JP2006129729A - イヌリン分解酵素及びその遺伝子 - Google Patents
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Abstract
【解決手段】 特定のアミノ酸配列からなるイヌリン分解活性を有するタンパク質、そのタンパク質をコードする核酸、その核酸を挿入した組換えベクター及びその組換えベクターを導入した形質転換体。本タンパク質は新規な糖質加水分解酵素としてプロバイオティクスやシンバイオティクスの分野での活躍が期待される。
【選択図】 なし
Description
Davies et al., Biochem. Soc. Trans., 30, 291-297, 2002 Barrangou et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 100, 8957-8962, 2003
[1] 配列番号22に示すアミノ酸配列からなるタンパク質。
[2] 配列番号22に示すアミノ酸配列において、1〜40番目のアミノ酸及び811〜1296番目のアミノ酸のうち、1又は複数のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質であって、かつ、イヌリン分解活性を有するタンパク質。
[3] 配列番号23、配列番号24又は配列番号25に示すアミノ酸配列からなる[2]に記載のタンパク質。
[4] [1]に記載のタンパク質をコードする核酸。
[5] 配列番号21に示す塩基配列からなる核酸。
[6] [2]に記載のタンパク質をコードする核酸。
[7] [3]に記載のタンパク質をコードする核酸。
[8] [4]〜[7]のいずれか一項に記載の核酸を挿入した組換えベクター。
[9] [8]に記載の組換えベクターを導入した形質転換体。
本発明のタンパク質は、配列番号22に示すアミノ酸配列からなるイヌリン分解酵素である。1296のアミノ酸からなるが、Met1からAla40までの領域は細胞膜を通過するためのシグナルペプチドであり、成熟体はAla41からVal1296までの1256のアミノ酸からなると考えられる(配列番号23)。至適温度及びpHはそれぞれ50℃及び5.5である。Ala41からArg810までの領域は酵素触媒ドメインであり、イヌリン分解活性にとって必須である。Ala811以降のC末端領域は、機能は必ずしも明確ではないがイヌリン分解活性には必須ではない。
本発明の核酸は、本発明のタンパク質をコードしている。具体的な塩基配列としては、配列番号21に示す塩基配列などが挙げられる。本発明の核酸は、L. casei IAM1045株などの本発明のタンパク質を産生する微生物からゲノムDNAを調製し、得られたゲノムDNAを鋳型として配列番号21等に基づいて設計されるプライマーを用いてPCRで増幅し、常法により抽出・精製することにより調製することができる。また、本発明の核酸は、化学合成によって、又は、クローニングされたゲノムDNAライブラリーを鋳型としたPCRによっても、調製することができる。さらに、部位特異的突然変異誘発法等によって、配列番号21に示す塩基配列以外の塩基配列を有する本発明の核酸を合成することもできる。核酸に変異を導入する方法として、Kunkel法、Gapped duplex法等の公知の方法が挙げられる。例えば、部位特異的突然変異誘発法を利用した変異導入用キット(Mutan-KやMutan-Gなど;TAKARA)などを用いて、あるいは、LA PCR in vitro Mutagenesisシリーズキット(TAKARA)を用いて変異の導入が行われる。
本発明の組換えベクターは、本発明の核酸が挿入されている。この組換えベクターを利用して、本発明の形質転換体を得ることができる。
L. casei IAM1045株(東京大学分子細胞生物学研究所IAMカルチャーコレクションから入手)を1%グルコース含有YP培地(イーストエキストラクト−ペプトン ベース;Kodaira et al., Gene, 187, 45-53, 1997)で培養した後、TV培地(トリプトン−ビタミン ベース;Burne et al., Infect. Immun., 60, 4621-4632, 1992)で培養した。濁度(OD660)の上昇が停止したら、炭素源を加えて培養を続けた。炭素源は、(1)0.5%グルコース、(2)0.5%イヌリン、(3)0.25%グルコース及び0.25%イヌリン、(4)0.1%グルコース及び0.4%イヌリンである。増殖曲線を図1に示す。L. casei 1045株は、いずれの条件下でも増殖し、グルコースはもちろんイヌリンを炭素源として利用できることが明らかとなった。グルコース及びイヌリンを含む培地中(図1の黒三角)で増殖した場合、L. casei 1045株は中程度増殖した後、約20時間増殖が停止し、その後再び増殖した。ジオーキシー増殖の間のこの顕著に長い遅滞期(lag−phase)は、あまり好適でない炭素源(ラクトース、リボース及びマルトースなど)の存在下で増殖させたL. casei ATCC393株のそれと類似していた(Veyrat et al., Microbiol., 140, 1141-1149, 1994及びViana et al., Mol. Microbiol., 36, 570-584, 2000)。
V8消化で得られた61kDaのポリペプチド:QVQSSVGQSQTD
V8消化で得られた59kDaのポリペプチド:VSQNDQYNEPYR
トリプシン消化で得られた57kDaのポリペプチド:TTLPTSNEQV
トリプシン消化で得られた52kDaのポリペプチド:AVTSDVSQNDQYNEP
59kDaのポリペプチド及び52kDaのポリペプチドは共通するデカペプチドVSQNDQYNEP配列を含んでいる。この配列に基づいて、クローニングのための縮重オリゴヌクレオチドプローブを構築した。例えば、VSQNDQYNEPのためのTP1などである(表1を参照)。
プラスミドベクターpUC118(又はpUC119)を用い、E. coli XL1-Blueを宿主として、L. casei IAM1045株のゲノムDNAの制限HhaI遺伝子ライブラリーを大腸菌の系で構築した(Yokoi et al., Gene, 281, 115-122, 2001を参照)。すなわち、常法に従い、L. casei IAM1045株のゲノムDNAを抽出し、精製を行った。得られたゲノムDNAをHhaIで部分的に消化し、断片をpUC118のSmaI部位にクローニングした。
levH1は、配列決定した6359bpの核酸のうち、802番目(TTG)から4963番目(TAA)に位置し、分子量が138.8kDa、pIが4.66と計算される、1296アミノ酸残基のタンパク質(LevH1)をコードしている。levH1の核酸配列を配列番号21に、LevH1のアミノ酸配列を配列番号22に、それぞれ示す。V8プロテアーゼ又はトリプシンにより生成する4つのポリペプチドのN末端アミノ酸は、LevH1の内部の配列と完全に一致していた。TTLPTSNEQV(137〜146番目のアミノ酸)、QVQSSVGQSQTD(145〜156番目)、AVTSDVSQNDQYNEP(168〜182番目)、VSQNDQYNEPYR(173〜184番目)。
I:WMNDPN(LevH1の195〜200残基)
II:[F/W]SGSAVVDXXNT(293〜304残基)
III:FRDPKV(388〜392残基)
IV:ECPD(440〜443残基)
V:DXGXD(502〜506残基)
VI:WM[S/N]NW(526〜530残基)
VII:VDXXXVEVF(682〜690残基)
GH32及びGH68ファミリーにおいて、3つの酸性残基Asp(モチーフI)、Asp(モチーフIII)及びGlu(モチーフIV)は、活性部位として酵素活性に必須であると考えられており(いわゆる触媒3残基(catalytic triad))、それぞれ、触媒性求核剤、遷移状態安定剤及び一般的な酸/塩基触媒(プロトンドナー)である。いくつかの酵素において、これらの酸性残基が酵素活性に必須であることが、変異性データ及び/又は結晶学的データから示されている。例えば、酵母インベルターゼにおけるD42−E223(それぞれ、モチーフI及びIV)(Reddy et al., J. Biol. Chem., 265, 10817-10820, 1990及びReddy et al., J. Biol. Chem., 271, 13953-13957, 1996)、Bacillus subtilisのレバンスクラーゼにおけるD86−D247−E342(それぞれ、モチーフI、III及びIV)(Meng et al., Nat. Struc. Biol., 10, 935-941, 2003)、Lactobacillus reuteriのレバンスクラーゼにおけるD272−D424−E523(それぞれ、モチーフI、III及びIV)及びイヌロスクラーゼにおけるD249−D404−E503(それぞれ、モチーフI、III及びIV)(Ozimek et al., FEBS Lett., 560, 131-133, 2004)、Acetobacter diazotrophicusのレバンスクラーゼにおけるD309(モチーフIII)(Batista et al., Biochem. J., 337, 503-506, 1999)並びにStreptococcus salivariusのフルクトシルトランスフェラーゼにおけるD397(モチーフIII)(Song et al., Biochem. J., 344, 259-264, 1999)。触媒3残基に加えて、酵母インベルターゼのモチーフIVにおけるCys残基は、触媒における補助的な役割を果たしていると推測されている(Reddy et al., J. Biol. Chem., 271, 13953-13957, 1996)。しかし、他のモチーフII、V、VI及びVIIに関して、機能は未解明のままである。これらの結果から、LevH1の約770の連続するアミノ酸配列(A41〜R810)はおそらく酵素触媒ドメインを形成し、D198−D389−E440の3残基は触媒性求核剤、遷移状態安定剤及び一般的な酸/塩基触媒として機能していることが示唆された。二次構造予測の結果によれば、予想されるLevH1の触媒ドメインは専ら二次βストランドからなり、GH32ファミリーに属する他の糖質加水分解酵素と同様である。ノイラミニダーゼの構造と相同的な、GH32ファミリーに共通する6枚羽根のβプロペラ折り畳み構造が提案されている(Pons et al., Proteins, 33, 383-395, 1998及びPons et al., Proteins, 54, 424-432, 2004)。
LevH1の酵素触媒ドメインを解明するため、levH1中の4つの領域をPlac下にクローニングした。このようにして得られた4つの組換えプラスミド、pKNL1〜4を図4に示した。すべての組換えタンパク質はN末端にLacZ’の5残基MTMITを含んでいた。これらのプラスミドがコードするアミノ酸配列を図7に示した。S39からR810までの772残基を含有するpKL1、S39からG724までの686残基を含むpKL2(触媒ドメインのC末端側の86残基を欠く)、V82からR810までの729残基を含むpKNL3(触媒ドメインのN末端側43残基を欠く)及びV82からG724までの643残基を含むpKNL4(触媒ドメインのN末端側43残基及びC末端側86残基を欠く)。構築したプラスミドを表3にまとめる。
Claims (9)
- 配列番号22に示すアミノ酸配列からなるタンパク質。
- 配列番号22に示すアミノ酸配列において、1〜40番目のアミノ酸及び811〜1296番目のアミノ酸のうち、1又は複数のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質であって、かつ、イヌリン分解活性を有するタンパク質。
- 配列番号23、配列番号24又は配列番号25に示すアミノ酸配列からなる請求項2に記載のタンパク質。
- 請求項1に記載のタンパク質をコードする核酸。
- 配列番号21に示す塩基配列からなる核酸。
- 請求項2に記載のタンパク質をコードする核酸。
- 請求項3に記載のタンパク質をコードする核酸。
- 請求項請求項4〜7のいずれか一項に記載の核酸を挿入した組換えベクター。
- 請求項8に記載の組換えベクターを導入した形質転換体。
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