JP2005503114A - 核酸分子の電荷タグと分離方法 - Google Patents

核酸分子の電荷タグと分離方法 Download PDF

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Abstract

本発明は、陽性および中性荷電化合物を含む新規ホスホアミダイトに関する。本発明はまた、電荷タグが材料の実効電荷を増加または減少させる、固相支持体および核酸を含む材料に結合するための電荷タグを提供する。本発明はさらに、改変材料と非改変材料のあいだの電荷の差に基づいて分子を分離および特徴を調べる方法を提供する。

Description

【技術分野】
【０００１】
本発明は、その全文が参照として本明細書に組み入れられる、米国特許第6,001,567号の継続出願である係属中の米国特許出願第09/333,145号の一部継続出願である。
【０００２】
発明の分野
本発明は、陽性および中性荷電化合物を含む新規ホスホアミダイト（phosphoramidite）に関する。本発明はまた、電荷タグが材料の実効電荷を増加または減少させる、固相支持体および核酸を含む材料に結合させるための電荷タグを提供する。本発明はさらに、改変材料と非改変材料のあいだの電荷の差に基づいて分子を分離して特徴を調べる方法を提供する。
【背景技術】
【０００３】
発明の背景
特殊な核酸配列および配列変種を検出して特徴を調べる方法は、感染症の指標としてウイルスまたは細菌の核酸配列の有無を検出するために、ならびに疾患および癌に関連する遺伝子の変種または対立遺伝子の有無を検出するために用いられている。これらの方法はまた、法医学分析または父子鑑定のためのような、核酸起源を同定するためにも適用される。特殊な核酸配列および配列変種を検出して特徴を調べるために用いてもよい様々な方法が当技術分野で知られている。それにもかかわらず、ヒトゲノムのみならず病原性生物のような多数の他の生物のゲノムの核酸シークエンシングの完了によって、迅速で信頼でき、費用効果が高く、ユーザーが用いやすい、特殊な核酸配列の検出試験はますます必要となっている。重要なことに、これらの試験は、関係する配列の非常に少ないコピーを含む試料から検出可能なシグナルを生成することができなければならない。
【０００４】
特殊な核酸配列の特徴を調べるために多くの技術が開発されている。検出技術の例には、Gelfandらの米国特許第5,210,015号（その開示が参照として本明細書に組み入れられる）に記載される「TaqMan」またはニックトランスレーションPCRアッセイ、Urdeaの米国特許第4,775,619号および第5,118,605号（それらの開示が参照として本明細書に組み入れられる）に記載されるアッセイ、WalderおよびWalderの米国特許第5,403,711号に記載される触媒的ハイブリダイゼーション増幅アッセイ（その開示が参照として本明細書に組み入れられる）、Duckらの米国特許第4,876,187号および第5,011,769号に記載されるサイクリングプローブアッセイ、Westernらの米国特許第6,110,677号および第6,121,001号（その開示が参照として本明細書に組み入れられる）に記載される標的触媒オリゴヌクレオチド改変アッセイ、米国特許第5,952,174号のOrchid BioscienceのSNP検出法（その開示が参照として本明細書に組み入れられる）、Ullmanらの米国特許第5,882,867号（その開示が参照として本明細書に組み入れられる）の方法、MullisおよびMullisらの米国特許第4,683,195号、第4,683,202号、および第4,965,188号（その開示が参照として本明細書に組み入れられる）に記載されるポリメラーゼ連鎖反応（PCR）、ならびにBirkenmeyerらおよびBaranyらの米国特許第5,427,930号および第5,494,810号（その開示が参照として本明細書に組み入れられる）に記載されるリガーゼ連鎖反応（LCR）が含まれる。上記の例は、核酸に基づく検出アッセイを説明することを意図しており、網羅的なリストを提供するのではない。これらの技術のそれぞれは、所望の標的核酸を示す反応産物を検出するための検出段階を必要とする（例えば、切断産物、伸長産物等の検出）。検出法の感度、速度、および費用を改善するためにアッセイ法および検出機器に多くの進歩がなされているが、当技術分野には、アッセイをより感度よく有効にするために、さらに改善された方法、組成物、およびシステムがなお必要である。
【発明の開示】
【０００５】
発明の概要
本発明は、陽性および中性荷電化合物を含む新規ホスホアミダイトに関する。本発明はまた、電荷タグが材料の実効電荷を増加または減少させる、固相支持体および核酸を含む材料に結合させるための電荷タグを提供する。本発明はさらに、改変材料と非改変材料のあいだの電荷の差に基づいて分子を分離して特徴を調べる方法を提供する。
【０００６】
例えば、本発明は、核酸分子（例えば、核酸分子の末端）に結合した電荷タグを含む組成物を提供する。いくつかの態様において、電荷タグはホスフェート基と陽性荷電部分とを含む。いくつかの好ましい態様において、電荷タグはさらに色素を含む。本発明は、電荷タグの個々の基本単位成分の位置に限定されない。例えば、いくつかの態様において、色素は、核酸と陽性荷電部分のあいだに存在するが、他の態様において、陽性荷電部分は、核酸と色素のあいだに存在する。本発明はまた、電荷タグにおけるそれぞれのタイプの成分の数に制限されない（例えば、色素、陽性荷電部分等の数）。例えば、いくつかの態様において、電荷タグは第一および第二の陽性荷電部分を含む。
【０００７】
本発明のいくつかの態様において、電荷タグは実効陽電荷を有する。例えば、いくつかの態様において、電荷タグは、1、2、3価等の実効陽電荷を有する。いくつかの態様において、電荷タグは、特定の反応条件（例えば、pH 6〜10）に限って陽電荷を有する。
【０００８】
いくつかの態様において、電荷タグはさらに一つまたはそれ以上のヌクレオチドを含む。いくつかの態様において、電荷タグが結合する核酸分子は、標的核酸に対して相補的な配列を含む。いくつかのそのような態様において、電荷における一つまたはそれ以上のヌクレオチドは、標的核酸と相補的ではない。他のそのような態様において、核酸は、電荷タグが核酸の第二の部分（例えば、第二の部分に存在する核酸の末端）に結合している、標的核酸と相補的な第一の部分と該標的核酸と相補的でない第二の部分とを含む。
【０００９】
本発明のいくつかの態様において、核酸および電荷タグは、単離された電荷タグが実効陽電荷を有する、複合的な実効中性電荷を有する。他の態様において、核酸および電荷タグは、電荷タグが実効陽電荷を有する、複合的な実効陰電荷を有する。
【００１０】
本発明は、電荷タグの陽性荷電部分の特性に限定されない。陽性荷電部分には、一級アミン、二級アミン、三級アミン、アンモニウム基、陽性荷電金属基（例えば、連結基を通して電荷タグに結合したケージドイオン）等が含まれるがこれらに限定されない。
【００１１】
いくつかの態様において、電荷タグはさらに、陽性荷電ホスホアミダイトまたは中性ホスホアミダイトを含む。本発明は、陽性荷電ホスホアミダイトまたは中性ホスホアミダイトの性質に限定されない。例えば、いくつかの態様において、電荷タグは、本発明の新規ホスホアミダイトを含む。
【００１２】
例えば、本発明は、陽性荷電ホスホアミダイトを含む組成物を提供する。いくつかの態様において、陽性荷電ホスホアミダイトは、一級アミン基、二級アミン基、三級アミン基、アンモニウム基、荷電金属イオン等を含むがこれらに限定されない一つまたはそれ以上の陽性荷電部分を含む。いくつかの態様において、ホスホアミダイトは、１価の実効陽性電荷を有する。いくつかの特に好ましい態様において、ホスホアミダイトは以下の構造を有する：
【化３】
Figure 2005503114
式中、Xは、反応性ホスフェート基（例えば、PO4）であって、Yは保護基（例えば、ジメトキシトリチル[DMT]）および／または保護された基（例えば、DMT-保護ヒドロキシル基）である。
【００１３】
本発明はさらに、陽性または中性荷電ホスホアミダイトを含む核酸分子を含む組成物を提供する。本発明はまた、電荷タグが陽性荷電または中性荷電ホスホアミダイトを含む、核酸分子の末端に結合した電荷タグを含む組成物を提供する。いくつかの好ましい態様において、陽性荷電ホスホアミダイトは、もう一つの分子（ホスホアミダイト以外の分子）にさらに結合していないアミン基を含む。
【００１４】
本発明はさらに、中性荷電ホスホアミダイトを含む組成物を提供する。いくつかの好ましい態様において、中性荷電ホスホアミダイトは、一級アミン、二級アミン、三級アミン、アンモニウム基、荷電金属イオンを含む群より選択される窒素含有化学基を含む。いくつかの態様において、組成物はさらに、中性荷電ホスホアミダイトに結合した核酸分子を含む。いくつかの好ましい態様において、核酸分子は、中性荷電ホスホアミダイトを含む電荷タグに結合している。電荷タグはさらに、他の成分を如何なる順序で含んでもよい。例えば、電荷タグはさらに陽性荷電ホスホアミダイトを含んでもよい。本発明のいくつかの態様において、中性荷電ホスホアミダイトを含む電荷タグは、実効陽電荷を有する。本発明のいくつかの特に好ましい態様において、中性荷電ホスホアミダイトは以下の構造を有する：
【化４】
Figure 2005503114
式中、Xは、保護基（例えば、ジメトキシトリチル[DMT]基）および／または保護される基（例えば、DMT保護ヒドロキシル基）であり、Zは、反応性ホスフェートであって、ならびにNはアミン基を含む。いくつかの好ましい態様において、N基はN-(CH2)n-CH3であり、式中、nは0または1〜12の正の整数である。
【００１５】
本発明はまた、電荷タグに結合した固相支持体を含む組成物を提供する。例えば、いくつかの態様において、電荷タグは陽性荷電部分と、電荷タグを核酸分子に共有結合させるように形成された反応基とを含む。本明細書に記載の電荷タグの如何なるものも、固相支持体に結合してもよい。
【００１６】
本発明はさらに、ホスフェート基がアミン基に直接結合している、ホスフェート基に直接結合した蛍光色素を含む組成物を提供する。いくつかの態様において、組成物は、蛍光色素が電荷タグ内に含まれる、電荷タグを含む。本発明は、蛍光色素の性質に制限されない。しかし、いくつかの好ましい態様において、蛍光色素はCy色素（例えば、Cy3）を含む。
【００１７】
本発明はまた、電荷タグに結合した複数のオリゴヌクレオチドを含む混合物も提供する。いくつかの態様において、それぞれのオリゴヌクレオチドは、異なる電荷タグに結合している。他の態様において、二つまたはそれ以上の異なるオリゴヌクレオチドは、同じタイプの電荷タグを有する。いくつかの好ましい態様において、電荷タグのそれぞれは、ホスフェート基と陽性荷電部分とを含む。異なる電荷タグに結合したオリゴヌクレオチドの数に制限されないが、いくつかの態様において、複数のオリゴヌクレオチドは、それぞれが異なる電荷タグに結合した、四つまたはそれ以上のオリゴヌクレオチド（例えば、5、6、7、・・・、10、・・・、50、・・・、100、・・・）を含む。本明細書に記載の如何なる電荷タグも混合物において用いることを意図している。
【００１８】
本発明はさらに、以下の段階を含む、核酸分子を分離する方法を提供する：a）電荷不平衡オリゴヌクレオチドが反応混合物に含まれる、電荷タグを含む電荷不平衡オリゴヌクレオチドが生成される条件で、電荷タグを含む電荷平衡オリゴヌクレオチドを処置する段階、およびb）反応混合物から電荷不平衡オリゴヌクレオチドを分離する段階。本発明は、それによって電荷不平衡オリゴヌクレオチドが生成される手段に制限されないが、いくつかの好ましい態様において、オリゴヌクレオチドを、反応物質（例えば、ヌクレアーゼ）によって処置する。本明細書に記載の如何なる電荷タグも方法において用いることが意図される。本発明は、分離段階の性質に制限されないが、意図される分離段階には、ゲル電気泳動分離、キャピラリー電気泳動分離、キャピラリーゾーン電気泳動分離が含まれるがこれらに限定されず、分離はマイクロチャンネルである。
【００１９】
本発明はまた、以下の段階を含む、核酸分子を分離する方法を提供する：a）電荷不平衡オリゴヌクレオチドが反応混合物に含まれる、電荷タグを含む二つまたはそれ以上の電荷不平衡オリゴヌクレオチドが生成される条件で、それぞれが異なる電荷タグを含む複数の電荷平衡オリゴヌクレオチドを処置する段階；およびb）反応混合物から電荷不平衡オリゴヌクレオチドを分離する段階。いくつかの好ましい態様において、分離する段階は、異なる電荷タグを含む電荷不平衡オリゴヌクレオチドが互いに分離されるように、電荷不平衡オリゴヌクレオチドを分離することを含む。電荷タグ、オリゴヌクレオチド混合物および本明細書に記載の分離方法の如何なるものも、この方法と共に用いてもよい。
【００２０】
定義
本発明が容易に理解できるように、多くの用語および句を下記に定義する：
【００２１】
「電荷平衡」分子またはオリゴヌクレオチドという用語は、改変された分子またはオリゴヌクレオチドの大きさが減少するか（例えば、切断される、短縮される、解離する、結合が外れる、もしくはそうでなければそれがより小さい集合分子量を有する複合体もしくは分子の一部となるように変化している）、または大きさが増加する（例えば、拡大、伸長、会合、結合、またはそれがより大きい集合分子量を有する複合体または分子の一部となるように変化している）場合に、得られた産物が、投入された分子またはオリゴヌクレオチドとは異なる実効電荷または電荷質量比を有し（得られた分子はこのように、「電荷不平衡」分子またはオリゴヌクレオチドである）、それによって投入されて反応した分子またはオリゴヌクレオチドの電荷に基づく分離を行うことができるように、改変された分子またはオリゴヌクレオチドが電荷を有するように改変されている分子またはオリゴヌクレオチド（反応において投入されたオリゴヌクレオチド）を意味する。「電荷平衡」という用語は、改変されたまたは平衡な分子またはオリゴヌクレオチドが実効中性電荷を有することを意味しない（しかし、これもありうる）。電荷平衡は、この投入分子またはオリゴヌクレオチドから生成された特異的反応産物が、投入分子またはオリゴヌクレオチドからの電荷に基づいて分離できるような分子またはオリゴヌクレオチドのデザインおよび改変を意味する。
【００２２】
例えば、プローブオリゴヌクレオチドが以下の配列：
Figure 2005503114
（すなわち、改変塩基を有しない配列番号：1）を有し、プローブの切断が第二の残基と第三の残基のあいだで起こるINVADERオリゴヌクレオチド方向切断アッセイにおいて、このオリゴヌクレオチドについて可能性がある一つの電荷平衡型は、おそらく
Figure 2005503114
であろう。この改変オリゴヌクレオチドは、実効陰電荷を有する。切断後、以下のオリゴヌクレオチドが生成される：
Figure 2005503114
（配列番号：1の残基3〜22位）。5'-Cy3-アミノT-アミノ-T3'は、検出可能な部分（陽性荷電Cy3色素）と二つのアミノ改変塩基とを有する。アミノ改変塩基およびCy3色素は、ホスフェート基によって貢献される大量の陰電荷において陽電荷に寄与し、このように、5'Cy3-アミノT-アミノ-T3'オリゴヌクレオチドは実効陽電荷を有する。他のより長い切断断片は、投入プローブと同様に、実効陰電荷を有する。5'Cy3-アミノT-アミノ-T3'断片は、投入プローブ（電荷平衡オリゴヌクレオチド）からの電荷に基づいて分離可能であるため、これは電荷不平衡オリゴヌクレオチドと呼ばれる。より長い切断産物は一般的に、双方のオリゴヌクレオチドが実効陰電荷を有することから、投入オリゴヌクレオチドからの電荷に基づいて分離されない。
【００２３】
改変オリゴヌクレオチドを含む分子またはオリゴヌクレオチドに関連して用いられる「実効中性電荷」という用語は、存在する電荷（例えば、チミジン上のR-NH3 +基、シトシンのN3窒素、ホスフェート基の有無等）の合計が、所望の反応または分離条件で本質的にゼロであることを意味している。実効中性電荷を有する分子またはオリゴヌクレオチドは、電場を移動しないであろう。
【００２４】
改変オリゴヌクレオチドを含む分子またはオリゴヌクレオチドに関連して用いられる「実効陽電荷」という用語は、存在する電荷（例えば、チミジン上のR-NH3 +基、シトシンのN3窒素、ホスフェート基の有無等）の合計が、所望の反応条件で+1またはそれ以上であることを意味している。実効陽電荷を有する分子またはオリゴヌクレオチドは、電場の中を陰極方向に移動するであろう。
【００２５】
改変オリゴヌクレオチドを含む分子またはオリゴヌクレオチドに関連して用いられる「実効陰電荷」という用語は、存在する電荷（例えば、チミジン上のR-NH3 +基、シトシンのN3窒素、ホスフェート基の有無等）の合計が、所望の反応条件で-1またはそれ以下であることを意味している。実効陰電荷を有する分子またはオリゴヌクレオチドは、電場の中を陽極方向に移動するであろう。
【００２６】
本明細書において用いられるように、「相補的」または「相補性」という用語は、塩基対形成規則によって関連するポリヌクレオチドに関連して用いられる（すなわち、オリゴヌクレオチドまたは標的核酸のようなヌクレオチド配列）。例えば、配列「5'-A-G-T-3'」は、配列「3'-T-C-A-5'」と相補的である。相補性は、核酸塩基のごくいくつかが塩基対形成規則に従ってマッチする「部分的」であってもよい。または核酸のあいだに「完全な」または「全体的な」相補性が存在してもよい。核酸の鎖のあいだの相補性の程度は、核酸の鎖のあいだのハイブリダイゼーションの有効性および強度に対して有意な作用を有する。これは、増幅反応のみならず核酸間の結合に依存する検出方法において特に重要である。いずれかの用語はまた、特にポリヌクレオチドの意味において個々のヌクレオチドに関連して用いてもよい。例えば、オリゴヌクレオチド内の特定のヌクレオチドは、オリゴヌクレオチドの残りと核酸鎖とのあいだの相補性と対比または比較した場合に、もう一つの核酸鎖内のヌクレオチドに対するその相補性のために、または相補性がないために注目してもよい。
【００２７】
「相同性」または「相同な」という用語は、同一性の程度を意味する。部分的相同性または完全な相同性であってもよい。部分的に相同な配列は、もう一つの配列に対する同一性が100％未満である配列である。
【００２８】
本明細書において用いられるように、「ハイブリダイゼーション」という用語は、相補的な核酸の塩基対形成に関連して用いられる。ハイブリダイゼーションおよびハイブリダイゼーション強度（すなわち、核酸のあいだの会合強度）は、核酸のあいだの相補性の程度、関係する条件のストリンジェンシー、および形成されたハイブリッドのTmのような要因によって影響を受ける。「ハイブリダイゼーション」法は、一つの核酸をもう一つの相補的な核酸、すなわち相補的なヌクレオチド配列を有する核酸にアニーリングすることを含む。相補的な配列を含む核酸の二つのポリマーが互いを発見して、塩基対形成相互作用に基づいてアニーリングできることは、十分に認識された現象である。MarmurおよびLane、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 46：453（1960）およびDotyら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 46：461（1960）による「ハイブリダイゼーション」プロセスが最初に発見された後、このプロセスは改良を加えられ、現代生物学の必須のツールとなった。
【００２９】
相補性に関して、ハイブリダイゼーションが完全または部分的相補性を表すか否かを決定することは、いくつかの診断的応用にとって重要である。例えば、病原性DNA（ウイルス、細菌、真菌、マイコプラズマ、原虫由来のような）の有無を単純に決定することが望ましい場合、ハイブリダイゼーション法は、関連する配列が存在する場合のハイブリダイゼーションを確実にすることのみが重要である：部分的に相補的なプローブと完全に相補的なプローブの双方がハイブリダイズする条件を選択することができる。しかし、ハイブリダイゼーション法が部分的相補性と完全な相補性とを区別する他の診断応用を必要としてもよい。遺伝子多型性を検出することは興味深いかも知れない。例えば、ヒトヘモグロビンは一部分四つのポリペプチド鎖から構成される。これらの鎖の二つは、アミノ酸141個の同一の鎖（α鎖）であり、これらの鎖の二つは、アミノ酸146個の同一の鎖（β鎖）である。β鎖をコードする遺伝子は多型性を示すことが知られている。正常な対立遺伝子は、第6位にグルタミン酸を有するβ鎖をコードする。変異体対立遺伝子は、第6位でバリンを有するβ鎖をコードする。アミノ酸のこのような差は、鎌状赤血球性貧血として臨床的に知られる強い（個体が変異体対立遺伝子に関してホモ接合である場合に最も強い）生理学的影響を有する。アミノ酸の変化の遺伝的基礎は、正常な対立遺伝子DNA配列と変異体対立遺伝子DNA配列との一塩基の差を含む。
【００３０】
本明細書において用いられる核酸配列の相補体は、一つの配列の5'末端が他の配列の3'末端と対を形成するように核酸配列と並置した場合に、「逆平行会合」にあるオリゴヌクレオチドを意味する。天然の核酸において一般的に認められない特定の塩基を、本発明の核酸に含めてもよく、それらには例えば、イノシンおよび7-デアザグアニンが含まれる。相補性は完全である必要はない；安定な二本鎖は、ミスマッチ塩基対または非マッチ塩基を含んでもよい。核酸技術の当業者は、例えば、オリゴヌクレオチドの長さ、オリゴヌクレオチドの塩基組成および配列、イオン強度およびミスマッチ塩基対の発生率を含む多様な変数を経験的に考慮して二本鎖の安定性を決定することができる。
【００３１】
本明細書において用いられるように、「Tm」という用語は、「融解温度」に関連して用いられる。融解温度は、二本鎖核酸分子の集団が一本鎖に半分解離するようになる温度である。核酸のTmを計算するためのいくつかの等式は当技術分野で周知である。標準的な参考文献によって示されるように、Tm値の単純な推定値は、核酸が1 M NaClの水溶液中に存在する場合、以下の等式によって計算してもよい：Tm＝81.5＋0.41（％G＋C）（例えば、AndersonおよびYoung、Quantitative Filter Hybridization、Nucleic Acid Hybridization（1985）を参照のこと）。他の参考文献（例えば、Allawi, H.T.およびSantaLucia, J., Jr、Thermodynamics and NMR of internal G.T mismatches in DNA、Biochemistry 36、10581〜94（1997））には、配列特徴と共に構造および環境特徴をTmの計算に考慮に入れる、より洗練された計算が含まれる。
【００３２】
本明細書において用いられるように、「ストリンジェンシー」という用語は、核酸ハイブリダイゼーションが行われる温度、イオン強度、および他の化合物の存在の条件に関連して用いられる。「高ストリンジェンシー」条件では、核酸の塩基対形成は、高頻度の相補的塩基配列を有する核酸断片のあいだに限って起こるであろう。このように、「弱い」または「低い」ストリンジェンシー条件は、もう一つの核酸に対して完全に相補的ではない核酸を共にハイブリダイズまたはアニーリングすることが望ましい場合にしばしば必要である。
【００３３】
本明細書において用いられる「オリゴヌクレオチド」という用語は、二つまたはそれ以上のデオキシリボヌクレオチドまたはリボヌクレオチド、好ましくは少なくとも約5ヌクレオチド、より好ましくは少なくとも約10〜15ヌクレオチド、およびより好ましくは少なくとも約15〜30ヌクレオチドを含む分子として定義される。正確な大きさは多くの要因に依存し、これはオリゴヌクレオチドの最終的な機能または用途に依存する。オリゴヌクレオチドは、化学合成、DNA複製、逆転写、PCR、またはその組み合わせを含む如何なる方法で生成してもよい。
【００３４】
モノオリゴヌクレオチドは一つのモノヌクレオチド五炭糖環の5'ホスフェートが、ホスホジエステル結合によって一つの方向にその隣接する3'酸素に結合するようにオリゴヌクレオチドを生成するように反応するため、オリゴヌクレオチドの末端は、5'ホスフェートがモノヌクレオチド五炭糖環の3'酸素に結合していなければ「5'末端」と呼ばれ、その3'酸素がその後のモノヌクレオチド五炭糖環の5'ホスフェートに結合していないければ、「3'末端」と呼ばれる。本明細書において用いられるように、核酸配列は、より大きいオリゴヌクレオチドに対して内部であっても、同様に5'および3'末端を有すると言ってもよい。核酸鎖に沿った第一の領域は、核酸の鎖に沿って5'から3'方向に移動する場合に、第一の領域の3'末端が第二の領域の5'末端の前であればもう一つの領域の上流であると言われる。
【００３５】
本明細書において用いられるように「標識」という用語は、検出可能な（好ましくは定量可能な）シグナルを提供するために用いることができる、そして核酸または蛋白質に結合することができる如何なる原子または分子も意味する。標識は、蛍光、放射活性、比色法、重力測定、X-線回折または吸収、磁気学、酵素活性等によって検出可能なシグナルを提供してもよい。標識は、荷電部分（陽もしくは陰電荷）であってもよく、または中性電荷であってもよい。標識は、標識を含む配列が検出可能である限り、核酸または蛋白質配列を含みうる、またはそれらからなりうる。
【００３６】
本明細書および請求の範囲における「試料」という用語は、その最も広い意味において用いられる。一方、これには、標本または培養物（例えば、微生物培養物）が含まれることを意味する。一方、これには、生物試料と環境試料の双方が含まれることを意味する。試料には、合成起源の標本が含まれてもよい。
【００３７】
生物試料は、ヒトを含む動物、液体、固体（例えば、便）または組織と共に、液体および固体の食物ならびに飼料および乳製品、野菜、肉、および肉副産物のような成分、および廃棄物であってもよい。生物試料は、有蹄類、クマ、魚類、ウサギ類、齧歯類等のような動物を含むがこれらに限定されない、野生（feral）または野生動物と共に家畜動物の様々な家系の全てから得てもよい。
【００３８】
環境試料には、表面物質、土壌、水、および工業試料のような環境材料と共に、食品および乳製品加工機器、装置、備品、器具、使い捨ておよび非使い捨て器具から得られた試料が含まれる。これらの例は、本発明に適用可能である試料のタイプを制限すると解釈してはならない。
【００３９】
「標的核酸起源」という用語は、核酸（RNAまたはDNA）を含む如何なる試料も意味する。特に好ましい標的核酸源は、培養物、血液、唾液、脳脊髄液、腹腔液、乳汁、リンパ、喀痰、精液、および動物または植物組織を含むがこれらに限定されない生体試料である。
【００４０】
本明細書において用いられるように、「電荷タグ」という用語は、電荷タグが、他の分子の実効電荷とは異なる実効電荷を有する、もう一つの分子に結合した、または結合される基本単位の化学複合体を意味する。例えば、電荷タグは、核酸分子（例えば、核酸分子の末端）に結合してもよい。電荷タグは、色素、リンカー基、ヌクレオチド、ホスホアミダイト、ホスホネート、ホスフェート基、アミン基、蛍光消光基等を含むがこれらに限定されない如何なる数の所望の成分も含む。
【００４１】
「それぞれのオリゴヌクレオチドが異なる電荷タグに結合した複数のオリゴヌクレオチドを含む混合物」において、二つまたはそれ以上のオリゴヌクレオチドはそれぞれ、電荷タグの化学構造が互いに異なる、異なる電荷タグを有する。それぞれが異なる電荷タグを有するオリゴヌクレオチドの混合物もまた、さらなるオリゴヌクレオチドを含んでもよい。例えば、混合物は、同一の第一の電荷タグをそれぞれが有する第一の組のオリゴヌクレオチドと、同一の第二の電荷タグをそれぞれが有する第二の組のオリゴヌクレオチドとを含んでもよい。
【００４２】
本明細書において用いられるように、「陽性荷電部分」とは、実効陽電荷を含む化学基または分子を意味する。陽性荷電部分は、他の分子または材料に結合または会合してもよい。陽性荷電部分を含む組成物は、それ自身、実効陽電荷を有してもよいが（陽性荷電部分またはその他のために）、必ずしもその必要はない。本発明のいくつかの態様において、陽性荷電部分には、アミン（例えば、一級、二級、および三級アミン）が含まれるがこれらに限定されない。例えば、本発明のいくつかの態様において、ホスホアミダイトは、アミンを含む陽性荷電部分を含む。アミン基はしばしば、一つまたはそれ以上の分子に結合させるため（例えば、ホスホアミダイトをもう一つの分子に結合させる）の結合化学基として用いられる。しかし、本発明のいくつかの態様において、アミン基は、連結基として用いられず、分子に陽電荷を与えるために提供される。このように、いくつかの態様において、アミンは関係する分子（例えば、ホスホアミダイト）に結合するが、もう一つの分子にはこれ以上結合しない（例えば、ホスホアミダイト以外の分子に結合しない）。
【００４３】
本明細書において用いられるように、「色素」という用語は、分子、化合物、または光学的に検出可能なシグナルを提供することができる物質を意味する（例えば、蛍光、発光、比色等）。例えば、色素には、核酸分子に関連しうる蛍光分子（例えば、Cy3）が含まれる。
【００４４】
本明細書において用いられるように、「保護基」という用語は、化合物の化学改変または化合物の特定の化学基の改変を防止するために化合物に共有結合される分子または化学基を意味する。例えば、保護基は、例えば、反応基が分子内反応を含む化学反応に関与しないように化合物の反応基に結合してもよい。場合によっては、保護基は、所望の合成反応において分子をもう一つの分子に加えると、保護基が失われ、反応基を化合物との共有結合に関与させるように、脱離基として作用してもよい。本発明のホスホアミダイトは典型的に、核酸分子に添加する前に一つまたはそれ以上の保護基を含む。例えば、ホスホアミダイトの反応ホスフェート（すなわち、ホスホアミダイトを他の分子に添加した場合にもう一つの分子に共有結合するホスフェート基）は一つまたはそれ以上の保護基を含んでもよい。ホスホアミダイトおよび核酸分子に対するその添加に関する詳細な記述は、その全文が参照として本明細書に組み入れられる、BeaucageおよびIyer（Tetrahedron 49：1925[1993]）に提供される。
【００４５】
本明細書において用いられるように、「固相支持体」または「支持体」という用語は、それに対してもう一つの材料を結合する固体または半固体構造を提供する如何なる材料も意味する。そのような材料には、なめらかな支持体（例えば、金属、ガラス、プラスチック、シリコン、およびセラミクス表面）と共に織物材料および多孔性材料が含まれる。そのような材料にはまた、ゲル、ゴム、ポリマー、および他の非堅固材料が含まれるがこれらに限定されない。固体支持体は平坦である必要はない。支持体には、球状（例えば、ビーズ）を含む如何なるタイプの形状も含まれる。固相支持体に結合した材料は、固相支持体の如何なる部分に結合してもよい（例えば、多孔性の固相支持体材料の内部部分に結合してもよい）。本発明の好ましい態様は、固相支持体に結合した核酸分子、電荷タグ、および蛋白質のような生体分子を有する。生物材料は、それがランダムでない化学または物理的相互作用によって固相支持体に会合している場合に、固相支持体に「結合」している。いくつかの好ましい態様において、結合は共有結合によって行われる。しかし、結合は共有結合または永続的である必要はない。いくつかの態様において、材料は「スペーサー分子」または「リンカー基」を通して固相支持体に結合する。そのようなスペーサー分子は、生物材料に結合する第一の部分と固相支持体に結合する第二の部分とを有する分子である。このように、固相支持体に結合する場合、スペーサー分子は、固相支持体と生物材料とを隔てるが、双方に結合している。
【００４６】
本明細書において用いられるように、二つの分子に関連して「直接結合した」という用語は、親分子の一部ではない如何なる介在連結基またはスペーサー基も存在しない、二つの分子間の共有結合を意味する。
【００４７】
本明細書において用いられるように、「連結基」および「リンカー基」は、二つの実体（例えば、固相支持体、オリゴヌクレオチド、または他の分子）を連結または結合するが、個々に連結した実体のいずれかの一部ではない原子または分子を意味する。
【００４８】
本明細書において用いられるように、電荷平衡分子から電荷不平衡分子を作製するために用いられる物質を参照する場合の「反応物質」という用語は、電荷不平衡分子が生成されるように電荷平衡分子を変化させることができる如何なる物質（例えば、酵素、化学、物理装置等）も意味する。
【００４９】
本明細書において用いられるように、「キャピラリー電気泳動」、「キャピラリーゾーン電気泳動」および「マイクロフルード」法は、本発明の分離方法において用いられる方法を意味する。キャピラリー電気泳動、キャピラリーゾーン電気泳動およびマイクロフルード法は、Baker（1995）Capillary Electrophoresis、Wiley-Interscience、ニューヨーク、ニューヨーク州、Weinberger（2000）Capillary Electrophoresis、第二版、アカデミック出版、サンディエゴ、カリフォルニア州、Atamnaら、J. Liq. Chromatogr. 13：2517（1990）、Nishiら、Anal. Chem. 61：2434（1989）、Terabeら、Anal. Chem. 56：111（1984）、Bousseら、Annu. Rev. Biophys. Biomol. Struct. 29：155（2000）、およびそのそれぞれの全文が参照として本明細書に組み入れられる、米国特許第5,916,426号、第5,807,682号、第5,703,222号、第5,470,705号、第5,777,096号、および第5,514,543号を含むがこれらに限定されないテキストおよび雑誌に記載されている。
【００５０】
本明細書において用いられるように、「キット」という用語は、材料を輸送するための如何なる輸送システムも意味する。反応アッセイの意味において、そのような輸送システムには、反応試薬（例えば、オリゴヌクレオチド、酵素等を適用な容器において）および／または支持材料（例えば、緩衝液、アッセイを行うための書面での説明書等）のある場所から他の場所への保存、移動、または輸送を可能にするシステムが含まれる。例えば、キットには、関連する反応試薬および／または支持材料を含む一つまたはそれ以上の封入物（例えば、箱）が含まれる。本明細書において用いられるように、「断片化キット」という用語は、それぞれがキット全体の成分の一部を含む二つまたはそれ以上の異なる容器を含む輸送システムを意味する。容器は、意図するレシピエントに共にまたは個別に輸送してもよい。例えば、第一の容器はアッセイにおいて用いられる酵素を含んでもよく、第二の容器はオリゴヌクレオチドを含む。「断片化キット」という用語は、米国食品医薬品化粧品法第520(e)項の下に規制された分析物特異的試薬（ASR's）を含むキットを含むと解釈されるが、これに限定されない。実際に、キット全体の成分の一部をそれぞれが含む二つまたはそれ以上の異なる容器を含む如何なる輸送システムも、「断片化キット」という用語に含まれる。対照的に、「複合キット」は、単一の容器（例えば、所望の成分のそれぞれを収納する単一の箱）に反応アッセイの成分全てを含む輸送システムを意味する。「キット」という用語には、断片化キットと複合キットの双方が含まれる。
【００５１】
発明の説明
上記のように、いくつかの核酸に基づく検出アッセイは、オリゴヌクレオチドプローブの伸長および／または短縮を伴う。例えば、本明細書に記載するように、プライマー方向、プライマー非依存、およびINVADER方向切断アッセイと共に「ニブリング」アッセイは、全て標的核酸配列の存在を検出するための手段としてオリゴヌクレオチドの切断（すなわち、短縮）を伴う。オリゴヌクレオチドプローブの短縮を伴う他の検出方法の例には、「TaqMan」、またはニックトランスレーションPCRアッセイ、Urdeaの米国特許第4,775,619号、および第5,118,605号に記載のアッセイ、WalderおよびWalderによって記載される触媒的ハイブリダイゼーション増幅アッセイ、Duckらのサイクリングプローブアッセイ、およびWesternの標的触媒オリゴヌクレオチド改変アッセイが含まれる。オリゴヌクレオチドプローブ（またはプライマー）の伸長を伴う検出アッセイの例には、米国特許第5,952,174号のOrchid BioscienceのSNP検出法、Ullmanらの米国特許第5,882,867号の方法、ポリメラーゼ連鎖反応（PCR）、およびリガーゼ連鎖反応（LCR）が含まれる。上記の例は、オリゴヌクレオチドプローブの伸長および／または短縮を伴う核酸に基づく検出アッセイの説明を意図しており、網羅的なリストを提供しない。
【００５２】
典型的に、オリゴヌクレオチドプローブの伸長および／または短縮を伴う核酸に基づくアッセイは、反応産物を検出するために反応後分析を必要とする。特異的反応産物を、投入または未反応オリゴヌクレオチドプローブを含む他の反応成分から分離しなければならないことが一般的である。一つの検出技術は、反応および未反応オリゴヌクレオチドプローブの電気泳動による分離を伴う。アッセイがプローブの切断または短縮を伴う場合、未反応産物は反応または切断産物より長いであろう。アッセイがプローブ（またはプライマー）の伸長を伴う場合、反応産物は未反応プローブより長さが長いであろう。長さが異なる核酸分子を含む試料のゲルに基づく電気泳動は、これらの断片を主に大きさに基づいて分離する。これは、中性またはアルカリ性のpHを有する溶液中では、広く異なる大きさ（すなわち分子量）を有する核酸は、非常に類似の荷電対質量比を有し、荷電のみに基づいて分離できない（Andrews、Electrophoresis、第二版、オックスフォード大学出版（1986）、153〜154頁）という事実による。ゲルマトリクスは、分子ふるいとして作用して、核酸を大きさおよび形状（例えば、直線状、弛緩環状または共有結合によって閉鎖したスーパーコイル状の環状）に基づいて分離する。非改変核酸は、核酸の糖-ホスフェート骨格内に含まれる陰性荷電ホスフェート基の存在により実効陰電荷を有する。典型的に、試料は、陰極付近のゲルに適用され、核酸断片はゲルの中を陽極に向かって移動して、最も小さい断片はゲルの中を最も速く移動する。ゲル電気泳動が異なる断片を効率よく分離するためには（すなわち、互いを区別できるようにする）、大きさまたは形状の差は、ゲルの中の異なる断片の移動速度の認識可能な差を引き起こすために十分大きくなければならない。
【００５３】
本発明は、開始分子と一つまたはそれ以上の化学構成成分を添加または除去するように改変を受けた分子とのあいだの電荷の差に基づいて、核酸分子を含む分子の特徴を調べるための新規組成物および方法を提供する。例えば、本発明は、切断または伸長した核酸分子が、非改変核酸とは異なる電荷を含み、反応した分子の効率のよい分離および検出を可能にする、核酸分子を改変するための新規方法および組成物を提供する。本発明の電荷に基づく分離方法は、如何なる数のシステムにも応用可能であって（例えば、化学合成およびドラッグデザインにおける産物および中間体の分離および特徴付け）、核酸を用いることに限定されないが、以下の説明は、本発明の特定の好ましい局面を説明するために核酸応用に焦点を当てる。
【００５４】
本発明の詳細な説明を以下の章に説明する：
I．選択的な電荷の逆転による特異的核酸の分画
a．INVADERアッセイ切断反応における応用
II．電荷平衡分子の合成における陽性荷電部分
a．H-ホスホネート化学
b．新しいクラスのホスホアミダイト構築ブロック
【００５５】
I．選択的な電荷の逆転による特異的核酸の分画
本発明は、電荷に基づいて核酸断片を分画する新規手段を提供する。この新規分離技術は、付加物の電荷が複合体全体の電荷と比較して有意であるために、陽性荷電付加物が小さいオリゴヌクレオチドの電気泳動挙動に影響を及ぼしうるという知見に関係している。陽性荷電付加物（例えば、図1に示すCy3およびCy5蛍光色素、陽性荷電ヘテロ二量体DNA-結合色素等）を用いることの他に、オリゴヌクレオチドは、アミノ酸（特に有用なアミノ酸は荷電アミノ酸：リジン、アルギニン、アスパルテート、グルタメートである）、ポリペプチド、アミノ改変塩基のような改変塩基、荷電イオンまたは金属、ホスホネート骨格（全ての位置またはサブセットの位置で）、またはオリゴヌクレオチドの実効陽電荷に添加する他の如何なる化学もしくは分子構成成分を含んでもよい。他の態様において、下記にさらに考察するように、アミノ改変塩基および／または完全または部分的ホスホネート骨格を用いることに加えて、中性色素または検出部分（例えば、ビオチン、ストレプトアビジン等）を陽性荷電付加物の代わりに用いてもよい。
【００５６】
この認められた作用は、DNA分子の切断に基づくアッセイにおいて特に有用である。本明細書において例として記述するINVADERアッセイを用いて、オリゴヌクレオチドがCLEAVASE酵素または他の切断物質の作用を通して短縮される場合、陽電荷は、実効陰電荷を有意に減少させるのみならず、実際にそれを無効にする、標識実体の実効電荷を効率よく「ひっくり返す」ように生成することができる。この電荷の逆転により、極めて単純な手段によって、標的特異的切断産物は切断されていないプローブから分配することができる。例えば、切断産物は、ゲルに基づく電気泳動を用いない重点的な検出のために、反応容器の如何なる点にも配置された陰極に向けて移動するように作製することができる。スラブゲルを用いる場合、試料のウェルをゲルの中心に配置することができ、それによって切断と非切断プローブとが反対方向に移動することを観察することができる。または、従来の垂直方向のゲルを用いることができるが、電極は通常のDNA分子ゲルに対して逆転し（すなわち、陽極を上部に陰極を底に）、それによって切断された分子がゲルに入り、非切断分子は電気泳動緩衝液の上部リザーバーの中に拡散する。同様に、毛細管または微小チャンネル装置の電極は、陽性荷電切断分子が分離のために選択的に毛細管またはチャンネルの中に入るように生成することができる。
【００５７】
このタイプの読み取りの有意な利益は、基質から産物を分配するという絶対的な性質である（すなわち、分離は100％もの高さとなる可能性がある）。このことは、大量の非切断プローブがプローブに基づくアッセイのハイブリダイゼーション段階を促進するために提供されうるが、なおも消費されていない（すなわち、未反応の）プローブは本質的に、未反応プローブが特異的反応産物と同じ極に向かって移動しないという事実のために、バックグラウンドを減少させるために結果から差し引くことができることを意味している。
【００５８】
多数の陽性荷電付加物を用いることによって、合成分子は、正常な陰性荷電鎖がほぼ中性となる十分な改変を伴って構築することができる。そのように構築した場合、単一のホスフェート基の有無は、実効陰電荷または実効陽電荷のあいだの差を意味しうる。この知見は、一つの目的が、一般的に3'ホスフェートを欠損する酵素的に生成されたDNA断片と、一般的に3'ホスフェート（そしてこのように二つのさらなる陰電荷、図2）を保持する熱分解産物とを区別することである場合、特に有用である。実施例1および2は、実効陰性荷電基質オリゴヌクレオチドから陽性荷電反応産物を分離できることを証明している。これらの実施例において考察するように、オリゴヌクレオチドは、実効陰電荷から実効陽電荷化合物に変換してもよい。実施例2において、陽性荷電色素Cy3は、同様にオリゴヌクレオチドの5'末端で二つのアミノ置換残基を含む22量体（配列番号：1）の5'末端に組み入れた；このオリゴヌクレオチドプローブは実効陰電荷を有する。ヌクレオチド2個に起こったプローブへの切断後、以下の標識オリゴヌクレオチドが放出された：5'-Cy3-アミノT-アミノT-3'（配列番号：1の残っている20ヌクレオチドを含む非標識断片の他に）。この短い断片は、実効陽電荷を有するが、切断されたオリゴヌクレオチドの残りと非反応または投入オリゴヌクレオチドは実効陰電荷を有する。
【００５９】
本発明は、未反応分子は中性電荷であるかまたは実効陰電荷を有するが、如何なるオリゴヌクレオチドまたは分子の如何なる切断によって生成された特異的反応産物も、実効陽電荷を有するようにデザインすることができる態様を意図する。本発明はまた、投入核酸は実効陽電荷を有するが、放出された産物は実効陰電荷を有するようにデザインしてもよい態様も意図する。検出すべき放出産物の長さに応じて、陽性荷電色素は、プローブの一つの末端に組み入れてもよく、改変塩基は、切断によって陽性荷電色素を含む放出断片が実効陽電荷を有するように、オリゴヌクレオチドに沿って配置してもよい。アミノ改変塩基は、陽性荷電付加物（例えば、色素）の存在のみでは放出断片に実効陽電荷を付与するために十分でない場合に、放出断片の電荷を平衡にするために用いてもよい。さらに、ホスフェート骨格は、実効陽性荷電を付与するために十分なレベルでホスホネート骨格に置換してもよい（オリゴヌクレオチドの配列がアミノ置換塩基を用いることによって影響を受けない場合に特に有用である）。図3および4は、第二のT残基上のホスホネート群を含む短いオリゴヌクレオチドの構造を示す。完全なホスホネート置換骨格を含むオリゴヌクレオチドは、陰性荷電ホスホネート基が存在しないために電荷中性であろう（電荷を有する改変荷電残基が存在しない、または荷電付加物が存在しない場合）。ホスホネート含有ヌクレオチド（例えば、メチルホスホネート含有ヌクレオチド）は容易に入手可能で、当技術分野で周知の技術を用いて合成のあいだにオリゴヌクレオチドの如何なる位置にも組み入れることができる。
【００６０】
本質において、これらの態様において、本発明は、核酸に基づく検出アッセイにおいて投入オリゴヌクレオチドから特異的反応産物の分離を可能にするために電荷に基づく分離を利用することを意図する。この新規分離技術の基礎は、プローブの切断または伸長のいずれかの際に、それが「電荷不平衡」となって、特異的反応産物が実効電荷に基づいて投入反応物質から分離される可能性がある、「電荷平衡」であるオリゴヌクレオチドプローブ（典型的に、PCRの場合には「プライマー」と呼ばれる）をデザインして利用することである。
【００６１】
いくつかの態様において、PCRの場合のように、オリゴヌクレオチドプローブ（すなわち、プライマー）の伸長を伴うアッセイの場合、投入プライマーは、実効陽電荷を有するようにデザインされる。重合化のあいだに短いオリゴヌクレオチドプライマーが伸長すると、この場合実効陰電荷を有するPCR産物を生じるであろう。次に、特異的反応産物を、本明細書に記載の電荷に基づく分離技術を用いて投入プライマーから分離および濃縮してもよい。
【００６２】
a．INVADERアッセイ切断反応における適用
i．INVADER方向切断アッセイにおける5'ヌクレアーゼを用いた特異的核酸配列の検出
本発明は、INVADERアッセイにおいて生成された切断産物の検出に適応される。INVADERアッセイは、標的核酸の存在に依存する核酸切断構造を形成して、異なる切断産物を放出するために核酸切断構造を切断する手段を提供する。例えば、5'ヌクレアーゼ活性を用いて標的依存的切断構造を切断すると、得られた切断産物は試料中の特異的標的核酸配列の存在を示す。核酸の二つの鎖、またはオリゴヌクレオチドがいずれも、下記のようにそれらが重なり合う侵入性の切断構造を形成するように標的核酸鎖にハイブリダイズすると、侵入性の切断が起こりうる。切断物質（例えば、5'ヌクレアーゼ）と上流のオリゴヌクレオチドとの相互作用を通して、切断物質は、異なる断片が生成されるように、内部の部位で下流のオリゴヌクレオチドを切断するように作製することができる。そのような態様は、INVADERアッセイ（サードウェーブテクノロジーズ（Third Wave Technologies）社）と呼ばれ、その全文が参照として本明細書に組み入れられる、米国特許第5,846,717号、第5,985,557号、第5,994,069号、第6,001,567号、および第6,090,543号、ならびにPCT出願国際公開公報第97/27214号および国際公開公報第98/42873号に記載される。
【００６３】
INVADERアッセイはさらに、オリゴヌクレオチドプローブとのハイブリダイゼーションおよびプローブ切断の多数回のラウンドのあいだに、温度サイクリング（すなわち、標的核酸鎖の定期的な変性）または核酸合成（すなわち、標的またはプローブ核酸鎖の重合に基づく置換）を利用する必要なく、標的核酸が再利用またはリサイクルされるアッセイを提供する。切断反応が、プローブが標的鎖上で絶えず置換される条件で行われる場合（例えば、プローブ-プローブ置換、もしくはプローブ／標的の会合と解離との平衡を通して、またはこれらのメカニズムを含む組み合わせによって（Reynaldoら、J. Mol. Biol. 97：511[2000]））、多数のプローブが、今度は同じ標的とハイブリダイズして、それによって多数の切断と多数の切断産物の生成とが可能となる。
【００６４】
標的核酸鎖に対するその相補性の程度によって、オリゴヌクレオチドは、該標的の特異的領域を規定すると言ってもよい。侵入性の切断構造において、二つのオリゴヌクレオチドは、互いに隣接する標的（すなわち、それらのあいだに標的のさらなる領域がない領域）の領域を規定してハイブリダイズする。いずれか、または双方のオリゴヌクレオチドが、標的鎖に対して相補的でないさらなる部分を含んでもよい。侵入性の切断構造を形成するために、隣接してハイブリダイズする他に、上流のオリゴヌクレオチドの3'末端はさらなる部分を含まなければならない。双方のオリゴヌクレオチドが標的鎖にハイブリダイズして構造を形成し、そのような3'部分が構造内の上流のオリゴヌクレオチド上に存在する場合、オリゴヌクレオチドは、重なり合うと言ってもよく、構造は、重なり合うまたは侵入性の切断構造として記述してもよい。
【００６５】
一つの態様において、侵入性の切断構造の3'部分は単一のヌクレオチドである。この態様において、3'部分は如何なるヌクレオチドであってもよい（すなわち、標的鎖に対して相補的であってもよいが、相補的である必要はない）。好ましい態様において、3'部分は、標的鎖に対して相補的でない単一のヌクレオチドである。もう一つの態様において、3'部分はヌクレオチド様の化合物である（すなわち、ヌクレオチド類似体または有機環状化合物のようなヌクレオチドと類似の化学特徴を有する部分；例えば、米国特許第5,985,557号を参照のこと）。さらにもう一つの態様において、3'部分は、配列において下流のオリゴヌクレオチドのハイブリダイズした領域の5'末端に存在する一つまたはそれ以上のヌクレオチドを複製する一つまたはそれ以上のヌクレオチドである。さらなる態様において、3'部分のヌクレオチドの複製配列の後に、下流のオリゴヌクレオチド配列のさらなる複製物ではなく、他の如何なるヌクレオチドであってもよい単一のオリゴヌクレオチドが続く。さらにもう一つの態様において、3'部分のヌクレオチドの複製配列の後に、上記のようなヌクレオチド様化合物が続く。
【００６６】
下流のオリゴヌクレオチドは、標的核酸鎖とハイブリダイズする領域のいずれかの末端に結合したさらなる部分を有してもよい。好ましい態様において、さらなる部分は本発明のタグを含む。特に好ましい態様において、下流のオリゴヌクレオチドはその5'末端にタグまたは他の部分（すなわち、5'部分）を含む。
【００６７】
重なり合う切断構造が形成されると、これは、この構造に対して特異的なヌクレアーゼ（すなわち、構造を形成する如何なる核酸のヌクレオチド配列の認識よりもむしろこの構造の認識に基づいて、重なり合う構造における一つまたはそれ以上の核酸を切断するヌクレアーゼ）によって認識され、切断される。そのようなヌクレアーゼは、「構造特異的ヌクレアーゼ」と命名してもよい。いくつかの態様において、構造特異的ヌクレアーゼは、5'ヌクレアーゼである。好ましい態様において、構造特異的ヌクレアーゼは、DNAポリメラーゼの5'ヌクレアーゼである。もう一つの好ましい態様において、5'ヌクレアーゼを有するDNA分子ポリメラーゼは、合成欠損である。もう一つの好ましい態様において、5'ヌクレアーゼは、FEN-1エンドヌクレアーゼである。特に好ましい態様において、5'ヌクレアーゼは熱安定である。
【００６８】
いくつかの態様において、構造特異的ヌクレアーゼは、下流のオリゴヌクレオチドを選択的に切断する。好ましい態様において、下流のオリゴヌクレオチドは、重なり合う構造内で標的に対してハイブリダイズする領域の5'末端で一つのヌクレオチドに切断される。構造特異的ヌクレアーゼによる如何なる位置での重なり合う構造の切断によって、「切断産物」と呼ばれる核酸の一つまたはそれ以上の放出された位置または断片が生成される。
【００６９】
切断産物の検出は、標識の放出によって行ってもよい。そのような標識には、色素、32Pまたは35Sのような放射標識、ビオチンのような結合部分、金属イオンまたは化学基のような質量タグ、ポリアミンまたは荷電色素のような電荷タグ、ジゴキシゲニンのようなハプテン、発光、燐光、または蛍光発生部分、および単独または蛍光共鳴エネルギー移動（FRET）もしくは衝突蛍光エネルギー移動によるようなシフト放出スペクトルを抑制しうる部分と組み合わせた蛍光色素、のような如何なる一つまたはそれ以上が含まれてもよいがこれらに限定されない。
【００７０】
下記の実施例1〜3および9〜18は、INVADERアッセイにおいて電荷平衡オリゴヌクレオチドを用いることを証明する。切断によって、投入分子から容易に分離される電荷不平衡分子が産生される。切断産物は容易に検出され、効率的で感度のよいアッセイを提供する。
【００７１】
II．電荷平衡DNAプローブの合成における陽性荷電部分
本発明は、核酸分子を含む如何なる数の分子に結合してもよい新規陽性荷電部分を提供する。これらの陽性荷電部分は、本発明の電荷逆転分離法（「CRE」法）において用いられる。本明細書において用いられるように、「陽性荷電部分」という用語は、その意図する使用の反応条件（例えば、所望の反応条件のpHで関係する分子に結合した場合）において実効陽電荷を有する化学構造を意味する。陽性荷電部分は、必ずしも陽電荷を有する必要はない。実際に、本発明のいくつかの好ましい態様において、陽性荷電部分は、それが適当な反応条件に導入されるまで陽電荷を有しない。これはまた、「pH依存的」および「pH非依存的」陽電荷であると見なすことができる。pH依存的電荷は、特定のpH条件に限って電荷を有するものであるが、pH非依存的電荷は、pH条件にかかわらず電荷を有するものである。
【００７２】
陽性荷電部分または「電荷タグ」は、もう一つの部分に結合した場合に、以下の式で表すことができる：
X−Y
式中、Xは、実体（例えば、固相支持体、核酸分子等）であり、Yは電荷タグである。電荷タグは如何なる適した手段（例えば、共有結合、イオン相互作用等）によって直接または中間体（例えば、連結基）を通して他の実体に結合することができる。好ましい態様において、Xが核酸分子である場合、電荷タグは、核酸分子の3'または5'末端のいずれかに結合する。
【００７３】
電荷タグは多様な成分を含んでもよい。例えば、電荷タグYは以下の式によって表すことができる：
Y1−Y2
式中、Y1は、電荷タグに陽電荷を提供する化学成分を含み、Y2は、もう一つの所望の成分である。Y2は、例えば、色素、電荷タグに陽電荷を提供するもう一つの化学成分、電荷タグに対して他の分子が結合するための官能基、ヌクレオチド等であってもよい。そのような構造がもう一つの実体Xに結合する場合、Y1またはY2のいずれかがXに結合してもよい。
X−Y1−Y2、またはX−Y2−Y1
【００７４】
電荷タグは二つの成分に限定されない。電荷タグは所望の如何なる数の成分を含んでもよい。例えば、電荷タグは以下の式によって表すことができる：
Y1−Y2−Y3−Yn（n＝任意の正の整数）
式中、如何なるY基も電荷タグに陽電荷を提供する化学成分を含み、他のY基は、他の如何なる所望の成分である。例えば、いくつかの態様において、本発明は以下の構造の組成物を提供する：
X−Y1−Y2−Y3−Y4
式中、Xは、電荷タグに結合した実体（例えば、固相支持体、核酸分子等）であり、Y1は色素、Y2は、電荷に陽電荷を提供する化学成分、Y3は、他の分子の結合を可能にする官能基を含む成分であり、Y4は、陽電荷を提供する第二の化学成分である。Y1〜Y4のそれぞれの同一性は互換されうる（すなわち、本発明は成分の順序によって制限されない）。
【００７５】
本発明は、電荷タグに陽電荷を提供する化学成分の性質によって制限されない。そのような化学成分には、アミン（一級、二級、および三級アミン）、アンモニア、およびホスホニウムが含まれるがこれらに限定されない。化学成分はまた、そうでなければ一つまたはそれ以上の陽性荷電金属イオンを捕獲する、またはそれらに会合する化学複合体を含んでもよい。
【００７６】
本発明の好ましい態様において、電荷タグは、核酸分子（例えば、DNA分子分子）に結合する。電荷タグは核酸上に直接合成してもよく、または例えば固相支持体上または液相中で合成してから、核酸分子または他の如何なる所望の分子に結合してもよい。本発明のいくつかの好ましい態様において、核酸分子に結合される電荷タグは、H-ホスホネート化学によって（下記に詳細に記述）、新規ホスホアミダイトを組み入れることによって（下記に詳細に記述）、またはその双方の組み合わせによって合成された一つまたはそれ以上の成分を含む。例えば、本発明の組成物には、以下のような構造が含まれる：
[X]−[Y1−Y2−Y3−Y4]
式中、[X]は、核酸分子であって、[Y・・・]は電荷タグである。いくつかの態様において、Y1は色素であり、Y2は、H-ホスホネート化学を用いて合成され、電荷タグに陽電荷を提供する化学成分を含み、Y3は、陽性荷電ホスホアミダイトであり、そしてY4はヌクレオチドまたはポリヌクレオチドである。Y成分の如何なるものも互いに互換性である。
【００７７】
そのような組成物は、本発明の電荷分離アッセイにおいて用いられる。例えば、INVADERアッセイにおけるプローブ分子は、その5'末端に結合させた電荷タグを有してもよい。プローブは、オリゴヌクレオチド骨格における複数の陰電荷ホスフェート基のために実効陰電荷を含んでもよい。プローブの切断によって、残りのプローブから電荷タグが放出される。電荷タグを含む放出された切断断片は、実効陽電荷を有するが、残りのプローブオリゴヌクレオチドは実効陰電荷を有する。次に、切断断片は、非切断プローブから容易に分離して検出することができ、このことは実験試料に特異的標的配列が存在することを示している。
【００７８】
a．H-ホスホネート化学
先に考察したように、電荷タグの一つまたはそれ以上の成分は、H-ホスホネート化学を用いて合成することができる。本明細書に記載の方法を用いる電荷タグの産生は、広く多様な電荷タグのデザインのための簡便で柔軟なモジュールアプローチを提供する。その導入以降、固相H-ホスホネート化学（B.C. Froehler、Methods in Molecular Biology、20：33、S. Agrawal編、Humana出版、トトワ、ニュージャージー州[1993]）は、天然、改変、および標識オリゴヌクレオチドならびにDNAプローブの化学合成における有効なツールとして認識されている。当業者は、このアプローチによって、完全に改変されたホスホジエステル骨格を有するオリゴヌクレオチド断片の合成（例えば、オリゴヌクレオチドホスホロチオエート；Froechler[1993]、上記）、またはホスホジエステル骨格の特異的部分のみが改変されるオリゴヌクレオチド断片の合成（Agrawalら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85：7079[1988]、Froehler, Tetrahedron Lett. 27:5575[1986]、Froehlerら、Nucl. Acids Res. 16:4831[1988]）を行うことができることを知っている。H-ホスホネート化学を用いることによって、様々なタイプの改変をオリゴヌクレオチド分子に導入することができるが（Agrawalら、Froehler[1986]、上記、Letsingerら、J. Am. Chem. Soc.、110：4470[1988]、AgrawalおよびZamecnik、Nucl. Acid Res. 18：5419[1990]、Handongら、Bioconjugate Chem. 8：49[1997]、Vinogradovら、Bioconjugate Chem. 7：3[1995]、Schultzら、Tetrachedron Lett. 36：8407[1995]）、ホスホアミデート結合によるホスホジエステル結合の置換は、その有効性および合成柔軟性のために最も頻繁な変化の一つである。改変オリゴヌクレオチドの合成において、ホスホジエステル結合が陽性荷電基（例えば、三級アミノ基；Froehler[1986]、Froehlerら[1988]、およびLetsingerら、上記）を有するホスホアミデート結合によって完全または部分的に置換されるこのアプローチを使用したのは、FroehlerおよびLetsingerが最初であった。
【００７９】
本発明のいくつかの態様において、電荷タグはH-ホスホネート化学を用いて作製される。電荷タグは、核酸分子の末端に構築してもよく、または個々に合成して核酸分子に結合させてもよい。電荷タグの合成において、如何なる適した燐酸化剤を用いてもよい。例えば、添加する成分は以下の構造を含んでもよい：
A−B−P
式中、Aは保護基であり。Bは所望の官能基（例えば、電荷タグに陽電荷を提供する官能基）であり、Pは燐を含む化学基である。好ましい態様において、Bは電荷タグに陽電荷を提供することができる化学基を含む。しかし、いくつかの態様において、Bは陽性荷電基を合成後に電荷タグに結合させる官能基である。
【００８０】
H-ホスホネート化学を用いて（CRE）プローブを含む電荷平衡電荷タグの合成プロセスは以下の段階に分けることができる。
1．第一の段階において、標準的な自動ホスホアミダイトプロトコールを用いて特異的DNA配列を合成する（ホスホアミダイトもしくはH-ホスホネート化学を用いてレポーター分子（色素）をこの段階で分子に導入してもよく、または標準的な如何なる合成後標識プロトコールも用いて改変技法の他の段階の完了後にプローブに結合させることができる）。
2．第二段階において、改変技法は固相H-ホスホネート化学を用いて行う。固相支持体上に吊したDNAプローブは、適当な活性化試薬（例えば、塩化ピバロイル）の存在下で適当なH-ホスホネート単量体とカップリングさせる。この段階によって反応性H-ホスホネート中間体が形成される（図5）。
【００８１】
図5における「Z」基は、如何なる有機基も表す（オリゴヌクレオチドの化学合成のプロトコールにとって必要であるように、存在する如何なる他の官能基も保護される）。「Z」基は、選択的に、それに対してさらなる単量体単位（例えば、H-ホスホネート、ホスホアミダイト等）を共有結合または非共有結合（例えば、複合体形成によって）によって結合させることができる他のDMT-保護ヒドロキシル基（または他の適当に保護された官能基）を含んでもよい。本特許の開示における図5および他の図における波状の線は、例えば、制御多孔ガラス（CPG）とDNA分子（そしてこれらの組成物の如何なる二つの実体も結合してもよい）との結合を示すように、これらの目的に役立ちうる如何なる種類の原子または有機基も表す。
【００８２】
この段階は、H-ホスホネートに適合させたDNA分子シンセサイザー上で行うべきである、または固相H-ホスホネートカップリングプロトコールに従って手動で行うべきである。
【００８３】
改変技法のその後の段階は、組成物に陽電荷を導入することができるホスホアミデート含有基に中間体H-ホスホネートを変換させることを伴う。通常、この変換は、Atherton-Tod反応の助けを借りて行い、この反応において中間体H-ホスホネートIIIまたはIVを、無水非プロトン性溶媒、好ましくはピリジン、ピリジンとアセトニトリルとの混合液、またはピリジンとテトラヒドロフランとの混合液において、適当な一級または二級アミン、四塩化炭素（または反応に用いられるアミンと燐原子とのあいだにホスホアミデート結合が形成される同じタイプの変換が得られる他の試薬）の溶液によって処置する。図6は、VおよびVIの合成に至る変換を示す。
【００８４】
単量体H-ホスホネートの構造は選択的に、電荷タグを含むプローブの合成および改変の他の段階において用いることができる、適当に保護されたさらなる官能基（例えば、アミノ、ヒドロキシル、メルカプト、またはカルボキシ基）を含んでもよい。
【００８５】
改変技法がH-ホスホネート化学またはホスホアミダイト化学を用いて行われる多数のカップリング段階を伴う場合、改変技法において用いられるH-ホスホネート単量体は、選択的に、好ましくはDMT保護基によって保護されたヒドロキシル基を含まなければならないが、他の官能基はオリゴヌクレオチドの化学合成プロトコールに適合する保護基によって保護しなければならない。
【００８６】
中間材料IまたはIIを用いることができれば、改変技法の合成的柔軟性が有意に増加する（そして、広く多様な電荷平衡プローブを作製するために役立つ）ことに注目することは重要である。H-ホスホネート試薬および他の試薬（例えば、レポーター分子）の合成DNA分子配列に対するカップリングの配列を変化させることによって、異なるプローブ（CRE-VI）を合成することができる。プローブは、例えば、INDAVERアッセイにおいて切断されると、多様な極性および／または移動度の断片を生じる。H-ホスホネートアプローチの合成的柔軟性は、多数の標識CREプローブの合成例に簡便に示すことができる。
【００８７】
別の基（例えば、多数の陰電荷または他の基を有する色素）によってプローブに導入された陰電荷を代償するためには、陽電荷を有する部分による多数の改変点の導入が望ましいかも知れない。
【００８８】
改変点二つのみ、すなわち一つは陽性荷電部分を導入し、一つは構造調節のために中性基を導入する改変を含み、実効電荷を変化させない色素（例えば、ホスホアミダイト化学を用いて導入されたCy3色素）一つのみを有するCREプローブの合成を、図8に示す。
【００８９】
認められるように、一つのみのレポーター基、一つのタイプのH-ホスホネート単量体、および二つの異なるアミンを用いる合成技法は、異なる電荷平衡CREプローブを6個生成することができる。単一のレポーター分子（例えば、Cy3）を用いて合成された電荷平衡CREプローブについて可能性がある構造変化の数は、二つの構造的に異なるH-ホスホネート単量体の一つ、陽電荷を導入するための二つの異なるアミンの一つ、および構造調節のための二つの異なるアミンの一つを用いて合成を行う場合、有意に増加しうる。それらの試薬を用いると、陽電荷を導入する四つの異なる改変と四つの異なる構造調節改変が形成されるであろう。
【００９０】
考察した実施例において、電荷平衡CREプローブの構造は、レポーター分子（例えば、Cy3）によって占有される一つの位置、陽電荷を導入する改変によって占有される一つの位置、および（選択的に）構造調節改変によって占有される一つの位置を含まなければならない。上記の試薬を用いると、異なる電荷平衡CREプローブを全体で96個合成することができる。
【００９１】
可能性がある多数の構造の順列がほんの7個の異なる試薬を用いることによって得られ、それによって特に望ましいプローブ性能（すなわち、切断された陽性荷電断片のアッセイ成績および／または所望の電気泳動移動度）を提供する構造的配置を選択できることは明白である。如何なる中性改変も含まない（例えば、構造調節のために用いられるように）、または構造調節改変を加えることができる多数の点を含む電荷平衡プローブの合成において、同じ組の試薬を用いることができる。これはさらに、比較的少数（上記の例において7個）の試薬を用いて合成することができる電荷平衡プローブについて、可能性がある構造の数を増加させる。レポーター基も同様に、H-ホスホネート化学を用いてCREプローブに導入することができる。図9は、レポーター分子（例えば、色素）の活性化されたH-ホスホネートが固相に結合したオリゴヌクレオチドの利用可能なヒドロキシル基と反応して、中間体H-ホスホネートIVaが形成され、これがその後適当な一級または二級アミンおよび上記の化学反応を用いてホスホアミデート誘導体に変換されるプロセスを示す。
【００９２】
全ての場合において、これらの技法によって、荷電有機部分の特異的構造（後にCOM(+)として示す）がDNA分子配列に結合する。その結果、酵素的プロセスにおいて切断される陽性荷電断片（陽性電荷タグ；後に「PCT」と呼ぶ）は、一つのヌクレオチドおよびCOM(+)からなり、所望の実効陽電荷を有するであろう（図10）。
【００９３】
CREプローブの合成にH-ホスホネート化学を用いることを説明する例として、異なる5個の電荷平衡CREプローブの合成を行った（図11）。合成された全ての電荷平衡プローブを、INVADERアッセイにおいて調べた。切断されたPCTsは、逆キャピラリー電気泳動の条件において異なる電気泳動移動度を有する。CREプローブの改変においてH-ホスホネートを用いることは、四配位ホスホアミデート燐原子で新しいキラリティ中心の生成に関連している（図12）。キラル（光学活性）でより立体的にかさの大きいH-ホスホネート単量体（例えば、dT、dA、dC、dG H-ホスホネート）を用いると、異なるクロマトグラフィーおよび電気泳動特性を有するジアステレオ異性体を形成することができる。比較的小さくアキラル性のH-ホスホネート単量体（例えば、1,6-ヘキサンジオールのDMT-保護H-ホスホネート）を用いると、立体異性体の形成は、逆相HPLCおよびキャピラリー電気泳動条件のいずれにおいても検出できなかった。しかし、より大きい合成材料のジアステレオ異性体型は、分析的RP HPLCプロフィール、および無傷のCREプローブおよび酵素的切断の陽性荷電産物のCEプロフィールにおいて異なるピークとして検出できる。それらの条件でのジアステレオ異性体の分離は、改変段階において導入された置換基の性質によって変化して、それに依存しうる。H-ホスホネート試薬を用いて多数の改変点（n）を導入すると、2"ジアステレオ異性体が形成され、これはプローブ精製、分析のために用いられる条件、またはCRE実験条件において、分離されるまたは分離されない可能性がある。ジアステレオ異性体の分離は、プローブが複合アッセイにおいて用いられる状況では短所となりうる。電荷平衡CREプローブのジアステレオ異性体型の形成は、5'-DMT保護デオキシヌクレオチドのH-ホスホネートをい用いた全ての場合において認められた。
【００９４】
一つの場合において、（dA H-ホスホネート、中間体H-ホスホネートをホスホアミデートに変換するために用いられるアミン：H2NCH2CH2NMe2）、逆相HPLC条件（C-18カラム）においてジアステレオ異性体を分離すると、異性体を分離することができた。単離された分画を質量分析によって分析すると、材料は、所望の産物の分子量に対応する同一の分子量を有することが判明した。したがって、個々のジアステレオ異性体を精製する段階が意図されていない場合、または完全な分離が可能ではない場合、そのようなシステムに関してCREプローブの合成における構築ブロックとしてのアキラルH-ホスホネートを使用することは、キラルH-ホスホネートを使用するより好ましいかも知れない。しかし、純粋な形でのジアステレオ異性体の分離が可能である場合（例えば、逆相HPLCによって）、個々のジアステレオ異性体は、CREアッセイにおいて分離可能なタグとして用いることができ、H-ホスホネート生成CREプローブの多様なライブラリをさらに拡大する。
【００９５】
本発明のいくつかの態様において、Cy3のH-ホスホネートは、電荷タグに電荷含有単位を直接導入するために用いられる。例えば、Cy3のH-ホスホネートの使用は、以下の構造を含む電荷タグを提供しうる：
【化５】
Figure 2005503114
式中、如何なる所望のアミンもNRの位置に容易に組み入れることができる。これによって、例えば、分離アッセイにおいて異なる移動度を提供する異なる電荷タグのパレットが形成される。
【００９６】
b．新しいクラスのホスホアミダイト構築ブロック：「陽性荷電ホスホアミダイト」（PCP）および「中性ホスホアミダイト」（NP）
陽性荷電ホスホアミダイト（PCP）および中性ホスホアミダイト（NP）は、陽電荷と構造調節の双方を合成電荷平衡CREプローブに導入するようにデザインされた新しいクラスのホスホアミダイト構築ブロックを表す。
【００９７】
ホスホアミダイト試薬を用いる標準的なカップリングプロトコールは、ホスホジエステル結合の形成により、カップリング段階あたり陰電荷1個を生長しつつある分子に導入することに関連する（図13）。陰電荷と陽電荷の特定の比率が維持される電荷平衡CREプローブの合成において、さらなる陰電荷の導入は短所となりうる。この短所を克服するために、それぞれのカップリング段階において（陽性荷電ホスホアミダイト、PCP）実効陽電荷を導入するか、または余分の電荷（中性ホスホアミダイト、NP）を合成CREプローブに導入しないように、新しいタイプのホスホアミダイトをデザインした。図14は、本発明のいくつかの態様におけるPCPおよびNPホスホアミダイトの一般構造を示す。
【００９８】
陽性荷電基（Y+）は、陽性荷電型で存在しうる如何なる有機基、好ましくは一級、二級、または三級アミンを表す。四級アンモニウム基または他の有機陽性荷電基の導入による改変も同様に意図する。
【００９９】
PCPおよびNPはいずれも、カップリングあたり陰電荷1個を導入するが、構造調節因子として作用しうる他のホスホアミダイト構築ブロック（PBBs）と組み合わせて用いることができる。PCPおよびNPの構造の多様化はまた、合成CREプローブの構造調節の要因として役立ちうる。このアプローチによって、オリゴヌクレオチド合成のための標準的なホスホアミダイトカップリングプロトコールを用いて、非常に多様な電荷平衡CREプローブを合成することができる。
【０１００】
例えば、図15は、実効電荷ゼロを導入する（例えば、Cy3ホスホアミダイト）一つの色素ホスホアミダイト（DP）、陰電荷1個を導入するPBB、実効電荷ゼロを導入する一つのNP、および実効陽電荷1個を導入する一つのPCPを用いて行う場合、電荷平衡CREプローブの合成において可能性がある組み合わせを示す。図15に示すように、プローブ構造のデザインにおいて可能な位置順列の数が大きいために、試薬四つのみを用いて非常に多様な電荷平衡構造を合成することができる。
【０１０１】
図15は、レポーター分子（Cy3）がオリゴヌクレオチド配列に直接結合する電荷平衡CREプローブの合成を説明するが、レポーター分子が他の位置を占める他の構造順列も同様に意図される。
【０１０２】
したがって、このアプローチは、一つのみのレポーター分子を用いて多数の電荷平衡CREプローブを合成する独自の機会を与える。例えば、図13は、如何なる実効電荷も導入しない色素（例えば、Cy3ホスホアミダイト）をプローブ合成に用いる態様を示す。これは、例えばINDAVERアッセイを用いる複合検出系において用いられる電荷平衡CREプローブの異なるセットの合成に他の色素を使用することを除外しない。同様に、H-ホスホネートアプローチと比較して、新しいタイプのホスホアミダイトを使用しても、新しいキラリティ中心が形成されないことも注目に値する。
【０１０３】
さらなる態様において、本発明のH-ホスホネートおよびホスホアミダイトは、例えば、特異的に改変された電荷平衡CREプローブの合成において組み合わせて用いられる。図16は、合成された中性ホスホアミダイトおよび陽性荷電ホスホアミダイトの例を示し、図17は、PCPおよびNPを利用して合成された電荷平衡CREプローブの組の構造を示す。
【０１０４】
原子18個のリンカー（ポリエチレングリコール誘導体；グレンリサーチ（Glen Research）社；カタログ番号10-1918-90）の市販のホスホアミダイトを、構造調節のために用いる構築ブロックホスホアミダイトとして用いられた（図17において「18AL」として示される）。
【０１０５】
異なる長さおよび異なる化学的性質のリンカーは、構造調節試薬として用いることができる。
【０１０６】
本発明はまた、電荷基とホスフェート基とを有する単位を含む電荷タグを生成するためにホスホアミダイトを用いる新規合成法を提供する。例えば、上記のように、H-ホスホネート化学は、核酸構造に荷電単位を付加するために用いることができる。
【化６】
Figure 2005503114
（式中、Xは電荷タグの一つまたはそれ以上のさらなる成分であり、R基は、他の如何なる所望の化学基である）。同じ構造は、最初にホスホアミダイトを添加して、その後例えば、アミンの存在下でMichaelis-Arbuzov反応を用いることによって、ホスホアミダイト添加を用いて作製してもよい：
【化７】
Figure 2005503114
【０１０７】
電荷タグを生成する上記の方法によって、極めて多様な電荷タグを生成することができる。この多様な選択肢によって、複合検出法が可能となる。例えば、INVADERアッセイの場合、プローブオリゴヌクレオチドに結合した電荷タグは、以下の三つの成分を含みうる：
3'-[プローブ]-5'-[Y1−Y2−Y3]
式中、Y1は如何なる数の色素の一つであり、Y2は陽電荷を含む如何なる数の基の一つであり、Y3は四つのヌクレオチドの一つである（例えば、標的核酸に対して相補的でない）。四つの異なる色素および四つの異なる荷電基を用いる場合、これは、4×4×4、すなわち64個の異なる電荷タグを導入し、これは本明細書に記載の方法（例えば、微小流体学）を用いて個々に解決することができるであろう。さらなる成分またはさらなる選択肢をそれぞれの成分に添加することによって、何百から何千またはそれ以上の異なる電荷タグを作製して、多重分析において用いることができる。
【０１０８】
実施例
以下の実施例は、本発明の特定の好ましい態様および局面を説明するために示し、本発明の範囲を制限すると解釈してはならない。
【０１０９】
以下の開示において以下の省略語を使用する：Afu（Archaeoglobus fulgidus（硫酸還元古細菌））；Mth（Methanobacterium thermoautotrophicum（メタノバクテリウム））；Mja（Methanococcus jannaschii（メタノコッカス・ジャナスキイ））；Pfu（Pyrococcus furiosus（ピロコッカス・フリオサス））；Pwo（Pyrococcus woesei（ピロコッカス・ウォエセイ））；Taq（Thermus aquaticus（サームス・アクアチクス））；Taq DNAP、DNAP Taq、およびTaq Pol I（T. aquaticus DNAポリメラーゼI）；DNAPStf（DNAPTaqのシュトッフェル断片）；DNAPEcI（大腸菌DNAポリメラーゼI）；Tth（Thermus thermophilus（サームス・サーモフィルス））；Ex.（実施例）；Fig.（図）；℃（摂氏）；g（重力の場）；hr（時間）；min（分）；olio（オリゴヌクレオチド）；rxn（反応）；vol（容積）；w/v（重量対容積）；v/v（容積対容積）；BSA（ウシ血清アルブミン）；CTAB（臭化セチルトリメチルアンモニウム）；HPLC（高速液体クロマトグラフィー）；DNA（デオキシリボ核酸）；p（プラスミド）；μl（マイクロリットル）；ml（ミリリットル）；μg（マイクログラム）；mg（ミリグラム）；M（モル濃度）；mM（ミリモル濃度）；μM（マイクロモル濃度）；pmoles（ピコモル）；amoles（アットモル）；zmoles（ゼプトモル）；nm（ナノメートル）；kdal（キロダルトン）；OD（吸光度）；EDTA（エチレンジアミン四酢酸）；FITC（フルオレセインイソチオシアネート）；SDS（ドデシル硫酸ナトリウム）；NaPO4（燐酸ナトリウム）；NP-40（ノニデット-40）；Tris（トリス(ヒドロキシメチル)-アミノメタン）；PMSF（フェニルメチルスルホニルフルオリド）；TBE（トリスボレート-EDTA、すなわちHClではなくてホウ酸によって滴定し、EDTAを含むトリス緩衝液）；PBS（燐酸緩衝生理食塩液）；PBS（1 mM PMSFを含む燐酸緩衝生理食塩液）；PAGE（ポリアクリルアミドゲル電気泳動）；Tween（ポリオキシエチレン-ソルビタン）；ATCC（アメリカンタイプカルチャーコレクション、ロックビル、メリーランド州）；Coriell（コリエル細胞寄託所、カムデン、ニュージャージー州）；DSMZ（ドイツ微生物細胞培養コレクション、ブラウンシュバイヒ、ドイツ）；Sigma（シグマケミカル社、セントルイス、ミズーリ州）；MJ Research（MJリサーチ社、ウォータータウン、マサチューセッツ州）；Novagen（ノバゲンインク、マジソン、ウィスコンシン州）；Perkin Elmer（パーキンエルマーインストルメンツ、ノーウォーク、コネチカット州）；Promega（プロメガ社、マディソン、ウィスコンシン州）；Clontech（クロンテック社、パロアルト、カリフォルニア州）；Pharmacia（ファルマシア社、ピスキャタウェイ、ニュージャージー州）；Hitachi（ヒタチインストルメンツインク、サンノゼ、カリフォルニア州）；Qiagen（キアゲンインク、バレンシア、カリフォルニア州）；Bio101（バイオ101インク、ビスタ、カリフォルニア州）；Aldrich（アルドリッチケミカル社、ミルウォーキー、ウィスコンシン州）；VWR（VWRサイエンティフィックプロダクツ社、ウェストチェスター、ペンシルバニア州）；Glen Research（グレンリサーチ社、スターリング、バージニア州）；PE Biosystems（PE/アプライドバイオシステムズ社、フォスターシティ、カリフォルニア州）；Wheaton（ホイートンサイエンスプロダクツ歯、ミルビル、ニュージャージー州）；EM Science（EMサイエンス社、ギブスタウン、ニュージャージー州）；Gelman（ゲルマンサイエンス社、アナーバー、ミシガン州）；Becton Dickinsen（ベクトンディッキンソンラブウェア社、ベッドフォード、マサチューセッツ州）；Buchi（ビュキアナリティカル社、スイス）；Chemglass（ケムグラスインク、バインランド、ニュージャージー州）；Dot Scientific （ドットサイエンティフィックインク、バートン、ミシガン州）；Eppendorf Scientific（エッペンドルフサイエンティフィックインク、ウェストバリー、ニューヨーク州）；Applied Biosystems（アプライドバイオシステムズ社、フォスターシティ、カリフォルニア州）；Invitrogen（インビトロジェン社、カールスバッド、カリフォルニア州）；Ambion（アンビオンインク、オースチン、テキサス州）；Gibco BRL（ライフテクノロジーズ、ガイサーズバーグ、メリーランド州）；USB（USバイオケミカル社、クリーブランド、オハイオ州）：Calbiochem（カルビオケム社、サンディエゴ、カリフォルニア州）。
【０１１０】
実施例1
電荷の逆転によるDNAの検出
特異的標的の検出は、プローブオリゴヌクレオチドの切断によってINVADER方向切断アッセイにおいて行う。切断されたプローブは、下記の電荷逆転技術を用いて切断されていないプローブから分離してもよい。この新規分離技術は、付加物の電荷が複合体全体の電荷と比較して有意であるために、陽性荷電付加物は、小さいオリゴヌクレオチドの電気泳動挙動に影響を及ぼしうるという知見に関連している。荷電付加物による異常な移動度に関する知見は文献において報告されているが、認められた全ての場合において、他の科学者によって行われた出願は、酵素的伸長によってオリゴヌクレオチドをより大きくすることを伴った。陰性荷電ヌクレオチドが付加されると、付加物の正の影響は有意でなくなるまで減少する。その結果、陽性荷電付加物の影響はなくなり、既存の文献においてほとんど注目されなかった。
【０１１１】
多数の陽性荷電付加物を用いることによって、通常の陰性荷電鎖をほぼ中性にする十分な改変を有する合成分子を構築することができる。そのように構築した場合、単一のホスフェート基の有無は、実効陰電荷または実効陽電荷のあいだの差を意味しうる。この知見は、目的が、一般的に3'ホスフェートを欠損するDNAの酵素的に生成された断片と、一般的に3'ホスフェートを保持する（そしてこのようにさらなる陰電荷2個を有する）熱分解産物とを区別することである場合、特に有用である。
【０１１２】
a）DNAオリゴヌクレオチドの熱切断産物の特徴付け
DNAプローブが熱分解されるとバックグラウンドが高くなり、それによって特異的酵素切断によって生成したシグナルが曖昧となり、シグナル対ノイズ比が減少しうる。DNA熱分解産物の性質をよりよく理解するために、5'テトラクロロフルオレセイン（TET）標識オリゴヌクレオチド78（配列番号：3）および79（配列番号：4）（それぞれ、100 pmol）を10 mM NaCO3（pH 10.6）50 μl、50 mM NaClと共に90℃で4時間インキュベートした。試料の蒸発を防止するために、反応混合物の上にCHILLOUT液体ワックス（MJ Research社）50 μlを載せた。次に、反応を二つの等量のアリコットに分けた（AおよびB）。アリコットAをメチルバイオレットローディング緩衝液25 μlと混合して、100 mM MgCl2 2.5μlおよび1単位/μl仔ウシ腸アルカリホスファターゼ（CIAP）（Promega社）1μlを加えて、37℃で30分間インキュベートすることによってアリコットBを脱燐酸化した後、メチルバイオレットローディング緩衝液25 μlを加えた。各試料1 μlを12％ポリアクリルアミド変性ゲルの中の電気泳動によって分離して、実施例21に記載するように撮像した：FMBIOイメージアナライザーに585 nmフィルターを用いた。得られた像のスキャンを図2に示す。
【０１１３】
図2において、レーン1〜3は、TET標識オリゴヌクレオチド78を含み、レーン4〜6はTET標識オリゴヌクレオチド79を含む。レーン1および4は、熱処理していない反応産物を含む。レーン2および5は、熱処理していない反応からの産物を含み、レーン3および6は、熱処理した後、ホスファターゼ処置を行った反応産物を含む。
【０１１４】
図2に示すように、熱処理は、5'-TET-標識DNAの有意な切断を引き起こし、梯子状の分解産物を生成する（図2、レーン2、3、5および6）。バンドの強度は、オリゴヌクレオチド配列におけるプリンおよびピリミジン塩基の位置に相関して、これは、ピリミジンよりプリンに関する速度がより速い非塩基性中間産物の形成によって、骨格の加水分解が起こる可能性があることを示している（LindahlおよびKarlstrom、Biochem. 12：5151[1973]）。
【０１１５】
脱燐酸化は、熱分解プロセスによって生成された全ての産物の移動度を減少させ、より短い産物に関して最も強い作用を認めた（図2、レーン3および6）。このことは、熱分解産物がCIAPによる脱燐酸化によって除去することができる3'末端ホスホリル基を有することを証明している。ホスホリル基の除去によって、全体的な陰電荷が2価減少する。そのため、少数の陰電荷を有するより短い産物は、電荷2個の除去によってかなりの影響を受ける。これによって、より大きい分子種について認められた場合より短い産物においてより大きい移動度のシフトが起こる。
【０１１６】
CLEAVASE酵素によって生成した産物は、このさらなる3'ホスフェートを含まない。したがって、所望の反応産物が陽電荷1または2個を含むようなアッセイをデザインする場合、類似の熱分解産物は中性または陰性であろう。これによって、下記の電荷逆転法によってバックグラウンドから産物を容易に分離することができる。
【０１１７】
b）短いアミノ改変オリゴヌクレオチドの脱燐酸化は標識産物の実効電荷を逆転させることができる
オリゴヌクレオチドが実効陰性荷電化合物から実効陽性荷電化合物にどのように変化しうるかを証明するために、70、74、75、および76と記し、図3〜4に示す短いアミノ改変オリゴヌクレオチド4個を合成した。四つの改変オリゴヌクレオチドは全て、5'末端に存在するCy3色素を有し、これは個々に本実施例に記載する反応および単離条件において陽性荷電している。化合物70および74は、反応条件において、C10またはC6リンカーを通してそれぞれC5位に結合した陽性荷電R-NH3 +基を示す二つのアミノ改変チミジンを含む。化合物70および74は、3'末端が燐酸化されているため、それらは、陰電荷4個と陽電荷3個とからなる。化合物75は、74における内部C6アミノ改変チミジンホスフェートが、チミジンメチルホスホネートに置換されているという点において74とは異なる。ホスホネート骨格は非荷電であり、化合物75上に全体として陰電荷3個が存在する。これは化合物75に実効陰電荷1個を与える。化合物76は、内部アミノ改変チミジンが内部シトシンホスホネートに置換されているという点において70とは異なる。シトシンのN3窒素のpKaは4〜7となりうる。このように、この化合物の実効電荷は、溶液のpHに応じて-1〜0となりうる。分析を単純にするために、それぞれの群は、電荷の全体数を割付られるが、各化学基のpKaおよび周囲のpHに応じて、実効電荷は、割り付けられた総数とは異なってもよいと認識される。この差は、本発明において調べた酵素反応において用いられたpHの範囲に対して有意ではないと想定される。
【０１１８】
これらの化合物の脱燐酸化、または3'末端のホスホリル基の除去によって、陰電荷2個が消失して、実効陽電荷1個を有する産物が生成される。この実験において、等電点電気泳動（IEF）法を用いて、脱燐酸化の際に記述の基質に関して、電荷が1価の陰電荷から1価の陽電荷に変化することを証明した。
【０１１９】
基質70、74、75、および76は、標準的なホスホアミダイト化学によって合成して、14 M水酸化アンモニウム溶液中で22℃で24時間脱保護した後、溶媒を真空で除去した。乾燥粉末をH2O 200 μlに再懸濁して、0.2 μmフィルターを通過させた。保存溶液の濃度は、H2Oによって200倍希釈した試料の分光光度計（Spectronic Genesys 2、Milton Roy（ミルトンロイ）社、ロチェスター、ニューヨーク州）による261 nmでのUV-吸収によって推定した。
【０１２０】
化合物70および74、75および76の脱燐酸化は、粗保存溶液（濃度範囲は約0.5〜2 mM）10 μlを2単位CIAPのCIAP緩衝液（Promega）溶液100 μlによって37℃で1時間処置することによって行った。次に、CIAPを不活化するために反応物を75℃で15分間加熱した。明快にするために、脱燐酸化化合物を「dp」と命名する。例えば、脱燐酸化後、基質70は70dpとなる。
【０１２１】
IEF実験の試料を調製するために、基質および脱燐酸化産物の保存溶液の濃度を、水による希釈によって532 nmで8.5×10-3の均一な吸光度となるように調節した。各試料2μlを、PhastSystem電気泳動ユニット（Pharmacia）およびPhastGel IEF 3-9培地（Pharmacia）を用いるIEFによって、製造元のプロトコールに従って分析した。分離は、以下のプログラムによって15℃で行った：前泳動；2,000 V、2.5 mA、3.5 W、75 Vh；ローディング；200 V、2.5 mA、3.5 W、15 Vh；泳動；2,000 V、2.5 mA、3.5 W、130 Vh。分離後、585 nmのフィルターを備えたFMBIOイメージアナライザー（Hitachi）を用いて試料を可視化した。得られたイメージャースキャンを図18に示す。
【０１２２】
図18は、基質70、74、75、および76ならびにその脱燐酸化産物のIEF分離の結果を示す。矢印で示した「試料ローディング位置」は、ローディング位置を示し、「＋」印は陽極の位置を示し、「−」は陰極の位置を示す。
【０１２３】
図18に示す結果は、基質70、74、75、および76が陽極方向に移動するが、脱燐酸化産物70dp、74dp、75dp、および76dpは、陰極方向に移動したことを示している。移動方向の認められた差は、基質（マイナス1）および産物（プラス1）の予想される実効電荷と一致した。燐酸化化合物の移動度における小さい変動は、全体的なpIが変化することを示している。これはまた、脱燐酸化化合物についても当てはまった。例えば、76dpにシトシンが存在すると、この化合物は陰極に向かってさらに移動して、このことは他の脱燐酸化化合物と比較して全体的なpIがより高いことを示している。天然のアミノ改変塩基（70dpおよび74dp）を非荷電メチルホスホネート架橋（産物75dpおよび76dp）と組み合わせて用いることによって、さらなる陽電荷が得ることができることに注目することは重要である。
【０１２４】
先に示した結果は、ホスフェート基1個を除去することによって、オリゴヌクレオチドの実効電荷を逆転させて、電場の逆転を引き起こし、産物が容易に分離できること、およびオリゴヌクレオチドの正確な塩基組成が絶対的な移動度に影響を及ぼすが、電荷逆転作用には影響を及ぼさないことを証明している。
【０１２５】
実施例2
電荷の逆転によるINVADER方向切断反応における特異的切断産物の検出
本実施例において、電荷の逆転を用いて、INVADER方向切断アッセイにおいて生成された産物を反応カクテルに存在する他の全ての核酸から単離できることを証明する。
【０１２６】
切断アッセイの酵素
CLEAVASE A/G酵素は、米国特許第6,090,606号およびPCT出願国際公開公報第98/23774号（その全文が参照として本明細書に組み入れられる）に記載されるように調製した；Afu FEN1およびPfu FEN1は、国際公開公報第98/23774号に記載される通りに単離した。これらの試験において用いた他の二つの酵素、すなわちCLEAVASE TthAKK酵素とAve FEN 1ヌクレアーゼは、以下の章に記載するように作製した。
【０１２７】
CLEAVASE TthAKKのクローニングおよび発現
最初のTthPolの単離
ATCCからの乾燥Thermus thermophilus株HB-8（ATCC#27634）1バイアルからゲノムDNAを調製した。DNAポリメラーゼ遺伝子は、以下のプライマーを用いてPCRによって増幅した：
Figure 2005503114
および
Figure 2005503114
得られたPCRをEcoRIおよびSalI制限エンドヌクレアーゼによって消化して、EcoRI/SalI消化プラスミドベクターpTrc99Gに挿入した。pTrc99Gベクターは、pTrc99Aマップの270位でのGを除去するようにpTrc99Aベクター（Pharmacia社）を改変することによって作製した。この目的のため、pTrc99AプラスミドDNAをNcoIによって切断して、凹んだ3'末端を四つ全てのdNTPの存在下で大腸菌ポリメラーゼIのクレノウ断片を用いて37℃で15分間塞いだ。65℃で10分間インキュベートすることによってクレノウ断片を不活化した後、プラスミドDNAをEcoRIによって切断して、端部を四つ全てのdNTPの存在下で大腸菌ポリメラーゼIのクレノウ断片を用いて37℃で15分間塞いだ。次に、クレノウ断片を65℃で10分間インキュベートすることによって不活化した。プラスミドDNAをエタノール沈殿させて、ライゲーションによって再度環状化して、これを用いて大腸菌JM109細胞（Promega社）を形質転換した。pTrc99GプラスミドDNAを単一のコロニーから単離して、270位（pTrc99Aマップを参照して）でのGの欠失を、DNAシークエンシングによって確認した。上記のようにこのベクターにTth DNAを挿入すると、プラスミドpTrcTth-1が作製された。このTthポリメラーゼ構築物は、5'オリゴヌクレオチドから偶然に省略されたヌクレオチド1個を欠失し、その結果、ポリメラーゼ遺伝子がフレーム外に存在する。この誤りは、製造元の説明書に従ってTRANSFORMER部位特異的変異誘発キット（Clontech）、および以下のオリゴヌクレオチド：
Figure 2005503114
を用いてpTrcTth-1の部位特異的変異誘発によって修正され、プラスミドpTrcTth-2が得られた。蛋白質および蛋白質をコードする核酸配列は、TthPolと呼ばれ、配列番号：8および9としてそれぞれ記載される。
【０１２８】
改変されたTthPol遺伝子：Tth DN
Tth DN構築物は、上記のTthPol-2を変異させることによって作製した。787位のアスパラギン酸をコードする配列は、上記の部位特異的変異誘発によってアスパラギンをコードする配列に変化した。以下のオリゴヌクレオチド：
Figure 2005503114
によるpTrcTth-2の変異誘発を行ってプラスミドpTrcTthDNを作製した。Tth DNと呼ばれる変異蛋白質、および核酸配列をコードする蛋白質をそれぞれ、配列番号：11および12に記載する。
【０１２９】
Tth DN HT
アミノ酸ヒスチジン6個のタグ（His-tag）をTth DNのカルボキシ末端に加えた。TRANSFORMER部位特異的変異誘発キット（Clontech社）を用いて、製造元の説明書に従って部位特異的変異誘発を行った。プラスミドpTth DNについて用いた変異誘発オリゴヌクレオチドは、配列
Figure 2005503114
、配列136-037-05であった。選択プライマー、トランスオリゴAlwNI/SpeI（Clontech社、カタログ番号6488-1）を双方の変異誘発反応に用いた。得られた変異体遺伝子をTth DN HT（配列番号：14、核酸配列；配列番号：15、アミノ酸配列）と命名した。
【０１３０】
Tth DN HTの精製
Tth DN HT蛋白質は、上記のように大腸菌株JM109において発現させた。硫酸アンモニウム沈殿および遠心後、蛋白質沈降物をQ緩衝液（50 mMトリス-HCl、pH 8.0、0.1 mM EDTA、0.1％ツイーン20）0.5 mlに懸濁した。蛋白質はHis-結合樹脂および緩衝液キット（Novagen社）を用いて、製造元の説明書に従って、アフィニティクロマトグラフィーによってさらに精製した。His-結合樹脂1 mlをカラムに移して、カラム容積の3倍量の滅菌水によって洗浄して、1×チャージ緩衝液5倍量を加え、1×結合緩衝液3倍量によって平衡にした。蛋白質試料に1×結合緩衝液4 mlを加えて、試料溶液をカラムにローディングした。1×結合緩衝液3 mlおよび1×洗浄緩衝液3 mlによって洗浄した後、結合したHis-タグ蛋白質を1×溶出緩衝液1 mlによって溶出した。次に、純粋な酵素を50％グリセロール、20 mMトリス-HCl、pH 8.0、50 mM KCl、0.5％ツイーン20、0.5％ノニデット P40、および100 μg/ml BSAに対して透析した。酵素濃度は、279 nmでの吸光度を測定することによって決定した。
【０１３１】
Tth DN RX HTの生成
変異誘発は、3つのさらなる独自の制限酵素部位をTth DN HT酵素のポリメラーゼドメインに導入するために行った。Transformer部位特異的変異誘発キット（Clontech社）を用いて製造元の説明書に従って部位特異的変異誘発を行った。異なる二つの選択プライマーの一つ、トランスオリゴAlwNI/SpeIまたはスイッチオリゴSpeI/AlwNI（クロンテック社カタログ番号6488-1、またはカタログ番号6373-1）を記述の全ての変異誘発反応について用いた。所定の反応において用いた選択オリゴは、ベクターに存在する選択制限部位に依存する。変異誘発プライマーは、全て標準的な合成化学によって合成した。得られたコロニーは、大腸菌株JM109に発現させた。
【０１３２】
Tth DN HT遺伝子のセンス鎖に対応する変異誘発プライマー
Figure 2005503114
を用いてNot I部位（アミノ酸328位）を作製した。センス鎖変異誘発プライマー
Figure 2005503114
および
Figure 2005503114
をそれぞれ用いて、BstI（アミノ酸382位）およびNdeI（アミノ酸443位）部位を導入した。変異体プラスミドを過剰発現させて、Qiagen QiaPrep Spin Mini Prepキット（カタログ番号27106）を用いて精製した。DNAシークエンシングおよび制限マッピングによって、ベクターを制限部位の有無に関して調べた。構築物は、Tth DN RX HT（DNA配列、配列番号：19；アミノ酸配列、配列番号：20）と命名する。
【０１３３】
点突然変異の付加
全ての変異誘発反応に関して十分な開始材料を得るために、QIAGENプラスミドMaxiキット（Qiagen社）を用いて、製造元のプロトコールに従って、プラスミドDNAをJM109の一晩培養物200 mlから精製した。Transformer部位特異的変異誘発キット（Clontech社）を用いて、製造元のプロトコールに従って全ての部位特異的変異を導入した。二つの異なる選択プライマーの一つ、トランスオリゴAlwNI/SpeIまたはスイッチオリゴSpeI/AlwNI（Clontech社、カタログ番号6488-1、またはカタログ番号6373-1）を記述の全ての変異誘発反応について用いた。所定の反応において用いた選択オリゴは、ベクターに存在する選択制限部位に依存する。変異誘発プライマーは全て、標準的な合成化学によって合成した。双方のタイプの反応に関して得られたコロニーは、大腸菌株JM109であった。変異体蛋白質の発現および精製は、先に詳述したように行った。
【０１３４】
Tth DN RX HT H786Aの構築
変異誘発プライマー583-001-04
Figure 2005503114
を用いてpTrc99G Tth DN RX HT DNA上で部位特異的変異誘発を行って、H786A変異体酵素（DNA配列、配列番号：22；アミノ酸配列、配列番号：23）を作製した。
【０１３５】
Tth DN RX HT（H786A/G506K/Q509K）の構築
上記のように作製した変異体Tth DN RX HT H786Aから始めて、変異原性プライマー604-022-02：
Figure 2005503114
を用いて部位特異的変異誘発を行い、「Cleavase TthAKK」と命名されるこの変種を生成した（DNA配列、配列番号：25；アミノ酸配列、配列番号：26）。
【０１３６】
組み換え型蛋白質の大規模調製
組み換え型蛋白質は、Taq DNAポリメラーゼ調製プロトコール（Engelkeら、Anal. Biochem. 191：396[1990]）に由来する以下の技術によって以下のように精製した。pTrc99A TaqPol、pTrc99GTthPolのいずれかを含む大腸菌株（株JM109）を、100 mg/mlアンピシリンを含むLB 3 mlに接種して、37℃で16時間増殖させた。一晩培養物全体を100 mg/mlアンピシリンを含むLB 200 mlまたは350 mlに接種して、激しく振とうしながら37℃でA600が0.8となるまで増殖させた。IPTG（1 M保存溶液）を最終濃度1 mMとなるように加えて、37℃で16時間増殖させた。
【０１３７】
誘導した細胞を沈降させて、細胞沈降物の重量を測定した。2×DG緩衝液（100 mMトリス-HCl、pH 7.6、0.1 ml EDTA）を等量加えて、沈降物を攪拌によって懸濁した。50 mg/mlライソザイム（Sigma社）を最終濃度が1 mg/mlとなるように加えて、細胞を室温で15分間インキュベートした。デオキシコール酸（10％溶液）を滴下して、攪拌しながら最終濃度が0.2％となるように加えた。H2O 1倍量および2×DG緩衝液1倍量を加えて、得られた混合物を氷中で2分間超音波処理して、混合物の粘度を減少させた。超音波処理後、3 M (NH4)2SO4を最終濃度0.2 Mとなるように加えて、溶解物を14000×gで4℃で20分間遠心した。上清を除去して、70℃で60分間インキュベートしてから10％ポリエチルイミン（PEI）を0.25％となるように加えた。氷中で30分間インキュベートした後、混合物を14,000×gで4℃で20分間遠心した。この時点で、上清を除去して、(NH4)2SO4を加えて以下のように蛋白質を沈殿させた。
【０１３８】
3 M (NH4)2SO4の2倍量を加えて蛋白質を沈殿させた。混合物を室温で16時間一晩インキュベートした後4℃、14,000×gで20分間遠心した。蛋白質沈殿物をQ緩衝液（50 mM トリス-HCl、pH 8.0、0.1 mM EDTA、0.1％ツイーン20）0.5 mlに懸濁した。懸濁した蛋白質調製物をA279の測定によって定量して、透析して50％グリセロール、20 mMトリスHCl、pH 8.0、50 mM KCl、0.5％ツイーン20、0.5％ノニデット P-40において、100 μg/ml BSAと共に保存した。
【０１３９】
AveFEN1ヌクレアーゼのクローニングおよび発現
新しい遺伝子ファミリーメンバーをクローニングする一般的な方法は、そのファミリーにおける保存されたアミノ酸配列に対して相補的な縮重オリゴヌクレオチドを用いてPCR反応を行い、その後遺伝子特異的PCR断片をクローニングおよびシークエンシングすることである。次に、残りの遺伝子配列を得るために、この配列情報を用いて、PCR歩行反応において用いることができるセンスおよびアンチセンス遺伝子特異的プライマーをデザインすることができる（Nucleic Acids Res. 1995a、23(6)1087〜1088）。次に、センスおよびアンチセンスPCR歩行から得た配列を組み合わせて、関係する遺伝子の完全なオープンリーディングフレーム（ORF）に関するDNA配列を作製することができる。完全なORFが判明すれば、遺伝子の5'末端と3'末端の双方に対して特異的なプライマーをデザインして、ゲノムDNAに関してPCR反応を行って、遺伝子全体を増幅することができる。次に、この生物特異的な増幅された断片を発現ベクターにクローニングすることができ、当技術分野で既知の方法によって、および下記に詳細に示すように、関係する蛋白質を発現させて精製することができる。
【０１４０】
A．Ave FEN1遺伝子の配列を得るための縮重PCRとPCR歩行
Pyrococcus furiosus（配列番号：27）、Methanococcus jannaschii（配列番号：28）、Methanobacterium thermoautotrophicum（配列番号：29）、およびArchaeoglobus fulgidus（配列番号：30）からのFEN1遺伝子の蛋白質配列を並置して、保存されたアミノ酸のブロックを同定した。保存された配列ブロックVFDG（バリン、フェニルアラニン、アスパラギン酸、グリシン）、EGEAQ（グルタミン酸、グリシン、グルタミン酸、アラニン、グルタミン）、SQDYD（セリン、グルタミン、アスパラギン酸、チロシン、アスパラギン酸）、およびGTDYN/GTDFN（グリシン、トレオニン、アスパラギン酸、チロシンまたはフェニルアラニン、アスパラギン）を、全ての古細菌FEN1遺伝子に存在する可能性がある配列として選択した。これらの保存配列ブロックのそれぞれに関して縮重オリゴヌクレオチドをデザインした。オリゴヌクレオチドのFEN1遺伝子特異的部分の他に、ネステッドPCRを行うためにオリゴヌクレオチドの5'末端に15ヌクレオチドのテール部を付加した。縮重オリゴヌクレオチドがFEN1遺伝子のセンスまたはアンチセンス鎖を標的とするか否かに応じて、異なるテール配列を用いた。
【０１４１】
オリゴヌクレオチドのフォワードおよび／またはリバース版を作製して、FEN1遺伝子のセンスおよびアンチセンス鎖をそれぞれ標的とした。オリゴヌクレオチドはVFDG-Fwd（配列番号：31）、EGEAQ-Fwd（配列番号：32）、QDYD-Fwd（配列番号：33）、EGEAQ-Rev（配列番号：34）、SQDYD-Rev1（配列番号：35）、SQDYD-Rev2（配列番号：36）、およびGTDYN-Rev（配列番号：37）である。SQDYD-Rev配列に関しては、セリンが6個の異なるコドンによってコードされているために、二つのオリゴヌクレオチドを作製した。PCRにおいて用いる場合、SQDYD-Rev1とSQDYD-Rev2オリゴヌクレオチドは1：2の比率で混合した。QDYD-Fwdオリゴヌクレオチドの場合、保存されたSQDYD配列の最後の4個のアミノ酸のみをターゲティングすることによって、混合する必要はなかった。GTDYN-Revオリゴヌクレオチドも同様に、チロシンおよびフェニルアラニンのコドンがヌクレオチド3個中2個を共有するために、配列GTDFNを認識する。
【０１４２】
第一に、下記のように生きた細菌株1バイアルからゲノムDNAを調製した。全ての細菌株はDSMZ（ドイツ微生物細胞培養コレクション、Acidianus ambivalens−DSM #3772）から得た。細胞を凍結乾燥した場合、それらをTNE（10 mMトリスHCl、pH 8.0、1 mM EDTA、100 mM NaCl）200 μlに再懸濁した。細胞が液体懸濁液の場合、それらは20,000×gで2分間遠心して、細胞沈降物をTNE 200 μlに再懸濁した。20％SDS（ドデシル硫酸ナトリウム）20 μlおよび1 mg/mlプロテナーゼK 2 μlを加えて、懸濁液を65℃で30分間インキュベートした。溶解した細胞懸濁液を緩衝フェノール、1：1フェノール：クロロホルム、およびクロロホルムにおいてこれらの順で連続して抽出した。核酸は、等量の冷100％エタノールを加えて沈殿させた。核酸は20,000×gで5分間遠心することによって沈降させた。核酸沈降物を70％エタノールによって洗浄して、空気乾燥させ、TE（10 mMトリスHCl、pH 8.0、1 mM EDTA）50 μlに再懸濁した。最終的なDNA沈降物をTE（10 mMトリスHCl、pH 8.0、1 mM EDTA）50 μlに再懸濁した。
【０１４３】
ネステッドPCRの両反応は、Advantage cDNA PCRキット（Clontech社）を用いて製造元の説明書に従って、全てのオリゴヌクレオチドに関して最終濃度1 μMで行った。第一の反応は、フォワードおよびリバース縮重オリゴヌクレオチドの可能な6通りの組み合わせによって容積20 μlにおいて行い、この中には、上記のゲノムDNA調製物のいずれか1 μlが含まれる。サイクリング条件は、95℃で15秒、50℃または55℃で15秒、および68℃で30秒を20サイクルであった。第二の反応は、上記の縮重オリゴヌクレオチドの5'テール配列と同じ配列を有するプライマーを利用する。二つのプライマーは、203-01-01（配列番号：38）および203-01-02（配列番号：39）である。第二の反応は、20サイクルの代わりに30サイクルを行ったことと、反応容積が25 μlであったことを除き、第一の反応に関して記述したものと全く同様に行う。第二のPCRの後、反応物5 μlを2％または4％アガロースゲル上にローディングして、エチジウムブロマイド染色によってDNAを可視化した。全てのプライマー対に関して既に同定されたFEN1配列に基づいて予想される産物の大きさは、以下の通りである：VFDG-FwdおよびEGEAQ-Rev：275塩基対、VFDG-FwdおよびSQDYD-Rev；325塩基対、VFDG-FwdおよびGTDYN-Rev；510塩基対、EGEAQ-FwdおよびSQDYD-Rev；100塩基対、EGEAQ-FwdおよびGTDYN-Rev；290塩基対、QDYD-FwdおよびGTDYN-Rev；230塩基対。プライマー対、VFDG-FwdおよびEGEAQ-Revは、試みた全てのDNA試料に関して正確な大きさのDNA産物を生成することが可能であった。プライマー対、VFDG-FwdおよびGTDYN-Revは、試みたDNA試料のほとんどに関して正確な大きさのDNA産物を生成することが可能であった。
【０１４４】
予想される大きさのDNA産物を縮重PCRによって作製する場合、そのDNA断片を単離して、pGEM-T Easyライゲーションキットを用いて製造元の説明書に従ってpGEM-T Easy（Promega社）にクローニングした。DNA配列を決定して、配列を用いてFEN1遺伝子の残りをクローニングするためにセンスおよびアンチセンスゲノム歩行オリゴヌクレオチドを作製した。オリゴヌクレオチドは、ゲノム歩行PCR反応に関して様々なゲノムDNA試料を調製するために用いたゲノムウォーカーキット（Clontech社）のパラメータに従ってデザインした。
【０１４５】
ゲノムDNAは、ランダム12量体オリゴヌクレオチドを用いてランダムに増幅した。PCR反応物100 μlをAdvantage cDNA PCRキット（Clontech社）と共に設定して、これはゲノムDNA 10 μlを含み、15 μMランダム12量体オリゴヌクレオチドを含んだ。以下のパラメータを用いて50サイクルを行った：95℃で30秒、50℃で30秒、68℃で5分。PCR反応が完了した後、増幅したDNAをHigh Pure PCR産物精製キット（Boehringer Mannheim社）によって精製した。精製したDNAを10 mMトリスHCl、pH 8.5の全量200 μlに溶出させた。
【０１４６】
ゲノム歩行プロトコールは3段階からなる。最初に、ゲノムDNA試料を、異なる5個の反応において異なる5個の平滑末端制限酵素によって切断する。第二に、切断したDNAを、タグ配列としての役割を有するアダプターにライゲーションして、同様に、バックグラウンド増幅を防止するようにデザインする。第三に、ライゲーションしたDNAを、遺伝子特異的プライマー、およびアダプター配列の一部として同じ配列を有するプライマーによって増幅する。
【０１４７】
制限消化物50 μlは、ランダム増幅ゲノムDNAおよびDra I制限酵素30 μlを含んだ。37℃で4時間後、切断したDNAを、GENECLEAN II（Bio 101社）またはQIAEX II（Qiagen社）のいずれかによって、製造元の説明書に従って精製した。DNAは、いずれの場合においても10 mMトリスHCl、pH 8.5、10 μlに溶出した。この切断DNA 5.6 μlを、6 μMゲノムウォーカーアダプターを含むライゲーション反応物10 μlにおいて用いた。反応は、室温で一晩行った後、70℃で10分間加熱してT4 DNAリガーゼを不活化した。次に、ライゲーション反応物をTE（10 mMトリスHCl、pH 8.0、1 mM EDTA）70 μlによって希釈した。
【０１４８】
希釈したライゲーション混合物1μlを、PCR反応物25 μlにおいて、0.2 μM遺伝子特異的プライマーと、ゲノムウォーカーアダプターの5'部分と同じ配列を有する0.2 μMプライマーAP-1（Clontech社）と共に用いた。それぞれのDNA試料に関して10回の反応を行った。アンチセンス歩行PCR反応（ゲノム試料を切断するために異なる制限酵素5個に関して）5回はセンス遺伝子特異的プライマーを用いて行い、センス歩行PCR反応5回はそれぞれのDNA試料に関するアンチセンス遺伝子特異的プライマーを用いて行った。サイクリングパラメータは、Universal Genome Walking キット（Clontech社）によって推奨された通りに行い、以下の通りであった；94℃で25秒および72℃で3分を7サイクル、94℃で25秒および67℃で3分を32サイクルの後に、67℃で7分。
【０１４９】
Archaeoglobus veneficus（Ave）ゲノム歩行は以下の通りに行った。一次アンチセンスプライマーはAve 34AS（配列番号：40）および一次センスプライマーはAve 65S（配列番号：41）であった。ネステッドPCR反応は、ネステッドプライマーAP-2と、ネステッドアンチセンスプライマーAve 32AS（配列番号：42）またはネステッドセンスプライマーAve 67S（配列番号：43）のいずれかとを用いて行った。ネステッド反応25 μlは、一次PCR歩行反応に関して先に記述した通りに行った。一次反応物をH2Oにおいて50倍希釈して、それらの希釈液0.5 μlをネステッドPCR反応に加えた。ネステッドPCR反応のサイクリングパラメータは、Universal Genome Walking キット（Clontech社）によって推奨された通りに行い、以下の通りであった；94℃で25秒および72℃で3分を5サイクル、94℃で25秒および67℃で3分を20サイクルの後に、67℃で7分。Stu I切断Aveゲノム試料上でのネステッドアンチセンスPCR反応によって、1キロベースDNA産物が生成され、これを製造元の説明書に従ってpGEM-T Easy（Promega社）にクローニングしてシークエンシングした。EcoRV切断Aveゲノム試料上でのネステッドセンスPCR反応によって1.1キロベースの産物が生成され、これをこれを製造元の説明書に従ってpGEM-T Easy（Promega社）にクローニングしてシークエンシングした。
【０１５０】
Ave FEN-1ヌクレアーゼIの発現ベクターへのクローニング
PCR反応は、先にデザインしたプライマーおよび関係する微生物からのゲノムDNAを用いて行った。PCR産物をゲル精製した後、PCRプライマーに組み入れられる部位に対応する制限エンドヌクレアーゼによって切断した。切断されたPCR産物をより小さい消化断片から精製して、これらの切断産物を発現ベクターにクローニングした。場合によっては、これは、形質転換および蛋白質発現／精製の前のクローニングプロセスの最終段階であった。場合によっては第五段階が必要であった。場合によっては、クローニングにとって必要なプライマー配列の結果としてORFに組み入れられた如何なるヌクレオチドも除去するために、変異誘発段階を行わなければならなかった。
【０１５１】
最後に、細菌宿主（例えば、大腸菌JM109）を、クローニングしたFEN-1を含む発現ベクターによって形質転換して、蛋白質発現および精製を下記のように行った。
【０１５２】
Archaeaglobus veneficus（Ave）からのFEN-1のクローニングは、DSM#11195ゲノムDNAおよびPCRプライマーAve
Figure 2005503114
およびAve
Figure 2005503114
を用いて上記の通りに行った。用いた変異誘発オリゴヌクレオチドは、Ave
Figure 2005503114
であった。Ave FEN-1エンドヌクレアーゼをコードするオープンリーディングフレーム（ORF）を、配列番号：47に提供する。このORFによってコードされたアミノ酸配列を配列番号：48に提供する。
【０１５３】
組み換え型Ave FEN-1蛋白質の大規模調製
Ave FEN-1蛋白質は、以下のようなTaq DNAポリメラーゼ調製プロトコール（Engelkeら、Anal. Biochem. 191：396[1990]）に由来する以下の技術によって精製した。上記の構築物を含む大腸菌細胞（株JM109）を、100 μg/mlアンピシリンを含むLB（ルリアブロス）3 mlに接種して37℃で16時間増殖させた。一晩培養物全体を、100 μg/mlアンピシリンを含むLB 200 mlまたは350 mlに接種して、A600が0.8となるまで激しく振とうしながら37℃で増殖させた。IPTG（1 M保存液）を最終濃度1 mMとなるように加えて、37℃で16時間インキュベートした。
【０１５４】
誘導した細胞を沈降させて、細胞沈降物の重量を測定した。2×DG緩衝液（100 mMトリス-HCl、pH 7.6、0.1 ml EDTA）の等量を加えて、沈降物を攪拌によって再懸濁した。50 mg/mlライソザイム（Sigma社）を最終濃度が1 mg/mlとなるように加えて、細胞を室温で15分間インキュベートした。デオキシコール酸（10％溶液）を滴下して、攪拌しながら最終濃度が0.2％となるように加えた。H2O 1倍量および2×DG緩衝液1倍量を加えて、得られた混合物を氷中で2分間超音波処理して、混合物の粘度を減少させた。超音波処理後、3 M (NH4)2SO4を最終濃度0.2 Mとなるように加えて、溶解物を14000×gで4℃で20分間遠心した。上清を除去して、70℃で60分間インキュベートしてから10％ポリエチルイミン（PEI）を0.25％となるように加えた。氷中で30分間インキュベートした後、混合物を14,000×gで4℃で20分間遠心した。この時点で、上清を除去して、(NH4)2SO4を加えて以下のようにFEN-1蛋白質を沈殿させた。
【０１５５】
固体(NH4)2SO4最終濃度が3 M（〜75％飽和）となるように加えて、FEN-1蛋白質を沈殿させた。混合物を氷中で30分間インキュベートした後、蛋白質を4℃、14,000×gで20分間遠心した。蛋白質沈降物をQ緩衝液（50 mM トリス-HCl、pH 8.0、0.1 mM EDTA、0.1％ツイーン20）0.5 mlに再懸濁した。再懸濁した蛋白質調製物をA279の測定によって定量した。
【０１５６】
電荷平衡プローブを用いたINVADERアッセイ
本実験は、以下のCy3-標識オリゴヌクレオチドを利用した：
Figure 2005503114
（配列番号：1；「オリゴ61」とも呼ばれる）。オリゴ61は、実効陽性荷電標識産物を切断すると放出するようにデザインした。実効陽性荷電5'末端標識産物がINVADER方向切断アッセイにおいてCLEAVASE酵素によって認識されるか否かを調べるため、プローブオリゴ61（配列番号：1）およびINVADERオリゴヌクレオチド67（配列番号：2）を、DNAシンセサイザー（ABI 391）において標準的なホスホアミダイト化学およびGlen Research社（スターリング、バージニア州）から得た試薬を用いて化学合成した。
【０１５７】
それぞれのアッセイ反応は、M13mp 18一本鎖DNA 100 fmole、プローブ（配列番号：1）およびINVADER（配列番号：2）オリゴヌクレオチドをそれぞれ10 pmole、ならびにCLEAVASE A/G 20単位を、10 mM MOPS、pH 7.4と共に100 mM KClの溶液10 μlからなった。蒸発を防止するために試料の上に鉱油を載せた。試料を50℃、55℃、60℃、または65℃にして、40 mM MnCl2 1μlを加えて切断を開始した。反応を25分間進行させた後、20 mM EDTAおよび0.02％メチルバイオレットを含む95％ホルムアミド10 μlを加えて終了させた。陰性対照実験は、標的M13mp 18を欠損し、60℃で行った。それぞれの反応の5 μlを20％変性ポリアクリルアミドゲル（クロスリンク29：1）の個々のウェルに、8 M尿素の45 mMトリス-ホウ酸塩（pH 8.3）および1.4 mM EDTAを含む緩衝液溶液と共にローディングした。20ワットの電場を30分間適用して、電極は図19Bに示す方向であった（すなわち、逆方向）。これらの反応の産物は、FMBIO蛍光イメージャーを用いて可視化して、得られたイメージャーのスキャンを図19Bに示す。
【０１５８】
図19Aは、標的M13mp 18 DNAに沿ったINVADER（配列番号：2）およびプローブ（配列番号：1）のアラインメントを示す略図を提供する；M13mp 18配列の53塩基のみを示す（配列番号：49）。INVADERオリゴヌクレオチドの配列をM13mp 18標的の下に示し、矢印を用いてM13mp 18配列の上に、プローブおよび標的と比較したINVADERの位置を示す。図19Aに示すように、INVADERおよびプローブオリゴヌクレオチドは、重なり合う2塩基の領域を共有する。
【０１５９】
図19Bにおいて、レーン1〜4はそれぞれ、50℃、55℃、60℃、および65℃で行った反応を含む：レーン5は、対照反応を含んだ（標的を欠損する）。図19Bにおいて、切断産物はパネルの上半分の暗いバンドとして示される；より低い位置に認められたかすかなバンドは、生成された一次産物の量に比例しているように思われ、本発明は特定のメカニズムに限定されないが、これは一つのヌクレオチドを二本鎖に切断することを表す可能性がある。切断されないプローブはゲルに入らず、このように目に見えない。対照レーンは、バックグラウンドに対して検出可能なシグナルを示さなかった（レーン5）。侵入性の切断反応において予想されるように、特異的切断産物の蓄積速度は、温度依存的であった。これらの特定のオリゴヌクレオチドおよび標的を用いて、産物の最も速い蓄積速度は55℃で認め（レーン2）、65℃では非常にわずかな産物を認めた（レーン4）。
【０１６０】
高温で長時間インキュベートすると、DNAプローブは、非特異的に切断することができ（すなわち、熱分解を受ける）、得られた断片は、分析に対して妨害するバックグラウンドに関与する。そのような熱分解産物は、単一のヌクレオチドから完全長のプローブまでに及ぶ。この実験において、切断産物の電荷に基づく分離（すなわち電荷の逆転）によって、熱分解によって生じたプローブ断片からの標的依存的切断の特異的産物の感度のよい分離を行うことができるか否かを調べた。
【０１６１】
この検出法の感度限界を調べるために、標的M13mp 18 DNAを1 fmoleから1 amoleの範囲で10倍連続希釈した。INVADERおよびプローブオリゴヌクレオチドは、上記の通りであった（すなわちそれぞれ、配列番号：2および1）。侵入性の切断産物は、以下の改変を行って上記のように行った：反応は55℃で行い、100 mM KClの代わりに250 mMまたは100 mM KGluを用いて、INVADERオリゴヌクレオチド1pmoleのみを加えた。反応は上記のように開始して、12.5時間進行させた。M13mp 18標的DNAを欠損する陰性対照反応も同様に行った。反応は、20 mM EDTAおよび0.02％メチルバイオレットを含む95％ホルムアミド10 μlを加えて終了させ、これらの混合物5 μlを電気泳動して、上記のように可視化した。得られたイメージャースキャンを図20に示す。
【０１６２】
図20において、レーン1は陰性対照を含む；レーン2〜5は100 mM KGluを用いて行った反応を含む；レーン6〜9は、250 mM KGluを用いて行った反応を含む。レーン2および6において分離した反応物は、標的DNA 1 fmoleを含む。レーン3および7の反応物は標的100 amoleを含んだ；レーン4および8の反応物は標的10 amoleを含み、そしてレーン5および9の反応物は標的1 amoleを含んだ。図20に示す結果は、電荷の逆転を用いて侵入性切断反応における特異的切断産物の産生を検出する検出限界が、標的分子1アットモルまたは約6.02×105個またはそれ未満であることを示している。対照レーンには、検出可能なシグナルを認めず、これは非特異的加水分解または他の分解産物が酵素特異的切断産物と同じ方向に移動しないことを示している。Cy3の励起および放出最大値はそれぞれ554および568であるが、FABIOイメージャーアナライザは532で励起して585で検出する。したがって、特異的切断産物の検出限界は、より厳密にマッチさせた励起源と検出フィルターとを用いることによって改善することができる。
【０１６３】
実施例3
CLEAVASE A/GまたはPfu FEN-1ヌクレアーゼを用いた侵入性切断速度に及ぼす5'陽電荷の影響の試験
陽性荷電付加物を含むプローブオリゴヌクレオチドの5'末端上の陽電荷が、CLEAVASE A/GまたはPfu FEN-1ヌクレアーゼのプローブ5'アームの切断能に影響を及ぼすか否かを調べるために、以下の実験を行った。
【０１６４】
以下の配列を有する二つのプローブオリゴヌクレオチドをINVADER反応において用いた：プローブ34-180-1：
Figure 2005503114
式中、NはCy3またはフルオレセイン基（それぞれ、配列番号：50または51）のいずれかを含むスペーサーを表す、およびプローブ34-180-2：
Figure 2005503114
式中、Nは、TETまたはフルオレセイン基（それぞれ、配列番号：52または53）のいずれかを含むスペーサーを表す。プローブ34-180-1（配列番号：50）は、二つの5'末端T残基上にアミノ改変基、および5'末端にCy3標識を有し、5'末端に余分の陽電荷を作製する。プローブ34-180-2（配列番号：52）は、5'末端にTET標識を有し、余分の陽電荷を有しない。プローブ34-180-1の3'末端上のフルオレセイン標識によって、標準的な方向に泳動したアクリルアミドゲルにおいて3'切断産物と非切断プローブの同時可視化を行うことができる（すなわち、陽極方向に移動するDNAと共に）。プローブ34-180-1の5'切断産物は実効陽電荷を有し、非切断プローブと同じ方向には移動せず、このように、反対方向に泳動したゲル上での分離によって可視化される（すなわち、陰極に向かって移動するDNAと共に）。
【０１６５】
切断反応は以下のように行った。全ての条件は1試料あたり2本ずつ行った。Pfu FEN-1およびCLEAVASE A/Gヌクレアーゼに関して酵素混合物を作製した。Pfu FEN-1ミクス各2 μlはPfu FEN-1 100 ngと7.5 mM MgCl2とを含んだ。CLEAVASE A/Gヌクレアーゼミクス各2 μlは、CLEAVASE A/Gヌクレアーゼ26.5 ngと4.0 mM MnCl2とを含んだ。緩衝液、M13mp 18およびINVADERオリゴヌクレオチドを含む四つのマスターミクスを作製した。ミクス1の各7 μlは、10 mM HEPES（pH 7.2）中にM13mp 18、5 fmole、INVADERオリゴヌクレオチド123（配列番号：54）10 pmoleを含んだ。ミクス2の各7 μlは、10 mM HEPES（pH 7.2）中にM13mp 18、1 fmole、INVADERオリゴヌクレオチド123、10 pmoleを含んだ。ミクス3の各7 μlは、10 mM HEPES（pH 7.2）、250 mM KGlu中にM13mp 18、5 fmole、INVADERオリゴヌクレオチド123、10 pmoleを含んだ。ミクス4の各7 μlは、10 mM HEPES（pH 7.2）、250 mM KGlu中にM13mp 18、1 fmole、INVADERオリゴヌクレオチド123、10 pmoleを含んだ。各ミクス7 μl毎にプローブ34-180-1（配列番号：50）またはプローブ34-180-2（配列番号：52）のいずれか10 pmoleを加えた。上記のDNA溶液はCHILLOUT蒸発防止バリア10 μlで覆って、65℃にした。ミクス1〜2に関して行う反応は、Pfu FEN-1ミクス2 μlを加えて開始して、ミクス3〜4に関して行う反応は、CLEAVASE A/Gヌクレアーゼミクス2 μlを加えて開始した。65℃で30分後、10 mM EDTAを含む95％ホルムアミド8 μlを加えて反応を終了させた。試料を90℃で1分間加熱した直後に、45 mMトリス-ホウ酸塩（pH 8.3）、1.4 mM EDTAを含む緩衝液において7 M尿素を含む20％変性アクリルアミドゲル（19：1クロスリンク）によって、および45 mMトリス-ホウ酸塩（pH 8.3）、1.4 mM EDTAを含む緩衝液において20％未変性アクリルアミドゲル（29：1クロスリンク）によって電気泳動を行った。
【０１６６】
切断反応産物は、電気泳動後にHitachi FNBIO蛍光イメージャーによって可視化した。得られた像を図21に示す。図21Aは、標準的な電気泳動方向に泳動させた変性ゲルを示し、図21Bは、逆方向に泳動させた未変性ゲルを示す。Pfu-FEN-1およびCLEAVASE A/Gヌクレアーゼによって産生された反応産物をそれぞれ、レーン1〜8および9〜16に示す。M13mp 18、5 fmoleとM13mp 18、1 fmoleの反応からの産物をレーン1〜4、9〜12（5 fmole）、および5〜8、13〜16（1 fmole）に示す。プローブ34-180-1は、レーン1〜2、5〜6、9〜10、13〜14であり、プローブ34-180-2はレーン3〜4、7〜8、11〜12、15〜16である。
【０１６７】
全ての切断反応からのフルオレセイン標識3'末端断片を図21Aにおいて左側の「3'」の印で示す。3ヌクレオチド5' TET標識産物は、この図では認められないが、5' Cy3-標識産物は図21Bに示される。
【０１６８】
図21Aにおける3'末端のバンドを用いて、異なる5'末端標識の存在下で異なる酵素による切断速度を比較することができる。存在する標的核酸の量にかかわらず、Pfu FEN-1とCLEAVASE A/Gヌクレアーゼはいずれも、5' TET標識プローブからの産物をより多く示すことがこのバンドからわかる。Pfu FEN-1では、この選択性が中等度であり、シグナルの約25〜40％増加を認めたに過ぎなかった。しかし、CLEAVASE A/Gヌクレアーゼの場合、5' TET標識に対して強い選択性を認めた。したがって、産物を分離するために電荷逆転法を用いた場合、産物の実質的な量はCLEAVASE A/Gヌクレアーゼ触媒反応から認められるが、Pfu FEN-1ヌクレアーゼは、Cy3標識プローブの切断にとって好ましい酵素である。
【０１６９】
実施例4
5'ホスホアミダイト（陽性荷電ホスホアミダイトまたは中性ホスホアミダイト）の固相支持体への手動でのカップリング
本実施例は、それによって陽電荷または中性電荷を有するホスホアミダイトを固相支持体上のオリゴヌクレオチドにカップリングさせることができる一つの手段を示す。下記のカップリング方法は、例として提供するのであって、制限するためではない；他のカップリング法も同様に有効であることが証明される可能性がある。
【０１７０】
Pyrex Brandのファイバーガラスウールの1/4インチプラグ（Aldrich社、カタログ番号Z 25,289-0）を、最初にパスツールピペットまたは類似の装置を用いてガラスウールをシリンジの底に押し込んで、その後ピストンによって圧縮することによって、2.5 mlハミルトン気密シリンジ（VWR社、カタログ番号90168）にきっちりと充填した。ピストンを抜いて、オリゴヌクレオチド配列、配列番号：55（なおも5'末端がジメトキシトリチル[DMT]部分で保護されている）とカップリングした乾燥コントロールポアガラス（CPG）支持体約40 mgを、充填したガラスウール上部のシリンジに加えた。加えたCPGの量は、合成したCPGのバッチと共に変化して、固相支持体上にローディングしたオリゴヌクレオチドの量に特に依存する。ピストンを再度挿入してガラスウール上にCPGカップリングDNAを充填するように押した。5インチの18ゲージルアーロック針をシリンジに取り付けて、全ての試薬を針を通して反応管（シリンジ）に入れた。残りの技法のあいだ、ピストンはシリンジの中に入れたままであった。
【０１７１】
ピストンを再度挿入すると、CPG-オリゴヌクレオチド複合体を塩化メチレンによって、1 mlを針を通してシリンジに入れて、3〜5回上下にして、ピストンを押して洗浄液を押し出すことによって、3回洗浄した（孔径3-オングストロームで活性化したものを保存、分子ふるい[Aldrich社、カタログ番号20,858-2]）。
【０１７２】
次に、反応物を脱ブロック（塩化メチレン中において3％に希釈したジクロロ酢酸[15％塩化メチレン溶液をGlen Research社に特別注文した]）溶液1 mlによって洗浄して、上記のようにDMTを除去した。洗浄は、遊離のトリチル基によって生成したオレンジ色が完全に消失するまで行い、3回全ての洗浄に関して最大インキュベーション時間は1分であった。
【０１７３】
最後の洗浄後、反応物をアセトニトリル：ピリジンの1：1混合物1 mlによって3回中和して、水素化カルシウム上で保存した。この後、2 mlをアセトニトリルによって洗浄して、水素化カルシウム上で保存することを8回行った。適当なホスホアミダイト溶液（50〜100 mM陽性荷電または中性ホスホアミダイトのアセトニトリル溶液、水素化カルシウム上で保存）1.5 mlおよび活性化剤（0.25 M 5-エチルチオ-1H-テトラゾール[Glen Research社、カタログ番号30-3140]の活性化分子ふるい上での無水アセトニトリル溶液）1 mlをシリンジに引き上げた。シリコンストッパー（Aldrich社、カタログ番号Z16608-1）を用いて針を密封して、手で室温で20分間軽く揺り動かした。
【０１７４】
20分間インキュベーションの後、溶液を押し出し、水素化カルシウム上で保存したアセトニトリル1 mlによる6回洗浄を上記のように行った。酸化剤（0.02 Mヨウ素のテトラヒドロフラン／ピリジン／水[Glen Research社、カタログ番号40-4330]）2 mlをシリンジに入れて、針を再度シリコンストッパーによって密封して、反応物を室温で3分間軽く揺り動かした。この後、アセトニトリル（水素化カルシウム上で保存）1 mlによる洗浄を4回行い、アセトニトリル：ピリジン（水素化カルシウム上で保存した1：1混合物）1 mlによる洗浄を2回行った。Cap B溶液（10％n-メチルイミダゾールの8：1テトラヒドロフラン：ピリジン[PE Biosystems社]溶液）1 ml、およびCap A（THF／無水酢酸、9：1、PE Biosystems社）1 mlをシリンジにとって、針にキャップをして反応物を室温で3分間軽く揺り動かした。この後、アセトニトリル：ピリジン（1：1、水素化カルシウム上で保存）1 mlによる洗浄を6回、および活性化分子ふるい上で保存した塩化メチレン1 mlによる洗浄を5回行った。
【０１７５】
その後手動のカップリングを行う場合、脱ブロック洗浄から開始して上記の技法を繰り返すことができる。その後の自動カップリングに関して、支持体を合成カラムに移してシンセサイザーに結合させることができる。反応が完了すれば、脱ブロックによって洗浄し、上記のようにアセトニトリル：ピリジン1 mlによる洗浄3回によって中和して、アセトニトリル2 mlによる洗浄を8回行うことによって5'ジメトキシトリチルを除去することができる。
【０１７６】
脱保護プロトコール
新たに改変したオリゴヌクレオチドを有する乾燥支持体（CPG）を、テフロンを裏打ちしたキャップを備えた（Wheaton、240408）4 mlガラスバイアル（Wheaton、224801）に移した。濃水酸化アンモニウム（EM Sciences AX 1303-13）1 mlを加えて、反応物を室温で一晩インキュベートした。次に、使い捨ての1 mlシリンジ（B-D、309602）を用いて混合物を0.2 μmテフロンAcrodiscフィルター（Gelman、4423T）を通して濾過して、最終的にspeedvacにおいて完全に乾燥させた。
【０１７７】
実施例5
陽性荷電ホスホアミダイトの合成
1）モノ-DMT保護4,4'-トリメチレン(ビス(1-ピペリジンエタノール))の調製：
4,4'-トリメチレン(ビス(1-ピペリジンエタノール))[Aldrich社、カタログ番号12,122-3]10 g（33.4 mmol）およびN-N-ジ-イソプロピルエチルアミン[Aldrich社、カタログ番号38,764-9]1.46 ml（8.4 mmol）を250 ml丸底フラスコ（ChemGlass社、カタログ番号CG-1506のような）において混合した。磁気攪拌棒を加えて、中等度の速度で攪拌を開始した。塩化4,4'-ジメトキシトリチル（Aldrich社、カタログ番号10,001-3）2.84 g（8.4 mmol）を絶えず攪拌しながらゆっくりと（約1分間にわたって）固体として徐々に加えた。フラスコをゴム製の隔膜で覆って、反応物を絶えず攪拌しながら完了するまで室温で約1時間インキュベートした。反応物を薄層クロマトグラフィー（EM Science 60F254、VWR社からのシリカプレート、カタログ番号5715-7）によって、当技術分野で既知の標準的な方法を用いて、開始材料である塩化4,4'-ジメトキシトリチルがクロマトグラフィープレート上に検出されなくなるまでモニターした。次に、反応産物を濾過して4.5×25 cmのガラスクロマトグラフィーカラム（ガラスフリットとテフロン停止栓を備える）および70〜230メッシュの60オングストロームのシリカゲル（Aldrich社、カタログ番号28,862-4）を用いてカラムクロマトグラフィーによって精製した。展開溶媒は5％メタノール、5％トリエチルアミン、および90％塩化メチレンの溶液であった。クロマトグラフィーは、当技術分野で既知の標準的な方法によって行った。産物は黄色の油で、収率は4.8 g（95％）であり、TLCによって決定したRf値は0.55であった。TLCはEM Science 60F254シリカプレート（VWR社、カタログ番号5715-7）を用いて、5％トリエチルアミン／95％ジオキサンの展開緩衝液において行った。
【０１７８】
2）ホスホアミダイトの調製：
上記の反応において合成したモノ-DMT保護4,4'-トリメチレン(ビス(1-ピペリジンエタノール))1.3 g（2.2 mmol）を250 ml丸底フラスコにおいてアセトニトリル20 mlと共に3回共蒸発させた。ドライアイス／アルコール濃縮器（Buchi社、モデル番号R-114）を備えたBuchi Rotovaporを蒸発のために用い、混合物をそれぞれの共蒸発に関して完全に乾燥させた。
【０１７９】
次に、乾燥産物を塩化メチレン12 mlに溶解した後、2-シアノエチルテトライソプロピルホスホロジアミダイト（Aldrich社、カタログ番号30,599-5）0.85 ml（2.7 mmol）を加えた。無水アセトニトリル3 mlに溶解したテトラゾール122 mg（1.7 mmol/4 ml）を激しくかき回しながら加えて、反応容器をコルクリングの中に入れて、攪拌装置にテープで取り付けて、中等度の速度で室温で1.5時間攪拌した。反応物をTLCによってモニターして、モノ-DMT保護4,4'-トリメチレン(ビス(1-ピペリジンエタノール))がTLCによって検出されなくなった場合に完了した。
【０１８０】
塩化メチレン25 mlを加えて容積を増加させて、反応物全体を100 ml分液漏斗に移した。等量（約40 ml）の5％重炭酸ナトリウム：1％トリエチルアミン溶液を加えて、混合物を15秒間振とうして平衡にした。下の有機相を漏斗から排水して保持した。上の水相を捨てて、有機相を分液漏斗に戻して、重炭酸ナトリウム／トリエチルアミン洗浄を全体で3回を繰り返した。
【０１８１】
有機相をアーレンマイヤーフラスコに移して、固体硫酸マグネシウム（約20 g）をかき回しながら、固体の塊が検出されなくなるまで徐々に加えた。硫酸マグネシウムを、すりガラスのアダプター（Chemglass社、カタログ番号CG-1406）を備えたブフナー濾紙漏斗によって濾過して、溶液を濃縮して、先細りの丸底フラスコにおいてBuchi Rotovapor上でアセトニトリル20 mlによって2回共蒸発させた。乾燥産物の量を質量で測定した後、アセトニトリルに再度溶解して最終濃度約150〜200 mg/mlとした。水素化カルシウムの顆粒をいくつか加えた。次に、溶解した産物を褐色ガラスバイアル（Wheaton社、カタログ番号224754）に分けて（2 ml／瓶）、最初に水吸引装置によって産物が極めて粘性の油に見えるまで乾燥させた後、五酸化燐（Aldrich社、カタログ番号29822-0）とDRIERITE（VWR社、カタログ番号22891-040）とを含むガラスデシケータ（VWR社）において真空下で一晩乾燥させた。収率は約1.6 g（92.1％）であり、TLCによって測定したRf値は0.7であった。TLCは、展開前EM Science 60F254シリカプレート（VWR社、カタログ番号5715-7）を用いて、展開緩衝液5％トリエチルアミン／95％ジオキサンにおいて行った。
【０１８２】
実施例6
中性ホスホアミダイトの合成
1）モノ-DMT保護N-メチルジエタノールアミンの合成
N-メチルジエタノールアミン8.3 g（70.0 mmol）、ジイソプロピルエチルアミン2.2 ml（12.6 mmol）、およびアセトニトリル100 mlを250 ml丸底フラスコ（Chemglass社、カタログ番号CG-1506のような）において混合した。磁気攪拌棒を加えて、中等度の速度で攪拌を開始した。塩化4,4'-ジメトキシトリチル（Aldrich社、カタログ番号10,001-3）4 g（11.8 mmol）を絶えず攪拌しながら固体として徐々に（約1分間かけて）加えた。フラスコを覆って、反応物を絶えず攪拌しながら完了するまで室温で約1時間インキュベートした。反応物を薄層クロマトグラフィー（EM Science 60F254、VWR社からのシリカプレート、カタログ番号5715-7）によって、当技術分野で既知の標準的な方法を用いてモニターした。反応は、開始材料である塩化4,4'-ジメトキシトリチルがクロマトグラフィープレート上に検出されなくなると完了する。
【０１８３】
1時間インキュベーション後、反応産物をBuchi Rotovaporを用いて濃縮した後、塩化メチレン50 mlに溶解した。溶解した産物を250 mlガラス製の分液漏斗に移して、上記のように5％重炭酸ナトリウム50 mlによって3回洗浄して、飽和塩化ナトリウムによって1回洗浄した。
【０１８４】
次に、反応産物を濾過して4.5×25 cmのガラスクロマトグラフィーカラム（ガラスフリットとテフロン停止栓を備える）および70〜230メッシュの60オングストロームのシリカゲル（Aldrich社、カタログ番号28,862-4）を用いてカラムクロマトグラフィーによって精製した。展開溶媒は5％メタノール、5％トリエチルアミン、および90％塩化メチレンの溶液であった。クロマトグラフィーは、当技術分野で既知の標準的な方法によって行った。産物は黄色の油で、収率は約4.8 g（95％）であり、TLCによって決定したRf値は0.55であった。TLCは、展開前EM Science 60F254シリカプレート（VWR社、カタログ番号5715-7）を用いて、5％トリエチルアミン／95％ジオキサンの展開緩衝液において行った。
【０１８５】
2）ホスホアミダイトの調製
上記の反応において合成したモノ-DMT保護N-メチルジエタノールアミン1.3 g（3.2 mmol）を250 ml丸底フラスコにおいてアセトニトリル（ACN）20 mlと共に3回共蒸発させた。ドライアイス／アルコール、Buchi Rotovapor（Buchi、モデル番号R-114）を蒸発のために用い、混合物はそれぞれの共蒸発に関して完全に乾燥させた。
【０１８６】
次に、乾燥産物を塩化メチレン12.6 mlに溶解した後、2-シアノエチルテトライソプロピルホスホロジアミダイト（Aldrich社、カタログ番号30,599-5）1.2 ml（3.8 mmol）を加えた。テトラゾール／アセトニトリル173 mg（2.5 mmol/4 ml）を激しくかき回しながら加えて、反応容器をコルクリングの中に固定して、攪拌装置にテープで取り付けて、中等度の速度で室温で3時間攪拌した。塩化メチレン25 mlを加えて容積を増加させて、反応物全体を100 ml分液漏斗に移した。等量（約40 ml）の5％重炭酸ナトリウム：1％トリエチルアミン溶液を加えて、混合物を3〜5秒間振とうして平衡にした。下の有機相を漏斗から排水して保持した。上の水相を捨てて、有機相を分液漏斗に戻して、重炭酸ナトリウム／トリエチルアミン洗浄を全体で3回を繰り返した。有機相をアーレンマイヤーフラスコに移して、固体硫酸マグネシウム（約20 g）をかき回しながら、固体の塊が検出されなくなるまで徐々に加えた。硫酸マグネシウムを、すりガラスのアダプター（Chemglass社、カタログ番号CG-1406）を備えたブフナー濾紙漏斗によって濾過して、溶液を濃縮して、先細りの丸底フラスコにおいてBuchi Rotovapor上でアセトニトリル20 mlによって2回共蒸発させた。乾燥産物の量を質量で測定した後、アセトニトリル（および水素化カルシウムの顆粒数個）に再度溶解して最終濃度約150〜200 mg/mlとした。次に、溶解した産物を褐色ガラスバイアル（Wheaton社）に分けて（2 ml／瓶）、最初に水吸引装置によって産物が極めて粘性の油に見えるまで乾燥させた後、五酸化燐（Aldrich社）とDRIERITE（VWR社）とを含むガラスデシケータ（VWR社）において真空下で一晩乾燥させた。収率は約1.9 g（97.0％）であり、TLCによって測定したRf値は0.8であった。TLCは、展開前EM Science 60F254シリカプレート（VWR社、カタログ番号5715-7）を用いて、展開緩衝液5％トリエチルアミン／95％ジオキサンにおいて行った。
【０１８７】
実施例7
1,6-ヘキサンジオールH-ホスフェートの合成
1）DMT保護1,6-ヘキサンジオールの合成
1,6-ヘキサンジオール（Aldrich社、カタログ番号24,011-7）3 g（25 mmol）を無水テトラヒドロフラン（THF）（Aldrich社、カタログ番号18,656-2）120 mlに溶解した。ジイソプロピルエチルアミン（Aldrich社、カタログ番号38,764-9）1.5 ml（1.1 g、88 mmol）を加えて、得られた混合物（水分から保護）を室温で15分間攪拌した。塩化ジメトキシトリチル（DMTCI）3 g（9 mmol）を加えて、溶液を室温で攪拌しながら2時間インキュベートした。得られた混合物をBuchi Rotovapor（Buchi社、モデルR-114）によって減圧下で濃縮して、当技術分野で既知の標準的な方法によって、濃縮材料を濾過してシリカゲルカラム（70〜230メッシュ）／ヘキサン：酢酸エチル1：1を用いてカラムクロマトグラフィーによって精製した。単離された材料（TLCによって決定；Rf＝0.3）を含む分画を合わせて濃縮した。収率は77％であった（2.9 g；7 mmol）。
【０１８８】
2）DMT-1,6-ヘキサンジオールH-ホスフェートの合成
下記の全ての反応は、水分から保護された系において窒素下で行った。
【０１８９】
a）トリイミダゾリド燐の合成（PIm3）
三塩化燐（PCl3、Aldrich社、カタログ番号31,011-5）4.3 ml（5.9 g：43 mmol）を軽く攪拌しながら0℃で無水THF 100 mlに溶解した。温度を0℃に維持して、攪拌を継続し、10分間で、無水THF 40 mlに溶解した塩化トリメチルシリル（Me3Si-Cl、Aldrich社、カタログ番号C7,285-4）18.8 ml（18 g、129 mmol）を反応物に加えた。Me3Si-Clを加えた後、反応混合物を絶えず攪拌しながら0℃で30分間インキュベートした後、絶えず攪拌しながら室温で30分間インキュベートした。最後に、反応混合物を水分から保護して減圧下でその当初の容積の75％まで濃縮した。
【０１９０】
b）H-ホスホネートの合成
上記で合成したDMT-保護1,6-ヘキサンジオール5.9 g（14 mmol）を無水アセトニトリル10 mlに溶解した後、トリイミダゾリド燐（PIm3）溶液に室温で徐々に（絶えず攪拌しながら、約5分間かけて）加えた。反応物を、攪拌しながら室温で4時間インキュベートした後、水100 ml、氷50 g、トリエチルアミン20 mlおよび塩化メチレン50 mlを含む分液漏斗に移した。有機相と水相とを分離させ、有機相（下相）分画を単離した。先に記述したようにTLCによって決定してDMT含有材料が有機分画に存在しなくなるまで抽出を繰り返した。合わせた有機相分画を硫酸マグネシウム上で1時間乾燥させた後、減圧下で濃縮した。濃縮産物を、シリカゲル70〜230メッシュ、塩化メチレン／10％メタノール／5％トリエチルアミンを用いるカラムクロマトグラフィーによって精製した（Rf＝0.5）。
【０１９１】
分画を含む産物を合わせて濃縮した。収率：5.8 g（61％）。次に、最終濃縮産物を無水アセトニトリル50 mlによって5回共蒸発させて、高真空下で18時間乾燥させ、ピリジン／アセトニトリル1：1、18 mlに溶解した。活性化分子ふるい（3オングストローム）を加えた。
【０１９２】
実施例8
H-ホスホネート化学を用いてCREプローブへの改変の手動での導入
2.5 ml気密ハミルトンシリンジ（VWR社、カタログ番号90168）を、DNA CREプローブ（例えば、配列番号：55）をカップリングさせた1μmol CPG支持体（DMT on）にローディングした（実施例4に詳述するように）。
【０１９３】
DMTを除去するために、CPG/オリゴヌクレオチド複合体を二塩化メチレン1 mlによって2回洗浄した（実施例4に詳述するように）後、3％ジクロロ酢酸の二塩化メチレン溶液5 mlによって1分間洗浄した。次に、反応物を無水アセトニトリル／ピリジン1：1、1 mlによって10回洗浄した。最終洗浄後、異なるH-ホスホネート部分（実施例7において合成した1,6-ヘキサンジオールH-ホスホネート；dA-H-ホスホネート、dC-H-ホスホネート、dG-H-ホスホネート、またはdT-H-ホスホネート[Glen Research社、カタログ番号10-1200-05、10-1210-05、10-1220-05、10-1230-05]）5個のうち1個を以下のように加えた。H-ホスホネート溶液（濃度：50〜150 μmol/ml）1 mlおよび塩化トリメチルアセチルの無水アセトニトリル／ピリジン1：1（濃度：100〜250 μmol/ml）溶液1 mlをシリンジに引き入れ、針を密封して、軽く揺り動かしながら室温で5〜10分間インキュベートした。シリンジの内容物を押し出して、アセトニトリル／ピリジン1：1、1 mlによる洗浄を6回行った。最後の洗浄後、一級または二級アミン（例えば、N,N-ジメチルエチレンジアミン、Aldrich社、カタログ番号D15,780-5）0.1〜0.2 gの無水ピリジン溶液1 mlの後に無水四塩化炭素0.5 mlをシリンジに引き入れて、軽く振とうさせながら室温で5〜15分間インキュベートした。シリンジの内容物を押し出し、無水アセトニトリル／ピリジン1：1、1mlによる洗浄を6回行った。この後、塩化メチレン1 mlによる洗浄を6回行い、3％ジクロロ酢酸／二塩化メチレン5 mlによる1分間の洗浄；無水アセトニトリル／ピリジン1：1、1mlによる洗浄を10回；および塩化メチレン1 mlによる洗浄を6回行った。
【０１９４】
乾燥支持体（CPG）を、テフロン内層キャップ（Wheaton社、240408）を備えた4 mlガラスバイアル（Wheaton社、224801）に移した。濃水酸化アンモニウム（EM Sciences AX 1303-13）1 mlを加えて、反応物を55℃で12時間インキュベートした。切断および脱保護が完了した後、アンモニア溶液を含む産物を減圧下で濃縮して、イオン交換HPLCまたは逆相HPLC精製を行った。
【０１９５】
全てのHPLC精製に関して、Hitachi HPLC（インターフェースモデル# D-7000；ポンプモデル#7100；ダイオードアレイ検出器モデル#L-7455）システム、および当技術分野で既知の標準的な方法を用いた。逆相HPLC精製のために用いた特異的条件は：C-18 Dionex分析カラム（4.6×250 mm）で、流速は1 ml/分、100％緩衝液A（0.1 M TEAA）および0％緩衝液B（アセトニトリル）から始めて、緩衝液Bに1％緩衝液B/分の割合で変化させる。当技術分野で既知の方法によって分画を回収して質量分析によって分析し、完全な産物を同定した。
【０１９６】
イオン交換HPLC精製のために用いた特異的条件は以下の通りであった：Amersham Pharmacia Biotech HR 10/10 15Q IEカラム（10×100 mm）で流速は5 ml/分。緩衝液A（20 mM過塩素酸ナトリウム、20 mM酢酸ナトリウム、10％アセトニトリル、pH 7.35）および緩衝液B（600 mM過塩素酸ナトリウム、600 mM酢酸ナトリウム、10％アセトニトリル、pH 7.35）を、勾配において開始と終了時は5％A／95％Bを用い、勾配は約65％B/分で増加させた。当技術分野で既知の方法によって、分画を回収して質量分析によって分析し、所望の産物を同定した。
【０１９７】
実施例9
INVADERアッセイ反応に及ぼすタグ改変の影響
本実施例において、その5'末端に陽性荷電タグを含むオリゴヌクレオチドプローブをINVADERアッセイ反応において調べ、二つの異なるように改変したプローブオリゴヌクレオチドを用いて反応のターンオーバー速度を比較した。ここに、ターンオーバー速度は、単位時間あたりの標的あたりの切断事象の数として定義される。ターンオーバー速度は、Lyamichevら、Biochemistry 39：9523[2000]に記載されるように決定した。
【０１９８】
第一のオリゴヌクレオチドプローブ、
Figure 2005503114
は、実施例2に記載するようにアミノT改変を利用した。
【０１９９】
第二のオリゴヌクレオチドプローブ
Figure 2005503114
を、図11に示すH-ホスホネート改変V-(Hex)を用いて合成した。プローブ203-85-5および490-52のINVADER方向切断は、実効陽性荷電Cy3-標識産物5'-Cy3-アミノT-アミノT-3'および5'-V-(Hex)-C-3'をそれぞれ放出するようにデザインした。第一の産物は、アミノTの後で酵素的切断によって作製し、第二の産物は天然の塩基Cの後の切断によって作製する。
【０２００】
プローブ203-85-5について用いるINVADERオリゴヌクレオチド
Figure 2005503114
および標的オリゴヌクレオチド
Figure 2005503114
を、Glen Research社から得たホスホアミダイト試薬および当技術分野で既知の標準的なホスホアミダイト化学を用いて合成した。下線で示したヌクレオチドは、2'-O-メチル改変を示す。プローブ490-52と共に用いるINVADERおよび標的オリゴヌクレオチドを、単一の分子
Figure 2005503114
に混合した。オリゴヌクレオチドは全てゲル精製して、記述のように定量した（Lyamichevら、上記）。
【０２０１】
アミノT改変プローブ203-85-5を利用するINVADERアッセイ反応は、以下のように行った：反応物10 μlを調製して、これは以下を含んだ（最終濃度）：2 μMアミノ改変プローブ（203-85-5）、1 μM INVADERオリゴヌクレオチド203-85-4（配列番号：58）、1 nM標的オリゴヌクレオチド203-85-3（配列番号：59）、32 nM AfuFEN1 CLEAVASE酵素、10 mM MOPS、pH 7.5、および4 mM MgCl2。
【０２０２】
プローブ490-52（2 μM）を利用するINVADER反応物を、IT5オリゴヌクレオチド（配列番号：60）1 nMを用いたことを除き、上記のように調製して、INVADERオリゴヌクレオチドと標的オリゴヌクレオチドの双方の役割を有した。
【０２０３】
反応物を200 μlの壁の薄いPCR試験管（Dot Scientific社、カタログ番号620-PCR）において氷中で混合して、Chill-OUT液体ワックス（MJ Research社）10 μlを重層して、Mastercycler加熱ブロック（Eppendorf社、カタログ番号5331 000.045）に移した。反応物を、温度勾配62±10℃（加熱ブロックにより制御）を用いて、55.3、57.7、60.5、63.4、66.2、および68.7℃で60分間インキュベートした。1時間後に、20 mM EDTAおよび0.02％メチルバイオレットを含む95％ホルムアミド10 μlを加えて反応を停止させた。
【０２０４】
各反応物1μlアリコットを、45 mMトリス-ホウ酸塩、pH 8.3および1 mM EDTAを含む緩衝液において7 M尿素を含む15％変性ポリアクリルアミドゲル（クロスリンク19：1）の200×200×1 mmスラブ2本のそれぞれにローディングした。陽極を上部の緩衝液リザーバー（逆方向）または下部のリザーバー（正常方向）のいずれかに接続して、20ワットの電場を30分間適用した。INVADER反応のあいだに生成された実効陽性荷電産物を逆方向のゲル電気泳動によって検出して、同じ試料の非切断プローブを正常方向での分離によって分析した。産物と非切断プローブに対応するバンドの強度は、532 nmレーザーおよび585 nmフィルターを備えたFMBIO-100蛍光イメージャー（Hitachi社、アラメダ、カリフォルニア州）を用いて感度レベル10％で測定した。
【０２０５】
プローブ203-85-5（配列番号：56）および490-52（配列番号：57）に関して、温度の関数として測定されたターンオーバー速度を図22に示す。改変V-(Hex)を導入するためにH-ホスホネート化学を用いて合成されたプローブ490-52は、アミノT改変プローブ203-85-5よりターンオーバー速度が約10倍大きい。
【０２０６】
実施例10
電荷の逆転による特異的切断産物の検出
本実施例は、RNA標的（CLEAVASE TthAKK）を含む切断構造を認識するCLEAVASE酵素が同様に、RNA標的と上記の陽性荷電プローブオリゴヌクレオチドとを含む構造を認識して切断することを証明する。本実施例において、ヒトMCP1インビトロ転写物を検出するために、異なる改変プローブオリゴヌクレオチド5個をINVADER反応において用いた。それぞれのプローブオリゴヌクレオチドは、電荷逆転法を用いて切断産物を検出することができるように、実効陽電荷を有する標識産物を放出するようにデザインした。
【０２０７】
異なる5個の5'末端改変Cy3-標識プローブオリゴヌクレオチドは：
Figure 2005503114
（図23）であった。5'改変体は、先に記載したように合成して、上記のオリゴヌクレオチド5個全てとINVADERオリゴヌクレオチド、Inv1
Figure 2005503114
は、標準的なホスホアミダイト化学とGlen Research社（スターリング、バージニア州）から得た試薬とを用いてDNAシンセサイザー（ABI 391）上で合成した。
【０２０８】
全てのプローブオリゴヌクレオチドは、陰イオン交換HPLCによって精製した。この精製方法を用いて、一つの主要なピークと一つまたはそれ以上の小さいピークを認めた。主要な（第一の）ピークからの材料を下記の全ての実験に用いた。
【０２０９】
インビトロ転写物は以下のように合成した。ヒトユビキチンcDNAは、ライブラリと共に提供された万能5'プライマー
Figure 2005503114
とユビキチン特異的3'プライマー
Figure 2005503114
とを用いてPCRによって、第一鎖ヒト肝臓DNAライブラリ（Clontech社、カタログ番号7407-1）から単離した。PCR反応は、製造元の説明書に従ってClontech社（カタログ番号8417-1）からの誤り修正ポリメラーゼ混合物によって行った。PCR産物の正確な大きさは500塩基であった。PCR産物は0.5×TBEにおいて1％アガロース上でゲル精製した。ゲルを10 μg/mlエチジウムブロマイドによって染色して、UV光の下で可視化して、おおよその大きさのバンドを切除して、QIAquickゲル抽出キット（Qiagen社、カタログ番号28706）によってDNAを回収した。次に、当技術分野で既知の方法によってゲル精製断片をpCR2.1-TOPOクローニングベクター（Invitrogen社、カタログ番号K4500-01）にクローニングした。陽性クローンを選択して、インサートの同一性をDNAシークエンシングによって確認した。陽性プラスミドをTOP10細胞（Invitrogen社）に形質転換した。細胞を増殖させて、プラスミドを分子生物学の技術分野に周知の方法によって単離した。上記で用いたものと同じ5'および3'プライマーをPCR反応において用いて、インビトロ転写反応において用いるための鋳型を作製した。インビトロ転写は、Ambion T7 MEGAshortscript RNA転写キット（Ambion社、カタログ番号1354）を用いて製造元の説明書に従って行った。得られたヒトユビキチン転写物は配列番号：69であった。AP1 5'プライマーを用いることには、インビトロ転写物の作製のために必要であるT7 RNAポリメラーゼプロモーターが含まれることに注意すること。以下の反応に用いた全ての転写物は、担体として20 ng/μl tRNA（Sigma社）を含んだ。
【０２１０】
HMCP1インビトロ転写物は以下のように合成した。ヒト単球化学遊走蛋白質-1（hMCP-1）cDNAは、10 μg/ml Con-A（コンカナバリンA）およびPHA（フィトヘムアグルチニン）刺激ヒトPBMC（末梢血単核球）総RNAから得た。総RNAは製造元のプロトコールに従ってTRIzol（登録商標）試薬（Gibco BRL社、カタログ番号15596）によって細胞1×107個から単離した。cDNAを作製するためにGeneAmp RNA PCRキット（Perkin Elmer社、カタログ番号N808-0017）を用いて逆転写を行うために総RNA 500 ngを用いた。このRT-PCRは、同様にT7 RNAポリメラーゼプロモーター部位を含む遺伝子特異的5'プライマー
Figure 2005503114
および3' hMCP-特異的プライマー
Figure 2005503114
を用いて行った。665塩基断片を同じPCRプライマーおよびTaq DNAポリメラーゼ（Perkin Elmer社、カタログ番号N808-0152）を用いて再度増幅した。断片をWizard（登録商標）PCR Preps DNA精製システム（Promega社、カタログ番号A7170）を用いてカラム精製して、O.D.260の測定によって定量した。インビトロ転写は、Ambion T7 MEGAshortscript RNA転写キット（Ambion社、カタログ番号1354）において、製造元のプロトコールに従って精製PCR産物600 ngを用いて行った。生成したhMCPインビトロ転写物（配列番号：72）は長さが647ヌクレオチドであった。
【０２１１】
インビトロ転写物の溶液をローディング色素（95％ホルムアミド、10 mM EDTA、メチルバイオレット色素）の等量と共に混合して、90℃で3分間熱変性させた後、7 M尿素を含む6％変性（19：1クロスリンク）アクリルアミドゲルにローディングして、0.5×TBEにおいて泳動させた。電気泳動後、ガラスプレートの一つを除去してゲルをプラスチックラップで覆った。次に、ゲルをラップ面を下にしてTLC（DC Fertigplatten Kieselgel 40 F254、Merck社、Art 5634）プレートに置き、他のガラスプレートを除去した。ゲル表面に携帯型のUV光源（254 nM；短波）を照射してRNAバンドを暗室で可視化した。核酸は暗いバンドとして見えるが、TLCプレートは緑色に見える、RNAに対応するバンドをカミソリの刃によって切除して、0.3 M酢酸ナトリウムを含むTE（10 mMトリス、0.1 mM EDTA）において37℃で4時間溶出した。インビトロ転写物を-20℃で一晩エタノール沈殿させて（または、-70℃で1時間の沈殿でも十分である）、4℃、14,000 rpmで30分間沈降させた。次に、沈降した核酸を70％エタノールによって洗浄して、再度5分間遠心した。エタノールを捨てた後、沈降した核酸を真空下で乾燥させ、RNアーゼ不含H2O（USB社、カタログ番号US70783）中に再懸濁した。インビトロ転写物の濃度は、OD260によって測定した。反応において用いたインビトロ転写物の希釈液は全て、20 ng/μl酵母tRNA（Sigma社、カタログ番号R5636）において調製した。
【０２１２】
それぞれの異なるプローブオリゴヌクレオチドについて一つずつ、5組の反応を行った。酵母tRNA 100 ngを含む陰性（非標的）対照を、それぞれの反応の組に関して行った。各10 μl反応物を室温で以下のように調製した。各プローブに関して一つずつ、異なるマスターミクス5 個を調製した。それぞれのミクスは以下を含んだ（最終濃度）：10 mM MOPS、pH 7.5、100 mM KCl、0.05％ツイーン、および0.05％ノニデット NP40、12.5 mM MgSO4、INVADERオリゴヌクレオチド（配列番号：66）5 pmole、およびCLEAVASE TthAKK酵素20 ngを含んだ。最後にプローブ（配列番号：61、62、63、64、または65）の一つ10 pmoleを最終容積10 μl／反応／マスターミクスとなるように加えた。マスターミクスを軽く攪拌して、それぞれの5 μlを適当な反応容器（200 μlの薄い壁のPCR試験管、Dot Scientific社、カタログ番号620-PCR）に移した後、ヒトMCP1インビトロ転写物5 μl（0、0.1、1、または10 fmoleを含む）を加えた。酵母tRNA（Sigma社）100 ngを陰性対照として用いた。試料を上下に3回ピペッティングして混合した。次に、蒸発を防止するために、試料に着色Chill out 14液体ワックス（MJ Research社）10 μlを重層して、63℃で60分間インキュベートした。10 mM EDTAを含む95％ホルムアミド50 μlを加えて反応を停止させた。
【０２１３】
試料を、45 mMトリス-ホウ酸塩（pH 8.3）、1 mM EDTAを含む緩衝液において、7 M尿素を含む15％変性アクリルアミドゲル（19：1クロスリンク）において泳動させた。ゲルを、ローディング前、電極を正常方向にして予め泳動させた。試料をローディングの直前に90℃で1分間加熱して、ウェルあたり2 μlをローディングした。電極を正常方向にして20ワットの電場を30分間適用した。電気泳動後、585 nmフィルターを備えたHitachi FMBIO蛍光イメージャーによって20％の感度で、産物を可視化した。次に、ゲルを泳動装置上で交換して新鮮な緩衝液をリザーバーに加えた。次に、電極を逆方向に置いて、ゲルを予め泳動させ、上記のようにローディングした。ゲルを逆方向で1時間泳動させ、産物を上記のように可視化した。得られた像を図24に示す。図24Aは、標準的な泳動方向で泳動させた変性ゲルを示し、図24Bは、逆方向に泳動させた変性ゲルを示す。プローブV-(HEX)パネルA；プローブV-(dA)パネルB；プローブV-(dC)パネルC；プローブV-(dG)パネルD；およびプローブV-(dT)パネルE。
【０２１４】
実施例11
CLEAVASE TthAKK酵素を用いた切断速度に及ぼす5'陽電荷の影響
先の実施例は、CLEAVASE TthAKK酵素が、RNA標的と陽性荷電プローブオリゴヌクレオチドとを含む切断構造を認識して切断できることを証明した。本実施例は、切断速度に及ぼす陽性荷電プローブの影響を調べる。
【０２１５】
実施例10に記載の陽性荷電プローブオリゴヌクレオチド5個全てを、5'フルオレセイン標識「対照」プローブオリゴヌクレオチド（配列番号：73；Glen Research社からの5'フルオレセインホスホアミダイト）に対して調べた。陽性荷電および対照プローブはいずれも、同じ配列を検出するようにデザインして、そのため分析物特異的領域において同一である。フルオレセイン標識とCRE-V標識プローブとの差には、5'末端での電荷の差、および切断産物の長さ、または5'フラップが含まれる。陽性荷電プローブの5'フラップは1塩基であるが、対照プローブは3塩基の5'フラップを生じる。
【０２１６】
反応は、hMCP1インビトロ転写物を標的として用いて実施例10に記載するように行った。それぞれのプローブオリゴヌクレオチドに関して一つの標的レベルのみを用いて切断速度を調べた。それぞれの反応には、hMCP1インビトロ転写物いずれか1 fmoleと共に酵母tRNA 100 ngを担体として加えた；酵母tRNA 100 ngも同様に、陰性対照として作用した。標的を含む反応は1試料あたり4個ずつ行ったが、tRNA対照反応は1個行った。
【０２１７】
ターンオーバー速度は、Lyamichevら（上記）に記載されるように決定し、図25にグラフで示す。速度は、P3（配列番号：63）に関して2〜9切断事象／標的／分の範囲であり、陽性荷電プローブにおいて最高速度を示した。フルオレセイン標識プローブの平均切断速度は12切断事象／標的／分であった。
【０２１８】
実施例12
5'陽性荷電プローブオリゴヌクレオチドによるバックグラウンド蓄積速度の試験
陽性荷電プローブオリゴヌクレオチドを用いる重要な長所は、上記の実施例において記述および詳述されるように、単純な逆極性のゲル電気泳動を用いて、シグナル（例えば、陽性荷電シグナル分子を有する1塩基フラップ）を他の異常な反応産物または非切断プローブから完全に分離できることである。この実験は、バックグラウンド切断産物（異常な切断、または熱分解産物）が、逆極性ゲルでは、たとえ反応物を大量の標的と共に長時間インキュベートしても移動しないことを確認し、これによってより精度が高く単純なデータ解釈が得られる。
【０２１９】
用いたプローブオリゴヌクレオチドはP2（実験実施例10に記載、配列番号：62）であり、用いたINVADERオリゴヌクレオチドは、実施例10に記載したようにInv1（配列番号：66）であった。反応条件およびゲルに基づく分離方法は10に記載した通りに行った。反応は、hMCP1インビトロ転写物0（陰性対照として100 ng/5 μl tRNA；バックグラウンドの推定）、0.01、0.1、および1 fmoleについて反応容積10 μlにおいて行った。反応は実施例10に記載するように構築して、63℃で1、2、4、8および24時間インキュベートした。反応産物は正常または逆極性ゲルにおいて、実施例10に記載するように分離して、同様に実施例10に記載するように、Hitachi FMBIOスキャナイメージおよびソフトウェアからの強度に基づいて分析した。結果を図26にグラフで示す。図26Aは、標準的な電気泳動方向に泳動した変性ゲルの結果を表し、図26Bは逆方向に泳動した変性ゲルの結果を表す。
【０２２０】
実施例13
多数の陽性荷電プローブを用いたRNA標的の検出
先の実験は、CLEAVASE酵素によって構造特異的に切断された陽性荷電プローブを用いて、RNA標的を検出することができ、特定の検出プラットフォームにおいて、シグナル対バックグラウンド比が「正常」な陰性荷電プローブオリゴヌクレオチドより優れているように分析することができることを証明した。
【０２２１】
本実験は、異なる5'陽性荷電プローブの切断産物を、同じ反応に用いた場合でも区別できる（異なる質量対電荷比に基づいて）ことを証明する。
【０２２２】
この実験において用いたオリゴヌクレオチド、反応条件、ゲルに基づく分離、および分析は、異なる4個のプローブ[P1、P2、P4、およびP5]のそれぞれ2 pmoleを用いて、標的レベルがhMCP1インビトロ転写物0（tRNA 100 ngのみ）、0.1、1、および10 fmoleであったことを除き、実施例10に記載した通りに実施した。各反応物2 μlを逆極性のゲルにローディングして記述のように分離した。
【０２２３】
得られた像を図27に示す。切断産物は全て、実効陽電荷を有する。プローブオリゴヌクレオチドP1、P2およびP4からの切断産物の移動はそれらの大きさの差（分子量）のためにゲル上で容易に分離された。対照的に、P5プローブオリゴヌクレオチドからの切断産物は、P4産物とほとんど区別できなかった；これらの産物の大きさおよび電荷は非常に類似である。このことは、好ましい多数の態様が、その切断産物が選択される検出系において容易に区別できるプローブを利用することを示している。
【０２２４】
実施例14
陽性荷電タグによるカスケード反応におけるヒトMCP1およびヒトユビキチンインビトロ転写物の検出
本実施例において、二段階の連続的侵入性切断反応を用いて、真の多重反応において（いずれの標的も同じ反応において検出される）hMCP1およびhユビキチンインビトロ転写物を検出する。陽性荷電プローブ（本明細書においてレポーターオリゴヌクレオチド、またはレポーター標識オリゴヌクレオチドと命名される）を、図28AおよびBに示すように連続的な侵入性の反応の第二段階において用いる。カスケードINVADERスキームによって提供される追加の増幅は、より大きい感度とより低い検出限界とを生じ、これは標的レベルが限られる場合に重要である。
【０２２５】
連続的侵入性切断反応のメカニズムは以下の通りである。一次INVADERおよびプローブオリゴヌクレオチド（標的とハイブリダイズするオリゴヌクレオチド）は標識されないが、適当な標的配列とハイブリダイズすると、CLEAVASE酵素によって認識される重なり合う構造を形成する（図28A）。酵素はこの構造を切断して5'フラップを遊離にする。次に、フラップは第二の反応のINVADERオリゴとして作用する。二次反応は異なる三つのオリゴヌクレオチドを含む：1）5'フラップとレポーター標識二次プローブオリゴヌクレオチドの双方に対して相補的な隣接領域を有するフラップ-レポーター架橋オリゴヌクレオチド；2）架橋オリゴヌクレオチドの一部と相補的なレポーター標識二次オリゴヌクレオチド、および3）一次反応からの5'フラップであって、架橋オリゴヌクレオチドの一部と相補的であるINVADERオリゴヌクレオチド。重なり合う構造が二次反応を形成する場合、酵素は、レポーター標識オリゴヌクレオチドから5'フラップを切断して、陽電荷を有する検出可能なシグナルを生じる。
【０２２６】
二次反応において、非切断プローブ分子の5'フラップは、フラップレポーター架橋オリゴのハイブリダイゼーションに関して、放出された5'-フラップと競合することができ、このように二次反応におけるシグナル産生を減少させる。この競合を回避するために、「ARRESTORオリゴヌクレオチド」と呼ばれる相補的オリゴヌクレオチドを加えることによって、一次インキュベーション後に非切断プローブを分離する。ARRESTORオリゴヌクレオチドは、プローブの標的特異的領域と十分に相補的であり、5'-フラップ領域まで部分的に伸長する；このように、これは5'-フラップのフラップ-レポーター架橋オリゴヌクレオチドに対する結合を妨害しない。このように、ARRESTORオリゴヌクレオチドは、非切断プローブとフラップ-レポーター結合オリゴヌクレオチドのあいだの相互作用を防止することによって二次反応においてより有効なシグナル産生を促進する。ARRESTORオリゴヌクレオチドの全ての塩基は2'O-メチル-改変であり、これによって、ARRESTORオリゴヌクレオチドはCLEAVASE酵素による切断に対して抵抗性となる。
【０２２７】
hMCP1二次レポータープローブオリゴヌクレオチドのために用いられるタグは5'V(dC)-Cy3（図28A）であったが、hユビキチン二次レポータープローブオリゴヌクレオチドは、5'V(dG)-Cy3タグを組み入れた（図28B）。これらのタグは、実施例10に示し、図24に示すように、それらの質量対電荷比が異なるためにそれらが容易に分離されて同定されることから選択した。ヒトMCP1インビトロ転写物を検出するために用いたオリゴヌクレオチドは以下の通りであった：一次プローブオリゴヌクレオチド
Figure 2005503114
一次INVADERオリゴヌクレオチドInv1（配列番号：66）、ARRESTORオリゴヌクレオチド
Figure 2005503114
フラップ-レポーター架橋オリゴヌクレオチド
Figure 2005503114
およびレポーター標識二次プローブオリゴヌクレオチド
Figure 2005503114
。下線を引いた塩基は、2'-O-メチル改変を意味する。ヒトユビキチンインビトロ転写物を検出するために用いられるオリゴヌクレオチドは以下の通りであった：一次プローブオリゴヌクレオチド
Figure 2005503114
一次INVADERオリゴヌクレオチド
Figure 2005503114
ARRESTORオリゴヌクレオチド
Figure 2005503114
フラップ-レポーター架橋オリゴヌクレオチド
Figure 2005503114
および二次レポーター-標識プローブオリゴヌクレオチド
Figure 2005503114
。三つの対照反応の組をこの実験に含めた：1）hMCP1転写物を検出するために、同様に実施例10において用いた5'V(dC)プローブ（P3、配列番号：63）およびINVADERオリゴヌクレオチドInv1（配列番号：66）を用いて、非カスケード反応（基本INVADER、実施例10に記載）を用いる対照反応；2）一つの標的を検出するために用いられるオリゴヌクレオチドと、他の標的のシグナル生成メカニズムとの交叉反応性の欠如を証明するためにデザインされた対照反応の組；ならびに3）hMCP1またはhユビキチンを検出するために、多重反応に関して全ての一次および二次成分が存在するが、二次レポーターオリゴヌクレオチドは一つのみが存在する対照の組。
【０２２８】
一次反応容積は10 μlであり、二次反応容積は15 μlであった。それぞれのアッセイ反応は、単一および多重反応に関してヒトユビキチンおよび／またはMCP1インビトロ転写物（それぞれ、配列番号：69または72）0、1、10、100、または1000 amoleを含み、一次プローブオリゴヌクレオチド（配列番号：71および75）それぞれ10 pmole、それぞれの一次INVADER（配列番号：66および79）オリゴヌクレオチド5 pmole、およびCLEACASE TthAKK酵素20 ngを、10 mM MOPS、pH 7.5、100 mM KCl、0.05％ツイーン、0.05％ノニデット NP40、12.5 mM MgSO4の溶液10 μl中に含んだ。反応は、適当な一次反応ミクス（緩衝液、酵素、MgSO4、一次プローブオリゴおよび一次INVADERオリゴヌクレオチド）を反応容器（低プロフィールMJ Research Inc.、カタログ番号MLL9601）に分配してから標的またはtRNA 5 μlを陰性対照として加えた。蒸発を防止するため、試料に着色Chill-out 14液体ワックス（MJ Research社）を重層して、60℃で60分間インキュベートした。
【０２２９】
一次反応が完了した後、適当な二次反応混合物（適当なフラップ-レポーター架橋オリゴヌクレオチド[配列番号：76および／または81]2.5 pmole、ARRESTORオリゴヌクレオチド[配列番号：75および／または80]40 pmole、および各二次レポーター標識オリゴヌクレオチド[配列番号：77および82]10 pmoleを、二次反応の最終濃度が10 mM MOPS、pH 7.5、0.05％ツイーン、0.05％ノニデット NP40、20 mM MgSO4となるように）5 μlを各反応に加えて、60℃で1時間インキュベートした。
【０２３０】
反応は、95％ホルムアミドおよび10 mM EDTAを含む停止緩衝液50 μlを加えて停止させた。各反応物2 μlを、正常および逆極性のゲル電気泳動の双方によって分析した。試料を90℃で1分間加熱した直後に、45 mMトリス-ホウ酸塩（pH 8.3）、1.4 mM EDTAを含む緩衝液において7 M尿素を含む15％変性アクリルアミドゲル（19：1クロスリンク）の中を電気泳動させた。20ワットの電場を逆方向に1時間適用した。ゲルを、Hitachi FMBIO-100蛍光イメージャー上で585 nmフィルターによって感度20％でスキャンした。
【０２３１】
逆極性ゲルの像を図29に示す；パネルA：基本カスケード反応；パネルB：多重カスケード反応；パネルC；MPC1レポーターオリゴによるカスケード反応；およびパネルD：ユビキチンレポーターオリゴによるカスケード反応。
【０２３２】
実施例15
多重CREフォーマットによる細胞溶解物からのヒトMCP1およびユビキチン転写物の検出
先の実験は、陽性荷電プローブオリゴヌクレオチドを用いてカスケード侵入性切断反応においてインビトロ転写物を検出することができること、およびそれらが実際の多重反応フォーマットにおいて十分に機能することを証明した。本実験は、実施例14に記載のアッセイフォーマットを用いて、細胞溶解物、および総細胞RNAの調製物からhMCP1およびhユビキチン転写物の双方を検出することができることを証明する。
【０２３３】
細胞溶解物および総RNAは、MG 63細胞（ATCC # CRL-1427）から調製した。細胞は、ATCCによって提供された説明書に従って、当技術分野で既知の標準的な方法によって増殖させた。溶解物調製のために用いた細胞は、96ウェル平底組織培養プレートにおいて増殖させ、総RNA調製物のために用いた細胞は10 cm組織培養皿において増殖させた。いずれかの技法の前、細胞をヒト腫瘍壊死因子-α（TNF-α[Calbiochem社、カタログ番号654205]）およびヒトインターロイキン1β（IL-1β[Calbiochem社、カタログ番号407615]）の双方によって刺激した。誘導培地における最終濃度はTNF-αおよびIL-1βの双方に関して10 ng/mlであった。
【０２３４】
細胞溶解物は以下のように調製した：溶解前、細胞を燐酸緩衝生理食塩液（PBS）200 μlによって2回洗浄した。次に、細胞溶解緩衝液（20 mMトリス、pH 7.5、5 mM MgCl2、20 ng/μl tRNA、0.5％ノニデット NP-40）30 μlを加えて、室温で5分間インキュベートして細胞を溶解した。各溶解物20 μlを96ウェルマイクロプレート（MJ Research社）に移した。蒸発による容量の喪失を防止するためにプレートに蓋をして、INVADER反応の前にマイクロプレートを80℃で15分間加熱することによって細胞ヌクレアーゼを不活化した。
【０２３５】
総RNAは、製造元のプロトコールに従って刺激および非刺激細胞からTrizol試薬（Gibco BRL社、カタログ番号15596）によって単離した。細胞を10 cmプレートにおいて約6〜7×106個/プレートとなるまで増殖させて、いずれも10 ng/mlのTNF-αおよびIL-1βによって2時間処置した。次に、RNAをRNAase不含蒸留水（USB社、カタログ番号US70783）に懸濁して、-70℃で保存した。
【０２３６】
以下の実験において、異なる三つのINVADERアッセイフォーマットを用いた。多重カスケード反応フォーマットを用いて各分析物を検出した；非多重（単一）カスケード反応フォーマットも同様に用いて各分析物を検出した；そして基本INVADER（非カスケード）反応フォーマットはhMCP1検出のみに用いた。フォーマットは全て、検出部分として本発明の陽性荷電標識プローブを用いた。各分析物の検出は、総RNA、細胞溶解物、およびインビトロ転写物を用いて行った。
【０２３７】
基本の非カスケードINVADER反応と共に、単一および多重カスケード反応に関する標的レベルは：5 μl中にインビトロ転写物0もしくは1 fmole；細胞溶解物（細胞約2000個）5 μl；または5 μl中に総RNA 50 ngであった。
【０２３８】
多重カスケード反応は、実施例14に記載のように調製して、双方の標的を検出するために必要な全てのオリゴヌクレオチドを含めた。唯一の標的を検出するために行ったカスケード反応は、標的（hユビキチンまたはhMCP1）の一つのみを検出するために必要なオリゴヌクレオチドを加えたが、双方は加えなかったことを除き、実施例14に記載した通りに調製した。基本の非カスケードINVADER反応は、実施例10に記載するように調製した。
【０２３９】
INVADER反応の産物を、逆極性ゲル電気泳動（陽性荷電切断産物）または正常極性ゲル電気泳動（完全長のプローブ）上で分離して、ゲルをHitachi FMBIO-100蛍光イメージャー上で585 nmフィルターによって感度20％でスキャンした。
【０２４０】
正常および逆極性ゲルの像を図30AおよびBに示す。正常極性の像は逆極性パネルの下のパネルに示し、レーンは垂直に配置した同じ反応産物を示す。レーン1〜4は、インビトロ転写物0（−の印で示す）または1 fmole（+の印で示す）のいずれかによる結果を示す；レーン5〜8は、細胞刺激を行わない（−の印で示す）、または溶解物調製前に細胞刺激を4時間行った場合（+の印で示す）の細胞溶解物（反応あたり細胞約2000個）を用いた結果を示す；レーン9〜12は、細胞刺激を行わない（−の印で示す）、または総RNA調製前に細胞刺激を4時間行った場合（+の印で示す）の反応総RNAあたり約50 ngを用いた結果を示す。レーン1〜3、5〜7、および9〜11は、カスケード反応の結果を示す；レーン4、8および12は、基本の非カスケード反応の結果を示す。
【０２４１】
実施例16
キャピラリー電気泳動による陽性荷電標識オリゴヌクレオチドタグの検出
キャピラリー電気泳動（CE）は、DNA分子オリゴヌクレオチドを含む広く多様な分子の迅速かつ有効な分離のために用いることができる極めて有用なツールである（その全文が参照として本明細書に組み入れられる、Baker, D.R.（1995）、Capillary Electrophoresis、ウィリーインターサイエンス出版、ニューヨーク州、アメリカ）。CEは、高感度、使用しやすさ、および低コストという長所を提供する。これは、例えばレーザー誘導蛍光を用いて、色素標識タグを検出する迅速かつ有効な方法を提供する。市販のCE装置のほとんども同様に電荷逆転電気泳動（CRE）を行うことができる。したがって、先に記述して証明したように、侵入性の切断反応によって生成された陽性荷電タグを検出する方法としてCREを用いることを決定した。
【０２４２】
異なる陽性荷電タグ（例えば、CREプローブを用いたINVADERアッセイ反応産物）の興味深い特徴はその低い電荷対質量比である。本研究において用いたオリゴヌクレオチド-陽電荷タグは、実効電荷+1を有し、質量はDNAヌクレオチド塩基の質量よりわずかに高かった。このように、適当な試料の輸送にとって必要な注入時間のためにラインの広範化および感度不良が起こることから、従来のCEに基づくDNA分子分離方法（ゲル充填キャピラリーのような）を用いることは極めて難しいであろう。
【０２４３】
したがって、荷電ゾーン電気泳動（CZE）、およびミセル界面動電キャピラリー電気泳動（MECC、またはMEKCC）を用いる流体力学注入および試料のスタッキングのような他のCE技術（Weinberger, R.（1993）、Practical capillary electrophoresis、アカデミック出版、サンディエゴ、アメリカ、その全文が参照として本明細書に組み入れられる）を用いて、陽性荷電タグオリゴヌクレオチドの分離にとって必要な感度および分離が得られた。
【０２４４】
以下の実施例は、INVADER反応によって作製された陽性荷電タグオリゴヌクレオチドのMECC-CEに基づく分離のための実験条件の最適化を示す。
【０２４５】
CRE条件の最適化：陽性荷電オリゴヌクレオチドタグの検出
試料のスタッキングおよびミセル動電キャピラリー電気泳動（MECC）を用いるキャピラリー電気泳動を用いてCRE実験を行うための最適な条件を決定するために、多くの変数を調べた。変数は、INVADER切断タグ産物検出の解像度および感度に対して最大の影響を有するように決定した。CREプローブは、実施例4〜6に記載した通りに合成した。タグは、図17の上から下に示し、それぞれ、タグ6、タグ3、タグ5、タグ4、タグ1およびタグ2と命名した。これらのタグを放出するためにこれらにおいて用いたINVADERアッセイ反応は、オリゴヌクレオチド、標的DNA、プローブおよび実施例18に記載の条件を用いて行った。
【０２４６】
特に指示していない限り、下記の全ての実験は、YAG 532 nmレーザー（JDS Uniphase社）および580±10 nm放射フィルター（Andover Corporation、カタログ番号580FS10-12.5）を備えたBeckman-Coulter P/ACE MDQキャピラリー電気泳動システムにおいて行った。100ミクロンのeCAP（Beckman-Coulter）キャピラリー（ウィンドウまで10 cm）を、分離緩衝液50 mMビス-トリスホウ酸塩pH 6.5を用いて、25 kVの一定の分離電圧によって25℃で泳動した。毛細管に50 mM ビス-トリスホウ酸塩、pH 6.5および2％オクチルグルカシドを予め充填した。注入した試料は、10 mM MOPS、0.05％ NP40、0.05％ツイーン20、7.5 mM MgCl2、および10 ng/μl tRNAにおいてタグ6個の10 nM最終濃度混合物からなり、これを毛細管の陽極側から0.5 psiの真空注入を用いて毛細管に流体力学的に注入した。試料を、陽極毛細管末端から陰極毛細管末端まで、毛細管のウィンドウまで10 cmの距離を泳動させた。データは如何なる計算または操作も行わずに生のCEクロマトグラフの軌跡の積み重ねとして表す。
【０２４７】
1）CE解像度に及ぼす試料緩衝液成分の影響
試料のスタッキングは、試料緩衝液と分離緩衝液との導電強度およびイオン強度の差に依存するため、スタッキングの効率に及ぼすINVADER反応緩衝液成分の影響をまず調べた。これを行うため、タグ6個それぞれの10 nM濃度を水（A）、10 mM MOPS（B）、10 mM MOPS、0.05％NP40、および0.05％ツイーン20（C）、10 mM MOPS、0.05％NP40、0.05％ツイーン20、および7.5 mM MgCl2（D）、10 mM MOPS、0.05％NP40、0.05％ツイーン20、7.5 mM MgCl2、および10 ng/μl tRNA（E）、ならびに10 mM MOPS、0.05％NP40、0.05％ツイーン20、7.5 mM MgCl2、10 ng/μl tRNA、および10 ng/μl Afu FEN1ヌクレアーゼ（F）を含む緩衝液において混合した。結果を図31に示す。
【０２４８】
最適なスタッキングおよび感度のために提案された最小の試料緩衝液成分は、10 mM MOPSと共に洗浄剤（0.05％NP40およびツイーン20）が存在することであることがわかる。水または50 mM MOPS中の試料は如何なる検出も得られず、洗浄剤の存在が方法にとって重要であることを示唆している。同様に、試料緩衝液Fはなおも良好な解像度および検出感度を可能にすることが認められうる。INVADER反応は試料緩衝液Fにおいて行われるため、CREの泳動前に試料の処置（すなわち、脱塩または濃縮）を行う必要はない。
【０２４９】
2）注入時間の効果：
有効な試料のスタッキングは、毛細管に注入される容積に非常に依存する（Weinberger, R.、Practical Capillary Electrophoresis、アカデミック出版、サンディエゴ、アメリカ[1993]）。本実験において、試料の最適な（最大の）注入容積を決定した。次に、最善の解像度を生じる試料注入容積をその後の実験に用いた。
【０２５０】
試料は、0.5 psiの真空を用いて10、20、30、40、および60秒間注入した。結果を図32に示す（それぞれA、B、C、D、およびE）。結果は、10〜40秒間の注入によって感度の増加が起こることを示している。しかし、40〜60秒のあいだでは、解像度の喪失が明らかであり、スタッキングがもはや最適ではないことを示唆している。したがって、その後の全ての実験に注入時間40秒間を用いた。
【０２５１】
3）毛細管のタイプの影響：
CEの電気末端浸透圧流（EOF）は、用いた毛細管のコーティングのタイプ（Weinberger、上記）に非常に依存する。一般的に用いられる裸の溶融シリカ毛細管は、特定のCE応用にとって問題を引き起こす可能性があるEOFを有する（Baker, D.R.、Capillary Electrophoresis、ウィリーインターサイエンス出版、ニューヨーク州、アメリカ[1995]）。コーティングした毛細管は通常、EOF問題の解決として用いられる。二つの異なるタイプのコーティング、すなわち、動的コーティングと静的コーティングがある。動的コーティングは通常、界面活性剤を毛細管充填緩衝液に加えることによって得られる。この界面活性剤は、毛細管壁のシラノール基と相互作用して、EOFを最小限にする。一方、静的コーティングは、毛細管壁をコーティングするシラノール基のヒドロキシルと反応する化学物質によって裸のシリカ毛細管を前処置することによって得られ、このようにして毛細管を中性にしてEOFを消失させる。最適なCRE成績を得るために最善のコーティング材料を決定するために、いくつかの静的コーティング毛細管を調べた。調べた毛細管は以下の通りであった：A）100 μeCAP DNAポリアクリルアミドコーティング毛細管（Beckman-Coulter）；B）75 μCEPコーティング毛細管（Agilent Technologies社）；C）75 μμSIL-ワックスコーティング毛細管（J＆W Scientific社）；D）75 μ5％T、5％G予め充填μPAGE毛細管（J＆W Scientific社）；E）75 μ裸の溶融シリカ（Beckman-Coulter社）（図33）。親水性コーティングを有する毛細管（すなわち、ポリアクリルアミド100 μeCAPおよび75μCEP）は、最善の分離および感度を生じた。このことは、適当なコーティング材料（動的または静的）によって、裸のシリカは、CREに基づくINVADERアッセイを解像するために効率よく用いることができることを示唆している。
【０２５２】
4）CREに及ぼす分離（電極）と毛細管充填緩衝液の効果
最大の試料スタッキングを生じる分離緩衝液のイオン強度を決定するために、50 mM濃度、pH 7.2の（A）ビストリスホウ酸塩、（B）トリスホウ酸塩、および（C）MOPSを用いて、INVADERアッセイタグ産物についてCREを行った。これらの実験に関して、毛細管に、MECC条件を得るために2％オクチルグルコシドを添加して、分離緩衝液と同じ緩衝液を充填した。図34は、用いた異なる緩衝液の結果を示す。最適なスタッキングは、50 mMビストリスホウ酸塩、pH 7.2を含む緩衝液について得られる。次に、この緩衝液のpHをその後のCE実験に用いるために最適にした。調べた緩衝液のpHは以下の通りであった：（A）pH 6.0、（B）6.5、および（C）7.2の50 mMビストリスホウ酸塩緩衝液。結果を図35に示す。INVADER生成陽性タグの最適な試料のスタッキングおよび分離は、pH 6.5で得られる。
【０２５３】
最後に、用いるビストリスホウ酸塩緩衝液の最適な濃度を決定するために、全てpH 6.5の25 mM（A）、50 mM（B）、および100 mM（C）濃度を調べた（図36）。結果は、ビストリスホウ酸塩の最適な濃度が50 mMであることを示している。例えば、TAE、燐酸塩およびクエン酸塩のようなホウ酸塩基剤でない緩衝液を用いることも同様に意図される。
【０２５４】
5）INVADERアッセイ生成陽性タグのMECC分離効率に及ぼす洗浄剤の影響
MECCは、CEによって分離される試料と洗浄剤によって一般的に形成されるミセルの親水性荷電末端とのあいだの相互作用を利用する（Weinberger、上記）。どのミセル形成洗浄剤が最適な結果を生じるかを決定するために、異なる多くの洗浄剤を調べた。（A）如何なる洗浄剤も添加しない；（B）2％オクチルグルコシド；（C）2％NP-40；（D）2％ツイーン-20；（E）2％トライトンX100；（F）2％MEGA-9；（G）2％Brij 35；および（H）30 mMコール酸ナトリウムを添加した、50 mMビストリスホウ酸塩、pH 6.5緩衝液を充填した毛細管を用いて、CRTを行った。
【０２５５】
結果を図37に示す。最適なMECC分離は2％オクチルグルコシドの存在下で得られ、NP-40、ツイーン20、トライトンX100およびBrij 35を用いた場合の解像度は低かったことが認められうる。MEGA-9およびコール酸ナトリウムを用いた場合には、試料は検出されなかった。同様に、洗浄剤が存在しなければ解像度が不良な単一のピークを生じ、このことは、試料のスタッキングがなおも成功していることを示唆していることは注目に値する。
【０２５６】
実施例17
キャピラリー電気泳動を用いることによるH-ホスホネート改変の分析
本実施例において、上記のH-ホスホネートタグを用いたINVADER反応産物（例えば、実施例10）を、キャピラリー電気泳動（CE）によって分析した。ゲル電気泳動と比較すると、キャピラリー電気泳動は、より高い感度および解像度、より速い分離時間、毛細管の自動化、ならびにMECCのようなゲルフォーマットに適用することができない条件で使用できることを提供する。
【０２５７】
四つの陽性荷電タグ5'-V-(Hex)-Cy3-C-3'、5'-V-(dA)-Cy3-C-3'、5'-V-(dG)-Cy3-C-3'、および5'-V-(dT)-Cy3-C-3'を、実施例10に記載するように対応するプローブの侵入性の切断によって作製した（それぞれ、配列番号：61〜65）。簡単に説明すると、各プローブオリゴ（P1、P2、P4、およびP5）10 pmoleを、プローブを切断産物にほぼ完全に確実に変換するために、ヒトMCP1インビトロ転写物10 fmoleの存在下で3時間切断した。切断されたタグを、10 mM MOPS、pH 7.5、7.5 mM MgCl2、10 ng/μL tRNA（Sigma社）、0.05％ツイーン20、および0.05％ノニデット P40を含む溶液を用いて10 nM濃度に希釈して、INVADER反応の緩衝液条件を模倣した。試料を60 cm eCAP DNA 100 μm直径毛細管（Beckman社）において、532 nmレーザーと580±20 nm放射フィルターとを備えたPageMDQ CE装置（Beckman社）を用いてミセル界面動電クロマトグラフィー（MECC）の条件で分離した。毛細管充填緩衝液は、50 mMビストリスホウ酸塩、pH 6.5および2％オクチルグルコシド（Sigma社）を含み、電極緩衝液は50 mMビストリスホウ酸塩、pH 6.5を含んだ。毛細管の出口に0.5 psi真空を20秒間適用することによって試料を注入した。陽極を入り口の緩衝液に接続して、16 kVの電場を適用することによってタグを分離した。毛細管の入り口から検出器のウィンドウまでの分離距離は10 cmであった。
【０２５８】
図38は、個々に、そして四つ全ての分子の等モル混合物として分離された、四つの実効陽性荷電タグ5'-V-(HEX)-Cy3-C-3'、5'-V-(dA)-Cy3-C-3'、5'-V-(dG)-Cy3-C-3'、および5'-V-(dT)-Cy3-C-3'のMECCプロフィールを示す。5'-V-(Hex)-Cy3-C-3'は単一のバンドを生じたが、タグ5'-V-(dA)-Cy3-C-3'、5'-V-(dG)-Cy3-C-3'、および5'-V-(dT)-Cy3-C-3'はそれぞれ二つの主要なピークを生じた。二重ピークのプロフィールは、調べたタグのそれぞれが合成された際に形成されたジアステレオ異性体の存在によって説明することができる。5'-V-(Hex)-Cy3-C-3'によって形成されたステレオ異性体は、これらの実験条件では分離されない。四つ全てのタグの混合物の分離を行ったところ、予想される7個のピークではなくてピーク4個を示したに過ぎず、何らかのタグまたはジアステレオ異性体がこれらの条件において類似の移動度を有することを示唆している。
【０２５９】
eCAP DNA毛細管の解像度は、10〜20回の泳動後徐々に減少することが認められ、これは図38に示すタグ混合物の分離に影響を及ぼしうる。新鮮な毛細管を用いて四つのタグの同じ混合物を分析する場合、同じ条件で7個全てのピークが認められた（図39）。
【０２６０】
実施例18
ホスホアミダイト化学を用いて合成された実効陽性荷電タグの分離
電荷平衡オリゴヌクレオチドの合成は、実施例4〜6に記載するホスホアミダイト化学を用いて行うことができる。実施例7および8に記載したタグに関して用いたH-ホスホネート化学と比較すると、ホスホアミダイト化学は、市販のシンセサイザーを用い、そして合成の際にホスホアミダイト燐原子でのキラリティ中心の導入を回避するという長所を提供する。一般構造
Figure 2005503114
（式中、TagNは、実施例4〜6に記載する6個の実効陽性荷電の一つを示す）を有する6個のオリゴヌクレオチド（図17の上から下に示し、それぞれタグ6、タグ3、タグ5、タグ4、タグ1およびタグ2と命名する）。それぞれのプローブは、INVADERオリゴヌクレオチド
Figure 2005503114
および標的オリゴヌクレオチド
Figure 2005503114
との侵入性切断反応において切断して、実効陽電荷タグ5'-TagN-G-3'を生じる。
【０２６１】
それぞれのINVADERアッセイ反応は、プローブ6個中1個の2 μMについて行い、0.1 μM INVADERオリゴヌクレオチド509-54-3、10 nM標的オリゴヌクレオチド509-54-1、およびAve FEN1 CLEAVASE酵素（10 ng/μl）100 ngの、10 mM MOPS、pH 7.5、7.5 mM MgCl2を含む溶液10 μL中で行った。反応物は63℃で3時間インキュベートした。これらの条件で、ほぼ全てのプローブ分子が切断されて、約2 μMのそれぞれの陽性荷電タグを生成した。切断産物を、10 mM MOPS、pH 7.5、7.5 mM MgCl2、10 ng/μl tRNA（Sigma社）、0.05％ツイーン20、および0.05％ノニデット P40を含む溶液中で10 nM濃度まで希釈して、実施例16および17に記載するようにMECCによって分析した。
【０２６２】
図40は、個々に、または分子6個全ての等モル混合物として分離した実効陽性荷電タグ6個のそれぞれのMECCプロフィールを示す。タグのそれぞれは単一のピークを生じ、改変によるキラリティ中心が存在しないことを確認した。6個全てのタグの混合物のMECC分離は、6個のピークを生じ、本明細書に記載のCE条件が実効陽性荷電改変を有する6個全てのタグの化学構造の差を検出することができることを示している。MECCアッセイの抗力を証明する分離は、タグの2つの対、タグ1／タグ2およびタグ4／タグ5が、結合の順のみが異なる同一の化学構築ブロックで構成され、したがって、同一の化学組成を有するという事実によって強調される。それにもかかわらず、それらは容易に解像されて、このことは添加順序をさらなる変数として用いることができ、さらに、単純な構築ブロックの集合体から形成することができるタグのライブラリを拡大することを証明する。
【０２６３】
ゲル電気泳動と比較したMECCアッセイの優れた解像度を、図41に示す。95％ホルムアミド、20 mM EDTA、および0.02％メチルバイオレット2 μl中に5'-Tag1-G-3'または5'-Tag2-G-3' 0.2 pmolを含む試料を、45 mMトリス-ホウ酸塩、pH 8.3、および1 mM EDTA（図41A）を含む緩衝液において7 M尿素を含む20％変性ポリアクリルアミドゲル（19：1クロスリンク）の100×100×2 mmスラブ上に、または50 mMビストリスホウ酸塩、pH 6.5（図41B）を含む緩衝液において10％未変性ポリアクリルアミドゲル（クロスリンク19：1）の100×100×2 mmスラブ上にローディングした。上部の緩衝液リザーバー（逆方向）に接続した陽極に5ワットの電場を30分間適用して試料を分離した。実施例9に記載するように、FMBIO-100蛍光イメージャーを用いてタグを可視化した。図41Aは、変性ゲルの条件で5'-Tag1-G-3'または5'-Tag2-G-3' が非常に低い移動度を有し、この特徴に基づいてそれらを同定できないことを示している。未変性条件（図41B）では、実効陽性荷電タグのそれぞれは2本のバンドとして分離された。電気泳動の移動度には、二つのタグを互いに分離できるほどの有意差を認めなかった。
【０２６４】
上記の明細書において言及した全ての出版物および特許は、参照として本明細書に組み入れられる。本発明の記述の方法およびシステムの様々な改変および変更が当業者に明らかであるが、それらも本発明の範囲および精神に含まれる。本発明は、特定の好ましい態様に結びつけて説明してきたが、請求の本発明はそのような特定の態様に不当に制限されないと理解すべきである。実際に、本発明を行うために記述の様式の様々な改変が関連する技術分野の当業者に明らかであるが、それらも以下の請求の範囲内であると解釈される。
【図面の簡単な説明】
【０２６５】
【図１】いくつかの陽性荷電ヘテロ二量体DNA結合色素の化学構造を示す。
【図２】3'ホスフェート基を含むまたは欠損するオリゴヌクレオチドの熱分解を示す蛍光イメージャーによって作製された像である。
【図３】アミノ改変オリゴヌクレオチド70および74位の構造を示す。
【図４ａ】アミノ改変オリゴヌクレオチド75の構造を示す。
【図４ｂ】アミノ改変オリゴヌクレオチド76の構造を示す。
【図５】反応性H-ホスホネート中間体の形成に至る段階を示す。この図面と他の図面においてこれらの組成物の様々な構成物の結合を示す波状の線は、この連結目的の役割を果たしうる如何なる有機官能基も表す。
【図６】VおよびVI化合物の合成に至る変換段階を表す。
【図７】構成成分の添加順序を（例えば、図6の化合物VIの作製に至る順序と比較して）変化させることによる、さらなる化合物VIIの作製を示す。
【図８】二つの改変点を含むプローブに関して考えられるいくつかの改変形状を示す。
【図９】H-ホスホネート化学を用いて合成された化合物にレポーター群（例えば、色素）を導入するプロセスを示す。
【図１０】INVADERアッセイにおける切断によるオリゴヌクレオチドから陽性電荷タグの放出を示す。
【図１１】それらがオリゴヌクレオチドに結合するように示す、異なる5個の電荷タグを示す。
【図１２】キラルホスホアミダイトを示す。
【図１３】オリゴヌクレオチド合成の際の、ホスホアミダイト基のホスホジエステル結合への変換を示す。
【図１４】中性（A）および陽性荷電（B）ホスホアミダイトの一般構造を示す。
【図１５】色素、構築ブロック、中性および陽性荷電ホスホアミダイトをそれぞれ一つ用いて、電荷平衡プローブの合成におけるいくつかの可能性がある組み合わせを示す。
【図１６】合成中性および陽性荷電ホスホアミダイトの例を示す。
【図１７】中性および陽性荷電ホスホアミダイトを用いて作製された一群の電荷平衡オリゴヌクレオチドプローブの構造を示す。
【図１８】基質70、70dp、74、74dp、75、75dp、76、および76dpの移動を示すIEFゲルの蛍光イメージャースキャンによって作製された像である。
【図１９Ａ】標的特異的INVADERオリゴヌクレオチド（配列番号：2）および標的核酸（配列番号：49）に沿って5' Cy3標識を有する標的特異的プローブオリゴヌクレオチド（配列番号：11）の配置を示す図を提供する。
【図１９Ｂ】電荷の逆転（すなわち、切断産物の荷電に基づく分離）を用いて侵入性切断アッセイにおいて生成された特異的切断産物の検出を示す蛍光イメージャーによって作製された像である。
【図２０】電荷の逆転を用いて侵入性切断アッセイにおいて生成された特異的切断産物の検出感度を示す蛍光イメージャーによって作製された像である。
【図２１】CLEAVASE A/GおよびPfu FEN-1ヌクレアーゼならびに5'陽電荷を有するまたは欠損するプローブを用いて生成された産物を示す蛍光イメージャーによって作製された像である；図21Aに示すゲルは、標準的な方向に泳動させ、図21Bに示すゲルは逆方向に泳動させた。
【図２２】電荷改変プローブの切断速度を比較するグラフを示す。
【図２３Ａ】侵入性切断におけるH-ホスホネート（HP）-電荷改変プローブの略図を示す。
【図２３Ｂ】電荷改変ヌクレオシド（dN）およびヘキサノール（HEX）タグの構造を示す。
【図２４Ａ】標準的な方向に泳動したゲル電気泳動によって分離した異なる5個の電荷平衡プローブの切断産物を示す蛍光イメージャーによって作製した像である。
【図２４Ｂ】逆方向に泳動したゲル電気泳動によって分離した異なる5個の電荷平衡プローブの切断産物を示す蛍光イメージャーによって作製した像である。
【図２５】電荷平衡プローブ5個および蛍光標識対照プローブ1個の切断速度を比較するグラフを示す。
【図２６Ａ】1〜24時間のあいだの異なる時間で行った反応における特異的シグナルの蓄積速度を比較するグラフを示す。
【図２６Ｂ】1〜24時間のあいだの異なる時間で行った反応において検出されたバックグラウンドシグナルの量を比較するグラフを示す。
【図２７】逆方向に泳動したゲル電気泳動によって分離した、異なる4個の電荷平衡プローブの切断産物を、単独または一本のレーンにおいて組み合わせて示す蛍光イメージャーによって作製した像である。
【図２８Ａ】検出のために電荷タグを放出するカスケード切断反応においてヒトMCP-1 RNAの検出のために用いられるオリゴヌクレオチドの略図を示す。
【図２８Ｂ】検出のために電荷タグを放出するカスケード切断反応においてヒトユビキチンRNAの検出のために用いられるオリゴヌクレオチドの略図を示す。
【図２９】ヒトMCP-1およびユビキチンmRNAを単独または同じ反応において組み合わせて検出するためにINVADERアッセイの産物を示す蛍光イメージャーによって作製された像である。産物は、逆方向に泳動させたゲル電気泳動によって分離した。
【図３０Ａ】ヒトMCP-1およびユビキチンRNAを単独または同じ反応において組み合わせて検出するためにINVADERアッセイの産物を比較する、逆または正常な極性で行ったゲル電気泳動によって分離した、蛍光イメージャーによって作製した像を示す。
【図３０Ｂ】ヒトMCP-1およびユビキチンRNAを単独または同じ反応において組み合わせて検出するためにINVADERアッセイの産物を比較する、逆または正常な極性で行ったゲル電気泳動によって分離した蛍光イメージャーによって作製した像を示す。
【図３１】CE分離に及ぼす試料緩衝液成分の影響を示すミセル界面動電クロマトグラフィー（MECC）プロフィールを示す。
【図３２】CE分離に及ぼす注入時間の影響を示すMECCプロフィールを示す。
【図３３】CE分離に及ぼす毛細管タイプの影響を示すMECCプロフィールを示す。
【図３４】CE分離に及ぼす分離緩衝液のイオン強度の影響を示すMECCプロフィールを示す。
【図３５】CE分離に及ぼす分離緩衝液のpHの影響を示すMECCプロフィールを示す。
【図３６】CE分離に及ぼすビス-トリスホウ酸緩衝液の影響を示すMECCプロフィールを示す。
【図３７】CE分離効率に及ぼす洗浄剤の影響を示すMECCプロフィールを示す。
【図３８】個々に、または4個全ての分子の等モル混合物として分離された実効陽性荷電タグ4個、5'-V-Cy3-C-3'、5'-V-(dA)-Cy3-C-3'、5'-V-(dG)-Cy3-C-3'、および5'-V-(dT)-Cy3-C-3'のMECCプロフィールを示す。
【図３９】図38に示すタグ混合物の分離に及ぼす新鮮な毛細管を用いる影響を示すMECCプロフィールを示す。
【図４０】個々に、または6個全ての分子の等モル混合物として分離された実効陽性荷電タグ6個それぞれのMECCプロフィールを示す。
【図４１】変性ゲル（A）の条件での5'-Tag1-G-3'または5'-Tag2-G-3'の移動度を未変性ゲル（B）の条件での移動度と比較する蛍光イメージャーによって作製した像を示す。

Claims (86)

  1. 電荷タグがホスフェート基と陽性荷電部分とを含む、核酸分子の末端に結合した電荷タグを含む組成物。
  2. 電荷タグがさらに色素を含む、請求項1記載の組成物。
  3. 色素が核酸と陽性荷電部分とのあいだに存在する、請求項2記載の組成物。
  4. 陽性荷電部分が核酸と色素のあいだに存在する、請求項2記載の組成物。
  5. 電荷タグが第二の陽性荷電部分をさらに含む、請求項1記載の組成物。
  6. 電荷タグがpH 6〜10で1価の実効陽電荷を有する、請求項1記載の組成物。
  7. 電荷タグがpH 6〜10で2価の実効陽電荷を有する、請求項1記載の組成物。
  8. 電荷タグが一つまたはそれ以上のヌクレオチドをさらに含む、請求項1記載の組成物。
  9. 核酸分子が、標的核酸と相補的な配列を含み、電荷タグの一つまたはそれ以上のヌクレオチドが該標的核酸とは相補的でない、請求項8記載の組成物。
  10. 核酸が標的核酸と相補的な第一の部分と、該標的核酸と相補的ではない第二の部分とを含み、該第二の部分が前記末端を含む、請求項1記載の組成物。
  11. 核酸および電荷タグが複合実効中性電荷を有し、該電荷タグが実効陽電荷を有する、請求項1記載の組成物。
  12. 核酸および電荷タグが複合実効陰電荷を有し、該電荷タグが実効陽電荷を有する、請求項1記載の組成物。
  13. 電荷タグが一級アミンを含む、請求項1記載の組成物。
  14. 電荷タグが二級アミンを含む、請求項1記載の組成物。
  15. 電荷タグが三級アミンを含む、請求項1記載の組成物。
  16. 電荷タグがアンモニウム基を含む、請求項1記載の組成物。
  17. 電荷タグが陽性荷電ホスホアミダイトをさらに含む、請求項1記載の組成物。
  18. 電荷タグが中性ホスホアミダイトをさらに含む、請求項1記載の組成物。
  19. 陽性荷電ホスホアミダイトを含む組成物。
  20. ホスホアミダイトが一級アミン基を含む、請求項19記載の組成物。
  21. ホスホアミダイトが二級アミン基を含む、請求項19記載の組成物。
  22. ホスホアミダイトが三級アミン基を含む、請求項19記載の組成物。
  23. ホスホアミダイトがアンモニウム基を含む、請求項19記載の組成物。
  24. ホスホアミダイトが1価の実効陽電荷を有する、請求項19記載の組成物。
  25. ホスホアミダイトが以下の構造を有する、請求項19記載の組成物：
    Figure 2005503114
    式中、Xは反応性ホスフェート基であり、Yは保護されたヒドロキシル基である。
  26. 核酸分子が陽性荷電ホスホアミダイトを含む、核酸分子を含む組成物。
  27. 電荷タグが陽性荷電ホスホアミダイトを含む、核酸分子の末端に結合した電荷タグを含む組成物。
  28. 陽性荷電ホスホアミダイトがアミン基を含み、該アミン基がもう一つの分子にさらに結合していない、請求項27記載の組成物。
  29. 中性荷電ホスホアミダイトが、二級アミン、三級アミン、およびアンモニウム基からなる群より選択される窒素含有化学基を含む、中性荷電ホスホアミダイトを含む組成物。
  30. 組成物が中性荷電ホスホアミダイトに結合した核酸分子をさらに含む、請求項29記載の組成物。
  31. 核酸分子が中性荷電ホスホアミダイトを含む電荷タグに結合している、請求項30記載の組成物。
  32. 電荷タグが陽性荷電ホスホアミダイトをさらに含む、請求項30記載の組成物。
  33. 電荷タグが実効陽電荷を有する、請求項32記載の組成物。
  34. ホスホアミダイトが以下の構造を有する、請求項29記載の組成物：
    Figure 2005503114
    式中、Xは保護されたヒドロキシル基であり、Zは反応性ホスフェートであり、Nはアミン基を含む。
  35. NがN-(CH2)nCH3であって、nが0であるか、または1〜12までの正の整数である、請求項34記載の組成物。
  36. 電荷タグが陽性荷電部分と、該電荷タグを核酸分子に共有結合させるように形成された反応基とを含む、電荷タグに結合した固相支持体を含む組成物。
  37. ホスフェート基がアミン基に直接結合している、ホスフェート基に直接結合した蛍光色素を含む組成物。
  38. 組成物が電荷タグを含み、蛍光色素が該電荷タグ内に含まれる、請求項37記載の組成物。
  39. 蛍光色素がCy3を含む、請求項37記載の組成物。
  40. 各オリゴヌクレオチドが異なる電荷タグに結合し、該電荷タグのそれぞれがホスフェート基と陽性荷電部分とを含む、複数のオリゴヌクレオチドを含む混合物。
  41. 複数のオリゴヌクレオチドが、それぞれが異なる電荷タグに結合した4個またはそれ以上のオリゴヌクレオチドを含む、請求項40記載の混合物。
  42. 複数のオリゴヌクレオチドが、それぞれが異なる電荷タグに結合した10個またはそれ以上のオリゴヌクレオチドを含む、請求項40記載の混合物。
  43. 複数のオリゴヌクレオチドが、それぞれが異なる電荷タグに結合した20個またはそれ以上のオリゴヌクレオチドを含む、請求項40記載の混合物。
  44. 複数のオリゴヌクレオチドが、それぞれが異なる電荷タグに結合した50個またはそれ以上のオリゴヌクレオチドを含む、請求項40記載の混合物。
  45. 電荷タグが色素を含む、請求項40記載の混合物。
  46. 電荷タグが第二の陽性荷電部分を含む、請求項40記載の混合物。
  47. 電荷タグが一つまたはそれ以上のヌクレオチドをさらに含む、請求項40記載の混合物。
  48. 電荷タグに結合したオリゴヌクレオチドのそれぞれが、複合実効中性電荷を有し、該電荷タグが実効陽電荷を有する、請求項40記載の混合物。
  49. 電荷タグに結合したオリゴヌクレオチドのそれぞれが、複合実効陰電荷を有し、該電荷タグが実効陽電荷を有する、請求項40記載の混合物。
  50. 電荷タグが陽性荷電ホスホアミダイトを含む、請求項40記載の混合物。
  51. 電荷タグが中性ホスホアミダイトを含む、請求項40記載の混合物。
  52. 以下の段階を含む、核酸分子を分離する方法：
    a）電荷不平衡オリゴヌクレオチドが反応混合物に含まれる、電荷タグを含む電荷不平衡オリゴヌクレオチドが生成される条件で電荷タグを含む電荷平衡オリゴヌクレオチドを処置する段階；および
    b）該電荷不平衡オリゴヌクレオチドを該反応混合物から分離する段階。
  53. 条件が電荷平衡オリゴヌクレオチドを反応物質によって処置する段階を含む、請求項51記載の方法。
  54. 電荷タグがオリゴヌクレオチドの末端に結合し、該電荷タグがホスフェート基と陽性荷電部分とを含む、請求項51記載の方法。
  55. 電荷タグが色素を含む、請求項51記載の方法。
  56. 色素がオリゴヌクレオチドと陽性荷電部分とのあいだに存在する、請求項54記載の方法。
  57. 陽性荷電部分がオリゴヌクレオチドと色素のあいだに存在する、請求項54記載の方法。
  58. 電荷タグが第二の陽性荷電部分をさらに含む、請求項53記載の方法。
  59. 電荷タグが一つまたはそれ以上のヌクレオチドを含む、請求項51記載の方法。
  60. オリゴヌクレオチドが標的核酸に対して相補的な配列を含み、電荷タグの一つまたはそれ以上のヌクレオチドが該標的核酸と相補的でない、請求項58記載の方法。
  61. オリゴヌクレオチドが標的核酸と相補的な第一の部分と、該標的核酸と相補的でない第二の部分とを含み、該第二の部分が前記末端を含む、請求項53記載の方法。
  62. 電荷平衡オリゴヌクレオチドが実効中性電荷を有し、電荷不平衡オリゴヌクレオチドが実効陽電荷を有する、請求項51記載の方法。
  63. 電荷平衡オリゴヌクレオチドが実効陰電荷を有し、電荷不平衡オリゴヌクレオチドが実効陽電荷を有する、請求項51記載の方法。
  64. 電荷タグが一級アミンを含む、請求項51記載の方法。
  65. 電荷タグが二級アミンを含む、請求項51記載の方法。
  66. 電荷タグが三級アミンを含む、請求項51記載の方法。
  67. 電荷タグがアンモニウム基を含む、請求項51記載の方法。
  68. 電荷タグが陽性荷電ホスホアミダイトを含む、請求項51記載の方法。
  69. 電荷タグが中性ホスホアミダイトを含む、請求項51記載の方法。
  70. 分離する段階がキャピラリー電気泳動分離を含む、請求項51記載の方法。
  71. 分離する段階がキャピラリーゾーン電気泳動分離を含む、請求項51記載の方法。
  72. 分離する段階がマイクロチャンネルにおいて起こる、請求項51記載の方法。
  73. 以下の段階を含む、核酸分子を分離する方法：
    a）電荷不平衡オリゴヌクレオチドが反応混合物に含まれる、電荷タグを含む二つまたはそれ以上の電荷不平衡オリゴヌクレオチドが生成される条件で、それぞれが異なる電荷タグを含む複数の電荷平衡オリゴヌクレオチドを処置する段階；および
    b）該反応混合物から該電荷不平衡オリゴヌクレオチドを分離する段階。
  74. 分離する段階が、異なる電荷タグを含む電荷不平衡オリゴヌクレオチドが互いに分離されるように、該電荷不平衡オリゴヌクレオチドを分離する段階を含む、請求項72記載の方法。
  75. 複数の電荷平衡オリゴヌクレオチドが、異なる電荷タグを含む4個またはそれ以上の電荷平衡オリゴヌクレオチドを含む、請求項72記載の方法。
  76. 複数の電荷平衡オリゴヌクレオチドが、異なる電荷タグを含む10個またはそれ以上の電荷平衡オリゴヌクレオチドを含む、請求項72記載の方法。
  77. 複数の電荷平衡オリゴヌクレオチドが、異なる電荷タグを含む20個またはそれ以上の電荷平衡オリゴヌクレオチドを含む、請求項72記載の方法。
  78. 複数の電荷平衡オリゴヌクレオチドが、異なる電荷タグを含む50個またはそれ以上の電荷平衡オリゴヌクレオチドを含む、請求項72記載の方法。
  79. 条件が電荷平衡オリゴヌクレオチドを反応物質によって処置する段階を含む、請求項72記載の方法。
  80. 電荷タグが複数のオリゴヌクレオチドの末端に結合し、該電荷タグがホスフェート基と陽性荷電部分とを含む、請求項72記載の方法。
  81. 電荷タグが色素を含む、請求項72記載の方法。
  82. 電荷タグが陽性荷電ホスホアミダイトを含む、請求項72記載の方法。
  83. 電荷タグが中性ホスホアミダイトを含む、請求項72記載の方法。
  84. 分離する段階がキャピラリー電気泳動分離を含む、請求項72記載の方法。
  85. 分離する段階がキャピラリーゾーン電気泳動分離を含む、請求項72記載の方法。
  86. 分離する段階がマイクロチャンネルにおいて起こる、請求項72記載の方法。
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