JP2005504549A5

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Publication number: JP2005504549A5
Application number: JP2003534578A
Authority: JP
Filing date: 2002-10-04
Publication date: 2006-01-05
Anticipated expiration: 2022-10-04

Description

表１．変異を水素結合形成能または疎水性のいずれかを失っている残基に対して引き起こした。ＳＴＩ５７１がＭ３１８およびＤ３８１のペプチドバックボーンと水素結合するものと予測した。それゆえ、該残基の変異は行われなかった。多くの変異がキナーゼ不活性型Ａｂｌを生じた。Ｌ３７０ＧはＳＴＩ５７１に対する感受性を変化させなかった。Ｔ３１５Ｖの変異は野生型Ａｂｌキナーゼと比べて１０倍、ＳＴＩ５７１に対する感受性が増加した。

別の研究では、オーストラリアおよびニュージーランドの１２のセンターのＣＭＬ患者を変異解析について試験した。試料をＢＣＲ−ＡＢＬレベルの分子評価のためまず集め、保存ＲＮＡが測定可能なレベルのＢＣＲ−ＡＢＬを含有し、かつ対照遺伝子レベルが未分解ＲＮＡを示したときのみ変異解析を続けた。患者は、６ヶ月またはそれ以上のイマチニブ治療を受けたか、または抵抗性となり６ヶ月前に治療を終えたかのいずれかであった（ｎ＝２）。１５６患者由来の試料が利用可能であったが、１２の試料のうち４つが低レベルのＢＣＲ−ＡＢＬのため、そして８つがＲＮＡの質が十分でないため試験できなかった。残る１４４人の患者をイマチニブの開始時の異常段階によりグループ化した；ＡＰが４０人、診断から１２ヶ月以上であるとして定義された後期ＣＰの６４人、および診断から１２ヶ月未満であるとして定義された初期ＣＰの４０人。１６人の初期ＣＰ患者がインターフェロン治療に既に失敗し、そして２４人がイマチニブ治療前、ヒドロキシ尿素を投与されているだけであった。イマチニブの効果を、フィラデルフィア染色体陽性細胞の数が３５％未満ならメジャー細胞遺伝学的効果（ＭＣＲ）、または３５〜１００％ならＭＣＲなしのいずれかについて６ヶ月時での細胞遺伝学的解析により分類した。イマチニブ抵抗性を、少なくとも３ヶ月間続いた血液学的完全寛解（ＣＨＲ）の喪失、加速期または急性期への変化を伴うＣＨＲの喪失、または確立したＣＨＲまたは細胞遺伝学的完全寛解（フィラデルフィア染色体陰性として定義されたＣＣＲ）の喪失として定義した。３４６のＲＮＡ試料を本明細書において既に記載した様に解析した。利用可能なＲＮＡにより、患者を１〜１５の異なる時間ポイント間で変異について試験した。それゆえ、イマチニブ治療の投与期間の中央値を、最後の時間ポイントの解析から決定した。ＡＰ患者のイマチニブ投与の中央値は９ヶ月（範囲４〜２４）であり、後期ＣＰ患者の中央値は１０ヶ月（範囲６〜２４）であり、そして初期ＣＰ患者の中央値は１４ヶ月（範囲５〜２４）であった。

ＲＴ−ＰＣＲ−ＲＦＬＰアッセイ
ＲＮＡ抽出。全ＲＮＡを、製造元の指示によりＴＲｉｚｏｌ試薬（Life Technologies、ＵＫ）で凍結した一定分量の１０７人の末梢血リンパ球から抽出した。ＲＮＡペレットを１０μｌのＲＮＡｓｅフリーの水に再溶解し、そして量を紫外線蛍光分析法により評価した。

ＲＦＬＰ解析。ＰＣＲ産物の１／５を５Ｕの制限酵素ＤｄｅＩ（Roche、Switzerland）により切断し、２．５％のエチジウムブロマイド染色アガロースゲルで電気泳動した。

ＳＴＩ５７１に対して抵抗性を有する加速期の３人のＣＭＬ患者では、ＤｄｅＩ切断パターンは２つの集団のＡｂｌ転写物を示した。野生型配列は、それぞれ１７１ｂｐおよび３６ｂｐの２つのフラグメントにより特徴付けられ、そして変異型配列は２０７ｂｐの未切断フラグメントにより特徴付けられた。バンド輝度の差は、１人の患者について小集団の変異型転写物、そして２人以上の患者について大集団の変異型転写物を示した。このＲＴ−ＰＣＲ−ＲＦＬＰアッセイにより、２０７ｂｐの未切断フラグメントのみを該患者で検出したので、診断時にＴｈｒ３１５Ｉｌｅ変異型転写物を検出できなかった。解析を、ＳＴＩ５７１で３ヶ月治療後の細胞遺伝学的完全寛解の１６人の患者でも行った。該患者のうち全てで、Ｔｈｒ３１５Ｉｌｅ変異が存在しなかった。

ＤＮＡおよびＲＮＡの直接的配列解析
２４人のＳＴＩ５７１抵抗性患者において、ＡｂｌキナーゼドメインおよびＡＴＰ−ループ領域を、抵抗性時およびＳＴＩ５７１治療前のＰＣＲＤＮＡおよびｃＤＮＡ産物（それぞれ、２０７ｂｐのＦ４Ｒ４−ＰＣＲフラグメントおよび４６２ｂｐのＦ３Ｒ２−ＰＣＲフラグメント）から直接的に配列決定した。配列決定データにより、既にＲＴ−ＰＣＲ−ＲＦＬＰが検出した３人中２人の患者のＴｈｒ３１５Ｉｌｅ変異を確認したが、より低レベルの変異型転写物を有する残りの患者では失敗した。それぞれの患者のヘテロ接合体の割合を、ＲＴ−ＰＣＲ−ＲＦＬＰパターンにより、クロマトグラフィー１次配列データの特異的Ｃシグナル幅とＴシグナル幅との比較により表す。

Claims

天然のヒトＡｂｌキナーゼドメインのアミノ酸配列（ここで、Ｍｅｔ２４４、Ｌｅｕ２４８、Ｇｌｙ２５０、Ｇｌｕ２５２、Ｔｙｒ２５３、Ｖａｌ２５６、Ｇｌｕ２５８、Ｐｈｅ３１１、Ｉｌｅ３１３、Ｐｈｅ３１７、Ｍｅｔ３１８、Ｍｅｔ３５１、Ｇｌｕ３５５、Ｐｈｅ３５９、Ｉｌｅ３６０、Ｈｉｓ３６１、Ｌｅｕ３７０、Ａｓｐ３８１、Ｐｈｅ３８２、Ｈｉｓ３９６、Ｓｅｒ４１７、Ｇｌｕ４５９およびＰｈｅ４８６から選択される少なくとも１つのアミノ酸が別のアミノ酸により置換され、該機能的キナーゼドメインがＮ−［４−メチル−３−（４−ピリジン−３−イル−ピリミジン−２−イルアミノ）−フェニル］−４−（４−メチル−ピペラジン−１−イルメチル）−ベンズアミドまたはその塩によるそのチロシンキナーゼ活性の阻害に対して抵抗性である）を含む機能的キナーゼドメインを含む単離ポリペプチド。
天然のヒトＡｂｌキナーゼドメインのアミノ酸配列において、Ｍｅｔ２４４、Ｌｅｕ２４８、Ｇｌｙ２５０、Ｇｌｕ２５２、Ｔｙｒ２５３、Ｖａｌ２５６、Ｇｌｕ２５８、Ｐｈｅ３１１、Ｉｌｅ３１３、Ｐｈｅ３１７、Ｍｅｔ３１８、Ｇｌｕ３５５、Ｐｈｅ３５９、Ｉｌｅ３６０、Ｈｉｓ３６１、Ｌｅｕ３７０、Ａｓｐ３８１、Ｐｈｅ３８２、Ｈｉｓ３９６、Ｓｅｒ４１７、Ｇｌｕ４５９およびＰｈｅ４８６から選択される少なくとも１つのアミノ酸が別のアミノ酸により置換されている、請求項１に記載の単離ポリペプチド。
天然のヒトＡｂｌキナーゼドメインのアミノ酸配列において、Ｍｅｔ２４４、Ｌｅｕ２４８、Ｇｌｙ２５０、Ｇｌｕ２５２、Ｔｙｒ２５３、Ｇｌｕ２５８、Ｐｈｅ３１１、Ｐｈｅ３１７、Ｍｅｔ３５１、Ｇｌｕ３５５、Ｐｈｅ３５９、Ｈｉｓ３９６、Ｓｅｒ４１７、Ｇｌｕ４５９およびＰｈｅ４８６から選択される少なくとも１つのアミノ酸が別のアミノ酸により置換されている、請求項１に記載の単離ポリペプチド。
天然のヒトＡｂｌキナーゼドメインのアミノ酸配列において、Ｍｅｔ２４４、Ｌｅｕ２４８、Ｇｌｙ２５０、Ｇｌｕ２５２、Ｔｙｒ２５３、Ｇｌｕ２５８、Ｐｈｅ３１１、Ｐｈｅ３１７、Ｇｌｕ３５５、Ｐｈｅ３５９、Ｈｉｓ３９６、Ｓｅｒ４１７、Ｇｌｕ４５９およびＰｈｅ４８６から選択される少なくとも１つのアミノ酸が別のアミノ酸により置換されている、請求項３に記載の単離ポリペプチド。
天然のヒトＡｂｌキナーゼドメインのアミノ酸配列において、Ｇｌｙ２５０、Ｔｙｒ２５３、Ｇｌｕ２５８、Ｐｈｅ３１７およびＨｉｓ３９６から選択される少なくとも１つのアミノ酸が別のアミノ酸により置換されている、請求項４に記載の単離ポリペプチド。
天然のヒトＡｂｌキナーゼドメインのアミノ酸配列において、単一アミノ酸が別のアミノ酸により置換されている、請求項１〜５のいずれか１つに記載の単離ポリペプチド。
天然のヒトＡｂｌキナーゼドメインのアミノ酸配列がＭｅｔ２４４Ｖａｌ、Ｌｅｕ２４８Ｖａｌ、Ｇｌｙ２５０Ｇｌｕ、Ｇｌｙ２５０Ａｌａ、Ｇｌｕ２５２Ｈｉｓ、Ｔｙｒ２５３Ｈｉｓ、Ｔｙｒ２５３Ｐｈｅ、Ｇｌｕ２５８Ｇｌｙ、Ｐｈｅ３１１Ｌｅｕ、Ｐｈｅ３１７Ｌｅｕ、Ｍｅｔ３５１Ｔｈｒ、Ｇｌｕ３５５Ｇｌｙ、Ｐｈｅ３５９Ｖａｌ、Ｈｉｓ３９６Ｐｒｏ、Ｈｉｓ３９６Ａｒｇ、Ｓｅｒ４１７Ｔｙｒ、Ｇｌｕ４５９ＬｙｓおよびＰｈｅ４８６Ｓｅｒから選択される少なくとも１つのアミノ酸変異を含有する、請求項３に記載の単離ポリペプチド。
天然のヒトＡｂｌキナーゼドメインのアミノ酸配列がＭｅｔ２４４Ｖａｌ、Ｌｅｕ２４８Ｖａｌ、Ｇｌｙ２５０Ｇｌｕ、Ｇｌｙ２５０Ａｌａ、Ｇｌｕ２５２Ｈｉｓ、Ｔｙｒ２５３Ｈｉｓ、Ｔｙｒ２５３Ｐｈｅ、Ｇｌｕ２５８Ｇｌｙ、Ｐｈｅ３１１Ｌｅｕ、Ｐｈｅ３１７Ｌｅｕ、Ｇｌｕ３５５Ｇｌｙ、Ｐｈｅ３５９Ｖａｌ、Ｈｉｓ３９６Ｐｒｏ、Ｈｉｓ３９６Ａｒｇ、Ｓｅｒ４１７Ｔｙｒ、Ｇｌｕ４５９ＬｙｓおよびＰｈｅ４８６Ｓｅｒから選択される少なくとも１つのアミノ酸変異を含有する、請求項７に記載の単離ポリペプチド。
天然のヒトＡｂｌキナーゼドメインのアミノ酸配列がＧｌｙ２５０Ｇｌｕ、Ｔｙｒ２５３Ｈｉｓ、Ｔｙｒ２５３Ｐｈｅ、Ｇｌｕ２５８Ｇｌｙ、Ｐｈｅ３１７ＬｅｕおよびＨｉｓ３９６Ｐｒｏから選択される少なくとも１つのアミノ酸変異を含有する、請求項８に記載の単離ポリペプチド。
天然のヒトＡｂｌキナーゼドメインのアミノ酸配列がアミノ酸変異Ｍｅｔ３５１Ｔｈｒを含有する、請求項７に記載の単離ポリペプチド。
天然のヒトＡｂｌキナーゼドメインのアミノ酸配列がアミノ酸変異Ｍｅｔ２４４Ｖａｌを含有する、請求項８に記載の単離ポリペプチド。
天然のヒトＡｂｌキナーゼドメインのアミノ酸配列がアミノ酸変異Ｇｌｙ２５０Ｇｌｕを含有する、請求項９に記載の単離ポリペプチド。
天然のヒトＡｂｌキナーゼドメインのアミノ酸配列がアミノ酸変異Ｔｙｒ２５３Ｈｉｓを含有する、請求項９に記載の単離ポリペプチド。
天然のヒトＡｂｌキナーゼドメインのアミノ酸配列またはその本質的に類似の配列がアミノ酸変異Ｔｙｒ２５３Ｐｈｅを含有する、請求項９に記載の単離ポリペプチド。
天然のヒトＡｂｌキナーゼドメインのアミノ酸配列またはその本質的に類似の配列がアミノ酸変異Ｇｌｕ２５８Ｇｌｙを含有する、請求項９に記載の単離ポリペプチド。
天然のヒトＡｂｌキナーゼドメインのアミノ酸配列またはその本質的に類似の配列がアミノ酸変異Ｐｈｅ３１１Ｌｅｕを含有する、請求項８に記載の単離ポリペプチド。
天然のヒトＡｂｌキナーゼドメインのアミノ酸配列またはその本質的に類似の配列がアミノ酸変異Ｐｈｅ３１７Ｌｅｕを含有する、請求項９に記載の単離ポリペプチド。
天然のヒトＡｂｌキナーゼドメインのアミノ酸配列またはその本質的に類似の配列がアミノ酸変異Ｈｉｓ３９６Ｐｒｏを含有する、請求項９に記載の単離ポリペプチド。
天然のヒトＡｂｌキナーゼドメインのアミノ酸配列またはその本質的に類似の配列がアミノ酸変異Ｐｈｅ４８６Ｓｅｒを含有する、請求項８に記載の単離ポリペプチド。
天然のヒトＡｂｌキナーゼドメインのアミノ酸配列またはその本質的に類似の配列がアミノ酸変異Ｌｅｕ２４８Ｖａｌを含有する、請求項８に記載の単離ポリペプチド。
天然のヒトＡｂｌキナーゼドメインのアミノ酸配列またはその本質的に類似の配列がアミノ酸変異Ｇｌｙ２５０Ａｌａを含有する、請求項８に記載の単離ポリペプチド。
天然のヒトＡｂｌキナーゼドメインのアミノ酸配列またはその本質的に類似の配列がアミノ酸変異Ｇｌｕ２５２Ｈｉｓを含有する、請求項８に記載の単離ポリペプチド。
天然のヒトＡｂｌキナーゼドメインのアミノ酸配列またはその本質的に類似の配列がアミノ酸変異Ｇｌｕ３５５Ｇｌｙを含有する、請求項８に記載の単離ポリペプチド。
天然のヒトＡｂｌキナーゼドメインのアミノ酸配列またはその本質的に類似の配列がアミノ酸変異Ｐｈｅ３５９Ｖａｌを含有する、請求項８に記載の単離ポリペプチド。
天然のヒトＡｂｌキナーゼドメインのアミノ酸配列またはその本質的に類似の配列がアミノ酸変異Ｈｉｓ３９６Ａｒｇを含有する、請求項８に記載の単離ポリペプチド。
天然のヒトＡｂｌキナーゼドメインのアミノ酸配列またはその本質的に類似の配列がアミノ酸変異Ｓｅｒ４１７Ｔｙｒを含有する、請求項８に記載の単離ポリペプチド。
天然のヒトＡｂｌキナーゼドメインのアミノ酸配列またはその本質的に類似の配列がアミノ酸変異Ｇｌｕ４５９Ｌｙｓを含有する、請求項８に記載の単離ポリペプチド。
天然のヒトＡｂｌキナーゼドメインのアミノ酸配列がＭｅｔ２４４Ｖａｌ、Ｌｅｕ２４８Ｖａｌ、Ｇｌｙ２５０Ｇｌｕ、Ｇｌｙ２５０Ａｌａ、Ｇｌｕ２５２Ｈｉｓ、Ｔｙｒ２５３Ｈｉｓ、Ｔｙｒ２５３Ｐｈｅ、Ｇｌｕ２５８Ｇｌｙ、Ｐｈｅ３１１Ｌｅｕ、Ｐｈｅ３１７Ｌｅｕ、Ｍｅｔ３５１Ｔｈｒ、Ｇｌｕ３５５Ｇｌｙ、Ｐｈｅ３５９Ｖａｌ、Ｈｉｓ３９６Ｐｒｏ、Ｈｉｓ３９６Ａｒｇ、Ｓｅｒ４１７Ｔｙｒ、Ｇｌｕ４５９ＬｙｓおよびＰｈｅ４８６Ｓｅｒから選択される少なくとも１つの追加のアミノ酸変異を含有し得る、請求項１０〜２７のいずれか１つに記載の単離ポリペプチド。
天然のヒトＡｂｌキナーゼドメインのアミノ酸配列が配列番号：２のアミノ酸２２９〜５００からなる、請求項１〜２８のいずれか１つに記載の単離ポリペプチド。
Ｂｃｒ−Ａｂｌチロシンキナーゼである、請求項１〜２９のいずれか１つに記載の単離ポリペプチド。
該ポリペプチドのチロシンキナーゼ活性を阻害する化合物をスクリーンするための、請求項１〜３０のいずれか１つに記載のポリペプチドの使用。
請求項１〜３０のいずれか１つに記載のポリペプチドをコード化するヌクレオチド配列を含む単離核酸分子。
該ポリペプチドのチロシンキナーゼ活性を阻害する化合物のスクリーニングで使用するための、請求項１〜３０のいずれか１つに記載のポリペプチドの産生における請求項３２に記載の核酸分子の使用。
請求項３２に記載の核酸分子を含む組み換えベクター。
組み換え発現ベクターである請求項３４に記載の組み換えベクター。
請求項３４または３５に記載の組み換えベクターを含む宿主細胞。