KR102362797B1 - 나노실리카 입자를 포함하는 조성물 및 치료요법(therapy)용 T 림프구의 활성화 방법에 있어 이들의 용도 - Google Patents

나노실리카 입자를 포함하는 조성물 및 치료요법(therapy)용 T 림프구의 활성화 방법에 있어 이들의 용도 Download PDF

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Abstract

0.5 nm와 20 nm 사이의 표준 입자 크기결정에 의한 평균 입자를 갖는 실리카 입자를 포함하는 조성물이 배양 중 또는 전혈 내 림프구를 활성화시키는데 사용하기 위해 기술된다.

Description

나노실리카 입자를 포함하는 조성물 및 치료요법(therapy)용 T 림프구의 활성화 방법에 있어 이들의 용도
본 발명은 나노실리카 입자를 포함하는 조성물 및 치료요법용 T 림프구의 활성화 방법에 있어 이들의 용도, 및 특히 치료요법에 사용하기 위한 실리카 입자 조성물의 효능을 특성화하는 바이오마커에 관한 것이다. 이들 마커의 사용에 기초한 분석 및 스크리닝 방법이 또한 기술되고, 나노실리카 조성물 또는 대상체(subject)에 투여되기 전에 생체 외에서 활성화된 T 림프구를 생산 및/또는 전달하기 위한 장치 및 키트도 기술된다.
실리콘(Silicon)은 환경적으로 편재하는 성분으로 서구 세계의 성인 인간은 현재 하루에 약 15 내지 50 mg을 섭취한다. 자연적으로 이는 실리콘이 산소 원자에 연결되어 있는 규산염(silicate)으로 발생한다. 규산 및 실리카가 또한 이러한 구조에 대해 사용되는 용어이다. 이들은 오르토(ortho)로도 불리는, 가장 단순한 모노 규산(mono silicic acid)에서 실리카 입자에 이른다. 본원에서 용어 규산염 및 실리카는 다른 이온을 또한 함유할 수 있지만, 크기, 응축의 정도, pH 등과 같은 인자에 의해 결정되는 수소 함량을 함유하는 규소 및 산소가 주된, 실리콘, 산소 및 수소 함유 물질을 의미하는데 호환적으로 사용될 수 있다. 가용성 규산염의 정확한 생물학적 역할이 아직 이해되지는 않았지만 많은 증거는 결합 조직 건강에서의 중요한 역할을 지적한다(Jugdaohsingh et al., 2008). 전형적인 결합 조직에는 뼈, 관절, 혈관, 피부, 머리카락 및 손톱이 포함되지만, 골다공증, 골감소증 및 다른 근골격계 및 관절 장애, 모든 유형의 암, 다양한 피부 상태, 혈관, 심혈관 및 관상동맥 심장병, 염증 질환, 자가면역 질환, 알츠하이머병 및 다양한 형태의 인지 손상, 다양한 유형의 감염, 상처 및 궤양, 위장, 간, 신장 및 면역 관련 장애 및 호르몬 관련 변화 및 장애를 포함하는 다양한 의학적 조건에서 가용성 또는 고분자 규산염의 식이, 보충, 또는 치료적 이익에 대한 주목할만한 증거가 또한 존재한다. 규산염의 유익한 영양적 및 치료적 효과는 다른 동물, 특히 다른 포유류에도 미치고 있는 것으로 보인다.
투여 후 효과적인 획득(흡수)을 가능케 하는 제형을 수득하는 것은 용이한 일이 아니지만, 규산염은 경구 영양 보충제로 사용되었다. 그의 자연 발생적인 무기 형태에서 실리콘은 오르토규산으로서 가용성이다. 그러나, 자연 조건하에서, 이는 점차적으로 응축 및/또는 크기가 증가한 다음 쉽게 재-용해되지 않는 입자의 중합 개시를 방지하기 위해 pH<9에서 수성 규산염의 최대 평형 용해도이기 때문에. 예컨대, 식수에서 이의 농도는 상대적으로 낮을 필요가 있다(≤1.7 mM). 이러한 거동은 농축된 형태의 흡수를 가능케 하기 위해 내장에서 용해되지 않기 때문에 보충 실리콘의 개발을 어렵게 하지만, 희석된 형태는 섭취될 필요가 있는 다량의 보충제(예컨대, 20-100 ml/일)를 초래한다.
일반적으로, 리간드와 같은 특정 화학적 모이어티가 가용성 양이온/음이온에 결합하여 이들이 생리학적 pH에서 침전될 수 있게 하지만, 규산염은 전형적으로 단량체가 임의의 다른 분자보다 그 자체에 대해 더 큰 친화도를 갖기 때문에(즉, 자기-조립(self-assembly)을 거침) 다루기 어렵고, 실리콘의 농도가 높을수록 수용액에서 이의 자기-조립을 중지시키는 것이 더 어렵다. 이는 생체이용가능한 규산염 조성물을 제조하기 위한 대안적인 전략을 유도하였다.
그러나, 또한, 의도적으로 또는 우발적으로, 연구자들은 침전된 규산염 조성물의 생물학적 효과를 연구하였다. 예를 들어, 세포에 대한 고분자, 나노-크기 및 미크론 크기의 규산염의 영향을 조사하였다.
US 2011/0229577(Kerek)은 입자가 반응 혼합물의 pH가 먼저 감소된 후 증가되어 pH 2.1 또는 9.2 초과의 pH인 조성물을 유도하는 조건에서 응축되는 쉘-유사(shell-like) 구조를 갖는 규산 입자를 개시한다. US 2011/0229577에 개시된 응축된 규산염 조성물은 시험관 내 세포 배양에서 낮은 독성을 가질 뿐만 아니라 칼슘 ATPase 펌프의 억제제이고 모든 세포 유형에서 아폽토시스를 유도하는 것으로 기술된다. 이렇게 응축된 규산염의 종양의 크기를 감소시키기 위한 용도가 보고된다.
높은 수준의 콜린에 의해 응집으로부터 안정화된 실리카 조성물이 식품 보충제로 판매되고 "콜린 안정화 오르토규산"(Biosil™; 염화콜린 안정화 오르토-규산, WO 95/ 21124 및 EP 1 371 289 A 참조)으로 언급된다.
US 2009/0130230(Stanley)은 규산염 조성물 및 염증 상태, 암, 세균 및 바이러스 감염의 치료, 및 감염 및 비감염 상처의 치료를 위한 이들의 용도를 개시한다. 이 참고문헌은 치료가 선천성 면역계의 활성화를 통해 일어난다고 가정한다.
WO 2015/121666(Medical Research Council)은 폴리올, 당 및/또는 4차 암모늄염, 예컨대 콜린 및 카르니틴과 같은 안정화제를 포함하는 나노실리카 조성물을 개시한다. 특히, WO 2015/121666은 고분자 규산 및 나노실리카 입자를 포함하는 안정화된 고분자 규산염 조성물을 제조하는 방법을 제공하는데, 여기서 규산염의 중합 및 입자 크기 성장이 제어되고 생성된 입자는 규산염 농도, pH 및/또는 안정화제의 조합을 통해 크기가 안정화된다. 일련의 의학적 상태 및 실리콘 보충을 위한 이들 조성물의 용도가 개시된다.
T 림프구는 신체로부터 감염되고 암성인 세포의 제거를 조율하고(CD4+ T 헬퍼 세포) 실행하는(CD8+ 세포독성 T 세포) 둘 모두에 직접적인 책임이 있는 적응 면역계의 세포이다. 따라서, 이들은 면역계의 중요 부분이다. 시험관 내에서 규산염에 의한 다중클론 인간 T-세포 활성화가 1994년에 최초로 보고되었고(Ueki et al., 1994), 규폐증(silicosis)과 같은 상태에서 T 세포 활성화와 규산염의 지속적인 관련성에도 불구하고, T 세포 상호작용의 크기, 구조, 정도 및 규산염과 T 세포 상호작용을 정의하는 작용 메커니즘은 아직까지 파악하기 어려운 상태이다 (Hayashi et al., 2010, Lee et al., 2012, Kusaka et al., 2014).
발명의 요약
광범위하게, 본 발명은 고분자 실리카 또는 실리카 중합체로도 명명된, 실리카 입자, 특히 0.5 nm와 20 nm 사이의 표준 입자 크기결정에 의한 평균 입자를 갖는 실리카 구조를 포함하는 조성물이 배양 중 또는 전혈 내 림프구를 활성화시키는데 사용될 수 있다는 발견에 기초한다. 이렇게 새로이 관찰된 기술적 효과는 암, 감염 및 다른 만성 질환에 대한 실리카 치료 효능의 마커 및 바이오마커로 사용되는 T 세포 활성화의 가능성을 열어준다. 임의의 특정 이론에 구속되기를 바라지 않으면서, 본 발명자들은 실리카 입자가 T 세포 수용체에 결합하여, 예를 들어 CD69 및/또는 CD25 발현을 증가시킴으로써 검출 가능한 정도로, 이들을 부분적으로 활성화하는 것으로 생각된다. 이는 T 세포가 이들의(예컨대, 암세포 또는 감염된 세포의) 동족 항원을 만나는 경우 활성화되는 것을 의미한다. 이는 T 세포가 정지상태(quiescent)가 될 가능성이 적고, 따라서 활성화가 수의학 및 인간 의학 둘 다에서, 암 또는 특정 만성 질환에서 유도된 T 세포 고갈을 극복하는데 제공될 수 있음을 의미한다.
통상적으로, 한 방향으로 100 nm 미만의 직경을 갖는 일차 입자는, 부피 기준으로, 1과 100 nm 사이에서 백만 배에 달할 수 있지만, 막연히 "나노"라고 불린다. 또한, 대부분의 연구자들은 단순히 "나노구조화된(nanostructured)" 집합체(aggregates) 또는 응집체(agglomerates)에 집중한다. 실제로 분산된 나노입자는 잘 연구되지 않았고 직경이 10 nm 미만(즉, 단백질 크기 범위)의 것들은 생물의약 응용에서 상대적으로 거의 관심을 받지 못하였다. 예를 들어, 광범위한 연구에 따르면 실리카 입자(-Si-O-Si-, 및 이들의 가장 응축된 형태인 SiO2로도 불림)는 무정형(거의 응축되지 않음) 거대 입자에 대한 양성 활성부터 결정형 석영에 대한 강한 전염증성(proinflammatory)에 이르는 크기 및 결정성에 따라 차별화된 세포 활성-결정성과 무관하게 나노실리카에 의해 부분적으로 모의되는 효과를 나타내는 것으로 밝혀졌다. 그러나, 초미세 실리카 입자(10 nm 미만의 직경)에 대한 연구는 거의 없다. 데이터의 부족에도 불구하고, 초미세 실리카 입자는, 수성 단량체 Si(OH)4의 농도가 ca. 1.7 mM 총 [Si]를 초과하는 경우 이들의 형성이 일어나기 때문에 편재한다. 이러한　'과-포화된(super-saturated)' 규산염 제조물을 사용하여 Stanley 등은 제조된 혼합물로 암이 치료될 수 있음을 교시한다. Kerek는 초미세 규산염 입자가 암의 치료에 유용할 수 있음을 되풀이하고 있고 이들의 합성을 위한 다수의 잠재적인 방법을 열거한다.
따라서, 제1 양태에서, 본 발명은 대상체/개체(subject/individual)를 위한 치료요법용 T 림프구를 활성화하는 방법에 사용하기 위한 0.5 nm와 20 nm 사이의 평균 직경을 갖는 실리카 입자를 포함하는 조성물을 제공하고, 상기 T 림프구의 활성화는 T 림프구에 의한 CD69 및/또는 CD25의 발현을 증가시킴을 특징으로 한다. 예로서, 바람직하게는 CD69 및/또는 CD25의 발현은, 예를 들어 비자극된 기저선 대조군에 비해, 적어도 20%, 적어도 30%, 적어도 40%, 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 또는 적어도 80% 증가된다.
말초 혈액 단핵구 세포(PBMC)를 사용해 CD69 및/또는 CD25 발현을 결정하기 위한 세포 분석이 하기에 제공된 실시예에 개시되지만, 이들 바이오마커에 대한 대안적인 분석은 당업자에게 자명할 것이다.
일반적으로, 본 발명자들은 Kerek(상동)의 교시에 따라 제조된 조성물 또는 콜린-안정화 오르토규산(Biosil™)과 같이, 선행기술에 개시된 조성물이 아닌, 본원에 기술된 실리카 입자 조성물을 사용하여 T 림프구 활성화가 달성될 수 있음을 확인하였다.
일반적으로, 본 발명에 사용된 나노실리카 조성물과의 접촉에 의해 활성화되는 T 림프구는 T 헬퍼 세포(helper cell), 세포독성 T 세포, 세포독성 자연 살해 T 세포 또는 감마 델타 T 세포와 같은 T 세포이다. 이는 T 헬퍼(CD4+) 및 세포독성(CD8+) T 세포를 사용한 실험에서 뒷받침된다. 대안적으로 또는 부가적으로, T 림프구 활성화는 CD40L, LAP/GARP 및/또는 FoxP3으로부터 선택되는 T 세포 활성화의 하나 이상의 추가 마커의 발현을 증가시킨다.
CD25(Cluster of Differentiation 25)는 IL-2 수용체의 알파 체인이다. 이는 활성화된 T 세포 상에 존재하는 타입 I 막횡단 단백질이다.
CD69(Cluster of Differentiation 69)는 인간 막횡단 C-타입 렉틴 단백질이다. T 림프구 및 자연 살해 T(NKT) 세포의 활성화는, 생체 내 및 시험관 내 둘 다에서, CD69의 발현을 유도한다.
CD154로도 불리는, CD40 리간드 또는 CD40L은 활성화된 T 림프구 상에서 주로 발현되는 단백질이고 TNF 수퍼패밀리 분자의 일원이다.
LRRC32(Leucine Rich Repeat Containing 32)로도 알려진 GARP(Glycoprotein A Repetitions Predominant)는 혈소판 및 활성화된 FOXP3+　조절 T 세포 상에서 잠재적 TGF-β의 표면 발현에 필수적인 단백질이다. GARP 및 잠재기-연관 펩티드(Latency-associated peptide, LAP)의 증가된 발현은 조절 유형 T 림프구(Treg)의 활성화 및 확장의 지표이다.
스커핀(scurfin)으로도 알려진, FoxP3(Forkhead box P3)은 면역계 반응에 관여하는 단백질이다. FOX 단백질 패밀리의 일원인, FOXP3은 조절 유형 T 세포(Treg)의 발달 및 기능에 있어서 조절 경로의 마스터 조절자로서 기능하는 것으로 보인다.
대안적으로 또는 부가적으로, 일부 경우에, 림프구 활성화는 IFN-γ의 발현 증가에 의해 확인될 수 있다. 본원에 기술된 실험은 조성물이 림프구 활성화를 야기하지만, 이들이 실질적으로 림프구 세포 증식을 유도하지는 않음을 추가로 보여준다.
당해 분야에 익히 공지된 바와 같이, 가용성 규산과 점차적으로 응축된 규산염 조성물 사이에는 평형이 존재한다. 따라서, 본 발명에서, "안정화된 고분자 규산염 조성물"은 본원에 기술된 특성을 갖는 고분자 규산 및 나노규산염 입자뿐만 아니라, 조성물 또는 이를 포함하는 제제 내에서 평형 상태에 있는 규산 및 폴리규산의 가용성 형태를 포함한다.
규산이 건강 및 질병 예방 또는 인간 및 다른 동물에서의 치료에 유익함을 시사하는 증거가 당해 분야에서 대두되고 있다. 일반적으로, 본 발명의 조성물은 나노규산염이 성장하여 고차 폴리규산염 및 규산염 입자를 형성하려는 자연적인 경향이 성장 지연제로서 작용할 수 있는 유기 화합물과 같은 물질의 함유에 의해 저해되는, 즉 폴리규산이 겔 및 더 응축된 규산염 입자 또는 고분자 및 원하는 크기의 입자보다 더 큰 입자를 형성하려는 자연적인 경향을 억제하는, 고분자 규산염 조성물을 포함한다. 또한, 일부 경우에, 본 발명자들은 이 접근법이 조성물이 생리학적으로 허용가능한 pH, 특히 중성 또는 약산성 pH 또는 약알칼리성 pH에서 안정하다는 것을 의미함을 발견하였다.
본원에 기술된 방법의 추가 이점은, 합성 동안 pH, 실리콘 농도, 및 안정화제 농도의 선택적 제어를 통해, 입자 크기가 바람직한 입자 크기에 따라 직경이 0.5 nm 미만 직경에서 최대 10 또는 20 nm 직경에 이르는 작은 고분자로부터 제작될 수 있고, 이는 선택된 입자 크기로 대상체 또는 동물에의 투여를 가능케 하도록 개요된 본 발명에 따라 안정화될 수 있다는 것이다. 입자 크기가 크기의 범위를 지칭하고 본원에서 인용된 숫자가 평균 직경, 가장 일반적으로는 그 입자 범위의 평균 직경을 의미하는 것은 당업자에게 자명할 것이다.
추가 양태에서, 본 발명은 대상체/개체를 위한 치료요법용으로 T 림프구를 활성화시키기 위한 약제의 제조에 있어 0.5 nm와 20 nm 사이의 평균 직경을 갖는 실리카 입자를 포함하는 조성물의 용도를 제공하고, 상기 T 림프구의 활성화는 T 림프구에 의한 CD69 및/또는 CD25의 발현을 증가시킴을 특징으로 한다.
추가 양태에서, 본 발명은 하기를 포함하는, 대상체 또는 개체에의 치료적 투여를 위한 실리카 입자 조성물의 효능을 결정하는 방법을 제공한다:
(a) T 림프구의 시료를 실리카 입자 조성물과 접촉시키는 단계;
(b) 시료에 존재하는 T 림프구에 의한 CD69 및/또는 CD25의 발현을 결정하는 단계; 및
(c) T 림프구에 의한 CD69 및/또는 CD25의 발현을 증가시킴을 야기하는 실리카 입자 조성물을 치료요법에 사용하기에 적합한 것으로 확인하는 단계.
추가 양태에서, 본 발명은 하기를 포함하는, 대상체 또는 개체에의 치료적 투여를 위한 실리카 입자 조성물의 효능을 결정하기 위한 분석법(assay)을 제공한다:
(a) T 림프구의 시료를 실리카 입자 조성물과 접촉시키는 단계;
(b) 시료에 존재하는 T 림프구에 의한 CD69 및/또는 CD25의 발현을 결정하는 단계;
(c) 대조군 값에 대한 CD69 및/또는 CD25의 발현량을 측정 또는 정량화하고, 만약 CD69 및/또는 CD25의 발현량이 대조군 값에 비해 증가한다면, 실리카 입자 조성물을 치료적 투여에 적합한 것으로 선택하는 단계.
추가 양태에서, 본 발명은 하기를 포함하는, 대상체 또는 개체에의 실리카 입자 조성물의 투여, 또는 이의 투여 프로토콜을 포함하는 치료요법의 효능을 결정하는 방법을 제공한다:
(a) 치료되는 대상체 또는 개체로부터의 T 림프구의 시료를 실리카 입자 조성물, 또는 이의 투여 프로토콜과 접촉시키는 단계;
(b) 시료에 존재하는 T 림프구에 의한 CD69 및/또는 CD25의 발현을 결정하는 단계; 및
(c) T 림프구에 의한 CD69 및/또는 CD25의 발현 증가가 단계 (b)에서 관찰된 대상체 또는 개체를 실리카 입자 조성물, 또는 이의 투여 프로토콜로 성공적으로 치료된 것으로 확인하는 단계; 또는
(d) T 림프구에 의한 CD69 및/또는 CD25의 발현 증가가 단계 (b)에서 전혀 관찰되지 않은 대상체 또는 개체를 확인하고, 이러한 대상체 또는 개체에게 제공된 실리카 입자 조성물, 또는 이의 투여 프로토콜을 변경하는 단계;
(e) 선택적으로 대상체 또는 개체가 실리카 입자 조성물, 또는 이의 투여 프로토콜로 성공적으로 치료될 때까지 단계 (a) 내지 (d)를 반복하는 단계.
본원에 개시된 분석법 및 방법에서, T 림프구에 의한 CD69 및/또는 CD25의 발현 증가는 기준치, 예를 들어 비자극된 기저선 대조군에 대해 결정된다.
추가 양태에서, 본 발명은 실리카 입자 조성물의 치료적 효능에 대한 마커 또는 바이오마커로서의, T 림프구에 의한 CD69 및/또는 CD25 발현의 용도를 제공한다.
추가 양태에서, 본 발명은 하기를 포함하는, 치료적 사용을 위한 실리카 조성물을 제조하기 위한 장치를 제공한다:
pH>10.5의 규산염 용액을 포함하는 제1 용기, 산성 완충액을 포함하는 제2 용기;
규산염 용액 및 산성 완충액의 유동을 제어하기 위한 유동 제어 수단; 및
상기 2개 용액이 대상체에의 투여 전에 혼합되도록 콜로이드 실리카 조성물을 전달하기 위한 제1 및 제2 용기와 유체 연통(fluid communication)되는 배출구.
일 구현예에서, 장치는 실리카 조성물의 배치 합성(batch synthesis)을 위해 사용되고 콜로이드 실리카 조성물의 제조를 위해 용액을 혼합하기 위한 제1 및 제2 용기와 유체 연통된 혼합 챔버(chamber)를 추가로 포함한다. 대안적으로, 장치가 본 발명의 실리카 조성물의 유동 합성(flow synthesis)을 위한 것인 경우, 용액의 혼합은 이들이 전달될 때 인 시튜(in situ)로, 예를 들어 대상체에의 투여 전에 i.v. 라인에서 일어날 수 있다.
본 발명의 추가 양태에서, 장치는 생체 외 T 림프구 치료요법용으로 개조될 수 있다. 이 양태에서, 장치는 대상체로부터 수득된 T 림프구를 포함하는 생물학적 시료를 콜로이드 실리카 조성물과 접촉시켜 치료요법용 T 림프구의 활성화를 야기하기 위한 챔버 및/또는 대상체로부터 추출된 T 림프구를 포함하는 시료를 접촉 챔버에 전달하고 활성화된 T 림프구를 대상체에 되돌려 보내기 위한 수단을 추가로 포함할 수 있다.
추가 양태에서, 본 발명은 (i) pH>10.5의 규산염 용액을 포함하는 제1 용기, 및 (ii) 산성 완충액을 포함하는 제2 용기, 및 (iii) 규산염 용액과 산성 완충액을 혼합하여 4.0과 8.5 사이, 더욱 바람직하게는, 4.0과 6.5 사이의 pH를 갖는 치료적으로 활성인 콜로이드 실리카 조성물을 제조하기 위한 사용설명서를 포함하는 키트를 제공한다. 바람직하게는, 산성 용액은 염산, 시트르산과 같은 카르복실산, 또는 글리신과 같은 산성 아미노산을 포함한다.
이하, 첨부된 도면을 참조하여 제한 없이 실시예에 의해 본 발명의 구현예가 기술될 것이다. 그러나 본 발명의 다양한 추가적인 양태 및 구현예는 본 개시내용에 비추어 당업자에게 자명할 것이다.
본원에 사용되는 경우 "및/또는"은 2개의 특정된 특징 또는 구성요소 각각에 대해 다른 하나가 존재 또는 부재하는 구체적인 개시로 간주된다. 예를 들어, "A 및/또는 B"는, 마치 각각이 본원에 개별적으로 개시된 것과 같이, (i) A, (ii) B, 및 (iii) A 및 B의 각각의 구체적인 개시로 간주된다.
맥락이 달리 지시하지 않는 한, 상기에 개시된 특징의 설명 및 정의는 본 발명의 임의의 특정 양태 또는 구현예로 제한되지 않으며 기술된 모든 양태 및 구현예에 동등하게 적용된다.
도 1. 본 발명의 실리카 입자 조성물 및 Kerek(US 2011/0229577)의 실시예 4에 따라 합성된 나노실리카 입자 Si(OMe)4)에 의한 T 세포 활성화. 세포를 나노입자로 처리하고 24시간 후 활성화를 평가하였다.
도 2. 본 발명의 실리카 입자 조성물 및 ch-OSA®(콜린-안정화 오르토규산, BioSil™)에 의한 T 세포 활성화.
도 3. Kerek 대비 본 발명의 실리카 입자 조성물에 의한 CD4+ 및 CD8+ 발현.
도 4. Kerek(+ 양성 대조군, SEB) 대비 본 발명의 실리카 입자 조성물에 의한 CD4+ 및 CD8+ 발현.
도 5. Biosil™ 대비 본 발명의 실리카 입자 조성물에 의한 CD4+ 및 CD8+ 발현.
도 6. Biosil™(+ 양성 대조군, SEB) 대비 본 발명의 실리카 입자 조성물에 의한 CD4+ 및 CD8+ 발현.
도 7. 23-40 mM Si ± 염화나트륨의 최종 농도로 알칼라인 규산나트륨 용액의 pH 중화(pH 7) 및 ~20 h의 인큐베이션(분산액의 경우 > 3 nm)에 의해 또는 500 mM 알칼라인 규산염 용액을 pH 0.8-1로 조정하고 세포 배양액에의 첨가 전에 ~20 h의 인큐베이션(<3 nm 분산액)(n = >8)에 의해 제조된, 다양한 크기의 초미세 나노실리카에 의한 CD4 및 CD8 T 세포의 활성화. 입자 평균 직경(DV0.5)이 보고된다.
도 8. 'HS-7'로 명명되고 23 mM Si의 최종 농도로 알칼라인 규산나트륨 용액의 pH 중화(pH 7)에 의해 제조되고 세포 배양액(n = 6-7)에의 첨가 전에 ~20 h 인큐베이션된 초미세 나노실리카에 의한 다양한 Th 계통 세포 유형의 활성화. 입자는 반복 분석으로부터 평균 직경(DV0.5) = 3.4-3.8 nm을 갖는다.
도 9. HUVEC 세포의 융합성에 대한 suc. uSANS (a), 인 시튜 uSANS (b) 및 이들의 비히클 대조군 (c)의 영향. 세포 독성(즉, 세포 모양의 변화 및/또는 세포사)을 유발하였기 때문에, HS7으로 명명된, 연구된 세 번째 나노실리카에 대해서는 참고 데이터를 나타낼 수 없었고, 모든 3개 농도(1, 2 및 4 mM Si)에서 단기간의 인큐베이션 후(< 1 h) 및 4-5 h 인큐베이션 후 대부분의 세포는 4 mM 농도에서 사멸하였다. 더 낮은 농도의 HS7(0.1, 0.25 및 0.5 mM Si)을 이용한 하기 실험에서는, 0.5 mM Si에서조차 독성이 나타났다.
도 10. 시간의 경과에 따라 측정된 pZap70은 T 세포 수용체와 상호작용하는 나노실리카로부터 비롯된 T 세포의 신속한 활성화를 입증하고, 이는 ZAP-70의 인산화를 초래한다.
도 11. 몰리브덴산염 분석에 의해 결정된 바와 같은 산성 저장 중의 uSANS의 화학적 불안정성. 모든 재료를 실온 또는 4℃에 저장하였다. 수크로스-안정화 uSANS(Suc uSANS)는 pH 2.15±0.15 또는 1.5±0.1에서 저장한 반면, 비-안정화 재료(NS uSANS)는 pH 1.5±0.1에서 저장하였다. 더 높은 OD는 더 큰 화학적 불안정성(즉, 덜 응축된 규산염)을 나타낸다.
도 12. 중화 (pH 7) 시 시간의 경과에 따른 uSANS의 화학적 불안정성. 몰리브덴산염 분석을 사용하여 중화 전(pH 2.3) 및 후(t 0h 내지 t 6h)에 uSANS와 가용성 규산염(Si(OH)4)의 불안정성을 비교하였다.
도 13. 다양한 인큐베이션 기간(1분 내지 1h) 후 인 시튜 형성된 uSANS(40 mM Si)의 화학적 불안정성.
상세한 설명
실리콘의 생물학적 역할 및 규산염의 화학적 성질
증거에 의하면, 단량체 또는 고분자의 규산이 인간 및 다른 동물에서의 건강 및 질병 예방 또는 치료에 유익한 것으로 제시된다. 그러나, 상기에 언급된 바와 같이, 당해 분야의 근본적인 문제점은 그의 단량체가 Si(OH)4로 표시되는 규산이 자가 조립되고 pHs ≤9.0 및 상기 농도에서 수성 규산염의 최대 용해도(25℃에서 1.7 mM, Jugdaosingh et al.의 도 1 참조, 상동)는 불용성 종을 형성한다. 당해 분야에 익히 공지된 바와 같이, 가용성 규산과 점차적으로 응축된 규산염 종, 즉 모노-, 디-, 및 트리-규산, 폴리규산 및 나노 실리카 입자 사이에는 평형이 존재한다.
규산 용액으로부터의 성장 과정은 단일 단위의 크기가 커지고 점점 더 발전하게 되는(즉, 덜 불안정하고, 가용성이고/이거나 용해할 수 있음) 진화를 포함하고, 따라서 첨가된 알칼리의 부재하에서 Si(OH)4 쪽으로 거의 돌아갈 수 없다. 성장은 중합, 집합, 응집, 또는 가용성 종의 표면 침착으로 인한 크기 증가를 포함할 수 있다. 폴리규산의 성장은 결국 적절한 조건하에서 겔 형성을 초래한다. 이러한 요인들은 수성 규산염의 이러한 농도보다 높고 생리학적으로 관련된 pH에서 규산염을 안정화시키는 것을 매우 어렵게 만든다.
따라서, 투약량이 농도 및 화학적 형태 둘 다의 측면에서, 생리학적 건강과 양립할 수 있는 pH에서, 그리고 건강에 유해한 효과를 가질 수 있는 규산염의 나노입자가 지속되는 것을 피할 수 있는 방식으로 바람직한 효과를 위해 요구되는 바와 같이 실리콘을 전달해야만 하기 때문에, 규산염의 투여는 도전 과제이다. 특히 주목해야 할 점은 투약량의 적용 도중에는, 일반적으로 생리학적 환경으로 인해 주목할만한 3가지 변화가 발생한다는 것이다. 첫째로, 생리학적 유체로 희석될 것이고, 둘째로, pH 변화가 있을 것이고, 셋째로, 이온 강도의 변화가 있을 것이다. 이러한 영향의 최종적인 효과가 투여된 규산염의 거동을 결정할 것이다.
나노실리카 조성물 및 T 림프구 활성화
본 발명자들은 본 발명의 나노실리카 조성물, 및 더욱 바람직하게는 실리카의 초미세 나노입자(< 10 nm 직경)가, 예를 들어 마커 CD25 및 CD69의 T 림프구 표면 상에서의 증가에 의해 측정되는 바와 같이, T 림프구 활성화를 촉진할 수 있음을 발견하였다. 임의의 특정 이론에 구속되기를 원치 않으면서, 본 발명자들은 이 활성화가 CD3-T 림프구 수용체 복합체(본원에서 CD3-TCR 복합체로 언급됨)에 대한 나노실리카의 직접적인 결합을 통해 일어나는 것으로 생각한다. 중요하게는, 크기가 나노실리카 조성물이 T 림프구를 활성화시킬 수 있는지에 대한 하나의 지표인 것으로 보이지만, 다른 요인들이 이러한 특성에 기여할 수 있다. 예를 들어, 높은 수준의 콜린에 의한 응집으로부터 안정화된 실리카의 초미세 나노입자는 식품 보충제로서 판매되고 '콜린 안정화 오르토규산'(Biosil™, 염화콜린 안정화 오르토-규산, WO 95/21124 및 EP 1 371 289 A 참조)으로 언급되지만, 이들은 본 발명의 분석에서 T 림프구 활성화를 자극할 수 없었다(도 2 및 5 참조). 또 다른 예로서, 본원의 실시예 4에서 비교를 위해 제조된, Kerek(US 2011/0229577)에 의해 보고된 나노실리카는 규산염의 알칼라인 용액의 pH 조정에 의해 제조된 약간의 새로 침전된 나노실리카에 비해 CD4 T 림프구의 매우 약한 활성화 유도제였고, CD8 T 림프구 활성화의 중등의 유도제였다(도 1, 3 및 4 참조). 추가 실시예에 따르면, WO2015/121666에 보고된 수크로스 안정화 나노실리카 입자는 비-안정화 입자와 같은 방식으로 CD4 및 CD8 T 림프구를 활성화시킬 수 있었다. 따라서, 일 양태에서, 본 발명은 간단한 물리-화학적 측정으로부터는 명백하지 않기 때문에 T 림프구 자극용 실리카 입자 조성물의 효능을 결정하기 위한 분석을 제공한다. 따라서, 이는 더 나은 표적화된 T 림프구 활성화 치료요법을 가능케 할 수 있는 CD8 및 CD4 T 림프구에 대한 임의의 바람직한 차등적인 효과를 포함하여, 실리카 나노입자의 활성을 선택하게 할 수 있다.
그럼에도 불구하고, 본 발명자들은 또한 T 림프구의 특이적 아형 또는 '계통'이 초미세 나노실리카에의 노출에 의해 동시에 활성화될 수 있음을 확인하였다. 예를 들어, CD4+ T 헬퍼(Th) 세포는 이들이 조절에 관여하는 면역반응의 유형에 따라 다수의 상이한 Th 계통으로 편리하게 분할될 수 있다(Geginat et al., 2015). 소위 Th1 CD4+ 헬퍼 세포는 세포독성 T 림프구 반응을 매개하고 단핵구를 활성화시킬 수 있으며, 이들은 IFN-γ의 생산을 특징으로 한다(Geginat et al., 2015). 반면, 소위 조절 CD4+ T 헬퍼 세포(Treg)는 면역반응을 억제하는 역할을 담당하고 이들은 폭스헤드 박스(foxhead box) P3 (FoxP3) 단백질 및 LAP과 GARP의 표면 발현으로 확인할 수 있다(Sakaguchi et al., 2010, Gauthy et al., 2013; Stockis et al., 2009). 반면, 소위 Th2 CD4+ T 헬퍼 세포는, 예를 들어 B 세포 반응의 매개를 담당할 수 있다. CD154로도 불리는, CD40 리간드는 Th2 세포에서 발현되고 B 세포의 CD40 수용체와 결합하여, B 세포 증식 및 생존을 촉진할 수 있다(Crotty, 2015; Elgueta et al., 2009).
본 발명자들은 다중 계통 유형의 T 림프구가 이들 초미세 나노실리카 입자를 통해 T 림프구 활성화에 영향을 받을 수 있음을 확인하였다(도 8). 이는 T 림프구가 다수의 치료적 응용에서 사용되는 것을 가능케 한다. 첫째로, 이 분석은 한 계통의 T 림프구 쪽으로 이러한 효과를 선택하거나 편향시키는 나노실리카의 특정 유형/형태를 동정하는데 사용될 수 있고, 그로써 조절, Th1 또는 Th2가 치료를 통해 우선적으로 선택될 수 있다. 예를 들어, Th1 세포의 선택적 활성화는 암 또는 바이러스 질환에 바람직할 수 있다. Tregs의 선택적 활성화는 자가면역 또는 염증 질환에 바람직할 수 있다.
둘째로, 만성적 투여와 함께, T 림프구의 활성화는 '소모(exhaustion)', 다시 말해 활성화의 역전을 달성하도록 치료적으로 사용될 수 있고, 따라서 모든, 또는 실제로 선택된, T 림프구 유형의 감쇠(불활성화)를 달성할 수 있다. 예를 들어, 이는 다발성 경화증 또는 류마티스 관절염, 크론병(Crohn's disease) 또는 류마티스 관절염과 같은 고전적 Th1, 또는 천식 또는 궤양성 대장염과 같은 Th2와 같은 고전적 자가면역인지 여부와 무관하게 '염증 질환'에서 치료학적으로 도움이 될 수 있다. 자가면역 질환은 Th1 또는 Th2 편향(polarisation)을 가질 수 있고, 이에 류마티스 관절염이 2회 언급된다.
셋째로, 모든 또는 선택된 T 림프구의 활성화 또는 배출을 위한 실리카 입자의 사용은 특정 T 세포 계통 또는 표현형을 억제하거나 증진시키고, 그로써 반응 유형을 선택하는 치료요법의 동시-투여와 함께 사용될 수 있다. 예를 들어, 사이클로포스파미드(cyclophosphamide)에 의한 암 치료요법을 위한 Treg T 림프구 계통의 격리(Becker et al., 2013)는 따라서 만성 T 림프구 소모를 회피하는 레지멘(regimen)으로 시행될 수 있는 나노실리카 치료요법으로 효과기 T 림프구 계통의 선택된 '성장'을 가능게 한다. 이러한 목적을 위한 동시-투여는 나노실리카의 투여 전 및/또는 도중 및/또는 후일 수 있고 하나 이상의 제제를 포함할 수 있다.
치료적 나노실리카는 위장관에서 거의 흡수되지 않기 때문에 비경구적으로 전달하는 것이 바람직할 것이다(Jugdaohsingh et al., 2000). 정맥내 투여가 특히 바람직할 수 있는 것으로 인지된다(WO 2015121666). 그러나, 이는 혈류에서 효과적인 치료적 용량을 달성하기 위해 고농도로 주입될 수 있는, 나노실리카가 혈관계를 감싸는 내피세포에 최소한으로 독성일 것을 요구할 것이다. 실제로, WO 2015/121666에 개시된 나노실리카의 한 형태인, 소위 uSANS 입자는 최소한으로 지속하며, 따라서 Stanley에 의해 US 2009/0130230에 이전에 개시된 것들보다 내피세포에 덜 독성을 갖는다(본원에서 HS7 입자로 언급됨). HS 7 입자는 0.5 mM Si보다 높은 상대적으로 더 독성이고, 따라서 치료적 용량에서 임상적 응용을 감소시킨다. 그러나, HS7 입자보다는 더 관용적이지만, uSANS 입자는 여전히 내피세포에 중등의 독성을 나타낸다(도 9). 그러나, 본 발명자들은 나노실리카에 의한 T 림프구의 제타-체인-연합 단백질 키나제(Zeta-chain-associated protein kinase) 70(pZap70)의 신속한 인산화에 의해 입증된 바와 같이, 나노실리카 입자와 TCR의 매우 신속한 상호작용이 존재함(도 10)을 발견하였고, 이는 혈액 또는 단리된 세포의 체외 처리가 나노실리카를 전달하는 유용한 방법임을 의미한다. 특히, 이들의 조직 또는 생체유체로부터의 단리 정도를 갖거나, 또는 전혈에 존재하는 바와 같은, 세포는 장시간 체외로 빠져나올 필요가 없으며, 그 후에 나노실리카로 처리되고 요법용으로 재-주입될 수 있다. 이는 나노실리카에 의한 면역세포와 단백질 결합, 및 나노실리카 입자의 일부 분해가 그의 재-투여 시 나노실리카에 의한 내피세포 상호작용 및 손상을 최소화하므로 내피 손상을 방지할 것이다.
따라서, 일 양태에서, 본 발명은 대상체/개체를 위한 치료요법을 위해 T 림프구를 활성화시키는 방법에 사용하기 위한 0.5 nm와 20 nm 사이의 평균 직경을 갖는 실리카 입자를 포함하는 조성물을 제공하고, 상기 방법은 대상체에의 투여 전에 인 시튜 합성에 의해 실리카 입자의 조성물을 제조하는 것을 포함한다. 본 발명의 다른 양태에서와 같이, T 림프구의 활성화는 일반적으로 T 림프구에 의한 CD69 및/또는 CD25의 발현을 증가시킴을 특징으로 한다.
대안적으로 또는 부가적으로, 본 발명은 대상체로부터 T 세포를 포함하는 시료를 수득하고, T 세포 시료를 본 발명의 실리카 조성물과 접촉시켜 시료 내 T 세포 활성화를 일으키고, 대상체에 활성화된 T 세포를 투여하는(즉, 되돌려 보내는) 것을 포함하는 T 세포 치료요법의 방법에 사용하기 위한 조성물을 제공한다.
본 발명의 추가 구현예로서, 본 발명자들은 최소한으로 독성인 uSANS, 즉, 배치 합성 또는 유동 합성 접근법 중 하나에 의해 임상적 응용 바로 직전에 생산되는 uSANS가 인 시튜 합성을 통해 생산될 수 있음을 발견하였다. 이러한 인 시튜 uSANS는 준-중성(quasi-neutral) 완충 시스템에서 배치 합성에 의해 생산될 수 있다. 인 시튜 합성은 2개의 용액 시스템을 포함한다: (ii) 산성 완충액(시트르산염과 같은 카르복실산염 및 글리신과 같은 아미노산을 포함)에 의해 중화되는 (i) pH>10.5의 규산염 용액(즉, 규산염은 콜로이드성이기 보다는 가용성임). 상기 두 용액의 혼합은 적당히 산성인 pH 4.0 및 6.5(더욱 바람직하게는 pH 5.0 및 6.0)을 초래하고 클러스터/콜로이드 규산염(즉, 나노실리카)이 그 후에 재빨리 형성된다. 이러한 콜로이드는 점차적으로 더 응축되고 이어서 선택된 불안정성 시점에서 투여될 수 있다. 바람직하게는 느린 인큐베이션(배치 인 시튜(batch in situ) 합성)의 경우 pH 4.0과 6.5 사이 또는 빠른 인큐베이션(유동 인 시튜 합성)의 경우 pH 6.5와 8.5 사이에서 인큐베이션이 수행될 것이다. 인큐베이션 동안 규산염의 농도는 바람직하게는 10 mM과 100 mM 사이, 바람직하게는 20 mM과 60 mM 사이의 범위이다. 인큐베이션 시간은 바람직하게는 인 시튜 배치 합성의 경우 15분과 60분 사이 또는 인 시튜 유동 합성의 경우 10초와 5분 사이(즉, 혼합과 정맥 내 도입 시점 사이의 시간 길이)이다. 예를 들어, 산 및 규산염 성분의 혼합 시 30분의 인큐베이션이 (i) 40 mM Si, (ii) 실온, (iii) pH 5.3(pH 스트립으로 pH 4.0-5.0으로 측정됨)에서의 배치 합성에 적절할 것이다. 또한, 예시적 목적으로, 유동 합성은 실온에서, (반응 튜브 내에서) 단 1분간의 인큐베이션을 요구할 수 있고 pH 7.0-8.0에서 50 mM Si(2개 성분의 혼합 시)를 포함할 수 있다. 유용하게도, 본 발명자들은 합성 조건이 본원에 기술된 몰리브덴산염 분석(불안정성 분석)의 사용을 통해 최적 입자 불안정성에 대해 미세-조정될 수 있음을 발견하였다.
본 발명의 추가 구현예로서, 인 시튜 uSANS가 유동 시스템을 통해 생산될 수 있다. 이는 유동 시스템이 정맥내 전달 시스템, 또는 세포 단리/처리 시스템에 연결될 수 있고, 그로써 합성과 전달 사이의 취급(및 오염 가능성)을 최소화할 수 있기 때문에 유리하다. 이 유동 합성에서 2개 용액은 인 라인(in line)으로 혼합된다: (i) pH>10.5의 규산염 용액(즉, 콜로이드성이 아닌 가용성 규산염) 및 ii) 산성액. 2개 유동이 조합될 때, 거의 중성의 pH (pH 6.5-8.0)가 달성되고 이는 체외로 대상체 또는 대상체의 세포에 직접적으로 투여될 수 있는 불안정한 규산염의 신속한 형성을 가능케 한다. 유용하게도, 이 유동 합성 시스템은 고도로 조율 가능하다. 예를 들어, 더 응축된 입자(요구되는 경우)는 더 긴 반응 튜빙(tubing)을 사용해 제조될 수 있고, 이는 대상체 또는 장치에의 주입 전에 더 긴 인큐베이션 시간(반응 튜빙 내에서)을 초래한다.
유용하게도, 인 시튜 uSANS는 최상의 표준 uSANS로서 T-세포 활성화에 효과적이지만 독성은 덜하다. 구체적으로, 단기간 노출 시 - 활성물질이 신속히 희석되는 정맥내 전달의 대표적인 경우, 인 시튜 uSANS는 시험된 가장 높은 농도에서조차 독성의 완벽한 결여를 나타내었다(4 mM; 도 9). 이러한 입자는 치료 프로토콜에서 발생하지 않는 손상을 유발하기 위해 내피세포와 함께 지속적으로 존재할 필요가 있다. 인 시튜 uSANS 시스템의 추가 이점은 완충제(예컨대, 규산염) 및 규산염 용액이 매우 안정하기 때문에 그의 성분 용액의 저장 수명은 사실상 '무한'이라는 점이다. 이는 낮은 저장 pH 및, 선택적으로, 안정화제의 존재에 의해 안정화되더라도, 몰리브덴산염 분석에 의해 입증될 수 있는 바와 같이, 점차적으로 덜 불안정해지는 표준 uSANS 와 대조적이다(도 11). 표준 uSANS의 또 다른 제한은, 이들의 낮은 pH로 인해, 이들 용액이 투여 전(예컨대, i.v. 전달)에 중화되어야 한다는 것이다. 그러나, 중화 전에, 불안정성은 급속히 감소하고, 이는 임상적으로 바람직하지 않은 특징이다. 실제로 이 효과는 중화 직후 측정 가능하며 12분 후 콜로이드는 더 이상 임상적으로 사용할 수 없다(도 12).
나노실리카 조성물
본 발명은 선택적으로 하나 이상의 안정화제에 의해 안정화된, 0.5 nm와 20 nm 사이의 평균 직경을 갖는 실리카 입자의 형태로 나노실리카를 포함하는 조성물에 관한 것이다. 본 출원에 개시된 발견은 본 발명의 나노실리카 조성물이 T 세포를 활성화시키는 방법에 사용될 수 있고, 그로써 하기에서 더 상세히 논의되는 바와 같이, 특히 암 및 감염의 치료에 있어, 대상체 또는 개체에 대한 치료요법을 제공한다.
대안적으로, 안정화제를 포함하는 안정화된 나노실리카 조성물을 포함하는 조성물 및 이의 제조 방법은 그 전체가 참조로서 포함되는 WO 2015/121666(Medical Research Council)에 기술되어 있다. 본 발명의 나노실리카 조성물과 사용하기에 적합한 안정화제의 예시에는 폴리올, 당 및/또는 4차 암모늄염, 예컨대 콜린 및 카르니틴이 포함된다. 구체적으로, WO 2015/121666은 고분자 규산 및 나노실리카 입자를 포함하는 안정화된 고분자 규산염 조성물을 제조하는 방법을 제공하는데, 여기서 규산염의 중합 및 입자 크기 성장이 제어되고 제조된 입자는 규산염 농도, pH 및/또는 안정화제의 조합을 통해 크기 안정화된다. 일부 구현예에서, 조성물은 이들이 입자 크기 성장을 유도할 수 있고 유용한 부가적인 특성을 갖는 조성물을 제공할 수 있기 때문에 금속 양이온으로 추가 도핑될 수 있다.
본 발명의 나노실리카 조성물은 20 nm 이하의 평균 직경을 갖는 가용성 폴리규산 및 나노실리카 입자를 포함하고, 일부 경우에 평균 직경은 더욱 바람직하게는 10 nm 미만, 더욱 바람직하게는 5 nm, 4 nm, 3 nm, 2 nm, 1 nm 또는 0.5 nm이다. 일부 구현예에서, 입자는 약 0.5 nm 내지 약 2 nm, 또는 약 0.5 nm 내지 약 3 nm, 또는 약 0.5 nm 내지 약 4 nm, 또는 약 0.5 nm 내지 약 5 nm, 또는 약 0.5 nm 내지 약 10 nm, 또는 약 0.5 nm 내지 약 15 nm, 또는 약 0.5 nm 내지 약 20 nm, 또는 약 5 nm 내지 약 20 nm, 또는 약 5 nm 내지 약 15 nm, 또는 약 5 nm 내지 약 10 nm, 또는 약 10 nm 내지 약 15 nm, 또는 약 10 nm 내지 약 20 nm, 또는 약 15 nm 내지 약 20 nm의 범위일 수 있다. 바람직한 조성물은 0.5 nm와 10 nm 사이의 평균 직경을 갖는 실리카 입자 및 2 nm와 5 nm 사이의 평균 직경을 갖는 실리카 입자를 포함한다.
고분자 규산 및/또는 나노실리카 입자의 비-가용성 특성은, 몰리브덴산 분석이 가용성 규산 분획을 결정하므로 상기에 언급된 바와 같이, 이 분석에 의해 간접적으로 확인될 수 있다. 일반적으로, 이 물질은 가용성 규산과 평형을 이룰 것이며, 전형적인 가용성 규산 농도는 pH<9.0에서 약 <2 mM이다. 본 발명의 나노실리카 조성물은 더 큰 나노입자(예컨대, 바람직하게는 50 nm 초과, 더욱 바람직하게는 20 nm 초과의 평균 크기를 가짐)를 포함하는 규산염, -OH 기가 사실상 존재하지 않는, 규산의 완전 응축된 형태인 폴리규산 겔 및 이산화규소(SiO2)의 더욱 응측된 형태와 대비될 수 있다. 폴리규산 입자의 크기는 동적 광산란을 이용하여 결정될 수 있고, 안정하지 않다면, 신선하게 준비된 시료에서 측정하는 것이 바람직하다. 당업자에 의해 이해될 것인 바와 같이, 폴리규산은 다른 규산염 종과 평형을 이룰 것이다. 예를 들어, 존재하는 정확한 조건에 따라, 이는 더 소량의 가용성 규산을 포함할 수 있다.
본 발명에 사용된 나노실리카 입자의 조성물은 일반적으로 수화되는데(aquated), 물은 이들의 합성 과정 전반에 존재하고, 바람직하게는 최종 제제 내에, 적어도 어느 정도(예컨대, 적어도 5 wt%, 더욱 바람직하게는 적어도 10 wt%, 적어도 20 wt%의 물) 존재하며, 즉, 재료가 제제화 및 후속 투여 전에 건조되거나 상당히 가열되지 않는다. 그러나 규산염 입자로부터 물 분자가 대체되는 고농도에서는 안정화제 또는 다른 제제화제가 사용될 수 있음이 명백할 것이다. 따라서, 제제가 건조되지 않더라도 물은 대체될 수 있다.
본 발명에 따라 사용되는 조성물 나노실리카 입자의 안정화는 바람직하게는 그들의 합성부터 그들의 저장, 제제화 및/또는 투여(예컨대, 응집의 바람직하지 않은 결여)까지 확장된다.
본 발명에 따라 사용되는 조성물 나노실리카 입자는 준안정적(metastable)이고, 즉 조성물은 이들의 의도된 용도의 저장 수명의 목적에 적합한 안정성을 보유한다. 예시로서, 본 발명의 고분자 규산염 조성물은 저장 안정성, 예를 들어 3개월 이상, 더욱 바람직하게는 6개월 이상, 더욱 바람직하게는 12개월 이상, 더욱 바람직하게는 24개월 이상 안정한 것이 바람직하다. 따라서, 본 발명의 고분자 규산염 조성물은 규산(또는 규산염) 분자의 부분적 응축에 의해 제조될 수 있다. 이러한 물질은 분리된, 비-집합된 클러스터 또는 콜로이드로서 준안정적이다.
본 발명의 일부 구현예에서, 나노실리카 입자의 조성물은 안정화제, 바람직하게는 당 및/또는 폴리알킬렌 글리콜을 포함한다. 당은 8개 단당 또는 그 이하로 구성된 올리고당, 예컨대 단량체, 이량체 또는 삼량체 당을 포함한다. 바람직한 당은 수크로스이다. 당 내 단량체 단위의 최대 수는 그의 투여가 투여 시 대상체에서 면역반응을 유도하지 않도록 선택된다. 폴리알킬렌 글리콜은 폴리에틸렌 글리콜(PEG) 및 폴리프로필렌 글리콜을 포함하는 폴리에테르 화합물의 패밀리이다. 당(당류)인 안정화제의 예시에는 단량체, 이랑체, 삼량체 및 고분자 당(당류), 또는 상응하는 당 알코올, 예컨대 글루코스, 프럭토스, 만노스, 수크로스, 쓰레이톨, 에리쓰리톨, 소르비톨, 만니톨, 갈락티톨 또는 아도니톨이 포함된다. 안정화제가 당인 일부 구현예에서, 이는 락토스 이외의 올리고당이다. 당 알코올이 사용되는 일부 구현예에서, 이는 만니톨 이외이다. 내부적으로 투여되는 조성물에 대한 안정화제로서의 당의 사용은, 이들이 인간 및 동물 대상체에의 투여용으로 안정하기 때문에 본 발명에서 바람직하다.
일부 구현예에서, 하나 이상의 상이한 당(들) 또는 폴리알킬렌 글리콜(들)의 조합, 예컨대, 2개, 3개, 4개, 또는 5개 이상의 당 또는 폴리알킬렌 글리콜의 조합을, 예컨대, 이들을 단계 (a) 및/또는 (b)에 첨가함으로써 사용할 수 있다. 당 및/또는 폴리알킬렌 글리콜 안정화제는 일반적으로 0.01 M과 3.0 M 사이, 더욱 바람직하게는 0.03 M과 2.0 M 사이, 가장 바람직하게는 0.1 M과 1.5 M 사이의 농도에서 첨가된다. 당업자는 임의의 주어진 상황에서 당 및/또는 폴리알킬렌 글리콜의 조합이 잘 작동하는지 여부를 결정하기 위해 일상적인 시험을 수행할 수 있다.
본 발명의 안정화된 나노실리카 조성물은 물 중에 메타규산 나트륨, 붕사(borax), 티오황산 나트륨, 탄산칼륨 및 정제된 설탕을 함유하는 조성물을 기술하는, 미국특허공개 제2003/0206967호(Choi 등)에 기술된 조성물과 구별될 수 있다. 이는 본 발명의 안정화된 고분자 규산염 조성물의 pH와는 대조적으로, 약 pH 13의 pH를 갖는 매우 알칼리성인 조성물을 생성하고, 이는 바람직하게는 pH 3.0과 9.0 사이, 더욱 바람직하게는 3.0과 8.0 사이, 더욱 바람직하게는 5.5와 7.5 사이이다. 본 발명이 안정한 규산염 중합체를 제조하기 위해 pH를 낮춤으로써 조성물을 제조하므로, Choi 등의 조성물을 제조하는데 사용된 방법은 본 발명과는 다르다. 상기에 비추어 볼 때, 본 발명에 사용된 나노실리카 조성물은 메타규산 나트륨, 붕사, 티오황산 나트륨, 탄산칼륨의 하나 이상을 포함하지 않는 것이 바람직하고, 바람직하게는 붕사를 포함하지 않는다. 본 발명의 바람직한 나노실리카 조성물은 콜린 및/또는 에탄올이 없을 수 있고, 따라서 각각 Biosil™ 및 Kerek에 기술된 규산염 조성물과 다르다.
다른 양태에서, 본 발명은 카르복실산을 안정화제로 사용할 수 있고 카르복실산은 C2-10 카르복실산, 예를 들어 옥살산, 말론산, 글루타르산, 타르타르산, 석신산, 아디프산 또는 피멜산과 같은 디카르복실산, 또는 이들의 이온화된 형태(즉, 상응하는 카르복실산염), 예컨대 아디프산염일 수 있다. 또는 글루콘산과 같은 모노카르복실산일 수 있다. 안정화제의 또 다른 예시는 식 HOOC-R1-COOH로 표시될 수 있는 디카르복실산(또는 이들의 이온화된 형태)일 수 있고, 여기서 R1은 선택적으로 치환된 C1-10 알킬, C1-10 알케닐 or C1-10 알키닐 기이다. 일반적으로, R1이 C1-10 알킬 기, 더욱 바람직하게는 C2-6 알킬 기인, 카르복실산의 사용이 바람직하다.
놀랍게도 본 발명자들은 또한 본 발명의 나노실리카 조성물이 알코올과 같은 비-수성 용매의 첨가에 의해 더욱 안정화될 수 있음을 발견하였다. 알코올의 바람직한 예시는 에탄올이다. 예시로서, 비-수성 용매는 10% v/v와 50% v/v 사이, 또는 20% v/v와 50% v/v 사이 또는 10% v/v와 20% v/v 사이로 첨가될 수 있다. 나아가, 일부 경우에 본 발명자들은 수크로스와 알코올의 조합이 나노실리카 조성물을 안정화시키는데 특히 효과적이었음을 발견하였다.
본 발명의 방법 단계에 대한 이하의 설명에서, 상기 방법의 일부 단계를 재정렬하고/하거나 단계의 일부가 동시에 일어나는 것이 가능할 수 있음이 당업자에게 명백할 것이다. 상기 단계 중 다른 것은 상기에 지시된 바와 같이 선택적이고 이하에서 더 설명된다.
본 발명에 이르는 연구에서, 본 발명자들은 출발 알칼라인 규산염 용액의 pH가 낮아지는 속도, 안정화제, 특히 당 또는 폴리알킬렌 글리콜의 포함, 금속 양이온의 첨가 및/또는 비-수성 용매의 첨가를 비롯한 다수의 요인들이 나노실리카 조성물의 안정성에 기여함을 발견하였다. 나노실리카 조성물을 제조하는 방법은, 단독으로 또는 임의의 조합으로, 이들 접근법을 사용하여, 예컨대 보충제 또는 치료제로 사용하기에 충분한 안정성을 갖는 나노실리카 조성물을 제조할 수 있다.
일부 경우에서, 특히 나노규산염의 초소형 입자("uSANS")의 제조에서는, 알칼라인 규산염 용액의 pH가 낮아지는 속도는 제조된 나노실리카 조성물의 안정성에 상당한 영향을 미칠 수 있다. 바람직하게는, pH는 60초 미만, 더욱 바람직하게는 30초 미만, 더욱 바람직하게는 10초 미만, 또는 가장 바람직하게는 5초 미만의 기간에 걸쳐서(예컨대, pH 4.0 또는 3.0 이하의 pH로) 낮아진다. 대안적인 실리카 입자 조성물 HS-7의 제조가 하기 실시예에서 제공된다.
알칼라인 규산염 용액의 농도는 0.05 M과 1.5 M 사이, 더욱 바람직하게는 0.03 M과 2.0 M 사이, 가장 바람직하게는 0.1 M과 1.0 M 사이인 것이 바람직하다. 또한, 9.5보다 높은 pH의 사용이 규산염의 용해도를 유지하는데 바람직하고, 바람직하게는 단계 (a)에서 알칼라인 규산염 용액의 pH는 약 pH 10.5 초과이고, 더욱 바람직하게는 약 pH 11.5 초과이다. 최종 고분자 규산염 조성물에서, 실리콘의 농도는 2.5 mM 이상, 5.0 mM 이상, 25 mM 이상, 30 mM 이상, 40 mM 이상, 50 mM 이상, 100 mM 이상, 250 mM 이상, 500 mM 이상일 수 있다. 최종 안정화된 고분자 규산염 조성물에서, 실리콘의 농도는 1.5 M 이하, 1.0 M 이하, 500 mM 이하일 수 있고, 이들 상한 및 하한 사이의 범위이다.
일부 구현예에서, 감소된 pH는 제조될 수 있는 안정화된 규산염 나노입자의 유형에 영향을 미칠 수 있다. 실시예에 나타난 바와 같이, 5 nm 이하의 평균 직경을 갖는 uSANS 또는 매우 작은 입자가 10 초과의 pH에서 3.0 이하로 pH를 급격히 저하시킴으로써 형성될 수 있고 이는 실리콘의 농도가 1 M까지 사용되게 할 수 있다. 대안적으로, SANS 또는 작은 나노입자는 10 nm 이하의 평균 직경을 가지며 pH를 약 7.4로 저하시킴으로써 형성될 수 있다. 이 경우에, 약 50 mM 이하의 더 낮은 농도가 사용될 수 있다. 따라서, 감소된 pH는 7.4 이하, 또는 pH 3.0 이하일 수 있다. 이는 기술된 바와 같은 낮은 pH에서 uSANS의 제조를 가능케 하는데, uSANS를 소정의 입자 크기의 SANS로 성장시키기 위해 pH를 상승시키고 다시 pH를 저하시킴으로써 크기를 안정화시키는 것이 요구된다. 선택적으로, 이 방법의 일부 단계에서 안정화제가 요구된다. 이러한 방법은 당업계의 중요한 부분이다.
일부 경우에, 안정화된 수성 현탁액의 장기 보관을 위해 pH를 낮추고/낮추거나 현탁액을 희석시킬 수 있다. 대안적으로 또는 부가적으로, 비-생리학적 pH에서의 장기 보관 시 또는 대상체에의 투여 전에. 나노규산염 현탁액은 생리학적 pH로 조정되고/되거나 희석되고/되거나 안정화제가 첨가될 수 있다.
나노규산염의 입자 크기가 의도된 응용에 대해 충분히 안정한 상태(<20 nm)로 유지되도록 조성물이 안정화될 수 있다. 예를 들어, 정맥내 투여를 위한 제제의 경우에, 제1 저장 용액의 입자 크기(예컨대, pH <3 및 100 mM Si에서)는 저장 기간 동안 안정할 것이고, 그 후에 완충된 i.v. 용액으로 희석되면, 이는 적용 전 처음 몇 시간 동안은 안정한 상태를 유지할 것이고, 일단 투여되면, 응집을 겪지 않을 것이다.
인 시튜 uSANS (규산염)의 배치 합성을 위한 합성 방법론
스톡 용액의 제조
성분 A(HCl + 규산): (i) 0.307 g의 규산(MW 192.124)을 180 ml의 UHP 용수에 용해시킴; (ii) 0.783 ml의 37% HCl을 교반하에 첨가함; (iii) UHP 용수를 사용해 부피를 200 ml로 조정함.
성분 B(80 mM 규산나트륨): 2.56 ml의 규산나트륨(~6.25 M Si)을 최종 부피 200 mL의 물로 희석함
성분 C(식염수; 선택적): 4.5 g의 NaCl을 45 ml의 UHP 용수에 용해시키고 최종 부피를 UHP 용수를 사용해 50 ml로 조정한다.
성분 A, B 및 C(선택적)의 안정화: 멸균 조건(유동 캐비닛)에서, 상기 성분 용액을 0.22 μm 필터를 통해 주사기로 멸균 용기 내로 여과한다.
콜로이드의 제조
단계 1: 성분 A(2.5 mL)를 성분 B(2.5 mL)와 혼합한다. 결과 pH는 pH 전극(pH 스트립 4.0-5.0)에 의해 측정된 바와 같이 대략 5.4이다.
단계 2: 30분간 인큐베이션함
단계 3(선택적): 인큐베이션 후 및 투여 직전에, 성분 C(0.425 mL)를 첨가하여 혼합한다.
인 시튜 uSANS ( 비완충됨 ) 의 인 라인 합성을 위한 합성 방법론
스톡 용액의 제조
성분 A(HCL): 1.2의 37% HCl을 최종 부피 100 mL의 물로 희석함.
성분 B(50 mM 규산나트륨): 0.8 mL의 규산나트륨(Sigma-338443, ~6.25M Si)을 최종 부피 100 mL의 물로 희석함
콜로이드의 제조
콜로이드를 30 cm 길이의 반응 튜빙을 사용하여 도 6에 제시된 바와 같은 유도 시스템에서 제조한다. 주사기 펌프 A 및 B를 각각 1.05 및 48.5 mL/h에서 작동시켰고, 이는 7.55의 pH를 초래하였다.
조성물의 제제화 및 사용
본 발명의 나노실리카 조성물은 규산염-함유 치료제로서 사용하기 위해 제제화될 수 있다. 조성물은 나노실리카 입자에 추가로, 약제학적으로 허용가능한 부형제, 담체, 완충제, 안정화제 또는 당업자에게 익히 알려진 다른 물질을 포함할 수 있다. 이러한 물질은 비-독성이어야 하고 나노실리카 입자 조성물의 효능을 방해해서는 안된다.
본원에 기술된 실험은, 본 발명의 나노실리카 입자 조성물이, 예를 들어 T 림프구의 비처리된 대조군 시료에 비해, 바이오마커 CD69 및/또는 CD25의 발현 증가에 의해 결정되는 바와 같이 T 림프구를 직접적으로 활성화시킬 수 있음을 입증한다. 본 발명의 분석 및 방법은 효과적인 치료적 실리카 입자 조성물의 스크리닝 및 개발에, 그리고 대상체 또는 개체에 투여되는 치료법의 효능을 결정하기 위해 사용될 수 있다.
본 발명을 이용한 T 림프구의 활성화는, 이것이 치료의 방식이든 예방의 방식이든, 대상체에 치료적 이익을 갖게 되는 다양한 상태 또는 질환의 치료에 사용될 수 있고, 적합한 농도로 투여될 때, 본 발명에 사용되는 실리카 조성물은 암세포에 실질적으로 직접 세포독성이지 않다는 이점을 갖는다. 암은 또한: 흑색종, 피부암, 폐암, 췌장암, 대장암 및 기타 내장암, 위암, 유방암, 림프종, 백혈병, 자궁암, 전립선암, 식도암, 골암, 방광암, 자궁경부암, 자궁내막암, 뇌암, 안암, 난소암, 고환암, 간암, 신장암, 두경부암을 포함하지만 이들로 제한되지 않으며, 전이성 및 원발성 암을 포함한다.
그러나, 암의 치료가 본 발명의 바람직한 용도 중 하나이지만, 본원에 기술된 T 세포 요법은 다른 상태, 특히 세균 감염 또는 바이러스 감염과 같은 감염의 치료에 사용될 수 있다. 감염에는: 바이러스, 레트로바이러스 및 미코박테리아, 그람 양성 세균 및 그람 음성 세균과 같은 세균, 뿐만 아니라 연충(helminths), 기생충 및 기타 감염 물질에 의한 감염이 포함되지만, 이들로 제한되는 것은 아니다. 일시적으로 안정한 규산염 나노입자는 그 자체가 결합조직 건강을 증진시키는데 효과적이고 골다공증, 골절 치유, 관절 질환, 피부 질환, 혈관 장애에 유용할 수 있는 규산의 방출을 위한 저장소로서 작용할 수 있다.
따라서, 투여는 비경구 투여, 후자는 특히 정맥내 투여에 의한 것일 수 있다.
본 발명의 조성물의 다른 의학적 용도는 고혈압, 당뇨병, 골 질환, 심장혈관 질환, 신경퇴행성 병리, 상기에 언급되지 않은 모든 유형의 암, 위산과다, 골다공증, 치석, 알츠하이머병, 크루츠펠트-야곱병(Creutzfeld-Jacob disease)의 치료뿐만 아니라 상처 치유를 포함한다. 본 발명의 조성물의 다른 의학적 용도는 햇볕 화상의 치료를 비롯한 화상, 상처 또는 병원균 또는 부식성 화학물질에 의해 영향을 받은 피부, 또는 건선, 습진 및 다른 종류의 피부염을 포함하는 임의의 피부 질환의 치료를 포함한다.
일부 양태에서, 활성화된 T 림프구를 사용하는 본 발명의 의학적 용도는 인간 대상체의 치료에 사용하기 위한 것이다. 그러나, 본 발명은 인간 대상체의 상태를 치료 또는 예방하기 위한 응용을 가질 뿐만 아니라, 예를 들어 비-인간 동물의 치료, 특히 개, 고양이 및 말과 같은 비-인간 포유류의 치료에 사용하기 위한 수의학 분야에서의 응용을 갖는다.
액체 약학적 조성물은 일반적으로 물, 석유, 동물유 또는 식물유, 광물유 또는 합성유와 같은 액체 담체를 포함한다. 생리학적 식염수, 덱스트로스 또는 다른 당류 용액 또는 글리콜, 예컨대 에틸렌 글리콜, 프로필렌 글리콜 또는 폴리에틸렌 글리콜이 포함될 수 있다. 규산염-함유 보충제가, 예컨대 물질의 성분의 전달을 제어하기 위해 고체 형태로 유지될 필요가 있는 경우에는, 그에 따라, 예컨대 물질의 액체 제제가 만들어지는 제제의 성분을 선택하는 것이 필요할 수 있다. 필요에 따라, 예를 들어 고분자 규산염 조성물이 점적(drip)을 통해 대상체에 투여하기에 적합한 본 발명의 구현예에서는, 보존제, 안정화제, 완충제, 항산화제 및/또는 다른 첨가제가 포함될 수 있다.
치료적 응용에서, 본 발명에 따라 사용되는 나노실리카 조성물은 "예방적 유효량" 또는 "치료적 유효량"(경우에 따라 예방이 치료요법으로 간주될 수 있지만)이 개체에 제공되는 것이 바람직하고, 이는 개체에게 이익(예컨대, 생체이용률)을 나타내는데 충분하다. 실제 투여량, 및 투여 속도 및 시간 경과는 치료되는 대상의 성질 및 중증도에 좌우될 것이다. 치료의 처방, 예컨대 복용량 결정 등은 일반의 또는 다른 의사의 책임 하에 이루어지며, 전형적으로 치료되는 장애, 개별 환자의 상태, 전달 부위, 투여 방법 및 개업의에게 공지된 다른 요인을 고려한다. 상기에 언급된 기법 및 프로토콜의 예시는 문헌[Remington's Pharmaceutical Sciences, 20th Edition, 2000, Lippincott, Williams & Wilkins]에서 확인할 수 있다. 조성물은 치료되는 상태에 따라, 단독으로 또는 다른 치료와 함께, 동시에 또는 순차적으로 투여될 수 있다.
재료 및 방법
실리카 입자 조성물 HS-7의 제조
0.1 g의 규산나트륨(cat. # 338443; Sigma-Aldrich Chemical Co., Gillingham, UK)을 20 g의 증류된 탈이온수(DDW; 18 MΩ/cm)에 희석하고 염산(HCl, 4-5 M)으로 pH 6.7-7.0(pH 테스트 스트립, Sigma-Aldrich Co., cat. # P3536)으로 조정하여 HS-7을 제조하였다. 분산액을 실온에서 16-24시간 동안 평형이 되게 유지시켰다.
실리카 입자 조성물 "uSANS"의 제조
초소형의 무정형 나노실리카(uSANS) 나노입자 분산액(1.9 nm)을 WO 2015/121666에 따라 제조하였다. 4 mL의 규산나트륨(cat. # 338443; Sigma-Aldrich Chemical Co., Gillingham, UK)을 30 mL의 증류된 이온수(DDW; 18 MΩ/cm)에 희석하여 uSANS를 제조하였다. 2 mL의 HCL(37%)을 혼합하는 동안 신속히 첨가하였다. 용액을 H2O를 사용해 50 mL로 희석하고 사용 전에 실온에서 16-24시간 동안 인큐베이션하였다.
US 2011/0229577(Kerek)의 실시예 4에 따른 비교 실리카 조성물
7.4 ml의 TMOS를 25 ml의 UHP 용수와 혼합하였다. pH를 아세트산(0.5 M)을 사용해 3.6으로 조정하고 제조된 혼합물을 교반하에 오일 배쓰 내 45℃에서 5분간 인큐베이션하였다. 이어서, 현탁액을 40분간 실온에서 냉각시키고 pH를 1 M HCL을 사용해 2.0으로 조정하였다. 마지막으로, 메탄올을 회전증발기(rotavapor)(T = 40-45℃)를 사용해 제거하였다.
세포 분석
말초 혈액 단핵구 세포(PBMC)를 밀도 구배 원심분리를 사용해 National Blood Service(Cambridge, UK)로부터 구매한 단일 백혈구 콘(cone)으로부터 단리하였다. 세포를 동결 매질(10% DMSO, 50% FBS, 40% RPMI 1640) 중에서 냉동시켰다. 냉동된 세포를 해동시키고, RPMI로 세척하고, 10% FBS, 0.3 g/L L-글루타민, 1% 페니실린-스트렙토마이신 및 0.01 μg/mL DNase를 함유하는 RPMI에서 2시간 동안 휴지시켰다. 세포를 RPMI + 20% FCS 중에 2×106 세포/mL로 재현탁하고 0.5 mL을 FACS 튜브에 첨가하고 이어서 0.5 mL RPMI +/- 1600 μM 나노실리카를 처리하였다(1.0×106 세포/mL, 800 μM 나노실리카 제공). 세포를 24시간 동안 인큐베이션하고, PBS+1% BSA로 세척하고, FACS 항체 및 생존능 마커(CD3, CD4, CD8, CD25, CD69, 7-AAD 생존력 마커)로 염색하였다. 세포를 수집 & 분석용 Summit 소프트웨어를 사용하는 Cyan-ADP 유동 세포계측기(Beckman Coulter) 상에서 즉시 분석하였고, 시료당 최소 400,000개의 이벤트를 획득하였다.
초미세 나노실리카에 의한 CD4 및 CD8 T 세포의 활성화
말초 혈액 단핵구 세포(PBMC)를 밀도 구배 원심분리를 사용해 National Blood Service(Cambridge, UK)로부터 구매한 단일 백혈구 콘으로부터 단리하였다. 세포를 동결 매질(10% DMSO, 50% FBS, 40% RPMI 1640) 중에서 냉동시켰다. 냉동된 세포를 해동시키고, RPMI로 세척하고, 10% FBS, 0.3 g/L L-글루타민, 1% 페니실린-스트렙토마이신 및 0.01 μg/mL DNase를 함유하는 RPMI에서 2시간 동안 휴지시켰다. 세포를 RPMI + 20% FCS 중에 2×106 세포/mL로 재현탁하고 0.5 mL을 FACS 튜브에 첨가하고 이어서 0.5 mL RPMI +/- 1600 μM 나노실리카를 처리하였다(1.0×106 세포/mL, 800 μM 나노실리카 제공). 세포를 24시간 동안 인큐베이션하고, PBS+1% BSA로 세척하고, FACS 항체 및 생존능 마커(CD3, CD4, CD8, CD25, CD69, 7-AAD 생존력 마커)로 염색하였다. 세포를 수집 & 분석용 Summit 소프트웨어를 사용하는 Cyan-ADP 유동 세포계측기(Beckman Coulter) 상에서 즉시 분석하였고, 시료당 최소 400,000개의 이벤트를 획득하였다.
초미세 나노실리카에 의한 상이한 Th 계동 세포 유형의 활성화
말초 혈액 단핵구 세포(PBMC)를 밀도 구배 원심분리를 사용해 National Blood Service(Cambridge, UK)로부터 구매한 단일 백혈구 콘으로부터 단리하였다. 세포를 동결 매질(10% DMSO, 50% FBS, 40% RPMI 1640) 중에서 냉동시켰다. 냉동된 세포를 해동시키고, RPMI로 세척하고, 10% FBS, 0.3 g/L L-글루타민, 1% 페니실린-스트렙토마이신 및 0.01 μg/mL DNase를 함유하는 RPMI에서 2시간 동안 휴지시켰다. 세포를 RPMI + 20% FCS 중에 2×106 세포/mL로 재현탁하고 0.5 mL을 FACS 튜브에 첨가하고 이어서 0.5 mL RPMI +/- 17 μL 또는 35 μL 나노실리카를 처리하였다(1.0×106 세포/mL, 각각 400 및 800 μM 나노실리카 제공). 세포를 24시간 동안 인큐베이션하고, PBS+1% BSA로 세척하고, FACS 항체 및 생존능 마커(CD3, CD4, CD8, CD25, CD69, CD40L, LAP, GARP, 7-AAD 생존력 마커)로 염색하였다. FoxP3의 세포내 염색을 위해, 세포막을 세포내 염색 전에 세포막 투과성 완충제로 처리하였다. 세포를 수집 & 분석용 Summit 소프트웨어를 사용하는 Cyan-ADP 유동 세포계측기(Beckman Coulter) 상에서 즉시 분석하였고, 시료당 최소 400,000개의 이벤트를 획득하였다. IFN 감마 사이토카인 분석을 위해, 인큐베이션의 말기에 수집된 세포 상층액을 제조사의 지침에 따라 표준 ELISA 키트를 사용하여 IFN 감마의 존재하에서 분석하였다.
내피 정맥 세포에 대한 나노실리카의 3가지 다른 형태의 독성
인간 제대혈 정맥 내피세포(HUVEC; ATCC, Manassas, USA)를 액체 질소 중의 냉동-저장으로부터 소생시켰고 완전 성장 배지에서 유지하였다: 10% 소 태아 혈청(FBS 'Gold'; PAA Laboratories, UK), 50 μg/mL 페니실린 및 스트렙토마이신(Invitrogen Ltd, Life Technologies UK), 0.1 mg/mL 헤파린(Sigma Aldrich Chemical Co, UK) 및 0.05 mg/mL 내피세포 성장 보충제(Alfa Aesar, UK)가 보충된, F-12K 배지(ATCC). 세포를 Nunc T75 배양 플라스크(75 cm2; VWR International, UK)에서 37℃의 5% CO2를 함유하는 습윤 대기 중에서 성장시켰다. 실험을 위해, 세포를 0.1% 트립신/0.02% EDTA 용액을 이용해 70% 융합성에서 분리하고 웰당 1 mL의 완전 성장 배지와 함께 48-웰 플레이트에 접종하였다. 세포를 융합성 단층으로 성장시켰다.
나노실리카 처리. 3종의 나노실리카 제조물을 시험하였다. 이들은 각각 하기 방식으로 제조된 나노실리카를 지칭하는 HS7, 인 시튜 uSANs 및 수크로스 uSANs로 지칭된다: Suc. uSANS: 1일된 uSANS를 500 mM Si(OH)4 + 1.5 M 수크로스를 pH 0.8-1로 신속히 산성화하고 H2O + 글루코스(최종 글루코스 농도 136 mM)를 이용해 즉시 40 mM로 희석하여 제조하였다. 분산액을 밤새 인큐베이션하고 사용 직전에 pH 7로 중화시켰다.
인 시튜 uSANS(pH 5.0; 배치 합성; 시트르산염 완충됨)를 1 mL의 80 mM Si(OH)4 및 1 mL의 시트르산염(8 mM, + 47 mM HCL)을 혼합하여 제조하였다. 용액을 30분간 인큐베이션하고 사용 전에 0.17 mL의 10× 식염수를 첨가하였다.
이들을 1, 2 및 4 mM 총 Si의 최종 실리콘 농도로 완전 성장 배지 중의 세포에 첨가하였다. 이러한 처리를 비처리된 세포 및 비히클 처리된 세포와 비교하였다-3종의 비히클(나노실리카 제조물당 하나)을 4 mM 나노실리카 처리와 동등한 용량에서 시험하였다. 각 처리군 및 대조군을 6배수로 시험하였다(즉, n=6). 간략히는, 배지를 6배수 웰로부터 흡인하고, 나노실리카를 완전 성장 배지 중에 희석하고 즉시 웰에 첨가하였다(웰당 0.5 ml).
나노실리카 또는 비히클 처리의 세포 첨가 후에, 48-웰 플레이트를 IncuCyte Zoom 생 세포 이미징 시스템(Essen Bioscience Inc., USA)에 넣어두고 68시간에 걸쳐, 매 2시간마다 위상차 이미지를 얻었다.
나노실리카에 의한 T 세포에서 pZap70 유도
말초 혈액 단핵구 세포(PBMC)를 밀도 구배 원심분리를 사용해 National Blood Service(Cambridge, UK)로부터 구매한 단일 백혈구 콘으로부터 단리하였다. 세포를 동결 매질(10% DMSO, 50% FBS, 40% RPMI 1640) 중에서 냉동시켰다. 냉동된 세포를 해동시키고, RPMI로 세척하고, 10% FBS, 0.3 g/L L-글루타민, 1% 페니실린-스트렙토마이신 및 0.01 μg/mL DNase를 함유하는 RPMI에서 2시간 동안 휴지시켰다. T 세포를 손상되지 않은(untouched) Pan T 세포 단리 키트를 사용하여 농축시켰다. 세포를 RPMI + 20% FCS 중에 2×106 세포/mL로 재현탁하고 0.5 mL을 FACS 튜브에 첨가하고 이어서 0.5 mL RPMI +/- 1600 μM 나노실리카를 처리하였다(1.0×106 세포/mL, 800 μM 나노실리카 제공). 세포를 0-6시간 동안 인큐베이션하고, 회전시키고 NuPage LDS 시료 완충제를 사용하여 용해시켰다. 웨스턴 블롯 분석을 용해물에 대해 수행하여, 빈쿨린(vinculin)(내부 대조군, (An et al., 2012; Solan et al., 2003)) 및 pZap70(Tyr319)에 대해 염색하였다. 밴드 강도를 통합하여 정량하였고 내부 대조군의 백분율로 표시하였다.
TCR/CD3 복합체가 pMHC 복합체, 수퍼항원 또는 유사분열 항체에 의해 결합된 후, T 세포 활성화가 인산화된 면역수용체 티로신-기반 활성화 모티프(ITAM)에 위치하는, 제타-사슬 연관 단백질 키나제 70(Zap70)의 인산화를 통해 개시된다(Love and Hayes, 2010). 인산화된 Zap70(pZap70)는 이어서 활성화된 T 세포(NFAT)의 핵 인자를 통한 신호전달 및 활성화된 T 세포 반응을 초래하는 하류 단백질을 인산화시킨다(Chakraborty and Weiss, 2014; Fathman and Lineberry, 2007; Rossy et al., 2012; Wang et al., 2010).
몰리브덴산염 용해 분석
몰리브덴산염 용해 분석은 고분자 규산염 조성물의 시료를 취하고 이를 완충제 중에 희석하는 것을 포함한다. 몰리브덴산 분석은, 분석의 시간 경과에 따라 완충제의 분액 내에 존재하는 가용성 규산염의 농도를 결정하는데 사용될 수 있다. 실시예에 나타난 바와 같이, 조성물은 50 mM HEPES 완충제 중에 pH 7.0-7.4로 희석될 수 있다. 예시적인 몰리브덴산 분석은 100 μL의 시험 용액 또는 표준품(Sigma Aldrich Si ICP 30 표준품으로부터 제조됨, 1000 mg/L) 및 200 μL 몰리브덴산 착색 용액(34.5 mM Mo (NH4Mo7　4H2O로 첨가됨) 및 0.15 M H2SO4)을 이용한다. 분석액을 웰 플레이트로 옮기고 10분간 혼합한다. 인큐베이션 후, 흡광도(400 nm)를 측정하고 가용성 규산의 농도를 표준 곡선을 사용하여 결정할 수 있다.
몰리브덴산염 불안정성 분석
7.5 μL의 40 mM Si 현탁액을 96 웰 플레이트로 옮기고 100 μL의 UHP 용수 및 이어서 200 μL의 몰리브덴산 용액(0.15 M H2SO4 중의 34.5 mM NH4Mo7O244H2O)을 매우 신속히 첨가하였다. 400 nm에서의 흡광도를 17시간 동안 매 60초마다 측정하였다. 40 mM의 규산 용액을 이 분석에서 대조군으로 사용하였다.
용해 분석
전혈을 헤파린 튜브에 수집하여 가볍게 혼합하였다. 응고를 방지하기 위해 헤파린을(0.5 mg/mL의 농도로) 추가 첨가하였고, 나노실리카를 하기 일정에 따라 연속적으로 희석하였다: 25초간 16 mM, 1시간 동안 4 mM, 3시간 동안 2 mM 및 20시간 동안 1 mM. 처리 및 인큐베이션 후, 적혈구를 용해시키고, 염색한 후, FACS를 즉시 수행하였다. 양성 대조군으로, SEB를 2 μg/mL로 전혈에 첨가하였다. 이 분석에 따르면 인 시튜 uSANS(규산염 완충된, 배치 합성)가, CD4(+)-CD25, CD4(+)-CD69, CD8(+)-CD25, 및 CD8(+)-CD69 판독(readout)에 의해 결정되는 바와 같은, 표준 uSANS와 동일한 자극 프로파일을 갖는 것으로 나타났다.
결과
상기에 기재된 실험은 초미세 나노실리카만이 T 림프구 세포의 만성적 활성화를 유도함(가용성 규산(Si(OH)4)도 아니고 더 큰 실리카 입자(예컨대, > 10 nm)도 이러하지 않음)을 입증한다. 도 1 및 2는 비자극된 기저선 대조군 및 US 2011/0229577(Kerek, 도 1)에 따라 제조된 규산염 및 상업적으로 이용가능한 콜린 안정화 오르토규산 조성물인, Biosil™(도 2)에 비해, 24시간 동안의 규산 및 초미세 나노실리카 처리 후 헬퍼 T 세포에서 활성화 마커 CD69의 발현을 나타낸다. 도 3 내지 6은 T 림프구 수퍼항원 SEB(Staphylococcal enterotoxin B)이 양성 대조군으로 사용된 것을 추가하는, 유사한 비교를 나타낸다. 본 발명의 실리카 입자 조성물은 CD25 및 CD69 활성화 마커 발현 수준을 증가시킴으로써 T 세포 활성화를 유도하는 것으로 나타났다. 다시 말해, 규산은 T 세포 상의 활성화 마커의 발현에 아무런 영향을 미치지 않았다(데이터 미제시). 본 발명의 초미세 나노실리카는 또한 수퍼항원 SEB와 비슷하게, T 세포의 만성적 활성화를 유도하였다. 도면은 나노실리카가 T 헬퍼(CD4+) 및 세포독성(CD8+) T 세포 둘 다를 활성화시킴을 보여준다(즉, 이들은 나노실리카 노출 시 CD25 및 CD69 양성이 됨).
본원에 기술된 실험은 다양한 계통 유형의 T 세포가 이러한 초미세 나노실리카 입자를 통해 T 세포 활성화에 영향을 받을 수 있음을 보여준다 (도 8).
그러나, HS7 입자보다 더 관용적이긴 하지만, uSANS 입자는 여전히 내피세포에 중도의 독성을 나타낸다(도 9). 그러나, 최소 독성의 uSANS가 인 시튜 합성을 통해 제조될 수 있다. 이는 준-중성의 완충된 시스템에서의 배치 합성 또는 대안적으로 유동 합성을 통해서일 수 있다. 이러한 결과는 또한 본원에 기술된 인 시튜 합성 방법을 이용하여 제조된 uSANS로 복제될 수 있다.
선행기술문헌:
본 명세서에 언급된 모든 문서는 그 전체가 참조로서 본원에 포함된다.
Figure 112019021364527-pct00001
Figure 112019021364527-pct00002
Figure 112019021364527-pct00003
Figure 112019021364527-pct00004

Claims (48)

  1. 암, 감염 또는 염증 질환을 갖는 대상체/개체(subject/individual)를 치료하는 방법에 사용하기 위해 T 림프구를 활성화하기 위한 0.5 nm와 10 nm 사이의 평균 직경을 갖는 실리카 입자를 포함하는 조성물로서, T 림프구의 활성화가 T 림프구에 의한 CD69 및/또는 CD25의 발현을 증가시킴을 특징으로 하고, 감염이 바이러스 감염, 세균 감염, 연충(helminths) 감염 또는 기생충 감염이고, 염증 질환이 다발성 경화증, 류마티스성 관절염, 크론병(Crohn's disease), 천식 또는 궤양성 대장염인, 조성물.
  2. 제1항에 있어서, CD69 및/또는 CD25의 발현이 비자극된 기저선 대조군에 비해 적어도 20% 증가하는 것인, 조성물.
  3. 제1항에 있어서, T 림프구가 T 세포인 것인, 조성물.
  4. 제1항에 있어서, T 세포가 T 헬퍼 세포(helper cell), 조절 T 세포, 세포독성 T 세포, 자연 살해 T 세포(NKT) 또는 감마 델타 T 세포인 것인, 조성물.
  5. 제1항에 있어서, 림프구 활성화가 염증성 Th1 타입 반응의 유도를 포함하는 것인, 조성물.
  6. 제1항에 있어서, 림프구의 활성화가 CD40L, LAP/GARP 및/또는 FoxP3으로부터 선택되는 하나 이상의 추가 마커의 발현을 증가시킴을 포함하는 것인, 조성물.
  7. 제1항에 있어서, T 림프구의 활성화가 IFN-γ의 발현을 증가시킴을 포함하는 것인, 조성물.
  8. 제1항에 있어서, 조성물이 림프구 세포 증식을 유도하지 않는 것인, 조성물.
  9. 삭제
  10. 제1항에 있어서, 실리카 입자가 2 nm와 5 nm 사이의 평균 직경을 갖는 것인, 조성물.
  11. 제1항에 있어서, 조성물이 폴리올, 당, 4차 암모늄염, 콜린, 카르니틴 및 이들의 조합으로부터 선택되는 안정화제를 포함하는 것인, 조성물.
  12. 제1항에 있어서, 조성물이 폴리올, 당, 4차 암모늄염 및 이들의 조합으로부터 선택되는 안정화제를 포함하지 않는 것인, 조성물.
  13. 제1항에 있어서, 실리카 조성물이 침전에 의해 수득될 수 있는 것인, 조성물.
  14. 삭제
  15. 제1항에 있어서, 실리카 입자 조성물이 암세포에 대해 직접적으로 세포독성을 나타내지 않는 것인, 조성물.
  16. 삭제
  17. 삭제
  18. 삭제
  19. 삭제
  20. 삭제
  21. 삭제
  22. 제1항에 있어서, 방법이 대상체에의 투여 전에 인 시튜(in situ) 합성에 의해 실리카 입자의 조성물을 제조하는 것을 포함하는 것인, 조성물.
  23. 제22항에 있어서, 인 시튜 합성이 (i) pH>10.5의 규산염 용액 및 (ii) 산성 완충액을 혼합하여 4.0과 8.5 사이의 pH를 갖는 콜로이드 실리카 조성물을 제조하는 것을 포함하는 것인, 조성물.
  24. 제23항에 있어서, 인 시튜 합성이 (i) pH>10.5의 규산염 용액 및 (ii) 산성 완충액을 혼합하여 배치 인 시튜(batch in situ) 합성 공정으로 4.0과 6.5 사이의 pH를 갖는 콜로이드 실리카 조성물을 제조하는 것을 포함하는 것인, 조성물.
  25. 제23항에 있어서, 인 시튜 합성이 (i) pH>10.5의 규산염 용액 및 (ii) 산성 완충액을 혼합하여 유동 인 시튜 합성 공정으로 6.5와 8.5 사이의 pH를 갖는 콜로이드 실리카 조성물을 제조하는 것을 포함하는 것인, 조성물.
  26. 제23항 내지 제25항 중 어느 한 항에 있어서, 콜로이드 실리카 조성물이 대상체에 투여하기 위한 것인, 조성물.
  27. 제26항에 있어서, 방법이 콜로이드 실리카 조성물을 규산염 용액 및 산성 완충액을 혼합한 후 12분 미만에 대상체에 투여하는 것을 포함하는 것인, 조성물.
  28. 제1항 내지 제8항, 제10항 내지 제13항, 및 제15항 중 어느 한 항에 있어서, 조성물이 정맥내 투여를 위한 것인, 조성물.
  29. 제23항 내지 제25항 중 어느 한 항에 있어서, 산성 완충액이 염산, 시트르산, 카르복실산, 글리신, 또는 산성 아미노산을 포함하는 것인, 조성물.
  30. 제1항 내지 제8항, 제10항 내지 제13항, 및 제15항 중 어느 한 항에 있어서, 방법이 대상체로부터 T 세포를 포함하는 시료를 수득하고, T 세포 시료를 실리카 조성물과 접촉시켜 시료 내 T 세포의 활성화를 유도하고 활성화된 T 세포를 대상체에 투여하는 것을 포함하는 T 세포 치료요법의 방법인 것인, 조성물.
  31. 제1항 내지 제8항, 제10항 내지 제13항, 및 제15항 중 어느 한 항에 있어서, 활성화된 T 림프구가 인간 대상체의 치료에 사용하기 위한 것인, 조성물.
  32. 제1항 내지 제8항, 제10항 내지 제13항, 및 제15항 중 어느 한 항에 있어서, 활성화된 T 림프구가 비-인간 동물의 치료에 사용하기 위한 것인, 조성물.
  33. 제32항에 있어서, 활성화된 T 림프구가 수의학적 용도로 사용하기 위한 것인, 조성물.
  34. 제33항에 있어서, 활성화된 T 림프구가 개, 고양이 또는 말의 치료에 사용하기 위한 것인, 조성물.
  35. 삭제
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  41. 제1항 내지 제8항, 제10항 내지 제13항, 및 제15항 중 어느 한 항에 따른 실리카 조성물을 제조하기 위한 장치로서, 하기를 포함하는 장치:
    pH>10.5의 규산염 용액을 포함하는 제1 용기, 산성 완충액을 포함하는 제2 용기;
    규산염 용액 및 산성 완충액의 유동을 제어하기 위한 유동 제어 수단; 및
    상기 2개의 용액이 대상체에의 투여 전에 혼합되도록 콜로이드 실리카 조성물을 전달하기 위해 제1 및 제2 용기와 유체 연통(fluid communication)되는 배출구.
  42. 제41항에 있어서, 장치가 콜로이드 실리카 조성물을 제조하도록 상기 용액의 혼합을 위해 제1 및 제2 용기와 유체 연통된 혼합 챔버(chamber)를 추가로 포함하는 것인, 장치.
  43. 제41항에 있어서, 용액이 대상체에의 투여 전에 i.v. 라인에서 인 시튜로 혼합하는 것인, 장치.
  44. 제41항에 있어서, 장치가 대상체로부터 수득된 T 림프구를 포함하는 생물학적 시료를 콜로이드 실리카 조성물과 접촉시켜 T 림프구의 활성화를 야기하기 위한 챔버를 추가로 포함하는 것인, 장치.
  45. 제44항에 있어서, 장치가 대상체로부터 추출된 T 림프구를 포함하는 시료를 접촉 챔버로 전달하고 활성화된 T 림프구를 대상체에 되돌려 보내기 위한 수단을 포함하는 것인, 장치.
  46. 제41항에 있어서, 배출구가 콜로이드 실리카 조성물 또는 활성화된 T 림프구를 대상체에 전달하기 위한 정맥 내 라인에 연결되는 것인, 장치.
  47. (i) pH>10.5의 규산염 용액을 포함하는 제1 용기, 및 (ii) 산성 완충액을 포함하는 제2 용기, 및 (iii) 규산염 용액과 산성 완충액을 혼합하여 4.0과 8.5 사이의 pH를 갖는 치료적 활성 콜로이드 실리카 조성물을 제조하기 위한 사용설명서를 포함하는 키트.
  48. 제47항에 있어서, 산성 완충액이 염산, 시트르산, 카르복실산, 글리신, 또는 산성 아미노산을 포함하는 것인, 키트.
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