CN100384988C - 2型鸡星状病毒 - Google Patents

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Abstract

本发明提供新的鸡星状病毒(CAstV)。该鸡星状病毒(CAstV)与已知的鸟类星状病毒在免疫学上不同，能够用于制备疫苗。

Description

2型鸡星状病毒
本发明涉及2型鸡星状病毒、受此病毒感染的细胞培养物，以及包含此病毒的疫苗。
许多病毒与鸡和火鸡的肠道疾病和生长迟滞相关。以鸡为例，病毒包括网状内皮组织增生病毒(reticulo-endotheliosis virus)、呼肠孤病毒(reoviruses)、马立克氏病病毒(Marek’s Disease virus)、鸡贫血病毒(chick anaemia virus)、一些肠道病毒(enteroviruses)、肠道病毒样病毒(enterovirus-like viruses)、鸟类脑脊髓炎病毒(avian encephalomyelitis virus，AE virus)以及一类名叫鸟类肾炎病毒(avian nephritis virus，ANV)的星状病毒。
星状病毒为小的圆形、无被膜病毒，典型直径为28-30纳米，含正链RNA基因组。就例如通过电子显微镜观察可见的各自特征性形态学结构而言，星状病毒不同于其它小圆形病毒(small roundviruses，SRVs)，如细小病毒(parvoviruses)、环状病毒(circoviruses)、细小核糖核酸病毒(picornaviruses)、杯状病毒(caliciviruses)。
星状病毒科(Astroviridae)分为两类，哺乳动物星状病毒和鸟类星状病毒(见B.N.Fields等人，1996年，野生病毒学(FieldsVirology)，第26章)。后者在《鸟类病理学》(Avian Pathology)，31；213-227，2002一文中由Koci和Schultz-Cherry进行了深入的综述。这篇文章尤其对(鸟类)星状病毒的基因组组构和分子生物学特性进行了综述，并对此星形病毒的开放读码框提供了序列分析。
火鸡星状病毒同火鸡雏鸟的腹泻及高致死率相关。已经鉴定出的火鸡星状病毒有两种，TastV-1和TastV-2。但这两种火鸡星状病毒被发现在遗传学和免疫学上不同。
Yamaguchi等人在1979年从鸡体内分离得到的鸟类肾炎病毒(ANV)(鸟类疾病(Avian Diseases)，23；571-581)在全基因组被测序后，已被(重)分类为星状病毒(Imada等人，J.Virol，74；8487-8493，2000)。此病毒同轻度生长抑制和肾损伤有关，但也报道了一定的死亡率。一日龄的鸡最易感染ANV导致的疾病。
已证明鸭星状病毒(DAstV)是鸭二型肝炎的病原。鸭星状病毒被证明与从鸡、火鸡体内分离出的星状病毒(ANV)以及能导致I型、III型DVH的病毒在免疫学上不同。
本发明人鉴定出从鸡体内可分离的一种新(亚)型鸟类星状病毒，CastV-2。此病毒同已知的鸡星状病毒ANV(CastV-1)以及其它鸟类星状病毒在免疫学上不同。
因此，本发明提供2型鸡星状病毒(CAstV-2)，其特征在于，此病毒是在法国巴黎巴斯德研究所国立微生物保藏中心(CollectionNationale de Cultures de Microorganismes(CNCM)of theInstitute Pasteur)保藏的编号为I-2932的CAstV，或能诱导产生中和此保藏病毒的抗血清的免疫学上相关的CastV。
如上文所述，现有的鸟类星状病毒在免疫学上不同，上文所定义的CastV-2也被发现与以前所知的鸟类(星状)病毒在免疫学上可区别。这类新病毒CastV-2可用于家禽疫苗的制备和诊断试验。本发明的CastV-2可从保藏机构(巴斯德研究所的CNCM)得到，或者可从野外受感染的动物中分离得到，并能通过与针对保藏病毒产生的特异性抗血清在实施例中描述的免疫学试验中反应加以鉴定。病毒中和试验法尤其适合本发明CastV-2病毒的鉴定。
众所周知，自然界同类生物之间存在生物学变异。为了本发明的目的，保藏的CastV被作为其它CastV-2病毒株与之免疫学相关的CastV-2的参考病毒株。在本领域中，病毒中和试验法和免疫荧光(IF)试验法被广泛用于判断(鸟类)病毒之间是否存在免疫学关系。典型的病毒中和试验法和免疫荧光试验法在实施例中得到了阐述，并在Mockett等人(鸟类病理学，22；751-770，1993)、McNulty等人(鸟类病理学，19；75-87，1990)和Nersessian等人(AM.J.Vet.Res.，50；1475-1480，1989)的文献中公开。表1和表2显示，CastV-2病毒株构成了与已知鸟类星状病毒免疫学上不同的鸡星状病毒的同源血清组。
因此，如果鸟类星状病毒同保藏的CastV免疫学上相关，也即是说如果这种鸟类星状病毒能诱导产生抗血清，并且此抗血清能在病毒中和试验中中和保藏的病毒，那么此CastV被认为属于本发明。以下实施例2中阐述了可用于判断免疫学关系的中和试验法。
显然，用于病毒中和试验的抗血清应该具有合适的质量。在实施例2中阐述了这种抗血清的制备方法。
通常，向3-4周龄的SPF鸡口服接种活病毒株可以制备抗活CastV的合适的抗血清，接种用病毒株效价为102.0-109.0pfu/只动物，更优选范围为103.0-108.0pfu/只动物。感染3至4周(优选4周)后可取血。在第一次感染3至4周后，可用和第一次感染中所用大致相同剂量的同一活病毒株对鸡进行第二次感染。第二次感染2至4周后可取血。
向3-4周龄的SPF鸡皮下或肌肉内接种灭活病毒制品和佐剂可以得到抗灭活CastV的合适的抗血清。灭活前所述制品的感染效价可为107.0-1011.0pfu/只动物，更优选为108.0-1010.0pfu/只动物。接种3至4周(优选4周)后可取血。在第一次接种活的或灭活的病毒制品3至4周后，可对鸡进行再次灭活病毒接种。第二次接种后2至4周取血。
合适质量的抗血清所含的抗同源病毒的抗体效价典型地不小于256。
优选地，本发明提供2型鸡星状病毒(CAstV-2)，其特征在于此病毒是在法国巴黎巴斯德研究所的国立微生物保藏中心(Collection Nationale de Cultures de Microorganismes(CNCM)of the Institute Pasteur)保藏的编号为I-2932的CAstV，或免疫学上相关的CastV，通过病毒交叉中和反应确定和根据Archetti和Horsefall的方法(J.Exp.Med.，92；441-462，1950)计算得到的该免疫学相关病毒与保藏病毒的相关性百分数(％R)至少为32，更优选为至少50，最优选为至少70。试验病毒同保藏的CastV之间“R值”为32-50说明两者之间存在明确的免疫学关系，而“R值”为50-70以及至少70分别说明较少及极少/没有免疫学差异。
CAstV-2的进一步表征：
乙醚和IDUR处理：此病毒为乙醚抗性的稳定病毒，其生长不受IDUR抑制。说明此病毒为RNA病毒。
免疫荧光试验：感染的细胞培养物在用免疫荧光试验测试时显示细胞质荧光而细胞核无荧光。高抗体效价的血清可在稀释度大于1∶256时使用，仍有明亮的荧光。
交叉中和试验：在空斑减少试验中抗其自身的抗血清能够很好地中和此病毒，经常可观察到效价大于512。使用抗以下成份的抗血清未显示交叉中和反应。
a)鸟类腺病毒(CELO、GAL、Tipton、EDS和HEV)
b)鸟类脑脊髓炎病毒(AE)
c)家禽、火鸡和鸽子痘病毒
d)感染性囊病病毒
e)鸟类肺病毒(TRT)
f)逆转录病毒(鸟类白血病和网状内皮组织增生病毒)
g)鸟类呼肠孤病毒
h)鸟类肾炎病毒
i)鸡贫血病毒
电镜观察：将含有从受感染细胞中纯化的病毒颗粒的悬液置于碳包被的铜栅上并进行负染。电子显微镜观察结果揭示了直径为25-30纳米的小圆形病毒集簇的存在。
RT-PCR和测序：为了得到该病毒基因组序列信息，使用Rneasy试剂盒(Qiagen)从纯化病毒中分离总RNA。RT-PCR使用的两条引物来源于位于小圆结构病毒(SRSV)基因组ORF1中的保守区(Wyn-Jones等人，J.Virol.Methods，87；99-107，2000)。得到的PCR产物大小约400个碱基对(bp)。将从两个方向确定的核苷酸序列(约320bp)通过基本本地排列检索工具(basic local alignment searchtools，BLAST)与GeneBank数据库中报道的序列比较。发现从PCR产物中得到的推定氨基酸序列与火鸡星状病毒1、2(62％同一性)，鸟类肾炎病毒(55％同一性)和羊星状病毒(33％同一性)的非结构多聚蛋白有中等程度的相似性。这些基因信息说明这种病毒是一种鸡星状病毒，属于星状病毒科(Astroviridae)。
如实施例所示，本发明中的CastV-2显示出以前未见的免疫原性。因此，这种新的CastV-2能够作为一种新的可以有效保护家禽抵御这种新的CastV-2感染导致的疾病的鸟类星状病毒疫苗的基础。因此，本发明的另一方面即是保护家禽免受鸟类星状病毒感染引起的疾病侵袭的疫苗，其特征为此疫苗中含有上文所定义的CastV-2病毒，同时还伴有药学上可接受的载体或稀释剂。
此疫苗中可掺入减毒的或灭活的本发明CastV-2病毒。
本发明的疫苗可按照常规方法制备。例如，制备来源于对家禽致病的病毒，诸如感染性支气管炎病毒(Infectious bronchitisvirus)、马立克氏病病毒以及感染性囊病病毒的市售活疫苗和灭活疫苗常用的那些方法(Pastoret等人，兽医疫苗学(VeterinaryVaccinology)，Elsevier，Amsterdam，1997)可以用于制备此疫苗。
简而言之，将易感基质接种本发明CastV-2，并繁殖直到病毒复制达到期望的感染效价，之后收获含CastV-2材料，可任选灭活，然后与可药用载体或稀释剂混合。
每一种能够支持CastV-2复制的基质均可被用于制备本发明的疫苗。这类基质包括原代(鸟类)细胞培养物，如鸡胚胎成纤维细胞(CEF)或鸡胚胎肝细胞(CEL)。通常，细胞在39℃孵育并可在24-48小时后感染，此时从培养物中去掉培养基，并在培养物中接种病毒并吸收20-40分钟。接着再加入新的培养基继续孵育24-96小时。此时可分开或一起收获受感染的细胞及细胞培养液。为了释放与细胞相结合的病毒，将受感染的细胞超声3×5秒钟。若需要，细胞残骸可通过过滤或离心去除。
因此，在进一步的实施方案中，本发明提供了以上定义的CastV-2感染的细胞培养物。
新的CastV-2也可以在受孕鸡蛋中繁殖。
CastV-2的减毒可以通过在支持该病毒复制的细胞培养物，例如原代细胞培养物(如CEL细胞培养物)或已经建立起来的细胞系中进行标准连续传代来实现。在这种情况下，可以使用5-150，优选20-50代的传代水平。显然，此新CastV-2的自然发生的减毒株也可用于活疫苗的制备。
含有该活病毒的本发明疫苗可以以悬浮液或冻干形式制备和销售，并额外含有药学上可接受的载体或用于这类组合物的常规稀释剂。载体包括稳定剂、防腐剂和缓冲剂。合适的稳定剂是例如SPGA、糖类(如山梨糖醇、甘露糖醇、淀粉、蔗糖、葡聚糖、谷氨酸或葡萄糖)、蛋白质(如干乳清、白蛋白、酪蛋白)或它们的降解产物。合适的缓冲剂如碱金属磷酸盐。合适的防腐剂有噻汞撒、硫柳汞和庆大霉素。稀释剂包括水、含水缓冲液(如缓冲盐水)、醇类及多元醇(如甘油)。
如果需要，本发明的活疫苗可含有佐剂。具有佐剂活性的适当化合物和组合物的实例与下文中提到的灭活疫苗中的相同。
尽管本发明的疫苗可以通过经例如肌内、皮下或in ovo等途径注射给药，但是该疫苗优选采用家禽免疫接种常用的廉价大规模施用(mass application)途径给药。对于此CastV-2疫苗，该途径包括饮用水、喷洒和气雾免疫。
作为另一种选择，本发明还提供含灭活(杀死)形式的新CastV-2的疫苗。
在病毒繁殖步骤后对收获的病毒灭活的目的是消除病毒的复制。一般而言，可以通过本领域熟知的化学或物理的方法达到此目的。甲醛和β-丙酸内酯是合适的灭活剂。
含有灭活CastV-2的疫苗可含有例如一种或多种上文所提到的适于该目的的可药用载体或稀释剂。
优选地，本发明的灭活疫苗含有一种或多种具佐剂活性的化合物。用于该目的的适当的化合物或者组合物包括氢氧化铝、磷酸铝或氧化铝，基于例如矿物油，如
Figure C0382203600091
或
Figure C0382203600092
，或植物油如维生素E醋酸盐的水包油或油包水乳状液，和皂苷类。
本发明的疫苗含有有效剂量的CastV-2作为活性成分，即一定量的免疫性CastV-2物质，该量将在接种的鸟类体内诱导针对烈性病毒攻击的免疫。在此，免疫被定义为在接种后的鸟群体中诱导的保护水平比未接种群体在统计学上显著提高。
典型地，本发明的活疫苗施用剂量可以是每只动物101-106空斑形成单位(pfu)(1mL剂量)，优选每只动物103-105pfu。灭活疫苗可含有每只动物106-1010pfu的抗原当量(antigenic equivalent)。
灭活疫苗常通过肠胃外(如肌肉或皮下)途径给药。
本发明CastV-2疫苗不仅可以对鸡有效，对其它家禽，如火鸡，也可以成功地使用此疫苗接种。鸡包括肉仔鸡(broilers)、小母鸡(pullets)、繁殖鸡及产蛋鸡。
无论之前是否作为年幼种禽接种CastV-2，都可能通过接种亲本种禽(例如12-16周龄的肉鸡繁殖种禽)诱导抗体反应。这种接种方案诱导产生的抗体效价高，并可通过卵黄传给后代，以提供对抗野外星状病毒早期攻击的保护。也可能对雏鸟进行接种，尤其是在生命早期(优选在若干日龄时)接种活的减毒疫苗，以诱导自动免疫。
本发明还包括联合疫苗，它除了包括上文所述的CastV-2外，还含有感染家禽的其它病原体的一种或多种疫苗成分。
优选地，这种联合疫苗还包含马立克氏病病毒(MDV)、感染性支气管炎病毒(IBV)、新城疫病毒(Newcastle disease virus，NDV)、减蛋综合症(egg drop syndrome，EDS)病毒、火鸡鼻气管炎病毒(turkeyrhinotracheitis virus，TRTV)或呼肠孤病毒的一种或者多种疫苗株。
本发明的CastV-2也可用于制备诊断试验制剂(diagnosticassays)。CastV-2可用作抗原在免疫试验中用于在被怀疑感染该病毒的动物样品中检测CastV-2抗体。或者，CastV-2可以被用于产生检测例如CastV-2抗原的诊断试验用的抗血清。
实施例
实施例1CastV-2病毒株的分离
CastV-2-VDU/As1
将从10只患腹泻的肉仔鸡(5日龄)取得的气管和肛门拭样并用PBS洗涤，并将每个样本的全部体积(0.2mL)液体接种到CEL培养物中。6天后在一个接种气管拭样的培养物中观察到由星状病毒引起的致细胞病变。从其它样品中分离得到了呼肠孤病毒和腺病毒。此星状病毒被空斑纯化3次，然后从一个含至少10个空斑的平板中取出一个空斑。
CastV-2-VDU/As2
从一周龄显示生长不均的肉仔鸡体内取出十份1mL的肝素化血样品。(用台式离心机)离心分离得到白细胞。将约0.1mL压紧白细胞接种到两个48小时鸡胚胎肝(CEL)6厘米细胞培养平板每一个的培养基中。
5％CO2空气、37℃孵育24小时后，从培养物中去除白细胞和培养基。使用磷酸缓冲盐水(PBS)清洗培养物并补充此维持培养基。
继续孵育6天后，在两个接种白细胞的培养物中观察到由星状细胞引起的致细胞病变。从中没有分离出其它病毒。
CastV-2-VDU/As3
此病毒由患有腹泻的三周龄鸡(匀浆的)小肠(SI)中分离得到。小肠样品通过初筛过滤，用PBS稀释100倍，此PBS中含有5倍正常细胞培养水平的青霉素和链霉素。然后将此样品(台式离心机)离心去除颗粒残骸，上清以10倍为梯度，逐步稀释至10-6，每个梯度稀释液接种到四个CEL平板上。待吸收40分钟后，将平板覆盖含0.9％琼脂的培养基，其中两块板再加入正常液体维持培养基。
4天后，在不超过10-3的稀释度观察到典型的呼肠孤病毒空斑及CPE。
在10-4稀释度在一个平板上观察到一个空斑。将此空斑挑出并接种到新鲜的CEL培养物上，到第5天培养出典型的星状病毒CPE。病毒再进行两次空斑挑斑，之后保存病毒库。
收获此病毒感染的CEL培养物：
收集表现出致细胞病变的CEL培养物的培养液上清液并于-70℃冻存。
用橡胶细胞刮棒收集CEL细胞并于-70℃冻存。
当使用空斑滴定试验进行滴定时，上清液和细胞都含病毒。通常细胞中的效价比上清液的效价高10倍以上。
将CAstV-2病毒株VDU/As2的样品于2002年9月13日保藏在法国巴黎巴斯德研究所的国立微生物保藏中心(CollectionNationale de Cultures de Microorganismes of the InstitutePasteur)(28，Rue du Docteur Roux，F-75724 Paris Cedex 15)，保藏编号为I-2932。
实施例2CastV-2的免疫学表征
材料与方法
特异性抗血清的制备
将十只2周龄的SPF鸡(White Leghorn)以106pfu/只鸡的剂量口服接种活的CastV-2。四周后每只鸡再在皮下接种109pfu的混有不完全弗氏佐剂的CastV-2(体积为0.5mL/只鸡)。最后一次接种后4周取血，分离出血清并在-20℃保存。此血清中和效价变化范围为256-1024。通过类似方法制备抗其它鸟类星状病毒的血清。
病毒中和试验
对CastV-2、ANV(除表1b所描述的ANV实验外)、TastV和DVH-2抗体试验采用空斑减少试验。抗血清以磷酸缓冲盐水按照两倍梯度稀释。将等体积的每种稀释的抗血清(通常取0.5mL)与等体积的稀释成含0.1mL约200空斑形成单位(pfu)的病毒制品混合。
将此抗血清/病毒混合物在室温(20-22℃)孵育40分钟，然后，将各稀释度取出0.1mL接种到两块6cm盛有48小时铺满鸡胚胎细胞培养物的已去除培养基的平皿中。
在38.5℃吸收40分钟后给培养物覆盖含有1％细菌用琼脂(Bacto agar)的EAGLES维持培养基。
将此培养物于5％CO2空气，38.5℃条件中培养5天，然后每块平板中加入2mL中性红溶液。
24小时后对空斑计数，使用入射光或对着白色背景进行观察。
使用接种有一种病毒/抗血清稀释液的两块平板上的空斑数的平均值计算中和反应后存活的病毒空斑形成单位百分率，与病毒阳性对照和对照阴性血清比较。
抗血清的效价被表示为同阴性对照血清相比，最接近给出菌斑减少75％的抗血清稀释度的倒数。所有的血清效价都按照加入等体积病毒后的终稀释度计算。
表1b描述的ANV抗体试验使用了微量滴定中和试验。病毒溶液以MEM稀释达到200组织培养感染剂量(tissue culture infectivedoses，TCID)/0.1mL，将血清的2倍连续稀释物与等体积的此稀释病毒混合。室温孵育1小时后从每个稀释度中取出0.1mL加入96孔板中4个微量滴定孔，每孔中再加入0.1mL生长培养基和3×104个细胞。在每个试验中还包括病毒滴定和阴性血清。在38.5℃，CO2气氛条件下孵育5天，通过显微镜读数。50％孔显示CPE的稀释度值即是血清效价。
免疫荧光试验(IFT)
在24孔板中培养易感细胞。当铺满时将它们用病毒感染。感染的培养物在接种12-18小时后用100％甲基化酒精(meths)固定1小时，倒掉甲基化酒精。当甲基化酒精挥发完后，向固定的细胞中加入小体积的鸡抗血清(足够盖住细胞层)。在38.5℃孵育45分钟。然后用PBS清洗细胞层3-5次。以需要的稀释度将细胞层上加入小体积的适当兔IgG全分子FITC缀合物(足够盖住细胞层)。再在38.5℃孵育45分钟。然后再次用PBS清洗细胞层(3-5次)。最后加入50∶50的PBS∶甘油混合物(足够盖住细胞层)。此容器4℃避光保存，直到用荧光显微镜观察。感染的细胞显示细胞质荧光。
凝胶扩散试验
在用于凝胶扩散试验前，通过冻融感染的细胞悬液并加入等体积饱和硫酸铵，之后(过夜)沉淀和离心，来浓缩抗原混合物。浓缩的抗原在盛有PBS的容器中透析。
将抗原加入中心孔(2％琼脂糖凝胶)，外周孔加入待测试的血清。在潮湿容器中37℃孵育过夜。
如果发生了阳性抗体反应，则在抗原孔和抗体孔之间可观察到沉淀线。
结果
表1a鸟类星状病毒CastV-2、ANV与TastV间的免疫学关系
Figure C0382203600141
表1b鸟类星状病毒CastV-2、ANV与DVH-2间的免疫学关系
Figure C0382203600142
注释：
*＝血清效价
-＝阴性反应
+＝阳性反应
ND＝未试验
表2CastV-2病毒株之间的免疫学关系
Figure C0382203600151
注释：
*＝血清效价
+＝阳性反应
这些表格记载的结果证明，一方面，CastV-2病毒株构成了免疫学相关病毒的同源组，另一方面，CastV-2同其它鸟类星状病毒在免疫学上不同。
实施例3幼鸡致病性试验
向二十只日龄SPF鸡接种剂量为105.6pfu的CastV-2病毒株a的分离物。此病毒从该病毒的10-4稀释物经过了三次空斑挑斑，并经过了总共6代CEL培养传代。
所有接种的鸡都表现出腹泻，排泄物中含未完全消化的食物。感染5天后4只鸡被处死，它们全部表现出一定程度的小肠膨大。
17只未感染对照鸡没有表现出上述症状，且在第5天5只鸡被处死时发现其小肠正常。

Claims (11)

1、2型鸡星状病毒(CAstV-2)，其特征在于，此病毒是法国巴黎巴斯德研究所的国立微生物保藏中心(CNCM)保藏的、保藏编号为I-2932的CAstV，或能诱导产生中和此保藏病毒的抗血清的免疫学上相关的CAstV。
2、感染了权利要求1的CastV-2的细胞培养物。
3、权利要求2的细胞培养物，其特征在于此细胞培养物为鸡胚肝(CEL)细胞培养物。
4、用于保护家禽抵御鸟类星状病毒感染引起的疾病的疫苗，其特征在于此疫苗含有权利要求1的CastV-2以及药学上可接受的载体或稀释剂。
5、权利要求4的疫苗，其特征在于CastV-2为活的减毒形式。
6、权利要求4的疫苗，其特征在于此疫苗进一步含有能感染家禽的其它病原体的一种或多种疫苗成分。
7、权利要求4-6之任一项的疫苗，其特征在于此疫苗含有佐剂。
8、制备CastV-2抗原物质的方法，其特征在于将权利要求1的CastV-2在细胞培养物中繁殖并随后从细胞培养物中收获。
9、制备权利要求4-7任一项的疫苗的方法，其特征在于将权利要求1的CastV-2与药学上可接受的载体或者稀释剂混合。
10、权利要求4-7任一项的疫苗在制备保护家禽抵御鸟类星状病毒感染引起的疾病的药物中的用途。
11、权利要求10的用途，其中所述家禽是鸡。
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* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
GB0600081D0 (en) * 2006-01-04 2006-02-15 Univ Belfast Chicken virus vaccine and diagnostic
US8277814B2 (en) 2008-04-28 2012-10-02 Intervet International B.V. Avian Astrovirus
MX2010014562A (es) * 2008-06-26 2011-04-27 Ceva Sante Animale Sa Nuevo astrovirus.
WO2010059899A2 (en) * 2008-11-20 2010-05-27 University Of Georgia Research Foundation, Inc. Vaccine for runting-stunting syndrome
CN108251558A (zh) * 2017-12-21 2018-07-06 扬州大学 用于鸡星状病毒检测的实时荧光定量rt-pcr试剂盒及其应用

Family Cites Families (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DK0639640T3 (da) * 1993-07-30 2001-01-02 Akzo Nobel Nv Fjerkrævaccine indeholdende smitsomt bronchitis-virus serotype 4/91

Non-Patent Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
Avian astroviruses.. Koci,M.D.AVIAN PATHOLOGY,Vol.31 No.3. 2002
Avian astroviruses.. Koci,M.D.AVIAN PATHOLOGY,Vol.31 No.3. 2002 *
Avian Nephritis virus as a new member of the familyAstroviridae and construction of infectious ANV cDNA.. Imada, T.Journal of Virology,Vol.74 No.18. 2000
Avian Nephritis virus as a new member of the familyAstroviridae and construction of infectious ANV cDNA.. Imada, T.Journal of Virology,Vol.74 No.18. 2000 *
中国畜牧兽医学会禽病学分会第十一次学术研讨会论文集. 凌育，362-366，广东省家禽科学研究所. 2002
中国畜牧兽医学会禽病学分会第十一次学术研讨会论文集. 凌育，362-366，广东省家禽科学研究所. 2002 *

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