JP2005512505A - 外因性タンパク質をサイトゾルに運搬する方法およびその使用 - Google Patents
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Abstract
Description
本願は、外因性タンパク質をサイトゾルへ運搬する方法、新規な融合タンパク質、および、その使用に向けられる。
多くの注目が、免疫反応を発生させる方法に集中している。外因性の抗原に対する免疫反応の1つのクラスは、抗体生産であり、一般的に体液性免疫と呼ばれている。免疫反応の第二の形態は、抗原提示細胞(APC)による抗原提示に起因する。このタイプの免疫反応は、概して、細胞性免疫(CMI)、またはT細胞応答と呼ばれる。双方のタイプの免疫反応が重要であるにもかかわらず、近年、相当な労力がCMIにおかれている。ヒト免疫不全ウィルス(HIV)により引き起こされるAIDSのような感染症を扱う際、ウイルスとその部分に対する抗体応答は、免疫性を論議するのに十分な程証明されていない。同様に、多くの悪性病変に関連する外因性タンパク質を扱う際も、抗体応答は、十分に証明されていない。従って、推測は、CMI応答を発生させることに重点をおいている。
細胞性免疫反応を検出する現在利用可能な実験分析は、特に様々な臨床条件における大規模なワクチン効率試験に適用する場合に、深刻な短所がある。これは、当分野において、現在の技術を用いてCMIを測定するのに必要な利用可能な器具と技術的サポートが、それらが必要とされる環境においてしばしば最小限であるためである。CTLは、HIV−1感染の制御において重大な役割を有すると考えられており、多くのHTV−1ワクチン候補が、T細胞応答を刺激し、同様に抗体を中和するように設計される(1〜6)。しかしながら、HIV−特異的CTLのようなCMIを検出するための標準的な実験方法は複雑で、時間がかかり、しばしば極めて特殊化された設備に制限される。T細胞応答を測定する改良方法は、全てのT細胞依存性ワクチンまたは免疫療法の開発に重要な効果を持ち得る。この方策は、CMI応答が、病気の予防およびコントロールにおいて重要な役割を有することが知られているようなその他の研究分野に、適用可能であるかもしれない。
本発明は、外因性の抗原をサイトゾルに運搬する方法、新規な融合タンパク質、およびその使用を提供する。
本発明は、本発明の新規な融合ポリペプチドをコードするDNA配列、当該DNA配列によって特徴付けられる組換えDNA分子、当該DNA配列および分子で形質転換された単細胞宿主、ならびに、新規なポリペプチドおよび本発明の望ましい抗原に対するCMI免疫反応を発生させるための、当該配列、分子および宿主を用いる方法を提供する。
さらに好ましい実施形態において、本発明は、インビトロで細胞性免疫反応を測定するキットを提供する。
我々は、ここで、防御抗原(PA)の非存在下で、標的抗原(例えばタンパク質)を二量体タンパク質エキソトキシンの断片を含む輸送因子に結合させることによって、外因性タンパク質をサイトゾルに運搬する方法を見出した。好ましくは、該標的抗原は、輸送因子に融合される。好ましくは、該輸送因子は、アミノ酸1〜288からなる(配列番号2)B.anthracisからの致死因子の防御抗原結合ドメインであるか、または、カルボキシ部分のようなPA結合ドメインを含まないその断片である。例えば、輸送因子に関するアミノ酸LFn1アミノ酸断片の好ましい群の、約80個のカルボキシ主成分アミノ酸の断片は、デフォルト設定におけるBlastで配列番号2に少なくとも80%のホモロジーを示す少なくとも80アミノ酸を含む。さらにより好ましくは、該断片は、それに対して少なくとも90%のホモロジーを有し、さらにより好ましくは、それに対して少なくとも95%のホモロジーを有する。好ましくは、上記断片は、PA結合ドメインを含まない。好ましい輸送因子は、LFn断片またはその部分である。より好ましくは、該輸送因子は、少なくともLFnの60個のカルボキシ主成分アミノ酸を含むが、PA結合ドメインは含まない。1つの好ましい断片は、配列番号2のカルボキシ部分からの約105個またはそれ未満のアミノ酸を含む。
本発明の一実施形態は、発生させるための新規な融合ポリペプチドを含む組成物を提供する。本発明の他の実施形態は、外因性タンパク質をサイトゾルに運搬することによってCMI応答を測定するための分析を含む。好ましい実施形態は、CMI応答を測定するためのキットを提供する。
新規な融合ポリペプチドは、組換えにより製造される、または、化学的に合成される大きい多量体分子の部分でもよい。このような多量体はまた、脂質および炭水化物などのアミノ酸以外の成分に融合または結合したポリペプチドでもよい。
これら新規な融合タンパク質をコードするDNA配列は、容易に製造することができる。例えば、LFnをコードする配列は周知であり、既知の技術によって改変することができ、例えば望ましくない領域(例えば可変ループ)を除き、追加の望ましいコーディング配列(例えばリンカーセグメント)のいずれかを挿入することによって改変することができる。様々な標的抗原をコードする配列も当業界既知である。加えて、様々なアミノ酸残基に関するコドンが知られており、標準的な技術により代わりのコーディング配列を容易に調製することができる。
代表的な医薬組成物は、治療上有効な量の新規な融合タンパク質であり、該融合タンパク質は、免疫反応を誘導することができ、それにより予防の免疫原として作用し、必要に応じて製薬上許容でき、かつ適合可能な担体に含ませる。本明細書で用いられ、以下でより詳細に説明される「製薬上許容でき、かつ適合可能な担体」という用語は、(i)ヒトまたは他の動物への投与に適切な、1またはそれ以上の適合可能な固体または液体、充填剤、希釈剤または封入物質、および/または(ii)分子を標的細胞に運搬することができるシステム、を含む。従って、本発明において「担体」という用語は、有機または無機成分、天然または合成を示し、適用を容易にするために本発明の分子はそれらと結合する。「治療上有効な量」という用語は、治療しようとする特定の状態において望ましい結果が生じる、または望ましい影響を働かせる本発明の医薬組成物の量である。例えば、免疫反応を発生させるのに必要な量は、予防的な保護を提供することができる。一般的に、本組成物が予防の免疫原として用いようとする場合、少なくとも1つの「ブースト」が、第1回目の投与の後、定期的な間隔で投与され得る。同じ成分を含む組成物を調製する際に、様々な濃度を用いることができ、治療しようとする患者の年齢、状態の重症度、治療期間および投与様式におけるバリエーションを提供する。
また、多種多様な異なる新規な融合タンパク質を含むカクテルを提供し、多種多様な異なる新規な融合タンパク質または複数の抗原を含む融合タンパク質のいずれかで追加免疫してもよい(図8、9)。
本発明は、インビトロで細胞性免疫反応を測定するための分析を提供する。CMI応答を検出する現在利用可能な実験分析は、特に様々な臨床条件における大規模なワクチン効率試験に適用する場合に、深刻な短所がある。これは、利用可能な器具と技術的サポートが最小限であるためである。上述したように、HTV−1感染の制御においてCTLが重要な役割を有するという確信において、多くのHIV−1ワクチン候補が、T細胞応答を刺激し、同様に抗体を中和するように設計される(1〜6)。
本発明はまた、CMI応答を検出するためのキットを提供する。1つの好ましいキットは、これらチューブ、ウェル等の中に新規な融合タンパク質を含む。該キットは、好ましくは、インビトロでCMI応答を検出するためのウイルスまたは腫瘍含有試薬を含む。好ましくは、該キットは、血液のような生物学的な検体を採取するための装置を含む。好ましい実施形態において、該キットは、CMI応答を検出するための使用説明書を含む。好ましくは、該キットは、新規な融合タンパク質を凍結乾燥形態でを含む。
実施例1
材料および方法
LFn−HIV融合タンパク質
HIV−HXBからのenv gp120、gag p24をコードするDNA断片をPCRで増幅し、LFn発現プラスミドpET15bLFnにクローニングし、LFnとHIVコーディング配列との間のインフレーム融合を検証するために配列解析する。Nefコーディング配列をHIV−ELLから増幅した。LFnのタンパク質発現ベクターおよびその融合誘導体は、pET15bプラスミド(Novagen;Madison,WI)である。このベクター系の主要な特徴は、誘導性T7プロモーター、タンパク質精製のための内部のHis−Tag、および複数のクローニング部位が挙げられる。組換えLFnは、そのN末端に6個のタンデムヒスチジン残基を有する細胞内の可溶性タンパク質としてE.coliで発現される(14)。10リットルのBioflow 2000 bench top bioreactor(New Brunswick Scientific,NJ)で細菌を培養した。His標識タンパク質を、市販のキットを用いて製造者プロトコールに従って精製した(Novagen)。LFnの断片は、LFnコーディング領域を既知の技術により改変することにより作製できる。
Applied Biosystems社のペプチドシンセサイザー(モデル430A)で合成ペプチドを合成した。用いられた組換えワクシニアウイルスは、コントロールワクシニアベクターとしてNYCHを含む、vAbT141(Gag)、vAbT299(Env)、およびNef(15)であった。ブレフェルジンA、サイトカラシンBおよびクロロキン(Sigma,St Louis,MO)を、細胞培養物に2時間加え、2回洗浄した後、細胞に添加し返した。フロー分析用の抗体をBecton−Dickinson(San Jose,CA)から得た。
凍結保存されたPBMCを、LFN−HIV(30μg/ml)、組換えワクシニアベクター(MOI3〜5)またはペプチド(10μg/ml)と共に、37℃で、5%CO2で、一晩インキュベートした。自己由来B−LCLを、最適なペプチド(10μg/ml)、LFn−HIV(10μg/ml)または組換えワクシニアウイルス(MOI3〜5)と共に、一晩インキュベートし、2回洗浄し、副刺激の抗CD28および抗CD49d(1μg/ml,Becton−Dickinson,San Jose,CA)の存在下でE:T比が10:1でエフェクター細胞に加えた。その後、ブレフェルジンA(10μlのImg/ml)を加え、細胞培養物を37℃で6時間インキュベートし、アイソタイプコントロール(APC,PE,PerCPに対してはIgGI、および、FITCに対してはIgG2b)またはアロフィコシアニン(APC)標識CD3モノクローナル抗体(Mab)、フィコエリトリン(PE)標識抗CDS Mab(Becton Dickinson)の飽和溶液で染色した。暗所で4℃で20分間インキュベートした後、細胞をFACS洗剤で2回洗浄した。100μlの試薬A(Fix and Perm kit,Caltag Laboratories,Austria)を加え、暗所で室温(RT)で20分間インキュベートした後、細胞をFACS洗剤で2回洗浄した。次に、100μlの試薬B(Fix and Perm kit)を加え、細胞をRTで5分間インキュベートした。FITC−IFNガンマおよびペリディニンクロロフィルタンパク質(PerCP)共役CD69Mab(CD69perCP)抗体を加え、暗所で4℃でインキュベートした後、その細胞をFACS洗剤で2回洗浄し、Becton Dickinson社製のFACScaliburフローサイトメーターで、Cell Questソフトウェアを用いて分析した。
自己由来エプスタイン−バーウイルス(EBV)形質転換Bリンパ芽球様細胞系、同様にT1およびT2(HLA−B60)細胞系を抗原提示細胞(APC)として用いた。標的細胞を適切なインデックスペプチドまたはLFn−HIV構築物でパルスするか、または、一晩組換えワクシニアウイルスに感染させた。AC13(HLA B14制限p24[DRFYKTLRA])およびKM(HLV B60制限Nef[KEKGGLEGL])は、GagおよびNef特異的クローン(それぞれ)、および、AC2(HLA B44制限gp120[AENLWVTVY])である。全て、HIV感染個体(該固体のCTL応答はよく特徴付けられている)(Rosenberg,personal communication)から得られ、および、Env特異クローン(SP511)は血清陽性のウガンダ人から生成された(16)。Elispot研究で用いられたPMBCは、セネガルおよびウガンダからのHTV−1感染個体であった(15,16)。LFn−HIVのMHCクラスI制限提示におけるブレフェルジンA、サイトカラシンBまたはクロロキンの効果を調べるために:,APCをタンパク質構築物で標識し、RPMI1640m10%FCSで培養し、各試薬と共に1時間共培養し、続いて洗浄し、標準的なクロム放出分析で試験した。
凍結保存されたPBMCでElispot分析を行った。96−ウェルニトロセルロースプレート(Millititer,Millipore Corp.,Bedford,MA)を、0.5mg/mlのモノクローナル抗体1−D1K(Mabtech,Stockholm,Sweden)で4℃で一晩プレコーティングした。次にそのプレートをリン酸緩衝食塩水(PBS)で6回洗浄し、PBMCを、それぞれ二連のウェルに加え、50,000細胞/ウェルおよび25,000細胞/ウェルにした。そのプレートを、5%CO2で、37℃で一晩インキュベートし、続いてビオチン化モノクローナル抗体の抗IFN−Mab(Mabtech)を0.5mg/mlで加え(100分間)、続いてストレプトアビジン−ALP(Mabtech)を室温で加えた(1時間)。そのプレートをPBSで3回洗浄し、5−ブロモ−4−クロロ−3−インドリルリン酸塩およびニトロブルー(Sigma)を加えて反応を進行させた。15分後にTap waterを加えて反応を止めた。個々のサイトカイン生産細胞が黒いスポットとして検出され、黒いスポットは可視化され、SFC/ウェル(スポット形成コロニー/ウェル)として定量された。CTL頻度(CTLp)を、コントロールウェルから差し引きされ、4つのウェルを平均したスポット数から計算した。最終的なCTLpを106細胞あたりの平均頻度として報告した。SFCがコントロールの少なくとも2倍であれば、応答を陽性とみなした。バックグラウンドSFCは、平均して15/ウェル未満であった。
CD8+CTLクローンを、組換えIL−2の存在下で、抗CDSモノクローナル抗体(12F6)で刺激し、7日以内に活性を試験した。自己由来B−LCLまたはHLA適合APCを含む標的細胞を、HTV−1遺伝子産物を発現する組換えワクシニアウイルス(感染多重度は3〜5)またはLFnタンパク質(5〜30μg/ml)で一晩感染させ、放射性クロム(51Cr)で標識した。二連のウェルで行われた全ての分析に関して、最終容量200μl中、エフェクター:標的細胞の比(E:T)は10:1であった。4時間後に上清液を回収し、特異的な溶解のパーセントを、式:100×[(実験での放出−自発的放出)/(最大放出−自発的な放出)]により決定した。HIV−特異的CTL活性を、バックグラウンド/コントロールを超えて10%と定義した。全ての分析に関して、自発的な放出は最大放出の<30%であった。
LFn−HIVが細胞表面でMHC−I分子と結合するための能力を評価するために、リンパ芽球様B細胞系(B−LCL)をPAの存在または非存在下でLFn−HIVで感作し、いくつかのよく特徴付けられたHIV−特異的CTLクローンを用いて標準的なクロム放出分析で試験した(図3)。我々は、CTLが、PAの存在または非存在下で同等にLFn−HIVで感作した標的細胞を認識することを見出した。溶解レベルは、用量依存性であり、B−LCLを同じHTV抗原を発現する組換えワクシニアウイルスで感染させた場合のポジティブコントロールに匹敵するレベルを達成した。HTV−特異的CTL活性は、標的がLFn−HIVとより長い時間(1時間に対して8時間)インキュベーションされる場合にのみ明らかであり(データは示さず)、これは、表面抗原の出現における遅れと、細胞内プロセシングの必要性とを示す。
次に我々は、これら構築物のCTLによる認識がHLA−I制限であることを実証することによって、LFn−HIVが典型的なMHC−I経路により提示されることを確認した(図4)。2つのNef−(KM)およびGag特異的(AC13)クローン(それぞれHLA B60制限およびB14制限)を、LFnNefまたはLFn−p24を提示するHLA適合および非適合標的で試験した。HLA−適合標的のみが顕著な溶解を示し、LFn−HIVのMHC−I提示が確かめられた。
MHC−I分子上での多くの外因性の抗原の提示は、細胞内区画でのタンパク質分解を伴い(26〜28)、その後、ペプチドはサイトゾルに接近し、そこでMHCクラスI経路に侵入する。LFn介在抗原提示が酸性ベシクルでのタンパク質分解を必要とするかどうかを調べるために、我々は、LFn−HIVへ晒す際に、B−LCLをクロロキンで処理した(図5)。クロロキンは、エンドソーム区画およびリソソーム区画でpHを高め、それにより、活性のために酸性環境が必要なカテプシンによるタンパク質加水分解を抑制することが知られている(29,30)。我々の発見によれば、漏れやすい性質を有するファゴソームが、LFn−HIVのサイトゾルへの侵入に必要ないというこが示される。
MHC−I分子を用いて細胞表面でCTLエピトープを提示するLFn−HIVの能力を実証したことから、我々は、酵素結合スポット(Elispot)分析やフローに基づく細胞内インターフェロン分析などの様々なCMI分析におけるLFn融合タンパク質の適応性の試験を続行した。これら分析は、より簡単でより迅速なT細胞応答の推測を提供し、理論上より大規模な臨床試験に(特にワクチン研究に関する)適している。Elispot分析の主な利点は、HIV−特異的CTL応答が効果的に評価でき、大勢のヒトでも効率的に評価できることである(31)。目下、HIV抗原を発現する組換えワクシニアウイルスまたはオーバーラッピング合成ペプチドなどの様々な抗原刺激がこの分析で用いられている。凍結保存されたPBMC、同様にいくつかのHTV−1陽性個体からのCD8+CTLクローンを、Elispot分析で、LFn−gp120に対してLFn−p24、LFnNefを用いて、同じ抗原を発現する組換えワクシニアウイルスと並行して試験した。比較のスポット形成コロニーがLFn−HIVに関して観察され、いくつかの例において、明らかにバックグラウンドスポットが組換えワクシニアウイルスの場合より少なかった(図6)。
PA非存在下のLPn融合タンパク質はまた、MHCが制限された方法で、CTL標的細胞を感作することができる。このLFn融合タンパク質のサイトゾル運搬は、抗原提示細胞内部の細胞内の抗原プロセシングに関連する機能的輸送に依存する(Cao H,Agrawal D,Kushner N,Touzjian N,Essex M、および、Lu Y.J.Infect Dis.185:244−251(2002))。目下我々は、LFnに融合した緑色蛍光タンパク質(GFP)がPA非存在下で細胞に侵入できることを実証し、我々はさらに、この、外因性GFPのPA非依存性LFn運搬は、細胞性プロテオソームに関連すると考えられることを示し、これはこれまでの観察と一致する。
pEGFP−C1(Clontech)からのGFPオープンリーディングフレームをLFn発現ベクターに挿入することによって、LFn−GFP融合タンパク質を構築した(過去の研究で説明される)(Lu,Y.,R.et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA97:8027−32(2000))。
CHO細胞をコラーゲン処理したチャンバースライドで80%の群集になるように培養し、続いて精製LFn−GFPと共に1または2時間インキュベートし、続いてPBS、および、プロテアーゼを添加したPBSでよく洗浄し、膜結合タンパク質を除去した。次に、細胞を抗トランスフェリン抗体で染色し、パラホルムアルデヒドで固定した。そのスライドを、共焦点顕微鏡法でそれぞれ緑色(GFP)および赤色(抗トランスフェリン)に関して試験した。第三のイメージは、各フィールドに対して、過剰露出した緑色のイメージにより、同じ細胞の赤色のイメージと共に示される。その結果として、黄色のスポットは、GFPがトランスフェリンタンパク質と同じスポットにあることを示し、従って細胞内部のGFPの位置の参照を提供することを示す。図10で示したように、相当数の緑色のスポットが、LFn−GFPで標的化された細胞中で1時間で可視化され、これはLPn−GFPが実際に細胞に侵入できることを示す。まったく同じ実験条件で、GFP処理細胞において、緑色のスポットはほとんど示されなかった(図11)。
図10〜11で上述したのと同一の実験方法を用いて、我々は、抗トランスフェリン抗体を、それぞれ抗リソソーム抗体(図12)、抗エンドソーム抗体(図13)、抗ゴルジ抗体(図14)、および抗プロテオソーム抗体(図15)で置き換えた。これら様々なイメージを比較すると、最も黄色のスポットを含む過剰に露出したイメージは、図15で示されるイメージであり、それにおいて、緑色のスポットは、細胞性プロテオソームを示す赤色のスポットと顕著にオーバーラップした細胞内のLFn-GFPを示す。
我々は、さらに、PAの存在が、図10〜15に関して用いられた実験条件でLFn−GFP摂取を増強するかどうかを試験した。図16に示すように、PA添加は、PA非存在下でのスポットの数と比較して、細胞内部の緑色のスポットの数を増加させなかった。その上、PAの存在は、黄色のスポットの量を減少させたようにみえる。明らかに、これらの条件下で、これら黄色のスポットはそれでもPA非依存性のLFn−GFP侵入を示している。
LFnのN末端の半分の欠失、およびLFn免疫化におけるミョウバンのアジュバント効果
追加の動物免疫化データは、LFnのN末端の半分(PA結合ドメインを含む)は、抗原運搬に否定的な影響を与えることなく欠失させることができることを示す。まったく意外にも、我々は、ミョウバン添加により、LFn融合タンパク質によるCTL誘導を顕著に増強させ得ることを見出した。
マウスで、LFn−p24がPA非存在下でCTLを引き出すことができることを確かめるために、我々は、PAに結合するその能力を失わせるためにLFnのN末端の半分(1〜149)を欠失させた変異LFn融合タンパク質(MLFn−p24)を構築した。我々は、PA依存性の膜移動を試験するために特別に設計された実験方法を用いてこれを確認した。簡単に言えば、トリプシンでニックを入れたPAをCHO−K1細胞と共に4℃で2時間インキュベートした。次にその細胞を冷PBSで洗浄し、35S標識LFn−NGまたはLFn−ENVで4℃で2時間インキュベートした。その細胞をよく洗浄し、MES/グルコナート緩衝液(pH4.8)に37℃で2分間晒した。次にプロナーゼEまたは緩衝液を加えて、吸収されていないLFn融合タンパク質を結合させた表面を消化した。次に、その細胞を再び洗浄し、溶解し、計数した。PAで移動したタンパク質の割合を以下の式に従って計算した。割合=100×(PA存在下でのカウントおよびプロナーゼ処理細胞−PA非存在下でのカウントおよびプロナーゼ処理細胞)/(PAおよびmock処理細胞存在下でのカウント−PAおよびmock処理細胞非存在下でのカウント)。この特定の分析において、PAは、72%もの膜結合型LFnを細胞に移動させ、一方でPAにより移動したMLFnの量は検出されなかった。
Claims (33)
- 標的抗原を細胞のサイトゾルに運搬する方法であって、標的抗原を輸送因子に結合させることを含み、輸送因子は、細胞に対して毒性ではない二量体タンパク質エキソトキシンの断片を含み、防御抗原(PA)は用いられない、前記方法。
- 輸送因子が、配列番号2(LFn)またはその部分を含む、請求項1に記載の方法。
- 輸送因子が、配列番号2のPAに結合する部分を含まない断片である、請求項2に記載の方法。
- 輸送因子が、LFnの80個のカルボキシ主成分アミノ酸である、請求項3に記載の方法。
- 輸送因子が、配列番号2のアミノ酸1〜149を含まない、請求項3に記載の方法。
- 輸送因子が、配列番号3によりコードされる、請求項3に記載の方法。
- 輸送因子が、配列番号2と少なくとも80%のホモロジーを有する少なくとも80アミノ酸の断片である、請求項1に記載の方法。
- 輸送因子が、350個またはそれ未満のアミノ酸の断片である、請求項1に記載の方法。
- 輸送因子が、300個またはそれ未満のアミノ酸である、請求項1に記載の方法。
- 輸送因子が、250個またはそれ未満のアミノ酸である、請求項1に記載の方法。
- 輸送因子が、105個またはそれ未満のアミノ酸である、請求項1に記載の方法。
- 輸送因子が、配列番号2の、150〜253個またはそれ未満のアミノ酸である、請求項11に記載の方法。
- 標的抗原が、ウイルス性抗原、細菌の抗原、および腫瘍抗原からなる群より選択される、請求項1に記載の方法。
- ウイルス性抗原がHIV抗原である、請求項13に記載の方法。
- 輸送因子が、融合ポリペプチドの発現により標的抗原に結合し、単一の核酸コーディング配列により輸送因子と標的抗原との双方がコードされる、請求項1に記載の方法。
- 輸送因子が、化学結合により標的抗原に結合する、請求項1に記載の方法。
- 輸送因子が、細胞に対して毒性ではない二量体タンパク質エキソトキシンの断片を含み、標的抗原を細胞のサイトゾルに運搬するように機能する、標的抗原と輸送因子とを含む単離されたポリペプチド。
- 輸送因子が、対応する防御抗原(PA)に結合するドメインを含まない、請求項17に記載の単離されたポリペプチド。
- 請求項18に記載のポリペプチドをコードする単離されたDNA。
- ペプチドの発現のための少なくとも1つのプロモーター配列を含む5’−フランキング領域をさらに含む、請求項16に記載の単離されたDNA。
- 請求項20に記載の単離されたDNAを含むベクター。
- 標的抗原と輸送因子とを含む単離されたポリペプチドの免疫原性の量を含む医薬組成物であって、輸送因子は、細胞に対して毒性ではない二量体タンパク質エキソトキシンの断片を含み、標的抗原を細胞のサイトゾルに運搬するように機能し、対応する防御抗原が存在しない、前記医薬組成物。
- アジュバントをさらに含む、請求項22に記載の医薬組成物。
- アジュバントがミョウバンである、請求項23に記載の医薬組成物。
- 哺乳動物に請求項22に記載の医薬組成物を投与することを含む、哺乳動物において細胞性免疫反応を発生させる方法。
- 医薬組成物が、皮下または筋肉内投与により投与される、請求項25に記載の方法。
- 医薬組成物が、口での摂取により投与される、請求項25に記載の方法。
- 請求項18に記載の単離された核酸を細胞中で発現させることを含む、タンパク質を生産する方法。
- 細胞が、細菌の細胞、昆虫細胞、および哺乳動物細胞からなる群より選択される、請求項28に記載の方法。
- 細胞が細菌の細胞である、請求項29に記載の方法。
- 細胞性免疫反応分析において請求項17に記載のポリペプチドを用いることを含む、細胞性免疫反応を測定する方法。
- 細胞性免疫反応分析が、Elispot分析、および、フローに基づく細胞内のサイトカイン分析からなる群より選択される、請求項31に記載の方法。
- 請求項17に記載の新規なポリペプチドを含む、インビトロでの細胞性免疫反応を測定するキット。
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