JP2005532533A5

JP2005532533A5 -

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Publication number: JP2005532533A5
Application number: JP2003582178A
Authority: JP
Filing date: 2002-11-14
Publication date: 2009-07-30
Anticipated expiration: 2022-11-14

Description

エンティティ（酵素、抗体、タンパク質、ＤＮＡ、ヌクレオチド、ＰＮＡ、炭水化物、脂肪酸、レクチン、ペプチド、受容体、発色団、発蛍光団、化学発光性化合物、デンドリマー、ＪもしくはＨ凝集体、細胞、バクテリア、ウイルス、すべての原核生物もしくは真核生物、膜（合成または天然）、フラーレン、ナノチューブなど）の固定化は活性化された固体表面との単純な共有結合反応によって実施できる。例えば、粒子（例えばミクロスフェアおよびナノスフェア；任意の大きさ、形状または組成を有する１種もしくは複数の金属を含む金属粒子；半導体粒子、分子インプリントポリマー（ＭＩＰＳ）、磁性粒子；または着色材料）またはマイクロタイタープレートは固定化システムにおける、一般的な固体マトリックスである。活性のある官能化された表面の調製と保持は、高感度アッセイを開発するための十分な生物学的材料の確実な固定化に重要な要素である。現在の固体表面への生体分子の固定化手順では、活性化アミノ基もしくはカルボキシル基誘導固体表面とアミノもしくはチオール修飾生体分子との反応を用いる。活性化後、または官能化スペーサの導入後、これらの基は直接結合部位を提供する。ほとんどの官能基（ＮＨＳエステル、イソチオシアナートなど）は水性雰囲気で加水分解しやすく、１時間足らずで活性でなくなる（すなわち化学的に不活性化される）。

生体分子（オリゴヌクレオチド、タンパク質または炭水化物など）を蛍光性ミクロスフェア上に固定化するために最も頻繁に使用される方法は、表面のカルボキシ基を活性化することによるものである。活性化は、過剰のＥＤＣとカップリングｐＨ４〜６を必要とする。反応は、カルボジイミドとカルボキシル基の間での、活性化されたＯ−アシル尿素誘導体の中間形成を伴う。続く生体分子のアミノ基の第一窒素による求核的攻撃により、置換された尿素の放出を伴ってアミド結合が形成される。Ｏ−アシル尿素生成の最適ｐＨは約ｐＨ４〜５である。中間体の半減期は非常に短く、中間体は急速に加水分解を受ける、あるいは転移してＮ−アシル尿素付加体を生成する。求核試薬の第一アミノ基は約ｐＨ４〜５で大部分プロトン化され、したがってほとんど反応性がない。これらの制約によりカップリング収率が大幅に制限される。核酸塩基は低いｐＨで強いプロトン化を受ける。この種のプロトン化はらせん体の疎水性核を暴露するＤＮＡの融解を誘発し、固体マトリックスとの非特異的な疎水性相互作用を増進させる。これらの欠点にも関わらず、ＥＤＣ媒介カップリングは現在、生体分子の固体表面への共有結合固定化の主要な方法である（Ｈｅｒｍａｎｓｏｎ，Ｇ．Ｔ．ｉｎＢｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ、ＡｃａｄｅｍｉｃＰｒｅｓｓ；Ｎ．Ｙ．１９９６年；ＡｎｄｒｅａｓＦｒｅｙらのＢｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅＣｈｅｍ．１９９９年、１０、５６２〜７１頁；ＭａｘｉｍｅＡ．ＧｉｌｌｅｓらのＡｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１９９０年、１８４、２４４〜４８頁；ＶｉｖｉｅｎＷ．Ｆ．ＣｈａｎらのＢｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ．、１９８８年、第１５１巻２号、７０９〜１６頁；ＩｖａｎＬ．ＶａｌｕｅｖらのＢｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ、１９９８年、１９、４１〜４３頁）。

本発明の新規反応基はリンカー（Ｌ）によってエンティティＢ、Ｂ’等にコンジュゲートされており、Ｌはｎ個（例えば２〜１０００個）のＨ、Ｃ、Ｏ、Ｎ、Ｓｉ、Ｐ、Ｓの原子を線状もしくは分枝鎖、環またはこれらの組合せで有する炭化水素リンカーである。

具体的には、本発明は構造体１〜６の１個または複数を任意の組合せで含む新規のコンジュゲート組成物であって、

*** image (S1-S6) ***
その際、式中、
ｎは０、１、２または３であり、
ＸおよびＹは任意の組合せで酸素および／または硫黄であり、
Ｘ₂およびＸ₃は１種もしくは複数のハロゲン、好ましくは塩素またはフッ素であり、
Ｙ₂は窒素または炭素であり、
ａｒｏｍは置換されたもしくは置換されていないフェニル、ナフチルまたは他の多環式芳香族構造体であり、
Ｚはハライド、好ましくはクロリドもしくはフルオリド、２，３，５，６−テトラフルオロ−４−スルホ−フェノキシド、Ｎ−ヒドロキシサクシニミドまたは他の求電子（離核性）基であり、
Ｒ₁〜Ｒ₆は１種もしくは複数のハロゲンまたはＯ、Ｎ、Ｓｉ、Ｐ、Ｓからなる群から選択されるヘテロ原子を任意選択で、線状もしくは分枝鎖、環またはそれらの組合せで含む２〜１０００個の原子を含有する炭化水素リンカー基である、
その際、さらに、任意の組合せの構造体１〜６の１個または複数は、そのそれぞれのリンカー基であるＲ₁〜Ｒ₆によって、少なくとも１種のエンティティＢに連結されており、Ｂが
２−Ｄフィルムもしくは基体；
有機ポリマー、ＭＩＰＳ、ガラス、金属、クレー、樹脂、珪藻土、ゼオライト、無機結晶体、半導体粒子、半導体ナノ結晶、磁性粒子、フラーレン、ナノチューブ、またはそれらの任意の組合せからなる任意の大きさもしくは形状のミクロ粒子もしくはナノ粒子；
酵素、抗体、タンパク質、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ヌクレオチド、ＰＮＡ、炭水化物、脂肪酸、レクチン、ペプチド、受容体、デンドリマー、細胞、バクテリア、ウイルス、すべての原核生物もしくは真核生物、合成膜もしくは天然膜、ビオチン、ハプテン、有機モノマーもしくはポリマー、またはそれらの任意の組合せ；
発色団、発蛍光団、生物発光性もしくは化学発光性化合物、ＪもしくはＨ凝集体、またはそれらの任意の組合せ；
そのそれぞれのリンカー基であるＲ₁〜Ｒ₆によって連結された１種または複数の任意の組合せの構造体１〜６、あるいはそれらの任意の組合せ
である組成物を対象とする。

具体的には、そのそれぞれのリンカー基であるＲ₁〜Ｒ₆によって、少なくとも１種のエンティティＢに連結された任意の組合せの１個または複数の構造体１〜６を有する上記の１種または複数のコンジュゲート組成物を提供するステップと、
２−Ｄフィルムもしくは基体；
有機ポリマー、ＭＩＰＳ、ガラス、金属、クレー、樹脂、珪藻土、ゼオライト、無機結晶体（半導体、半導体ナノ結晶、磁性粒子を含む）、フラーレン、ナノチューブ、またはそれらの任意の組合せからなる任意の大きさもしくは形状のミクロ粒子もしくはナノ粒子；
酵素、抗体、タンパク質、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ヌクレオチド、ＰＮＡ、炭水化物、脂肪酸、レクチン、ペプチド、受容体、発色団、発蛍光団、生物発光性もしくは化学発光性化合物、ＪもしくはＨ凝集体、細胞、バクテリア、ウイルス、すべての原核生物もしくは真核生物、合成膜もしくは天然膜、ビオチン、ハプテン、有機モノマーもしくはポリマーまたはデンドリマー、あるいはそれらの任意の組合せ
を含む１種または複数の求核体含有エンティティを提供するステップと、１種または複数のコンジュゲート組成物と前記１種または複数の求核体含有エンティティとを反応させて、１種または複数の構造体１〜６のリンカー基によって、前記１種または複数の求核体含有エンティティに連結された少なくとも１種のエンティティＢを作製するステップとによって２種以上のエンティティを一緒にカップリングする方法を対象とする。

本発明の他の好ましい実施態様は、
（ａ）ｎが０、１、２または３であり、
（ｂ）ＸおよびＹが任意の組合せで酸素および／または硫黄であり、
（ｃ）ＺおよびＲ₁がハロゲン（クロリド、フルオリドを含む）；２，３，５，６−テトラフルオロ−４−スルホ−フェノキシド；Ｎ−ヒドロキシサクシニミド；および同様の求電子基、またはそれらの任意の組合せである上記の構造１の組成物を、
２−Ｄフィルムもしくは基体；
有機ポリマー、ＭＩＰＳ、ガラス、金属、クレー、樹脂、珪藻土、ゼオライト、無機結晶体、半導体粒子、半導体ナノ結晶、磁性粒子、フラーレン、ナノチューブ、またはそれらの任意の組合せからなる任意の大きさもしくは形状のミクロ粒子もしくはナノ粒子；
酵素、抗体、タンパク質、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ヌクレオチド、ＰＮＡ、炭水化物、脂肪酸、レクチン、ペプチド、受容体、発色団、発蛍光団、生物発光性もしくは化学発光性化合物、ＪもしくはＨ凝集体、細胞、バクテリア、ウイルス、すべての原核生物もしくは真核生物、合成膜もしくは天然膜、ビオチン、ハプテン、有機モノマーもしくはポリマーまたはデンドリマー、あるいはそれらの任意の組合せを含む１種または複数の求核体含有エンティティと反応させて、
架橋した１種または複数の求核体含有エンティティを提供する方法を対象とする。

ジアミンとヒドラジドは疎水性表面を提供することが知られている（表２、５〜８）。ポリエチレンアミン（表２、９）はミクロスフェアの表面電荷を制御するのに用いられる「プロトンスポンジ」効果を示す。ポリアミドとポリスルホンアミド（表２、１０〜１３）は約１〜２のｐＫａを有する酸性プロトンを含む。したがって、これらのリンカーは生理学的なｐＨでポリアニオンを提供し、それによって長期保存安定性がもたらされる。デンドリマーすなわち高度に分枝したリンカー（表２、１４）は、十分定義された形態構造に適合することが知られており、反応基に１種のカプセル化をもたらし、これによって反応基を加水分解から保護する。ＤＴＰＡ（ジエチレントリアミン五酢酸）リンカー（表２、１５）は多カルボキシレート体を提供する。この種のリンカーは安定した金属錯体を形成することが知られている。固定化の程度を改善するためにポリアクリル酸およびポリリシン鎖（表２、１６〜１７）を導入することができる。