JP2005503828A - 増幅可能な遺伝子を用いる遺伝学的スクリーニングの方法 - Google Patents

増幅可能な遺伝子を用いる遺伝学的スクリーニングの方法 Download PDF

Info

Publication number
JP2005503828A
JP2005503828A JP2003532677A JP2003532677A JP2005503828A JP 2005503828 A JP2005503828 A JP 2005503828A JP 2003532677 A JP2003532677 A JP 2003532677A JP 2003532677 A JP2003532677 A JP 2003532677A JP 2005503828 A JP2005503828 A JP 2005503828A
Authority
JP
Japan
Prior art keywords
nucleic acid
cell
cells
reporter
amplifiable
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
JP2003532677A
Other languages
English (en)
Inventor
サンストロム、ノエレ−アン
バイリー、チャールズ、ジェフリー
Original Assignee
ユニサーチ リミテッド
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by ユニサーチ リミテッド filed Critical ユニサーチ リミテッド
Publication of JP2005503828A publication Critical patent/JP2005503828A/ja
Pending legal-status Critical Current

Links

Images

Classifications

    • CCHEMISTRY; METALLURGY
    • C12BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12NMICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/85Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
    • CCHEMISTRY; METALLURGY
    • C12BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12NMICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/67General methods for enhancing the expression
    • C12N15/69Increasing the copy number of the vector
    • CCHEMISTRY; METALLURGY
    • C12BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12NMICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2830/00Vector systems having a special element relevant for transcription
    • CCHEMISTRY; METALLURGY
    • C12BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12NMICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2830/00Vector systems having a special element relevant for transcription
    • C12N2830/80Vector systems having a special element relevant for transcription from vertebrates
    • C12N2830/85Vector systems having a special element relevant for transcription from vertebrates mammalian

Landscapes

  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)

Abstract

本発明は、遺伝学的スクリーニング方法および関連細胞と遺伝子構成物に関する。特に、本発明は、レポータ核酸に結合された増幅可能な核酸を用いて当該核酸のコピー数における変化、一般的には増幅について細胞をスクリーニングする方法、当該核酸由来の当該ポリペプチドの発現増大について細胞をスクリーニングする方法、および関連細胞と遺伝子構成物に関する。この方法は、当該ポリペプチドまたはタンパク質を発現する組換え細胞の高処理スクリーニング、高レベルでの当該ポリペプチドまたはタンパク質を発現する細胞のスクリーニングを可能にする。

Description

【技術分野】
【0001】
本発明は、遺伝学的スクリーニング法および関連細胞と遺伝子構成物に関する。特に、本発明は、レポータ核酸に結合された増幅可能な核酸を用いて当該核酸のコピー数における変化、一般的には増幅について細胞をスクリーニングする方法、当該核酸由来の当該ポリペプチドの発現増大について細胞をスクリーニングする方法、および関連細胞と遺伝子構成物に関する。この方法は、当該ポリペプチドまたはタンパク質を発現する組換え細胞の高処理スクリーニング、特に、高レベルでの当該ポリペプチドまたはタンパク質を発現する細胞のスクリーニングを可能にする。
【背景技術】
【0002】
明細書の全体を通じて従来技術の考察は、かかる従来技術が広く周知であり、または分野における一般的な知識の一部を形成する許可として決して考えるべきではない。
【0003】
組換えタンパク質を生産するための安定したクローンを得るには、所望の当該遺伝子および主要な遺伝子マーカをコード化する発現ベクターによる細胞のトランスフェクションが必要である。発現ベクターDNAを吸収した細胞は、適切な選択培地中で生き延びる。通常、安定したトランスフェクタントの選択のために、抗生物質耐性遺伝子などの選択可能なマーカが当該標的遺伝子とともにトランスフェクションされる。
【0004】
一般的に用いられる多くの哺乳動物発現系は、安定してトランスフェクションされたチャイニーズハムスター卵巣(CHO)細胞に基づき、同系におけるトランスフェクション効率は、ベクターDNAを吸収した細胞の10〜60%である。しかし、異なる領域の染色体がトランスフェクションされた遺伝子の発現を変化させることによって位置効果によるゲノム内へ外来DNAを安定して組込むクローンの中には、組換え遺伝子発現における幅広いバリエーションが存在する。しかし、無作為の高い生産者の調査は、免疫検出を必要とする従来のスクリーニング法を用いることにより、時間がかかり、かつ労働集約型である。何百、何千ものトランスフェクションされたクローンが通常は組換えタンパク質生産における不規則変動についてスクリーニングされる。
【0005】
高生産性クローンのスクリーニングに加えて、増幅法を利用して所望遺伝子の高レベルの発現を達成することができる。これは、同時発現マーカ遺伝子の増幅の選択によって達成されうる。CHO細胞を使用する広く用いられている2つの増幅系は、ジヒドロ葉酸還元酵素(DHFR)(1)遺伝子およびグルタミンシンテターゼ(GS)(2)遺伝子である。上昇濃度のメトトレキサート(MTX)、DHFR機能またはメチオニンスルホキシミン(MSX)の阻害物、GSの阻害物の存在下の選択的環化により、統合化DNAの増幅および所望遺伝子生成物の発現増大が得られる。
【0006】
CHO−DHFR発現系は、変異CHO細胞株の使用を必要とし、ジヒドロ葉酸還元酵素の酵素活性を欠き(3)、グリシン、ヒポキサンチン、およびチミジン(GHT)の存在下に増殖しなければならない。GS発現系は、これらの細胞における内在性GS活性によりCHO細胞において有効ではない(4)。また、達成しうる増幅の量に対する制限があり、MTXおよびMSX耐性クローンは得られるが、さらに組換えタンパク質生産性の一層の増大は得られないように思われる(5、6)。
【0007】
本発明者らは、増幅可能な遺伝子、メタロチオネイン(MT)の使用を調査した。CHO細胞はMT遺伝子を含有するが、その遺伝子はDNAメチル化の結果として沈黙化するためMT活性を欠く(7)(8)(9)。MT遺伝子を有する発現ベクターは、外来遺伝子の同時増幅のために用いることができる(10)。MT遺伝子含有発現ベクターを使用するCHO細胞における外来遺伝子発現の選択および増幅についての方法が記載されている(11、12)。さらに、MT遺伝子は、発現すると金属に対する耐性を与えるという事実によりレポーターまたはマーカ遺伝子としても作用しうる。
【0008】
しかし、MT遺伝子を利用する発現系は、一部の細胞において、内在性MT遺伝子が選択圧力、すなわち金属イオンの添加に応答して増幅するという不利点を有する。増幅した内在性MT遺伝子はもはや沈黙せず、この遺伝子の発現は、外来性MT構成物(当該遺伝子を保有)によって形質転換されている細胞の「誤った」選択をもたらす。結果として、偽陽性が一般的となり、スクリーニングは労働集約的となる。
【0009】
レポータ遺伝子は公知である。例えば、緑色蛍光タンパク質(GFP)が、遺伝子発現、および誘導遺伝子生成物を発現する細胞の選択をモニタリングするために使用されている(13、14)。さらに、異なる波長で蛍光を発し、マーカまたはレポータ遺伝子としても使用しうるGFPの誘導体が開発されている。レポータペプチドが当該タンパク質に融合する発現系も公知である。しかし、これらの系は、ペプチドが融合タンパク質から分割されなければならず、さらに、例えば、当該タンパク質の畳込みに干渉し、または、タンパク質に付着されたままである場合は、その基質またはリガンドへのタンパク質の結合を阻害しうるといういくつかの不利点を有する。
【非特許文献1】
アルト(Alt),F.W.;ケレムス(Kellems),J.R.;ベルチノ(Bertino),J.R.;シムケ(Schimke),R.T.著, 培養マウス細胞のメトトレキサート−耐性変形におけるジヒドロ葉酸還元酵素遺伝子の選択的増大(Selective multiplication of dihydrofolate reductase genes in methotrexate-resistant variants of cultured murine cells.), J Biol Chem, 1978年(253), pp.1357〜1370
【非特許文献2】
コケット(Cockett),M.I.;ベビントン(Bebbington),C.R.;ヤラントン(Yarranton),G.T.著, グルタミンシンテターゼ遺伝子増幅を用いるチャイニーズハムスター卵巣細胞におけるメタロプロテイナーゼの組織阻害物の高レベル発現(High level expression of tissue inhibitor of metalloproteinases in Chinese hamster ovary cells using glutamine synthetase gene amplification.), Bio/Technology, 1990年(8), pp.662〜667
【非特許文献3】
ウアラウブ(Urlaub),G.;チェイスン(Chasin),L.A.著, ジヒドロ葉酸還元酵素活性における変異障害のチャイニーズハムスター細胞の分離(Isolation of Chinese hamster cell mutants deficient in dihydrofolate reductase activity.), Proc Natl Acad Sci USA, 1980年(77), pp.4216〜4220
【非特許文献4】
ブラウン(Brown),M.E.著, グルタミンシンテターゼを用いる組換え抗体の生産のためのプロセス開発(Process Development for the Production of Recombinant Antibodies Using the Glutamine Synthetase(GS) System.), Cytotechnology, 1992年(9), pp.231〜236
【非特許文献5】
ベビントン(Bebbington),C.R.著, 増幅選択可能なマーカとしてグルタミンシンテターゼ遺伝子を用いる骨髄腫細胞からの組換え抗体の高レベル発現(High-level Expression of a Recombinant Antibody from Myeloma Cells using a Glutamine Synthetase Gene as an Amplifiable Selectable Marker.), Bio/Technology, 1992年(10), pp.169〜175
【非特許文献6】
コケット(Cockett),M.I.;ベビントン(Bebbington),C.R.;ヤラントン(Yarranton),G.T.著, グルタミンシンテターゼ遺伝子増幅を用いるチャイニーズハムスター卵巣細胞におけるメタロプロテイナーゼの組織阻害物の高レベル発現(High level expression of tissue inhibitor of metalloproteinases in Chinese hamster ovary cells using glutamine synthetase gene amplification.), Bio/Technology, 1990年(8), pp.662〜667
【非特許文献7】
グナリ(Gounari),F.;バンクス(Banks),G.R.;カザイエ(Khazaie),K.;ジェゴ(Jeggo),P.A.;ホリデイ(Holliday),R.著, 遺伝子再活性化:哺乳動物DNAメチル化変異の分離のための手段(Gene reactivation:a tool for the isolation of mammalian DNA methylation mutants), Genes Dev, 1987年(1), pp.899〜912
【非特許文献8】
ハリス(Harris),M.著, CHO K1細胞におけるプロリン非依存性の5−アザシチジンによる高頻度誘導(High frequency induction by 5-azacytidine of proline independence in CHO K1 cells), Somatic Cell Mol Genet, 1984年(10), pp.615〜624
【非特許文献9】
スタリングス(Stallings),R.L.;クローフォード(Crawford),B.D.;トビー(Tobey),R.A.;テスマー(Tesmer),J.;ヒルデブランド(Hildebrand),C.E.著, カドミウムレスタンスへの5−アザシチジン誘発転換は同調細胞における不活性メタロチオネイン遺伝子の早期細胞周期複製との相関(5-azacytidine-induced conversion to cadmium restance correlates with early S phase replication of inactive metallothionein genes in synchronized cells.), Somatic Cell Mol Genet, 1986年(12), pp.423〜432
【非特許文献10】
ビーチ(Beach),L.R.;パルミーター(Palmiter),R.D.著, カドミウム耐性マウス細胞におけるメタロチオネイン−1遺伝子の増幅(Amplification of the metallothionein-1 gene in cadmium-resistant mouse cells.), Proc Natl Acad Sci USA, 1981年(78), pp.2110〜2114
【非特許文献11】
クシュナー(Kushner),P.J.;ホルト(Hort),E.;シャイン(Shine),J.;バクスター(Baxter),J.D.;グリーン(Greene),G.L.著, 高レベルのヒトエストロゲン受容体を発現し、エスストロゲンによって殺傷される細胞株の構成(Construction of cell lines that express high levels of the human estrogen receptor and are killed by esstrogens.), Mol Endocrinol, 1990年(4), pp.1465〜1473
【非特許文献12】
ベイリー(Bailey),C.J.;ベイグ(Baig),M.;グレイ(Gray),P.P.;サンストローム(Sunstrom),N.−A.著, 金属増幅可能な哺乳動物発現系における組換えタンパク質の高レベルの発現のための迅速な選択/増幅法(A rapid selection/amplification procedure for high-level expression of recombinant protein in a metal-amplifiable mammalian expression system.), Biotechnol Techniques, 1999年(13(9)), pp.615〜619
【非特許文献13】
チャルフィー(Chalfie),M.;トゥ(Tu),Y.;ユースキルヒェン(Euskirchen),G.;ワード(Ward),W.W.;プラスハー(Prasher),D.C.著, 遺伝子発現のマーカとしての緑色蛍光タンパク質(Green fluorescent protein as a marker for gene expression.), Science, 1994年(263), pp.802〜805
【非特許文献14】
モサー(Mosser),D.D.;キャロン(Caron),A.W.;ブジェット(Bourget),L.;ジョリクール(Jolicoeur),P.;マシー(Massie),B.著, 細胞発現誘導遺伝子生成物のスクリーニングおよび選択のための緑色蛍光タンパク質をコード化するdicistronicカセットの使用(Use of a dicistronic expression cassette encoding the green fluorescent protein for the screening and selection of cells expressing inducible gene products.), Biotechniques, 1997年(22), pp.150〜154
【非特許文献15】
カリン(Karin),M.;リチャーズ(Richards),R.I.著, ヒトメタロチオネイン遺伝子:mRNAの分子クローニングおよび配列分析(Human metallothionein genes: molecular cloning and sequence analysis of the mRNA.), Nature, 1982年(299), pp.797〜802
【非特許文献16】
PCRプライマー(PCR Primer):実験マニュアル(A Laboratory Manual.), 1995年, コールド・スプリング・ハーバー(Cold Spring Harbor),ニューヨーク州,プレインビル(Plainville)
【非特許文献17】
マクニール(McNeall),J.;サンチェス(Sanchez),A.;グレイ(Gray),P.P.;チェスターマン(Chesterman),C.N.;スレイ(Sleigh),M.J.著, 金属反応性要素を含有するメタロチオネインプロモーターからの過誘導性遺伝子発現(Hyperinducible gene expression from a metallothionein promoter containing metal-responsive elements.), Gene, 1989年(76), pp.81〜88
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【0010】
上記に照らして、本発明の目的は、従来技術の欠陥の少なくとも一部を克服または実質的に改善し、または有用な代案を提供する選択方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【0011】
レポータ核酸に結合された増幅可能な核酸を用いて、当該核酸の変化(例えば、増幅)コピー数を有する細胞をスクリーニングしうることが意外にも見出されている。この系は、当該生成物の発現について、また高レベルの当該生成物を生産する細胞の高処理選択のためのプロトコルにおいて、細胞を迅速にスクリーニングするためにも使用されうる。
【0012】
第1の態様によれば、本発明は、当該核酸のコピー数が他と比べ変化している細胞を、複数の細胞から識別する方法であって、
(a)当該核酸のコピー数が変化する前記細胞が、当該核酸およびレポータ核酸に結合された増幅可能な核酸を含み、かつ
(b)当該核酸のコピー数が増幅可能な核酸およびレポータ核酸のコピー数と相関し、かつ
他の細胞と比べレポータ核酸のコピー数における変化および/またはレポータ核酸の生成物の発現における変化を有する細胞について複数の細胞をスクリーニングするステップを含む方法を提供する。
【0013】
当業者は、複数の細胞における他の細胞が、当該核酸、増幅可能な核酸、およびレポータ核酸を有しうること、または有しえないことを理解するであろう。
【0014】
当該核酸およびレポータ核酸に結合された増幅可能な核酸は、単一のDNA分子上にありうる。かかる分子においては、当該核酸が増幅可能な核酸から10,000bp以下であることが好ましい。より好ましくは、当該核酸は増幅可能な核酸から1,000bp以下である。
【0015】
当業者は、レポータ核酸のコピー数が変化している細胞を識別する方法を認識するであろう。これらには、例えば、サザンブロット分析による候補クローンのスクリーニングまたは配列決定が含まれる。しかし、核酸のコピー数の増大が核酸の生成物の発現における増大と関連する可能性が高いことが本分野において公知である。したがって、本発明によれば、当該核酸のコピー数が変化している細胞を識別する好ましい手段は、レポータ核酸の生成物の発現における変化のスクリーニングによるものである。
【0016】
レポータ核酸の生成物の発現における増大は、当該核酸の生成物の発現における変化と相関することが好ましい。
【0017】
通常、当該核酸のコピー数における変化はコピー数の増幅である。しかし、当業者には、特定の状況下では、コピー数における減少を有する細胞を識別したいことが明らかであろう。これは、例えば、増幅可能な核酸が反応する因子を調整すること、例えば、細胞の成長培地における金属イオン濃度を減少させることによって達成しうる。
【0018】
増幅可能な核酸のコピー数は、細胞の成長培地中に存在する金属イオンの濃度によって調節されることが好ましい。かかる系においては、増幅可能な核酸のコピー数が当該核酸のコピー数と相関するため、当該核酸のコピー数は金属イオンの濃度によって制御されるであろう。示されているように、本発明において、当該核酸のコピー数における変化が生じた細胞は、レポータ核酸のコピー数の変化によって(またはレポータ核酸の生成物のレベルにおける変化によって)識別可能となる。より好ましくは、当該核酸のコピー数は、成長培地中の金属イオンを増大させることによって増幅され、最も好ましくは、1μM〜100μMの範囲内で金属イオン濃度における増大に反応して増幅される。最も好ましくは、金属イオン濃度における増大は、2.5μM〜5.0μMである。
【0019】
好ましくは、金属は、カドミウム、亜鉛、銅、コバルト、またはニッケルイオンであり、より好ましくは、カドミウムまたは亜鉛イオンである。
【0020】
好ましくは、増幅可能な核酸は、選択可能なマーカとして作用しうる生成物をコード化する。
【0021】
好ましくは、増幅可能な核酸は、メタロチオネイン(MT)、ジヒドロ葉酸還元酵素、グルタミンシンテターゼ遺伝子、CAD、アデノシンデアミナーゼ、アデニレートデアミナーゼ、UMPシンテターゼ、IMP5'−デヒドロゲナーゼ、ザンチン−グアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ、変異HGPRT酵素または変異チミジンキナーゼ、チミジル酸シンテターゼ、P−糖タンパク質170、リボヌクレオチドレダクターゼ、グルタミンシンテターゼ、アスパラギンシンテターゼ、アルギノコハク酸シンテターゼ、オルニチンデカルボキシラーゼ、HMG−CoAレダクターゼ、N−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼ、トレオニル−tRNAシンテターゼ、Na+、K+−ATP酵素をコード化する。より好ましくは、増幅可能な核酸は、ヒトMT遺伝子をコード化し、最も好ましくは、ヒトMT遺伝子はヒトメタロチオネインIIA遺伝子である。
【0022】
レポータ核酸の生成物は、ネオマイシン、アンピシリン、ハイグロマイシン、プロマイシン、ブレオマイシン、ゼオシン、またはカノマイシンのような阻害物の存在下で成長する能力を、フローサイトメトリ、蛍光プレートリーダー、蛍光計、顕微鏡スクリーニング、裸眼、または表現型検出などで検出することが望ましい。さらに望ましくは、蛍光活性化細胞選別装置(FACS)を用いるフローサイトメトリによって検出する。
【0023】
レポータ核酸は、緑色蛍光タンパク質(GFP)、または、例えば、強化緑色蛍光タンパク質(EGFP)、黄色蛍光タンパク質(YFP)、強化黄色蛍光タンパク質(EYFP)、青色蛍光タンパク質(BFP)、強化青色蛍光タンパク質(EBFP)、シアン蛍光タンパク質(CFP)、強化シアン蛍光タンパク質(ECFP)、または赤色蛍光タンパク質(dsRED)などその誘導体をコード化することが好ましい。最も好ましくは、蛍光タンパク質はEGFPである。しかし、当業者には、任意の蛍光タンパク質、および実際に任意の適切なレポーターを本発明において使用しうることが明らかであろう。
【0024】
当該核酸およびレポータ核酸に結合した増幅可能な核酸は、任意の適切な方法、例えば、形質転換またはトランスフェクションによって細胞内へ挿入されうる。核酸は、例えば、単一のDNA構成物上にある。あるいは、例えば、それらは、2つの構成物(結合した核酸を含む一方と、当該核酸を含む他方)上にありうる。かかる構成物は、細胞内へ同時形質転換され、または同時トランスフェクションされうる。理論に束縛されることなく、同時形質転換/同時トランスフェクト構成物が、形質転換/トランスフェクション中に再結合し、その結果、両方が細胞のゲノムDNAにおける同じ部位で統合し、増幅可能な核酸により当該核酸のコピー数が制御されることが提案されている。
【0025】
当業者は、当該核酸のコピー数における変化が増幅可能な核酸がレポータ核酸に結合されている増幅可能な核酸およびレポータ核酸のコピー数と相関するという条件で、任意の遺伝子構成物または系を本発明において使用されることを理解するであろう。
【0026】
好ましくは、核酸が単一のDNA構成物上にある場合、単一のDNA分子はプラスミドである。より好ましくは、pNKプラスミド由来のベクターである。しかし、任意の適切な構成物が使用されうることが理解されるであろう。
【0027】
好ましくは、レポータ核酸は増幅可能な核酸の下流に位置している。より好ましくは、増幅可能な核酸は、融合生成物が生産されるように2つの核酸のインフレーム融合によってレポータ遺伝子に結合されている。例えば、MTが増幅可能な核酸であり、GFPがレポータ核酸である実施形態において、この種類の結合により融合生成物MTGFPが得られる。
【0028】
しかし、当業者には、レポータ核酸のコピー数が増幅可能な核酸および当該核酸のコピー数と相関させる任意の形の結合が本発明において機能することが明らかであろう。さらに、本発明において利用される拡散のコピー数間の相関は、1:1の相関である必要はなく、かつ最も多くの場合、1:1の相関とはならない。本発明のためには、核酸のコピー数は、1つのコピー数の変化がもう1つのコピー数の変化において反映されるように、少なくともある程度相関していれば十分である。
【0029】
この点を考慮して、核酸は、例えば、内部リボソーム侵入部位(IRES)によって結合されうる。IRESは、転写物の(各)追加のリボソーム侵入部位の存在により対応する個別の生成物内へ翻訳されうる2つ以上の個別遺伝子から単一の転写物の生産を可能にする。好ましい実施形態では、IRESは弱毒化IRESでありうる。弱毒化IRESは、IRESの誘導体であり、結果として第1の生成物の生産に対して第2の遺伝子の生成物の生産が減少する。これは、増幅可能な核酸が弱毒化IRESよってレポータ核酸に結合されている系においては、例えば、増幅可能な核酸の生成物がレポータ核酸の生成物より高い量で生産されうるという利点を有する。したがって、レポータ核酸の生産における増大に基づき選択された細胞は、増幅可能な遺伝子の高レベルの発現、ひいては高レベルの当該核酸を有する可能性が高い。もちろん、多くの場合、高レベルの当該核酸により高レベルの当該核酸の生成物が得られる。
【0030】
さらに、レポータ核酸は、増幅可能な核酸のイントロンへクローン化されることによって増幅可能な核酸に結合されうる。
【0031】
当業者には、本発明の利点の1つが、レポータ核酸の生成物の参照によって高レベルの当該核酸の生成物(当該生成物)を生産する細胞を識別でき、したがって、当該生成物がそれを選択可能なレポータペプチドまたはタンパク質から分割する必要なく分離できることが明らかであろう。しかし、他方では、本発明は、当該核酸そのものが、例えば、インフレーム融合によって増幅可能な核酸およびレポータ核酸に結合される構成物に適用可能であることも理解されるべきである。当該生成物の要件によって、融合生成物は、適切なプロテアーゼ部位、または精製を補助する「タグ」、例えば、6−Hisタグ、またはグルタチオン−S−トランスフェラーゼタグ、またはFlagおよびヘモフィルスインフルエンザ菌エピトープなど特異的抗体によって容易に検出可能であるペプチドエピトープを含みうる。
【0032】
細胞は、任意の種類の原核細胞または真核細胞でありうる。好ましくは、細胞は哺乳動物細胞である。より好ましくは、懸濁液または付着チャイニーズハムスター卵巣細胞(CHO)である。最も好ましくは、細胞はCHOK1細胞である。
【0033】
もちろん、当該核酸は、例えば、抗体、生物製剤、エンドヌクレアーゼ、メチラーゼ、オキシドレダクターゼ、トランスフェラーゼ、ヒドロラーゼ、リサーゼ(Lysase)、イソメラーゼまたはリガーゼ、貯蔵ポリペプチド、輸送タンパク質、抗原または抗原決定基、保護または防御タンパク質、ホルモン、構造タンパク質、当該プロテアーゼまた合成ポリペプチドまたはその一部をコード化する核酸を含む任意の適切な核酸でありうる。
【0034】
第2の態様によれば、本発明は、当該ポリペプチドを発現する細胞を識別する方法であって、
(a)細胞内に当該ポリペプチドを発現させるステップであって、該ポリペプチドの発現が、レポータ核酸が増幅可能な核酸に結合されているレポーター核の発現と相関しているステップ、
(b)レポータ核酸の発現をモニタリングすることによって他の細胞の中から当該ポリペプチドを発現する細胞を識別するステップ、
を含む方法を提供する。
【0035】
第3の態様によれば、本発明は、当該ポリペプチドを分離する方法であって、
(a)当該ポリペプチドの発現が増幅可能な核酸およびレポータ核酸の発現と相関し、かつ増幅可能な核酸およびレポータ核酸が結合するように当該ポリペプチドをコード化する核酸を有する構成物によって形質転換またはトランスフェクションするステップと、
(b)増幅可能な核酸の発現を増大させるステップと、
(c)レポータ核酸の生成物を発現する細胞を選択するステップと、
(d)それらから当該ポリペプチドを分離するステップと、
を含む方法を提供する。
【0036】
好ましくは、増幅可能な核酸は、MTをコード化する遺伝子である。好ましくは、レポータ核酸は、GFPまたはその誘導体をコード化する遺伝子である。最も好ましくは、MTおよびGFP遺伝子はインフレーム融合されている。
【0037】
当業者には、本方法が高レベルの当該生成物を生成する細胞の高処理選択のためのロボットスクリーニングおよびプロトコルにおいて使用しうることが明らかであろう。
【0038】
したがって、第4の態様では、本発明は、(a)当該核酸と、(b)レポータ核酸に結合された増幅可能な核酸とを含み、当該核酸のコピー数が増幅可能な核酸およびレポータ核酸のコピー数と相関する細胞を提供する。
【0039】
第5の態様によれば、本発明は、第4の態様による細胞における当該核酸のコピー数を変化させる方法であって、増幅可能な核酸のコピー数を変化させる因子に細胞を曝露させるステップを含む方法を提供する。
【0040】
第6の態様によれば、本発明は、構成物が細胞内に存在する場合、当該核酸のコピー数が増幅可能な核酸およびレポータ核酸のコピー数と相関するように、当該核酸およびレポータ核酸に結合された増幅可能な核酸を含む構成物を提供する。
【0041】
第7の態様によれば、本発明は、第1または第2の態様による方法によって識別される細胞を提供する。
【0042】
第8の態様によれば、本発明は、第3の態様による方法によって分離される当該ポリペプチドを提供する。
【0043】
文脈上、明らかに他の意味に解すべき場合を除き、明細書および請求の範囲の全体を通じて、「含む(comprise)」、「含む(comprising)」等の語は、限定的な意味とは反対の包含的意味または包括的な意味で解釈すべきであり、すなわち、「含むが、限定されない」の意味である。
【発明を実施するための最良の形態】
【0044】
一般的に用いられる多くの哺乳動物発現系は、安定してトランスフェクションされたチャイニーズハムスター卵巣(CHO)細胞に基づく。高レベルの組換えタンパク質を生産する安定したクローンは、所望の当該遺伝子および主要な遺伝子マーカをコード化する発現ベクターによる細胞のトランスフェクション後に得られる。しかし、無作為の高い生産者の調査は、免疫検出を必要とする従来のスクリーニング法を用いることにより、時間がかかり、かつ労働集約型である。高い生産者のスクリーニングに関わる時間および労働を減少させる努力において、本発明者らは、増幅可能な核酸がレポータ核酸に結合され、当該核酸のコピー数の変化および/または当該核酸によってコード化される生成物の生産レベルの変化についての細胞の効率的なスクリーニングのために使用される系を構成した。
【0045】
以下に例示される系では、選択および増幅を視覚的にモニタリングすることができ、それによって、組換え遺伝子陽性クローンの効率的なスクリーニングが可能となり、かつ増幅後の当該生成物の高レベルの発現を有するクローンの選択が得られる。使用される代表的な増幅可能な核酸は、ヒトメタロチオネイン(MT)遺伝子であり、選択されたレポータ核酸は緑色蛍光タンパク質(GFP)遺伝子であった。これらの遺伝子は、核酸をインフレーム融合することによって結合させ、融合タンパク質、MTGFP(「融合マーカ」とも呼ばれる)の生産を可能にする。
【0046】
融合マーカの使用は、フローサイトメトリを用いることによって当該核酸を発現する高生産クローンのスクリーニングを容易にする。この方法は、ヒト成長ホルモン(hGH)またはクロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ(CAT)のいずれかの発現によって以下で明らかにされる。
【0047】
蛍光活性化細胞選別装置(FACS)により百万個の細胞を容易にスクリーニングし、本実施例MTGFPにおける高レベルの蛍光発生タンパク質を生成する細胞を選別することができる。当該核酸の増幅がMTGFP構成物の増幅と相関する場合、当該増幅核酸を有する細胞をMTGFP融合マーカに含まれるGFPからの蛍光の検出に依拠するFACSスクリーニングによって識別しうる。当該生成物の生産レベルは、しばしば当該生成物をコード化する核酸のコピー数の直接的関数であるため、MTGFPを生産するクローンの選択は、高レベルでの当該生成物を生産するクローンを提供する可能性が高い。
【0048】
MTGFP構成物でトランスフェクションされた細胞は、一連の段階的なカドミウム選択および増大蛍光による増幅に反応し、これらはフローサイトメーターまたは蛍光計(GFP蛍光を測定する適切なフィルタを備えたマイクロタイタープレートリーダー)を用いてモニタリングすることができる。増大カドミウム耐性プールから分離したクローンを用いることによって、本発明者らは、蛍光の増大が組換え生成物の増大レベルと直線的に相関することを明らかにした。蛍光の増大は生産性の増大の証拠である。
【0049】
マイクロタイタープレートにおけるクローンは、培養の完全性を阻害することなく蛍光計を用いてスクリーニングすることができ、高生産者を即座に識別することができる。MTGFPコード化発現ベクターを用いる高処理スクリーニング法は、特にその手順がロボット処理または自動化手順に適合される場合は、膨大な数の組換えクローンのスクリーニングに含まれる時間および労働を大幅に減少させる。
【0050】
MTGFP遺伝子の発現は主要な選択可能なマーカとして作用し、明確な金属濃度で、迅速、かつ抗生物質G418よりも効率的なクローンの選択を可能にする。MTGFP遺伝子は、外来遺伝子発現の増幅のための選択可能かつ増幅可能な遺伝子として使用できる。
【0051】
以下に記載されたプロトコルを用いることによって、金属および蛍光スクリーニングにおける選択/増幅の4週間以内に>30μg/106細胞/日の特異的生産性に達する細胞株を分離することが可能であった。過去において、かかる高レベルの生産性を支える一部のクローンの分離は、人時年を必要とする何千ものクローンのスクリーニング後のみに可能であった。かかるスクリーニング法は、現在必要とされる時間と労力の何分の1かで何万ものトランスフェクションされたクローンを管理する能力があるロボット処理システムを用いる自動化手順に容易に適合させることができる。
【0052】
これから添付の図面を参考にして、本発明の好ましい実施形態をほんの一例として記載する。
【実施例1】
【0053】
MTGFP融合遺伝子のエンジニアリング
強化緑色蛍光タンパク質(eGFP、クロンテック(Clonetech))のコード配列を、プライマー重複延長PCR(16)を用いてヒトメタロチオネインIIA遺伝子(MT)(15)の3'末端にインフレームクローン化した。このために、オリゴヌクレオチドを4個合成したが、それを以下に記載する。
MTGFP−1:5'TAC TCT TCC TCC CTG CAG TCT CTA 3'、
MTGFP−2:5'CAC CAT GGG CCC GGC GCA GCA GCT GCA 3'、
MTGFP−3:5'GCC GGG CCC ATG GTG AGC AAG GGC GAG 3'、
MTGFP−4:5'ATT TAC GCC TGC AGA TAC AT 3'
【0054】
MTGFP−1は、翻訳開始に対してMTをコード化する遺伝子の−758〜−735ntをアニールし、PstI部位(5'CTGCA/G 3')を含む。
【0055】
MTGFP−2は、MT転写開始部位に対して+630〜+656をアニールする。停止コドンTGAは、2つの追加のアミノ酸プロリンおよびグリシンをコード化する配列5'CCCGGG 3'、および制限酵素ApaIの認識配列によって置換される。
【0056】
MTGFP−3は、eGFPのコード配列の転写開始部位に対して−9〜+18にアニールする。ATG開始コドンはMT遺伝子配列とインフレームされており、MTGFP−2と相同性の15個のヌクレオチドタグ内に位置している。
【0057】
MTGFP−4は、eGFPのコード配列の転写開始部位に対して+954〜+973にアニールし、制限酵素PstIの認識部位を含む。
【0058】
eGFPは、記載されているように(16)アニール温度50℃下、Taqポリメラーゼ(ギブコ(Gibco)−BRL)、dNTP(プロゲン(Progen))、2mM Mg2+イオン、および10%DMSOを含有する反応混合物中でMTGFP−3およびMTGFP−4を用いてPCR増幅された。同様に、MTIIA遺伝子は、MTGFP−1およびMTGFP−2を用いて増幅された。増幅生成物はゲル精製され、プライマー重複延長を用いてプライマーMTGFP−1およびMTGFP−4を用いる融合MTGFPを増幅させた。反応は、GC豊富なMTコード化テンプレートDNAのために2mM Mg2+および10%DMSOを必要とした。特異性は、アニール温度を50℃から55℃に上昇させることによって3サイクル後に増大した。反応により3281個のDNAの塩基対画分が得られた。
【実施例2】
【0059】
発現ベクターpMTGFP、pMTGFP/hGH、およびpMTGFP/CATの構成
MTGFPコード配列を含有する2381bp画分をPstIで消化し、発現ベクターpNK内へのクローン化を可能にした(12)。ゲル抽出後、画分を含有するMTGFPをpNKΔMT(PstIを用いてpNKから削除されたMT遺伝子)内へクローン化し、pMTGFPを作成した。pMTGFP/hGHを構成するには、hGH(翻訳開始部位に対してnt−559〜+2094)のゲノム配列を含有する2223bp EcoRI/KpnI画分をそれぞれ制限酵素EcoRIおよびKpnIで以前に消化されたpMTGFPにライゲーションし、DH5細菌へ形質転換した。pMTGFP/CATを構成するには、CATのコード領域を含有する714bp DNA画分をHindIIIおよびKpnIでpNKCATを消化することによって得るとともに(12)、pMTGFPにおけるそれぞれの部位内へ挿入した。陰イオン交換プラスミド精製カラム(キアゲン(Qiagen)を用いて陽性クローンからDNAを分離し、精製した。
【実施例3】
【0060】
細胞培養およびトランスフェクション
細胞株を確立するために用いたCHOK1細胞は、CHOK1 ATCC CCL61由来であった。全細胞を10%FCS(CSL)を添加した完全培地(DMEM/Coons F12ミックス(CSL)中で増殖させた。トランスフェクション用に、リポフェクタミン2000(ライフテクノロジー(Life Technology))を用い、メーカーのプロトコルに従い混合されたDNAおよび試薬の最適な条件を用いて細胞をトランスでクションした。トランスフェクションの24時間後に培地を除去し、新鮮な完全培地と取り替え、プレートをさらに24時間インキュベートした。次いで、EDTA/PBSを用いて細胞を分離し、400μg/ml G418を含有する新鮮な完全培地中のT75フラスコに移した。
【実施例4】
【0061】
金属増幅
G418Rプールからの細胞(X日間400μg/ml G418で残存選択)を開始濃度2.5μM CdCl2および50μM ZnSO4で段階的に金属の量を増大させて増殖させた(12)。CdCl2の濃度が2倍になる前に、細胞を90%コンフルエンスで4回継代培養した。新鮮なZnSO4をつねに50μMの濃度で培地に添加した。各レベルのカドミウム耐性において、フローサイトメーターを用いて各プールの蛍光をモニタリングし、ELISAを用いて特異的生産性を測定した。
【実施例5】
【0062】
金属選択
プラスミドを含有するpMTGFPのトランスフェクション後、完全培地7mlsを含有する100mmプレートにCHO細胞を継代培養し、6時間接着させた。400μg/ml G418の存在下または非存在下に金属(1〜10μM CdCl2および100μM ZnSO4)を培地に添加した。金属耐性細胞の新生コロニーについて毎日、細胞をモニタリングした。金属を添加した約6日後、培地を除去し、100μM ZnSO4および2μM CdCl2を含有する完全培地と取り替えた。培養がコンフルエンスに達したら、フローサイトメトリを用いて蛍光を分析し、ELISAによって組換えタンパク質レベルを測定した。
【実施例6】
【0063】
フローサイトメトリ、FACS選別、および蛍光計
488nmで放射するマルチラインアルゴンレーザーを備えたMoFloサイトメーター(サイトメーション(Cytomation)、コロラド州、米国)を用いてフローサイトメトリを行った。分析は、CyCLOPSサミットオペレーティングシステムを用いて行った。選別が必要であった場合、ソートマスター(Sortmaster)ソフトウェアを用いて正確なドロップ遅延を測定し、ロボットのアームを制御するCyCLONEソフトウェアを用いて細胞をマイクロタイタープレートへ選別した。フローサイトメーターを較正し、各分析前にフロー−チェック(Flow-Check)TM蛍光球(ベックマン・コールター(Beckman Coulter))を用いて光学的に調整した。選別すべき細胞をトリプシン化し、完全培地中に再懸濁し、ナイロンメッシュを通じてろ過した。流量1000細胞/秒で細胞を分析した。単一の生細胞を順方向散乱および側方散乱を用いて測定した。通常、細胞は、200μg/ml G418および50μM ZnSO4とともに50:50の新鮮およびならし培地100μlを含有する96穴マイクロタイタープレートにウェル当り細胞1個を選別した。蛍光プレートリーダーまたは蛍光計(fmax、モレキュラー・デバイシス(Molecular Devices)、サニーベール、カリフォルニア州)を用いて細胞の蛍光強度も測定しえた。クオーツハロゲンランプを備えたこの蛍光計は、GFPの励起および放射スペクトルを検出するのに十分な485nmおよび538nmのフィルタセットを有する。ソフトマックスプロ(SOFTmaxPRO)ソフトウェアを用いて、マイクロタイタープレート上の分析を行った。
【実施例7】
【0064】
ELISA
hGHを測定するために、10日間96マイクロタイタープレート中で増殖した細胞からのならし培地を遠心分離し、ELISA(ロシュ(Roche)、マンハイム、ドイツ)を用いてhGHを定量化した。ELISA(ロシュ(Roche)、マンハイム、ドイツ)を用いて、以前に記載されているように(12)CATタンパク質レベルを測定した。
【0065】
結果
MTGFPの発現
融合タンパク質MTGFPの発現をプラスミドベクターpMTGFPでトランスフェクションしたCHO細胞においてスクリーニングした(図1)。発現ベクターpMTGFPはベクターpNKから構成された(12)が、これはメタロチオネインIIAをコード化するDNAがメタロチオネインIIA遺伝子の全プロモーター領域を保持する融合遺伝子のそれによって置換された点でpNKと異なる。改変メタロチオネインM2.6プロモーターは、複数のクローニング部位(MCS)へクローン化される標的遺伝子の発現を推進する。ネオマイシン類似体、G418、または金属のいずれかの細胞生存選択のプールをサイトメトリーを用いて分析した。G418の存在下または非存在下に種々の濃度のCd++(1〜10μM)を残存する細胞のプールから蛍光を測定した。図2は、増大する金属選択の関数としての選択されたプールの平均相対蛍光を示す。各プールは、G418の存在下または非存在下に指示金属濃度を含有する培地中8日の選択後の10,000個の単一生細胞を表す。低い(100μM Zn++)または金属を含まない選択では、選択のためにG418を使用したかどうかによって平均蛍光には2倍の差が存在する。G418のみの添加は、低濃度の金属(100μM Zn+++1〜2μM Cd++)よりも選択集団の充実化において有効であると思われる。しかし、細胞が100μM Zn+++4μM CD++を含有する金属中で選択される場合、平均蛍光はバックグラウンドレベルと比べて3けた以上増大する。トランスフェクションされていないCHO細胞のフローサイトメトリプロフィールに見られるバックグラウンド蛍光は、図2の差込図の7つの相対蛍光単位(RFU)の平均蛍光に対応するピークとして出現する。
【0066】
この金属濃度での選択による8日後、G418が倍地中に存在したかどうかに関係なく、集団中の全細胞が104RFUで蛍光を発している。実際に、バックグラウンド蛍光に対応するピークは認められない。高濃度の金属で選択された細胞の結果は同様であった。しかし、8および10μM Cd++における選択は相当な細胞死をひき起こし、したがってフローサイトメーターにおける分析に十分な細胞を得るために、100μM Zn++および2μM Cd++を含有する培地中の生存細胞の回収を必要とした。
【0067】
場合により波長を選別することなく光を弱める必要があった。これは、全可視スペクトルにわたる光を吸収する減光フィルタND1.3(カンパニー(Company))を用いて行われた。光電管に達する光を制限するフィルタを用いることによって、信号を相当に減少させることが可能であり、こうして10000RFUを超える蛍光を示す細胞の値を得た。
【0068】
これらの結果は、MTGFPが有効で主要な選択可能なマーカとして使用することができ、かつMTGFP融合タンパク質をコード化する発現ベクターでトランスフェクションされた細胞が効率的かつ迅速に選択されうることを示す。4μM CD++における選択は、選択がG418のみの場合よりも100倍多くの蛍光を有する細胞のプールをもたらす。
【0069】
MTGFP融合は同時発現遺伝子の主要かつ視覚的に選択可能なマーカとして使用できる
高生産クローンを充実化するための選択可能なマーカとしてのMTGFP融合タンパク質の使用を評価するために、レポータ遺伝子、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ(CAT)を改変M2.6メタロチオネイン(metallothione)プロモーターの制御下にMTGFPで同時発現した(17)。CAT遺伝子は、発現ベクターpMTGFPの複数のクローニング部位においてクローン化され、pMTGFP/CATと称された。CHO細胞は、pMTGFP/CATでトランスフェクションされ、前段に記載されたG418の存在下または非存在下に種々の濃度を含有する培地で選択された。選択の8日後にトランスフェクションされたプールを残存するフローサイトメトリプロフィールを表すグラフが、図3aに示されている。また、前段に見られるように、蛍光プールの大幅な充実化が4μM Cd+++100μM Zn以上の濃度で達成された。異なる選択的圧力下の各プールからのCAT発現レベルをCAT ELISA(ロシュ(Roche)、オーストラリア)を用いて分析したが、その結果は図3bに示されている。CATタンパク質レベルは、4μM Cd+++100μM Znを含有する培地で選択された細胞において20倍高く上昇し、フローサイトメーターからの蛍光測定値を反映し、G418が培地に含まれている場合には50倍高くなった。これらの結果は、MTGFP融合タンパク質をコード化する遺伝子でトランスフェクションされた細胞が、蛍光が高くかつ生産性が高いプールの充実化のために金属において有効に選択されうることを示す。高濃度でのカドミウムの細胞毒性により、選択はその後の実験のすべてについて4μM Cd++および100μM Zn++において行われた。
【0070】
MTGFPの発現を用いて増大金属における遺伝子増幅を視覚的にモニタリングすることができる
カドミウム耐性のマーカを提供することに加えて、組換え遺伝子発現の増幅はカドミウムの段階的な増大によって継続することができ、これは初期レベル以上の発現増大をもたらす。本発明者らは以前、漸進的に高いレベルのカドミウム耐性でのCAT生産の増大が、メタロチオネイン遺伝子をコード化する発現ベクターpNKでトランスフェクションされたCHO細胞をプールすることを明らかにした(12)。120μMカドミウムに対するトランスフェクションされた耐性のプールは、初期レベルに対してCAT遺伝子発現の500倍を超える増大をもたらした。しかし、かかる高レベルのカドミウムに達する段階的な選択が耐性細胞集団を発生させ、生産性の減少をもたらすことを示した(データを示さず)および(11)。MTX濃度の増大がしばしば特異的生産性の喪失をもたらすDHFR系が用いられている場合に同様の発現パターンも確認されている(ウーム(Wurm)(1990年))、カウフマン(Kaufman)ら(1985年)。DHFR増幅系を用いる試験は、MTX増幅には上限があり、かつ各組み換えCHO細胞株で異なることを示している。緑色蛍光メタロチオネイン遺伝子の存在は、フローサイトメーターおよび/または蛍光計を用いて、高度に増幅された、カドミウム耐性のクローンの視覚的スクリーニングを可能にする。蛍光を失う細胞の出現は、高濃度のカドミウムで検出された。高度に増幅されたカドミウム耐性トランスフェクトCHO細胞のプールにおける蛍光クローンの喪失は、それらの考えうる成長の利点が有望な高生産性プールの希釈をもたらす前に、蛍光集団の残余から容易に選別されうる。
【0071】
hGHの発現はGFP蛍光と相関する
CHO細胞をpMTGFP/hGHでトランスフェクションし、G418(400μg/ml)または金属(100μM Zn++および4μM Cd++を含有する培地)のいずれかの選択にかけた。選択培地における5日後、フローサイトメーターを用いて細胞を分析し、図4Aに示されているように、101、102、103、および104のその相対的な蛍光強度に従ってゲーティングした。フローサイトメトリプロフィールは、金属選択が4500の平均相対蛍光をもたらすが、G418耐性プールは平均345RFUの変動する蛍光強度の細胞からなっていることを示す。これはまた、金属選択が、G418のみよりも高い蛍光を発する細胞の選択においてより迅速かつ効率的であることを示す。細胞を96穴マイクロタイター組織培養プレートへ滅菌選別し、ゲート領域内からのウェル当り1個の細胞が図4Aにおけるプロフィールに示されている。種々の蛍光強度の12個のクローンをFACS選別後に分離し、マイクロタイタープレート中でコンフルエンスに増殖させた。各クローンのGFP蛍光を蛍光計を用いて測定し、ELISA(ロシュ(Roche)、オーストラリア)によって測定される、ならし培地中のそれぞれのhGHレベルに対してプロットした。図4Bは、GFP蛍光の関数として各クローンのhGH生産性を示す。フローサイトメトリによって1つのゲート領域内から選別されていた個々のクローンの測定された蛍光が、その蛍光レベルによって識別されうることが確認された。さらに重要なことに、フローサイトメトリによって測定された細胞のクローン集団の平均蛍光が、蛍光計によって測定される蛍光と十分に相関した。
【0072】
各クローンの複数の複製から現れる傾向は、蛍光計によって検出されるGFPの蛍光が、各クローンの特異的なhGH生産性に対して直線的な関係を示したことを示す。すなわち、フローサイトメトリ分析によって高い蛍光強度で選別されたクローンは、hGHの比較的高い生産者であり、かつ逆もまた同様であった。FACS選別に関係なく、クローンが蛍光計によって検出される高い蛍光を示した場合は、それらは同様にhGHの比較的高い生産者であった。フローサイトメトリ分析のその後の回は、各クローンが、最初に選別された強度で明確な蛍光ピークを示すことを確認するために行われた。これらのクローンのフローサイトメトリプロフィールは、培養2週間後と同じままであり、それらを凍結し、再培養すると変化することはなかった。
【0073】
蛍光の相対測定:フローサイトメーター対蛍光計
実験を行って、クローン分離株の蛍光における差を測定する蛍光計を用いる可能性を明らかにした。マイクロタイタープレートへの滅菌FACS選別は、トランスフェクションされた集団からクローンを得るための迅速かつ便利な方法である。個々のクローンを拡大させた後、蛍光計におけるマイクロタイタープレートをスキャニングすることによって蛍光の第2の測定を簡単に行った。この選択の第2の回は、個々のクローンの蛍光の性質を確認するために行い、培養中のクローン間を比較する別の測定を可能にした。迅速なスクリーニング法の用途のため、フローサイトメーターによって測定されるクローンの蛍光が蛍光計で再現可能であることを確立することが重要であった。図5は、異なる選択培地における分離後に蛍光計の値と比較したフローサイトメーターでスクリーニングされたクローンから得られた平均蛍光値のプロットである。これらの結果は、蛍光計のものと比べフローサイトメーターを用いて測定されるように蛍光の単位は異なるが、平均蛍光は2者間できわめてよく相関することを示す。
【0074】
高生産性クローンのための高処理選択プロトコル
きわめて高い生産性クローンのためにきわめて迅速な方法を使用することができる。迅速な選択の過程を示すフロー図が図6に示されている。この方法は、GFP蛍光と特異的組換えタンパク質生産性の相関に基づく。CHO細胞は、所望の遺伝子を発現するプラスミドベクターpMTGFPでトランスフェクションされる。金属(推奨濃度は、G418の存在下または非存在下に100μM Zn++および4μM Cd++となる)における選択の後、Cd++の増大濃度でさらに増幅されうる金属耐性細胞のプールが得られる。FACSを用いて1個または数個のマイクロタイタープレート内へ高蛍光細胞が識別され、かつ選別される。あるいは、マイクロタイターウェル内へ限界希釈平板法によってクローンを得ることができる。培養10日後、マイクロタイタープレート中の細胞が次いで蛍光計でスキャニングされる。MTGFPの発現から生じる蛍光は生産性の信頼できる指標であるため、クローン拡大およびその後の分析のために最も高い蛍光を発するクローンを選ぶことができる。この段階で、ならし培地をELISAを用いて分析し、組換えタンパク質発現を測定することができる。あるいは、金属中の選択/増幅後、1個または数個のマイクロタイタープレートへの限定希釈を行い、高価なFACS装置の必要を回避することができる。図6に示したプロトコルを用いることによって、>30μg/106細胞/日の特異的生産性を有する細胞株を分離することが可能であった。
【0075】
結論
選択および増幅特性が結合されている融合MTGFP遺伝子は、高レベルの発現を有する外来遺伝子の陽性クローンの有効な視覚的スクリーニング法を可能にする。融合タンパク質は、発現の選択および増幅のための主要かつ可視的なマーカである。蛍光は、核酸の増幅とだけではなく生産性とも相関し、したがって、高発現遺伝子をその蛍光レベルに従って識別することができる。本研究では、メタロチオネイン緑色蛍光タンパク質マーカ遺伝子およびフローサイトメトリを用いて高生産性クローンを識別する高処理スクリーニング法が記載されている。この方法は、何万ものトランスフェクションされた細胞の中から最も高い生産性のクローンを選択することが可能なロボットシステムを用いる自動化に適合しうる。
【0076】
本発明は特定の実施例に関して記載されてはいるが、当業者には、本発明が他の多くの形態で実施されうることが明らかであろう。
【図面の簡単な説明】
【0077】
【図1】pMTGFP哺乳動物発現ベクターを示す図である。融合遺伝子MTGFPは、野生型メタロチオネインIIAプロモーターの支配下にある。当該標的遺伝子がM2.6メタロチオネインプロモーター下流の複数のクローニング部位にクローン化された後、mRNAの下流プロセスのSV40ポリアデニル化部位をコード化する配列によってクローン化される。ネオマイシンおよびカナマイシン(Neo/Kan)をコード化する遺伝子は、そのそれぞれのプロモーターの支配下にそれぞれ哺乳動物細胞および細菌細胞におけるG418およびカナマイシンに対する抵抗を与える(ベイリー(Beiley)、ベイグ(Baig)ら、1999年(38)/同書)。
【図2】細胞のpMTGFPトランスフェクションされたプールの平均相対蛍光単位(RFU)を金属濃度に対してプロットし、個々のプールを選択するために用いた。トランスフェクションされたCHOK1細胞が、金属および/またはG418選択において選択された。平均RFUは、10,000個の単一生細胞の平均蛍光である。トランスフェクションされていない細胞と同等のバックグラウンド蛍光が減じられている。差込図は、金属および/またはG418選択を残存している細胞のフローサイトメトリプロフィールを示す。各プールの平均蛍光値は、分析前の選択に用いられた金属濃度の係数としてプロットされた。トランスフェクション48時間後、細胞を100μM亜鉛に曝露し、8日間、G418の非存在下および存在下に各セットの右側に示されているようにカドミウムの濃度を増大した。記号○はG418存在下の選択、記号●はG418非存在下の選択を表す。
【図3】細胞のpMTGFP/CATトランスフェクトプールの平均相対蛍光単位(RFU)および生産性を示す図である。
【図3A】平均RFUは、10,000個の単一の生細胞の平均蛍光である。トランスフェクションされていない細胞と同等のバックグラウンド蛍光が減じられている。各プールのRFUが金属濃度に対してプロットされ、個々のプールを選択するために用いられた。記号○はG418存在下の選択、記号●はG418非存在下の選択を表す。差込図は、図2に記載されているように金属および/またはG418にかけられたpMTGFPトランスフェクトCHOK1細胞のフローサイトメトリプロフィールを示す。
【図3B】金属選択pMTGFPプールからのCAT発現を示す図である。pg/μg総タンパク質で測定されるCAT発現を横座標上で示された金属(点状棒)および/またはG418(中実棒)で選択されたプールから測定した。金属濃度は、100μM ZnSO4および0、1、2、4、および6μM CdCl2を含む。
【図4A】(a)トランスフェクションされていないCHO細胞、(b)(b)G418、または(c)金属(100μM Zn+++4μM Cd++)を含有する培地中で選択されるpMTGFP/hGHでトランスフェクションされたCHO細胞のプールのフローサイトメトリで測定された蛍光プロフィールを示す図である。ゲート101、102、103、および104を蛍光の対応するレベルでセットし、マイクロタイタープレート内への各ゲート内から細胞を選別した。
【図4B】蛍光は生産性に対して直線的に相関する。12個のクローンの特異的生産性を蛍光計で測定されているように各個別のクローンの相対的蛍光に対してプロットした。クローンを選別し、マイクロタイタープレート中で増殖させ、(相関係数(R2)=0.79)を用いて条件培地をhGHについて分析した。
【図5】pNKGFPでトランスフェクションされたCHO細胞のフローサイトメーターおよび蛍光計を用いた蛍光の比較を示す図である。トランスフェクションされたプールを400μg/mlのG418の存在下または非存在下に、CdCl2(1〜6μM)ともに100μM ZnSO4からなる金属中で選択した。選択後、細胞を収穫し、フローサイトメーターにおける蛍光の分析またはマイクロタイタープレート内へ播種し、蛍光計で分析した。
【図6】高生産細胞株の迅速分離の高処理測定プロトコルを示す図である。

Claims (50)

  1. 当該核酸のコピー数が他と比べ変化している細胞を、複数の細胞から識別する方法であって、
    (a)当該核酸のコピー数が変化する前記細胞が、当該核酸およびレポータ核酸に結合された増幅可能な核酸を含み、かつ
    (b)当該核酸のコピー数が増幅可能な核酸およびレポータ核酸のコピー数と相関し、かつ
    他の細胞と比べレポータ核酸のコピー数における変化および/またはレポータ核酸の生成物の発現における変化を有する細胞について複数の細胞をスクリーニングするステップを含む方法。
  2. 当該核酸およびレポータ核酸に結合された増幅可能な核酸が単一DNA分子である、請求項1に記載の方法。
  3. 当該核酸が増幅可能な核酸から10,000bp以下である、請求項1または2に記載の方法。
  4. 当該核酸が増幅可能な核酸から1,000bp以下である、請求項3に記載の方法。
  5. レポータ核酸の生成物の発現における変化が、当該核酸の生成物の発現における変化と相関する、請求項1〜4のいずれか1項に記載の方法。
  6. 当該核酸のコピー数における変化がコピー数の増幅である、請求項1〜5のいずれか1項に記載の方法。
  7. 増幅可能な核酸のコピー数が、細胞の増殖培地中に存在する金属イオンの濃度によって調節される、請求項1〜6のいずれか1項に記載の方法。
  8. 増幅可能な核酸のコピー数が、細胞の増殖培地の金属イオン濃度を増大させることによって増幅する、請求項7に記載の方法。
  9. 増幅可能な核酸のコピー数が、1μM〜100μMの範囲内で低濃度から高濃度の両方で細胞の増殖培地の金属イオン濃度を増大させることによって増幅する、請求項8に記載の方法。
  10. 増幅可能な核酸のコピー数が、2.5μM〜5.0μMの金属イオン濃度を増大させることによって増幅する、請求項9に記載の方法。
  11. 金属イオンが、カドミウム、亜鉛、銅、コバルト、またはニッケルイオンである、請求項7〜10のいずれか1項に記載の方法。
  12. 金属イオンが、カドミウムまたは亜鉛イオンである、請求項11に記載の方法。
  13. 増幅可能な核酸が、選択可能なマーカとして作用しうる生成物をコード化する、請求項1〜12のいずれか1項に記載の方法。
  14. 増幅可能な核酸が、メタロチオネイン(MT)、ジヒドロ葉酸還元酵素、グルタミンシンテターゼ遺伝子、CAD、アデノシンデアミナーゼ、アデニレートデアミナーゼ、UMPシンテターゼ、IMP5'−デヒドロゲナーゼ、ザンチン−グアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ、変異HGPRT酵素または変異チミジンキナーゼ、チミジル酸シンテターゼ、P−糖タンパク質170、リボヌクレオチドレダクターゼ、グルタミンシンテターゼ、アスパラギンシンテターゼ、アルギノコハク酸シンテターゼ、オルニチンデカルボキシラーゼ、HMG−CoAレダクターゼ、N−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼ、トレオニル−tRNAシンテターゼ、Na+、K+−ATP酵素をコード化する請求項13に記載の方法であって、より好ましくは、増幅可能な核酸は、ヒトMT遺伝子をコード化し、最も好ましくは、ヒトMT遺伝子はヒトメタロチオネインIIA遺伝子である方法。
  15. レポータ核酸の生成物が、フローサイトメトリ、蛍光プレートリーダー、蛍光計、顕微鏡スクリーニング、裸眼、または表現型検出によって検出可能である、請求項1〜14のいずれか1項に記載の方法。
  16. 表現型検出が、阻害物存在下の増殖能の検出である、請求項15に記載の方法。
  17. 阻害物が、ネオマイシン、アンピシリン、ハイグロマイシン、プロマイシン、ブレオマイシン、ゼオシン、またはカノマイシンである、請求項16に記載の方法。
  18. レポータ核酸の生成物が、蛍光活性化細胞選別装置(FACS)を用いるフローサイトメトリによって検出可能である、請求項17に記載の方法。
  19. レポータ核酸が、緑色蛍光タンパク質(GFP)、またはその誘導体をコード化する、請求項1〜18のいずれか1項に記載の方法。
  20. GFPの誘導体が、強化緑色蛍光タンパク質(EGFP)、黄色蛍光タンパク質(YFP)、強化黄色蛍光タンパク質(EYFP)、青色蛍光タンパク質(BFP)、強化青色蛍光タンパク質(EBFP)、シアン蛍光タンパク質(CFP)、強化シアン蛍光タンパク質(ECFP)、または赤色蛍光タンパク質(dsRED)である、請求項19に記載の方法。
  21. GFPの誘導体が、蛍光タンパク質EGFPの誘導体である、請求項20に記載の方法。
  22. 当該核酸およびレポータ核酸に結合された増幅可能な核酸が、核酸による細胞の形質転換またはトランスフェクションによって細胞内に挿入される、請求項1〜21のいずれか1項に記載の方法。
  23. 核酸が単一DNA構成物上にある、請求項22に記載の方法。
  24. 核酸が2つ以上の構成物上にある、請求項22に記載の方法。
  25. 単一のDNA構成物がプラスミドである、請求項23に記載の方法。
  26. プラスミドがpNKプラスミド由来のベクターである、請求項25に記載の方法。
  27. レポータ核酸が増幅可能な核酸の下流に位置している、請求項1〜26のいずれか1項に記載の方法。
  28. 増幅可能な核酸が、融合生成物が生成されるように2つの核酸のインフレーム融合によってレポータ遺伝子に結合される、請求項27に記載の方法。
  29. 融合生成物がMTGFPである、請求項28に記載の方法。
  30. 核酸が内部リボソーム侵入部位(IRES)によって結合される、請求項1〜28のいずれか1項に記載の方法。
  31. IRESが弱毒化IRESである、請求項30に記載の方法。
  32. 当該核酸の生成物が融合タンパク質の一部である、請求項1に記載の方法。
  33. 融合生成物が、精製を補助するプロテアーゼ部位またはタグを含む、請求項32に記載の方法。
  34. 前記タグが6−Hisタグまたはグルタチオン−S−トランスフェラーゼタグまたはペプチドエピトープである、請求項33に記載の方法。
  35. 検出可能なエピトープが、Flagまたはヘモフィルスインフルエンザ菌エピトープである、請求項34に記載の方法。
  36. 前記細胞が哺乳動物細胞である、請求項1〜35のいずれか1項に記載の方法。
  37. 前記細胞がチャイニーズハムスター卵巣細胞(CHO)である、請求項36に記載の方法。
  38. 前記細胞がCHOK1細胞である、請求項37に記載の方法。
  39. 当該核酸が、抗体、生物製剤、エンドヌクレアーゼ、メチラーゼ、オキシドレダクターゼ、トランスフェラーゼ、ヒドロラーゼ、リサーゼ(Lysase)、イソメラーゼまたはリガーゼ、貯蔵ポリペプチド、輸送タンパク質、抗原または抗原決定基、保護または防御タンパク質、ホルモン、構造タンパク質、当該プロテアーゼまた合成ポリペプチドまたはその一部である、請求項1〜38のいずれか1項に記載の方法。
  40. 当該ポリペプチドを発現する細胞を識別する方法であって、
    (a)細胞内に当該ポリペプチドを発現させるステップであって、該ポリペプチドの発現が、レポータ核酸が増幅可能な核酸に結合されているレポーター核の発現と相関しているステップ、および
    (b)レポータ核酸の発現をモニタリングすることによって他の細胞の中から当該ポリペプチドを発現する細胞を識別するステップ、
    を含む方法。
  41. 当該ポリペプチドを分離する方法であって、
    (a)当該ポリペプチドの発現が増幅可能な核酸およびレポータ核酸の発現と相関し、かつ増幅可能な核酸およびレポータ核酸が結合するように当該ポリペプチドをコード化する核酸を有する構成物によって形質転換またはトランスフェクションするステップと、
    (b)増幅可能な核酸の発現を増大させるステップと、
    (c)レポータ核酸の生成物を発現する細胞を選択するステップと、
    (d)それらから当該ポリペプチドを分離するステップと、
    を含む方法。
  42. 増幅可能な核酸がMTをコード化する遺伝子である、請求項1〜41のいずれか1項に記載の方法。
  43. 前記レポータ核酸が、GFPまたはその誘導体をコード化する遺伝子である、請求項1〜42のいずれか1項に記載の方法。
  44. 前記MTおよびGFP遺伝子がインフレーム融合される、請求項43に記載の方法。
  45. 前記方法が、高レベルの当該生成物を生成する細胞の高処理選択のためのロボットスクリーニングおよび/またはプロトコルにおいて用いられる、請求項1〜44のいずれか1項に記載の方法。
  46. (a)当該核酸と、(b)レポータ核酸に結合された増幅可能な核酸とを含み、当該核酸のコピー数が増幅可能な核酸およびレポータ核酸のコピー数と相関する、細胞。
  47. 請求項46に記載の細胞内の当該核酸のコピー数を変化させる方法であって、増幅可能な核酸のコピー数を変化させる因子に細胞を曝露させるステップを含む方法。
  48. 構成物が細胞内に存在する場合、当該核酸のコピー数が増幅可能な核酸およびレポータ核酸のコピー数と相関するように、当該核酸およびレポータ核酸に結合された増幅可能な核酸を含む構成物。
  49. 請求項1〜45のいずれか1項に記載の方法によって識別される細胞。
  50. 請求項41に記載の方法によって分離される当該ポリペプチド。
JP2003532677A 2001-10-03 2002-10-03 増幅可能な遺伝子を用いる遺伝学的スクリーニングの方法 Pending JP2005503828A (ja)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
AUPR8051A AUPR805101A0 (en) 2001-10-03 2001-10-03 A method of genetic screening using an amplifiable gene
PCT/AU2002/001352 WO2003029461A1 (en) 2001-10-03 2002-10-03 A method of genetic screening using an amplifiable gene

Publications (1)

Publication Number Publication Date
JP2005503828A true JP2005503828A (ja) 2005-02-10

Family

ID=3831881

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
JP2003532677A Pending JP2005503828A (ja) 2001-10-03 2002-10-03 増幅可能な遺伝子を用いる遺伝学的スクリーニングの方法

Country Status (5)

Country Link
US (1) US20050142550A1 (ja)
EP (1) EP1451321A4 (ja)
JP (1) JP2005503828A (ja)
AU (2) AUPR805101A0 (ja)
WO (1) WO2003029461A1 (ja)

Families Citing this family (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US8273553B2 (en) * 2004-11-02 2012-09-25 Ares Trading S.A. Production of growth hormone in serum-free cell culture medium for mammalian cells
JP2008035701A (ja) * 2004-11-19 2008-02-21 Cellfree Sciences Co Ltd 無細胞タンパク質合成方法を用いた抗体検出方法及び特定タンパク質のスクリーニング方法
CN100432230C (zh) * 2006-05-11 2008-11-12 南京大学 一种金属硫蛋白融合表达方法及其应用
US8795981B2 (en) 2008-08-08 2014-08-05 Molecular Devices, Llc Cell detection
CN107338267A (zh) * 2016-05-03 2017-11-10 中国科学院深圳先进技术研究院 双顺反子表达载体及其构建方法与应用
US20210145946A1 (en) 2017-01-24 2021-05-20 Thoeris Gmbh Use of glutamine synthetase for treating hyperammonemia
CN114350625A (zh) * 2022-01-20 2022-04-15 杭州尚健生物技术有限公司 对抑制剂msx亲和力增强的谷氨酰胺合成酶突变体及其用途

Family Cites Families (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
ES2257303T3 (es) * 1999-07-12 2006-08-01 Genentech, Inc. Vectores de expresion y procedimientos.

Also Published As

Publication number Publication date
US20050142550A1 (en) 2005-06-30
AUPR805101A0 (en) 2001-10-25
AU2008221583A1 (en) 2008-10-16
EP1451321A4 (en) 2005-08-03
EP1451321A1 (en) 2004-09-01
WO2003029461A1 (en) 2003-04-10

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US10415055B2 (en) Enhanced expression and stability regions
US9944934B2 (en) Inducible eukaryotic expression system
EP2329020B1 (en) Cell surface display of polypeptide isoforms by stop codon readthrough
EP1196566B1 (en) Expression vectors and methods
JP4660046B2 (ja) 組換えタンパク質発現のためのベクターおよび方法
AU2008221583A1 (en) A method of genetic screening using an amplifiable gene
EA010863B1 (ru) Отбор клеток-хозяев, экспрессирующих белок на высоких уровнях
JP4817514B2 (ja) 新規動物細胞用ベクターおよびその使用
US20070054303A1 (en) Expression Vectors and Methods
JP7260510B2 (ja) 組み換え型タンパク質の効率的な選択性
JP4487068B2 (ja) 細胞の遺伝子変異機能の制御による変異タンパク質の作製方法
Bailey et al. High‐throughput clonal selection of recombinant CHO cells using a dominant selectable and amplifiable metallothionein‐GFP fusion protein
EP1293564A1 (en) Expression vector enabling screening of cells with high expression of recombinant protein, transformant with high expression of recombinant protein and utilization thereof
JP4528623B2 (ja) 迅速分解性レポーター融合タンパク質
JP2023062130A (ja) 標的タンパク質への検出可能なタグのCRISPR/Cas制御組み込みに基づく細胞の選択方法
Du et al. Analysis of heterogeneity and instability of stable mAb-expressing CHO cells
JP2002527060A (ja) 多様性を生み出す方法
TWI321152B (en) Expression vector, methods for the production of heterologous gene products and for the selection of recombinant cells producing high levels of such products
CA2608656A1 (en) Regulated vectors for selection of cells exhibiting desired phenotypes
JP2010514416A (ja) 新規な方法
AU2002331463A1 (en) A method of genetic screening using an amplifiable gene
TWI412590B (zh) 一種嵌合性內部核醣體進入區序列及其用途
CN112513279A (zh) 用于在重组酶介导的核酸序列向工程化的接受细胞发生盒交换整合期间追踪和操纵细胞的细胞表面标签交换(cste)系统
Wirth Isolation of recombinant cell clones exhibiting high-level expression of the introduced gene
Urech Screening for extracellular protein-protein interactions in a novel yeast growth selection system

Legal Events

Date Code Title Description
A621 Written request for application examination

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621

Effective date: 20050929

A131 Notification of reasons for refusal

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131

Effective date: 20080520

A601 Written request for extension of time

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A601

Effective date: 20080818

A602 Written permission of extension of time

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A602

Effective date: 20080825

A601 Written request for extension of time

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A601

Effective date: 20080917

A602 Written permission of extension of time

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A602

Effective date: 20080929

A601 Written request for extension of time

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A601

Effective date: 20081017

A602 Written permission of extension of time

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A602

Effective date: 20081024

A521 Request for written amendment filed

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523

Effective date: 20081120

A131 Notification of reasons for refusal

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131

Effective date: 20090609

A601 Written request for extension of time

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A601

Effective date: 20090909

A601 Written request for extension of time

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A601

Effective date: 20090909

A602 Written permission of extension of time

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A602

Effective date: 20090929

A601 Written request for extension of time

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A601

Effective date: 20091008

A601 Written request for extension of time

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A601

Effective date: 20091008

A602 Written permission of extension of time

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A602

Effective date: 20091026

A601 Written request for extension of time

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A601

Effective date: 20091106

A602 Written permission of extension of time

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A602

Effective date: 20091118

A02 Decision of refusal

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A02

Effective date: 20100223