ES2879881T3 - Composiciones que comprenden partículas de nanosílice y su uso en métodos de activación de linfocitos T para terapia - Google Patents

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Abstract

Una composición que comprende partículas de sílice que tienen un diámetro medio de entre 0,5 y 20 nm para usar en un método de activación de linfocitos T para terapia para un sujeto/individuo, en donde los linfocitos T activados son para usar en el tratamiento de cáncer y en donde la activación de los linfocitos T se caracteriza por un aumento en la expresión de CD69 y/o CD25 por los linfocitos T.

Description

DESCRIPCIÓN
Composiciones que comprenden partículas de nanosílice y su uso en métodos de activación de linfocitos T para terapia
Campo de la invención
La presente invención se refiere a composiciones que comprenden partículas de nanosílice y su uso en métodos de activación de linfocitos T para terapia y en particular, a biomarcadores que caracterizan la eficacia de las composiciones de partículas de sílice para usar en terapia. Se desvelan ensayos y métodos de selección basados en el uso de estos marcadores.
Antecedentes de la invención
El silicio es un elemento ubicuo medioambientalmente y los seres humanos adultos en el mundo occidental ingieren aproximadamente 15 a 50 mg por día actualmente. De forma natural, aparece como silicatos en donde el silicio se une a átomos de oxígeno. El ácido silícico y la sílice son términos usados también para tales estructuras. Estas varían desde el ácido monosilícico más simple, también denominado orto, a partículas de sílice. En el presente documento el término silicato y sílice pueden utilizarse indistintamente para indicar materiales que contienen silicio, oxígeno e hidrógeno que pueden contener también otros iones, pero predominantemente contienen silicio y oxígeno con un contenido de hidrógeno determinado por factores tales como tamaño, extensión de la condensación, pH, etc. El papel biológico preciso del silicato soluble todavía no se entiende, pero muchas pruebas apuntan a un papel importante en la salud de tejidos conectivos (Jugdaohsingh et al., 2008). Si bien los tejidos conectivos normalmente incluyen hueso, articulaciones, vasos sanguíneos, piel, cabello y uñas, existen pruebas notables también de un beneficio dietético, complementario o terapéutico del silicato soluble o polimérico en una amplia gama de afecciones médicas que incluyen osteoporosis, osteopenia y otros trastornos musculoesqueléticos y articulares, cánceres de todos los tipos, diversas afecciones de la piel, enfermedades vasculares, cardiovasculares y coronarias cardiacas, enfermedades inflamatorias, enfermedades autoinmunitarias, enfermedad de Alzheimer y diversas formas de deterioro cognitivo, infecciones de diversos tipos, heridas y úlceras, trastornos gastrointestinales, hepáticos, renales e inmunitarios relacionados y cambios y trastornos relacionados hormonales. Los efectos beneficiosos nutricionales y terapéuticos del silicato parece que se extienden a otros animales, especialmente a otros mamíferos.
El silicato se ha utilizado como un complemento nutricional oral, aunque lograr una formulación que permita una adquisición eficaz (absorción) tras la dosificación no es sencillo. El silicio en su forma inorgánica de origen natural es soluble como ácido ortosilícico. Sin embargo, su concentración, por ejemplo, en agua de bebida, necesita ser relativamente baja (£1,7 mM) dado que, en condiciones naturales, esta es la solubilidad de equilibrio máxima del silicato acuoso a pH < 9 para evitar el inicio de la polimerización de partículas que se condensan gradualmente y/o aumentan de tamaño y a continuación, no se resolubilizan fácilmente. Este comportamiento ha obstaculizado el desarrollo del silicio complementario, dado que las formas concentradas no se disuelven en el intestino para permitir la absorción, si bien las formas diluidas dan como resultado la necesidad de ingerir grandes cantidades de complemento (por ejemplo, 20-100 ml/día).
Normalmente, ciertas fracciones químicas, tales como ligandos, pueden utilizarse para unir y convertir cationes/aniones solubles que de otra manera precipitarían a pH fisiológico, pero el silicato es incómodo porque el monómero normalmente tiene mayor afinidad por sí mismo (es decir, para sufrir autoensamblaje) que por cualesquiera otras moléculas y cuanto mayor es la concentración de silicio, más difícil resulta detener su autoensamblaje en solución acuosa. Esto ha llevado a estrategias alternativas para producir composiciones de silicato biodisponibles.
Adicionalmente, sin embargo, a propósito o accidentalmente, los investigadores han estudiado los efectos biológicos de las composiciones de silicato precipitado. Por ejemplo, se han investigado los efectos sobre las células de silicatos poliméricos, nanométricos y micrométricos.
El documento US 2011/0229577 (Kerek) describe partículas de ácido silícico que tienen estructuras similares a carcasas en las que las partículas se condensan en condiciones en las que el pH de la mezcla de reacción se reduce primero y a continuación, aumenta, conduciendo a una composición que se dice que tiene un pH de 2,1 o un pH superior a 9,2. Las composiciones de silicatos condensados descritas en el documento US 2011/0229577 se describen como que tienen baja toxicidad en cultivos celulares in vitro, así como que son inhibidoras de la bomba de ATPasa de calcio y causan apoptosis en todos los tipos celulares. Se informa del uso de tales silicatos condensados para reducir el tamaño de los tumores.
Las composiciones de sílice que se estabilizan a partir de la aglomeración por elevados niveles de colina se venden como un complemento alimentario y se denominan "ácido ortosilícico estabilizado con colina" (Biosil™; ácido ortosilícico estabilizado con cloruro de colina, véase el documento WO 95/21124 y el documento EP 1371 289 A).
El documento US 2009/0130230 (Stanley) describe composiciones de silicato y sus usos para tratar afecciones inflamatorias, cáncer, infecciones bacterianas y víricas y el tratamiento de heridas infectadas y no infectadas. Esta referencia plantea la hipótesis de que los tratamientos se producen a través de la activación del sistema inmunitario innato.
El documento WO 2015/121666 (Medical Research Council) desvela composiciones de nanosílice que incluyen agentes estabilizantes tales como polioles, azúcares y/o sales de amonio cuaternario, tales como colina y carnitina. En particular, el documento WO 2015/121666 proporciona procesos para producir una composición de silicato polimérico estabilizada que comprende partículas de ácido silícico polimérico y de nanosílice, en las que se controla la polimerización de silicatos y el crecimiento del tamaño de partícula y las partículas resultantes se vuelven estables en tamaño mediante la combinación de la concentración de silicato, pH y/o estabilizante. Se describen los usos de estas composiciones para el tratamiento de una gama de afecciones médicas y para la complementación con silicio.
Los linfocitos T son células del sistema inmunitario adaptativo responsables de forma directa tanto de orquestar (linfocitos T auxiliares CD4+) como de ejecutar (linfocitos T citotóxicos CD8+) la eliminación de las células infectadas y cancerosas del cuerpo. Como tales, son una parte vital del sistema inmunitario. La activación de linfocitos T humanos policlonales por silicato in vitro se notificó por primera vez en 1994 (Ueki et al., 1994) y a pesar de las asociaciones en desarrollo de silicatos con la activación de linfocitos T en condiciones como la silicosis, el tamaño, la estructura, la extensión de las interacciones de los linfocitos T y el mecanismo de acción que definen las interacciones entre silicatos y linfocitos T siguen sin concretarse (Hayashi et al., 2010, Lee et al., 2012, Kusaka et al., 2014).
Sumario de la invención
En términos generales, la presente invención se basa en los hallazgos de que las composiciones que comprenden partículas de sílice, también denominadas sílice polimérica o polímeros de sílice, en particular estructuras de sílice que tienen un tamaño medio por tamaño por partícula convencional de entre 0,5 nm y 20 nm, pueden utilizarse para activar linfocitos en cultivo o en sangre completa. Este efecto técnico observado recientemente abre la posibilidad de que la activación de los linfocitos T se utilice como un marcador y un biomarcador de la eficacia del tratamiento con sílice para el cáncer, las infecciones y otra enfermedad crónica. Sin desear quedar ligados a ninguna teoría en particular, los presentes inventores creen que las partículas de sílice se unen a receptores de linfocitos T, activándolos parcialmente, por ejemplo, como se detecta aumentando la expresión de CD69 y/o CD25. Esto significa que los linfocitos T se activan cuando se encuentran con su antígeno afín (por ejemplo, una célula cancerosa o una célula infectada). Esto significa que es menos probable que los linfocitos T estén inactivos y por tanto, la activación puede servir para superar el agotamiento de los linfocitos T inducido en cánceres o ciertas enfermedades crónicas, tanto en medicina veterinaria como humana.
Convencionalmente, las partículas primarias de menos de 100 nm de diámetro en una dirección se denominan vagamente "nano" aunque, en volumen, esto puede abarcar un millón de veces entre 1 y 100 nm. Además, la mayoría de los investigadores se centran en agregados y aglomerados que simplemente están "nanoestructurados". Las nanopartículas verdaderamente dispersas están menos estudiadas y las de menos de 10 nm de diámetro (es decir, en el intervalo de los tamaños de proteínas) relativamente han recibido poca atención en aplicaciones biomédicas. Por ejemplo, unos estudios extensos han encontrado que las partículas de sílice (-Si-O-Si- y denominadas SiO2 en su forma más condensada) muestran actividades celulares diferenciales dependiendo del tamaño y cristalinidad, variando desde una actividad benigna para partículas grandes amorfas (pobremente condensadas) a fuertemente proinflamatoria para el cuarzo cristalino (un efecto que se imita parcialmente por la nanosílice independientemente de la cristalinidad). Sin embargo, existen pocos estudios sobre partículas de sílice ultrafinas (menos de 10 nm de diámetro). A pesar de la escasez de datos, las partículas de sílice ultrafinas son ubicuas, ya que su formación se produce cuando las concentraciones de Si(OH)4 monomérico acuoso superan la [Si] total de aprox. 1,7 mM. Utilizando tales preparaciones de silicato "sobresaturado", Stanley et al. enseñan que los cánceres pueden tratarse con la mezcla resultante. Kerek repite que las partículas de silicato ultrafinas pueden ser útiles en el tratamiento de cánceres y enumera un número de maneras potenciales para su síntesis.
Por consiguiente, en un primer aspecto, la presente invención proporciona una composición que comprende partículas de sílice que tienen un diámetro medio entre 0,5 y 20 nm para usar en un método de activación de linfocitos T para terapia para un sujeto/individuo, en donde la activación de los linfocitos T se caracteriza por un aumento en la expresión de CD69 y/o CD25 por los linfocitos T como se expone en las reivindicaciones. A modo de ejemplo, preferentemente el aumento en la expresión de CD69 y/o CD25 es de al menos un 20 %, de al menos un 30 %, de al menos un 40 %, de al menos un 50 %, de al menos un 60 %, de al menos un 70 % o de al menos un 80 %, por ejemplo, en comparación con un control basal sin estimular. Los ensayos celulares para determinar la expresión de CD69 y/o CD25 usando células mononucleares de sangre periférica (PBMC; del inglés, peripheral blood mononuclear cells) se describen en los ejemplos proporcionados más adelante, aunque los ensayos alternativos para estos biomarcadores serán evidentes para los expertos en la materia.
Generalmente, los presentes inventores han encontrado que la activación de linfocitos T puede lograrse utilizando las composiciones de partículas de sílice descritas en el presente documento, pero no las composiciones descritas en la técnica anterior, tales como las composiciones fabricadas de acuerdo con las enseñanzas de Kerek (citado anteriormente) o el ácido ortosilícico estabilizado con colina (Biosil™).
Generalmente, los linfocitos T activados por contacto con las composiciones de nanosílice utilizadas en la presente invención son linfocitos T tales como linfocitos T auxiliares, linfocitos T citotóxicos, linfocitos T citolíticos naturales o linfocitos T gamma delta. Esto se apoya en experimentos que utilizan linfocitos T auxiliares (CD4+) y citotóxicos (CD8+). Como alternativa o adicionalmente, la activación de linfocitos T aumenta la expresión de uno o más marcadores adicionales de activación de linfocitos T seleccionados entre CD40L, LAP/GARP y/o FoxP3.
CD25 (grupo de diferenciación 25; del inglés, cluster of differentiation 25) es la cadena alfa del receptor de IL-2. Es una proteína transmembrana de tipo I presente en los linfocitos T activados.
CD69 (grupo de diferenciación 69) es una proteína de lectina de tipo C transmembrana humana. La activación de los linfocitos T y de los linfocitos T citolíticos naturales (NKT; del inglés, natural killer T cells), tanto in vivo como in vitro, induce la expresión de CD69.
El ligando CD40 o CD40L, también denominado CD154, es una proteína que se expresa principalmente en linfocitos T activados y es un miembro de la superfamilia de moléculas TNF.
GARP (repeticiones predominantes de glicoproteína A; del inglés, glycoprotein A repetitions predominant) también conocida como LRRC32 (que contiene repeticiones ricas en leucina 32; del inglés, LRRC32) es una proteína que es esencial para la expresión en superficie de TGF-p latente en plaquetas y linfocitos T reguladores FOXP3+ activados. El aumento de la expresión de GARP y el péptido asociado a la latencia (LAP; del inglés, latency-associated peptide) son indicadores de la activación y expansión de los linfocitos T de tipo regulador (Treg).
FoxP3 (caja de la cabeza de tenedor; del inglés, forkhead box P3), también conocida como escurfina, es una proteína involucrada en las respuestas del sistema inmunitario. Un miembro de la familia de proteínas FOX, FOXP3 parece funcionar como un regulador maestro de la ruta reguladora en el desarrollo y función de los linfocitos T reguladores (Treg).
Como alternativa o adicionalmente, en algunos casos, la activación de linfocitos puede identificarse mediante un aumento en la expresión de IFN-y. Los experimentos descritos en el presente documento muestran adicionalmente que, si bien las composiciones provocan la activación de linfocitos, no inducen de forma sustancial la proliferación de células de linfocitos.
Como es bien conocido en la técnica, hay un equilibrio entre los ácidos silícicos solubles y las composiciones de silicato cada vez más condensadas. Por consiguiente, en la presente invención, la "composición de silicato polimérico estabilizado" incluye partículas de ácido silícico polimérico y de nanosilicato que tienen las propiedades descritas en el presente documento, así como formas solubles de ácido silícico y ácido polisilícico con las que están en equilibrio en la composición o en una formulación que la comprende.
Están surgiendo pruebas en la técnica que sugieren que el ácido silícico es beneficioso para la salud y la prevención o cura de enfermedades en seres humanos y otros animales. En general, las composiciones de la presente invención comprenden composiciones de silicato polimérico en las que la tendencia natural de los nanosilicatos a crecer para formar polisilicatos de orden superior y partículas de silicato se inhibe mediante la inclusión de sustancias tales como compuestos orgánicos que son capaces de actuar como retardadores del crecimiento, es decir, que inhiben la tendencia natural del ácido polisilícico a crecer para formar geles y partículas de silicato más condensadas o polímeros y partículas más grandes que las del tamaño deseado. Además, en algunos aspectos, los presentes inventores han encontrado que este enfoque significa que las composiciones son estables a pH fisiológicamente aceptables, especialmente a pH neutro o ligeramente ácido o a pH ligeramente alcalino.
Una ventaja adicional del método descrito en el presente documento es que a través del control selectivo del pH, la concentración de silicio y la concentración de estabilizante durante la síntesis, el tamaño de partícula puede ser a medida a partir de pequeños polímeros de menos de 0,5 nm de diámetro hasta 10 o 20 nm de diámetro, dependiendo del tamaño de partícula deseable y de que, a continuación, se pueda estabilizar de acuerdo con la invención esbozada para permitir la administración a un sujeto o animal en el tamaño de partículas elegido. Quedará claro para los expertos en la materia que un tamaño de partícula se refiere a un intervalo de tamaños y que el número aquí indicado se refiere al diámetro promedio, más comúnmente el diámetro medio de ese intervalo de partículas.
En un aspecto adicional, la presente invención proporciona un método para determinar la eficacia de una composición de partículas de sílice para la administración terapéutica a un sujeto o individuo, comprendiendo el método:
(a) poner en contacto una muestra de linfocitos T con la composición de partículas de sílice;
(b) determinar la expresión de CD69 y/o CD25 por los linfocitos T presentes en la muestra; y
(c) identificar las composiciones de partículas de sílice que causan un aumento en la expresión de CD69 y/o CD25 por los linfocitos T como adecuadas para usar en terapia.
En un aspecto adicional, la presente invención proporciona un ensayo para determinar la eficacia de una composición de partículas de sílice para la administración terapéutica a un sujeto o individuo, comprendiendo el ensayo: (a) poner en contacto una muestra de linfocitos T con la composición de partículas de sílice;
(b) determinar la expresión de CD69 y/o CD25 por los linfocitos T presentes en la muestra;
(c) medir o cuantificar la cantidad de expresión de CD69 y/o CD25 respecto a un valor de control y si la cantidad de expresión de CD69 y/o CD25 aumenta relativa al valor de control, seleccionar la composición de partículas de sílice como adecuada para la administración terapéutica.
En un aspecto adicional, la presente invención proporciona un método para determinar la eficacia de una terapia que comprende la administración de una composición de partículas de sílice o protocolo de administración de la misma, al sujeto o individuo, comprendiendo el método:
(a) poner en contacto una muestra de linfocitos T del sujeto o individuo tratado con la composición de partículas de sílice o protocolo de administración de la misma;
(b) determinar la expresión de CD69 y/o CD25 por los linfocitos T presentes en la muestra; y
(c) identificar un sujeto o individuo para el que se observa un aumento en la expresión de CD69 y/o CD25 por los linfocitos T en la etapa (b) como tratado exitosamente con la composición de partículas de sílice o protocolo de administración de la misma; o
(d) identificar un sujeto o individuo para el que no se observa aumento en la expresión de CD69 y/o CD25 por los linfocitos T en la etapa (b) y modificar la composición de partículas de sílice o protocolo de administración de la misma, proporcionada a ese sujeto o individual;
(e) opcionalmente repetir las etapas (a) a (d) hasta que el sujeto o individuo se trate exitosamente con la composición de partículas de sílice o protocolo de administración de la misma.
En los ensayos y métodos expuestos en el presente documento, el aumento en la expresión de CD69 y/o CD25 por los linfocitos T se determina relativo a un valor de referencia, por ejemplo, un control basal sin estimular.
En un aspecto adicional, la presente invención proporciona el uso de la expresión de CD69 y/o CD25 por linfocitos T como marcadores o biomarcadores de la eficacia terapéutica de las composiciones de partículas de sílice.
También se describe un dispositivo para producir una composición de sílice para uso terapéutico, comprendiendo el dispositivo:
un primer envase que comprende una solución de silicato a pH > 10,5, un segundo envase que comprende una solución de tampón ácida;
medios de control de flujo para controlar el flujo de la solución de silicato y la solución de tampón ácida; y una salida en comunicación fluida con los envases primero y segundo para suministrar la composición de sílice coloidal de modo que las dos soluciones se mezclen antes de la administración a un sujeto.
El dispositivo puede utilizarse para la síntesis discontinua de la composición de sílice y además comprende una cámara de mezcla en comunicación fluida con los envases primero y segundo para mezclar las soluciones para producir una composición de sílice coloidal. Como alternativa, cuando el dispositivo es para la síntesis de flujo de las composiciones de sílice de la presente invención, la mezcla de las soluciones puede producirse in situ según se suministran, por ejemplo, en una vía i.v. antes de la administración a un sujeto.
El dispositivo puede adaptarse para la terapia de linfocitos T ex vivo. El dispositivo puede también comprender una cámara para poner en contacto una muestra biológica que comprende linfocitos T obtenidos de un sujeto con la composición de sílice coloidal para provocar la activación de los linfocitos T para terapia y/o medios para suministrar la muestra que comprende linfocitos T extraídos del sujeto a la cámara de contacto y para devolver los linfocitos T activados al sujeto.
También se describe un kit que comprende (i) un primer envase que comprende una solución de silicato a pH > 10,5 y (ii) un segundo envase que comprende una solución de tampón ácida e (iii) instrucciones para mezclar la solución de silicato y la solución de tampón ácida para producir una composición de sílice coloidal terapéuticamente activa que tiene un pH entre 4,0 y 8,5, más preferentemente de 4,0 a 6,5. Preferentemente, la solución ácida comprende ácido clorhídrico, un ácido carboxílico, tal como ácido cítrico o un aminoácido ácido, tal como la glicina.
A continuación se describirán realizaciones de la presente invención a modo de ejemplo y no de limitación con referencia a las figuras adjuntas. Sin embargo, diversos aspectos y realizaciones adicionales de la presente invención serán evidentes para los expertos en la materia a la vista de la presente divulgación.
Cuando se usa en el presente documento, "y/o" debe interpretarse como la divulgación específica de cada una de las dos características o componentes especificados, con o sin el otro. Por ejemplo, "A y/o B" ha de interpretarse como la divulgación específica de cada uno de (i) A, (ii) B y (iii) A y B, como si cada uno de ellos se estableciera individualmente en el presente documento.
A menos que el contexto indique otra cosa, las descripciones y definiciones de las características establecidas anteriormente no se limitan a ningún aspecto o realización particular de la invención y se aplican igualmente a todos los aspectos y realizaciones que se describen.
Breve descripción de las figuras
Figura 1. Activación de linfocitos T mediante composiciones de partículas de sílice de la presente invención y partículas de nanosílice sintetizadas de acuerdo con el Ejemplo 4 (Si(OMe)4) de Kerek (documento US 2011/0229577). Las células se trataron con las nanopartículas y se evaluó la activación después de 24 h.
Figura 2. Activación de linfocitos T mediante composiciones de partículas de sílice de la presente invención y ch-OSA® (ácido ortosilícico estabilizado con colina, BioSil™)
Figura 3. Expresión de CD4+ y CD8+ mediante composiciones de partículas de sílice de la presente invención en comparación con Kerek.
Figura 4. Expresión de CD4+ y CD8+ mediante composiciones de partículas de sílice de la presente invención en comparación con Kerek (+ control positivo, SEB).
Figura 5. Expresión de CD4+ y CD8+ mediante composiciones de partículas de sílice de la presente invención en comparación con Biosil™.
Figura 6. Expresión de CD4+ y CD8+ mediante composiciones de partículas de sílice de la presente invención en comparación con Biosil™ (+ control positivo, SEB).
Figura 7. La activación de linfocitos T CD4 y CD8 mediante nanosílice ultrafina de diferente tamaño, preparada por neutralización del pH (pH 7) de una solución alcalina de silicato de sodio a una concentración final de Si ± cloruro sódico 23-40 mM e incubación durante ~ 20 h (para dispersiones > 3 nm) o ajustando una solución de silicato alcalino 500 mM a pH 0,8-1 e incubando durante ~ 20 h (dispersiones < 3 nm) antes de la adición a cultivos celulares (n = > 8). Se notifican los diámetros medios de las partículas (DV0,5).
Figura 8. La activación de diferentes tipos de células del linaje Th mediante nanosílice ultrafina que se denomina "HS-7" y se prepara mediante neutralización del pH (pH 7) de una solución alcalina de silicato de sodio a una concentración final de Si 23 mM y se incuba durante 20 h antes de la adición a cultivos celulares (n = 6-7). Las partículas tuvieron un diámetro medio (DV0,5) = 3,4-3,8 nm a partir de análisis repetidos.
Figura 9. Efecto de uSANS sac. (a), uSANS in situ (b) y sus controles de vehículos (c) en la confluencia de células HUVEC. Téngase en cuenta que los datos no pueden mostrarse para la tercera nanosílice estudiada, denominada HS7, porque indujo toxicidad celular (es decir, un cambio en la forma celular y/o muerte celular), después de un corto período de incubación (< 1 h) en las tres concentraciones (Si 1, 2 y 4 mM) y después de 4-5 h de incubación, la mayoría de las células habían muerto a la concentración de 4 mM. En los experimentos siguientes con concentraciones más bajas de HS7 (0,1, 0,25 y 0,5 mM de Si) hubo toxicidad incluso a Si 0,5 mM.
Figura 10. El pZap70 medido a lo largo del tiempo demuestra la rápida activación de los linfocitos T que se origina a partir de la nanosílice que interactúa con el receptor de los linfocitos T, lo que conduce a la fosforilación de ZAP-70.
Figura 11. Labilidad química de uSANS durante el almacenamiento ácido, como se determina mediante un ensayo de molibdato. Todos los materiales se almacenaron a temperatura ambiente o a 4 °C. Las uSANS estabilizadas con sacarosa (uSANS sac) se almacenaron a pH 2,15±0,15 o 1,5±0,1, si bien los materiales sin estabilizar (uSANS SE) se almacenaron a pH 1,5±0,1. Las DO más altas indican una mayor labilidad química (es decir, menos silicatos condensados).
Figura 12. Labilidad química de las uSANS a lo largo del tiempo tras la neutralización (pH 7). Se utilizó un ensayo de molibdato para comparar la labilidad de los silicatos solubles (Si(OH)4) con uSANS antes (pH 2,3) y después de la neutralización (t 0h a t 6h).
Figura 13. Labilidad química de las uSANS formadas in situ (Si 40 mM) después de diversos períodos de incubación (1 min a 1 h).
Descripción detallada
El papel biológico del silicio y la química de los silicatos
Las pruebas sugieren que los ácidos silícicos, ya sean monoméricos o poliméricos, son beneficiosos para la salud y la prevención o cura de enfermedades en seres humanos y otros animales. Sin embargo, como se ha descrito anteriormente, el problema fundamental en la técnica es que el ácido silícico, cuyo monómero se representa como Si(OH)4, se autoensambla y a pH < 9,0 y concentraciones por encima de la solubilidad máxima del silicato acuoso (1,7 mM a 25 °C, véase la Figura 1 de Jugdaosingh et al., anteriormente citado) forma especies insolubles. Como se conoce bien en la técnica, hay un equilibrio entre los ácidos silícicos solubles y las especies de silicato cada vez más condensadas, en concreto, partículas de ácidos mono, di y trisilícicos, de ácidos polisilícicos y de nanosílice. El proceso de crecimiento a partir de soluciones de ácido silícico implica una evolución en la que la unidad individual crece en tamaño y se vuelve cada vez más evolucionada (es decir, menos lábil, soluble y/o disoluble) y por tanto, menos capaz de regresar hacia Si(OH)4 en ausencia de álcali añadido. El crecimiento puede incluir polimerización, aglomeración, agregación o un aumento de tamaño debido a la deposición superficial de especies solubles. El crecimiento de ácidos polisilícicos conduce finalmente a la formación de gel en condiciones adecuadas. Estos factores hacen extremadamente difícil estabilizar las composiciones de silicato por encima de estas concentraciones de silicato acuoso y a un pH fisiológicamente relevante.
La dosificación de silicato es por tanto un desafío, porque la posología debe suministrar el silicio requerido para un efecto deseable en términos tanto de concentración como de forma química y a un pH que sea compatible con la salud fisiológica y de una manera que evitará las nanopartículas persistentes de silicato que pueden tener efectos adversos para la salud. De particular interés es que durante la aplicación de una posología, se producen generalmente tres cambios notables, debido al entorno fisiológico. En primer lugar, habrá dilución por los fluidos fisiológicos y en segundo lugar habrá un cambio de pH y en tercer lugar, habrá un cambio en la fuerza iónica. El efecto neto de estas influencias determinará el comportamiento del silicato dosificado.
Composiciones de nanosílice y activación de linfocitos T
Los presentes inventores han encontrado que las composiciones de nanosílice de la presente invención y más preferentemente las nanopartículas ultrafinas de sílice (< 10 nm de diámetro), pueden estimular la activación de los linfocitos T como se mide, por ejemplo, mediante un aumento en la superficie de linfocitos T de los marcadores CD25 y CD69. Si bien no se desea quedar ligados a ninguna teoría en particular, los presentes inventores creen que esto se produce a través de la unión directa de la nanosílice al complejo receptor de linfocitos CD3-T (denominado en el presente documento complejo CD3-TCR). Cabe destacar que, aunque el tamaño parece ser una variable predictiva de si las composiciones de nanosílice son capaces de activar los linfocitos T, otros factores pueden contribuir a esta propiedad. Por ejemplo, las nanopartículas ultrafinas de sílice que se estabilizan a partir de la aglomeración por elevados niveles de colina se venden como un complemento alimentario y se denominan "ácido ortosilícico estabilizado con colina" (Biosil™; ácido ortosilícico estabilizado con cloruro de colina, véase el documento WO 95/21124 y el documento EP 1371 289 A), aunque estas no fueron capaces de estimular la activación de linfocitos T en los presentes ensayos (véase las Figuras 2 y 5). En otro ejemplo, la nanosílice notificada por Kerek (documento US 2011/0229577), preparada a modo de comparación en el Ejemplo 4 del presente documento, fue un inductor de activación muy débil de linfocitos T CD4 y un inductor modesto de activación de linfocitos T CD8, en comparación con algunas nanosílices recién precipitadas preparadas por ajuste de pH de soluciones alcalinas de sales de silicato (véanse las Figuras 1, 3 y 4). Un ejemplo adicional es que las partículas de nanosílice estabilizadas con sacarosa descritas en el documento WO2015/121666 fueron capaces de activar los linfocitos T CD4 y CD8 de la misma manera que las partículas no estabilizadas. Por tanto, en un aspecto, la presente invención proporciona un ensayo para determinar la eficacia de una composición de partículas de sílice para estimular linfocitos T, dado que esto no es obvio a partir de determinaciones fisicoquímicas simples. A su vez, esto puede permitir que se elija la actividad de una nanopartícula de sílice, incluyendo cualesquier efectos diferenciales deseables sobre los linfocitos T CD8 y CD4 que pueda permitir una terapia de activación de linfocitos T mejor dirigida.
No obstante, los inventores también han descubierto que los subtipos específicos o "linajes" de linfocitos T pueden activarse simultáneamente mediante su exposición a la nanosílice ultrafina. Por ejemplo, los linfocitos T auxiliares (Th) CD4+ pueden dividirse convenientemente en un número de linajes de Th diferentes dependiendo del tipo de respuesta inmunitaria en el que estén involucrados en cuanto a regulación (Geginat et al., 2015). Los denominados linfocitos T auxiliares Th1 CD4+ podrían mediar una respuesta de linfocitos T citotóxicos y activar monocitos y se caracterizan por la producción de IFN-y (Geginat et al., 2015). En cambio, los denominados linfocitos T auxiliares reguladores (Treg) CD4+ son responsables de suprimir respuestas inmunitarias y estas pueden identificarse por la proteína foxhead box P3 (FoxP3) y la expresión de superficie de LAP y GARP (Sakaguchi et al., 2010, Gauthy et al., 2013; Stockis et al., 2009). En cambio, los denominados linfocitos T auxiliares Th2 CD4+ podrían ser responsables de mediar las respuestas de los linfocitos B, por ejemplo. El ligando CD40, también denominado CD154, podría expresarse en los linfocitos Th2 y acoplarse al receptor CD40 de los linfocitos B, facilitando la proliferación y supervivencia de los linfocitos B (Crotty, 2015; Elgueta et al., 2009).
Los presentes inventores han descubierto que los linfocitos T de múltiples tipos de linaje pueden ser susceptibles a la activación de los linfocitos T a través de estas partículas de nanosílice ultrafinas (Figura 8). Esto permite que los linfocitos T se empleen en un número de aplicaciones terapéuticas. Primero, el ensayo puede utilizarse para identificar tipos/formas específicos de nanosílice que seleccionan o polarizan este efecto hacia un linaje de linfocitos T, de modo que los Th1 o Th2 reguladores podrían seleccionarse preferentemente a través del tratamiento. Por ejemplo, la activación selectiva de linfocitos Th1 puede ser deseable para cánceres o enfermedades víricas. La activación selectiva de Treg puede ser deseable para enfermedades autoinmunitarias o inflamatorias.
En segundo lugar, con una dosificación crónica, la activación de los linfocitos T puede usarse terapéuticamente para lograr el "agotamiento", en otras palabras, lo contrario de la activación y por tanto, la amortiguación (desactivación) de todos o de hecho, los tipos seleccionados de linfocitos T. Por ejemplo, esto puede ser terapéuticamente útil en una "enfermedad inflamatoria" independientemente de que sean autoinmunitarias clásicas, tales como esclerosis múltiple o artritis reumatoide, Th1 clásica, tal como la enfermedad de Crohn o artritis reumatoide o Th2, tal como el asma o la colitis ulcerosa. Las enfermedades autoinmunitarias pueden tener polarización de Th1 o Th2, por lo que la artritis reumatoide se menciona dos veces.
En tercer lugar, el uso de partículas de sílice para activar o agotar todos o los linfocitos T seleccionados puede utilizarse junto con la coadministración de terapia que suprima o potencie un linaje o un fenotipo de linfocitos T específico, seleccionando de este modo el tipo de respuesta. Por ejemplo, el secuestro del linaje de linfocitos T Treg para una terapia del cáncer mediante ciclofosfamida (Becker et al., 2013), permitiendo por tanto el "crecimiento" seleccionado de linajes de linfocitos T efectores con terapia de nanosílice que podría implementarse en un régimen que evite el agotamiento crónico de linfocitos T. La coadministración para tales propósitos puede ser antes y/o durante y/o después de la administración de la nanosílice y puede implicar uno o más agentes.
Será deseable suministrar nanosílice terapéutica por vía parenteral, dado que se absorbe poco desde el tracto gastrointestinal (Jugdaohsingh et al., 2000). Se reconoce que la administración intravenosa puede ser especialmente deseable (documento WO 2015121666). Sin embargo, esto requeriría que la nanosílice, que puede inyectarse a altas concentraciones para lograr dosis terapéuticas eficaces en el torrente sanguíneo, sea tóxica de forma mínima para las células endoteliales que revisten el sistema vascular. De hecho, las denominadas partículas uSANS, una forma de nanosílice, descritas en el documento WO 2015/121666, son persistentes de forma mínima y por tanto son menos tóxicas para las células endoteliales que las desveladas previamente en el documento US 2009/0130230 de Stanley (denominadas en el presente documento partículas HS7). Las partículas HS7 son comparativamente más tóxicas por encima de Si 0,5 mM, reduciendo así su aplicación clínica a dosis terapéuticas. Sin embargo, a pesar de que se toleran mejor que las partículas HS7, las partículas uSANS todavía muestran una toxicidad moderada para las células endoteliales (Figura 9). Sin embargo, los inventores han descubierto que hay una interacción muy rápida de las partículas de nanosílice con el TCR, como demuestra la rápida fosforilación de la proteína quinasa 70 asociada a la cadena Zeta (pZap70) de los linfocitos T mediante nanosílice (Figura 10) y esto significa que el tratamiento extracorpóreo de sangre o de células aisladas es un método útil para administrar la nanosílice. En particular, las células, con un grado de aislamiento de su tejido o biofluido o como presentes en la sangre completa, no necesitan estar fuera del cuerpo durante mucho tiempo y a continuación, pueden tratarse con nanosílice y reinyectarse para uso terapéutico. Esto evitaría el daño endotelial, dado que la célula inmunitaria y la proteína se unen por la nanosílice y alguna disolución de las partículas de nanosílice, minimizaría las interacciones de las células endoteliales y el daño de la nanosílice tras su readministración.
Por consiguiente, en un aspecto, la presente invención proporciona una composición que comprende partículas de sílice que tienen un diámetro medio entre 0,5 y 20 nm para usar en un método de activación de linfocitos T para terapia para un sujeto/individuo, en donde el método comprende producir la composición de partículas de sílice mediante síntesis in situ antes de la administración al sujeto. Como en otros aspectos de la presente invención, la activación de los linfocitos T se caracteriza generalmente por un aumento en la expresión de c D69 y/o CD25 por los linfocitos T.
Como alternativa o adicionalmente, la presente invención proporciona una composición para usar en un método de terapia de linfocitos T que comprende obtener una muestra que comprende linfocitos T de un sujeto, poner en contacto la muestra de linfocitos T con la composición de sílice de la presente invención para provocar que los linfocitos T en la muestra se activen y administrar (es decir, devolver) los linfocitos T activados al sujeto.
Como una realización adicional en la presente invención, los inventores descubrieron que se pueden producir uSANS tóxicas de forma mínima a través de una síntesis in situ, es decir, uSANS que se producen casi inmediatamente antes de la aplicación clínica mediante una síntesis discontinua o un enfoque de síntesis de flujo. Estas uSANS in situ pueden producirse mediante una síntesis discontinua en sistemas tamponados cuasi neutros. La síntesis in situ comprende un sistema de dos soluciones: (i) una solución de silicato a pH > 10,5 (es decir, el silicato es soluble en vez de coloidal) que se neutraliza mediante una (ii) solución tampón ácida (que comprende un carboxilato, tal como citrato o un aminoácido, tal como glicina). La mezcla de las dos soluciones da como resultado un pH moderadamente ácido de 4,0 y 6,5 (y más preferentemente entre pH 5,0 y 6,0) y a continuación, se forman rápidamente silicatos agrupados/coloidales (es decir, nanosílice). Estos coloides se vuelven gradualmente más condensados y a continuación, pueden administrarse en un punto elegido de labilidad. Preferentemente, la incubación se llevará a cabo entre pH 4,0 y 6,5 para incubaciones lentas (síntesis in situ discontinua) o entre pH 6,5 y 8,5 para incubaciones rápidas (síntesis in situ de flujo). La concentración de silicato durante la incubación varía preferentemente entre 10 y 100 mM, preferentemente entre 20 y 60 mM. El tiempo de incubación es de preferentemente entre 15 y 60 min para la síntesis discontinua in situ o entre 10 segundos y 5 min para la síntesis de flujo in situ (es decir, el período de tiempo entre el punto de mezcla y la introducción intravenosa). Por ejemplo, 30 min de incubación tras la mezcla del ácido y los componentes de silicato, será adecuado para una síntesis discontinua a (i) Si 40 mM, (ii) temperatura ambiente, (iii) pH 5,3 (medido como pH 4,0-5,0 con tiras de pH). Adicionalmente, con propósitos ilustrativos, una síntesis de flujo puede requerir solo 1 minuto de incubación (dentro del tubo de reacción), a temperatura ambiente y puede comprender Si 50 mM (tras la mezcla de los dos componentes) a pH 7,0-8,0. De forma provechosa, los presentes inventores descubrieron que las condiciones sintéticas pueden ajustarse para una labilidad de partículas óptima a través del uso de un ensayo de molibdato descrito en el presente documento (ensayo de labilidad).
Las uSANS in situ pueden producirse a través de un sistema de flujo. Esto es ventajoso porque el sistema de flujo puede unirse a un sistema de suministro intravenoso o un sistema de aislamiento/tratamiento celular, minimizando por tanto la manipulación (y la contaminación potencial) entre la síntesis y el suministro. En esta síntesis de flujo se mezclan dos soluciones en línea: (i) una solución de silicato a pH > 10,5 (es decir, silicato soluble en vez de coloidal) y ii) una solución ácida. Tras la combinación los dos flujos, se logra un pH cerca del neutro (pH 6,5-8,0) que da como resultado la rápida formación de silicatos lábiles que pueden administrarse directamente a un sujeto o las células de un sujeto extracorpóreamente. De forma provechosa, este sistema de síntesis de flujo es altamente ajustable. Por ejemplo, pueden producirse más partículas condensadas (si se requiere) empleando tubos de reacción más largos, lo que da como resultado tiempos de incubación más largos (en el tubo de reacción) antes de la inyección a un sujeto o un dispositivo.
De forma provechosa, las uSANS in situ son tan eficaces activando linfocitos T como las mejores uSANS convencionales, pero son menos tóxicas. En particular, durante períodos cortos de exposición, representativos del suministro intravenoso donde hay una dilución rápida del activo, las uSANS in situ muestran una falta completa de toxicidad incluso a la concentración más alta probada (4 mM; Figura 9). Estas partículas necesitan estar presentes persistentemente con las células endoteliales para provocar daños que no ocurrirían en los protocolos de tratamiento. Una ventaja adicional del sistema de uSANS in situ es que la vida útil de las soluciones que lo componen es prácticamente "infinita", ya que tanto las soluciones tampón (por ejemplo, citrato) como las soluciones de silicato son extremadamente estables. Esto contrasta con las uSANS convencionales que se vuelven gradualmente menos lábiles, como puede demostrarse mediante un ensayo de molibdato, a pesar de estar estabilizados por el bajo pH de almacenamiento y opcionalmente, la presencia de agentes estabilizantes (Figura 11). Una limitación adicional para las uSANS convencionales es que, debido a su bajo pH, estas soluciones deben neutralizarse antes de la administración (por ejemplo, suministro i.v.). Sin embargo, tras la neutralización, la labilidad disminuye rápidamente, lo que es una característica clínicamente no deseable. De hecho, este efecto es medible inmediatamente después de la neutralización y tras 12 minutos los coloides no pueden utilizarse más clínicamente (Figura 12).
Composiciones de nanosílice
La presente invención se refiere a las composiciones que comprenden nanosílice en forma de partículas de sílice que tienen un diámetro medio entre 0,5 nm y 20 nm, opcionalmente estabilizadas por uno o más agentes estabilizantes. Los hallazgos descritos en la presente solicitud muestran que las composiciones de nanosílice de la presente invención pueden utilizarse en métodos de activación de linfocitos T y por tanto, proporcionar una terapia para un sujeto o individuo, en particular en el tratamiento del cáncer e infecciones, como se discute en mayor detalle más adelante.
Como alternativa, las composiciones que comprenden composiciones de nanosílice estabilizadas que incluyen agentes estabilizantes y procesos para su producción se describen en el documento WO 2015/121666 (Medical Research Council) que se incorpora en el presente documento por referencia en su totalidad. Los ejemplos de agentes estabilizantes adecuados para usar con la composición de nanosílice de la presente invención incluyen polioles, azúcares y/o sales de amonio cuaternario, tales como colina y carnitina. En particular, el documento WO 2015/121666 proporciona procesos para producir una composición de silicato polimérico estabilizado que comprende partículas de ácido silícico polimérico y de nanosílice, en las que se controla la polimerización de silicatos y el crecimiento del tamaño de partícula y las partículas resultantes se vuelven estables en tamaño mediante la combinación de la concentración de silicato, pH y/o estabilizante. En algunas realizaciones, las composiciones se pueden dopar adicionalmente con cationes metálicos ya que estos pueden inducir el crecimiento del tamaño de partícula y pueden proporcionar a las composiciones propiedades adicionales útiles.
Las composiciones de nanosílice de la presente invención comprenden ácido polisilícico soluble y partículas de nanosílice que tienen diámetros medios de 20 nm o menos y en algunos casos diámetros medios que son preferentemente menos de 10 nm, más preferentemente menos de 5 nm, 4 nm, 3 nm, 2 nm, 1 nm o 0,5 nm. En algunas realizaciones, las partículas pueden variar de aproximadamente 0,5 nm a aproximadamente 2 nm o de aproximadamente 0,5 nm a aproximadamente 3 nm o de aproximadamente 0,5 nm a aproximadamente 4 nm o de aproximadamente 0,5 nm a aproximadamente 5 nm o de aproximadamente 0,5 nm a aproximadamente 10 nm o de aproximadamente 0,5 nm a aproximadamente 15 nm o de aproximadamente 0,5 nm a aproximadamente 20 nm o de aproximadamente 5 nm a aproximadamente 20 nm o de aproximadamente 5 nm a aproximadamente 15 nm o de aproximadamente De 5 nm a aproximadamente 10 nm o de aproximadamente 10 nm a aproximadamente 15 nm o de aproximadamente 10 nm a aproximadamente 20 nm o de aproximadamente 15 nm a aproximadamente 20 nm. Las composiciones preferidas incluyen partículas de sílice que tienen un diámetro medio entre 0,5 y 10 nm y partículas de sílice que tienen un diámetro medio entre 2 y 5 nm.
La naturaleza no soluble del ácido silícico polimérico y/o las partículas de nanosílice se puede confirmar indirectamente mediante el ensayo del ácido molíbdico mencionado anteriormente, dado que este determina la fracción de ácido silícico soluble. En general, los materiales estarán en equilibrio con el ácido silícico soluble, siendo la concentración típica de ácido silícico soluble aproximadamente < 2 mM a pH < 9,0. Las composiciones de nanosílice de la presente invención pueden contrastarse con formas más condensadas de silicatos, incluyendo las nanopartículas más grandes (por ejemplo, que tienen preferentemente un tamaño medio superior a 50 nm y más preferentemente superior a 20 nm), geles de ácido polisilícico y dióxido de silicio (SO 2), la forma completamente condensada de ácido silícico, en la que los grupos -OH están virtualmente ausentes. El tamaño de las partículas de ácidos polisilícicos se puede determinar usando dispersión de luz dinámica y se prefiere que las mediciones se hagan sobre muestras recién preparadas, si no están estabilizadas. Tal como entenderán los expertos en la materia, los ácidos polisilícicos estarán en equilibrio con otras especies de silicatos. Por ejemplo y dependiendo de las condiciones precisas presentes, esto puede incluir cantidades más pequeñas de ácido silícico soluble.
Las composiciones de partículas de nanosílice utilizadas en la presente invención generalmente se aguan, es decir, el agua está presente a lo largo de su síntesis y al menos en cierto grado (por ejemplo, al menos un 5 % en peso, más preferentemente al menos un 10 % en peso, al menos 20 % en peso de agua), preferentemente también en la formulación final, es decir, los materiales no se secan ni se calientan considerablemente antes de la formulación y la administración posterior. Será evidente, sin embargo, que pueden utilizarse estabilizantes u otros agentes de formulación a concentraciones tan altas que desplacen las moléculas de agua de las partículas de silicato. Como tal, el agua puede desplazarse aunque la formulación no se seque.
La estabilización de las composiciones de partículas de nanosílice utilizadas de acuerdo con la presente invención se extiende preferentemente desde su síntesis hasta su almacenamiento, formulación y/o administración (por ejemplo, falta de aglomeración no deseada).
Las composiciones de partículas de nanosílice utilizadas de acuerdo con la presente invención son metaestables, es decir, las composiciones poseen una estabilidad que se ajusta al fin de la vida útil de su uso previsto. A modo ilustrativo, se prefiere que las composiciones de silicato polimérico de la presente invención sean estables en almacenamiento, por ejemplo, siendo estables durante 3 meses o más, más preferentemente durante 6 meses o más, más preferentemente durante 12 meses o más y más preferentemente 24 meses o más. Por tanto, las composiciones de silicato polimérico de la presente invención pueden producirse por condensación parcial de moléculas de ácido silícico (o de silicato). Estos materiales son metaestables como agrupamientos o coloides discretos, no agregados.
En algunas realizaciones de la presente invención, las composiciones de partículas de nanosílice incluyen un agente estabilizante, preferentemente un azúcar y/o un polialquilenglicol. Los azúcares incluyen oligosacáridos compuestos por ocho monosacáridos o menos, tales como sacáridos monoméricos, diméricos o triméricos. Un azúcar preferido es la sacarosa. El número máximo de unidades monoméricas en el azúcar se elige de modo que su administración no provoque una respuesta inmunitaria en el sujeto en la administración. Los polialquilenglicoles son una familia de compuestos de poliéter que incluyen polietilenglicol (PEG) y polipropilenglicol. Entre los ejemplos de agentes estabilizantes que son azúcares (sacáridos) se incluyen azúcares monoméricos, diméricos, triméricos y poliméricos (sacárido) o los correspondientes alcoholes de azúcar, tales como glucosa, fructosa, manosa, sacarosa, treitol, eritritol, sorbitol, manitol, galactitol o adonitol. En algunas realizaciones en las que el agente estabilizante es un azúcar, es un oligosacárido distinto de la lactosa. En algunas realizaciones en las que se usa un alcohol de azúcar, es distinto del manitol. El uso de azúcares como agentes estabilizantes para composiciones que se administran internamente se prefiere en la presente invención, dado que son seguros para la administración a sujetos humanos y animales.
En algunas realizaciones, es posible emplear combinaciones de más de un azúcar o polialquilenglicol diferente, por ejemplo, dos, tres, cuatro o cinco o más azúcares o polialquilenglicoles, por ejemplo, añadiéndolos en la(s) etapa(s) (a) y/o (b). Los agentes estabilizantes de azúcar y/o polialquilenglicol se añaden generalmente a una concentración entre 0,01 M y 3,0 M y más preferentemente entre 0,03 y 2,0 M y lo más preferentemente entre 0,1 M y 1,5 M. El experto en la materia puede llevar a cabo pruebas de rutina para determinar qué combinaciones de azúcares y/o polialquilenglicoles funcionan mejor en cualquier situación dada.
Las composiciones de nanosílice estabilizadas de la presente invención pueden distinguirse de las composiciones desveladas en la publicación de patente de Estados Unidos n.° 2003/0206967 (Choi et al.) que describe una composición que comprende metasilicato de sodio, bórax, tiosulfato de sodio, carbonato potásico y azúcar refinada en agua. Esto da como resultado una composición muy alcalina que tiene un pH de aproximadamente pH 13, en contraste con los pH de las composiciones de silicato polimérico estabilizado de la presente invención, que están preferentemente entre pH 3,0 y 9,0, más preferentemente entre 3,0 y 8,0 y más preferentemente entre 5,5 y 7,5. El proceso utilizado para hacer las composiciones de Choi et al. difiere de la presente invención, dado que la presente invención produce las composiciones reduciendo el pH para producir polímeros de silicato estables. En vista de lo anterior, se prefiere que las composiciones de nanosílice utilizadas en la presente invención no comprendan uno o más de metasilicato de sodio, bórax, tiosulfato de sodio, carbonato de potasio y preferentemente no incluyan bórax. Las composiciones de nanosílice preferidas de la presente invención pueden ser sin colina y/o sin etanol y por tanto, difieren de Biosil™ y las composiciones de silicatos descritas en Kerek respectivamente.
En otros aspectos, la presente invención puede usar ácidos carboxílicos como agentes estabilizantes y el ácido carboxílico puede ser un ácido carboxílico C2-10, por ejemplo, un ácido dicarboxílico tal como ácido oxálico, ácido malónico, ácido glutárico, ácido tartárico, ácido succínico, ácido adípico o ácido pimélico o formas ionizadas de los mismos (es decir, el carboxilato correspondiente), tales como adipato. O por ejemplo, un ácido monocarboxílico, tal como el ácido glucónico. Ejemplos adicionales de agentes estabilizantes son los ácidos dicarboxílicos, que pueden estar representados por la fórmula HOOC-R1-COOH (o una forma ionizada del mismo), donde R1 es un grupo alquilo C1-10, alquenilo C1-10 o alquinilo C1-10 opcionalmente sustituido. En general, se prefiere el uso de ácidos carboxílicos en los que R1 es un grupo alquilo C1-10 y más preferentemente es un grupo alquilo C2-6.
Los presentes inventores también encontraron sorprendentemente que las composiciones de nanosílice de la presente invención pueden estabilizarse adicionalmente añadiendo un disolvente no acuoso, tal como un alcohol. Un ejemplo preferido de alcohol es el etanol. A modo ilustrativo, el disolvente no acuoso puede añadirse entre un 10 y 50 % v/v o entre un 20 y 50 % v/v o entre un 10 y 20 % v/v. Asimismo, en algunos casos los presentes inventores encontraron que la combinación de sacarosa con alcohol fue particularmente eficaz para estabilizar las composiciones de nanosílice.
En la siguiente discusión de las etapas de los procesos de la presente invención, será evidente para los expertos en la materia que se pueden reordenar algunas de las etapas del proceso anterior y/o algunas de las etapas para que tengan lugar simultáneamente. Otras de las etapas son opcionales, como se indica arriba y se explica adicionalmente más adelante.
En el trabajo que conduce a la presente invención, los inventores encontraron que un número de factores contribuye a la estabilidad de las composiciones de nanosílice, incluyendo la tasa a la que se reduce el pH de la solución de silicato alcalino inicial, la inclusión de estabilizantes, en particular azúcares o polialquilenglicoles, la adición de cationes metálicos y/o la adición de un disolvente no acuoso. Los procesos para producir composiciones de nanosílice pueden emplear estos enfoques, solos o en cualquier combinación, para producir composiciones de nanosílice que tengan suficiente estabilidad para su uso, por ejemplo, como complementos o agentes terapéuticos.
En algunos casos, en particular para la producción de partículas ultrapequeñas de nanosilicatos ("uSANS"), la velocidad a la que se reduce el pH de la solución de silicato alcalino puede tener un efecto significativo sobre la estabilidad de las composiciones de nanosílice resultantes. Preferentemente, el pH se reduce (por ejemplo, a un pH menor o igual a pH 4,0 o 3,0) durante un período de menos de 60 segundos, más preferentemente menos de 30 segundos, más preferentemente menos de 10 segundos o lo más preferentemente menos de 5 segundos. La producción de una composición alternativa de partículas de sílice HS-7 se proporciona en los ejemplos siguientes.
Se prefiere que la concentración de la solución de silicato alcalino esté entre 0,05 M y 1,5 M y más preferentemente esté entre 0,03 y 2,0 M y lo más preferentemente entre 0,1 M y 1,0 M. El uso de pH que sean superiores a 9,5 también se prefieren con el fin de mantener la solubilidad de los silicatos y preferentemente en la etapa (a) el pH de la solución de silicato alcalino es aproximadamente pH 10,5 o superior y todavía más preferentemente es aproximadamente pH 11,5 o superior. En las composiciones finales de silicato polimérico, la concentración de silicio puede ser 2,5 mM o más, 5,0 mM o más, 25 mM o más, 30 mM o más, 40 mM o más, 50 mM o más, 100 mM o más, 250 mM o más, 500 mM o más. En las composiciones finales de silicato polimérico estabilizado, la concentración de silicio puede ser 1,5 M o menos, 1,0 M o menos, 500 mM o menos y varía entre estos límites inferiores y superiores.
En algunas realizaciones, el pH reducido puede tener un efecto sobre el tipo de nanopartículas de silicato estabilizadas que pueden producirse. Como se muestra en los ejemplos, pueden formarse uSANS o partículas muy pequeñas que tienen diámetros medios de 5 nm o menos bajando rápidamente el pH desde un pH mayor de 10 a 3,0 o menos y permitir que se usen concentraciones de silicio de hasta 1 M. Como alternativa, las SANS o nanopartículas pequeñas tienen diámetros medios de 10 nm o menos y pueden formarse reduciendo el pH a aproximadamente 7,4. En este caso, pueden usarse concentraciones más bajas de aproximadamente 50 mM o menos. Por consiguiente, el pH reducido puede ser 7,4 o menor o pH 3,0 o menor. Esto permite la preparación de uSANS en un pH bajo, como se describe, el pH se eleva para hacer crecer uSANS a SANs de un tamaño de partícula determinado y el tamaño se estabiliza bajando el pH de nuevo, si esto fuera necesario. Opcionalmente, se requiere un estabilizante en alguna etapa de este proceso. Estos procesos son una parte importante de la técnica.
En algún caso, el pH puede reducirse y/o la suspensión puede diluirse para el almacenamiento a largo plazo de suspensiones acuosas estabilizadas. Como alternativa o adicionalmente, tras el almacenamiento a largo plazo a un pH no fisiológico y antes de la administración a un sujeto, la suspensión de nanosilicato puede ajustarse a un pH fisiológico y/o diluirse y/o añadirse estabilizante.
La composición se puede estabilizar, de modo que el tamaño de partícula de los nanosilicatos permanezca suficientemente estable (< 20 nm) para la aplicación prevista. Por ejemplo, en el caso de una formulación para administración intravenosa, el tamaño de partícula de la primera solución de almacenamiento (por ejemplo, a pH <3 y Si 100 mM) será estable durante el período de almacenamiento y a continuación, una vez diluido con una solución tamponada i.v. permanecerá estable primero durante las pocas horas antes de la aplicación y a continuación, una vez administrada, no sufrirá aglomeración.
Metodología sintética para la síntesis discontinua de uSANS in situ (citrato)
Preparación de soluciones madre
Componente A (HCl Ácido cítrico): (i) Disolver 0,307 g de ácido cítrico (PM 192,124) en 180 ml de agua UHP; (ii) Añadir 0,783 ml de HCl al 37 % con agitación; (iii) Ajustar el volumen a 200 ml con agua UHP.
Componente B (Silicato de sodio 80 mM): Diluir 2,56 ml de silicato de sodio (Si ~ 6,25 M) en un volumen final de 200 ml de agua Componente C (solución salina; opcional): se disuelven 4,5 g de NaCl en 45 ml de agua UHP y el volumen final se ajusta a 50 ml con agua UHP.
Esterilización de los componentes A, B y C (opcional): En condiciones estériles (campana de flujo), filtrar con jeringa las soluciones componentes a través de un filtro de 0,22 pm en un envase estéril.
Preparación de coloides
Etapa 1: El componente A (2,5 ml) se mezcla con el componente B (2,5 ml). El pH resultante es de aproximadamente 5,4 medido con un peachímetro (tiras de pH 4,0- 5,0).
Etapa 2: Incubar durante 30 min
Etapa 3 (opcional): Después de la incubación e inmediatamente antes de la administración, se añade y mezcla el componente C (0,425 ml).
Metodología sintética para la síntesis en línea de uSANS in situ (sin tamponar)
Preparación de soluciones madre
Componente A (HCl): Diluir 1,2 ml de HCl al 37 % en un volumen final de 100 ml de agua.
Componente B (Silicato de sodio 50 mM): Diluir 0,8 ml de silicato de sodio (Sigma-338443, Si ~ 6,25 M) en un volumen final de 100 ml de agua
Preparación de coloides
Los coloides se preparan en un sistema de flujo como se representa en la Figura 6 utilizando un tubo de reacción con una longitud de 30 cm. Las bombas de jeringa A y B estuvieron operando a 1,05 y 48,5 ml/h, respectivamente, lo que dio como resultado un pH de 7,55.
Formulación y usos de las composiciones
Las composiciones de nanosílice de la presente invención pueden formularse para usar como agentes terapéuticos que contienen silicato. Las composiciones pueden comprender, además de las partículas de nanosílice, un excipiente farmacéuticamente aceptable, un vehículo, un tampón, un estabilizante u otros materiales bien conocidos por los expertos en la materia. Tales materiales no deben ser tóxicos y no deben interferir con la eficacia de las composiciones de partículas de nanosílice.
Los experimentos descritos en el presente documento demuestran que las composiciones de partículas de nanosílice de la presente invención son capaces de activar directamente los linfocitos T como se determina mediante un aumento en la expresión de los biomarcadores CD69 y/o CD25, por ejemplo, en comparación con una muestra de linfocitos T de control sin tratar. Los ensayos y métodos de la presente invención pueden usarse en la selección y desarrollo de composiciones de partículas de sílice terapéuticas eficaces y para determinar la eficacia de las terapias administradas a un sujeto o individuo.
La activación de linfocitos T utilizando la presente invención puede usarse en el tratamiento de una gama de afecciones o trastornos en los que esto tendría beneficio terapéutico para un sujeto, ya sea a modo de tratamiento o profilaxis y con la ventaja de que, cuando se administra en una concentración apropiada, las composiciones de partículas de sílice utilizadas en la presente invención no son sustancialmente citotóxicas de forma directa para las células cancerosas. Los cánceres también pueden incluir, pero no se limitan a: melanoma, cánceres de piel, cáncer de pulmón, cáncer de páncreas, cánceres de colon, recto y otros esplénicos, cáncer gástrico, cáncer de mama, linfomas, leucemias, cánceres de útero, cáncer de próstata, cáncer de esófago, cánceres de huesos, cánceres de vejiga, cáncer de cuello uterino, cáncer de endometrio, cáncer de cerebro, cánceres de ojo, cáncer de ovario, cáncer testicular, cáncer de hígado, cáncer de riñón, cánceres de cabeza y cuello e incluye cánceres metastásicos y primarios.
Sin embargo, si bien un uso preferido de los compuestos de la invención es en el tratamiento de cáncer, las terapias con linfocitos T descritas en el presente documento pueden usarse para el tratamiento de otras afecciones, en particular el tratamiento de una infección, tal como infección bacteriana o infección vírica. La infección incluye, pero no se limita a: infección por virus, retrovirus y bacteria, tal como Mycobacteria, bacteria Gram positiva y bacteria Gram negativa, así como helmintos, parásitos y otros agentes infecciosos. Las nanopartículas de silicato transitoriamente estables también pueden actuar como un depósito para la liberación de ácido silícico que en sí mismo es eficaz para mejorar la salud del tejido conectivo y puede ser útil en la osteoporosis, cicatrización de fracturas, enfermedades de las articulaciones, dermatopatías, trastornos de los vasos sanguíneos.
Como tal, la administración puede ser mediante administración parenteral, la última especialmente por vía intravenosa.
Otros usos médicos de las composiciones de la presente invención incluyen el tratamiento de la hipertensión, diabetes, enfermedades óseas, enfermedades cardiovasculares, patologías neurodegenerativas, cáncer de todos los tipos no mencionados anteriormente, hiperacidez, osteoporosis, cálculo dental, enfermedad de Alzheimer, enfermedad de Creutzfeldt-Jacob como así como para la cicatrización de heridas. Otros usos médicos de las composiciones de la presente invención incluyen el tratamiento de la piel afectada por una quemadura, herida o acción de patógenos o de productos químicos cáusticos, incluyendo el tratamiento de una quemadura solar o cualquier enfermedad de la piel, incluyendo psoriasis, eccema y dermatitis de otros tipos.
En algunos aspectos, los usos médicos de la presente invención que utilizan linfocitos T activados son para usar en el tratamiento de un sujeto humano. Sin embargo, además de tener aplicaciones para el tratamiento o prevención de afecciones en sujetos humanos, la presente invención tiene aplicación en el campo veterinario, por ejemplo, para usar en el tratamiento de un animal no humano y más especialmente, de mamíferos no humanos, tales como perros, gatos y caballos.
Las composiciones farmacéuticas líquidas incluyen generalmente un vehículo líquido, tal como agua, petróleo, aceites animales o vegetales, aceite mineral o aceite sintético. Puede incluirse solución salina fisiológica, dextrosa u otra solución de sacáridos o glicoles, tal como etilenglicol, propilenglicol o polietilenglicol. Cuando el complemento que contiene silicato necesita mantenerse en forma sólida, por ejemplo, para controlar el suministro de un componente del material, puede que sea necesario por consiguiente, seleccionar componentes de la formulación, por ejemplo, cuando se hace una formulación líquida del material. Pueden incluirse conservantes, estabilizantes, tampones, antioxidantes y/u otros aditivos, según sea necesario, por ejemplo, en realizaciones de la presente invención en las que las composiciones de silicato polimérico son adecuadas para la administración a un sujeto a través de un gotero.
En aplicaciones terapéuticas, las composiciones de nanosílice utilizadas de acuerdo con la presente invención se dan preferentemente a un individuo en una "cantidad profilácticamente eficaz" o una "cantidad terapéuticamente eficaz" (según sea el caso, aunque la profilaxis puede considerarse terapia), siendo esto suficiente para mostrar beneficio para el individuo (por ejemplo, biodisponibilidad). La cantidad real administrada y la velocidad y la evolución temporal de la administración, dependerán de la naturaleza y la gravedad de lo que se está tratando. La prescripción del tratamiento, por ejemplo, las decisiones sobre la posología, etc., están dentro de la responsabilidad de los médicos de cabecera y otros facultativos y normalmente tiene en cuenta el trastorno a tratar, la afección del paciente individual, el sitio de suministro, el método de administración y otros factores conocidos por los facultativos. Pueden encontrarse ejemplos de las técnicas y protocolos mencionados anteriormente en Remington's Pharmaceutical Sciences, 20a edición, 2000, Lippincott, Williams & Wilkins. Una composición puede administrarse sola o junto con otros tratamientos, ya sea de manera simultánea o de manera secuencial, dependiendo de la afección a tratar.
Materiales y métodos
Preparación de la composición de partículas de sílice HS-7
HS-7 se preparó diluyendo 0,1 g de silicato de sodio (n.° de cat. 338443; Sigma-Aldrich Chemical Co., Gillingham, Reino Unido) en 20 g de agua desionizada destilada (DDW; 18 MQ/cm) y ajustando a pH 6,7-7,0 (tiras de prueba de pH, Sigma-Aldrich Co., n.° de cat. P3536) con ácido clorhídrico (HCl, 4-5 M). Las dispersiones se dejaron equilibrar durante 16-24 a temperatura ambiente.
Preparación de la composición de partículas de sílice "uSANS"
Las dispersiones de nanopartículas de nanosílice amorfas ultrapequeñas (uSANS; del inglés, ultra-small amorphous nanosilica) (1,9 nm) se prepararon de acuerdo con el documento WO 2015/121666. Las uSANS se prepararon diluyendo 4 ml de silicato de sodio (n.° de cat. 338443; Sigma-Aldrich Chemical Co., Gillingham, Reino Unido) en 30 ml de agua desionizada destilada (DDW, del inglés, distilled deionized water; 18 MQ/cm). Se añadieron rápidamente 2 ml de HCl (37 %) durante la mezcla. La solución se diluyó a 50 ml con H2O y se incubó a temperatura ambiente de 16 a 24 h antes de su uso.
Composiciones de sílice comparativas de acuerdo con el Ejemplo 4 del documento US 2011/0229577 (Kerek)
Se mezclaron 7,4 ml de TMOS con 25 ml de agua UHP. El pH se ajustó a 3,6 con ácido acético (0,5 M) y la mezcla resultante se incubó durante 5 minutos a 45 °C en un baño de aceite con agitación. A continuación, la suspensión se dejó enfriar a temperatura ambiente durante 40 minutos y se ajustó el pH a 2,0 con HCl 1M. Finalmente, el metanol se eliminó usando un rotavapor (T = 40-45 °C).
Ensayo celulares
Se aislaron células mononucleares de sangre periférica (PBMC) de conos de leucocitos individuales adquiridos del National Blood Service (Cambridge, Reino Unido) usando centrifugación de gradiente de densidad. Las células se congelaron en medio de congelación (DMSO al 10 %, FBS al 50 %, RPMI 1640 al 40 %). Las células congeladas se descongelaron, se lavaron en RPMI y se dejaron reposar 2 h en RPMI que contenía FBS al 10 %, 0,3 g/l de L-glutamina, penicilina-estreptomicina al 1 % y 0,01 pg/ml de ADNasa. Las células se resuspendieron en RPMI FCS al 20 % a 2 x 106 células/ml y se añadieron 0,5 ml a tubos de FACS, seguido de 0,5 ml de tratamiento de nanosílice de RPMI /- 1600 uM (dando 1,0 x 106 células/ml, nanosílice 800 uM). Las células se incubaron durante 24 h, se lavaron con PBS BSA al 1 % y se tiñeron con anticuerpos de FACS y un marcador de viabilidad (CD3, CD4, CD8, CD25, CD69, marcador de viabilidad 7-AAD). Las células se analizaron inmediatamente en un citómetro de flujo Cyan-ADP utilizando el software Summit para adquisición y análisis (Beckman Coulter), adquiriendo un mínimo de 400.000 eventos por muestra.
La activación de linfocitos T CD4 y CD8 mediante nanosílice ultrafina
Se aislaron células mononucleares de sangre periférica (PBMC) de conos de leucocitos individuales adquiridos del National Blood Service (Cambridge, Reino Unido) usando centrifugación de gradiente de densidad. Las células se congelaron en medio de congelación (DMSO al 10 %, FBS al 50 %, RPMI 1640 al 40 %). Las células congeladas se descongelaron, se lavaron en RPMI y se dejaron reposar 2 h en RPMI que contenía FBS al 10 %, 0,3 g/l de L-glutamina, penicilina estreptomicina al 1 % y 0,01 pg/ml de ADNasa. Las células se resuspendieron en RPMI FCS al 20 % a 2 x 106 células/ml y se añadieron 0,5 ml a tubos de FACS, seguido de 0,5 ml de tratamiento de nanosílice de RPMI /- 1600 uM (dando 1,0 x 106 células/ml, nanosílice 800 uM). Las células se incubaron durante 24 h, se lavaron con PBS BSA al 1 % y se tiñeron con anticuerpos de FACS y un marcador de viabilidad (CD3, CD4, CD8, CD25, CD69, marcador de viabilidad 7-AAD). Las células se analizaron inmediatamente en un citómetro de flujo Cyan-ADP utilizando el software Summit para adquisición y análisis (Beckman Coulter), adquiriendo un mínimo de 400.000 eventos por muestra.
La activación de diferentes tipos de células del linaje Th mediante nanosílice ultrafina
Se aislaron células mononucleares de sangre periférica (PBMC) de conos de leucocitos individuales adquiridos del National Blood Service (Cambridge, Reino Unido) usando centrifugación de gradiente de densidad. Las células se congelaron en medio de congelación (DMSO al 10 %, FBS al 50 %, RPMI 1640 al 40 %). Las células congeladas se descongelaron, se lavaron en RPMI y se dejaron reposar 2 h en RPMI que contenía FBS al 10 %, 0,3 g/l de L-glutamina, penicilina estreptomicina al 1 % y 0,01 pg/ml de ADNasa. Las células se resuspendieron en RPMI FCS al 20 % a 2 x 106 células/ml y se añadieron 0,5 ml a tubos de FACS seguido de 0,5 ml de RPMI /- 17 ul o 35 ul de tratamiento de nanosílice (dando 1,0 x 106 células/ml y nanosílice 400 y 800 uM, respectivamente). Las células se incubaron durante 24 h, se lavaron con PBS BSA al 1 % y se tiñeron con anticuerpos de FACS y un marcador de viabilidad (CD3, CD4, CD8, CD25, CD69, CD40L, LAP, GARP, marcador de viabilidad 7-AAD). Para la tinción intracelular de FoxP3, las membranas celulares se trataron con un tampón de permeabilización de membrana celular antes de la tinción intracelular. Las células se analizaron inmediatamente en un citómetro de flujo Cyan-ADP utilizando el software Summit para adquisición y análisis (Beckman Coulter), adquiriendo un mínimo de 400.000 eventos por muestra. Para el análisis de citocinas de IFN gamma, los sobrenadantes celulares recogidos al final de la incubación se analizaron para determinar la presencia de IFN gamma utilizando kits de ELISA estándar de acuerdo con las instrucciones de los fabricantes.
Toxicidad de tres formas diferentes de nanosílice en células de venas endoteliales
Se resucitaron células endoteliales de la vena del cordón umbilical humano (HUVEC; del inglés, human umbilical cord vein endothelial cells; ATCC, Manassas, Estados Unidos) de crioalmacenamiento en nitrógeno líquido y se mantuvieron en medio de crecimiento completo: medio F-12K (ATCC), complementado con suero fetal bovino al 10 % (FBS "Gold"; PAA Laboratories, Reino Unido), 50 pg/ml de penicilina y estreptomicina (Invitrogen Ltd, Life Technologies Reino Unido), 0,1 mg/ml de heparina (Sigma Aldrich Chemical Co, Reino Unido) y 0,05 mg/ml de Endothelial Cell Growth Supplement (Alfa Aesar, Reino Unido). Las células se cultivaron en matraces de cultivo Nunc T75 (75 cm2; VWR International, Reino Unido) a 37 °C en una atmósfera humidificada que contenía CO2 al 5 %. Para los experimentos, las células se separaron al 70 % de confluencia con una solución de tripsina al 0,1 %/EDTA al 0,02 % y se sembraron en placas de 48 pocillos con 1 ml de medio de crecimiento completo por pocillo. Las células se cultivaron hasta una monocapa confluente.
Tratamiento de nanosílice. Se probaron tres preparaciones de nanosílice. Estas se denominan HS7, uSANS in situ y uSANS sacarosa que, respectivamente, se refieren a nanosílice preparada de las siguientes formas: uSANS sac.: Se prepararon uSANS de 1 día acidificando rápidamente Si(OH)4 500 mM sacarosa 1,5 M a pH 0,8-1 y diluyendo inmediatamente a 40 mM con H2O glucosa (concentración final de glucosa 136 mM). La dispersión se incubó durante la noche y se neutralizó a pH 7 inmediatamente antes de su uso.
uSANS in situ; (pH 5,0; síntesis discontinua; tamponado con citrato) se preparó mezclando 1 ml de Si(OH)480 mM y 1 ml de citrato (8 mM, HCl 47 mM). La solución se incubó durante 30 min y se añadieron 0,17 ml 10x de solución salina antes de su uso.
Estos se añadieron a células en el medio de crecimiento completo a concentraciones finales de silicio de Si total 1, 2 y 4 mM. Estos tratamientos se compararon con células sin tratar y células tratadas con vehículo; los tres vehículos (uno por preparación de nanosílice) se probaron en la dosis equivalente a los tratamientos de nanosílice 4 mM. Cada tratamiento y control se probó por sextuplicado (es decir, n = 6). Brevemente, el medio se aspiró de los pocillos sextuplicados, la nanosílice se diluyó en medio de crecimiento completo y se añadió inmediatamente a los pocillos (0,5 ml por pocillo).
Tras la adición de tratamientos de nanosílice o vehículo a las células, las placas de 48 pocillos se colocaron en el sistema de imágenes de células vivas IncuCyte Zoom (Essen BioScience Inc., Estados Unidos) y se adquirieron imágenes de contraste de fase cada 2 h, durante un período de 68 h.
Inducción de pZap70 en linfocitos Tpor Nanosílice
Se aislaron células mononucleares de sangre periférica (PBMC) de conos de leucocitos individuales adquiridos del National Blood Service (Cambridge, Reino Unido) usando centrifugación de gradiente de densidad. Las células se congelaron en medio de congelación (DMSO al 10 %, FBS al 50 %, RPMI 1640 al 40 %). Las células congeladas se descongelaron, se lavaron en RPMI y se dejaron reposar 2 h en RPMI que contenía FBS al 10 %, 0,3 g/l de L-glutamina, penicilina estreptomicina al 1 % y 0,01 pg/ml de ADNasa. Los linfocitos T se enriquecieron usando kits de aislamiento de linfocitos T Pan intactos. Las células se resuspendieron en RPMI FCS al 20 % a 2 x 106 células/ml y se añadieron 0,5 ml a tubos de FACS, seguido de 0,5 ml de tratamiento de nanosílice de RPMI /- 1600 uM (dando 1,0 x 106 células/ml, nanosílice 800 uM). Las células se incubaron durante 0-6 h, se centrifugaron y se lisaron usando tampón de muestra NuPage LDS. El análisis de transferencia Western se realizó sobre los lisados, tinción de vinculina (control interno, (An et al., 2012; Solan et al., 2003)) y pZap70 (Tyr319). Las intensidades de las bandas se cuantificaron a través de integración y se representaron como un porcentaje del control interno.
Después de acoplarse el complejo TCR/CD3 mediante un complejo pMHC, superantígeno o anticuerpo mitógeno, la activación de los linfocitos T se inicia mediante la fosforilación de la proteína quinasa 70 asociada a la cadena zeta (Zap70), ubicada en los motivos de activación de inmunorreceptores basados en tirosina (ITAM; del inglés, immunoreceptor tyrosine-based activation motifs) fosforilados (Love y Hayes, 2010). La Zap70 fosforilada (pZap70), a continuación, fosforila proteínas en dirección 3' conduciendo a la señalización a través del factor nuclear de linfocitos T activados (NFAT; del inglés, nuclear factor of activated T cells) y a una respuesta de los linfocitos T activados (Chakraborty y Weiss, 2014; Fathman y Lineberry, 2007; Rossy et al., 2012; Wang et al., 2010).
Ensayo de disolución de molibdato
Un ensayo de disolución de molibdato implica tomar una muestra de una composición de silicato polimérico y diluirla en tampón. Puede usarse un ensayo de ácido molíbdico para determinar la concentración de silicato soluble presente en una alícuota del tampón en el transcurso del tiempo del ensayo. Como se muestra en los ejemplos, la composición puede diluirse en tampón HEPES 50 mM y a pH 7,0-7,4. Un ensayo de ácido molíbdico ilustrativo emplea 100 pl de la solución de prueba o estándar (preparado a partir del estándar Si ICP 30 de Sigma Aldrich, 1000 mg/l) y 200 pl de solución colorante de ácido molíbdico (Mo 34,5 mM (añadido como NH4Mo74H2O) y H2SO40,15 M). La solución de ensayo se transfiere a una placa de pocillos y se mezcla durante 10 minutos. Después de la incubación, la absorbancia (400 nm) puede medirse y la concentración de ácido silícico soluble puede determinarse usando una curva estándar.
Ensayo de labilidad de molibdato
Se transfirieron 7,5 pl de suspensiones de Si 40 mM a una placa de 96 pocillos y muy rápidamente se añadieron 100 pl de agua UHP seguido de 200 pl de solución de ácido molíbdico (NH4Mo7O244H2O 34,5 mM en H2SO40,15 M). La absorbancia a 400 nm se midió cada 60 s durante 17 h. Se usó una solución de ácido silícico 40 mM como control en el ensayo.
Ensayo de disolución
Se recogió sangre completa en tubos de heparina y se mezcló brevemente. Se añadió heparina adicional (a una concentración de 0,5 mg/ml) para evitar la coagulación, nanosílice y se diluyó sucesivamente de acuerdo con la siguiente programación, 16 mM durante 25 s, 4 mM durante 1 h, 2 mM durante 3 h y 1 mM durante 20 h. Después del tratamiento y la incubación, los glóbulos rojos se lisaron, se tiñeron y se realizó una FACS inmediatamente. Para el control positivo, se añadió SEB a sangre completa a 2 ug/ml. Este ensayo mostró que las uSANS in situ (tamponado con citrato, síntesis discontinua) tenían el mismo perfil estimulante que las uSANS convencionales, como se determinó por las lecturas de CD4(+)-CD25, CD4 (+)-CD69, CD8(+)-CD25, and CD8 (+)-CD69.
Resultados
Los experimentos descritos anteriormente demuestran que solo la nanosílice ultrafina induce la activación crónica de las células de linfocitos T (ni el ácido silícico soluble (Si(OH)4 ni las partículas de sílice más grandes (por ejemplo, > 10 nm) hacen esto). Las Figuras 1 y 2 muestran la expresión del marcador de activación CD69 en los linfocitos T auxiliares después del tratamiento de ácido silícico y nanosílice ultrafina durante 24 h, en comparación con un control basal sin estimular y los silicatos producidos de acuerdo con el documento US 2011/0229577 (Kerek, Figura 1) y la composición de ácido ortosilícico estabilizado con colina disponible comercialmente, Biosil™ (Figura 2). Las Figuras 3 a 6 muestran comparaciones similares, con la adición de que el superantígeno de linfocitos T SEB (enterotoxina estafilocócica B) se usó como control positivo. Se demostró que las composiciones de partículas de sílice de la presente invención inducen la activación de los linfocitos T aumentando los niveles de expresión del marcador de activación de CD25 y CD69. De nuevo, el ácido silícico no tuvo ningún efecto sobre la expresión de los marcadores de activación en los linfocitos T (datos no mostrados).
La nanosílice ultrafina de la presente invención también indujo la activación crónica de los linfocitos T, comparable a la del superantígeno SEB. Las figuras muestran que la nanosílice activa tanto los linfocitos T auxiliares (CD4+) como los linfocitos T citotóxicos (CD8+) (es decir, que se vuelven positivos para CD25 y CD69 tras la exposición al nanosilicato).
Los experimentos descritos en el presente documento muestran que los linfocitos T de múltiples tipos de linaje pueden ser susceptibles a la activación de los linfocitos T a través de estas partículas de nanosílice ultrafinas (Figura 8). Sin embargo, a pesar de que se toleran mejor que las partículas HS7, las partículas uSANS todavía muestran una toxicidad moderada para las células endoteliales (Figura 9). Sin embargo, se pueden producir uSANS tóxicas de forma mínima mediante una síntesis in situ. Esta puede ser una síntesis discontinua en sistemas tamponados cuasi neutros o alternativamente, a través de una síntesis de flujo. Estos resultados también pueden replicarse con uSANS producidas usando un método de síntesis in situ como se describe en el presente documento.
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Claims (29)

REIVINDICACIONES
1. Una composición que comprende partículas de sílice que tienen un diámetro medio de entre 0,5 y 20 nm para usar en un método de activación de linfocitos T para terapia para un sujeto/individuo, en donde los linfocitos T activados son para usar en el tratamiento de cáncer y en donde la activación de los linfocitos T se caracteriza por un aumento en la expresión de CD69 y/o CD25 por los linfocitos T.
2. La composición para usar en un método de tratamiento de la reivindicación 1, en donde la composición de las partículas se sílice no es sustancialmente citotóxica de forma directa para las células cancerosas.
3. La composición para usar en un método de tratamiento médico de la reivindicación 1 o la reivindicación 2, en donde el cáncer es melanoma, cáncer de piel, cáncer de pulmón, cáncer de páncreas, cáncer colorrectal, cáncer gástrico, cáncer de mama, linfoma, leucemia, cáncer de útero, cáncer de próstata, cáncer de esófago, cáncer de huesos, cáncer de vejiga, cáncer de cuello uterino, cáncer de endometrio, cáncer de cerebro, cáncer de ojo, cáncer de ovario, cáncer testicular, cáncer de hígado, cáncer de riñón o cáncer de cabeza y cuello.
4. Una composición que comprende partículas de sílice que tienen un diámetro medio de entre 0,5 y 20 nm para usar en un método de activación de linfocitos T para terapia para un sujeto/individuo, en donde la composición es para usar en terapia de linfocitos T y en donde la activación de los linfocitos T se caracteriza por un aumento en la expresión de CD69 y/o CD25 por los linfocitos T, en donde la terapia de linfocitos T se selecciona de:
(a) osteoporosis, cicatrización de fracturas, enfermedad de las articulaciones, enfermedad de la piel o un trastorno de los vasos sanguíneos; o
(b) hipertensión, diabetes, una enfermedad ósea, enfermedad cardiovascular, una patología neurodegenerativa, hiperacidez, osteoporosis, cálculo dental, enfermedad de Alzheimer o enfermedad de Creutzfeldt-Jacob; o (c) el tratamiento de piel afectada por una quemadura, herida o acción de patógenos o de productos químicos cáusticos, psoriasis, eccema o dermatitis.
5. Una composición que comprende partículas de sílice que tienen un diámetro medio de entre 0,5 y 20 nm para usar en un método de activación de linfocitos T para terapia para un sujeto/individuo, en donde los linfocitos T activados son para usar en el tratamiento de una infección y en donde la activación de los linfocitos T se caracteriza por un aumento en la expresión de CD69 y/o CD25 por los linfocitos T.
6. Una composición que comprende partículas de sílice que tienen un diámetro medio de entre 0,5 y 20 nm para usar en un método de activación de linfocitos T para terapia para un sujeto/individuo, en donde los linfocitos T activados son para usar en el tratamiento de una enfermedad inflamatoria y en donde la activación de los linfocitos T se caracteriza por un aumento en la expresión de CD69 y/o CD25 por los linfocitos T.
7. La composición para usar en un método de tratamiento de la reivindicación 6, en donde la enfermedad inflamatoria es esclerosis múltiple, artritis reumatoide, enfermedad de Crohn, asma o colitis ulcerosa.
8. La composición para usar en un método de tratamiento de una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde el aumento en la expresión de CD69 y/o CD25 es de al menos un 20 % en comparación con un control basal sin estimular.
9. La composición para usar en un método de tratamiento de una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde los linfocitos T son células T, opcionalmente en donde los linfocitos T son linfocitos T auxiliares, linfocitos T reguladores, linfocitos T citotóxicos, linfocitos T citolíticos naturales (NKT) o linfocitos T gamma delta.
10. La composición para usar en un método de tratamiento de una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde la activación linfocitaria comprende inducir una respuesta inflamatoria de tipo Th1.
11. La composición para usar en un método de tratamiento de una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde:
(a) la activación de los linfocitos comprende aumentar la expresión de uno o más marcadores adicionales seleccionados de CD40L, LAP/GARP y/o FoxP3; y/o
(b) la activación de las células de linfocitos comprende aumentar la expresión de IFN-y.
12. La composición para usar en un método de tratamiento de una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde la composición no induce de forma sustancial la proliferación de células de linfocitos.
13. La composición para usar en un método de tratamiento de una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde las partículas de sílice tienen un diámetro medio de entre 0,5 y 10 nm, opcionalmente en donde las partículas de sílice tienen un diámetro medio de entre 2 y 5 nm.
14. La composición para usar en un método de tratamiento de una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde:
(a) la composición comprende agentes estabilizantes, opcionalmente seleccionados de polioles, azúcares y/o sales de amonio cuaternario, tales como colina y carnitina; o
(b) la solución no comprende un agente estabilizante.
15. La composición para usar en un método de tratamiento de una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde la composición de sílice puede obtenerse mediante precipitación.
16. La composición para usar en un método de tratamiento de una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde el método comprende administrar al sujeto un agente capaz de suprimir o mejorar uno o más linajes o fenotipos de linfocitos T específicos, opcionalmente en donde el agente es ciclofosfamida.
17. La composición para usar en un método de tratamiento de una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde el método comprende producir la composición de partículas de sílice mediante síntesis in situ antes de la administración al sujeto.
18. La composición para usar en un método de tratamiento de una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde:
(a) la síntesis in situ comprende mezclar (i) una solución de silicato a pH > 10,5 y (ii) una solución tampón ácida para producir una composición de sílice coloidal que tiene un pH entre 4,0 y 8,5; o
(b) la síntesis in situ comprende mezclar (i) una solución de silicato a pH > 10,5 y (ii) una solución tampón ácida para producir una composición de sílice coloidal que tiene un pH entre 4,0 y 6,5 en un proceso de síntesis in situ discontinua; o
(c) la síntesis in situ comprende mezclar (i) una solución de silicato a pH > 10,5 y (ii) una solución tampón ácida para producir una composición de sílice coloidal que tiene un pH entre 6,5 y 8,5 en un proceso de síntesis in situ de flujo.
19. La composición para usar en un método de tratamiento de una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde la composición de sílice coloidal es para la administración a un sujeto, opcionalmente en donde el método comprende administrar la composición de sílice coloidal al sujeto en menos de 12 minutos a partir de la mezcla de las soluciones.
20. La composición para usar en un método de tratamiento de una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde la composición es para administración intravenosa.
21. La composición para usar en un método de tratamiento de la reivindicación 18, en donde la solución ácida comprende ácido clorhídrico, un ácido carboxílico, tal como ácido cítrico o un aminoácido ácido, tal como la glicina.
22. La composición para usar en un método de tratamiento de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 19, en donde el método es un método de terapia de linfocitos T que comprende obtener de un sujeto una muestra que comprende linfocitos T, poner en contacto la muestra de linfocitos T con la composición de sílice para provocar que los linfocitos T en la muestra se activen y administrar los linfocitos T activados al sujeto.
23. La composición para usar en un método de tratamiento de una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde los linfocitos T activados son para usar en el tratamiento de un sujeto humano.
24. La composición para usar en un método de tratamiento de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 23, en donde los linfocitos T activados son para usar en el tratamiento de un animal no humano, opcionalmente en donde los linfocitos T activados son para uso veterinario, opcionalmente en donde los linfocitos T activados son para usar en el tratamiento de perros, gatos o caballos.
25. Un método para determinar la eficacia de una composición de partículas de sílice para la administración terapéutica a un sujeto o individuo, comprendiendo el método:
(a) poner en contacto una muestra de linfocitos T con la composición de partículas de sílice;
(b) determinar la expresión de CD69 y/o CD25 por los linfocitos T presentes en la muestra; y
(c) identificar las composiciones de partículas de sílice que causan un aumento en la expresión de CD69 y/o CD25 por los linfocitos T como adecuadas para usar en terapia.
26. Un ensayo para determinar la eficacia de una composición de partículas de sílice para la administración terapéutica a un sujeto o individuo, comprendiendo el ensayo:
(a) poner en contacto una muestra de linfocitos T con la composición de partículas de sílice;
(b) determinar la expresión de CD69 y/o CD25 por los linfocitos T presentes en la muestra;
(c) medir o cuantificar la cantidad de expresión de CD69 y/o CD25 respecto a un valor de control y si la cantidad de expresión de CD69 y/o CD25 aumenta con relación al valor de control, seleccionar la composición de partículas de sílice como adecuada para la administración terapéutica.
27. Un método para determinar la eficacia de una terapia que comprende la administración de una composición de partículas de sílice o protocolo de administración de la misma, al sujeto o individuo, comprendiendo el método:
(a) poner en contacto una muestra de linfocitos T del sujeto o individuo tratado con la composición de partículas de sílice o protocolo de administración de la misma;
(b) determinar la expresión de CD69 y/o CD25 por los linfocitos T presentes en la muestra; y
(c) identificar un sujeto o individuo para el que se observa un aumento en la expresión de CD69 y/o CD25 por los linfocitos T en la etapa (b) como tratado con éxito con la composición de partículas de sílice o protocolo de administración de la misma; o
(d) identificar un sujeto o individuo para el que no se observa aumento en la expresión de CD69 y/o CD25 por los linfocitos T en la etapa (b) y modificar la composición de partículas de sílice o protocolo de administración de la misma, proporcionada a ese sujeto o individual;
(e) opcionalmente repetir las etapas (a) a (d) hasta que el sujeto o individuo se trate con éxito con la composición de partículas de sílice o protocolo de administración de la misma.
28. El método o ensayo de una cualquiera de las reivindicaciones 25 a 27, en donde el aumento en la expresión de CD69 y/o CD25 por los linfocitos T se determina con relación a un valor de referencia, opcionalmente en donde el valor de referencia es un control basal sin estimular.
29. Uso de la expresión de CD69 y/o CD25 por linfocitos T como marcadores o biomarcadores de la eficacia terapéutica de las composiciones de partículas de sílice.
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