観察によりまたは腹腔鏡または内視鏡などの剛性または可撓性光学経路によって光学的に近接可能な組織の生体診断情報を得るにある。

さらに本発明の目的は癌性、病性その他損傷した組織の範囲を高い精度で低価格で分析し又は検知するにある。

さらに本発明の目的は組織を監視し、器官または組織移植片が生存可能であるか否かを決定するにある。

さらに本発明の目的は生体内の酸素潅注、血色素、その他の代謝産物、および組織または血液化学物質を測定するにある。

本発明のさらに別の目的は薬品、特に光力学的療法に使用される薬品の一時的または空間的分布を監視するにある。

本発明のさらに別の目的は、その大きさが医師にとって臨床的に重要な組織の容積素子を解析するにある。

上述およびその他の目的は以下のせつめいにより明らかとなされる。

（発明の概要）
広い意味において本発明は標本、例えば組織の輪郭を定めた区域からの放射に対する応答を誘出し検知する装置を提供し、該組織は直観的に言えば強力かつ純粋、すなわち希釈されない応答を与える。粒子ビームは材料（例えば化学的元素および金属化微細構造）の量的微細分析に著しく有効であることが判っているけれども、低いエネルギ放射に対して応答を引き出すことと、より透明な媒体例えば生命装置内の有機材料または流体中の化学反応などのように複雑な装置の場合とは著しく相違する。例えば音響的（例えば圧縮波）放射と光子的放射との双方は多数の騒音導入欠陥、例えば散乱、モード変換、吸収および再放射、多数の関連するまたは類似の効果、例えばこのような放射に対して集められた応答が空間的に近接する区域から又は物理的に関連する位置にあるが実質的に無関係な混信材料からの無関係な雑音によって希釈され、不純化され、濾過され、その他実質的に変化せしめられる。本発明はこの欠点を例えば組織の層、局部的な成長、又は反応容積などの容積素子を刺激し応答を集めるプローベによって解決するものであり、これは活性手順に従って詳述される。これは照明ビームなどの刺激ビームがその大部分が第１の区域外にある限定された照射分布を有し、刺激に対する応答を収集する装置の収集効率が第２の区域について同様な空間的区別を有し、第１および第２の区域が交差して試験される容積素子を限定する用にすることによって達成される。従って、容積素子は刺激および検出感度において重なる空間的分布によって限定される。

本発明の理解のための例示として、サンプルの照射およびサンプルからの光の収集を説明するが、「光」、「照射」または「放射」という用語を使用する。しかし、これら用語は明細書および請求の範囲において電磁的放射の各種の形式を含むものであり、ビーム、焦点光、その他の各種形式、各種空間分布のものを含み、視野ストッパ、絞りおよび焦点調節素子を使用するものであってよく、また音響的放射も含む。

本発明をより完全に述べるために、特定用語について述べる。本発明は範囲ストッパの使用を企図しており、これは照明および集光経路対物レンズの解像度に対比して大であるが、応答が集められる局部的容積素子を限定するように使用される。本出願人は本発明の最も有用な量的限定は囲まれた動力の大きさと対比的なスポットの寸法とである。回折が存在しないとき、映像は幾何光学的に正確に予測されるが、収差の影響はある。比較的なスポット寸法とは幾何光学的に予測される映像の大きさと回折が適切に考慮された場合の映像の大きさとの比較、または映像が回折効果と残留収差との存在下で正確に測定されたものとの比較である。囲まれた動力とは全光学的フラックスの映像表面内での分数であり、これは記述された限界、例えば幾何学的映像内に限定される。さらに、解答は光学装置の主軸に関する映像の位置によって変化し、従って正確に限定すれば、定義は解答が特定される位置を含む。これはフィールドストッパの平面内にあると定められる。本明細書および請求の範囲において用語「大きいフィールドストッパ」、「回折限定スポットより大きいフィールドストッパ」、「対物レンズの古典的解像度より大きいフィールドストッパ」はフィールドストッパの大きさが点目的物が配置されその映像がフィールドストッパの位置にあるとき、関連する充分に修正された対物レンズによって形成された点目的物の映像に対比して大であることを意味する。

「容積微小プローベ」、「容積微小プローベ形状」および「弱い共焦形状」は
１）試料を特定するために放射を使用する配置にして、
ａ）照射および集光経路に１対のフィールドストッパを使用し、該フィールドストッパは関連する対物レンズのフィールドストッパの古典的解決より大であり、
ｂ）フィールドストッパは少なくとも部分的に試料の通常の容積素子を介して結合され、
ｃ）観察された放射を使用して共通の容積素子を特定する。
２）照射および集光フィールドストッパの形状は物理的に同一である。
容積プローベとは、
１）容積が微小なプローベ、又は
２）試料を特定する放射を行う任意の形状にして、
ａ）情報が抽出される容積素子にして、照射および観察経路の部分容積に限定され、
ｂ）これにより、該容積素子の外方の放射始発部とは区別され、
ｃ）容積素子は試料の全容積より小であり、
ｄ）容積素子の予めの決定および少なくとも部分的な寸法および位置の決定が可能で、試料内の位置の効果的な識別が可能である。

同様に用語「光学的」および「放射」も電磁的、音響的、光学的および放射的を含み、「容積素子」は光学的形状によって限定される局部的容積をいう。

一般的に、本発明の器具は、限定された容積素子からの光学的応答を集めることによって作動し、この応答の収集が「記録」を形成するが、これは永久的または短命である。「記録」は光検知器または検知器処理回路からの電気的信号でよく、表示スクリーン上の目視可能な表示であってよく、数学量で示す測定値、またはメモリまたはハード記録装置の測定値でもよい。

以下の説明では理想的媒体、すなわち散乱または該媒体の屈折率が光の伝播に実質的に影響を与えないものとしている。

代表的な装置として、２つの光学的組立体のそれぞれのフィールドストッパが共役して容積素子を介して求められる光学的応答を与えるようになされる。第１の光学的組立体は光源またはその他の放射源からのビームを容積素子に選択的に伝達するフィールドストッパをイメージする。第２の光学的組立体は目標容積素子から始発する光または放射を集め、光または放射を検知器に伝達して第１の伝達されたビームと容積素子との相互作用を解析する。第１の光学的組立体は選択された容積素子の選択的照射を行うフィールドストッパを含み、第２の光学的組立体は目標容積素子から発散する放射または光の収集光学体への収集を制限する第２のフィールドストッパを含む。さらに、制御器が設けられ、これは本発明のいくつかの実施例によれば選択された容積素子の試験片の表面に相対的な深さを２つの光学的組立体のそれぞれのイメージ区域を制御しそれぞれの結合状態を保持しその標本化された容積素子を両組立体の共通結合点として調節する。これらフィールドストッパの一般的寸法は生理学的に興味のある容積素子を標本化し又は処理するために常に大であり、従って対象物の古典的解決よりも大となされている。標本化された容積素子内の２つの組立体のそれぞれの対象物によって形成されるフィールドストッパの像は、それぞれのフィールドストッパの限定された（幾何学的）非回折イメージを通る光束の実質的にすべて（例えば９５％以上）を囲んでおり、光学系および試験片の損失について適切な修正を行う。フィールドストッパの寸法は少なくとも数個の細胞というような生理学的に有意の大きさの組織を含む標本容積素子を限定するように選択される。

本発明の一実施例において照射および集光光学系は同一素子であり、フィルタ装置またはビーム分割装置が使用されて、照射および集光ビームを分離する。

照射および集光フィールドストッパの共役は通常は共焦点配置によって達成され、光学的装置（照射および集光装置）によってフィールドストッパの映像が形成され、光学的装置は対象物と重なって配置される。フィールドストッパが小さいピンホール（回折効果によって深度判定が制御される）である場合の共焦点配置は従来技術に示される。例えば米国特許第３，０１３，４６７号明細書には２重焦点、すなわち共焦点装置が示され、２つの光学的に共役のピンホールのフィールドストッパを有しており、形成されるイメージのコントラストは限定された焦点区域の外方から始発する実質的に総ての光を排除することによって改良される、すなわち横方向視野を制御しイメージ部分を囲む区域の有効深度を最小にすることによって改良される。これら単一の点から得られたデータは実用性が小であり、共焦点顕微鏡の場合、通常試料を横方向に走査することによって得る複数の点の相対的応答によって所望の高いコントラストの２次元映像が得られる。

本発明によればフィールドストッパは対象物を照射し収集する限定された回折スポットより大きい寸法を有する容積素子を限定し、単一容積素子から得られたデータが新しいスペクトル信号を含み、これが診断情報として使用される。共焦点顕微鏡は目標表面の映像を標本上の多数の密接に間隔をおかれた点から得られた光学的応答の回旋によって与えるが、本発明は非映像化マイクロプローベとして示され、標本試験片の映像を得る必要がなく、重要な分析データは標本としての別々の容積素子から得られる。すなわち、有限の容積素子から得られた絶対的光学的応答エネルギ（信号）の量を最適のものとするが、従来の共焦点顕微鏡においては多数の超顕微鏡的対象物からの応答における強化されたコントラストが所望の目的となされる。目標が全く相違しているので、共焦点顕微鏡は少なくとも１つのフィールドストッパを使用し、これは従来の対象物の解像度より小であり、複数の隣接する点からの読みが得られる。本発明のフィールドストッパは対象物の回折限定スポットの寸法より著しく大であり、単一の容積素子から有用な応答が得られる。多数のフィールドストッパの使用は著しく大きい容積限定応答を生じ、集められた光の信号／ノイズ比を根本的に変化せしめ、事象の検知と迅速な測定とをその光学的特性によって可能とするが、これは共焦顕微鏡においては観察さえされなかったことである。比較すれば、共焦顕微鏡における固有の深さ識別、すなわち視野の深度、すなわち回折によって限定される焦点容積素子の深度は照射光の波長および該光と試料との相互作用の特性によって定まり、これに反して本発明の固有の深さ識別は光学的装置の幾何学的変数のみに依存するものである。

選択された容積素子からの光学的応答は容積素子についての重要な情報、例えば化学的、形態学的および一般的に生理学的情報を有している。試料がスペクトル的に簡単であれば、その光学的反応はピーク値を調和させ、１つ以上の選択された波長について回旋除去または強度決定を行う従来のスペクトル技術によって解析される。このような装置の一例として、複数の化合物の混合物の均一度の決定がある。しかし、試料が上述したような複雑な生物学的標本である場合、従来の装置で観察されるスペクトルの複雑さは意味のある診断を与えない。このような生物学的標本が微妙な特性を知るために分析される場合に、関連出願によれば驚くべきことに、別々の容積素子から得られた光学的応答を空間的にフィルタして変換し、又は非イメージ顕微鏡的に得られたデータに関連して上述変換を行うことによって診断的に有意の結果が得られる。

この点に関する本発明の方法によれば、最初に、特定目標病理学の訓練セットまたは標本が選定され、該標本は望ましくは少なくとも１０個の試験片を含む。最初に試験片中の明確な容積素子からの光学的応答が集められ、記録される。標本と同一の容積の素子が本発明の非イメージ容積微細プローベとして使用され、生検される。すなわち、使用した容積素子の組織病理学的分析が病理学研究室で実施され、試験片は任意の目盛り（例えば１から１０）で目盛られ、これは病理Ｃ（たとえば特定の癌）の程度を示す。目盛Ｃ_i（ここにＣ_iは訓練セットの標本ｊについての目盛値を示す）はできるだけ正確である必要があり、従って病理学者の求めた多数の値（同一の容積素子について）の平均値を使用する。そこで数式Σａ（_je）・Ｆ（Ｉ_ij）＝Ｃ_jが得られ、ここに、ｉはスペクトルの窓（通常５〜５０ｎｍ）、Ｆ（Ｉ_ij）は容積素子ｊについての窓ｉにおける測定されたスペクトル応答についての応答強さその他の特性の関数である。関数Ｆは該窓における応答強度であってよく、この場合Ｆ（Ｉ_ij）＝Ｉ_ij、または Ｆ（Ｉ_ij）＝（ｄＩ_ij）／（ｄλ）／（Ｉ_ij）、この場合（λ）は窓（ｉ）における媒体の波長その他の関数である。係数ａ_ieは病理目盛Ｃに対する関連変換係数であり、上述の式から周知の数学技法、例えば多変数線形回帰解析法により求めることができる。この解析において、値Ｃ_jの病理学的偏椅と光学的応答との間の忠実な関連に必要な窓ｉの数は最小となり、病理目盛Ｃに対する関連係数ａ_ieの組が求められる。光学窓ｉの空間ベクトルを形成している応答（Ｉ_ik）が前述訓練セット以外の試料からの個々の素子の限定された数に限定され、ベクトルＦ（Ｉ_ik）に変換操作（ａ_ic）を行って和Σａ（_ic）・Ｆ（Ｉ_ij）＝Ｃ_kが得られ、試料とした容積素子の目標病理目盛Ｃの量が決定される。

本発明の実施例としての器具は濁った材料、例えば生物学的組織、水、プラスチック、被覆、および化学的反応過程に有用であり、生物学的組織の生体内および生体外検査に特に有利である。内部的分析を得るためには、本発明は現存形式の剛性および可撓性内視鏡と共に作動可能である。本発明は第１および第２の光学素子を光ファイバによって内視鏡、腹腔鏡または関節鏡に連結するようにしてもよい。

本発明の性質および目的を理解するために、以下の詳細な説明と添付図面とを参照する。

図１は本発明の容積検査装置１０を示し、試料１８内の容積素子を照射し照射された試料１８内の容積素子から放射される放射が検出される。容積素子からの放射は衝突する放射に対して多くの点で変更せしめられ、容積素子からの「光学的応答」または単に「応答」という。これら変換は試料とされた容積素子の特異な特性を保持しており、化学的、形態学的、物理的、生理学的特性を保有する。光学的応答は反射、伝達、選択的吸収、各種形式の散乱、各種形式の発光、特に蛍光を含む電磁放射として示される。

装置１０は、放射を発生する放射部１２と、第１の光制限部１４と、指向（対物）光学系１６と（これらは集合的に照射光学系という）を含み、光制限部を通過して形成されたビームが試料１８を照射する。さらに装置１０は、収集光学系２０と、第２の光制限部２２と、検出部２４とを含み、収集光学系２０は照射された試料１８からの放射を収集し検出し、これが第２の光制限部２２を通る。さらに、装置１０は制御部２６を含み、これは照射および収集光学系またはその一部に連結されて、照射が指向される位置を調節し、選択された容積素子からの応答を収集する、例えばプローベをそれぞれの深さ区域に、又は試験される容積素子に指向させる。これは照射および収集制限部１４、２２にフィールドストッパを設けることによって達成されるが、詳細は後述する。

作動時に照射部１２と制限部１４と指向光学系１６とが試料１８内の容積素子を照射する。照射部１２は放射を発生し、制限部１４に指向させる。制限部１４は放射の一部を選択的に指向（対物）光学系１６に伝達し、これは試料１８に含まれる容積素子上の光制限フィールドストッパに焦点を合わせる。

収集光学系２０と光制限部２２と検出部２４とは照射された容積素子の少なくとも一部から収集光学系に向かう放射を共同して検知する。収集光学系２０は試料１８に含まれ照射される容積素子の像を光制限部２２のフィールドストッパに形成する。光制限部２２は収集光学系２０からの放射を選択的に検出部２４に伝達する。検出部２４は電磁放射の特性、例えば１つ以上のスペクトル線の強さ、またはスペクトラムの区域などを明確とする。

照射と応答収集との共働する制限とによって、対象容積素子以外からのすべての応答が空間的に制限され、検知される容積素子からの信号と背景との比が著しく増大する。

制御部２６は指向光学系１６と収集光学系２０との位置を空間的に調節して、試料１８に含まれる複数の容積素子を照射し検出し、または光制限フィールドストッパの位置を調節して同様な効果を得る。本発明の別の態様によれば、制御部２６は照射ビームと検出ビームとを試料１８の２次面積区域に照射する。これは装置１０のビーム軸線を試料１８に相対的に変更して、試料１８内の容積素子を放射ビームの軸線に直角の方向から変位した各種の位置に指向することによって達成される。このとき、制御部２６は装置１０の試料１８に相対的な位置を互いに直交する位置とは異なる位置とする。

図２は本発明による装置１０の素子の物理的配置を試料と共に示している。図示された装置１０は光源すなわち照射部１２と、照射連結体３２と、照射部連結光学系３４と、第１のフィールドストッパ３６を含む第１の光制限部１４と、レンズ３８、４２から成り照射対物体１６として示される映像手段とを含み、レンズ３８、４２は照射対物体１６の正面組立体を形成し、試料１８に含まれる容積素子４６を第１の光制限部からの入力放射ビーム４４により照射する開口ストッパ４０が設けられる。図２には、さらに、レンズ５２（対物組立体）、５６から成るコレクタ２０と、開口ストッパ５４と、第２の視野ストッパ５８を含む第２の光制限部２２と、検知器連結部６８と、容積素子４６から発する帰還放射４８を捕捉し分析する検知器２４とを含む。

照射連結光学系３４に関連する照射連結部３２が電磁放射の経路を与え、電磁放射は放射部１２から制限部１４を通る。検出器連結部６８と検出器連結光学系６０とが電磁放射を第２の光制限部２２から検出部２４に導く。連結部３２および連結部６８は代表的には直径５０マイクロｍないし２００マイクロｍの光ファイバ、または光ガイドとする。通常、光ファイバまたは光ガイドは多数モードとなされ、すなわち連結部３２、６８は広い波長範囲の電磁信号を伝達可能となされる。照射連結光学系３４と検出部連結光学系６０とは代表的にはレンズまたは同等素子を含み、連結部３２、６８間およびその他の部分間を通る電磁波を整合せしめまたは合致せしめる。連結光学系３４、６０のレンズは正確に整合しており電磁放射が連結部３２、６８を通って出る、または入るときの動力損失を最小とする。

図示する第１の光制限部１４はフィールドストッパ３６を含み、これは光学系において視野を制限するために使用される各種の制限体であってよい。本明細書においてフィールドストッパとは任意の形状、例えば円形、楕円形、矩形、溝形または正方形開口であってよく、視野を制限する。さらに、一定の形状、寸法を持ってもよく、調節可能な寸法形状、例えば調節可能な虹彩などであってよく、限定された有効断面積を有する光フアイバなどのように開口部を有し通常はフィールドストッパの機能を行う素子であってよい。作動時にはフィールドストッパ３６は遮光することにより光学系１６に入る光を選択的に制限する。一実施例において、照明組立体の第１の部分の基準（平行）光線が光学系１６に指向され、これが照射目的物として作用し、光制限部１４の位置の調節を必要とせずに軸線方向に移動せしめられる。この調節は制御部２６の制御によって行われるが、ビーム４４の焦点位置を軸線方向に変更して選択された個々の容積素子を照射するようにする。

対物光学系１６は第１の開口ストッパ４０を含み、対物レンズの開口を制限すると共に、レンズ組立体３８、４２の縁部によって限定される開口が試料１８内の限定された試験容積体４６内に光ビームを指向する。設けられる場合、開口ストッパ４０はレンズ４２によって試料１８に投射される電磁放射ビームの断面積を制限し又は限定するに役立つ。レンズ４２は放射４４のビームが試料１８の焦点区域においてフィールドストッパ３６の狭いイメージ範囲に収斂するように作動する。放射４４のビームが焦点を結ぶ試料１８の容積は、検出される容積素子４６を含むが、詳細は図３について説明する。

光制限部１４と指向光学系１６の焦点能力とによって入力放射４４の強度は光学系１６の焦点区域において最大となり、制限部１４の開口は入力放射４４の強度が横方向および試料１８内の前述焦点区域から離れる方向に軸線方向に減少する。

入力放射４４が検査される容積素子４６を照射すると、この放射はフィールドストッパ３６によって限定される試料容積内の材料と影響しあう。この相互作用によって照射された試料から始発する２次光ビームが全方向（４πステラディアン）に指向される。この２次ビームは、入射放射に対する試料の応答動作であるが、試料容積内の材料の反射、散乱および吸収（スペクトルの特定部分における応答の欠如として観察される）、さらに、特異な蛍光の発散がある。試料からの光学的応答の一部として収集される放射４８があり、収集器に到達したものは検知器２４に集められる。

収集組立体２０は前方対物レンズ５２と、第２の開口ストッパ５４と、検査される容積素子４６から発する放射エネルギ４８を集めると共に、該容積素子の最大断面積をフィールドストッパ５８へのビームに直角にイメージするリレイレンズ５６を有している。１つの実施例において、レンズ５２は焦点長さが前述断面積部分からの距離に等しく、従って放射４８を収集し放射４８を平行光線として再指向することができる。開口ストッパ５４は光集光対物レンズ５２から限定された寸法の放射ビームを選択的に通過せしめ、第２のレンズ５６は容積素子４６の前述断面積を第２の光制限部２２にイメージする。

図示した第２の光制限部２２はフィールドストッパ５８を含む。フィールドストッパ５８は光学的装置に通常使用される任意の開口を代表する。作動時に収集組立体２０はフィールドストッパ５８上に容積素子４６をイメージし、正確には該収集光学系の軸線に直角な該容積素子の最大断面積が定められる。すなわち、フィールドストッパ５８、３６は容積素子４６を介して対をなしている。フィールドストッパ５８を通った光は連結光学系６０と検知器連結体６８とを通って検知器２４に到達する。容積素子４６内に最大の照射を与えるため照射ビームを空間的にフィルタすることと、容積素子４６からの光を空間的にフィルタすることとによって、容積素子４６の外側区域からの光を識別することを可能とする。

放射が始発する容積素子をフィールドストッパで制限する効果は光学系の断面図として示す図３Ａ、図３Ｂ、図３Ｃを参照して説明する。

図３Ａは照射光学系の一部を示し、照射フィールドストッパ３６を通った光は光学素子７１（図２の照射対物体１６に対応する）に到達する。図２における照射部１２からの限界光２００、２０１はフィールドストッパ３６の点Ａを通るもので、限界光２０２、２０３はフィールドストッパ３６の点Ｂを通ったものである。限界光２００、２０２は開口ストッパ４０の点Ｃを通り、限界光２０１、２０３は開口ストッパ４０の点Ｄを通る。光２００、２０１はイメージ平面２５０のＡ’点で収斂し、光２０２、２０３はイメージ平面２５０のＢ’点で収斂している。点Ａ’、Ｂ’はフィールドストッパ３６のイメージ３６’の限界点として示される。フィールドストッパ３６が円形であれば点Ａ’、Ｂ’は直径の両端を示している。限界光２００、２０１、２０２、２０３はさらに、試料１８内に伝達される。

回折がないとした幾何光学近似によれば、光２００、２０１、２０２、２０３は入力放射４４の幾何学的限界を示す。試料１８内に散乱がないとき、入力放射４４は点Ｈ、Ｂ’、Ｃ、Ｄ、Ａ’、Ｋによって囲まれる区域に限定される。フィールドストッパ３６の内側を通った放射は開口ストッパ４０を通り、次に容積素子４６を通るが、その限界は点Ａ’、Ｆ、Ｂ’、Ｅによって示される。フィールドストッパ３６が円形であれば、容積素子４６は双円錐形であり、頂点Ｆ、Ｅを有する２つの円錐が共通の底面３６’を有している。容積素子４６は図３Ｂに示すように、単に放射４４がぼかされない区域を示すものである。

位置３６’において放射は最大であって、容積素子４６の外方で急速に低下する。図３Ａにおいて、フィールドストッパ３６とその映像３６’との寸法は開口ストッパ４０の直径、照射対物体７１と仮想平面２５０との距離に対比して誇張して示している。従って、照射される容積４６１の外側では内側に対比した場合フィールドストッパ３６’の中心Ｌと容積４６１の中心Ｇとの距離の２乗に比例して減少する。放射４４は試料１８に作用して放射を始発せしめる。始発された放射は相互作用の性質によって変化し、例えば始発する放射が蛍光の場合は発生源Ｇを囲む全球面（４πステラディアン）に放射されるが、方向性を持ってもよく、部分的に吸収されたビームの場合もあり、逆方向への散乱光の場合もある。任意の発生源Ｇからの放射の強さは、その点における入射４４の強さに比例するものとなっている。

照射装置とは別に集光装置を説明する。光学法則は本質的に可逆性であるから照射装置と集光装置とは共役的である。この共役性は集光装置を示す図３Ｂに明らかである。容積体４６１’からの放射は検知器２４（図２）に集められ検出されるが、照射と集光とを同時に考えるとき図３Ａの容積体４６１に少なくとも部分的に対応する。

図３Ｂに示すように、容積体４６１’からの放射は検出部２４に到達するが、収集開口ストッパ５４と収集フィールドストッパ５８とを経由する。検出部に到達する試料１８からの放射は放射４８に含まれる。回折がない場合、光３００、３０１、３０２、３０３は集光放射４８の幾何学的限界を示す。試料１８内に散乱がない場合、集光される放射４８は点Ｈ″′、Ｂ″′、Ｃ″、Ｄ″、Ａ″′、Ｋ″′によって限定される容積４６１’内に含まれる。放射４８のすべてはフィールドストッパ５８の内部の点を通り、これらが開口ストッパ５４を通り、その断面が点Ａ″′、Ｆ″′、Ｂ″′、Ｃ″′で限定される容積素子４６’を通っている。フィールドストッパ５８が円形の場合、容積素子４６’は双円錐形であって、頂点Ｅ″′、Ｆ″′を有する２つの円錐が共通の底面５８’を有して双円錐形を形成している。

フィールドストッパ５８を通る放射４８はイメージ５８’を通るが、イメージ５８’の下方（図において）の試料１８、例えば点Ｇ″′から始発する。更に、放射４８はフィールドストッパ５８を通るから、逆にイメージ５８’の上方からの放射はイメージ５８’を通る。すなわち、収集される総ての放射は対物体７２の収集開口に収集される、すなわち、容積部４６１’の内側にあって開口ストッパ５４に向かって指向され、第２に、検知部２４に到達する放射はフィールドストッパ５８を通る。この第２の状態は収集部の収集効率が発生源からの距離、例えばＧ″′とフィールドストッパのイメージの中心Ｌ″′との距離の２乗にほぼ等しい。

図３Ｂにおいて、フィールドストッパ５８とそのイメージ５８’との相対的寸法は開口ストッパ５４の直径、又は対物体７２からイメージ平面３５０までの距離に対比して誇大に示される。実際は角度Ｃ″′Ｆ″′Ｄ″は角度Ｃ″′Ｅ″′Ｄ″とほぼ等しく、効率または放射の計算において精度に小さいロスがあるが角度Ｃ″′Ｌ″′Ｄ″で代替できる。角度「１／２｛Ｃ″′Ｌ″′Ｄ″｝」の正弦関数が対物体７２の作動数的開口（ＮＡ）を示しており、開口ストッパを通る光に対する対物体の公称の収集角度を表す。図３Ｂにおいて、光源は４６１’として示すが、これは容積素子４６’の外方で、平面３５０より著しく下方で、例えば点Ｇ″′からのフィールドストッパ５８’の張る角度はイメージ５８’の中心Ｌ″′からの角度より小である。従って点Ｇ″′から放射される光は対物体７２に集められる立体角内にあるが、フィールドストッパ５８を通って伝播しないがこれは最初にイメージ５８’を通る必要があることによる。従って、収集効率は立体角の比、すなわち例えば光源点Ｇ″′からイメージ５８’の中心までの距離の２乗の比となる。容積素子４６’の外方で面３５０と対物体７２との間の試料１８内の光源点から４８に放射される光において、イメージ５８’は開口ストッパより小さい立体角を張り、従って、この光源点について、光線が通過する開口ストッパの面積は減少し、収集効率も同様に減少する。

容積素子４６’内の光源点に関し、対物体７２の実際の収集角度内に放射される光線は検知部２４に到達する。すなわち、容積素子４６’は試料１８の唯一の容積素子であり、これから発する放射４６はぼかされない。

従って、本発明の回折のない光学装置では、ぼかしは容積素子を限定し、これから有意の信号が検知される。

図３Ｃは容積素子４６″を示し、共役する照射および集光光学系によって限定され、観察角度φ（図２の５０）は１８０°ではない。深さ識別は改良され、共通フィールドストッパと共通対物体を使用するものより信号はいくらか弱いが、これは図３Ａの容積４６と図３Ｂの４６’とが実質的にかつ不完全に対応していることによる。この場合の容積素子４６″は容積素子４６、４６’の重なる部分から成り、これを通してフィールドストッパが共役する。一般的にはフィールドストッパは図示のように中心を同一として重ねられ、共役しない双円錐体の頂点は除去されて小さい素子となり、交差した円錐類似の形状を有し、これからの光学的応答は強化される。照射および収集装置は移動せしめられ、このフィールドストッパの像は対称性の少ない、例えば細片形、楔形などをなし、観察される試料と同様または斜めに整合するものとなる。この場合、全信号は著しく減少するが、試料からの検知信号の割合は増加し、有用な情報の内容は強化される。

装置１０は共役するフィールドストッパ３６、５８を使用して試料１８内の視野を横方向および深さ方向に制限する。試料１８は装置の所望の特性に合わせた供試容積素子を限定する。当業者にはフィールドストッパ３６、５８は図３Ｃに示すように容積素子４６″を介して共役するが、同一焦点ではなく、それぞれのイメージ、すなわち図３Ｃにおける断面３６’、５８’は重なっていないで共通線を有するのみである。一般的に光学的経路、フィールドストッパの位置と形状および対物体素子は整合してよく、これらが容積素子を限定し、位置と方向とが定められる。例えば形状は細片形、楔形、半月形、円錐形などが照射および収集区域の交差によって生ずる。

当業者が理解されるように、２つのフィールドストッパは完全に共役するより本発明は非イメージ容積、微細プローベ装置を含み、検知容積は分割共役、すなわちフィールドストッパのイメージの部分的一致により限定され、従って上述の双円錐体が部分的に重なる。この装置の望ましい実施例において、照射および収集光学系は互いに平行で、対物体は僅かに変位し、または楔形をなし、イメージの共通して重なり合う区域を形成するが、両組立体の光軸は偏位している。

図３Ｃに示すように、これら形態のいづれにおいても、入射ビーム４４と容積素子４６″との相互作用、すなわちこれらの光経路に共通な容積区域は２回空間的にフィルタされ、この容積区域から検出された光は照射および収集分布の結果として低下する振幅を有する。低いレベルの光が試料１８の容積素子を焦点外で照射し、望ましくは選択されなかった素子が強く照射された焦点区域、すなわちプローベ容積体のイメージを著しく覆うことはない。さらに、選択された容積素子の内側でなく、焦点材料の外部から到達する低レベルの光は非常に小さい部分のみが収集光学系に到達する。すなわち、共通容積素子４６″の外側から始発する光が検知される信号に与える影響は前述双円錐体の共通中心からの距離の４乗に比例して減少する。この結果は本発明の装置によって選択された容積素子から収集される復帰信号を該容積素子の外部から集められる復帰信号に対して著しく強化する。

寸法に関し、例示すれば１ないし２０マイクロメータの基本的寸法の細胞から成る基本的微細構造、及び１０倍ないし数千倍大きい層または生長過程を検出する臨床的巨大構造を有する生物学的組織を検出するもので、プローベ装置は照射視野ストッパとして数十ないし数百マイクロメータの寸法を有し、収集ストッパも数十ないし数百マイクロメータの寸法となされる。代表的な実施例において、照射および収集視野ストッパは２５ないし５００マイクロメータとなされ、対象物の拡大度は１／１０と１との間である。代表的な実施例において、フィールドストッパの寸法は上述の値となされる。実際の光学系において大きいフィールドストッパが必要である。

良く修征された対物レンズによって形成される点状対象物の像は点状とはならない。これは、明るく照明された中央の点がイメージの強さの１／２以上を消費し、残りは開口ストッパの形状に従って、及び開口ストッパ上の入射光の振幅および位相分布に従ってイメージ上に分布される。マックスウエルの近似方程式によれば、寸法 ｄ’＝ｋλ／ＮＡ が得られ、ここに λ は単色入射光の波長、ＮＡは対物レンズのイメージ側の作動数的開口、ｋは１桁の係数である。実際的の光学系における通常の場合として、平面または球面波入射光が円形対称の良く修正された対物レンズに入射したとき、イメージは当業者に周知の渦巻き模様で中央の最大部を囲む第１の空白部の直径は ｄ’＝１．２λ／ＮＡとなり、像の強さの８４％はこの直径内にある。

実際の光学系に通常の別の実施例として、入射光が最低次のＴＥＭ₀₀レーザーである場合、イメージにおける放射はガウス関数によって分布し、通常限定される回折スポット直径 ｄ’＝０．６４λ／ＮＡ となり、この直径においてイメージ照射は回折パターンの中心における最大照射の約１３．５％であり、その部分のエネルギは全体の約８７％である。従って、本発明による開口ストッパはその直径が ｄ＞ｋλ／ＮＡ であり、ここに、ｋは開口ストッパと入射光とによって定まる定数である。対物レンズ、開口ストッパおよび照射の実際的値に対して、ｄ＞２λ／ＮＡであり、通常は ｄ＞＞λ／ＮＡ である。

良く修正された対物レンズにより形成される大きい物体の像でも幾何光学で予測される完全な複製ではない。幾何学的イメージの縁部を注意深く調査すると回折の影響が判るが、これら影響はイメージの寸法が回折スポットの大きさと匹敵する場合以外は無視できる。これは幾何学的イメージの外方では実質的に光学的力が存在しないことによる。すなわち、イメージ平面内の光学的動力の分布は、対象物例えばフィールドストッパが小さくて回折効果が関連する対象物の光学的性能を支配するか否かを定める限界値となる。例えば対象物からの光学的動力の９５％がイメージ表面に到達するとき対象物の幾何学的イメージとなされる。

図２の実施例において、容積素子４６の光軸に沿った選択は対物体前方組立体（４２、５２）の同期的軸方向運動によって達成される。これは、対物体の前方組立体を選択された容積素子４６からそれぞれの焦点位置に等しい距離に位置せしめるようにする。しかし、新規の容積素子の場合、試料を２つの固定の光学的組立体に対して移動せしめ、または一方の光学的組立体を他方に対して移動せしめて、選択された容積素子を２つのフィールドストッパの共役点に位置せしめるようにする。

照射装置の光軸ｚに沿った容積選択を行う別の手段として、素子の別の運動があり、フィールドストッパの運動、または他の光学的素子を運動せしめて照射装置の対物体のイメージ距離を変更せしめるものがある。しかし、２つの光学的組立体の一方の運動は他方の関連する運動によって補償する必要があり、例えば、収集光学的組立体において２つのフィールドストッパの共役関係または分割した共役関係は選択された容積素子４６を介して達成される。

図４は変形した装置１０’を示し、これは非イメージ容積マイクロプローベの連結運動組立体を不要とし、共通対物組立体が試験片を照射し、同一軸線または経路に沿って光を集める。装置１０’は照射部１２と、連結光学体３４と、ビーム分割部１００と、第１の光制限部１４と、対物体１６と、検知部２４と、前方対物光学素子４２を移動せしめて異なる深さの容積素子をサンプルするための制御器２６とを含む。ビームスプリッタ１００が連結光学体３４の前方および後方素子の間に配置され、光制限部１４の方向から入る光を反射するが、照射部１２の方向から到達する光は通過させる。ビームスプリッタ１００から反射する光は検知部２４に指向される。

作動時に照射部１２は放射ビームを発生し、これが連結光学体３４とビームスプリッタ１００とを経て光制限部１４に向かう。光制限部１４は放射ビームを選択的に伝達し、光はフィールドストッパ３６を通って対象物１６に到達する。対象物１６はフィールドストッパ開口３６内の試料１８内にイメージを形成する。試料１８から反射し又は始発した光は対物光学体１６に集められ、光制限部１４内の同一のフィールドストッパ開口３６を通って戻る。従って光制限部１４は対物体に到着する試料１８からの放射の一部分のみを選択的に通過させる。通過した部分は主としてまたは本質的に容積素子４６からの応答を含む。選択的に伝達されるビームはビームスプリッタ１００に向かう。ビームスプリッタ１００は選択的に伝達されたビームの少なくとも一部を検知部２４に指向し、分析および特性を記録する。図２の実施例と同様に、照射源と光制限部とは試料内に局限された強度の回折限定より大きい照射スポットを形成する。

図４Ａは別の実施例１０″を示し、共通対物組立体が試料を照射し同一経路に沿って光を集める。装置１０″は照射部としてレーザ、例えば波長６３３ｎｍの線形に偏光した出力を有するメレグリオ社（Melles Griot）05-LHP-121-111レーザを有し、レーザ出力をパルス化し信号を強化して同期検知を可能とするビーム変調組立体９９７が設けられ、例えば４５度の入射角の６３３ｎｍ放射と共に使用されるレイナルド社（Reynard Corporation）製の極性検知２色性ビーム分割部１００が配置され、入射する偏光レーザ放射の９０％以上が反射されるようになされ、連結レンズ９１３、例えばメレグリオ社のＬＡ００１１が２０ｍｍの焦点距離を有し、これがレーザ放射を照射連結部３２に連結し、連結部３２の受入れ数値開口と適合する。連結部は光ファイバ例えば長さ２ｍのセラムオプチック社（Ceram Optic）のＵＶ２００／２２０Ａ１２とし、２００ミクロンの芯を有し、数値開口（ＮＡ）が０．１２であり、ナイロンジャケットで囲まれ、端部にはアウガット社(Augat SMC)のコネクタを有する。光学的ヘッドは連結光学組立体３４と、フィールドストッパ３６とを有し、これは例えばナショナル・アパーチャー(National Aperture)社のステンレス鋼フィールドストッパで、１００ミクロンのレーザーカット開口をＰＡ−３アダプタに有する。対物組立体１６が設けられ、これらは試料１８を照射するに共働する。試料１８は装置１０″の性能を較正するためには像であってもよく、例えば透明媒体内に分散した散乱素子を含み、その表面の下方に例えばナイルブルーなどの染料で染色された糸を配置して小さい癌を模擬し、または鶏の胸肉などの天然組織内に癌に通常使用される薬に浸した糸を挿入したものとしてこの薬によって処理された小腫瘍の吸収および発散特性を模擬するようにしてもよく、または試料をそのように処理された腫瘍としてもよい。照射されたナイルブルーは波長６７０ｎｍおよび７８０ｎｍに集中された蛍光を発する。光学的ヘッドは試料１８の容積素子４６内に発生する蛍光を感知し、照射連結部３２に連結し、これが結合レンズ９１３の受け入れ数値開口に照射し、これが集められた放射を基準化し、２色性ビーム分割部１００に送る。ビームスプリッタ１００は６７０ｎｍ以上の蛍光の９０％以上を伝達するようになされている。伝達された蛍光は光学的フィルタ９１５、例えばショット社（Schott）のＲ６８ガラスとなされ、このガラスは散乱した６３３ｎｍの放射の１０⁴分の１以下を伝達するが、蛍光の１／２以上を検知フォトマルチプライヤ９２４に伝達し、これは例えばハママツ（Hamamatsu）Ｒ９２８となされる。

フォトマルチプライヤ９２４の電気的出力９３０はロックイン増幅器９２６、例えばプリンストン（Princeton Applied Rearch）社のＳＲ３５０増幅器となされる。パルス発生器９２５（ヒューレット社 Hewlett Packerd 8003A）が例えば約８５０ヘルツで発振するように調節され、ビーム変調組立体を制御し、変調組立体とロックイン増幅器とを同調せしめる。ロックイン増幅器はフォトマルチプライヤ９２４の電気的出力９３０を処理して平均強度をディスプレイに表示し、例えばテクトロニクス(Tektronix)４７５となされるオシロスコープ９２６に平均強度に比例する信号を送る。表示された信号強度は測定される容積素子４６から発する蛍光に比例する。制御器２６は光学的ヘッド９１４を３つの直交する方向運動せしめ、各種の容積素子の蛍光を測定可能とする。

詳細には変調組立体は音響光学的偏向装置、例えばイソメット社（Isomet）の１２０１Ｅで、２２１Ａ−２−３９駆動部を含み、これがパルス発生機９２５のパルスを受けたとき偏向した１次及び高次のビームを発生し、パルス発生機の出力がゼロの場合にゼロ次の偏向されないビームを発生する。出力ビームはレーザ９１２から音響光学的偏向装置９９１を通り、回転ミラー９９２に送られ、ビームはモード選択器９９５に指向される。モード選択器９９５は、例えば偏向装置９９１から約８００ｍｍ離れており、モード選択器に入る偏向されたビームはゼロ次の偏向されないビームの衝突点から充分に離れている。モード選択器は充分に大きい、例えば直径約１ｍｍの開口を有し、１次のビームの通過を可能としているが、モード選択器の本体はその他のモードの伝達を妨げ、阻止する。１次のビームはレーザー照射を含み、これが第２の回転ミラー９９４に当り、調節可能の虹彩９９６を経てビーム分割器１００に指向される。虹彩９９６は一例として約３．５ｍｍの開口に調節される。調節可能の虹彩はモード選択器９９５を通って洩れる残留モードがあれば除去し、レーザー照射器９１２の出力に広く存在する最低次のＴＥＭ₀₀ガウス（Gaussian）モード以外の付帯的なレーザービームがあればそれを除去する。レーザー照射器９１２の出力のこの最終的清浄化作業によって、その後の照射用光学素子による散乱が生じてフォトマルチプライヤに向かう光学的経路内へ入ることが防止される。従って光学的ヘッド９１４に入るレーザー照射はパルス発生機９２５のパルス周波数を有する清浄化されたパルスである。

光学的ヘッド連結器は前方および後方素子３４１、３４２を含み、例えば１対のエドモンド・サイエンチック社（Edmund Scientific）製のＭ６３８７アクロマットで、焦点距離１７ｍｍとする。副組立体３４が照射連結ファイバ３２の出力の数値的開口に適合し、照射をフィールドストッパ３６に指向するが、これは例えば直径１００ミクロンの円形開口であって入力照射を約３０％の効率で選択的に通過せしめ対物組立体のバック素子３８に送る。素子３８は例えばメレス・グリオ（Melles Griot）社の 01 LAO 028/078 で焦点距離約３１．５ｍｍで、開口ストッパ４０を介する連結効率を最大にするように選択され、該開口ストッパ４０は代表的には直径が８ないし８．５ｍｍで前方素子４２と一体となされている。前方素子４２は１組の顕微鏡対物レンズの１つで、その拡大度は視野ストッパのイメージが所望の直径を有するように定める。前方素子４２は例えばアメリカン・オプティカル社（American Optical Corp.）の焦点長さ約４ｍｍおよび、０．６６ｍｍのＮＡの４４Ｘ対物レンズ、無限大に修正された同社の焦点長さ約８．５ｍｍ、および０．５ｍｍのＮＡの２０Ｘ平面アクロマート対物レンズ、または焦点長さ約２０．３ｍｍおよび０．２ｍｍのＮＡで約１２ｍｍの長い作動距離のオプティック社（Optics for Research）の１０倍対物レンズがある。これらの対物レンズは図４Ｂに示す測定を実施するために使用されるもので、これが装置１０″の予測された性能を実証する。

図４Ｂおよび図４Ｃは図４Ａに実施例として示す実際的な作動装置で行った測定結果を示す。

図４および図４Ａの実施例において、収集および照射装置は同等であり、図３Ａおよび図３Ｂに示すいくつかの装置は同一の素子、すなわち対物レンズ７１、７２、開口ストッパ４０、５４および視野ストッパ３６、５８は同一の装置であると物理的に認識される。これら実施例において視野ストッパ３６、５８は共通のイメージ３６′、５８′（図３Ａ、図３Ｂ）を介して自動的に共役するが、これらは図３Ａ、図３Ｂのぼかしがなく照射された光源容積素子４６、４６′と同様に通常のものである。この実施例において、照射効率および収集効率は共通のフィールドストッパ・イメージにおいて、例えば図３ＡのＧ、図３ＢのＧ″′に示す遠隔点に相対的に最高であり、容積素子４６内で高い値に留まる。同様に、容積素子４６内で収集効率は高いが、これは容積素子４６′の場合も同様となされる。図３Ａ、図３Ｂの４６１に同等な光源点４６０、例えばＧに対する照射及び収集の全効率は両（照射及び収集）効率と照射に対する発散の大きさに関する関数との積と同様に概略的に低下する、すなわち、イメージ５８′と同等なイメージ３６′の中心からの距離のほぼ４乗に比例して低下する。光軸上にない点については低下が著しいことが判る。試料内でのロス以外に、上述理由に実質的に影響を与えない要素として、収集フィールドストッパ５８によって与えられる限定によるものでなければ、球面４５０（４５０′）に沿って配置され焦点外れの容積素子から始発して収集された放射４４の全光束が、容積素子４６（４６′）と同様に検知器（２４）によって検知される放射に対する背景信号とほぼ同様に役立つが、このことは照射され放射する容積４６１（４６１′）の内側の球面４５０′の面積がイメージ３６′（５８′）からの距離の２乗になることによる。しかし、本発明の装置によれば、収集フィールドストッパ５８のために収集効率の低下が早いので容積素子４６１′からの背景状態の総合値が、焦点区域、詳細にはぼかされない容積素子およびその周辺から集められる信号を支配することはない。

で示され、ｄ″は検知器フィールドストッパのイメージ５８の直径、ＮＡは対物体７２のイメージ側作動数値開口、であり、従って光学的装置の幾何学的配置によって決定される。これに対比して同焦点鏡検方法によれば、回折が優勢な機構が照射および収集効率を制御するする場合は深度解析Δは入射光と媒体との相互作用の性質によって定まる。例えば、ウイルソン（T.Wilson）は「生物学的同焦点鏡検方法ハンドブック、Handbook of Biological Confocal Microscopy，J.B.Pawley,Ed.,Chapter 11，113-126，Plenum Press，New York，1990」において蛍光同焦点鏡検方法によれば、Δ＝２．８λ／ＮＡ²ここに λ は単色照射光の波長、また、入射光がコヒーレントのときは Δ＝１．４λ／ＮＡ²となっている。

図４Ｃは図４Ａの装置を使用して得られた小さい高写真感光性の腫瘍類似の２つの人工物の代表的な２次元的図である。第１の試料はナイルブルーで染色した２００ミクロンの糸（Talon-American Sewing Bee mercerized cotton #50）を乾燥し、ポリマー（Duco Cement）の薄い層を被覆して染色が主組織に拡散することを防止したものである。縫合物は鶏の胸の表面下５００〜８００μに挿入された。６３３ｎｍで励磁したとき蛍光が６７０ｎｍ以上の波長で観察された。深度分析は７６μであり、横走査分析は２５μであった。縫合線は明確に観察することができた。データ処理は最少となされた。等強度曲線を得るため生データは６次有理関数で処理され背景定数は除去された。等強度曲線が５０％強度を太線として示される。図４の別の実施例では第２の試料が使用された。第２の試料は直径１３０μの市販の綿糸（コーツアンドクラーク Coats and Clark #50）で、ベンゾポルフィリン誘導体モノアシッド（ＢＤＰ−ＭＡ）で同様に処理され、腫瘍の光力学治療のための薬が使用された。鶏の胸は部分的に燐酸処理された塩水で浸漬され、プラスチックフィルム（Dow Handiwrap）でシールされた。図は生データである（相対的強度を深さｚと横方向走査ｘとで示す）。この強力な明確な信号は、染色が小腫瘍の信号を強化するために使用されたとき可能であって、外科処置に有用な最少信号処理が必要である。腫瘍組織に本質的な蛍光が観察されたときは、より複雑な処理が通常必要である。

図４Ｃにおいて「深さ」寸法は装置の光軸方向（鉛直方向）に沿っている。水平すなわち「横」方向は糸に直角である。これら２つの軸線の機能の差は「横」解像度が２５μであり、「深さ」解像度が７６μである。

直接に臨床的興味はないが、付加的な細部の信号解析がさらに測定を改善せしめる。深さ方向に輪郭線を延長せしめる。深さの解析は約５０μだけ、半径方向の解析より大であり、従って５０％の輪郭線深さは輪郭線幅より約１００μだけ大であると予測される。実際に測定された差は約１２５μである。また、糸の太さは糸の中心において深さ解像度より大でないから、観察された供試容積は蛍光目標で充填されているが、糸の縁部においては充填されていない。この関係において簡単な回旋解析計算が円筒形形状を補償すると期待される。

装置１０″の素子から検知光学的拡大器に送られる６３３ｎｍのレーザ放射の量を最少とするため、図４Ａに示す望ましい実施例１０″では薄い反射性フィールドストッパ開口担持体を例えば２度の角度で傾斜せしめ、通過しない照射が収集光学的経路に反射することがないようにする。さらに、光学的ヘッド組立体の内径部はねじ切りされ、吸収性拡散ペイントで塗装され、壁に散乱する光が最適に吸収され又は阻止される。空間フィルタをビーム分割器１００と光学的フィルタ組立体９１５との間の収集経路内に挿入され、照射連結部３２の端部における連結部からの反射は阻止されるが、帰還する蛍光は通過するようにする。

上述説明から及び以下の説明から理解されるように、本発明の容積微細検査器は生理学的影響又は状態の広い範囲を検知し又は監視することを可能とする。一例として、皮膚または組織移植片を監視する深さ識別光学系に対する要望が存在する。移植片が良好に血管化しているか否かの状態を容易に検知することは壌死状態または急速に増殖している組織（回復）状態の検知と同様に必要である。血管化状態は各種ヘモグロビンと同様にスペクトル的に測定可能であるから、血液潅注およびこれら測定は深さ解析を可能とする。

光力学的癌治療の処置中に使用される薬の消耗の測定は特に重要な応用例である。光力学的治療技術の現在の欠点の１つは癌に実際に供給された薬の量を求める信頼性のある方法がないことである。光力学的治療に使用される薬は化学製品で、これは該当する波長（通常、赤色または近赤外線）の光を受けたとき光活性化して有毒性となるものがある。また、急速に増殖する組織内に優先的に集まる場合もある。この形式の化学製品にはポルフィリン誘導体があり、ポルフィリン症を発生させ、光感知性の蛍光を生ずる。図４Ｃはこのような薬の１つとしてのベンゾポルフィリン誘導体モノアシッドの検出を示し、図４Ａの装置によって照射されたときの高選択性空間的検知の結果を示す。

別の応用例として、火傷した組織の深さおよび生存能力の決定がある。外科医にとって困難な決定は火傷の処置において火傷した組織の除去の場所と可否を決定するにある。区域が回復する見込みの場合には、瘢痕化、回復時間および感染の危険は放置したほうが低くなる。この健全状態を判定する最良の評価は健全な組織の深さを知ることである。このことは本来の光学的特性を観察し、乾燥痴皮に与えたマーカー薬品を観察すること、などで達成される。インドシアニン緑は蛍光染料でこの目的で使用されるが、安全で心臓能力の指示薬として使用されている。静脈内に注射されると、体内に急速に分布され健全な血管から漏れることはない。従って、火傷の下方の深さを決定することにより、健全な血管の深さを決定することができる。グリーン（Greeｎ）氏および彼のマサチュセツゼネラル病院（Massachusetts General Hospital）における協力者は、始めに赤色、つぎにＵＶ（紫外線）で励起された蛍光を観察する技術について特許を得ている。ＵＶ励起蛍光は赤色励起蛍光より散乱が大であり、差の測定によって火傷の深さが決定される。しかし、本発明によれば、直接かつより正確な測定が容積素子を異なる深さに配置し光学的応答を観察することにより、無傷の組織の区域を正確に決定することができる。

本発明は試料内の選択された容積素子を照射し、それからの光を検出することに関し、容積素子は部分的に比較的に大きい開口源によって限定されるが、本発明は任意公知の形式の照射を使用するものでよく、強化された信号水準によって明確な空間的Ｚ軸識別（照射の光軸）を与え、組織層の形状、寸法または生物学的特徴に対応するものであり、本発明出願人は、本発明の利用により重要なスペクトル応答情報が得られ、従来この種の解析には無益であると考えられた照射源も使用可能であることを明らかとした。さらに、本発明によれば、収集されるスペクトル情報は単に振幅または動力ではなく、収集されたスペクトル情報の全範囲を使用する。例えば図５は非イメージ容積顕微鏡を示し、照射部１２は複数の光源、詳細には窒素レーザー１０１が３３７ｎｍの光を放射し、白色光源１０２と、レーザーダイオード１０４と、光放出ダイオード１０６とを含む。さらに、図５は単色走査体１０８とスペクトログラフ１１０とを含む。照射部１２は容積素子を検査する各種多数の光源であり、検知部２４は選択された容積素子からの電磁放射の検知しまたは記録する各種装置を有している。通常、照射部１２は紫外線の下方から赤外線を越える範囲の波長の電磁放射を発生し、検知部２４と関連するデータ処理装置１１２とが、それぞれの又は連続するスペクトル情報を検知する。さらに、フィルタし加算し時間計算を行い微分し、さらに各種処理を行う信号処理装置が設けられる。詳細には、データプロセッサ１１２は訓練用試験片について分析、例えば多変数統計解析を行って関連変換マトリックスを求め、変換マトリックスを訓練用試験片以外の試験片に適用して関連する応答から多数の病理学的状態を得る手段も含む。

作動時に光放出ダイオード１０６は赤色検知または目標光を発生し、装置１０から放射される光で照射される試料１８内の一般的区域を識別する目視を助けるもので、目標または操作ビームとなり、装置１０を目標とする方向に指向することを容易とし、検査される選択された容積素子が位置する区域を限定し明確とする。適切なビーム操作装置，例えばイメージ又は特徴を狙うガルバノメータ制御の操向鏡を備え、変位に応答して１つ以上の操向鏡を制御する装置は公知となされている。白色光源１０２は広い波長範囲の光を生じ、窒素レーザー１０１とレーザーダイオード１０４とは特定波長の単色放射を発生する。例えば窒素レーザー１０１は波長３３７ｎｍの紫外線を発生し、レーザーダイオード１０４は波長７８０ｎｍの放射を行う。白色光源１０２は複数の波長の光を発生し、電磁スペクトルの広い範囲についての吸収と反射とを含む光学的応答を明確にするために有用である。

窒素レーザー１０１は容積素子４６内の材料を励起し蛍光を発生させる。目標容積素子から発生する蛍光の振幅と波長とは容積素子の重要な診断または分析特性を有しており、収集装置とデータ分析装置とが蛍光応答を使用して容積素子の病理学的情報を与える。白色光源１０２とレーザーダイオード１０４とは容積素子４６と選択的に作用し、放射に対する応答から病理学的情報が得られる。これら応答は散乱、吸収および反射特性を含む。本発明のいくつかの実施例において複数の光源に関連して図２に示した非イメージ容積マイクロプローベおよび図５に関連して説明した検知器を使用することにより、照射ビームに対する目標容積素子の応答の角度的空間分布が同様に分析目的に使用される。この応用例は、例えば流体またはゲル状の培養媒体中のバクテリアの成長過程の連続的監視、又は複雑な発酵過程の監視を含む。

図５の装置の検知部２４は目標容積素子４６から発する放射応答を分析する走査単色装置１０８とスペクトログラフ１１０とを含む。検知器２４が試料１８からの放射を最初にスペクトログラフ１１０およびモノクロメータ１０８に送る。スペクトログラフ１１０は収集した放射ビームを解析のためにスペクトルに分散し、モノクロメータ１０８は収集された分散したビームから特定区域のスペクトルを分離し、その強度その他の特性を決定する。スペクトログラフ１１０またはモノクロメータ１０８が特定の波長またはスペクトル領域を分離した後に、その後の分析が行われる。詳細には、検知部２４の系統は収集された放射に含まれる光の特定波長と該特定波長の特性とを決定する。特定波長の特性は、該波長の放射の強度、存在する場合は該波長における偏光の方向、および該波長における位相のずれ、がある。収集された放射の別の特性として、蛍光が存在する場合の蛍光の存続時間、特定の波長における放射ピークの波長のずれ、がある。

検出されたデータの制御、貯蔵および分析のため、図５には、検知器２４に連結されたデータプロセッサ１１２と、データプロセッサ１１２に連結されたメモリ装置１１４とがある。データプロセッサ１１２は例えば一般用プログラム可能のコンピュータであってよく、またメモリ装置１１４はデジタルメモリチップ、フロッピー、ハードディスク、磁気テープ、読み書きコンパクトディスクなどの電子記憶装置とする。データプロセッサ１１２は読み専用メモリを含んでよく、これが関連変換ベクトルまたはマトリックスのメモリを備えるが、前者は単純病理の自動的診断に使用され、後者は複数の病理の自動的診断に使用される。さらに、複数のコンピュータを設け、試料の組に名札をつけ、キーボード入力によって与えられるデータを付加し、関連変換を行い、記憶し、更新しまたは変換し、メモリに記憶するようにしてもよいが、これは後述する。

一般的に、本発明は収集した応答を少なくとも部分的に記録し、編集し、分析するように作用する。本発明の安価な実施例において病理の診断的予測のみが与えられる。すなわち、装置には特定診断状態の関連変換ベクトルまたはマトリックスのメモリが設けられ、単に信号Ｉ_ijを記録し、容積素子ｊに対する診断的記録Ｃ_jを得るに必要な関数Ｆ（Ｉ_ij）を計算するが、これについては以下に詳述する。

広い意味において、検知器２４の出力はデータプロセッサ１１２に供給され、データプロセッサは検知器２４の出力を処理し、又はデータをメモリ装置１１４に貯蔵して、後に処理する。データプロセッサ１１２は検知器１１２から得られた第１のデータとメモリ装置１１４からの第２のデータとを比較する。例えば、データプロセッサ１１２は検査した材料を示す第１のデータとメモリ装置１１４からの第２のデータとを比較する。本発明の望ましい実施例によれば第２のデータは工学的応答データのメモリ、または望ましくは該メモリから抽出された数学的モデルを含むが、これは「非イメージ容積マイクロプローベの方法論および作動」（Methodology and Operation of the Non Imaging Volume Microscope）と題する章に記載されている。

メモリ装置１１４は特定材料に関する大量のデータを記憶するために使用される。例えばメモリ装置１１４は生物学的組織の特定形式と作用する光の特性に関するデータを記憶し、光の波長のそれぞれの組において励起に応答する特定の形式の生物学的組織と作用する光の特性に関するデータを記憶し、または組織の深さによって索引をつけたスペクトルを記憶し、または従来の観察データから得られた複雑な多次元スペクトルデータを記憶する。

記憶装置１１４は特定の症状の生物学的組織試料から得られた光の特定の特性に関連する情報を記憶する。例えば、１つの波長において反射した光と第２の波長において反射した光との比を、既知の観察と関連する癌性組織の成長と関連して求め、または外科的に関連する状態、例えば組織の１つの層が厚くなること、前癌状態の代謝的変化、または悪性、などをスペクトルのメモリ及び以前の外科的特徴に関連して決定する。すなわち、注釈され又は記憶された数値化スペクトルとの関係は診断の判断を与えるもので、特定の個々のスペクトル特性の認識がなくても、ピークまたは吸収バンドが従来は診断に必要とされていた。

非イメージ容積マイクロプローベの方法論および作動
従来技術によれば複雑で異質の細胞間質のスペクトルおよび化学分析は、この対象物から得られる応答を高い均質性の区域に限定せきないという理由で妨げられていた。この問題を処理するために多数の微細プローベが開発され、電子顕微鏡、イオンマイクロプローベ、その他各種の装置が、形態学的およびある程度は化学的（通常は原理的）分析情報を、試料の点基準で、または面基準（例えばイオン顕微鏡）で与えるようになされている。しかし、これら方法は試料を真空中に配置する必要があり、結果として組織を破壊するものであり、さらに、これらの方法は有機材料の分析には使用できない。生物学的組織の生体微小分析は従来の古典的マイクロプローベとは相違する。詳細には、判別される組織の代表的寸法が大である必要がないが、その寸法は分析技術で特殊の訓練を受けている者、例えば外科医、プロセス制御技術者その他の専門家以外でも操作可能な分析工具を必要とすることが望ましい。本発明の非イメージ容積マイクロプローベによれば、生体の生物学的組織の微細検査、およびその他の組織の本来の環境における検査が実施可能である。この非イメージ容積マイクロプローベは各種の適用例があり、そのいくつかを以下に説明するが、本発明を限定するものではない。

本発明の一実施例において、容積素子内の材料と衝突する放射との相互作用が少なくとも特定の徴候を表す、容積素子からの応答が各種明確な波長または波長の組に対する、受取り光の強度の用語、または応答スペクトルで示される。特定の分析技術の訓練を受けた研究者はこのスペクトルを使用して容積素子に関する重要な情報を、入射する放射および放射と目標材料との相互作用に関する研究者の知識に基づいて認識しまたは演繹する。各種の分析手段、例えばスペクトルのピーク比較またはスペクトル分析を行うようになされたソフトウエアプログラムなどを直接に使用して、隠された相互作用に関する研究者の基本的理解を増加し且つ、目標容積素子に関する化学的、形態学的および生理学的性質に関する情報を与える。公知の基本的原理によれば本発明が研究者に与えるデータは、装置から直接に得られ、良く限定された容積素子から直接得られるもので、目標容積素子の外部から与えられる光の関連スペクトルを弱める応答または干渉は除去される。従って、大きい異質の試料内の特性を識別する能力を妨げるような背景ノイズが引き出されることはない。異質の試料から明確なスペクトルを得るこの能力により、本発明の非イメージ容積マイクロプローベは、収集した容積応答データを通常形式の比較的簡単な数値分析モジュールの入力として従来技術の吸収スペクトル分析、散乱分析、蛍光分析、ラーマン（Raman）分散その他の変数またはスペクトル分析を、不明確な又は不充分な信号の場合の複雑性を伴わずに、可能とする。

本発明の別の実施例において、観察された生データから意味のある結論を導く技術的能力を有しない使用者のために、装置は特定の分析作業のために本質的に予め較正されている。非イメージ容積マイクロプローベを較正する方法を以下に述べる。

説明を簡単にするために、本方法の目標を、ある状態、詳細には光学的視認が可能な組織、例えば外部皮膚、頚部内その他内視鏡または腹腔鏡によって近接可能な空所内などの組織のある状態、たとえば胃腸の経路（口から始まって、食道および胃を通り、直腸検査、大腸）、又は腹腔鏡検査によって近接可能の腹腔内の各種器官、にある状態が存在するか否かを診断する、非イメージ容積マイクロプローベを較正するものとする。これら状態において、スペクトロスコープの操作訓練を受けていない医師は疑わしい組織を見て、色彩消失その他の形態的異常が存在した場合その区域からのサンプルをとって顕微鏡検査のため病理学研究室に送り、癌が存在するか否かを決定し、癌の場合はその成長段階を決定する。本発明は目視検査のときに、疑わしい目標組織の病理学的性質を決定する光学的に得られた診断記録を提供し、必要の場合には直接活動を行うことを可能とし、いづれの場合にも生検のために組織を別に取るという必要はなくなる。さらに、本発明の非イメージ容積マイクロプローベ法は医師によって観察された組織の自動的診断を与えるもので、顕微鏡下による組織の検査を行う病理学者を必要としない診断を可能とする。

特定の病理学に対して本発明の非イメージ容積マイクロプローベを較正するため、該特定の病理学に対する試験片の訓練セットを選択する。ここで「訓練セット」とは組織試験片の一群をいい、各試験片は病理学研究室で以前に行った試験の状態を明確に示すものとなされる。さらに、生検を行うに先立って望ましくは訓練セットの各試験片と本発明の非イメージ容積マイクロプローベとを使用してスペクトル応答の記録を調査する。この場合、訓練セットの目標容積素子（この場合、組織はその後に病理学研究室で病理学状態の検査を行う）は図５に示す容積マイクロプローベで検査を行う。両者はレーザーＵＶ光源（１０１）と広バンド白色光源（１０２）との両者で照射される。ＵＶおよび白色光源に対する試験片ｊ内の目標容積素子の応答をＪ_ujおよびＪ_ijとする。ここに、ｕ及びｉはそれぞれ、ＵＶおよび白色光励起に対するスペクトル応答のスペクトル波の中央バンドの波長を示す。例えば、Ｊ_ujは蛍光で、Ｊ_ijは背景散乱応答であってよい。これらのデータはメモリ１１４に貯蔵され、後に使用される。訓練セットは非イメージ容積マイクロプローベで得た応答を記録した後に使用され、各試験片の病理学的決定は記録Ｃ_jとして記録され、ここにｊは試験片の識別であり、Ｃ_jは試験片の状態によって記録スケールとして選択された数、例えばゼロから１０までの単一軸上のスケールとし、０は正常の組織、１０は完全に根を下した重い癌の組織変化のものとする。この訓練セットは非イメージ容積マイクロプローベを較正し、訓練セットに存在するそれぞれの組織の病理学的状態が存在するか否かを将来判定することを可能とし、従って訓練セットの病理学的状態の決定には深い注意を払う必要がある。望ましくは、同一の試料を顕微鏡的に多数の病理学者によって独立的に盲検させ、各病理学者の議論において明確に識別できる試験片を訓練セット用として使用する。

試験片の記録Ｃ_jが決定されると、メモリ１１４に以前に貯蔵されたＩ_ujおよびＪ_ijが使用されて関係式が得られる。
Σａ_jＦ（Ｉ_ij）＋Σｂ_uＦ（Ｊ_uj）＝Ｃ_j （１）

白色光およびＵＶ光に対する収集された応答ｉおよびｕのそれぞれの狭いバンド幅の波長は通常５および５０ｎｍであるが、検知モノクロメータ１０８とスペクトログラフ１１０の解像度による。

関数Ｆの選択は受取る応答の性質にある程度よっている。ほとんど特徴のないスペクトル応答（すなわち、比較的平滑で、波長による変化が小である）を受けたとき応答強度、すなわち正常強度として Ｆ（Ｉ_ij）＝Ｉ_ijまたは、Ｆ（Ｉ_ij）＝Ｉ_ij／Ｋ が得られ、ここにＫは受取ったスペクトラム内の最大応答、または、望ましい波長（例えば、生物学的組織内で水またはヘモグロビンの存在するときの）に対する応答である。望ましいスペクトルが鋭い特性を有するとき、λを波長とし、Ｆ（Ｉ_ij）＝（ｄＩ_ij／ｄλ）Ｉ_ijとなる。

データプロセッサ１１２は次に回帰解析を行い、明確な関係式を得るため使用されたｉおよびｕの数を最小とし、関連定数のための式（１）を求める。実験的に得られたｊの式を使用し、関連定数を未知であるとして回帰解析を行うと最良の関係を有する解答がえられる。最小化は波長の最少数を与え、応答Ｉ_ij、Ｊ_ujは測定される現象に満足すべき関係式を与える。較正過程において絶対的な必要数より著しく多数のデータが集められ、これらデータの多くは互いに関連している。数学的に見れば、最少のセットはこれら組織の応答に基づいて定める。応答の最少セットが決定されると、その後の、非イメージ容積マイクロプローベの実際的の診断用の使用において応答の最少数（例えば狭い波長バンドの最少数の応答）を可能とし、処理を迅速とする。

波長および関連する係数ａ_jおよびｂ_uの最少数の組を得るための方法は従来技術で公知であり、多変数回帰解析および単変数回帰解析を含む。別の統計的方法、例えば中立ネットワーク解析も利用可能であり、この目的に使用可能となされる。この統計的手段は簡単なソフトウエアプログラムとして利用可能であり、商品名スタティスティカ（STATISTICA，Statsoft Inc.）または、プレディクト（PREDICT，Neural Ware Inc.）として入手可能である。

通常、白色光およびＵＶ光に対する応答はＩ_ij、Ｊ_ujとして示される。別の応答も容積素子４６を特徴づけるために使用される。詳細には、容積素子からのすべての応答をＲ_ijとして示すことができる。すなわち、メモリ内にＲ_ijを含むものとするが、容積素子に関する別の情報として、前述の非イメージ容積マイクロプローベでは決定されなかったが、観察された記録と診断される病理との関係の改善に役立つ別の情報もある。このような情報として、一般的な医学記録情報、例えば患者の類別、例えば非限定的に、性別、年齢、人種、体重などがある。このような情報は、回帰手法においてこれらを含むことが信頼性を高めるという点で改善するものであり、付加的な人工的応答Ｒ_ijとして記録する。ここに指数ｉは得られた応答の形式を示し、非イメージ・マイクロプローベから得られたか、他の手段、例えば外来の患者、通常人、データなどのいづれかを示す。
関連係数を与える式（１）を単純化すれば、次式が得られる。
Σａ_jＦ（Ｒ_ij）＝Ｃ_j （２）

単純化された式において、（ａ_j）は病理Ｃにに対する関連ベクトル（ａ）であり、整理した応答（Ｒ_ij）は訓練セットの容積素子ｊに対する応答ベクトル（Ｒ_j）である。機能的応答ベクトルＦ（Ｒ_ij）は応答ベクトル（Ｒ_j）内の応答素子の整理した関数として規定される。同様に、整理したスコア（Ｃ_j）は訓練セットに対する病理学的スコアベクトル（Ｃ）である。与えられた病理Ｃに対して非イメージ容積マイクロプローベを較正する方法は、従って、応答ベクトル（Ｒ_j）と対応する病理学的スコアベクトル（Ｃ）とのすべてを編集し、機能的応答ベクトルＦ（Ｒ_ij）を定めた後に、これらのデータに基づいて最小関連ベクトル（ａ）を決定し、これが非イメージ容積マイクロプローベの較正ベクトルとなる。これら数学的結果はメモリに記憶され、基本的ソフトウエアと共に新しい試料に適用される。

プローベの臨床的作動を次に述べる。較正された装置が訓練セット以外の容積素子（新しい容積素子はｋで示す）内の与えられた病理Ｃの範囲を決定するために使用され、応答ベクトル（Ｒ_k）が容積素子ｋに対して、および応答（Ｒ_ik）のいくつかは人工的応答（例えば医学的記録からの付加的データ、例えば性別、人種など）であるが、これらが装置によって決定され、データ処理装置１１２に入力され、容積素子ｋに対する病理ＣのスコアＣ_kが、関連ベクトル（ａ）と関数的応答ベクトルＦ（Ｒ_j）との積、すなわち、Ｃ_k＝Σａ_jＦ（Ｒ_ij）として得られる。従って較正された非イメージ容積マイクロプローベを病理学的状態Ｃ_kが不明の容積素子ｋに対して使用すると、容積素子ｋ内の病理学的状態Ｃの直接かつ自動的な検査と診断とが可能となり、観察された応答ベクトルに対して内蔵された数学的装置が作用する。

この技術の訓練をうけた人には、本発明の非イメージ容積マイクロプローベが複数の各種病状Ｐ_m、ここにｍは特定の病状を示す、の診断のために較正可能であることが理解されよう。このように使用するとき、複数の病状の診断のための較正は、ｉを応答または特定形式の人工的応答のバンド幅、ｊを訓練セット内の容積素子または試験片、Ｐ_mjを試験片ｊの病状ｍのスコアとしたとき、前述と同様にして、ｊの訓練セットと、応答Ｒ_ijと、スコアＰ_mjとが得られる。前述と同様に較正時に、特定の病状ｍに対して多数の関連ベクトル（ａ_m）を得る。較正された非イメージ容積マイクロプローベの作動時に上述関連ベクトル（ａ_m）は関連マトリックス｛ａ｝で置換えられ、その素子はａ_jmであり、非特性試験片ｋに対する機能的応答ベクトル｛Ｆ（Ｒ_k）｝はマトリックス｛Ｆ（Ｒ_k）｝で置換えられ、その素子はＦ（Ｒ_imk）であり、診断結果はベクトル（Ｐ）_kで示され、その素子はＰ_mkであって、関連マトリックス｛ａ｝と機能的応答マトリックス｛Ｆ（Ｒ_k）｝との積として与えられる。従って、１組の診断状態が確認されて適切な応答用訓練セットがこれらのマトリックスを作るように処理されると、各状態に対する診断結果が新しい試料に対して、容積素子応答に関して簡単なマトリックス作業によって自動的に計算される。

本発明の分析方法の実際的実施例において、つくられた相関関係は同一応答、または少なくとも部分的に重なる応答、例えば、限定された波長バンドの特定のセット内の検知された放射の大きさを、異なる病理症状のために使用する。従って、応答（Ｒ_k）（素子Ｒ_ikを有する）のベクトルが必要とされ、これは診断記録Ｐ_mkを得るために容積素子ｋからの応答の最少数のセットを含む。マトリックス｛ａ｝は関連変換マトリックスと名付けることができるが、これは１組の測定可能の値（または観測値）を別の組の数または値の組に変換するもので、これが所望の病理学的スコアとなされる。このことは、関連する変換マトリックス｛ａ｝をベクトル、すなわち機能的応答ベクトル｛Ｆ（Ｒ_k）｝に乗算して応答ベクトル（Ｒ_k）の診断スコア（Ｐ）_kベクトルへの変換を与える。

注目すべきことは、光軸方向（ｚ軸）の複数の隣接する容積素子をプローブすることによって、深さｚの関数としての病理ｍのスコアＰ_m（ｚ）をプロットして関連病理の浸透深さを求めることができる。同様に、ある区域の病理学的状態の人工的３次元イメージは、ｘｙ平面（非イメージ容積マイクロプローベの光軸に直角な平面）内の多数の隣接する容積素子について前述手順を繰り返すことによって得られ、グレイまたは色をそれぞれの容積素子に付することによって、診断されたスコアＰ_m（ｘ，ｙ，ｚ）を得ることができる。

前述のように、容積プローベが局限された区域からの応答を集めるから、試料内の「病理勾配」をプロットする本発明の方法は病気の組織内の成長過程を明確とし、この方法と各種環境組織との間の複雑な関係を明らかにする。

上述により明らかとなされた相関変換方法は未知の試験片に対して診断的または解析的情報を、訓練セットの該訓練セット内の診断的または解析的データの独立的決定についての光学的応答に関連せしめて、与えるもので、ローゼンタール（Rosenthal）によって、人工的に均質な試料内では良好に作用するが、試料は信号対ノイズ比を適切とするためには寸法が過大である。本発明によれば、類似の方法ではあるが、著しく小さい生体の容積素子に対して良好な相関関係を与える。従来のスペクトロスコープ法、例えばアルファーノ（Alfano）は病的組織のスペクトルまたは光学的応答を健全な組織の光学的応答と比較して、目標組織の診断結果を得ることを試みている。この方法は感知性が低く、装置は頑丈で生体の外科的適用に不適当であるが、これは装置と検査される組織との間に大きい寸法差があることによる。本発明は上述した相関変換方法を使用することにより、目標組織内のスペクトル応答と任意の実在の（健全なまたは病理学的）組織の応答との比較を意図的に避けるものである。単一の特定の組織は対象物に生ずるすべての変化を表すことができないものであり、複数の対象物間の変化はスペクトルを変形せしめ、このことが従来技術における病理の診断結果の信頼性を失わせる。さらに、本発明による相関変換アルゴリズムの一部としての、非光学的応答と光学的応答との組み合わせは、病理の完全に人工的なモデル（訓練セット）を設け、これは従来の技術に示されなかったものである。小さい容積素子に対する光学的応答の空間的フィルタリングと組合わされた本発明の新規な手段は、生体組織の状態の診断の予測を可能とする、著しい効果を奏する。

検知された光学的応答の強化された情報の内容はデータの組を解析するに有用であることが知られている別の処理レジメン（ｒｅｇｉｍｅｎ）によっても観察されている。すなわち、例えば特定の病状を評価する変換Ｔを求める上述した特定の関連レジメンよりも、ピーク合致、スペクトル回旋解析、スペクトル比例合致、自己標準化のいづれかによる変換を行ってよい。フーリエ変換解析、判別解析、線形単変数および多変数回帰解析、主要素解析および神経解析がある。上述実施例においてこれらの方法を適用して試料と貯蔵したデータの組とを比較し、または上述した誘導方法による貯蔵した変換Ｔを適用してもよい。

本発明によって得られた光学的応答の強化された局部情報の内容は状態の判別または識別を可能とするもので、量、例えば病状の明確なまたは確立された識別を与えるものでない。実際、僅かな相違、過渡的な代謝または循環系効果およびその他の状態が収集されたスペクトルデータに現れる。従って、検知された状態は火傷、壊死、炎症、組織の回復、移植組織片の回復、移植組織片の拒絶反応、傷害、癌、前癌状態、良性の増殖、良性の形成障害、腫瘍の１つ以上の組があって、特定の化合物の存在または集中があるとき、化合物が生ずる代謝物または代謝産物、治療用または禁止されている薬剤およびその代謝産物、およびその他の病理または病理状態がある。さらに、非生物学的材料または純粋化合物が使用されたとき、その応答は多様の物理的または物理化学的現象、例えばスペクトル変位、偏光性変化、一時的の偏位、スペクトル偏位、ゼーマン（Zeeman）分割、スターク(Stark)分割、位相の偏位、周波数のずれ、及び照射に関連して放射する光の強度の変化など、がある。

収集された光の性質も試料および光学系によって変化し、１つ以上の散乱した照射、伝達される照射、弱化された照射、反射した照射、ラーマン分散をした照射、照射によって刺激された蛍光、照射によって刺激されたマーカーおよび治療学的蛍光がある。基本的照射は広いバンド幅の光源でも、狭いバンド幅の光源でも、実質的に単色の光源でも、光放射ダイオードでも、レーザまたは周波数および／または振幅変調形式であってもよい。

例示的装置
特定の実施例についての説明として、図６Ａ、図６Ｂは膣鏡としての本発明の応用例を示す。

図６Ａにおいて、本発明の非イメージ容積マイクロプローベ２２０が通常の膣鏡２１０の患者側ダブテイル部に取付けられ、その照射および収集経路は膣鏡の対物レンズ経路に組み合わされ、従って膣鏡を見る婦人科医師は特定の組織の診断的スコアが所望される区域を目視し特定することが可能であり、区域は観察した表面およびその下方のある深さの区域を含む。この装置において膣鏡の有効作動距離は約３０ｃｍであり、光学的ヘッド２２０は膣鏡のハウジングに整合し、取り付けられて、膣鏡との安定した整合を保証し、小さい操作鏡が検査ビームを照射し受け取る。操作スティック２０１と連結された鏡とによって非イメージ容積マイクロプローベの光学的経路が操作可能となされるが、この光学的経路は通常、膣鏡の視野内にあって視野と重なっている。光学的ヘッドの設計は各側からの装着を可能として婦人科医師の利き手に適合させることができ、コロプローベ（商標名）が婦人科医師の使用する空間に侵入することがなく、生検用鉗子のように装置を使用することを妨げない。装置の残りの部分は約５ｍの長さの光ファイバで光学的ヘッドに連結される。これは装置のかさばる部分を遠く離すことを可能とする。

作動時に婦人科医師は予め較正した非イメージ容積マイクロプローベを使用する、すなわち、装置はそのメモリ内に前述した相関マトリックス｛ａ｝を有し、これが子宮頸部内の目標容積素子から集めた光応答と相関し、病理学的症状、非限定的に例えば、炎症、回復、高または低程度の鱗状上皮障害、または新生物の可能性を検査する。婦人科医師は非イメージ容積マイクロプローベを病理学的症状が疑わしい所望の区域に指向する。婦人科医師はさらに人工反応を求めてもよく、すなわち、年齢などの非光学的情報、閉経後であればその長さ、閉経前であれば月経サイクル中の期間、その他の非本質的な医学記録的な情報を入力させてよい。これら人工的な応答は別の変数に対応するもので、相関変換が作用する値となる。婦人科医師は次に、非イメージ容積マイクロプローベによる対象区域からの所望の応答の登録を開始し、これは疑わしい病理組織の深さに関するｚ方向走査を含む。装置は観察された応答をサンプルし、保持する、または局部的位置から複数のサンプルを自動的に取る。非イメージ容積マイクロプローベが手動的または自動的に必要な数の応答を取ると、相関変換が応答ベクトルに作用してこれを病理症状に対するスコアのベクトルに変換するが、これに対して装置は較正されている。これはプロセッサ１１２内で行われ、プローベでサンプルされたそれぞれの容積素子ｋに対して関数応答（Ｆ(Ｒ_k)）のベクトルが計算され、これにメモリ１１４内にあって非イメージ容積マイクロプローベの較正時に求めた相関変換マトリックス｛ａ｝が乗算される。

組織の容積限定強化信号収集装置の１つの原型が子宮頸部の癌の生検および子宮頸部の異常の識別的診断のために改良された。この装置は商標名コルコプローベ（ＣorpoＰrobe^TM）として販売され、図６Ｂに装置１０″′として示されており、診断用非接触医学的スペクトロ写真測定装置となされている。装置１０″′は、健康の各種状態の組織のスペクトル的特性を、例えば自動蛍光およびスペクトル・バックスキャタ測定を行うもので、容積素子の大きさは一辺が数百ミクロンまたは大となされ、膣内鏡の作動距離は代表的には３００ｍｍとして婦人科医の使用を容易としている。測定モードおよびデータ処理は以下の図面を参照して説明する。

図６Ｂはモジュール２２０の詳細を示す。複数のファイバー２０２が各種のソースすなわち検知器素子を連結しモジュール内に位置決めし、各種の位置スイッチおよびモータつき制御部が照射および収集ファイバー組立体を所望の焦点位置に維持し、試験片内における相互の重なりを制御して、選択されたプローベ容積を図３Ａないし図３Ｃに示すように限定する。光学的ヘッド２２０内のリレイ鏡組立体２２１がこれら素子を光学的経路内に連結し、各種光源および素子を別個に維持して、１つ以上の照射源の点滅を制御し、収集された光が干渉なしに検知組立体に導かれることを可能とする。曲がった連結鏡が共通の前面対物組立体としてアナライザーおよび光学経路目視のために設けられる。注目することは、基本的光源およびリレイすなわち連結ファイバに関し、すべてのビーム形成およびビーム指向素子は反射性で、色収差および回折は防止される。光源をそれぞれのリレイレンズに連結する各種ファイバーは比較的大径で、例えば１００−３００μｍであり、大開口の光源として作用する。ファイバーの端部はステップモータで横方向運動、および前進、後退して目標組織内の焦点深さの調節も可能となされている。

図６Ｂには装置１０″′の主要構成要素として光学的ヘッド２２０以外にスペクトル光源、スペクトル測定部、制御コンピュータ２４０、および解析ソフトウエアが示される。

コルコプローベ（装置１０″′）とコルポスコープとは波長選択照準鏡２３０で光学的に連結され、鏡２３０は操作スティック２０１で操作され、視野を妨げることはない。これは装置の不作動時に婦人科医の膣内鏡の操作が妨げられることを防止する、すなわち、膣内鏡は装置が取付けてない場合と同様に操作可能であり、目視的および機械的に邪魔にならない。作動時には装置は押しボタン操作によって照準または測定モードとなる。操作スティックは操作者が膣内鏡の視野内でマーカービームを使用して標本点を選択することを可能とする。そこで、測定モードが選択される。標本点が選択されると、装置の照準が固定され、深さ走査が目標点の上２．５ｍｍから下２．５ｍｍの範囲で行われる。

照準光は点灯状態で、従って正確な生検を選択された場所に行い得る。また、多数の生検を行う場合は光学的ヘッド内にマイクロフォンを設けて、それぞれの試料を取ったときに声でその都度識別できるようにする。

装置は４つの光学的チャンネルを有し、子宮頚部の各部について実施することを可能とする。照明チャンネル２３１が内部照射源からの光を子宮頸部に送り、目視データを戻すが、目視可能な別の影響を与えることはない。白色光チャンネル２３２は広バンドの５３００°Ｋの光を使用し、スペクトル後方散乱測定を可能とする。赤色光６３５ｎｍのチャンネル２３３がマーカービームを与える。これは目視可能の明確なスポットをつくり、照準を可能とするが、自動的追跡制御フィードバックループとして使用できる。３３７ｎｍのＵＶチャンネル２３４が蛍光を励起せしめ、後方散乱測定を可能とする。図６Ｂには、７８０ｎｍの第５のチャンネルも示され、スペクトル特性が測定される容積素子の位置の測定を可能とする。望ましい実施例において、この機能は赤色チャンネル２３３が行うようになされる。

図６Ｂは装置の概略図である。いくつかの光源による広いスペクトル範囲の光が使用されるから、屈折素子は光学系に使用されず、屈折素子に関連する２次スペクトルという問題は生じない。さらに、この光学系は通常の膣内鏡の付属品収納箱内に収納可能に包装できる。以下の説明は一般的に図６Ｂの左から右へ、および上から下に向かって行う。

光学的ヘッド２２０の主要素として、ミラーＭは放射ビームを対物レンズから約３００ｍｍ離れた子宮頸部に送り、必要なビーム操作部が設けられる。ミラーＭは概略的に、間隔をおかれた短い細線を有する斜めの太線で示される。さらに光学的ヘッドは、波長選択的ビーム混合器（２色性鏡）を有し、これは細線のない斜めの太線で示される。他の素子として、励起チャンネルのための深度スキャン機構と距離検知器とがある。

トランスミッタ・ブロック２５０が励起レーザー２５１（例えばレーザー・サイエンス社、ＶＳＬ−３３７ＮＤ−Ｓ）と、５３００°Ｋの白色光源２５２（例えばウエルシュ・アリン社、Ｍ２４Ｅ００１）とを含む。励起出力エネルギ測定モニター２６１と、走査単色装置２６２（例えばスペクトログラフ社製のモデルＭ４７９のマノスペック１８）が背景散乱白色光を解析する。励起源は窒素レーザーである。これは他の形式でもよく、１つ以上の励起波長を持ってもよい。

窒素レーザーは例えば２５パルス／秒で励起してよく、その５ｎｓパルスの間に白色光の照準および整列用光源がコンピュータ制御により独立にパルス放射を行う。

レシーバ・ブロック２５０は、照準および位置監視チャンネル源２５３例えば６３５ｎｍレーザーダイオードと、位置監視レシーバ２６１と、３３７ｎｍバックスキャタ・レシーバ２６２と、蛍光スペクトル分析器２６４、例えばアクトンスペクトロ(Acton Spectro 150)および強化ＣＣＤ検知器（パッケージモデル CCD 567 MGE）を有する多チャンネル分析器（プリンストン社(Princeton Instrument)社）を含む。

制御コンピュータ２４０が、例えばナショナル・インスツルメント社製のソフトウエアを使用して、各種副組立体の作動を総合する。コンピュータはシステムの作動を制御し、数値化し、生データを将来の分析のために記憶する。さらに、制御コンピュータ２４０のプロセッサとメモリは図５のプロセッサ１１２とメモリ１１４の機能を行う。

図７は本発明による光学的プローベ・モジュール３００の別の実施例を示す。モジュール３００は前述基本的光学ビーム限定素子を収容する単一のハウジング３１０内に配置され、入力及び出力光ファイバ３１３、３１１によって装置の照射および検知部分にそれぞれ連結される。装置３１０はｘｙｚステージに取付けられ、コンピュータが入力ビーム、スペクトル選択、装置の試料上でのステップ運動、および受取った照射の分析、例えばそれぞれのプローベに対する数百の測定の分析の記録、を短い時間で行い、試料全体についてのスペクトル形状の図面を与える。

図８は本発明による、初期癌検査用の非イメージ容積プローベを示し、癌は粘膜組織に始発したもので、装置は体内空所の上皮粘膜内の新生物からの自己蛍光信号を検知し、下方の基質からの干渉信号を除去する。図８の実施例は２つの波長、３３７ｎｍと４６０ｎｍの自己蛍光を検知する。照射器８１２は３３７ｎｍのパルス窒素レーザーで、４６０ｎｍのダイ・レーザーモジュール８１３を有する。シャッター機構８１４がコンピュータ８４０で制御されて２つの励起波長を切換え、シャッタ機構８１５が、長波長光学的遮断フィルタ８２６を４６０ｎｍ励起の場合にコレクタ光学経路に入れる。光学的フィルタ８２６は、４６０ｎｍより長い波長の蛍光を通過せしめるが散乱光が収集スペクトル判別器８２７と検知器８２８に入ることを防止する。光学的フィルタ８１７は３３７ｎｍ励起放射を阻止するが、長い波長の蛍光は通過せしめる。光検知器８８２が励起レーザーの出力を監視し、収集された信号の各パルスの比較を与え、これはレーザー照射器出力の変化を示す修正信号によって行う。蛍光の強度は、照射パルスの強度によって定まり、該パルスは約５ｎｓ（ナノ秒）の存続時間を有し、電気的パルスストレチャ８３１、８３２が蛍光の短いパルスによる出力電気信号を長くして、信号プロセッサが各パルスのエネルギを正確に決定し得るようにする。この装置のスペクトルの広いバンド幅は、色収差を正確に制御することを必要とし、全反射性光学素子の使用によって達成される。光を効果的に走査モノクロメータと光ファイバ８３２とに連結するために使用される鏡８２６、８３４を非軸パラボラ素子とする。光学的ヘッド８１６は長い作動距離と高い数値の開口を有するから全反射性顕微鏡対物レンズとする。光ファイバ８３２がヘッドへの励起照射と検知器光学的経路内へのヘッドからの蛍光とを連結する。照射および収集の光学的経路はビーム分割器８１０が行う。

さらに、この装置は望ましい実施例において視野ストッパとして、多数モードファイバ８３２の端部が対物体８１６に近接して配置され、第１および第２の視野ストッパとして作用する。この配置は図６Ｂの実施例と異なり、これは別の多数モードファイバが第１および第２の視野ストッパとして設けられる。

図９Ａおよび図９Ｂは照射組立体の変形例を示す。複数の入力伝達ファイバ３１３ａ、３１３ｂ・・・が半径Ｒの円筒形形状のまわりに螺旋状に配置され、各ファイバの面は先行するものから短い距離Ｌだけ偏位しており、その出力は軸線方向Ａとなされる。半径Ｒの円筒は例えば大開口の収集ファイバ、または筒、リングなどの機械的素子であってよい。その他の組合わせは当業者に容易である。多数のファイバ３１３からの出力ビームは単一の対物レンズ３０１により試料３２０のそれぞれのプローベ容積区域に合焦される。図９Ａは２つのファイバ端部３１３ａ、３１３ｂからの出力ビームを示し、その外方端（１、２として示す）はそれぞれ、試料内の別個のプローベ容積に合焦される。図９Ｂは対応するプローベ容積の区域内の試料の詳細を示す。それぞれの対応するプローベ容積３４０ａ、３４０ｂ・・・は半径 Ｒ′＝｜ｍ｜Ｒ で示され、｜ｍ｜は対物装置の拡大倍率である。さらに、各プローベ容積は、ｚ軸に関して偏位しており、プラグ状のプローベ容積の周りに螺旋形に側方に僅かに変位しており、ｚ軸偏位はｍ²Ｌ で示され、Ｌはもとの伝達ファイバの軸方向ステップ間隔である。従って、ファイバの固定配列は試料３１２内の複数の異なる深さにサンプル採取プラグを配置する。これは固定的であり、ファイバ端部と対物レンズ３０１との間に一定の間隔を与え、組織の異なる層内のサンプル採取は正確で、装置３０１の安定性とは実質的に無関係である。この特性は組織の深さ解析スペクトル分析の再現性を著しく高める。端部鏡の実施例において照射および集光組立体は良好な焦点を達成し、プローベ端部は対象物間隔を限定し、光学系の一部を形成する。

各種光学的形態が、望ましくない上方信号の効果的な除去を伴って非イメージ容積プローベ形態を達成する。図１０Ａは一つの実施例を示し、照射および集光ビーム４４′、４８′はそれぞれ本質的に平行となされる。この場合、平行視野ストッパＦＳが集光窓の幅を限定し、交差角度が容積素子の寸法と縦横比に影響を与える。

非イメージ容積プローベ装置の別の実施例において、照射および集光ビームは交差してよく、また共通の視野ストッパＦＳを使用してもよいが、共通の対物レンズ組立体を使用する。これを図１０Ｂに示す。ここで、光源１２と検知器２４とがそれぞれ斜めに指向されてストッパＦＳと交差するが、対物組立体２１はその明瞭なアパーチャの異なる部分ａ、ａ′が照射と集光とに使用される。バッフルＢが分割された対物開口の２つの明確に区分された区域を規定する。フィールドストッパＦＳの試料１８内のイメージにおいて、２つのビームは交差して、安定的に整合する分割共役容積素子を限定する。別の通常の対物組立体の開口分割法も使用可能であり、例えば小さい鏡を使用して別個の光学的経路をつくり、２つの別個のフィールドストッパを通して対物レンズの別の位置に導くようにしてもよい。

別の実施例として対物組立体に複数の開口すなわち瞳部を設け、間隔をおかれて配置された瞳部を照射および検知に使用する。図１０Ｃ、図１０Ｄはこの実施例を示し、非対象に交差するが干渉を防止するビームを使用している。対物体の開口を単純に分割すると、分割された２つの部分の隣接する分割部が深度解析に有効でなくなるから、マスクＭを対物体１６内に設けて瞳部をＮ組の直径的に対向する副瞳部（２Ｎ個）の対（Ｐ_na、Ｐ_nb、・・・Ｐ_nn）に分割し、各対は１つの自己結合ストッパ、例えば図９Ａ、９Ｂに示すファイバ端つきストッパに連結されている。これで、散乱によって生ずる混信は最小となるが、対物体１６の直径だけ間隔をおかれたものとすると、交差ビームによる深度解析は最大となる。Ｎ組の瞳部が任意所望の配列に配置され、Ｎ個の読みが同時に得られる。図１０Ｄは瞳部のマスクＭの配置を示し、これは瞳部の組をレンズ上に限定する。マスクした瞳部を有する単一の対物体でそれぞれの対物体を代替してもよいが、これには複雑な整合作業が必要であるが、収差の影響は小とある。重要なことは、それぞれの対物小レンズをマイクロレンズとしてよく、マイクロレンズは内視鏡などの小器具に対する空間的および焦点的制約に適合する。内視鏡としての実施例を図１１に示す。

本発明のさらに別の実施例として第２の、または別のフィールドストッパが分散素子と組合わせて使用され、ホログラフ的または屈折対物レンズの残留色収差を修正する。通常、広いスペクトルバンド幅蛍光同焦点顕微鏡のための最良の対物レンズは色収差に対して良好に修正されている。これらは約３００ｎｍないし１０００ｎｍ以上の広い範囲のについて一定倍率の良好なイメージをつくる。しかし、この良好なレンズも過大な「２次スペクトラム」をスペクトル範囲の一部に含む。２次スペクトラムはレンズの位置に関係的なイメージの軸方向位置の波長依存的ずれである。大きいフィールドストッパでもイメージのずれは２つの悪影響すなわち、（１）変位したイメージから始発する焦点外れの光束は、急速にフィールドストッパより大となり、エネルギのロスがある、（２）同焦点状態のロス（ＦＳ₁およびＦＳ₂）によって背景識別の低下および深さ識別能力の低下が生ずる。部分的にこの理由により、前述装置は本発明の広スペクトルバンド幅装置の反射性対物体に依存している。しかし、ビーム分割器の一部として分散素子を使用することによって、第２のフィールドストッパＦＳ₁を第１のフィールドストッパに共役する正しい位置に配置することができる。図１０Ｅに示すように収差補正分散素子ＤＥは集められた光をそれぞれのビームλ_iに対して別々の位置に配置する。それぞれのビームλ_iは対応するファイバー端部ＦＳ_iに連結され、これが第２のフィールドストッパとして作用してそれぞれのλ_iに対する正しい共役位置に配置されている。分散素子は、例えばホログラフ的に形成された素子、プリズムまたは従来の伝達または反射格子とする。

本発明によるプローベの別の実施例として、内視鏡その他の接触または内部遠隔検知応用例がある。この実施例を図１１に示す。この場合、照射ファイバと受取ファイバとはそれぞれ長い本体５００を通り、（これは通常のカテーテルでよい）、イメージヘッド５１０に到達する。イメージヘッドは本体またはカテーテルの端部に位置する。ヘッド５１０は活性焦点合わせ光学系、例えば１つ以上のロッドレンズとし、プローベ容積の深さに合わせることができる。望ましくは、内視鏡としての例えば図９Ａに示す実施例においては、光入力は、照射ファイバ５１３ａ，・・・の別個の１つに与えられるが、これらは装置の外部であるからイメージヘッド内の光学系の運動を必要としない。この装置は堅く完全に内蔵したものとすることができ、組織表面に対して滑らかに曲がった接触面を呈する。
広いスペクトル幅が必要でなければ、回折ロッド(グリンレンズ(GRIN lense))が光ファイバに有利に連結され、簡単な光学的連結が可能となり、短い焦点距離は人体内の組織に対する内視鏡操作を容易とする。図は複数の螺旋形に配置された入力光ファイバからの光を受けるレンズ５１４を示す。

上述実施例のそれぞれにおいて、プローベ容積は照射およびイメージ用ビームの交差によって限定され、大きい信号強度を与え、刺激、散乱、反射、蛍光、および組織の陰の区域からあつまる光は効果的に除去される。大きい照射ストッパがプローベ容積内に所望の強さの照射を与え、良好なスペクトル測定を行うことができる。

本発明の各種実施例において、部分的に有利なものもある。これら実施例としては、照射および収集光学系が反射性、下方二重性、スペクトル変形軽減性のものがある。さらに、照射および収集フィールドストッパが物理的に同一素子であるものもあり、収集ビームが共通のフィールドストッパを通った後に照射ビーム経路から分離されるものもある。別の実施例では多数モードの光ファイバを照射フィールドストッパとして使用する。位置の変化する対象物を検査するに有利な実施例として、フィールドストッパを照射および収集光学系のそれぞれの光軸に沿って制御された併進運動を行うようにする。対象物を光軸に沿って運動せしめてもよい。

本発明は特定の望ましい実施例に関連して、及びいくつかの例示的な使用方法を説明したが当業者には理解されるように、形状および細部に関する各種変形例は、本発明の精神および範囲内において実施可能である。本発明を理解すれば、改変例、変形例は容易であり、これら改変例、変形例は請求の範囲によって限定される本発明の範囲内である。

図１は本発明による容積検査装置のブロック図。 図２は本発明による容積検査装置の概略図。 図３Ａは装置の光経路と、観察可能な容積素子を限定するための整合を示す図。 図３Ｂは装置の光経路と、観察可能な容積素子を限定するための整合を示す図。 図３Ｃは装置の光経路と、観察可能な容積素子を限定するための整合を示す図。 図４は本発明による容積検査装置の別の実施例の概略図。 図４Ａは図４の概略図を実施する実際の装置の概略図。 図４Ｂは図４Ａの装置の光経路を示す図。 図４Ｃは図４Ａの装置の光経路を示す図。 図５は本発明による容積検査装置の多波長実施例の概略図。 図６Ａは膣鏡に好適な実施例を示す図。 図６Ｂは膣鏡に好適な実施例を示す図。 図７は試料の３軸走査を行うに適した実施例を示す図。 図８は筋肉組織の上皮に限定される新生物を検出する実施例を示す図。 図９Ａは静止の照射光がＺ軸走査を行う装置を示す図。 図９Ｂは静止の照射光がＺ軸走査を行う装置を示す図。 図１０Ａは照射および集光装置の別の実施例を示す図。 図１０Ｂは照射および集光装置の別の実施例を示す図。 図１０Ｃは照射および集光装置の別の実施例を示す図。 図１０Ｄは照射および集光装置の別の実施例を示す図。 図１０Ｅは照射および集光装置の別の実施例を示す図。 図１１は子宮検査装置としての実施例を示す図。

Claims (30)

1. 特定の材料標本の特性Ｐを電磁放射と前記標本との相互作用により決定する方法において、
   ａ）独立した分析により決定されて前記特性Ｐを処理する前記材料の試験体から成る訓練用集合を蓄積する段階と、
   ｂ）前記訓練用集合の各試験体の少なくとも１つの画定された体積要素から光学反応を得る段階と、
   ｃ）少なくとも前記ｂ）段階で得られた光学反応の副集合と前記ａ）段階で決定された特性Ｐとの間の相関変換Ｔを引き出す段階であって、前記変換のオペランドとして必要なｎ_p個の反応を決定することを含む段階と、
   ｄ）前記標本の少なくとも１つの体積要素からｎ_p個の光学反応を得る段階と、
   ｅ）前記ｃ）段階で決定された相関変換Ｔを前記ｎ_p個の光学反応に応用して前記標本の前記体積要素の特性Ｐを表す出力を生成する段階とを備え、
   ｆ）体積要素の各反応が、
   ｉ）第１の視野絞りを有した照明光学素子を介して前記体積要素を照明し、該第１の視野絞りの寸法が該第１の視野絞りから測定される前記照明光学素子の作動開口数で割った照明放射の波長の商に比較して大きく、
   ii）第２の視野絞りを有した収集光学素子を介して前記体積要素から光学反応を収集し、該第２の視野絞りの寸法が該第２の視野絞りから測定される収集光学素子の作動開口数で割った光学反応の波長の商に比較して大きく、且つ
   iii）前記２つの視野絞りを前記体積要素を介して互いに少なくとも部分的に光学的接合するように配置して、前記第２の視野絞りを介して収集された反応が前記の如き体積要素から放射する光に実質的に限定されるようにして得られることを特徴とする特定の材料標本の特性Ｐを電磁放射と前記標本との相互作用により決定する方法。
2. 前記ａ）段階乃至ｃ）段階が最初に実行されて前記変換Ｔを決定し、更に、前記変換Ｔを器具内に記憶する段階を含み、その後特定の標本の特性Ｐを決定する工程がｄ）段階を実行して光学反応を得るとともに、該得られた光学反応に前記記憶された変換Ｔを応用することで実行されることを特徴とする請求項１に記載の方法。
3. 前記特定の標本が生物学的標本であり、且つ、前記特性Ｐが病的条件であることを特徴とする請求項１に記載の方法。
4. 前記材料が非生物学的物理処理される材料であり、且つ、前記特性Ｐが存在のランク、条件の測定、物性の大きさ及び構成要素の濃度の少なくとも１つであることを特徴とする請求項１に記載の方法。
5. 前記変換Ｔを応用する段階が前記特定の標本の分布位置からの反応に応用して前記試験体中の特性Ｐの分布地図を作成することを特徴とする請求項１に記載の方法。
6. 前記特定の標本が生物学的標本であり、且つ、前記特性Ｐが病的条件でない医療記録データを含んでいることを特徴とする請求項１に記載の方法。
7. 前記特定の標本が生体内組織標本、生体外組織標本、能動的生物学的処理の局部体積、能動的化学反応の局部体積、物理的処理の局部体積、深さ分解移植片生活能力標本、薬物摂取標本及び酸素灌流標本から成る集合から選択されることを特徴とする請求項１に記載の方法。
8. 前記相関変換Ｔが、複数の反応に作用して前記特性の範囲の大きさまたはランクを生成する（ｉ）ベクトル及び複数の反応に作用して特定の標本に存在する複数の異なる特性Ｐ_iの各々の大きさまたはランクを生成する（ii）マトリックスから選択されることを特徴とする請求項１に記載の方法。
9. 前記光学反応が前記材料中の対物レンズ組立体により撮像されるマルチモードファイバの端部を介して照明するとともに標本からの光を集光することにより得られることを特徴とする請求項１に記載の方法。
10. 前記蓄積する段階が
    生体内組織に照明を指向し且つ該生体内組織からの光学反応を収集するとともに記憶する段階と、
    前記光学反応が得られた組織の病理学的ランクを正確に決定する段階と、
    前記訓練用集合から前記相関変換を引き出す前に、追加の生体内組織標本に対して前記の指向、収集及び記憶段階及び正確に決定する段階を繰り返し行って前記訓練用集合を形成する段階とを含むことを特徴とする請求項１に記載の方法。
11. 生体内組織を診断して一定の条件を求める方法において、
    生体内で診断される組織内の画定された体積要素の周りの限定領域を選択的に照明して該画定された体積要素を光学的に刺激し、前記画定された体積要素から光を集光し、光の集光が前記画定された体積要素から優先的に放射する光に実質的に限定されて、集光された光が選択照明に対する前記体積要素の反応を形成するようにする段階と、
    前記反応を検出して前記画定された体積要素から受けられた前記反応を表す検出信号を形成する段階とを備え、
    前記検出信号が複数の波長の各々の波長で前記画定された体積要素から放射する光の光度を実質的に表して前記要素の特性を特徴付けることを特徴とする生体内組織を診断して一定の条件を求める方法。
12. 更に、
    前記検出信号に変換を応用して前記測定信号と相関する変換信号値を生成し、該値が前記画定された体積内で生じる条件の存在、度合い及び激しさの少なくとも１つのランクである段階を含んでいることを特徴とする請求項１１に記載の方法。
13. 更に、
    前記検出信号を記憶する段階を含み、前記変換を応用する段階が前記変換を医療記録データで補足される前記記憶された検出信号に応用することを特徴とする請求項１２に記載の方法。
14. 標本内の一定の部位を特徴付ける方法において、
    前記部位の前記標本に指向された第１の光学路に沿って前記標本を照明する段階と、
    前記標本内に焦点を合わせた第２の光学路に沿った前記標本からの放射を集光して、前記第１の光学路及び前記第２の光学路の交差が前記第１及び第２の光学路の双方のピーク領域に配置された選択された体積要素を画定するようにして、集光された放射が前記体積要素から放射する照明に対する反応を選択的に表すようにした段階と、
    集光した放射を分析して該集光した放射内のスペクトル情報から決定可能な前記選択された体積要素の特徴を決定する段階とを備え、
    前記分析する段階が記憶したマトリックス変換を少なくとも前記集光した放射の一部に応用して前記体積要素中で生じる１つまたは１つ以上の処理の存在または範囲を直接に特徴付ける出力を生成することを含んでいることを特徴とする標本内の一定の部位を特徴付ける方法。
15. 自然環境にある物質の一定の条件を測定する測定方法において、
    物質の試験体を照明し且つ自然環境にある該試験体からの光学反応を収集して、該光学反応が軸線に沿って局在する前記試験体内の副体積から実質的且つ優先的に引き出されるようにする段階と、
    前記光学反応を検出するとともにデジタル化して複数の値として前記反応を表す段階と、
    自然環境光学反応及び該自然環境光学反応の各々について該反応が得られた材料中で支配的である条件の専門的評価から形成された訓練用集合から引き出される変換を記憶する段階と、
    前記記憶された変換を前記試験体からの前記複数の値に応用して前記条件を識別する出力を生成する段階とを備えることを特徴とする自然環境にある物質の一定の条件を測定する測定方法。
16. 前記自然環境が生きている組織環境であり、前記光学反応が前記生きている組織中の局部体積要素のみから実質的に放射するとともに、該局部体積要素を表すことを特徴とする請求項１５に記載の測定方法。
17. 前記局部体積要素が組織深さのｚ軸線に沿って局在していることを特徴とする請求項１６に記載の測定方法。
18. 前記照明及び収集する段階が、
    （ｉ）下部または上部を除外した組織層及び
    （ii）隣接する組織を実質的に除外した組織の極巨視的体積要素の少なくとも一方を忠実に表すサイズを有する局在した支持体からの反応を収集することを特徴とする請求項１６に記載の方法。
19. 更に、
    走査を行い前記組織を横断して分布した局在した体積要素を抜き取って前記組織中の前記条件のプロフィールを発達させる段階を含んでいることを特徴とする請求項１６に記載の方法。
20. 前記照明及び収集する段階が非回折限定照明で実行され且つ前記組織の処理のサイズに寸法的に対応する体積要素からの非撮像方法による照明に対する反応を収集することを特徴とする請求項１６に記載の方法。
21. 組織からのスペクトルデータを検出する方法において、
    第１の光学路の第１の領域から実質的に単調に落下して離間する前記組織の第１の強度分布で前記組織内へ照明を指向する段階と、
    光学素子を前記組織内へ指向し且つ第２の光学路の第２の領域から少なくとも第２の方向に沿って実質的に単調に落下して離間する収集分布の効力で自身から放射する光を集光し、前記第１及び第２の光学路が重畳している段階と、
    前記照明及び集光が前記第１の光学路及び前記第２の光学路を１次元において関心の組織特徴に対応する非点状の体積要素中で重畳するように整合して、前記集光された光が前記関心の組織特徴の前記照明に対する光学反応を選択的且つ実質的にに表すようにした段階とを備えていることを特徴とする組織からのスペクトルデータを検出する方法。
22. 更に、
    集光した光を処理して０．１より大きな信号ノイズ比を達成する段階を備えていることを特徴とする請求項２１に記載の方法。
23. 照明及び収集効力の落下が強力に弁別を行い、前記体積要素の外側の領域からの光の積分寄与により生じるノイズを前記体積要素の内側からの光学反応の約半分未満に効果的に制限することを特徴とする請求項２１に記載の方法。
24. 電磁放射と標本の体積要素との相互作用を決定する方法において、
    ｉ）第１の視野絞りを有した照明光学組立体を介して前記体積要素を照明し、該第１の視野絞りの寸法が該第１の視野絞りから測定される前記照明光学素子の作動開口数で割った前記照明放射の波長の商に比較して大きい段階と、
    ii）第２の視野絞りを有した収集光学組立体を介して前記体積要素から光学反応を収集し、該第２の視野絞りの寸法が該第２の視野絞りから測定される収集光学素子の作動開口数で割った光学反応の波長の商に比較して大きい段階と、
    iii）前記２つの視野絞りを前記体積要素を介して互いに少なくとも部分的に光学的接合するように配置して、前記第２の視野絞りを介して収集された反応が前記の如き体積要素から放射する光に実質的に限定されるようにする段階とを備えていることを特徴とする電磁放射と標本との相互作用を決定する方法。
25. 前記照明及び収集光学組立体が同一であり、且つ、前記反応が部分的に反射をする鏡、波長選択鏡、プリズム及び格子の少なくとも１つを備えたビームスプリッタにより分離されることを特徴とする請求項２４に記載の方法。
26. 前記照明及び収集光学組立体が同一であり、且つ、前記反応が開口組立体により前記照明から分離されていることを特徴とする請求項２４に記載の方法。
27. 前記２つの視野絞りが前記接合が部分的且つ共有されるように配置されていることを特徴とする請求項２４に記載の方法。
28. 少なくとも前記第１の視野絞りがマルチモード光学ファイバの出力端であることを特徴とする請求項２４に記載の方法。
29. 患者の生体内組織を特徴付けて少なくとも１つの条件／病状Ｐを決定する方法において、
    組織の訓練用集合、該組織の条件／病状ランク及び前記組織から収集された照明に対する反応から光学データを条件／病状と相関させる相関変換を決定する段階と、
    特徴付ける試験体内の局部体積要素を、該局部体積要素から放射する前記照明に対する光学反応を優先的に収集する器具で選択的に照明する段階と、
    前記光学反応に前記相関変換を応用して前記組織の局部体積要素内に存在する前記条件／病状の程度を示す試験体ランクを生成する段階とを備えていることを特徴とする患者の生体内組織を特徴付けて少なくとも１つの条件／病状Ｐを決定する方法。
30. 更に、
    患者に関係する医療記録データを入力する段階を含み、前記相関変換を応用する段階が前記光学反応と一緒に前記変換を前記医療記録データの少なくとも一部に応用し、且つ、前記決定する段階が前記訓練用集合内の前記医療記録データを少なくとも部分的に参照して前記変換を決定することを特徴とする請求項２９に記載の方法。

Images