JP2006136232A

JP2006136232A - 穀物の遺伝子増幅法

Info

Publication number: JP2006136232A
Application number: JP2004328070A
Authority: JP
Inventors: Koichi Kojima; 浩一児嶋; Naoyuki Nishimura; 直行西村
Original assignee: Shimadzu Corp
Current assignee: Shimadzu Corp
Priority date: 2004-11-11
Filing date: 2004-11-11
Publication date: 2006-06-01
Anticipated expiration: 2024-11-11
Also published as: JP4670318B2

Abstract

【課題】簡便で効率がよく、且つ操作を行う者の熟練度に関わらず高い再現性を有する穀物の遺伝子増幅法を提供する。
【解決手段】穀物粒の水洗浄液を直接に試料として用いて、穀物の遺伝子を増幅する遺伝子増幅法。穀物がコメ類である場合には、穀物粒の水洗浄液は、コメの水洗浄液である。単一の個体に由来する一粒又は複数粒の穀物粒から得られる水洗浄液を用いることができる。複数の個体に由来する穀物粒から得られる水洗浄液を用いることもできる。また、穀物粒の糟糠及び／又は胚芽を直接に試料として用いて、穀物の遺伝子を増幅する遺伝子増幅法。穀物がコメ類である場合には、穀物粒の糟糠及び／又は胚芽は、コメの糠及び／又は胚芽である。単一の個体に由来する一粒又は複数粒の穀物粒から得られる糟糠及び／又は胚芽を用いることができる。複数の個体に由来する穀物粒から得られる水洗浄液を用いることもできる。
【選択図】図１

Description

本発明は、穀物の遺伝子増幅法に関し、特に、遺伝子を解析、若しくは遺伝子を操作することを目的に、穀物の遺伝子を増幅する方法に関する。

生体試料を用いて遺伝子増幅を行う場合には、それに先立って、遺伝子の増幅反応を阻害する色素、たんぱく、糖類、あるいは未知の夾雑物を取り除き、生体試料から遺伝子を担う物質である核酸を抽出する操作が必要である。

生体試料から核酸を抽出する方法として、生体試料をプロテネース等の酵素を用いて処理した後に、フェノール／クロロホルムによる除蛋白、エタノール沈殿による脱塩・濃縮を行うフェノール抽出法が一般的である。また、生体試料が植物である場合には、植物に多量に含まれる糖鎖成分を除去する必要があり、ＣＴＡＢ（Cetyl trimethyl ammonium bromide）法が用いられることもある。

例えば、特開２００１−９５５８９号公報には、特定の対合プライマーを用いて、コメ試料から抽出したＤＮＡを鋳型とするＰＣＲ法を行い、品種間の識別性の現れるバンドのみを増幅させ、電気泳動により検出することを特徴とするコメ試料の品種判別方法が開示されている。しかしながら、この方法では、ＰＣＲ法を行うのに先立って、フェノール抽出法、ＣＴＡＢ法等によって、コメ試料からＤＮＡを抽出する工程が必要である。

また、特開２００４−１４１０７９号公報には、イネの交配系統に同一品種を５回以上戻し交配することによって育成した同質遺伝子系統を対象とし、試料である当該イネ植物体、種子等から抽出・精製した鋳型ＤＮＡに、当該同質遺伝子系統に特異的なＤＮＡに含まれる塩基配列と相補的な塩基配列を有する識別用プライマーを共存させてＰＣＲを行い、増幅したＤＮＡの種類によって、試料中の同質遺伝子系統の有無を識別するとともに、試料中の同質遺伝子系統同士を互いに識別することを特徴とするイネの同質遺伝子系統識別法が開示されている。しかしながら、この方法では、ＰＣＲ法を行うのに先立って、ＣＴＡＢ法等によってコメ試料からＤＮＡを抽出する工程が必要である。

特開２００１−９５５８９号公報特開２００４−１４１０７９号公報

しかし、上記いずれの核酸抽出法も非常に煩雑で手間がかかる方法であり、遺伝子増幅や遺伝子解析等を多数の検体に対して行う場合には非常に効率が悪い。また、煩雑な操作を要することから、操作を行う者の熟練度によって、調製される核酸の質や量が不均一となり、再現性を要求される研究には不向きである。

本発明の目的は、簡便で効率がよく、且つ操作を行う者の熟練度に関わらず高い再現性を有する、穀物の遺伝子増幅法を提供することにある。

本発明者等は、上記の問題を解決するために鋭意検討した結果、穀物粒の水洗浄液を反応液に直接に添加して遺伝子増幅を行うことにより、また、穀物粒の糟糠及び／又は胚芽を反応液に直接に添加して遺伝子増幅を行うことにより、上記課題が解決されることを見出し、本発明に到達した。

本発明は、穀物粒の水洗浄液を直接に試料として用いて、穀物の遺伝子を増幅する遺伝子増幅法である。
本発明において、「直接に」とは、「遺伝子増幅に先立って、生体試料から、核酸を精製、抽出する過程が不要である」という意味である。
本発明において、「試料として」とは、「遺伝子増幅反応において、反応液に添加する鋳型ＤＮＡ、若しくはＲＮＡとして」という意味である。

本発明は、前記穀物粒の水洗浄液が、コメの水洗浄液である、前記の遺伝子増幅法である。

本発明は、前記穀物粒の水洗浄液が、単一の個体に由来する一粒又は複数粒の穀物粒から得られる、前記の遺伝子増幅法である。

本発明は、前記穀物粒の水洗浄液が、単一のイネの個体に由来する一粒又は複数粒のコメから得られる、前記の遺伝子増幅法である。

本発明は、前記穀物粒の水洗浄液が、複数の個体に由来する穀物粒から得られる、前記の遺伝子増幅法である。

本発明は、前記穀物粒の水洗浄液が、複数のイネの個体に由来するコメから得られる、前記の遺伝子増幅法である。

本発明は、穀物粒の糟糠及び／又は胚芽を直接に試料として用いて、穀物の遺伝子を増幅する遺伝子増幅法である。

本発明は、前記穀物粒の糟糠及び／又は胚芽が、コメの糠及び／又は胚芽である、前記の遺伝子増幅法である。

本発明は、前記穀物粒の糟糠及び／又は胚芽が、単一の個体に由来する一粒又は複数粒の穀物粒から得られる、前記の遺伝子増幅法である。

本発明は、前記穀物粒の糟糠及び／又は胚芽が、単一のイネの個体に由来する一粒又は複数粒のコメから得られる、前記の遺伝子増幅法である。

本発明は、前記穀物粒の糟糠及び／又は胚芽が、複数の個体に由来する穀物粒から得られる、前記の遺伝子増幅法である。

本発明は、前記穀物粒の糟糠及び／又は胚芽が、複数のイネの個体に由来するコメから得られる、前記の遺伝子増幅法である。

本発明によれば、遺伝子増幅に先立って、穀物から、核酸を精製、抽出する過程が不要であるため、簡便且つ安価な方法で効率よく、さらに操作を行う者の熟練度に関わらず高い再現性をもって、穀物の遺伝子を増幅することができる。

本発明における穀物として、コメ類、コムギ類、オオムギ類、トウモロコシ類、モロコシ類、ヒエ類、アワ類、キビ類、ライ麦類等が挙げられる。本発明の遺伝子増幅法は、コメ類に特に好ましく用いることができる。

コメ類は、その品種は特に限定されず、例えばコシヒカリ、ササニシキ、ひとめぼれ、あきたこまち、きらら３９７等のうるち米や、もち米等を対象とすることができる。

本発明における、穀物粒とは、穀物の種子をいう。

コメは、イネの種子であり、本発明におけるコメは、イネ種子の籾を籾摺りして得られる玄米、及び玄米を精米機によって精白して得られる精米を含む。

本発明における穀物粒の水洗浄液とは、穀物粒を水とを混合し、攪拌して得られる懸濁液をいう。このような水洗浄液には、穀物の糟糠及び胚芽等が含まれている。糟糠及び胚芽を構成する植物細胞には、穀物の遺伝子を担う核酸が含まれている。

穀物がコメである場合には、穀物粒の水洗浄液として、コメの水洗浄液を用いる。
コメの水洗浄液とは、コメと水とを混合して攪拌したときに生成する白濁した液体である。したがって、コメを研ぐ際に生じるコメのとぎ汁も含む。
コメの水洗浄液には、コメの糠及び胚芽などが含まれている。一般にコメは、胚乳、糠、及び胚芽から構成されている。糠及び胚芽を構成する植物細胞には、イネの遺伝子を担う核酸が含まれている。

穀物粒の糟糠として、例えば、コメの糠、コムギのフスマ、オオムギのフスマ、トウモロコシの外皮等を使用することができる。糟糠とは、穀物粒を外周部から連続して搗精したときの糟糠のことをいい、外周部から連続して３０重量％以内まで搗精したときの糟糠、いわゆる搗精歩留まり７０重量％以内の糟糠が好ましい。

通常、植物由来の材料を試料として遺伝子増幅を行う場合には、それに先立って、遺伝子の増幅反応を阻害する色素、たんぱく、糖類あるいは未知の夾雑物を取り除く操作が必要である。しかしながら、本発明によれば、適当量の穀物粒の水洗浄液、又は穀物粒の糟糠及び／又は胚芽を反応液に直接に添加して反応させることにより、精製された核酸を調製しなくても、穀物遺伝子の増幅が可能である。このことにより、核酸調製のための時間と手間がほぼ完全に省略でき、また、核酸を調製する操作者に起因するバラツキの問題も解消することができる。

このような穀物粒の水洗浄液、又は穀物粒の糟糠及び／又は胚芽の使用量としては特に限定されない。従って、穀物の品種等に応じて、適切な量を当業者が適宜決定すればよい。例えば、穀物粒に水を加え、撹拌機を用いて撹拌することにより得た水洗浄液の場合、以下の量で遺伝子増幅反応に用いることができる。例えば、穀物粒１ｇにつき２．５ｍｌの水を用いて得た水洗浄液であれば、反応液５０μｌ中に対して水洗浄液が０．０３〜２μｌ、好ましくは０．０４〜１．３μｌ、より好ましくは０．０８〜０．６３μｌ含まれるように用いることができる。

本発明における遺伝子増幅法とは、特に限定されず、公知の様々な遺伝子増幅法を用いることができる。また、各々の方法においては、通常用いられる試薬を制限なく使用でき、通常の条件で用いることができる。具体的には、ＰＣＲ（polymerase chain reaction）法、ＬＡＭＰ（Loop-Mediated Isothermal Amplification）法、ＩＣＡＮ（Isothermal and Chimeric primer-initiated Amplification of Nucleic acids）法等が挙げられる。

ＰＣＲ法は、ＤＮＡ鎖の中の特定の領域をはさんで、プライマーを結合させ、ＤＮＡポリメラーゼを作用させて、ＤＮＡ合成反応を繰り返すことによって、目的のＤＮＡ断片を数十万倍にも増幅できる方法である。

ＬＡＭＰ法は、標的遺伝子の６箇所の領域に対して４種類のプライマーを設定して、鎖置換反応を利用し、一定温度で反応させることを特徴とし、サンプルとなる遺伝子、プライマー、鎖置換型ＤＮＡ合成酵素、基質等を一緒に、一定温度（６５℃付近）で保温することにより、検出までを１ステップの工程で行うことができる方法である（T.Notomi et al.: Nucleic Acid Research, 2000, Vol. 28, No.12, e63）。ＤＮＡを１５分〜１時間で１０^９〜１０^１０倍に増幅することができる。

ＩＣＡＮ法は、ＲＮＡ−ＤＮＡキメラプライマー、鎖置換活性と鋳型交換活性とを有するＤＮＡポリメラーゼ、ＲＮａｓｅＨを用いる等温の遺伝子増幅方法である（宝酒造、２０００年）。キメラプライマーが鋳型と結合した後、ＤＮＡポリメラーゼにより相補鎖が合成される、その後、ＲＮａｓｅＨがキメラプライマー由来のＲＮＡ部分を切断し、切断部分から鎖置換反応と鋳型交換反応を伴った伸長反応が起こる。この反応が繰り返し起こることにより遺伝子が増幅される。

上記いずれの方法を用いた場合にも、穀物粒の水洗浄液、又は穀物粒の糟糠及び／又は胚芽を直接に反応液に添加して遺伝子増幅を行うことが可能である。穀物粒の水洗浄液、又は穀物粒の糟糠及び／又は胚芽に含まれるある種の植物細胞は、増幅反応において、高温条件にさらされたり、酵素処理されること等によって、細胞崩壊を起こすと考えられる。その結果、ＤＮＡ等の遺伝子が遊離され、プライマー等の反応液との接触が可能となる。

本発明において遺伝子とは、遺伝をつかさどる因子という概念であり、遺伝子が意味する具体的な物質としては、核酸、若しくは核酸配列である。更に核酸とは、ＤＮＡ、ＲＮＡの両方を意味する。

本発明において、単一の個体に由来する一粒又は複数粒の穀物粒から得られる水洗浄液を用いることができる。単一の個体とは、単一の植物体を意味し、イネにおいては、単一の株を意味する。

一粒の穀物粒から得られる水洗浄液にも複数の細胞が含まれており、遺伝子の増幅が可能である。

単一の個体に由来する穀物粒から得られる水洗浄液を用いることにより、その穀物単体の遺伝的な解析が可能である。このことは、穀物の遺伝子組み換え等の研究に非常に有用である。

同じように、単一の個体に由来する一粒又は複数粒の穀物粒から得られる糟糠及び／又は胚芽を用いることもできる。
また、穀物がコメである場合には、単一のイネの個体に由来する一粒又は複数粒のコメから得られる水洗浄液、又は糠及び／又は胚芽を用いることもできる。

また、本発明において、複数の個体に由来する穀物粒から得られる水洗浄液を用いることもできる。
複数の個体に由来する穀物粒から得られる水洗浄液からも遺伝子の増幅が可能である。複数の個体に由来する穀物粒から得られる水洗浄液を試料とした場合には、それらの個体の平均的な遺伝子情報を得ることができる。例えば、どのような品種が主体であるか、遺伝子組み換え体が混入しているか、等である。

同じように、複数の個体に由来する穀物粒から得られる糟糠及び／又は胚芽を用いることもできる。
また、穀物がコメである場合には、複数のイネの個体に由来するコメから得られる水洗浄液、糠及び／又は胚芽を用いることもできる。したがって、通常、食用として市販されているコメを試料とすることもできる。

［実験例１］
以下にコメの水洗浄液を直接に反応液に添加して、ＰＣＲ法を用いてイネ遺伝子を増幅した例を示すが、本発明はこれにより限定されるものではない。

コメ（鹿児島産ヒノヒカリ、複数株から得たコメ粒の混合物）４．０ｇに滅菌蒸留水１０ｍｌを加え、撹拌機（サイエンティフィックインダストリー社(Scientific Industries, inc.)製、ボルテックスジェニー２(Vortex Genie 2)G560）を用いて約１０秒間撹拌し、白濁したコメの水洗浄液を得た。

別途、以下の組成を有する反応液をチューブ内に調製し、同じものを１１個用意した。
・フォワードプライマー（１００μＭ）０．２５μｌ
・リバースプライマー（１００μＭ）０．２５μｌ
・１０Ｘ緩衝液５μｌ
（１００ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝溶液（ｐＨ８．３）、５００ｍＭＫＣｌ、１５ｍＭＭｇＣｌ_２）
・ｄＮＴＰｓ（２．５ｍＭ）４μｌ
・ＤＮＡポリメラーゼ（５ｕｎｉｔｓ／μｌ）０．２５μｌ
（タカラバイオ社製、TaKaRa Taq、R001A）

なお、上記プライマーは、イネ遺伝子に特異的な領域を増幅するためのプライマーであり、国立遺伝学研究所のＤＮＡデータベースに収録されているイネの塩基配列の一つ（アクセッションナンバーＡＰ００５１８８）を参考に設計した。具体的な塩基配列は、フォワードプライマーがＧＡＡＣＧＴＣＡＴＧＡＣＣＴＧＣＡＣＴＧＧ（配列番号１）、リバースプライマーがＧＣＣＡＡＧＴＴＧＧＴＧＡＧＴＴＧＧＴＴ（配列番号２）である。

上記の組成を有する１１個の反応液を、１〜１１とナンバリングした。これらのうち反応液１〜１０には、それぞれ、以下に示すコメの水洗浄液の各量をさらに加え、最後に、反応液の全量が５０μｌとなるように滅菌蒸留水を加えた。コントロールとして、反応液１１にはコメの水洗浄液を加えず、反応液の全量が５０μｌとなるように滅菌蒸留水を加えた。

（本実験例で用いたコメの水洗浄液（コメ１ｇにつき２．５ｍｌの滅菌蒸留水を用いて調製した水洗浄液）の量）
反応液１：１０μｌ
反応液２：５μｌ
反応液３：２．５μｌ
反応液４：１．３μｌ
反応液５：０．６３μｌ
反応液６：０．３１μｌ
反応液７：０．１６μｌ
反応液８：０．０８μｌ
反応液９：０．０４μｌ
反応液１０：０．０２μｌ
（反応液１１：０μｌ）

反応装置はＰＣＲサーマルサイクラー（タカラバイオ社製、TaKaRa PCR Thermal Cycler MP、TP3000）を用いた。上記反応液１〜１１の入った各チューブを、９４℃の温度条件下に２．５分間置き、ＤＮＡの遊離と変性を行った後に、変性（９４℃、１分間）、アニーリング（６０℃、２分間）及び伸長（７２℃、３分間）を３５サイクル行って反応させ、最後に７２℃で７分間伸長反応させて、反応を終了させた。

増幅されたＤＮＡを検出するために、アガロースゲル電気泳動を行い、臭化エチジウム染色によりバンドパターンを検出した。電気泳動の結果を図１に示す。図中レーンＭは、サイズマーカー（φＸ１７４をＨｉｎｃＩＩで消化切断したものの２．５μｇをアプライした。）であり、レーン１〜１１は、それぞれ反応液１〜１１を用いた結果を示したものである。

図１の結果から、反応液に、試料としてコメの水洗浄液を１．３、０．６３、０．３１、０．１６、０．０８、及び０．０４μｌ加えた反応液４〜９において、イネ遺伝子に特異的な増幅産物（図中矢印で示す）が検出された。

これらの実験結果から、コメの水洗浄液を直接に反応液に添加して、遺伝子増幅が可能であることが示された。穀物の各品種等に応じて、適切な水洗浄液の濃度及び量は、適宜定めるとよい。

ＰＣＲ反応産物の、アガロースゲル電気泳動による検出結果。

配列番号１は、プライマーの配列である。
配列番号２は、プライマーの配列である。

Claims

穀物粒の水洗浄液を直接に試料として用いて、穀物の遺伝子を増幅する遺伝子増幅法。
前記穀物粒の水洗浄液が、コメの水洗浄液である、請求項１に記載の遺伝子増幅法。
前記穀物粒の水洗浄液が、単一の個体に由来する一粒又は複数粒の穀物粒から得られる、請求項１又は２に記載の遺伝子増幅法。
前記穀物粒の水洗浄液が、複数の個体に由来する穀物粒から得られる、請求項１又は２に記載の遺伝子増幅法。
穀物粒の糟糠及び／又は胚芽を直接に試料として用いて、穀物の遺伝子を増幅する遺伝子増幅法。
前記穀物粒の糟糠及び／又は胚芽が、コメの糠及び／又は胚芽である、請求項５に記載の遺伝子増幅法。
前記穀物粒の糟糠及び／又は胚芽が、単一の個体に由来する一粒又は複数粒の穀物粒から得られる、請求項５又は６に記載の遺伝子増幅法。
前記穀物粒の糟糠及び／又は胚芽が、複数の個体に由来する穀物粒から得られる、請求項５又は６に記載の遺伝子増幅法。