JP2005520822A - オスモライトおよび二価微量元素を含むコリン−ケイ酸複合体 - Google Patents

Abstract

本発明は、オルトケイ酸およびケイ酸、第一の（「一定／第一」）オスモライトコリン、および遊離ヒドロキシル基を含まない弱いアルカリ化剤を含む生物学的調製物、およびｉ）ケイ素含有コリン溶液を加水分解し、それにより、コリン安定化オルトケイ酸およびオリゴマー溶液を形成させ；ii）ヒドロキシル基を含まない弱いアルカリ化剤を添加することによって、該コリンオルトケイ酸およびオリゴマー溶液をアルカリ化し；次いでiii）所望により、二価微量元素および／または第二のオスモライトを添加することを特徴とする該調製物の製法、および得られる調製物およびその使用に関する。

Description

発明の詳細な説明

本特許出願は、Ｃａ^２＋および／またはオスモライトを用いる、植物、動物およびヒトのための特別なコリン−（オルト）ケイ酸複合体の使用および調製を記載する。コリンは、ヒト、植物および動物で生物学的に利用可能な直ちに使用できる安定な溶液を調製することができるように、非常に低いｐＨにて、高度に濃縮されたオルトケイ酸（ＯＳＡ）およびオリゴマーのゲル化を阻害する。ＯＳＡのポリマーは、数百または数千のモノマー（ＯＳＡ）と呼ばれる単位から形成された（マクロ分子とも呼ばれる）巨大分子であり、他方、オリゴマーは数個のモノマーよりはかなり大きいが、マクロ分子よりも小さい中間的なサイズの分子である（Brinker CJら, Sol-Gel Science, The Physics and Chemistry of Sol-Gel processing, Academic Press, Boston, p.5）。また、コリンは、ヒトおよび動物の脂肪代謝で重要な役割を演じ、我々の細胞膜の重要なリン脂質であるホスファチジルコリンの形態で全ての種類の生きた細胞の一部である。ヒトはグリシンからコリンを合成するが、この合成は、年間を通じて良好な健康状態のためには十分ではないようである。また、それは重要な神経伝達物質であるアセチルコリンとしても存在する。それはビタミンＢ４として知られている。さらに、コリンはオスモライト、およびもう１つの重要なオスモライトであるベタインの前駆体である。それは、アルコール依存症、アルツハイマー病、狭心症、動脈硬化症、喘息、肝硬変、シスチン尿症、鬱病、糖尿病、湿疹、脂肪肝、毛髪および爪の問題、肝炎、高コレステロール、高血圧、腎臓障害、ＭＳ等のような疾患において補助食品として用いられている。また、それは、葉酸の作用に関連する。ほとんどの人々はその食品を通じて（レシチンとして）十分に摂取しているが、ほとんどの人々はコリンを欠乏しているという報告がある。葉酸の低い摂取は、身体におけるコリンの欠乏の理由であろう。ラットにおける最近の予備的な研究は、コリンが骨形成および骨再形成に関与し得ることを示している（Gugulielmotticら, IADR, 80th General Session, 2002）。コリンの毎日の摂取は２００ないし１０００ｍｇ／日と見積もられる。The National Academy of Sciencesは、１９９８年に、コリン欠乏食事についてのボランティアは十分なコリンを生じさせることができないことを示す研究（Zeisel, 2000, Nutrition, 16, 669-671）の後に、コリンを必須栄養素として分類した（Institute of Medicine, Food and Nutrition Board, Dietary reference Intake, 1998, 390-422）。コリンの欠乏は、マンガン欠乏ニワトリで見出されたもの、すなわち、骨、関節および軟骨の貧弱な発達と同様な軟骨における組織病理学的変化を引き起こすことが観察された。コリン、メチオニンおよびベタインとそれらの差との相互関係が最近レビューされている（Workelら, 1998, World Poultry, 14, 1998）。コリン単独はリン脂質の必須構成要素、骨の軟骨マトリックスの正常な成熟、およびブロイヤーにおけるペロシス（perosis)の予防として必要である。

植物、動物およびヒトにおけるケイ素の役割はよく記載されている。オルトケイ酸は生物学的に活性な分子であり、また、食品および飲料水中のケイ素はオルトケイ酸に処理されて、生物内で吸収され、輸送されることが知られている。非常に弱い酸であるオルトケイ酸は９．５よりも低い全てのｐＨにおいて非常に安定ではなく、迅速に沈殿されるか、またはゾルまたはゲルを形成し、これは生物にとって十分に利用できるものではない。従って、種々の生物のためのストック溶液として便利なオルトケイ酸およびオリゴマーの高度に濃縮された（＞０．５％ケイ素）溶液を調製するのは非常に困難である。以前の特許出願（ＷＯ ９５／２１１２４）においては、種々の温度において経時的に安定な高度に濃縮された溶液を調製する方法が記載されている。それらのストック溶液は、ゲルおよびゾルの形成を妨げるのに非常に酸性（ｐＨ＜１）である。その生物学的利用性は、他のケイ素化合物（ケイ酸塩、粘土、シリカ、ホーステイル(horsetail)、ゼオライト等）と比較して非常に高いが、それらの調製物は希釈の後には安定ではない。

濃縮された生物学的に利用可能なコリン−ケイ酸（ＳＡ）−オスモライト溶液の長期溶液を得るために、標準的な調製物が開発された。テストした全てのオスモライトから、ベタイン、イノシトール、エタノールアミン、グリシン、タウリンおよびマンニトール、ソルビトールのごとき単糖と組合せたコリンでの処方のみが、酸安定な溶液をもたらした。ベタインは健康な骨、軟骨、毛髪、爪および全ての種類のＧＡＧ系を維持する役割にかなり関与し得るので、それは好ましい。

これらのケイ酸希釈物は植物で（例えば、植物の葉への噴霧）、または広い範囲の動物（例えば、ブタ、家禽、ウマ）の飲料水で使用し得ることは知られていなかった。従って、水中のコリン−ケイ酸複合体を含む特別な溶液をテストし、特別な使用に適切に調製し、生物学的利用性および生理学的効果について比較した。以後、植物、動物およびヒトについての特別な調製物、および本発明のこれらの調製物を用いる予測されない結果を記載する。

植物および動物に対するカルシウムの利点は文献によく記載されている（Poovaiahら, 1988, Hortscience, 23, 267-71; Dellら, 1987, Handbook of Nutritionally Essential Mineral Elements, Marcel dekker, NY）。カルシウムは、コリンの圧力下でＯＳＡに関して完全に不活性であり、高度に濃縮されたＳＡの沈殿またはゲル化には干渉しないことは知られていなかった。文献では、塩の添加はゲル形成を加速し、特に、カルシウムイオンはケイ素の重合に対して非常に効果的であることが知られている（Healdら, 1955, J.Appl. Chem. London, 5, 425）。Ｃａ^２＋およびＯＳＡの種々の組合せをテストした後、驚くべきことに、Ｃａ^２＋は０．７未満のｐＨ値にて高度に濃縮されたＳＡ希釈物に干渉しないことが判明した。７．５までのｐＨ値を示す希釈物は０．０７％未満のケイ素濃度にて効果的に安定であり、これは、植物栄養素溶液、動物飲料水または動物食品用のスプレイとして用いるのに便宜である。従って、我々の調製におけるアルカリ化工程でＣａＣＯ_３としてのカルシウムの導入は適切である。Ｍｎ^２＋、Ｓｒ^２＋、Ｆｅ^２＋、Ｃｕ^２＋、Ｚｎ^２＋、Ｍｇ^２＋のごとき二価イオンのような他の微量元素を、アルカリ化工程の間、またはその後にＣａＣＯ_３と組みあわせて同時に添加することができよう。塩化物の形成およびその溶解性は限定的因子である。Ｚｎ^２＋の添加は動物適用において非常に興味深い。なぜならば、適切なＺｎは、不適切なＺｎ補足と共にＯＳＡ補足の間に血清で低下した唯一の元素であるように、高度に濃縮されたＯＳＡの吸収の間に身体から迅速に排除されるからである（低Ｚｎダイエット）。この観察は新しいものであり、不適切なＺｎ補足の間におけるＺｎとＯＳＡとを組合せる重要性を示す。興味深いことには、これらの結果は植物では得られなかった。植物におけるＺｎ濃度は、葉へのスプレイを通じての濃縮されたＯＳＡの添加の後には影響されなかった。ＳＡ−複合体ストック溶液は千倍に希釈し、夏場（７月および８月）の間に人参植物体に対するスプレイとして用いた。人参をＳｉ、Ｚｎ、Ｃｕ、Ｍｇ、ＣａまたはＦｅについて分析した。一週間に一回葉にスプレイした後に濃度が倍となったＳｉを除き、金属で見出された有意な差はなかった。

ＳＡ−コリン複合体の調製におけるアルカリ化工程の間でのＣａＣＯ_３の添加の結果、安定な溶液が得られ（低いｐＨ）、かなり生物学的に利用可能なものである。ｐＨを０．５まで増加させるための他のアルカリ（ＮａＯＨ、ＫＯＨ等）の添加の結果、一週間ないし三ヶ月後にゲル化が生じた。対照的に、ＣａＣＯ_３の添加は二年間の安定性を与える。我々はＣａＣＯ_３の代わりにアルカリ化でもう１つの化合物：オスモライトであるベタインを用いた。カルシウムとオスモライトとの組合せ、およびベタインと他のオスモライトとの組合せも可能であった。

本発明は、それらの製法による調製物、および障害および病気の治療における栄養物および医薬としてのそれらの使用に関する。

さらに、本発明は、穀物中の殺虫剤および毒性化合物の濃度を減少させるための、植物栄養素および／または真菌感染耐性剤としての生物学的調製物の使用に関する。

処方
全ての処方はコリンを含む。

カルシウムでの処方：
塩化コリンを真空下で乾燥し、乾燥した塩酸で処理する。四塩化ケイ素（ＩＶ）を、４０℃未満に維持する温度にて、形成された酸性コリン溶液に添加する（割合；ＳｉＣｌ_４−ｖｓ−塩化コリン：３ないし５モル当たり１モル）
加水分解のために（氷／氷水）を冷却しつつ溶液に添加し、ここに、温度は−１０℃ないし−３０℃の範囲内に保持する。水中の７０ないし７５％塩化コリンの溶液を、１：１の割合で加水分解溶液に添加する。得られた溶液を、１リットル当たり５０ｇ ＣａＣＯ_３の濃度の無水炭酸カルシウムの添加によってアルカリ化する。

^２９Ｓｉ−ＮＭＲを用いる構造の特徴付けは、炭素結合ケイ素（Ｓｉ）についてのスペクトル領域である−３０および−７０ｐｐｍの間にシグナルを示さなかった。スペクトルは、各々、Ｑ^０、Ｑ^１、Ｑ^２およびＱ^４種につき特徴的な−７２、−８２、−９２、−１０２および−１１２の周りに共鳴を示した。

カルシウムおよび亜鉛を含む処方２：
処方１に記載した調製物を調製する。アルカリ化の後に１００ｍｇ Ｚｎ／ｍｌの最終濃度にてＺｎＣｌ_２を添加する。

ベタインを含む処方３：
塩化コリンを真空下で乾燥し、乾燥した塩酸で処理する。四塩化ケイ素（ＩＶ）を、４０℃未満に維持する温度にて、形成された酸性コリン溶液に添加する（割合；ＳｉＣｌ_４−ｖｓ−塩化コリン：３ないし５モル当たり１モル）。
溶液Ａ：加水分解のために、冷却しつつ、水（氷／氷水）を溶液に添加し、ここに、温度は−１０℃ないし−３０℃の範囲内に保持する。
溶液Ｂ：１リットルのａ．ｄ．１を１．５ｋｇのベタインに添加することによって、蒸留水中にてベタイン溶液を調製する。
１．８リットルの７０ないし７５％塩化コリン水溶液を２リットルの溶液Ａに添加する。０．２リットルの溶液Ｂの添加によって、得られた溶液をアルカリ化する。

カルシウムおよびベタインでの処方４：
塩化コリンを真空下で乾燥し、乾燥された塩酸で処理する。四塩化ケイ素（ＩＶ）を、４０℃未満に維持する温度にて、形成された酸性コリン溶液に添加する（割合；ＳｉＣｌ_４−ｖｓ−塩化コリン：３ないし５モル当たり１モル）。
溶液Ａ：加水分解のために、水（氷／氷水）を冷却しつつ溶液に添加し、ここに、温度が−１０℃ないし−３０℃の範囲内に保持する。
溶液Ｂ：１リットルのａ．ｄ．１を１．５ｋｇのベタインに添加することによって、蒸留水中でベタイン溶液を調製する。
１．８リットルの７０ないし７５％塩化コリン水溶液を２リットルの溶液Ａに添加する。
０．１リットルの溶液Ｂおよび無水炭酸カルシウム（１リットル当たり２５ｇ ＣａＣＯ_３）双方の添加によって、得られた溶液をアルカリ化する。

カルシウムおよびタウリン（１００ｍｇ／ｍｌ）での処方５：
処方１に記載したごとき調製物を調製する。アルカリ化の後、１ミリリットル当たり１００ｍｇタウリンの最終濃度にて、タウリンを添加する。

ベタインおよびソルビトール（３００ｍｇ／ｍｌ）での処方６：
塩化コリンを真空下で乾燥し、乾燥された塩酸で処理する。四塩化ケイ素（ＩＶ）を、４０℃未満に維持される温度にて、形成された酸性コリン溶液に添加する（割合；ＳｉＣｌ_４−ｖｓ−塩化コリン：３ないし５モル当たり１モル）。
加水分解のために、冷却しつつ、水（氷／氷水）を溶液に添加し、ここに、温度は−１０℃ないし−３０℃の範囲内に維持される。１リットルのａ．ｄ．１を１．５ｋｇのベタインに添加することによって、蒸留水中に、ベタイン溶液を調製する。
溶液Ａ：加水分解のために、冷却しつつ、水（氷／氷水）を溶液に添加し、ここに、温度が−１０℃ないし−３０℃の範囲内に保持する。
溶液Ｂ：１リットルのａ．ｄ．１を１．５ｋｇのベタインに添加することによって、蒸留水中で、ベタイン溶液を調製する。
１．８リットルの７０ないし７５％塩化コリン水溶液を２リットルの溶液Ａに添加する。
得られた溶液を、０．２リットルの溶液Ｂを添加することによってアルカリ化する。アルカリ化の後、１ミリリットル当たり３００ｍｇソルビトールの最終濃度にて、ソルビトールを添加する。
全ての調製物は他の二価イオンと組合せることもできる。

実施例１：植物における増大した水保持。
ベタイン−コリン−ＳＡ調製物（０．９％Ｓｉ）を５００倍に希釈し、毎週レタス作物に噴霧した。同一起源の作物を有し、同一培養条件に維持した部位を、同時に、対照（水）および草本シリカ抽出物（Equisetum arvense）を噴霧した。収穫した作物のいくつかの生産パラメーターを調べて、頭部強固性、市販可能な部位、全新鮮重量および重量の喪失のような生産品質を記録した（表１）。ベタイン−コリン−ＳＡでの処理の結果、最高の新鮮重量および市販可能な部位が得られた。収穫された作物の品質はベタイン−コリン−ＳＡ処理の後に最高であった。というのは、重量の喪失は観察の間により低く、頭部強固性は対照または草本シリカ処理いずれと比較しても増加したからである。これらの結果は、ベタイン−コリン−ＳＡの適用が、植物の水保持を増加させることを示す。

実施例２：ベタイン−コリン−ＳＡを補足したニワトリにおける増大した骨密度
正常な食事（１．４ｍｇ Ｓｉ／ｇ）に付したブロイラーニワトリにベタイン−コリン−ＳＡ（Ｂ−ｃｈ−ＳＡ）を補足して、大腿部における血清カルシウム濃度および骨ミネラル含有量（ＢＭＣ）密度（ＢＭＤ）を調べた。
４２，５００のニワトリの群にその飲料水中にてＢ−ｃｈ−ＳＡ（１３．５ｍｇ Ｓｉ／１００ｋｇ体重／２日）を６週間投与し、これは、０．５％未満だけの全食事Ｓｉ摂取を増大させた。同一年齢の４２，６００ニワトリの対照群は同一の食物供給にて、しかしＢ−ｃｈ−ＳＡを補足することなく平行して出発した。３０のランダムに選択したニワトリの試料を、６週齢にて各群で採取し、血清カルシウム濃度および大腿部を分析した。大腿部ＢＭＣおよびＢＭＤをデュアルエネルギーＸ−線吸収測定によって分析した。スキャンを、全大腿部および大腿部における注目する５つの領域で記録した。平均の差をスチューデントの片側ｔ−検定で評価した。
血清Ｃａ濃度は、対照（６９．４７±１５．９９ｍｇ／ｍｌ，ｎ＝６０）と比較して補足したニワトリでは有意に高かった（ｐ＜０．０５）（７４．８５±１８．８２ｍｇ／ｍｌ，ｎ＝６０）。
ＢＭＣは、大腿部のスキャンした領域の全てにおいて、対照と比較して補足したニワトリでは有意に高かった。また、全ＢＭＣは、対照と比較して補足したニワトリにつき有意に高かった（＋８．４％，ｐ＝０．０１６）。
ＢＭＤは、対照と比較して補足したニワトリでは、中央骨幹（＋４．２５％，ｐ＝０．０２０９）、末端骨幹幹（＋４．８８％，ｐ＝０．０１０２）および臀部領域（＋５．６％，ｐ＝０．０１４）で有意に高かった。
Ｂ−ｃｈ−ＳＡの形態で０．５％未満だけブロイラーニワトリの全食事摂取を増加させた結果、大腿部の皮質および小柱骨において、有意に高い血清カルシウム濃度および高い骨質量および密度がもたらされた。

実施例３：人参における白黴感染の低下
人参における通常の真菌感染は、白色斑点として目に見える葉の白黴感染（Eryphe Heraclei）である。殺真菌剤が通常使用されるが、作物に吸収され、それは、消費者との毒性またはアレルギー反応をもたらすという不利を有する。
ベタイン−コリン−ＳＡの希釈物を３つの異なる人参の品種（Nerac、Tyne、Napa）に毎週噴霧し、播種から三月後に出発した。同一起源で、同一培養条件に維持した作物の部位に殺真菌剤を噴霧した。ベタイン−ｃｈ−ＳＡ、および殺真菌剤で処理した双方の作物は、処理を開始して一週間後に葉で顕著に少ない白色斑点を示し、未処理対照作物と比較した。影響を受けた葉のこの差は、作物の収穫まで観察された（表２）。

生産は、未処理作物比較してベタイン−ｃｈ−ＳＡ処理後に有意に高く、殺真菌剤で処理した作物に匹敵することが判明した。

実施例４：アマトウガラシ（sweet pepper)におけるケイ素の移動
アマトウガラシを栄養素溶液（水耕）で成長させた。ベタイン−コリン−ＳＡを栄養素溶液中に５００倍希釈した。同一起源で、かつ同一培養条件に維持した他の植物を補足した。葉および根におけるケイ素濃度を、補足から６週間後に原子吸光測定によって測定した。葉におけるケイ素濃度は、未補足対照と比較して、ベタイン−コリン−ＳＡを補足した植物の葉において１０倍高かった。これらの実験は、ベタイン−コリン−ＳＡからのケイ素は根から葉に移動することを明瞭に示す。

実施例５：植物における毒性化合物の葉の減少
殺虫剤は、真菌感染を予防するか、またはそれを治療するために、作物の栽培で通常用いられる。しかしながら、予防剤の使用はヒト、動物および環境に対するその毒性のため最小に維持すべきである。残留物の上限は収穫された作物について厳格に規制されており、作物の品質を保証するためにできる限り低くすることが必要である。カルシウム−コリン−ＳＡ（処方１参照）希釈物の適用は：
ｉ）作物を真菌感染に対してより耐性とし、これは殺真菌剤の低用量の使用を可能とし、
ii）収穫された作物における残留物の濃度を減少させる；
ことが判明した。

ａ）レタス
カルシウム−コリン−ＳＡ調製物を３ｍｌ／１０Ｌの濃度にて殺虫剤溶液に添加した。対照植物は殺虫剤のみで処理した（表Ａ参照）。
３日後、実生を植え、葉処理を開始し、４回反復した。処理間の期間は各回４日であった。作物を最後の処理から３週間後に収穫し、残留物（イプロジオン、ジチオカルバメート）の濃度を分析した。

残留物の濃度は、作物をカルシウム−コリン−ＳＡ調製物で処理した場合、有意に低かった：各々、ジチオカルバメートおよびイプロジオンにつき、６４％および３０％を超える減少が見出された（表Ｂ参照）。真菌に感染した作物はなかった。

ケイ素濃度が、カルシウム−コリン−ＳＡ調製物で処理したレタスでは４５％高かった（１０２μｇ Ｓｉ／ｇ乾燥重量）。

ｂ）ジャガイモ
カルシウム−コリン−ＳＡ調製物を、低用量の通常に使用される殺真菌剤Shirlan（フルアジナム、５００ｇ／Ｌ）と組合せた場合に、エキビョウキン（Phytophthora）感染の発生を評価した。Shirlanの最小の推奨用量は、作物のPhytophthora感染を予防するには、１ヘクタール当たり０．４リットルである。殺真菌剤用量を５０％減少させ、１ヘクタール当たり０．５Ｌのカルシウム−コリン−ＳＡ調製物と組合せた場合、Phytophthora感染の痕跡なくして作物は健康なままであり、他方、植物の未処理地区はかなり感染した。

特に、Ｃａ、およびベタインのごときオスモライトを含む新しいコリン−ＳＡ調製物は植物および動物で非常に高い生物学的利用性を示すことは、前記実施例から明らかである。これらの調製物は、植物強化用の栄養素および医薬、種々の負の条件（乾燥条件、微生物および昆虫での感染からのストレス条件）に対する保護として用いることができる。該調製物は、通常の（ケイ素リッチ）ダイエット下の動物で用いることができる。これは、これらの調製物（コリン−ＳＡ−オスモライトの複合体）が事実活性であることを意味する。従って、それらは、良好な結果をもって、ある種の生理学的状態に対して用いることができる。

Claims (11)

1. オルトケイ酸およびケイ酸、第一の（「一定／第一」）オスモライトコリン、および遊離ヒドロキシル基を含まない弱いアルカリ化剤を含む生物学的調製物。
2. 該アルカリ化剤がＣａＣＯ_３である請求項１記載の調製物。
3. 該アルカリ化剤がベタインである請求項１記載の調製物。
4. 該調製物が、さらに、ベタイン、グルシン、タウリン、カルニチン；イノシトール、エタノールアミン、およびそのリン酸塩；グルコース、キシロースおよびソルビトールのごとき単糖よりなる群から選択される第二のオスモライトを含む請求項２記載の調製物。
5. 該調製物が、さらに、ベタイン、グルシン、タウリン、カルニチン；イノシトール、エタノールアミン、およびそのリン酸塩；グルコース、キシロースおよびソルビトールのごとき単糖よりなる群から選択される第二のオスモライトを含む請求項３記載の調製物。
6. さらに、Ｃｕ、Ｍｎ、Ｍｇ、Ｓｒ、Ｚｎ、Ｃａ、Ｆｅのごとき二価微量元素を含む請求項１ないし５いずれか１記載の調製物。
7. 希釈された形態である請求項１ないし６いずれか１記載の調製物。
8. ｉ）ケイ素含有コリン溶液を加水分解し、それにより、コリン安定化オルトケイ酸およびオリゴマー溶液を形成させ；
   ii）ヒドロキシル基を含まない弱いアルカリ化剤を添加することによって、該コリンオルトケイ酸およびオリゴマー溶液をアルカリ化し；次いで
   iii）所望により、二価微量元素および／または第二のオスモライトを添加する；
   ことを特徴とする請求項１ないし６いずれか１記載の調製物の製法。
9. 請求項６記載の方法によって得ることができる生物学的調製物。
10. 植物を、物理学的、化学的および生物学的ストレス状態および攻撃に対して強化させるための、および骨、皮膚、軟骨、毛髪および爪、および結合組織に関連する病気に対して動物およびヒトで用いられる、植物、動物またはヒト栄養素または医薬としての請求項１ないし６、および９いずれか１記載の生物学的調製物の使用。
11. 植物栄養素および／または真菌感染耐性剤としての請求項１ないし６、および９いずれか１記載の生物学的調製物の使用。