JP2005534320A5

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Publication number: JP2005534320A5
Application number: JP2004526238A
Authority: JP
Filing date: 2003-07-30
Publication date: 2006-02-16
Anticipated expiration: 2023-07-30

Description

合成および生物活性ペプチドおよびタンパク質ドメインもまた、本発明の方法を用いて細胞をトランスフェクションするのに用いることができる。たとえば、ＡＡＹＡＮＡＡＶＥ（配列番号１）の配列を含む合成ペプチドを、細胞をトランスフェクションして細胞中のタンパク質チロシンキナーゼ（ＰＴＫ）活性を監視するのに用いることができる。このペプチドは近年、組み換え酵母においてＰＴＫ活性の迅速検出のための共通ＰＴＫ基材として用いられている（Clark,D.D.&Peterson,B.R.,J.Am.Chem.Soc.,1,207-209(2002)）。

補助試薬
本発明の特定の実施形態は補助試薬に関して記載される。一実施形態では、補助試薬はＤＥＡＥ−デキストラン、デキストラン、ポリリジン、およびポリエチルアミンのようなポリマーである。他の一実施形態では、補助試薬はまた、フィブロネクチンおよびゼラチンのような細胞接着促進タンパク質であってよい。補助試薬は糖を基礎とするゼラチン（たとえば、ポリエチレングリコール）または、アクリルアミドのような合成のまたは化学品を基礎とするゼラチンであってよい。別の一実施形態では、補助試薬はＡｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ｓｅｒ（配列番号２）、Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ｓｅｒ−Ｐｒｏ−Ａｌａ−Ｓｅｒ−Ｓｅｒ−Ｌｙｓ−Ｐｒｏ（配列番号３）、などといったＲＧＤペプチドであってもよい。あるいは、補助試薬はハイドロゲルおよびＲＧＤペプチドの混合物、および前述の分子の任意のものの混合物である。補助試薬の使用は細胞へのタンパク質送達の効率を高める。

実施例；β−ガラクトシダーゼの細胞への逆送達
材料
使用した材料は下記のものを含む；β−ガラクトシダーゼ（グレードＶＩＩＩ、Ｅ．Ｃｏｌｉから精製）、ＲＧＤペプチド（ｇｌｙ−ａｒｇ−ｇｌｙ−ａｓｐ−ｓｅｒ（配列番号４）、およびｇｌｙ−ａｒｇ−ｇｌｙ−ａｓｐ−ｓｅｒ−ｐｒｏ−ｌｙｓ（配列番号５））、デキストラン（Ｍ．Ｗ．４５０００Ｄａ）、およびＤＥＡＥ−デキストラン（Ｍ．Ｗ．４００００Ｄａ）（ＳｉｇｍａＣｈｅｍｉｃａｌ社（ミズーリ州Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ））；Ｃｈａｒｉｏｔ（Ｐｅｐ−１）（ＡｃｔｉｖｅＭｏｔｉｆＩｎｃ社、カリフォルニア州Ｃａｒｌｓｂａｄ）；およびＨＩＶＧＰ−４１断片（５１９−５４１）（Ｂａｃｈｅｍ社（ペンシルバニア州ＫｉｎｇｏｆＰｒｕｓｓｉａ））；およびγ−アミノプロピルシラン（ＧＡＰＳ）スライドはＣｏｒｎｉｎｇＩｎｃ社から入手した（品番２５５０）（ニューヨーク州Ｃｏｒｎｉｎｇ）。細胞培地はＧｉｂｃｏ社から入手した。β−ガラクトシダーゼ染色キットはＱｉａｇｅｎ社から入手した。他の化学薬品はＳｉｇｍａ社から入手した。

図３に解される通り、タンパク質を含むスポット上の細胞の、ある割合がＸ−ｇａｌ染色後に青くなり、表面上のこれらのタンパク質が細胞に入りこれらのタンパク質が細胞の内部でまだ完全に機能することを示唆する。Ｘ−ｇａｌ染色後の青色の出現によって証明される通り、β−ｇａｌおよび送達媒体（ＶＰ４１断片）を含む混合物スポット上に置かれた場合、両方の細胞株の細胞がトランスフェクションされる。逆送達過程は相対的に短い時間を要した。反応は典型的には３時間以内に起こった。細胞中へのタンパク質送達は非常に効率的であるように見える。タンパク質−混合物スポット上に播種された細胞はわずか３時間の短時間でトランスフェクションされた。無血清培地の使用は必要ではないが、無血清培地の使用は逆タンパク質送達過程のトランスフェクション効率を確かに改善する。ＤＥＡＥ−デキストラン、デキストラン、ＲＧＤペプチド（Ｇｌｙ−Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ｓｅｒ−Ｐｒｏ−Ｌｙｓ（配列番号５））またはこれらの試薬の組み合わせの存在もまた効率を改善する。一部の実験では、混合物スポットに接着した細胞をＸ−ｇａｌ染色後にトリプシン処理し、マイクロプレートウェルに再播種した。注目すべきことに、ｘ−ｇａｌの青色は細胞内に留まり、青色は実際に細胞内であって細胞内に送達された完全に機能するβ−ｇａｌに由来することを強く示唆した。

Claims

タンパク質をトランスフェクションされた細胞のアレイを表面上に作製する方法であって、タンパク質含有混合物を、不連続な定められた配置で表面上にスポットし；スポットがアレイ条件下で表面に付着したままであるように、タンパク質含有混合物を有する前記表面を乾燥し；細胞を添加して、タンパク質と細胞の両方を有する表面を作製し；さらに前記タンパク質を前記細胞中に輸送する：工程を含む方法。
タンパク質の細胞への進入を促進する条件下に前記表面を維持し、前記タンパク質を含む細胞のアレイを作製することをさらに含むことを特徴とする請求項１記載の方法。
前記タンパク質含有混合物が、目的タンパク質およびキャリヤー試薬を含むことを特徴とする請求項１または２記載の方法。
目的タンパク質を初代細胞株に送達する方法であって、細胞の第１の集団を提供し；前記細胞の第１の集団に、前記目的タンパク質のＤＮＡ構築物を導入し；前記細胞の第１の集団を表面上に置き；前記細胞の第１の集団をｉｎｓｉｔｕで溶解するか、または、前記目的タンパク質を前記細胞の第１の集団に分泌させ；前記目的タンパク質を前記表面上に捕捉し；前記目的タンパク質をキャリヤー試薬と反応させ；細胞の第２の集団を前記目的タンパク質上に置き；さらに、前記目的タンパク質を前記細胞の第２の集団に輸送する；工程を含む方法。
前記目的タンパク質が、生物活性ペプチド、タンパク質ドメイン、細胞内タンパク質、酵素、細胞表面タンパク質、毒素タンパク質、抗体、抗体−核酸複合体、タンパク質−核酸複合体、ペプチド−核酸複合体、タンパク質−ナノ粒子複合体、タンパク質−ポリマー複合体、タンパク質−有機化合物またはタンパク質−無機化合物間の複合体、複数タンパク質複合体、または任意のアミノ酸含有物質を含むことを特徴とする、請求項３または４記載の方法。
前記目的タンパク質が、移送ドメインおよび目的タンパク質ドメインを含む融合タンパク質を含むことを特徴とする請求項３または４記載の方法。
前記キャリヤー試薬が、天然または合成の輸送ペプチド、またはリポソームであるか、あるいは、生物活性細胞膜透過性試薬；細胞膜輸送ペプチド；タンパク質導入ドメイン（ＰＴＤｓ）を含むペプチド；シグナル配列；生物活性ペプチド；または細胞表面受容体に特異的に結合しそれを活性化することができるリガンド；を含むことを特徴とする、請求項３から６いずれか１項記載の方法。
前記タンパク質含有混合物が補助試薬をさらに含むことを特徴とする請求項１から３いずれか１項記載の方法。
タンパク質含有混合物を提供し；前記タンパク質含有混合物を定められた配置で表面上に置き；前記タンパク質含有混合物を前記表面に付着させ；さらに細胞を表面上に播種する：工程を含む方法によって作製され、前記タンパク質含有混合物が：ａ）目的タンパク質；ｂ）キャリヤー試薬と複合体を形成した目的タンパク質；ｃ）キャリヤー試薬と目的タンパク質との複合体；または（ｂ）および（ｃ）の混合物の溶液であることを特徴とするアレイ。
基材表面上にＤＮＡテンプレートを提供し；表面上で前記ＤＮＡテンプレートからタンパク質をｉｎｓｉｔｕで合成し；前記タンパク質を前記表面に付着させ；前記合成されたタンパク質をキャリヤー試薬と反応させ；細胞を前記表面に添加し；さらに前記タンパク質を前記細胞中に輸送する：工程を含む表面媒介性タンパク質送達法によって作製された、トランスフェクションされた細胞クラスターアレイ。
前記タンパク質合成工程が、無細胞反応として行われることを特徴とする請求項１０記載のアレイ。
前記目的タンパク質が、生物活性ペプチド、タンパク質ドメイン、細胞内タンパク質、酵素、細胞表面タンパク質、毒素タンパク質、抗体、抗体−核酸複合体、タンパク質−核酸複合体、ペプチド−核酸複合体、タンパク質−ナノ粒子複合体、タンパク質−ポリマー複合体、タンパク質−有機化合物またはタンパク質−無機化合物間の複合体、複数タンパク質複合体、または任意のアミノ酸含有物質を含むことを特徴とする、請求項９から１１いずれか１項記載のアレイ。
前記目的タンパク質が、移送ドメインおよび目的タンパク質ドメインを含む融合タンパク質を含むことを特徴とする請求項９から１１いずれか１項記載のアレイ。
前記キャリヤー試薬が、天然または合成の輸送ペプチド、またはリポソームであるか、あるいは、生物活性細胞膜透過性試薬；細胞膜輸送ペプチド；タンパク質導入ドメイン（ＰＴＤｓ）を含むペプチド；シグナル配列；生物活性ペプチド；または細胞表面受容体に特異的に結合しそれを活性化することができるリガンド；を含むことを特徴とする、請求項９から１３いずれか１項記載のアレイ。
前記タンパク質含有混合物が補助試薬をさらに含むことを特徴とする請求項９記載のアレイ。