JP2005538733A - ニワトリ2型アストロウイルス - Google Patents
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Abstract
Description
エーテルとIDURによる処理:ウイルスはエーテル耐性の安定な物質であり、IDURによりその増殖を阻害されないことから、RNAウイルスである。
a)トリアデノウイルス(CELO,GAL,Tipton,EDS及びHEV)
b)トリ脳脊髄炎ウイルス(AE)
c)ニワトリ、シチメンチョウ及びハトポックスウイルス
d)感染性嚢包性疾患ウイルス
e)トリニューモウイルス(TRT)
f)レトロウイルス(トリ白血病及び網膜内皮症ウイルス)
g)トリレオウイルス
h)トリ腎炎ウイルス
i)ヒナ貧血ウイルス。
CastV−2−VDU/As1
下痢症状のブロイラーヒナ10羽(5日齢)から採取した気管及び鼻腔スワブをPBSで洗浄し、各サンプルから総液量(0.2ml)をCEL培養物に接種した。6日後に気管スワブサンプルの1個を接種した培養物でアストロウイルスにより誘導された細胞変性効果が観察された。他のサンプルからはレオウイルスとアデノウイルスが単離された。このアストロウイルスを3回プラーク精製し、プラーク数10未満のプレートから単一プラークを採取した。
不均一成長を示した1週齢ブロイラーヒナから1mlヘパリン血サンプル10個を採取した。(卓上遠心機を使用して)遠心後にサンプルから白血球を分離し、48時間齢ヒナ胎児肝臓(CEL)6cm細胞培養組織プレート2枚の各々の培地に濃厚白血球約0.1mlを接種した。
このウイルスは下痢症状の3週齢ヒナ3羽に由来する小腸(ホモジナイズ)(SI)プールから単離された。粗フィルターを使用してSIサンプルを濾過し、正常細胞培養レベルの5倍のペニシリンとストレプトマイシンを加えたPBSで100倍に希釈した。サンプルを遠心(卓上遠心機)して粒状破片を除去した後、上清を10倍ずつ10−6まで段階希釈し、各希釈液をCELプレート4枚に接種した。40分間吸収後、0.9%寒天培地をプレートに重層し、標準体液保存培地を2回再補充した。
細胞変性効果を示すCEL培養物の上清細胞培養液を回収し、−70℃で凍結させた。
材料と方法
特異的抗血清の作製
2週齢SPFヒナ(ホワイトレグホン)10羽に1羽当たり106pfuの生きたCastV−2を経口接種した。更に4週間後に不完全フロイントアジュバント(容量0.5ml/羽)と混合した109pfuのCastV−2を各ヒナに皮下接種した。
CastV−2、ANV(表1bに記載するANV実験を除く)、TastV及びDVH−2抗体試験にはプラーク減少試験を使用した。抗血清をリン酸緩衝食塩水で2倍ずつ段階希釈した。約200プラーク形成単位0.1mlを含有するように希釈した等容量のウイルス調製物と等容量の各抗血清希釈液(一般には0.5ml)を混合した。
感受性細胞を24ウェルプレートで増殖させた。コンフルエントになったらウイルスを感染させた。接種後12〜18時間に感染培養物を100%メタノールで1時間固定した後、液を捨てた。メタノールが蒸発したら、小容量のヒナ抗血清を固定細胞に(細胞シートを覆うように十分に)重層した。次にこれを38.5℃で45分間インキュベートした。次に細胞シートをPBSで3〜5回洗浄した。小容量の適当なウサギIgG全分子FITCコンジュゲートを必要な希釈率で細胞シートに(細胞シートを覆うように十分に)重層した。次にこれを38.5℃で更に45分間インキュベートした。次に細胞シートをPBSで(3〜5回)洗浄した。最後にPBS:グリセロール50:50混合物を(細胞シートを覆うように十分に)加えた。蛍光顕微鏡で観測するまで容器を暗所で+4℃にて保存した。感染細胞は細胞蛍光を示す。
ゲル拡散試験で使用する前に、感染細胞懸濁液を凍結−融解し、等容量の硫酸アンモニウムを加えた後に(o/n)沈殿と遠心により抗原プールを濃縮した。濃縮抗原をPBS容器で透析した。
2日齢SPFヒナ20羽にCastV−2株aからの単離物105.6プラーク形成単位(PFU)を接種した。ウイルスはウイルスの10−4希釈液から3回プラーク採取し、合計6CEL培養継代しておいた。
Claims (10)
- フランス国パリに所在のパスツール研究所の国立微生物培養物コレクション(CNCM)にアクセション番号I−2932で寄託されたCAstV又は上記寄託ウイルスを中和する抗血清を誘導することが可能な免疫学的に近縁のCAstVであることを特徴とするニワトリ2型アストロウイルス(CAstV−2)。
- 請求項1に記載のCastV−2を感染させた細胞培養物。
- 細胞培養物がニワトリ胎児肝臓(CEL)細胞培養物であることを特徴とする請求項2に記載の細胞培養物。
- 医薬的に許容可能なキャリヤー又は希釈剤と共に請求項1に記載のCastV−2を含有することを特徴とするトリアストロウイルス感染に起因する疾患に対する家禽の防御用ワクチン。
- CastV−2が生きた弱毒形態であることを特徴とする請求項4に記載のワクチン。
- ワクチンが更に他の家禽感染性病原体の1種以上のワクチン成分を含有することを特徴とする請求項4又は5に記載のワクチン。
- ワクチンがアジュバントを含有することを特徴とする請求項4から6のいずれか一項に記載のワクチン。
- 請求項1に記載のCastV−2を細胞培養物で増殖させた後に細胞培養物から回収することを特徴とするCastV−2抗原材料の製造方法。
- 請求項1に記載のCastV−2を医薬的に許容可能なキャリヤー又は希釈剤と混合することを特徴とする請求項4から7のいずれか一項に記載のワクチンの製造方法。
- 請求項4から7のいずれか一項に記載のワクチンを動物に投与することを特徴とするトリアストロウイルス感染に起因する疾患に対する家禽、特にニワトリの防御方法。
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