JP2006094761A

JP2006094761A - 微生物定量装置

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Publication number: JP2006094761A
Application number: JP2004284403A
Authority: JP
Inventors: Tetsuya Doi; 哲哉土肥; Hideo Minagawa; 秀夫皆川
Original assignee: Nishihara Environmental Technology Co Ltd
Current assignee: Nishihara Environment Co Ltd
Priority date: 2004-09-29
Filing date: 2004-09-29
Publication date: 2006-04-13

Abstract

【課題】高感度の撮像手段を使用しない場合でも、目的の微生物を正確に定量することができる微生物定量装置を得ることを目的とする。
【解決手段】蛍光標識付のＤＮＡプローブが混合されている試料の光学像の撮像画像を構成している画素の明度を２値化する２値化処理部５と、その２値化処理部５による２値化後の明度がＨレベルである画素の個数ＣＨとＬレベルである画素の個数ＣＬとの割合Ｒを算出する割合算出部６とを設け、予め規定されている画素数の割合と微生物量との関係を参照して、その割合算出部６により算出された割合Ｒから試料に含まれている目的の微生物を定量する。
【選択図】図１

Description

この発明は、目的の微生物を定量する微生物定量装置に関するものである。

従来の微生物定量装置は、一定量の試料を膜で濾過して微生物である細菌を捕捉し、その細菌を所定の試薬を用いて発光させる。
そして、撮像手段が発光している細菌を撮像し、その発光画像を解析して細菌の個数を測定する（例えば、特許文献１を参照）。

具体的には、以下のようにして、発光画像から細菌の個数を測定する。
撮像手段により撮像された発光画像の画素値を２値化して２値画像を生成し、その２値画像内に存在するドット状の群（以下、高輝度画素群という）にラベリングする。
そして、高輝度画素群ｉの重み計算を実施して細菌の個数を計数する。ただし、ｉ＝１，２，・・・，ｎである。

即ち、高輝度画素群ｉにおいて、２値化前の群の最高輝度値をＩｍａｘ、２値化後の群の構成画素数をＳｉ、菌単体当りの最高輝度値をＩＳ、菌単体当りの平均画素数をＳＳとして、高輝度画素群ｉの重みＷｉを計算する。ただし、下式のｆは所定の関数を意味する。
Ｗｉ＝ｆ（Ｓｉ／ＳＳ）＋ｆ（Ｉｍａｘ／ＩＳ）−１
そして、高輝度画素群ｉの重みＷｉの総和を求めることにより、細菌の個数Ｎを計算する。
Ｎ＝ΣＷｉ
ただし、Σはｉ＝１からｎまでの総和を意味する。

特開平７−４４７０７号公報（段落番号［００２０］から［００２９］、図２）

従来の微生物定量装置は以上のように構成されているので、撮像手段の感度が高く、輝度値を高感度に測定することができれば、比較的正確に細菌の個数Ｎを計数することができる。しかし、高感度の撮像手段を用いることができない場合や、高感度の撮像手段を用いても誤差が発生しやすい環境下で使用される場合には、最高輝度値Ｉｍａｘ、ＩＳ等を正確に測定することができないため、細菌数Ｎの計数精度が劣化するなどの課題があった。

この発明は上記のような課題を解決するためになされたもので、高感度の撮像手段を使用しない場合でも、目的の微生物を正確に定量することができる微生物定量装置を得ることを目的とする。

この発明に係る微生物定量装置は、蛍光標識付のＤＮＡプローブが混合されている微生物含有試料の光学像を撮像する撮像手段と、その撮像手段により撮像された光学像の画像を構成している画素の明度を２値化する２値化手段と、その２値化手段による２値化後の明度がＨレベルである画素の個数とＬレベルである画素の個数との割合を算出する割合算出手段とを設け、予め規定されている画素数の割合と微生物量との関係に基づき、その割合算出手段により算出された割合から試料に含まれている目的の微生物を定量するようにしたものである。

以上のように、この発明によれば、蛍光標識付のＤＮＡプローブが混合されている微生物含有試料の光学像を撮像する撮像手段と、その撮像手段により撮像された光学像の画像を構成している画素の明度を２値化する２値化手段と、その２値化手段による２値化後の明度がＨレベルである画素の個数とＬレベルである画素の個数との割合を算出する割合算出手段とを設け、予め規定されている画素数の割合と微生物量との関係に基づき、その割合算出手段により算出された割合から試料に含まれている目的の微生物を定量するように構成したので、高感度の撮像手段を使用しない場合でも、目的の微生物を正確に定量することができる効果がある。

実施の形態１．
図１はこの発明の実施の形態１による微生物定量装置を示す構成図であり、図において、試料生成装置１は例えば遠心分離機などから構成され、水圏や土壌などから採取された採取物を遠心分離して精製することにより試料を生成し、目的の微生物と相補関係がある蛍光標識付のＤＮＡプローブを試料に混合する。

蛍光顕微鏡２は試料生成装置１により蛍光標識付のＤＮＡプローブが混合されている試料（微生物含有試料）内の発光体を検知し、その発光体の光学像を出力する。
ＣＣＤカメラ３は蛍光顕微鏡２から出力された光学像を撮像し、その撮像画像を出力する。
なお、蛍光顕微鏡２及びＣＣＤカメラ３から撮像手段が構成されている。

画像格納部４はＣＣＤカメラ３により撮像された画像を格納するメモリである。
２値化処理部５は画像格納部４に格納されている画像を構成している画素の明度を所定の閾値と比較し、その画素の明度が閾値より高ければ、その画素の明度をＨレベル（例えば、“１”）、その画素の明度が閾値より低ければ、その画素の明度をＬレベル（例えば、“０”）に変更する２値化処理を実施する。なお、２値化処理部５は２値化手段を構成している。

割合算出部６は２値化処理部５による２値化後の明度がＨレベルである画素の個数ＣＨとＬレベルである画素の個数ＣＬとの割合Ｒを算出する。なお、割合算出部６は割合算出手段を構成している。
検量線格納部７は画素数の割合Ｒと微生物量Ｑとの関係を表すものとして、大腸菌を用いて作成された検量線を格納しているメモリである。
定量部８は検量線格納部７に格納されている検量線を参照して、割合算出部６により算出された割合Ｒから試料に含まれている目的の微生物の量を求める。なお、検量線格納部７及び定量部８から定量手段が構成されている。
図２はこの発明の実施の形態１による微生物定量方法を示すフローチャートである。

次に動作について説明する。
例えば、水圏や土壌に含まれている微生物（主に細菌）を定量する場合には、例えば、測定担当者が水圏や土壌から約２ｍＬを採取して、その採取物を試料生成装置１にセットする。
また、測定担当者は、目的の微生物と相補性が高い蛍光標識付のＤＮＡプローブを用意する。

試料生成装置１は、測定担当者が採取物をセットすると、例えば、その採取物を遠心分離して精製し、４％程度のパラホルムアルデヒドによって固定し、その固定物を試料とする。
また、試料生成装置１は、測定担当者に用意されている蛍光標識付のＤＮＡプローブを試料に混合する。

このようにして、蛍光標識付のＤＮＡプローブが混合されると、そのＤＮＡプローブが目的の微生物と結合するため、目的の微生物が蛍光を発するようになる（ＤＮＡプローブの蛍光染色が赤色であれば、赤色を発光する）。
目的以外の微生物は、ＤＮＡプローブと相補性が低いので、ＤＮＡプローブと結合しない。したがって、目的以外の微生物は蛍光を発しない。
このように、蛍光標識付のＤＮＡプローブを混合して、目的の微生物を発光させる処理を蛍光ハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）と呼ばれるが、以下、ＦＩＳＨの原理を簡単に説明する。

一般に、ある細胞内のＤＮＡにおける塩基配列と、ある細胞内のＤＮＡにおける塩基配列との間に相補性が高い場合には２重鎖を形成する性質がある。即ち、相補性が高い２つの細胞は相互に結合する性質がある。
そこで、予め、目的の微生物の遺伝子だけが有する特有の塩基配列と結合する相補的なＤＮＡ断面に蛍光標識が付いているＤＮＡプローブを用意する。
目的の微生物が含まれている試料と、そのＤＮＡプローブとを混合すると、図３に示すように、目的の微生物とＤＮＡプローブが２重鎖を形成し、目的の微生物が蛍光を発するようになる。
目的以外の微生物はＤＮＡプローブと２重鎖を形成しないので、目的以外の微生物が蛍光を発することはない。

蛍光顕微鏡２は、試料生成装置１により蛍光標識付のＤＮＡプローブが混合された試料がセットされると、その試料内の発光体を検知し、その発光体の光学像を出力する（ステップＳＴ１）。
ＣＣＤカメラ３は、蛍光顕微鏡２から発光体の光学像を受けると、その光学像を撮像し、その撮像画像を画像格納部４に格納する（ステップＳＴ２）。
なお、撮像画像を構成している画素の明度は、例えば、最暗部の“０”から最明部の“２５５”の範囲で数値化されているものとする。また、画素の明度は、色の明るさを表す指標であるが、この実施の形態１では、単位面積当りの明るさを示す輝度を含む概念であるものとする。

図４はＣＣＤカメラ３により撮像された画像の一例を示す説明図である。
この画像では、目的の微生物が存在している領域は蛍光を発しているので、その蛍光色（例えば、赤色）で表示されるのに対し、目的の微生物が存在していない領域は黒色（背景色）で表示される。目的以外の微生物は、上述したように、蛍光標識付のＤＮＡプローブと結合しないので、蛍光色では表示されないが、例えば、その微生物が自力で発光していれば、蛍光色より薄い色で表示されることがある（図４の斜線部を参照）。また、ノイズの影響を受けているような場合でも、薄い色で表示されることがある。
そのため、ＣＣＤカメラ３により撮像された画像のままでは、目的の微生物が存在している領域と、他の領域を完全には区別することができない。

２値化処理部５は、ＣＣＤカメラ３により撮像された画像が画像格納部４に格納されると、目的の微生物が存在している領域と、他の領域を明確に区別するため、画像格納部４に格納されている画像を構成している画素の明度を２値化する（ステップＳＴ３）。
即ち、２値化処理部５は、画像を構成している画素毎に、当該画素の明度ｃｄと所定の閾値Ｋ（閾値Ｋは、ＤＮＡプローブの蛍光色より暗く、かつ、目的以外の微生物を排除するのには十分な明るい色の明度に設定される）を比較し、その画素の明度ｃｄが閾値Ｋより高ければ（ｃｄ≧Ｋ）、その画素の明度ｃｄをＨレベル（例えば、“１”）に変更して、蛍光色を発している状態に設定する。
一方、当該画素の明度ｃｄと所定の閾値Ｋを比較し、その画素の明度ｃｄが閾値Ｋより低ければ（ｃｄ＜Ｋ）、その画素の明度ｃｄをＬレベル（例えば、“０”）に変更して、蛍光色を発していない状態に設定する。
図５は２値化処理後の画像の一例を示す説明図であり、図５では図４の斜線部が除去されている。

割合算出部６は、２値化処理部５が画素の明度を２値化すると、２値化後の明度がＨレベルである画素の個数ＣＨを計数するとともに（ステップＳＴ４）、Ｌレベルである画素の個数ＣＬを計数し（ステップＳＴ５）、下記に示すように、Ｈレベルである画素の個数ＣＨと、Ｌレベルである画素の個数ＣＬとの割合Ｒを算出する（ステップＳＴ６）。
Ｒ＝ＣＨ／ＣＬ

定量部８は、割合算出部６が画素数の割合Ｒを算出すると、検量線格納部７に格納されている検量線を参照して、その割合Ｒから試料に含まれている目的の微生物を定量する（ステップＳＴ７）。
即ち、検量線格納部７には、図６に示すように、３種類の蛍光染色における検量線が格納されているので、定量部８は、色分布が最も正規分布に近い色（例えば、Ｃｙ３（赤））の検量線を選択する。
そして、定量部８は、割合算出部６により算出された画素数の割合Ｒの蛍光強度を、その選択した検量線（Ｙ＝ａＸ＋ｂ）に代入して、相当する菌体濃度（ＣＦＵ／ｍＬ）を算出する。

以下、大腸菌を用いた検量線の作成手順について説明する。
はじめに、大腸菌標準株（ＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉＡＴＣＣ８７３９）の適量をＬＢ培地に塗布して培養し、コロニーが発現したらコロニーの一部を釣菌する。そして、滅菌水に懸濁させてから、希釈平板法によって懸濁液の菌体濃度（ＣＦＵ／ｍＬ）を求める。
次に、懸濁液を段階的に滅菌水で希釈（１〜１０−３）した後、それぞれの希釈液に対して３種類の蛍光染色（Ｃｙ３（赤）、ＤＡＰＩ（青）、ＦＩＴＣ（緑）の染色）をそれぞれ行うことにより、９通りの試料を作成する。
最後に、図示せぬ画像処理装置が希釈試料毎に、３種類の蛍光強度を数値化して検量線（Ｙ＝ａＸ＋ｂ）を算出し、その検量線を検量線格納部７に格納する。
図６は３種類の蛍光染色における検量線を示す説明図である。

以上で明らかなように、この実施の形態１によれば、蛍光標識付のＤＮＡプローブが混合されている微生物含有試料の光学像の撮像画像を構成している画素の明度を２値化する２値化処理部５と、その２値化処理部５による２値化後の明度がＨレベルである画素の個数ＣＨとＬレベルである画素の個数ＣＬとの割合Ｒを算出する割合算出部６とを設け、予め規定されている画素数の割合と微生物量との関係に基づき、その割合算出部６により算出された割合Ｒから試料に含まれている目的の微生物を定量するように構成したので、高感度の撮像手段を使用しない場合でも、目的の微生物を正確に定量することができる効果を奏する。

即ち、目的の微生物を定量するに際して、目的の微生物が蛍光色で発光していることを検知できれば（所定の閾値より明るく発光していることを検知できれば）、その発光体の明度の正確な数値を知る必要がないので、高感度の撮像手段を使用しない場合でも、目的の微生物を正確に定量することができる。

また、この実施の形態１によれば、画素数の割合Ｒと微生物量Ｑとの関係を表すものとして、大腸菌を用いて作成された検量線を参照するように構成したので、例えば、面倒な重み計算等を実施することなく、簡単に目的の微生物を正確に定量することができる効果を奏する。

実施の形態２．
上記実施の形態１では、試料生成装置１により蛍光標識付のＤＮＡプローブが混合された試料がセットされると、蛍光顕微鏡２が試料内の発光体を１回だけ検知するものについて示したが、蛍光顕微鏡２が１つの試料につき、複数箇所（例えば、１０箇所以上）で発光体を検知し、複数の光学像を出力するようにしてもよい。

この場合、ＣＣＤカメラ３が蛍光顕微鏡２から出力された複数の光学像を撮像して、複数の撮像画像を画像格納部４に格納するので、２値化処理部５が複数の撮像画像に対して２値化処理を実施し、割合算出部６が複数の撮像画像に係る画素数の割合Ｒの平均値を算出するようにする。
したがって、定量部８は、検量線格納部７に格納されている検量線を参照して、その割合Ｒの平均値から試料に含まれている目的の微生物を定量するようになる。

以上で明らかなように、この実施の形態２によれば、ＣＣＤカメラ３が複数回試料の光学像を撮像して、２値化処理部５がＣＣＤカメラ３により撮像された複数の画像の画素を２値化し、割合算出部６が２値化処理部５による２値化後の複数の画像に係る画素数の割合Ｒの平均値を算出するように構成したので、例えば、ノイズの影響等を軽減して、更に、正確に目的の微生物を定量することができる効果を奏する。

上記実施の形態１，２では、目的の微生物を定量するものについて示したが、例えば、病原性の微生物の存在を検出するものとして利用するようにしてもよい（定量で表現すれば、“０”または“１００”）。

この発明の実施の形態１による微生物定量装置を示す構成図である。この発明の実施の形態１による微生物定量方法を示すフローチャートである。蛍光ハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）の原理を示す説明図である。ＣＣＤカメラにより撮像された画像の一例を示す説明図である。２値化処理後の画像の一例を示す説明図である。大腸菌を用いて作成された検量線を示す説明図である。

符号の説明

１試料生成装置
２蛍光顕微鏡（撮像手段）
３ＣＣＤカメラ（撮像手段）
４画像格納部
５２値化処理部（２値化手段）
６割合算出部（割合算出手段）
７検量線格納部（定量手段）
８定量部（定量手段）

Claims

蛍光標識付のＤＮＡプローブが混合されている微生物含有試料の光学像を撮像する撮像手段と、上記撮像手段により撮像された光学像の画像を構成している画素の明度を２値化する２値化手段と、上記２値化手段による２値化後の明度がＨレベルである画素の個数とＬレベルである画素の個数との割合を算出する割合算出手段と、予め規定されている画素数の割合と微生物量との関係に基づき、上記割合算出手段により算出された割合から試料に含まれている微生物を定量する定量手段とを備えた微生物定量装置。
撮像手段が複数回試料の光学像を撮像して、２値化手段が上記撮像手段により撮像された複数の画像の画素を２値化し、割合算出手段が上記２値化手段による２値化後の複数の画像に係る画素数の割合の平均値を算出することを特徴とする請求項１に記載の微生物定量装置。