JP2005502679A - 慢性疼痛の処置方法およびそのための組成物 - Google Patents
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Abstract
本発明は、慢性疼痛を処置または改善するための新規治療薬開発用の適切な標的としてのカテプシンＳを開示している。本発明は、慢性疼痛の処置および／または改善方法およびそのためのカテプシンＳ酵素活性および／またはカテプシン遺伝子発現に対する阻害効果をもつモジュレーターを含む医薬組成物に関するものである。本発明はまた、慢性疼痛を処置するための治療有用性を有する化合物の同定方法であって、カテプシンＳ活性および／または遺伝子発現を阻害し得、またインビボで慢性疼痛の病的作用を除去し得る化合物を同定することを含む方法に関するものである。
Description
【０００１】
発明の背景
疼痛は、一連の臨床状態を包含する語である。正常条件下における急な痛みは、潜在的組織損傷状況についての生理学的警告としてある一定の役割を果たし、有益なものである。また、通常炎症に伴うさらに持続的な疼痛は、軽い組織損傷に対する正常な防御応答としてみなされ得、創傷治癒時には消散する。しかしながら、刺激因子および疼痛に関連性が無く、疼痛がもはや防御機構でなくなったとき、慢性疼痛が起こる。これらのタイプの疼痛症候群(例、慣性関節リウマチ、癌性疼痛、神経因性疼痛)は、処置困難であることが知られている。成人集団の１０〜２０％が慢性疼痛に苦しんでいると推定される。現在までのところ、使用されている主たる鎮痛薬は、オピエートおよび非ステロイド系抗炎症剤(ＮＳＡＩＤＳ)に基くもので例えばアスピリンがある。両種類の薬剤とも深刻な副作用をもたらし得る。ＮＳＡＩＤＳは胃潰瘍および腎損傷を誘発し得、オピエートは、悪心、便秘、錯乱および依存症問題を誘発し得る。これらの不利な点にもかかわらず、最近になっても新たな種類の鎮痛薬は発見も開発もされていない。慢性疼痛につての追加的治療法が明らかに要望されている。
【０００２】
慢性疼痛状態は、若干の臨床的徴候を特徴とする。突発的疼痛の場合と同様、患者は、痛覚過敏(有害な機械的、高温または低温刺激因子に対する非常に誇張された応答)および異痛症(以前には非有害性であった刺激因子が現在は苦痛として感じられる)を呈し得る。これらの特徴は全て、末梢神経系における知覚神経の機能および脊髄および脳における知覚情報処理の変化を含む複雑な一連の事象から生じる。これらの変化は、直接ニューロン損傷に応じて、または組織損傷または炎症中に放出される伝達物質に応じて生じる。
【０００３】
概して、慢性疼痛症候群は、炎症性(侵害受容性としても知られている)または神経因性として定義され得る。慢性炎症性疼痛は、その名が示す通り、根元的炎症、例えば慢性関節リウマチ、火傷、筋肉損傷または外科的創傷が存在している状態の間に起こる。炎症性疼痛の根底にある機構に関する知識には近年かなり進歩が見られ、様々な伝達物質および知覚神経の末梢系末端のそれらの活性化および感作およびその結果として生じる脊髄ニューロンの反応性における長期変化を含むことが知られている。
【０００４】
慢性神経因性疼痛は、神経系の一次病変または機能不全が存在する場合に誘発され、例えば、三叉神経痛、糖尿病性神経障害、ヘルペス後神経痛、切断術または物理的神経損傷といった状態の間に起こる。慢性神経因性疼痛は、外傷、例えば糖尿病、帯状疱疹または末期癌(下記参照)といった病気または化学的損傷(例、ある種の抗ＨＩＶ薬剤)による神経への損傷から生じる。それはまた、切断術(乳房切断を含む)後に発生し得、腰痛に関与する場合もある。慢性神経因性疼痛の機構についてはあまり理解されていないが、ある種のイオンチャンネルの新規発現に起因する知覚神経の自然発火、脊髄の種々の層への知覚神経線維の発出、および知覚神経および脊髄における様々な神経伝達物質および受容体の発現の変化を含むと考えられている。伝統的な慢性神経因性疼痛は、頑性であることが判明しており、標準的な非ステロイド系およびオピエート鎮痛薬に耐性がある。したがって、このタイプの疼痛を処置するためのまだ検討されていない新規鎮痛薬が明らかに臨床的に要望されている。
【０００５】
癌性疼痛は、最も一般的な慢性疼痛症候群(おそらくは炎症性および神経因性成分を伴う)である。進行癌患者の３分の１は、特に胸部、前立腺および肺癌において骨格転移を発症することが推定される。一般的に転移性骨疾患は、通常離散した領域に位置する骨の疼痛をまねき、刺すような不快な症状の発現を伴い、疼き、焼けるようで、強い倦怠感を伴う感覚として報告される。骨癌疼痛に関与する機構は未知であるが、おそらくは構造上の損傷、骨膜刺激および神経絞扼を含むものと思われる。正常な骨代謝の破壊および炎症性プロスタグランジンおよびサイトカインの生成についての証拠が存在する。骨癌疼痛の現行処置は依然オピエートによるものであるが、必要とされる用量では許容できない副作用が誘発されるため、患者の少なくとも２０％は依然として疼痛が制御されていないままである。これらの患者の生活の質を最適にする、耐容性良好で有効な新規鎮痛薬が望まれる(Coleman RE(１９９７)Cancer ８０；１５８８−１５９４)。
【０００６】
変形性関節症の疼痛は、人々が一般開業医を受診することになる慢性神経因性疼痛の最もありふれた形態(おそらくは炎症性および神経因性成分を伴うと思われる)である。変形性関節症は、関節組織、主として軟骨、滑膜および肋軟骨下骨における進行性の構造変化を伴う慢性疾患である。典型的には、関節炎の関節は、軟骨浮腫およびびらん、肋軟骨下骨および滑膜肥厚、および骨増殖体の形成を呈し、全て関節表面変形の一因となる。変形性関節症の主たる臨床徴候は疼痛であるが、この状態において慢性神経因性疼痛の根元をなす機構は解明されていない。
【０００７】
伝統的に、疼痛シグナル伝達に関与する知覚神経線維、例えば「Ｃ線維」(Woolf C.J.et al.(１９９５)J.Comp.Neurol.３６０、１２１−１２４)または脊髄に沿って有害情報を伝達する知覚神経線維(Dickenson AH. & Sullivan A.(１９８７)Neuropharmacol.２６；１２３５−１２３８)に治療化合物を指向させることにより慢性神経因性疼痛を軽減する試みが為されてきた。また、化合物は、炎症中の組織からの伝達物質放出(例、サイトカインおよびブラジキニン)を遮断することにより、および／またはこれらの伝達物質についての受容体を遮断することにより、この疼痛を軽減し得ると仮定されている(Dray A. & Urban L.(１９９６)Annu.Rev.Pharmacol.Toxicol.３６；２５３−２８０)。
【０００８】
我々は、驚くべきことに、リソソームシステインプロテアーゼである、カテプシンＳについてのｍＲＮＡが、慢性疼痛動物モデルにおいてアップレギュレーションされること、およびカテプシンＳ阻害剤の投与により、これらの動物における機構的痛覚過敏が除去されることを発見した。すなわち、カテプシンＳは、慢性疼痛についての新規薬剤標的として使用され得る。本発明はまた、カテプシンＳ活性を阻害し、および／またはカテプシンＳ遺伝子発現を阻害するモジュレーターの同定方法およびヒトおよび獣医学的患者における慢性疼痛処置についての上記モジュレーターの使用を提供する。本発明はまた、上記モジュレーターを含む医薬組成物を提供する。
【０００９】
発明の要約
本出願は、カテプシンＳが、慢性疼痛を処置または改善するための新規治療薬の開発に適切な標的であるという発見に関するものである。すなわち、一態様において、本発明は、慢性神経因性疼痛を含む慢性疼痛を処置または改善するのに有用なモジュレーターの同定方法であって、ａ)候補モジュレーターがインビトロまたはインビボでカテプシンＳの活性を阻害、および／またはカテプシンＳ遺伝子発現を阻害する能力について検定することを含み、さらにｂ)同定された阻害性モジュレーターが、慢性疼痛動物モデルおよび／または慢性疼痛対象による臨床試験で観察される病的作用を除去する能力について検定することを含み得る方法に関するものである。
【００１０】
別の態様において、本発明は、慢性神経因性疼痛を含む慢性疼痛の処置または改善方法であって、カテプシンＳモジュレーターの有効量を処置または改善を必要とする対象に投与することを含む方法に関するものであり、この場合上記モジュレーターは、上記対象において例えばカテプシンＳの酵素活性を阻害および／またはカテプシンＳ遺伝子発現を阻害するものとする。一態様において、モジュレーターは、Ｎ−ヘテロアリール−カルボニトリルカテプシン阻害剤と称される化合物の種類に属する化合物である。別の態様において、モジュレーターは、化学的化合物[７−(２,２−ジメチル−プロピル)−６−チオフェン−２−イルメチル−７.Ｈ.−ピロロ[２,３−.ｄ.]ピリミジン−２−カルボニトリル]の遊離または医薬上許容される塩形態、すなわち本明細書で化合物Ａと称される物質である。さらに別の実施態様において、モジュレーターは、化学的化合物３−[(４−モルホリニルカルボニル)フェニルアラニルアミド]−１−フルオロ−５−フェニル−２−ペンタノン、すなわち本明細書で化合物Ｂと称される物質である。別の実施態様において、モジュレーターは、アンチセンスオリゴヌクレオチド、三重らせんＤＮＡ、リボザイム、ＲＮＡアプタマーおよび二本鎖ＲＮＡから成る群から選択される１種またはそれ以上の物質を含んでおり、この場合上記物質はカテプシンＳ遺伝子発現を阻害するように設計されている。さらに別の実施態様において、モジュレーターは、カテプシンＳに対する抗体またはそのフラグメントを含み、この場合上記抗体は、例えばカテプシンＳ酵素活性を阻害し得るものとする。
【００１１】
別の態様において、本発明は、慢性神経因性疼痛を含む慢性疼痛の処置または改善方法であって、有効量のカテプシンＳモジュレーターを含む医薬組成物を処置または改善を必要とする対象に投与することを含む方法に関するものである。様々な実施態様において、医薬組成物は、上記で検討したカテプシンＳモジュレーターのいずれかを含む。
【００１２】
別の態様において、本発明は、処置または改善を必要とする対象における慢性神経因性疼痛を含む慢性疼痛の処置または改善に有効な量でカテプシンＳモジュレーターを含む医薬組成物に関するものであり、上記モジュレーターは、例えばカテプシンＳの酵素活性を阻害および／またはカテプシンＳ遺伝子発現を阻害し得るものとする。一実施態様において、上記医薬組成物は、Ｎ−ヘテロアリール−カルボニトリルカテプシン阻害剤と称される化合物の種類に属する化合物を含む。一実施態様において、上記医薬組成物は、本明細書で化合物Ａと称される化学的化合物の遊離または医薬上許容される塩形態を含む。さらに別の実施態様において、上記医薬組成物は、本明細書で化合物Ｂと称される物質を含む。別の実施態様において、医薬組成物は、カテプシンＳの核酸配列に指向されたアンチセンスオリゴヌクレオチド、三重らせんＤＮＡ、リボザイム、ＲＮＡアプタマーまたは二本鎖ＲＮＡから成る群から選択される１種またはそれ以上の物質を含み、上記物質は、カテプシンＳ遺伝子発現を阻害するように設計されているものとする。さらに別の実施態様において、上記医薬組成物は、カテプシンＳに対する抗体またはそのフラグメントを含み、上記抗体は、例えばカテプシンＳ酵素活性を阻害し得るものとする。
【００１３】
別の態様において、本発明は、カテプシンＳモジュレーターによる処置に適切な候補であり得る慢性疼痛罹患対象の診断方法であって、上記対象からの生物学的試料においてこのタンパク質のレベルを検出することを含む方法に関するものであり、この場合、対照と比べてレベルが増加した対象は、カテプシンＳモジュレーター処置に適切な候補であるものとする。
【００１４】
さらに別の態様において、本発明は、カテプシンＳモジュレーターによる処置に適切な候補であり得る慢性疼痛罹患対象の診断方法であって、上記対象からの生物学的試料においてこのタンパク質のｍＲＮＡレベルを検定することを含む方法に関するものであり、この場合、対照と比べてレベルが増加した対象は、カテプシンＳモジュレーター処置に適切な候補であるものとする。
【００１５】
さらに別の態様において、慢性神経因性疼痛を含む慢性疼痛の処置または改善方法であって、(ａ)対象においてカテプシンＳｍＲＮＡおよび／またはタンパク質レベルについて検定し、そして(ｂ)対照と比べてカテプシンＳｍＲＮＡのレベルおよび／タンパク質レベルが増加した対象に、慢性疼痛の病的作用を処置または改善するのに十分な量でカテプシンＳモジュレーターを投与することを含む方法が提供される。
【００１６】
本発明のさらに別の態様において、患者から誘導された体組織試料から、カテプシンＳまたは関連調節性ポリペプチドをコード化するポリヌクレオチドの発現、またはカテプシンＳまたは関連調節性ポリペプチド、またはそのフラグメントのレベルを検出するのに必要な成分を含む検定方法およびキットが提供され、上記キットは、例えば、上記ポリペプチド、またはそのフラグメントに結合する抗体、または上記ポリヌクレオチドとハイブリダイズするオリゴヌクレオチドプローブを含むものとする。好ましい実施態様において、上記キットはまた、キット成分を使用する際の手順を詳述した使用説明書を含む。
【００１７】
本発明はまた、慢性神経因性疼痛を含む慢性疼痛の処置または改善用医薬の製造におけるカテプシンＳモジュレーターの使用に関するものである。一実施態様において、上記カテプシンＳモジュレーターは、化合物Ａの遊離または医薬上許容される塩形態である。別の実施態様において、上記カテプシンＳモジュレーターは化合物Ｂである。さらに別の実施態様において、カテプシンＳモジュレーターは、アンチセンスオリゴヌクレオチド、三重らせんＤＮＡ、リボザイム、ＲＮＡアプタマーおよび二本鎖ＲＮＡから成る群から選択される１種またはそれ以上の物質を含み、上記物質は、カテプシンＳ遺伝子発現を阻害するように設計されているものとする。さらに別の実施態様において、カテプシンＳモジュレーターは、カテプシンＳに対する１種またはそれ以上の抗体、またはそのフラグメントを含み、上記抗体またはそのフラグメントは例えばカテプシンＳ酵素活性を阻害し得るものとする。
【００１８】
本発明はまた、医薬として使用されるカテプシンＳモジュレーターに関するものである。一実施態様において、上記カテプシンＳモジュレーターは、化合物Ａの遊離または医薬上許容される塩形態である。別の実施態様において、上記カテプシンＳモジュレーターは化合物Ｂである。さらに別の実施態様において、カテプシンＳモジュレーターは、アンチセンスオリゴヌクレオチド、三重らせんＤＮＡ、リボザイム、ＲＮＡアプタマーおよび二本鎖ＲＮＡから成る群から選択される１種またはそれ以上の物質を含み、上記物質は、カテプシンＳ遺伝子発現を阻害するように設計されているものとする。さらに別の実施態様において、カテプシンＳモジュレーターは、カテプシンＳに対する１種またはそれ以上の抗体、またはそのフラグメントを含み、抗体またはそのフラグメントは、例えばカテプシンＳ酵素活性を阻害し得るものとする。
【００１９】
発明の詳細な説明
本明細書に記載されている本発明は、記載された特定の方法、プロトコルおよび試薬に限定されるわけではなく、これらは変わり得るものして考えるべきである。また、本明細書で使用されている用語は、特定実施態様の説明のみを目的とし、何らかの意味で本発明の範囲を制限する意図はないものと理解すべきである。
【００２０】
特記しない場合、本明細書で使用されている技術および科学用語は全て、この発明が属する分野において、当業者が通常理解しているのと同じ意味を有するものとする。本明細書に記載されたものと類似しているかまたは均等内容の方法および材料も本発明の実施または試験において使用され得るが、好ましい方法、装置および材料は本明細書に記載されているものである。本明細書で挙げられている出版物は全て、出版物に報告されているもので、本発明に関して使用され得る材料および方法を記載および開示することを目的として出典明示で援用する。
【００２１】
本発明を実施する場合、分子生物学における多くの慣用的技術が使用される。これらの技術は公知であり、例えばCurrent Protocols in Molecular Biology、第Ｉ、IIおよびIII巻、１９９７(F.M.Ausubel編)；Sambrook et al.、１９８９、Molecular Cloning: A Laboratory Manual、第２版、コールドスプリングハーバー・ラボラトリー・プレス、コールドスプリングハーバー、ニューヨーク；DNA Cloning：A Practical Approach、第ＩおよびII巻、１９８５(D,N,Glover編)；Oligonucleotide Synthesis、１９８４(M.L.Gait編)；Nucleic Acid Hybridization、１９８５(HamesおよびHiggins)；Transcription and Translation、１９８４(HamesおよびHiggins編)；Animal Cell Culture、１９８６(R.I.Freshney編)；Immobilized Cells and Enzymes、１９８６(ＩＲＬプレス)；Perbal、１９８４、A Practical Guide to Molecular Cloning；the series，Methods in Enzymology(アカデミック・プレス、インコーポレイテッド)；Gene Transfer Vectors for Mammalian Cells、１９８７(J.H.MillerおよびM.P.Calos編、コールドスプリングハーバー・ラボラトリー)；およびMethods in Enzymology、第１５４巻および第１５５巻(それぞれWuおよびGrossman、およびWu編)において説明されている。
【００２２】
英語原文の明細書および請求の範囲で使用されている、単数形「ａ」、「ａｎ」および「ｔｈｅ」は、文脈から明らかに特定されている場合を除き、その複数表示も包含するものとする。すなわち、例えば「抗体」と示されている語は、当業者に公知の１個またはそれ以上の抗体およびその均等内容物などを包含する。
【００２３】
「慢性疼痛の病的作用」は、限定されるわけではないが、痛覚過敏および異痛を含む。
【００２４】
ある物質(例、カテプシンＳモジュレーター)がカテプシンＳを「調節する」能力は、限定されるわけではないが、ある物質がカテプシンＳの酵素活性を阻害および／またはカテプシンＳ遺伝子発現を阻害する能力を包含する。上記調節はまた、カテプシンＳと相互作用する他のタンパク質、例えば関連調節性タンパク質またはカテプシンＳにより修飾されているタンパク質の能力に効果を及ぼすことも含み得る。
【００２５】
本明細書で使用されている「核酸配列」は、オリゴヌクレオチド、ヌクレオチドまたはポリヌクレオチド、およびそれらのフラグメントまたは一部分、および１本または２本鎖形態であり、センスまたはアンチセンス鎖を表し得るゲノムまたは合成起源のＤＮＡまたはＲＮＡを包含する。
【００２６】
本明細書で使用されている「アンチセンス」の語は、特異的ＤＮＡまたはＲＮＡ配列と相補的であるヌクレオチド配列をいう。「アンチセンス鎖」の語は、「センス」鎖に相補的である核酸鎖に関して使用される。アンチセンス分子は、相補鎖の合成を可能にするウイルスプロモーターに興味の対象である遺伝子(複数も可)を逆配向でライゲーションすることによる合成を含む、任意の方法により製造され得る。一旦細胞へ導入されると、この転写された鎖は、細胞により生産された天然配列を合わさって二重らせんを形成する。次いで、これらの二重らせんは、さらなる転写または翻訳を遮断する。「負」の表示はアンチセンス鎖をいうのに使用される場合もあり、「正」の表示はセンス鎖をいうのに使用される場合もある。
【００２７】
本明細書で意図するところによると、アンチセンスオリゴヌクレオチド、三重らせんＤＮＡ、ＲＮＡアプタマー、リボザイムおよび二本鎖ＲＮＡは、選択されたカテプシンＳのヌクレオチド配列が、カテプシンＳ遺伝子発現の遺伝子特異的阻害を生じさせるように「カテプシンＳの核酸配列に指向されて」いる。例えば、カテプシンＳヌクレオチド配列の知識を用いることにより、ｍＲＮＡとの非常に強いハイブリダイゼーションをもたらすアンチセンス分子が設計され得る。同様に、カテプシンＳの特異的ヌクレオチド配列を認識し、それを開裂するようにリボザイムは合成され得る(Cech．J.Amer.Med Assn.２６０：３０３０(１９８８))。遺伝子発現のターゲッティングされた阻害で使用される上記分子の設計技術は、当業者には熟知されている。
【００２８】
「カテプシンＳ」の語は、ヒトまたは他の種に由来する、限定されるわけではないが、カテプシンＳ配列を含む部分形態、イソ形態、前駆体形態、完全長ポリペプチド、融合タンパク質または上記のいずれかのフラグメントを含むこのポリペプチドのあらゆる形態を全て包含する。カテプシンＳの配列は、Ｇｅｎｂａｎｋにおいて、受入番号ＮＭ００４０７９で見出され得る。カテプシンＳの相同体は、当業者にとっては明白なことであるが、この定義に含まれるものとする。また、この語は、いずれかの種の天然に存する供給源、例えばゲノムＤＮＡライブラリーおよび遺伝子操作が加えられた発現系を含む宿主細胞から単離されるか、または例えば自動ペプチド合成装置を用いる化学合成または上記方法の組み合わせにより製造されるカテプシンＳをいうものとする。上記ポリペプチドの単離および調製手段は当業界では十分に理解されている。
【００２９】
本明細書で使用されている「試料」の語は、その最も広い意味で使用されている。対象からの生物学的試料は、血液、尿またはカテプシンＳ活性または遺伝子発現が検定され得る他の生物学的材料を含み得る。生物学的試料は脊髄神経節を含み得、そこから全ＲＮＡが、慣用的ガラスチップマイクロアレイ技術、例えばアフィメトリックスチップ、ＲＴ−ＰＣＲまたは他の慣用的方法を用いて遺伝子発現プロファイリング用に精製され得る。
【００３０】
本明細書で使用されている「抗体」の語は、エピトープ決定基と結合し得る、無傷の分子およびそのフラグメント、例えばＦａ、Ｆ(ａｂ')２およびＦｖをいう。カテプシンＳポリペプチドと結合する抗体は、免疫化抗原として興味の対象である小ペプチドを含む無傷のポリペプチドまたはフラグメントを用いて調製され得る。動物の免疫化に使用されるポリペプチドまたはペプチドは、ＲＮＡの翻訳から誘導されるか、または化学的に合成され得、所望の場合、担体タンパク質にコンジュゲートされ得る。ペプチドに化学的にカップリングする常用担体には、ウシ血清アルブミンおよびチログロブリンがある。次いで、カップリングしたペプチドを用いて、動物(例、マウス、ラットまたはウサギ)を免疫化する。
【００３１】
本明細書で使用されている「ヒト化抗体」の語は、アミノ酸が非抗原結合領域で置換されたことによりヒト抗体とより密接に類似していながら、もとの結合能力を依然保持している抗体分子をいう。
【００３２】
「治療有効量」は、限定されるわけではないが、痛覚過敏を含む慢性疼痛の病的作用の処置および／または改善に十分な薬剤量である。
【００３３】
本明細書で使用されている「関連調節性タンパク質」および「関連調節性ポリペプチド」は、慣用的方法、例えば本明細書記載の方法を用いて当業者により同定され得るカテプシンＳの調節に関与するポリペプチドをいう。
【００３４】
本明細書で定義されている疼痛は慢性疼痛を含む。「慢性疼痛」は、炎症性(侵害受容性)および神経因性疼痛を含む。
「対象」は、ヒトまたはヒト以外の生物体を包含する。
【００３５】
本発明は、カテプシンＳメッセンジャーＲＮＡが、慢性神経因性疼痛のラットモデルにおいてアップレギュレーションされるという驚くべき発見に基いている。この観察結果により、カテプシンＳ阻害剤は、慢性疼痛の実験モデルにかけられたラットで誘発された機械的痛覚過敏を除去するというさらなる発見が導かれている。すなわち、カテプシンＳは、以前にはカテプシンＳに係わることが知られていなかった病状である、慢性疼痛の処置用治療薬の開発についての有用な薬剤標的である。
【００３６】
すなわち、一態様において、本発明は、慢性神経因性疼痛を含む慢性疼痛の処置または改善に有用なモジュレーターの同定方法であって、ａ)候補モジュレーターがインビトロまたはインビボでカテプシンＳの活性を阻害、および／またはカテプシンＳ遺伝子発現を阻害する能力について検定することを含み、さらにｂ)同定された阻害性モジュレーターが、慢性疼痛動物モデルおよび／または慢性疼痛対象による臨床試験で観察される病的作用を除去する能力について検定することを含み得る方法に関するものである。
【００３７】
慣用的スクリーニング検定法(インビトロおよびインビボの両方)を用いることにより、カテプシンＳ酵素活性を阻害および／またはカテプシンＳ遺伝子発現を阻害するモジュレーターが同定され得る。カテプシンＳ活性レベルは、対象において慣用的酵素活性検定方法を用い、対象からの生物学的試料を用いて検定され得る。カテプシンＳ遺伝子発現(例、ｍＲＮＡレベル)はまた、当業者が熟知している方法、例えば慣用的ノーザン分析または市販のマイクロアレイを用いて測定され得る。さらに、カテプシンＳの試験化合物の阻害効果および／または関連調節性タンパク質レベルは、ＥＬＩＳＡ抗体に基く検定法または蛍光標識反応検定法により検出され得る。これらの技術は、高スループットスクリーニングについて容易に利用可能であり、当業者に熟知されたものである。
【００３８】
これらの試験から集められたデータを用いることにより、慢性疼痛の処置についての治療有用性をもつモジュレーターを同定し、次いで化合物がインビボで慢性疼痛の病的作用を改善する能力を評価する慣用的方法にしたがって、阻害性物質を、本明細書に記載された慢性疼痛の慣用的な生きた動物モデルおよび／または慢性疼痛を患うヒトによる臨床試験においてさらに検定し得る。
【００３９】
本明細書に開示された方法による分析用の候補モジュレーターには、カテプシン阻害活性を有することが知られている化学的化合物およびいかなるレベルにせよこのタンパク質に対するその効果がまだ特性確認されていない化合物がある。カテプシン阻害活性を有することが知られている化合物は、本明細書記載の動物疼痛モデルまたは臨床試験において直接検定され得る。
【００４０】
カテプシン阻害活性をもつ化合物、および必ずしも限定はされないがカテプシンＳのみを特異的に阻害する化合物は、有用な治療薬であることが判明し得る。例えば、混合カテプシン阻害剤(例、カテプシンＫまたはＬおよびＳを阻害し得る化合物)は、本発明において有用である。
【００４１】
本発明で有用な公知カテプシン阻害剤、例えばカテプシンＳ特異的阻害剤には、限定されるわけではないが、ノヴァーティス・コーポレーションの国際特許出願公開第ＷＯ９９／２４４６０号に記載されたジペプチドニトリル、α−アミノフルオロケトン、例えば米国特許第４５１８５２８号に記載されたもの、米国特許第５３７４６２３号に記載されたフルオリド遊離脱離基をもつペプチド、米国特許第５４８６６２３号に記載された複素環脱離基をもつ化合物、およびアルキルスルホニル含有化合物、例えば米国特許第６０３０９４６号に記載されたものがある。カテプシン阻害剤を開示している追加的参考文献には、国際公開第ＷＯ００／４９００７号、国際公開第ＷＯ００／４９００８号、国際公開第ＷＯ９７／４００６６号、国際公開第ＷＯ９６／４０７３７号、国際公開第ＷＯ０１／１９８１６号、国際公開第ＷＯ００／５５１２５号および国際公開第ＷＯ００／５１９９８号がある。システインプロテアーゼ阻害剤設計における進歩の治療的潜在性の概説については、Veber、Daniel F、Thompson、Scott K. Curr.Opin.Drug Discovery Dev.(２０００)、３(４)、３６２−３６９参照。
【００４２】
特に有用な種類の化合物は、より一般的にはＮ−ヘテロアリール−カルボニトリルカテプシン阻害剤として称され得る６−アリール−７Ｈ−ピロロ−(２,３−ｄ)−ピリミジン−２−カルボニトリルカテプシン阻害剤である。この種類に属する特に有用な一化合物は、式(Ｉ)の化合物、すなわち本明細書では化合物Ａと称される、[７−(２,２−ジメチル−プロピル)−６−チオフェン−２−イルメチル−７.Ｈ.−ピロロ[２,３−.ｄ.]ピリミジン−２−カルボニトリル]およびその医薬上許容される塩である(実施例３参照)。
式Ｉ：
【化１】
【００４３】
化合物Ａは、さらに英国特許出願第１２１０３３.５号および英国特許出願第１２８４８３.５号に開示されており、それらに記載された方法で合成され得る。簡単に述べると、１−プロパ−２−イニル−２Ｈ−チオフェン(１５ｍｍｏｌ)を室温で窒素雰囲気下ＤＭＦに溶かす。この溶液に、５−ブロモ−４−(２,２−ジメチルプロピルアミノ)−ピリミジン−２−カルボニトリル(８ｍｍｏｌ)、トリエチルアミン(２４ｍｍｏｌ)、よう化銅(Ｉ)(０.８ｍｍｏｌ)、およびジクロロビス(トリフェニルホスフィン)パラジウム(II)(０.４ｍｍｏｌ)を連続的に加える。混合物を窒素雰囲気下で３時間８０℃で加熱する。室温で冷却後、混合物をＨ２ＯおよびＡｃＯＥｔで希釈し、セライトで濾過する。有機層を取り、ＭｇＳＯ４で乾燥し、真空下濃縮する。残さをシリカゲルカラムクロマトグラフィー(ＡｃＯＥｔ：ＭｅＯＨ＝２０：１)により精製して、７−(２,２−ジメチル−プロピル)−６−チオフェン−２−イルメチル−７Ｈ−ピロロ[２,３−ｄ]ピリミジン−２−カルボニトリルを６４％収率で得る。Rf = 0.50 (n-ヘキサン:AcOEt =5:1); NMR: (CDCl3):1.04(s, 9H) 4.10(s, 2H), 4.43(s, 2H), 6.44(s, 1H), 6.85-6.86(m, 1H), 6.97-6.99(m, 1H), 7.23-7.25(m, 1H), 8.87(s, 1H)。
【００４４】
さらに、別の特に有用な化合物は、式(II)の化合物、３−[(４−モルホリニルカルボニル)−フェニルアラニルアミド]−１−フルオロ−５−フェニル−２−ペンタノン(J.Clin.Invest １９９３年３月、９１(３)：１０５２−６および米国特許第４５１８５２８号に開示されている)である。
式II：
【化２】
【００４５】
この化合物は、混合カテプシン阻害剤であり、本明細書では化合物Ｂ(実施例２参照)と称され、下記スキームにしたがって製造され得る。
【化３】
【００４６】
別の態様において、本発明は、慢性疼痛の処置または改善方法であって、処置または改善を必要とする対象にカテプシンＳモジュレーターの有効量を含む医薬組成物を投与することを含む方法に関するものである。上記モジュレーターは、カテプシンＳポリペプチドまたはそのフラグメントに指向した抗体を含む。ある種の特に好ましい実施態様において、医薬組成物は、ヒトカテプシンＳポリペプチドまたはヒトカテプシンＳポリペプチドの一部分に高選択的である抗体を含む。カテプシンＳに対する抗体は、対象においてタンパク質の凝集を誘発するため、酵素の活性を阻害または低減化し得る。上記抗体はまた、例えば、活性部位と直接相互作用することにより、または活性部位への基質の接近を遮断することにより、カテプシンＳ活性を阻害または低減化し得る。カテプシンＳ抗体はまた、カテプシンＳの調節に関与し、酵素活性に必要であり得るタンパク質−タンパク質相互作用を阻止することによるカテプシンＳ活性の阻害に使用され得る。阻害活性をもつ抗体、例えば本明細書記載のものは、当業者に熟知されている標準的検定法にしたがって製造され、同定され得る。
【００４７】
カテプシンＳ抗体はまた、診断に使用され得る。例えば、これらの抗体は、対象においてカテプシンＳのレベルを定量する慣用的方法にしたがって使用され得る。レベル増加は、慢性疼痛およびこの状態の重症度を示す。すなわち、異なるカテプシンＳレベルは、慢性疼痛の様々な臨床形態および重症度を示す。上記情報はまた、カテプシンＳ阻害剤による処置に応答する場合もしない場合もあり得る疼痛経験患者の部分集合を同定するのに有用である。同様に、対象においてカテプシンＳのメッセージレベルを定量することは、診断および適切な疼痛治療の決定に有用であると考えられる。適切な対照個体と比べてこのタンパク質のｍＲＮＡレベルが高い対象は、カテプシンＳ阻害剤による処置についての適切な候補であるとみなされる。
【００４８】
すなわち、別の態様において、本発明は、
(ａ)カテプシンＳのポリヌクレオチドまたはそのフラグメント、
(ｂ)(ａ)の配列と相補的なヌクレオチド配列、
(ｃ)カテプシンＳポリペプチド、またはそのフラグメント、または
(ｄ)カテプシンＳポリペプチドに対する抗体
を含む診断キットに関するものである。
【００４９】
上記キットにおいて、(ａ)、(ｂ)、(ｃ)または(ｄ)は、実質的な成分を構成し得るものとする。また、上記キットは、本明細書で検討されているカテプシンＳ関連調節性タンパク質またはカテプシンＳにより修飾されたタンパク質のレベルを検出するように設計された成分(ａ)〜(ｄ)を含み得ると考えられる。
【００５０】
同様に、カテプシンＳタンパク質レベルまたは酵素活性のモニタリングおよび／またはカテプシンＳ遺伝子発現(ｍＲＮＡレベル)の検出は、例えば、所定の疼痛処置プログラムの効力を測定するための臨床試験手順の一部として使用され得ると考えられる。例えば、疼痛用薬剤が投与された患者が評価され、臨床医は、カテプシンＳレベル、活性および／または遺伝子発現レベルが望ましいレベルよりも高い(すなわち疼痛を経験していない対照患者または疼痛が臨床的介入により十分に軽減された患者におけるレベルよりも高いレベル)患者を同定できる。これらのデータに基づいて、臨床医は、処方される疼痛薬剤の用量、投与プログラムまたはタイプを調節し得る。臨床医は、患者に対し個別に経験している疼痛の程度を尋ねることにより、特定疼痛薬剤の有効性を把握できることから、上記によるカテプシンＳの患者レベルのモニタリングは、患者の疼痛レベルの定量的評価を提供すると考えられる。さらに、かかる方法での対象におけるカテプシンＳレベルのモニタリングを用いることにより、非応答性患者(例、幼児、昏睡状態、火傷患者)が経験している疼痛レベルが評価され得る。次いで、臨床医は、上記データを用いることにより、上記患者についての疼痛薬剤の適切な用量、投与プログラムまたはタイプを決定することができる。
【００５１】
患者に対する治療を最適化するのに考慮すべき因子には、処置されている特定状態、処置されている特定哺乳類、個々の患者の臨床状態、活性化合物の送達部位、活性化合物の特定タイプ、投与方法、投与スケジュール、および開業医に知られている他の因子が含まれる。投与される活性化合物の治療有効量は、上記考察により決定されるもので、慢性疼痛、好ましくは慢性神経因性疼痛の処置に必要な最少量である。
【００５２】
カテプシンＳまたは関連調節性タンパク質に対する適切な抗体は、市販供給源から入手されるか、または慣用的方法にしたがって製造され得る。例えば、１つまたはそれ以上の差次的発現された遺伝子エピトープを特異的に認識し得る抗体の製造方法が、本明細書には記載されている。上記抗体には、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体(ｍＡｂ)、ヒト化またはキメラ抗体、１本鎖抗体、Ｆａｂフラグメント、Ｆ(ａｂ')２フラグメント、Ｆａｂ発現ライブラリーにより製造されるフラグメント、抗イディオタイプ(抗Ｉｄ)抗体、およびエピトープ結合性フラグメントが含まれ得るが、これらに限定されるわけではない。
【００５３】
本明細書で検討されているカテプシンＳポリペプチドに対する抗体を製造するため、様々な宿主動物がポリペプチドまたはその一部の注射により免疫化され得る。上記宿主動物には、ウサギ、マウスおよびラットが含まれ得るが、限定はされない。宿主の種によって、免疫応答を高めるために様々なアジュバントが使用され得、例としては、フロイントアジュバント(完全および不完全)、無機ゲル、例えば水酸化アルミニウム、表面活性物質、例えばリソレシチン、プルロニックポリオール、ポリアニオン、ペプチド、油性エマルジョン、キーホールリンペット・ヘモシアニン、ジニトロフェノールおよび潜在的に有用なヒトアジュバント、例えばＢＣＧ(カルメット−ゲラン杆菌、bacille Calmette-Guerin)およびコリネバクテリウム・パルブム(Corynebacterium parvum)があるが、これらに限定はされない。
【００５４】
ポリクローナル抗体は、抗原、例えば標的遺伝子産物、またはその抗原機能性誘導体により免疫化された動物の血清から誘導された抗体分子の異種集団である。ポリクローナル抗体を製造するためには、宿主動物、例えば上記の動物が、同じく上記のアジュバントを補ったポリペプチドまたはその一部分の注射により免疫化され得る。
【００５５】
特定抗原に対する抗体の均一集団であるモノクローナル抗体は、培養中の連続セルラインにより抗体分子を製造させる技術により得られる。これらの技術には、KohlerおよびMilstein(１９７５、Nature ２５６：４９５−４９７、および米国特許第４３７６１１０号)のハイブリドーマ技術、ヒトＢ細胞ハイブリドーマ技術(Kosbor et al.、１９８３、Immunology Today ４：７２；Cole et al.、１９８３、Proc.Natl.Acad.Sci.USA ８０：２０２６−２０３０)、およびＥＢＶ−ハイブリドーマ技術(Cole et al.、１９８５、Monoclonal Antibodies And Cancer Therapy、アラン・R.リス、インコーポレイテッド７７−９６頁)があるが、限定はされない。上記抗体は、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＥ、ＩｇＡ、ＩｇＤおよびそのサブクラスを含む免疫グロブリンのクラスに属し得る。この発明のｍＡｂを生産するハイブリドーマは、インビトロまたはインビボで培養され得る。この方法は、インビボで高力価のｍＡｂを生じることから、現時点では好ましい製造方法となっている。
【００５６】
さらに、適切な生物活性を有するヒト抗体分子からの遺伝子と一緒に適切な抗原特異性を有するマウス抗体分子からの遺伝子をスプライシングすることによる「キメラ抗体」の製造用に開発された技術(Morrison et al.、１９８４、Proc.Natl.Acad.Sci.、８１：６８５１−６８５５；Neuberger et al.、１９８４、Nature、３１２：６０４−６０８；Takeda et al.、１９８５、Nature、３１４：４５２−４５４)も使用され得る。キメラ抗体は、種々の部分が異なる動物種から誘導された分子、例えばネズミｍＡｂから誘導された可変または超可変域およびヒト免疫グロブリン定常域を有するものである。
【００５７】
別法として、１本鎖抗体の製造について報告された技術(米国特許第４９４６７７８号、Bird、１９８８、Science ２４２：４２３−４２６；Huston et al.、１９８８、Proc.Natl.Acad.Sci.USA ８５：５８７９−５８８３；およびWard et al.、１９８９、Nature３３４：５４４−５４６)は、差次的発現遺伝子−１本鎖抗体の製造に適合化され得る。１本鎖抗体は、アミノ酸架橋を介してＦｖ領域の重鎖および軽鎖フラグメントを結合して、１本鎖ポリペプチドを生じさせることにより形成される。
【００５８】
最も好ましくは、「ヒト化抗体」の製造に有用な技術を適合化させることにより、本明細書に開示されているポリペプチド、フラグメント、誘導体および機能的均等内容物に対する抗体を製造し得る。上記技術は、米国特許第５９３２４４８、５６９３７６２、５６９３７６１、５５８５０８９、５５３０１０１、５９１０７７１、５５６９８２５、５６２５１２６、５６３３４２５、５７８９６５０、５５４５５８０、５６６１０１６および５７７０４２９号に開示されており、これらの開示は全て、出典明示で援用する。
【００５９】
特異的エピトープを認識する抗体フラグメントは、公知技術により生成され得る。例えば、上記フラグメントには、抗体分子のペプシン消化により製造され得るＦ(ａｂ')２フラグメントおよびＦ(ａｂ')２フラグメントのジスルフィド架橋を還元することにより製造され得るＦａｂフラグメントがあるが、これらに限定はされない。別法として、Ｆａｂ発現ライブラリーを構築することにより(Huse et al.、１９８９、Science、２４６：１２７５−１２８１)、所望の特異性をもつモノクローナルＦａｂフラグメントが迅速かつ容易に同定され得る。
【００６０】
本明細書に記載されている抗体の検出は、標準ＥＬＩＳＡ、ＦＡＣＳ分析、およびインビトロまたはインビボで使用される標準イメージング技術を用いて達成され得る。抗体を検出可能物質にカップリング(すなわち、物理的結合)させることにより、検出は簡易化され得る。検出可能物質の例には、様々な酵素、補欠分子族、蛍光材料、発光材料、生物発光材料および放射性材料が含まれる。適切な酵素の例には、西洋ワサビペルオキシダーゼ、アルカリ性ホスファターゼ、(３−ガラクトシダーゼ、またはアセチルコリンエステラーゼがある。適切な補欠分子族複合体の例には、ストレプトアビジン／ビオチンおよびアビジン／ビオチンがある。適切な蛍光材料の例には、ウンベリフェロン、フルオレセイン、フルオレセインイソチオシアネート、ローダミン、ジクロロトリアジニルアミンフルオレセイン、ダンシルクロリドまたはフィコエリトリンがある。ルミネセンス材料の一例にはルミノールがある。生物発光材料の例には、ルシフェラーゼ、ルシフェリンおよびエクオリンがあり、適切な放射性材料の例には125Ｉ、131Ｉ、35Ｓまたは３Ｈがある。
【００６１】
検出の容易さについて、特に好ましいのはサンドイッチ検定法であり、その若干の変形も存在するが、それらは全て本発明に包含されるものとする。例えば、典型的前進検定法では、非標識抗体を固体基質に固定し、試験すべき試料を結合分子と接触させる。適切なインキュベーション期間後、抗体−抗原二元複合体を形成させるのに十分な期間、検出可能なシグナルを誘導し得るリポーター分子で標識した二次抗体を加え、インキュベーションし、抗体−抗原−標識抗体の三元複合体を形成させるのに十分な時間をおく。次いで、未反応物質があれば全て洗い流し、抗原の存在を、シグナルの観察により測定するか、または既知量の抗原を含む対照試料と比較することにより定量し得る。前進検定法に対する変形には、試料および抗体の両方を同時に結合抗体に加える同時検定法、または標識抗体および試験すべき試料を最初に合わせ、インキュベーションし、非標識表面結合抗体に加える逆検定法がある。これらの技術は、当業者には熟知されており、小さな変形についての可能性も容易に理解されるはずである。本明細書で使用されている「サンドイッチ検定法」は、基本的２サイト技術に対する変形も全て包含するものとする。本発明のイムノアッセイの場合、唯一の制限因子は、標識抗体が、カテプシンＳポリペプチドまたは関連調節タンパク質、またはそのフラグメントに特異的な抗体であることである。
【００６２】
最も一般的に使用されるリポーター分子は、酵素、発蛍光団−または放射性核種−含有分子である。酵素免疫検定法の場合、通常、グルタルアルデヒドまたは過ヨウ素酸手段により酵素を第２抗体にコンジュゲートする。しかしながら、容易に認められるように、広く多様な種々のライゲーション技術が存在しており、それらは当業者には熟知されている。一般的に使用される酵素としては、中でも西洋ワサビペルオキシダーゼ、グルコースオキシダーゼ、ベータ−ガラクトシダーゼおよびアルカリ性ホスファターゼがある。特異酵素により使用される基質は、対応する酵素の加水分解時に、検出可能な色の変化を生じるように一般的に選択される。例えば、ｐ−ニトロフェニルホスフェートは、アルカリ性ホスファターゼコンジュゲートを伴う使用に適切である。ペルオキシダーゼコンジュゲートについては、１,2−フェニレンジアミンまたはトルイジンが常用される。また、上記の色素原基質ではなく蛍光生成物を生じる、蛍光性基質の使用も可能である。次いで、適切な基質を含む溶液を三次複合体に加える。基質は、第２抗体に結合された酵素と反応して定性的視覚シグナルを与え、これを通常は分光光度計によってさらに定量することにより、血清試料中に存在する興味の対象であるポリペプチドまたはポリペプチドフラグメントの量の評価が得られる。
【００６３】
別法として、蛍光化合物、例えばフルオレセインおよびローダミンは、結合受容力を改変することなく抗体に化学的にカップリングされ得る。特定波長の光線照射により活性化されると、蛍光色素標識抗体は、光エネルギーを吸収し、分子における励起状態を誘導し、特徴的なより長い波長の光を放出する。放出は、光学顕微鏡により視覚的に検出され得る特徴的な色として現れる。免疫蛍光およびＥＩＡ技術は、両方とも当業界では十分に確立されており、本方法には特に好ましい。しかしながら、他のリポーター分子、例えば放射性同位元素、化学発光または生物発光分子もまた使用され得る。要求された用途に合うよういかに手順を変更するべきかは、当業者であれば容易に想到できるはずである。
【００６４】
本発明医薬組成物はまた、核酸レベルでカテプシンＳの発現を阻害する物質を含み得る。上記分子には、カテプシンＳ核酸の適切なヌクレオチド配列に指向されたリボザイム、アンチセンスオリゴヌクレオチド、三重らせんＤＮＡ、ＲＮＡアプタマーおよび／または二本鎖ＲＮＡがある。これらの阻害性分子は、過度の負担または実験を課することなく当業者により慣用技術を用いて生成され得る。例えば、遺伝子発現の修飾(例、阻害)は、本明細書で検討されているポリペプチドをコードする遺伝子の制御領域に対し、すなわちプロモーター、エンハンサーおよびイントロンに対し、アンチセンス分子、ＤＮＡまたはＲＮＡを設計することにより達成される。例として、例えば開始部位から−１０と＋１０位の間における、転写開始部位から誘導されたオリゴヌクレオチドが使用され得る。にもかかわらず、遺伝子の全領域を用いてアンチセンス分子を設計することにより、ｍＲＮＡとの非常に強いハイブリダイゼーションをもたらすものが生成され得、そして上記の適切なアンチセンスオリゴヌクレオチドは、当業者に熟知された標準的検定手順により調製および同定され得る。
【００６５】
同様に、遺伝子発現の発現阻害は、「三重らせん」塩基対合方法を用いて達成され得る。三重らせん対合は、二重らせんがポリメラーゼ、転写因子または調節分子の結合について十分に開裂できる能力の阻害を誘発することから、有用である。三重らせんＤＮＡを用いた最近の治療上の進歩については文献に記載されている(Gee,J.E.et al.(１９９４)Huber,B.E.およびB.I.Carr、Molecular and Immunologic Approaches、フツーラ・パブリッシング・カンパニー、マウントキスコ、ニューヨーク)。これらの分子はまた、転写物がリボソームと結合するのを阻止することによりｍＲＮＡの翻訳を遮断するように設計され得る。
【００６６】
リボザイム、すなわち酵素的ＲＮＡ分子はまた、ＲＮＡの特異的開裂を触媒することにより、遺伝子発現を阻害するのに使用され得る。リボザイムの作用機序は、相補的標的ＲＮＡとのリボザイム分子の配列特異的ハイブリダイゼーション、次いでエンドヌクレアーゼ加水分解的開裂を含む。使用され得る例としては、遺伝子操作を加えた「ハンマーヘッド」または「ヘアピン」モチーフリボザイム分子があり、それらは遺伝子配列、例えばカテプシンＳ遺伝子のエンドヌクレアーゼ加水分解的開裂を特異的かつ有効に触媒するよう設計され得る。
【００６７】
可能性のあるＲＮＡ標的内における特異的リボザイム開裂部位は、まず、以下の配列：ＧＵＡ、ＧＵＵおよびＧＵＣを含むリボザイム開裂部位について標的分子を走査することにより同定される。一旦同定されると、開裂部位を含む標的遺伝子の領域に対応する１５および２０間のリボヌクレオチドの短いＲＮＡ配列が、オリゴヌクレオチドを機能できなくさせ得る二次構造的特徴について評価され得る。候補標的の適合性はまた、リボヌクレアーゼ保護検定法を用いて相補的オリゴヌクレオチドとのハイブリダイゼーションへの接近性を試験することにより評価され得る。
【００６８】
リボザイム方法では、細胞をリボザイムに暴露するかまたは上記小ＲＮＡリボザイム分子の細胞において発現を誘導する(GrassiおよびMarini、１９９６、Annals of Medicine ２８：４９９−５１０；Gibson、１９９６、Cancer and Metastasis Reviews １５：２８７−２９９)。本明細書で検討されている遺伝子の少なくとも１つに対応するｍＲＮＡにターゲッティングされたハンマーヘッドおよびヘアピンリボザイムの細胞内発現は、遺伝子によりコード化されるタンパク質の阻害に利用され得る。
【００６９】
リボザイムは、リボザイム配列を組込んだＲＮＡオリゴヌクレオチドの形態で細胞に直接送達されるか、または所望のリボザイムＲＮＡをコードする発現ベクターとして細胞へ導入され得る。リボザイムは、常用の手順で、ｍＲＮＡを開裂し、それによって細胞におけるｍＲＮＡ存在量を修飾する上で触媒的に有効である十分な数でインビボ発現され得る(Cotten et al.、１９８９、EMBO J.８：３８６１−３８６６)。特に、慣用的な公知規則に従って設計され、例えば標準的ホスホルアミダイト化学作用により合成されたリボザイムコーディングＤＮＡ配列は、ｔＲＮＡをコードする遺伝子のアンチコドンステムおよびループにおける制限酵素部位へライゲーションされ得、次いで当業界の常用方法により興味の対象である細胞へ形質転換され、そこで発現され得る。また、好ましくは、誘導性プロモーター(例、グルココルチコイドまたはテトラサイクリン応答エレメント)をこの構築物に導入することにより、リボザイム発現は選択的に制御され得る。飽和的使用については、高度の構成的活性プロモーターが使用され得る。ｔＤＮＡ遺伝子(すなわち、ｔＲＮＡをコード化する遺伝子)は、それらのサイズが小さく、転写速度が速く、異なる種類の組織において遍在的に発現されることから、この出願では有用である。
【００７０】
したがって、リボザイムは、事実上いかなるｍＲＮＡ配列でも開裂するように常用手順で設計され得、細胞は、制御可能で触媒的に有効な量のリボザイムが発現されるように、上記リボザイム配列をコードするＤＮＡにより常用手順で形質転換され得る。したがって、細胞における事実上いずれのＲＮＡ種の存在量でも、修飾または摂動され得る。
【００７１】
リボザイム配列は、アンチセンスヌクレオチドについて記載した方法と本質的に同様にして修飾され得、例えばリボザイム配列は修飾塩基部分を含み得る。
【００７２】
ＲＮＡアプタマーもまた、細胞へ導入されるかまたは細胞で発現されることにより、ＲＮＡ存在量または活性を修飾し得る。ＲＮＡアプタマーは、タンパク質に特異的なＲＮＡリガンド、例えばそれらの翻訳を特異的に阻害し得るＴａｔおよびＲｅｖ ＲＮＡ(Good et al.、１９９７、Gene Therapy ４：４５−５４)である。
【００７３】
遺伝子発現の遺伝子特異的阻害はまた、慣用的二本鎖ＲＮＡ技術を用いて達成され得る。上記技術に関する記載は国際公開第ＷＯ９９／３２６１９号に見出され得、これを出典明示で援用する。
【００７４】
本発明のアンチセンス分子、三重らせんＤＮＡ、ＲＮＡアプタマーおよびリボザイムは、核酸分子合成についての当業界で公知の方法により調製され得る。これらの例としては、オリゴヌクレオチドを化学合成する技術、例えば固相ホスホルアミダイト化学合成技術がある。別法として、ＲＮＡ分子は、本明細書で検討されているポリペプチドの遺伝子をコード化するＤＮＡ配列のインビトロおよびインビボ転写により生成され得る。上記ＤＮＡ配列は、適切なＲＮＡポリメラーゼプロモーター、例えばＴ７またはＳＰ６を伴う広く多様なベクターへ組込まれ得る。別法として、アンチセンスＲＮＡを構成的または誘導的に合成するｃＤＮＡ構築物が、セルライン、細胞または組織へ導入され得る。
【００７５】
ベクターは、多くの利用可能な手段により細胞または組織へ導入され得、インビボ、インビトロまたはエクスビボで使用され得る。エクスビボ治療については、ベクターを、患者から採取した幹細胞へ導入し、同じ患者へ戻されるオートロガス移植体用にクローン増殖させ得る。トランスフェクションおよびリポソーム注射による送達は、当業界で熟知されている方法を用いて達成され得る。
【００７６】
カテプシンＳの遺伝子発現の上記阻害方法に加えて、小分子または他の天然生成物を同定および使用することにより、限定されるわけではないが、カテプシンＳを含め本明細書で検討されているポリペプチドのインビボ転写を阻害し得ることが本発明では考えられる。例えば、当業者であれば、慣用的方法を用いてセルラインの培養培地からの試料に容易に適用され得るカテプシンＳについての検定法を確立し得るはずである。この検定法を用いて、セルラインをスクリーニングにかけることにより、カテプシンＳを発現するものが見出される。これらのセルラインは、ニューロンに由来すると思われ、例えば９６ウェルプレートで培養される。セルラインにおけるカテプシンＳの調節が脊髄神経節(ＤＲＧ)における発現に接近すると、セルラインにおけるカテプシンＳ発現の小分子修飾因子は同じくインビボＤＲＧにおいてもカテプシンＳを修飾するという可能性が高くなる。一次組織ＤＲＧ外植体およびセルラインに対する遺伝子発現の既知修飾因子、例えばデキサメタゾン、ホルボールエステル、熱ショックの影響を比較することにより、最も使用に適切なセルラインが選択され得る。その場合、スクリーンは、単に、各ウェルに加えられた異なる化合物と共に設定された長さの時間細胞を培養し、次いでカテプシンＳ活性／ｍＲＮＡレベルについて検定することにより構成される。
【００７７】
上記検定法においてカテプシンＳの検出を容易にするために、ルシフェラーゼまたは他の市販の蛍光タンパク質を、カテプシンＳのプロモーターへ適切なマーカータンパク質として遺伝子融合させ得る。カテプシンＳのＡＴＧの上流配列、すなわちカテプシンＳのプロモーターは、ＮＣＢＩゲノム配列に対するＢＬＡＳＴへＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＮＭ＿００４０７９からの配列を用いることによりゲノム配列データから同定され得る。これによって、未知塩基を全く含まないカテプシンＳのＡＴＧの少なくとも５ｋｂ上流が与えられる。ヒトゲノムＤＮＡからの２ｋｂまたはそれより長いフラグメントを増幅するための２対の内側ＰＣＲプライマーは、容易に設計および試験され得る。プロモーターフラグメントは、ヒト細胞での発現用に設計されたプロモーター非随伴リポーター遺伝子ベクター(例、クロンテックのプロモーター非随伴強化蛍光タンパク質ベクターｐＥＣＦＰ−１、ｐＥＧＦＰ−１またはｐＥＹＦＰ)へ容易に挿入され得る。その場合、スクリーンは、各ウェルに加えられた異なる化合物と共に適切な長さの時間細胞を培養し、次いでリポーター遺伝子活性について検定することにより構成される。次いで、以前に記載した慢性疼痛のインビボモデルを用いて、インビボカテプシンＳ活性および／またはｍＲＮＡレベルに対する影響について、有望な化合物を検定する。追加的方法の詳細、例えば適切な培養時間、培養条件、リポーター検定法およびカテプシンＳのインビボ転写の阻害に有用な小分子または他の天然生成物の同定に使用され得る他の方法は、当業者に熟知されている。
【００７８】
さらに、カテプシンＳのｃＤＮＡおよび／またはタンパク質を用いることにより、ＤＲＧまたは神経系における他の組織からのニューロンでカテプシンＳにより修飾される他のタンパク質、例えば受容体が同定され得る。かくして同定されたタンパク質は、慢性疼痛を処置するための薬剤のスクリーニングに使用され得る。カテプシンＳの下流であるこれらの遺伝子を同定するため、例えば、慣用的方法を用い、慢性疼痛モデルにおける動物を特異的カテプシン阻害剤で処置し、動物を殺し、ＤＲＧを摘出し、全ＲＮＡをこれらの細胞から単離し、標準マイクロアレイ検定技術を用いて対照動物(薬剤が全く投与されていない動物)に対して改変されているメッセージレベルを同定し得ることが考えられる。
【００７９】
カテプシンが慢性疼痛状態でアップレギュレーションされるという知識に基づき、慣用的インビトロまたはインビボ検定法を用いることにより、カテプシンＳの過剰発現に至る可能性のある遺伝子が同定され得る。かくして同定された遺伝子によりコード化されるこれらの関連調節性タンパク質を用いることにより、慢性疼痛処置についての強力な治療剤であり得る薬剤がスクリーニングされ得る。例えば、カテプシンＳのプロモーター領域をリポーター遺伝子の上流に置き、構築物を適切なニューロン細胞(例えば、神経芽細胞腫セルライン)へトランスフェクションし、慣用的技術を用い、リポーター遺伝子発現の検出によりカテプシンＳプロモーターの活性化を誘発する上流遺伝子について細胞を検定するという慣用的リポーター遺伝子検定法が使用され得る。
【００８０】
本発明では、慢性疼痛を処置する方法として、慣用的方法にしたがって、例えば、関連調節性タンパク質またはカテプシンＳにより修飾されるタンパク質に対する抗体を設計し、および／または上記タンパク質についての遺伝子にターゲッティングされた阻害性アンチセンスオリゴヌクレオチド、三重らせんＤＮＡ、リボザイムおよびＲＮＡアプタマーを設計することによりこれらのタンパク質についての遺伝子の機能および／または発現を阻害し得ることが考えられる。慢性疼痛処置用の上記阻害性物質を含む医薬組成物もまた考えられる。
【００８１】
慢性神経因性疼痛を含む慢性疼痛の処置および／または改善に有用な本明細書で開示されている医薬組成物は、上記疾患の徴候を処置または改善するために治療有効量で患者に投与されるべきである。治療有効量とは、例えば、McGill疼痛スコア(Melzack,R.Pain(１９７５)９月号、１(３)：２７７−２９９)の使用に基いた慢性疼痛の疼痛徴候の改善をもたらすのに十分な化合物の量をいう。
【００８２】
本発明の阻害性物質は、医薬組成物として投与され得る。本発明にしたがって使用される上記医薬組成物は、１種またはそれ以上の生理学的に許容される担体または賦形剤を用いる慣用的方法で処方され得る。
【００８３】
すなわち、化合物およびそれらの生理学的に許容される塩類および溶媒和物は、吸入法または注入法(口または鼻を通して)による投与または局所、経口、頬側(バッカル)、非経口または直腸投与用に処方され得る。
【００８４】
経口投与用の場合、医薬組成物は、例えば、医薬上許容される賦形剤、例えば結合剤(例、ゼラチン化前トウモロコシ澱粉、ポリビニルピロリドンまたはヒドロキシプロピルメチルセルロース)、充填剤(例、乳糖、微晶性セルロースまたはリン酸水素カルシウム)、滑沢剤(例、ステアリン酸マグネシウム、タルクまたはシリカ)、崩壊剤(例、ジャガイモ澱粉または澱粉グリコール酸ナトリウム)、または湿潤剤(例、ラウリル硫酸ナトリウム)を用いた慣用的手段により製造される錠剤またはカプセル剤の形態を取り得る。錠剤は、当業界で公知の方法によりコーティングされ得る。経口投与用液体調製物は、例えば、溶液、シロップまたは懸濁液の形態を取り得るか、またはそれらは水または他の適切な賦形剤による使用前構成用の乾燥調製物としての形態を取り得る。上記液体調製物は、医薬上許容される添加物、例えば懸濁剤(例、ソルビトールシロップ、セルロース誘導体または硬化食用油脂)、乳化剤(例、レシチンまたはアラビアゴム)、非水性賦形剤(例、落花生油、油性エステル、エチルアルコールまたは分画植物油)、および保存剤(例、メチルまたはプロピル−ｐ−ヒドロキシベンゾエートまたはソルビン酸)を用いた慣用的手段により製造され得る。調製物はまた、適切ならば緩衝塩類、風味改良、着色および甘味剤を含み得る。
【００８５】
経口投与用調製物は、適切には活性化合物の放出制御がなされるように処方され得る。
頬側投与の場合、組成物は、慣用的方法で処方される錠剤またはトローチ剤の形態を取り得る。
【００８６】
吸入による投与の場合、本発明にしたがって使用される化合物は、好都合には、適切な高圧ガス、例えばジクロロジフルオロメタン、トリクロロフルオロメタン、ジクロロテトラフルオロエタン、二酸化炭素または他の適切なガスの使用により、加圧パックまたはネブライザーから放出されるエアゾール噴霧形態で送達される。加圧エアゾールの場合、単位用量は、バルブを取り付けて計量された量を送達することにより決定され得る。吸入器または注入器で使用される例えばゼラチンでできたカプセルおよびカートリッジは、化合物および適切な粉末基剤、例えば乳糖または澱粉の粉末混合物を含むものとして処方され得る。
【００８７】
化合物は、注射による、例えばボーラス注射または連続注入による非経口投与用に処方され得る。注射用処方物は、単位用量形態、例えばアンプルまたは多用量容器形態を呈し得、保存剤が加えられ得る。組成物は、油性または水性賦形剤中の懸濁液、溶液またはエマルジョンといった形態を取り得、処方用薬剤、例えば懸濁、安定および／または分散剤を含み得る。別法として、有効成分は、使用前に適切な賦形剤、例えば滅菌発熱物質不含有水により構成される粉末形態であり得る。
【００８８】
化合物はまた、直腸組成物、例えば慣用的坐剤基剤、例えばカカオバターまたは他のグリセリドを含有する例えば坐剤または停留浣腸として処方され得る。
【００８９】
前記処方物に加えて、化合物はまた、デポー形調製物として処方され得る。かかる長時間作用処方物は、植込み(例えば皮下または筋肉内)により、または筋肉内注射により投与され得る。すなわち、例えば、化合物は、適切なポリマー性または疎水性材料(例えば許容される油中のエマルジョンとして)またはイオン交換樹脂により、または難溶解性誘導体、例えば難溶解性塩として処方され得る。
【００９０】
組成物は、所望ならば、有効成分を含有する１個またはそれ以上の単位用量形態を含み得るパックまたはディスペンサー装置で提供され得る。パックは、例えば金属またはプラスチックホイル、例えばブリスターパックを含み得る。パックまたはディスペンサー装置には、投与に関する使用説明書が添付され得る。
【００９１】
本発明での使用に適切な医薬組成物には、有効成分が意図された目的の達成に有効な量で含有されている組成物が含まれる。有効量の決定は、当業者であれば十分行えることである。
【００９２】
いずれの化合物についても、治療有効量は、例えば新生物細胞の細胞培養検定法、または動物モデル、通常はマウス、ウサギ、イヌまたはブタにおいて最初に評価され得る。動物モデルはまた、適切な濃度範囲および投与経路を決定するのにも使用され得る。ＩＣ５０(すなわち、徴候の半最大阻害を達成する試験化合物の濃度)を含む循環血漿濃度範囲を達成する用量が、動物モデルにおいて処方され得る。次いで、上記情報を用いることにより、ヒトにおける有用な用量および投与経路が決定され得る。
【００９３】
治療有効量とは、慢性疼痛の病的作用を処置および／または改善するのに有用な、有効成分、例えばカテプシンＳ遺伝子発現を阻害するように設計された化合物Ａまたは化合物Ｂ、アンチセンスヌクレオチド、三重らせんＤＮＡ、リボザイム、ＲＮＡアプタマーおよび二本鎖ＲＮＡ、カテプシンＳまたは関連調節性タンパク質に対する抗体またはそのフラグメントの量をいう。治療有効性および毒性は、細胞培養物または実験動物において標準的医薬手順により測定され得、例えばＥＤ５０(集団の５０％で治療上有効な用量)およびＬＤ５０(集団の５０％についての致死用量)がある。毒性作用および治療効果間の用量比は治療指数であり、それはＬＤ５０／ＥＤ５０比として表され得る。大きな治療指数を呈する医薬組成物が好ましい。細胞培養検定法および動物試験から得られたデータは、ヒトで使用する場合の用量範囲を処方するのに使用される。上記組成物に含まれる用量は、好ましくは毒性をほとんどまたは全く伴わず、ＥＤ５０を含む循環濃度の範囲内である。用量は、使用される用量形態、患者の感受性、および投与経路によりこの範囲内で変化する。
【００９４】
正確な用量は、処置を必要とする対象に関する因子を考慮して開業医により決定される。十分なレベルの活性部分を提供するかまたは所望の効果を維持できるように、用量および投与を調節する。考慮され得る因子としては、病状の重さ、対象の全般的健康状態、対象の年齢、体重および性別、食餌療法、投与時間および頻度、薬剤の組み合わせ(複数も可)、反応感受性、および治療に対する耐容性／応答性がある。長時間作用医薬組成物は、特定処方物の半減期およびクリアランス速度により３〜４日ごと、１週間ごと、または２週間ごとに１回投与され得る。
【００９５】
通常の投与量は、投与経路によって、総量約１ｇ以下、０.１〜１０００００マイクログラムの範囲で変わり得る。特定用量および送達方法に関するガイダンスは、文献に提供されており、一般的に当業者に入手できるものである。当業者は、タンパク質またはそれらの阻害剤の場合とは異なるヌクレオチドについての処方物を採用する。同様に、ポリヌクレオチドまたはポリペプチドの送達は、特定細胞、条件、場所などに対して特異的である。タンパク質の経口投与に適切な医薬処方物は、例えば米国特許第５００８１１４、５５０５９６２、５６４１５１５、５６８１８１１、５７００４８６、５７６６６３３、５７９２４５１、５８５３７４８、５９７２３８７、５９７６５６９および６０５１５６１号に記載されている。
【００９６】
以下、実施例により本発明についてさらに説明するが、本発明を限定する意図はないものする。
【実施例】
【００９７】
実施例１
慢性疼痛の動物モデルにおけるカテプシンＳのＲＮＡ単離および発現プロファイリング
慢性疼痛のインビボ動物モデルには、以下のものが含まれる：
慢性炎症性疼痛モデル：
完全フロイントアジュバント誘発機械的痛覚過敏を、慢性炎症性疼痛のモデルとして使用し得る(Stein,C.et al. Pharmacol.Biochem.Behav.(１９８８)３１：４４５−４５１)。このモデルにおいて、典型的には雄スプラーグ‐ドーリーまたはウィスターラット(２００〜２５０ｇ)に対し、一方の後肢に２５μｌ完全フロイントアジュバントの足底内注射をする。著しい炎症がこの後肢で起こる。炎症性障害の２４時間後、機械的痛覚過敏が十分に確立されたと考えられる時点で、効力を評価するため薬剤を全身投与する。
【００９８】
慢性神経因性疼痛モデル：
何らかの形態の末梢神経損傷を伴う慢性神経因性疼痛の２動物モデルが使用され得る。Seltzerモデル(Seltzer et al.(１９９０)Pain ４３：２０５−２１８)では、ラットに麻酔をかけ、片方の大腿部(通常左)までの中ほどを小さく切開して、坐骨神経を露出させる。後方二頭筋半腱様神経が総坐骨神経から枝分かれする地点に対しちょうど遠位にある転子付近の部位における周囲結合組織から注意深く神経を取り除く。３／８曲線状逆切断(reversed-cutting)小針で７−０絹縫糸を神経に挿入し、神経の厚みの背側１／３〜１／２が結紮糸内で保持されるように堅く結紮する。筋肉および皮膚を縫合糸およびクリップで閉じ、創傷に抗生物質粉末を振り掛ける。シャム(sham、偽手術)動物では、坐骨神経を暴露させるが、結紮はせず、非シャム動物の場合と同様に創傷を閉じる。
【００９９】
慢性緊縛(ＣＣＩ)モデル(Bennett,G.J.およびXie,Y.K. Pain(１９８８)３３：８７−１０７)では、ラットに麻酔をかけ、片方の大腿部(通常左)までの中ほどを小さく切開して、坐骨神経を露出させる。周囲結合組織から神経を取り除き、４／０クロムガットの４本の結紮糸を各々約１ｍｍあけて神経の周囲を緩く縛ることにより、結紮糸が辛うじて神経表面を圧迫するようにする。上記と同様に創傷を縫合糸およびクリップで閉じる。シャム動物では、坐骨神経を暴露させるが、結紮はせず、非シャム動物の場合と同様に創傷を閉じる。
【０１００】
SeltzerおよびＣＣＩモデルとは対照的に、Chungモデルは脊髄神経の結紮を含む(Kim,S.O.およびChung,J.M. Pain(１９９２)：５０：３５５−３６３)。このモデルでは、ラットに麻酔をかけ、うつ伏せにして置き、Ｌ４−Ｓ２レベルで脊椎の左を切開する。傍脊椎筋肉を通して深い切れ込みを入れ、Ｌ４−Ｓ２レベルで棘状突起から筋肉を分離すると、坐骨神経の一部が現れ、それは枝分かれしてＬ４、Ｌ５またはＬ６脊髄神経を形成している。Ｌ６横突起を注意深く小骨鉗子で取り出し、これらの脊髄神経が見えるようにする。Ｌ５神経を単離し、７−０絹糸で固く結紮する。創傷を単一筋肉結紮(６−０絹)および１または２個の皮膚閉鎖クリップで閉じ、抗生物質粉末を振り掛ける。シャム動物では、Ｌ５神経を暴露させるが、結紮はせず、前記と同様に創傷を閉じる。
【０１０１】
行動指数
全慢性疼痛モデル(炎症性および神経因性)において、無痛覚計(ウゴ−バシーレ、ミラノ)を用いて増圧的刺激に対する両後肢の逃避閾値を測定することにより機械的痛覚過敏を評価する。両後肢の足底表面にフライ毛で適用した非有害性機械的刺激に対する逃避閾値を測定することにより、機械的異痛を評価する。各後肢の下側に適用した非有害性熱刺激に対する逃避潜伏期間を測定することにより、熱痛覚過敏を評価する。全モデルとも、機械的痛覚過敏および異痛および熱痛覚過敏は、術後１〜３日以内に現れ、少なくとも５０日間持続する。本明細書記載の検定法においては、薬剤を術前および術後に適用することにより痛覚過敏の発現に対するそれらの効果を評価し、特に手術の約１４日後、確立された痛覚過敏を除去するそれらの能力が測定され得る。
【０１０２】
痛覚過敏の除去パーセントは、以下の要領で計算される：
除去％＝{(投与後閾値−投与前閾値)／(無経験閾値−投与前閾値)}×１００
【０１０３】
本明細書に開示されている実験では、ウィスターラット(雄)を上記疼痛モデルで使用する。ラットは手術時点で約１２０〜１４０グラムの重さである。エンフルラン／Ｏ２吸入麻酔下で全手術を遂行する。全ての場合において、術後に創傷を閉じ、動物を回復させる。使用された全疼痛モデルにおいて、数日後偽手術動物以外は全て、著しい機械的および熱痛覚過敏および異痛を発現し、その結果、疼痛閾値の低下が生じ、接触、加圧または熱刺激に対する後肢の反射逃避応答の高まりが見られる。術後、動物はまた罹患した足に特徴的な変化を呈する。動物の大多数において、罹患した後肢のつま先は縮こまり、足は一方へ僅かにそれている。中には、つま先が下へねじ曲げられているラットもいる。結紮されたラットの歩き方は変化しているが、びっこは稀である。中には、罹患した後肢をケージの床から上げ、支えたとき後肢の異常な硬直伸展を示すラットも見られる。ラットは接触に対し非常に敏感になる傾向があり、声を出し得る。他の点では、ラットの全般的健康状態は良好である。
【０１０４】
慢性神経因性疼痛モデルにされたラットから摘出したＤＲＧからのＲＮＡ抽出(Selzer、ＣＣＩおよびChung)：
神経損傷と同側のＬ４およびＬ５ ＤＲＧを、標準的方法にしたがって神経因性疼痛のラットモデルから手術の１４、２１および５０日後に切開する。次いで、酸性グアニジニウムチオシアネート−フェノール−クロロホルム抽出方法(ChomczynskiおよびSacchi Anal.Biochem.、(１９８７)１６２：１５６−１５９；Chomczynski,P.、Biotechniques、１５：５３２−５３７(１９９３))にしたがって、全ＲＮＡ試料を切開したＤＲＧ組織から調製する。収率は、１ＤＲＧにつき約１μｇの総ＲＮＡである。逆転写(プライマー：T7prFB 5'-aaacgacggcacttcgaaattaatacgactcactatagggagacc.t30-3')および総ＲＮＡ試料からのビオチン標識プローブの調製は、慣用的方法にしたがって実施される(Lockhart DJ et al. Nat Biotechnol.１４：１６７５−８０(１９９６)；Mahadevappa M、Warrington JA.、Nat Biotechnol. １７：１１３４−６(１９９９))。５μｇの総ＲＮＡは、おおよその収率１５〜３５μｇの標識ビオチンＲＮＡである。各標識ＲＮＡを、標準方法を用いて２つのアフィメトリックス・ラットＵ３４Ａジーンチップにハイブリダイズさせる。次いで、アフィメトリックス・ジーンチップソフトウェアを用いて画像を分析することにより、ＲＮＡ発現レベルの測定値として正規化平均差異数値が得られる(アフィメトリックス、サンタクララ、カリフォルニア)。テキストファイルとしてデータをエクスポート後、データを分析する。
【０１０５】
表１は、アフィメトリックスＲＮＡプロファイリング実験から任意単位で(()内に標準偏差を付す)測定されたカテプシンＳの相対ｍＲＮＡレベルを要約している(Ｎ.Ｄ.：測定されず)。データは、カテプシンＳメッセンジャーＲＮＡが、ＣＣＩモデルでは１４および２１日目およびSeltzerモデルでは１４、２１および５０日目にシャム均等物に対してアップレギュレーションされることを示す。これらの時点は、神経因性痛覚過敏が十分に確率さえ、永続的であるときの条件を反映している。
【０１０６】
表１
カテプシンＳ ｍＲＮＡは、慢性神経因性疼痛の動物モデルにおいてアップレギュレーションされる。
【表１】
【０１０７】
カテプシンＳは、ヒトＤＲＧで発現される：
ヒトカテプシンＳ配列(Ｇｅｎｂａｎｋ受入番号ＮＭ００４０７９)を用いて、正規化ヒトＤＲＧ ｃＤＮＡライブラリー(ギブコＢＲＬ、ロックビル、メリーランド、米国)からの６００００クローンを配列決定することにより構築された専有配列データベースを検索した。２つのクローン、fga0000208999 および fga00000206288は、ＮＭ００４０７９と同一の配列を有する。したがって、カテプシンＳはまたヒトＤＲＧで発現されるという結論に達し得る。しかしながら、カテプシンＳがヒトＤＲＧで発現されることを確認するため、リアルタイムＰＣＲを以下の手順にしたがって遂行する。
【０１０８】
ＧｅｎｂａｎｋからのヒトカテプシンＳ遺伝子の配列(受入番号ＮＭ００４０７９)に基いて、リアルタイムＰＣＲ用の２対のプライマーを設計する。
【表２】
【０１０９】
オリゴヌクレオチドをシグマ−ジェノシス(ザ・ウッドランズ、テキサス)により製造する。正常ヒトＤＲＧからの総ＲＮＡを、ジーンウィズ・インコーポレイテッド(ニューヨーク、ニューヨーク)から入手する。総ＲＮＡからのｃＤＮＡの合成は、ＰＥアプライド・バイオシステムズ(フォスターシティー、カリフォルニア)からのＴａｑＭａｎ逆転写試薬キット(パート番号Ｎ８０８−０２３４)を用いて製造業者のプロトコルに従って遂行される。各１００μｌ反応物は、２μｇの総ＲＮＡ、１×ＴａｑＭａｎＲＴ緩衝液、５.５ｍＭのＭｇＣｌ２、５００μＭの各ｄＮＴＰ、２.５μＭのランダム６量体、０.４Ｕ／μＬのリボヌクレアーゼ阻害剤、および１.２５Ｕ／μＬのＭｕｌｔｉＳｃｒｉｂｅ逆転写酵素を含む。反応物を２５℃で１０分間、４８℃で４５分間、次いで７５℃で５分間インキュベーションする。
【０１１０】
ＰＥアプライド・バイオシステムズ(フォスターシティー、カリフォルニア)からのＳＹＢＲグリーンＰＣＲコア試薬キット(パート番号４３０４８８６)を用い、製造業者のプロトコルに従って定量的ＰＣＲを遂行する。ＰＥアプライド・バイオシステムズからのＡＢＩ Ｐｒｉｓｍ７７００配列検出システムを用いて、インキュベーションおよび検出を行う。各５０μＬ反応物は、上記逆転写反応からの鋳型ｃＤＮＡ５μＬ、１×ＳＹＢＲグリーンＰＣＲ緩衝液、３ｍＭのＭｇＣｌ２、２００μＭのｄＡＴＰ、２００μＭのｄＣＴＰ、２００μＭのｄＧＴＰ、４００μＭのｄＵＴＰ、０.０２５Ｕ／μＬのＡｍｐｌｉＴａｑ Ｇｏｌｄ、０.０１Ｕ／μＬのＡｍｐＥｒａｓｅ ＵＮＧ、および５０ｎＭの各前進および逆プライマーを含む。反応物を５０℃で２分間、９５℃で１０分間、次いで４０サイクルの９５℃で１５秒間および６０℃で１分間によりインキュベーションする。
【０１１１】
転写物を両プライマー対により少なくとも７.８サイクル検出できるように増幅した後、転写物は「逆転写酵素無し」対照で検出される。
【表３】
【０１１２】
ＰＣＲ増幅生成物を、慣用的方法にしたがってアクリルアミドゲルで分析する。両「＋逆転写酵素」反応により、予想通り１０１ｂｐ長である単一バンドが生じた。これらのデータは、カテプシンＳがヒトＤＲＧで検出できるように発現されることを確認している。
【０１１３】
実施例２
慢性疼痛の動物モデルにおけるカテプシン阻害剤の治療効果：化合物Ｂ
カテプシンＳが慢性神経因性疼痛の動物モデルでアップレギュレーションされることを示すデータに基づき、インビトロでカテプシンＳを含むシステインおよびセリンプロテアーゼを阻害することが知られている(米国特許第４５１８５２８号)、上記要領で製造された３−[(４−モルホリニルカルボニル)−フェニルアラニルアミド]−１−フルオロ−５−フェニル−２−ペンタノン(化合物Ｂ)の能力を、慢性疼痛モデルにおいて誘発された病的作用を除去するその能力について試験した。
【０１１４】
上記ＣＣＩ慢性疼痛モデルにしたがって、ラットを外科的処理にかけた。手術前、痛覚過敏が確立された１４日後、次いで化合物Ｂの単一経口胃管栄養量投与の１、３および６時間後に足の逃避閾値を測定する。結果を下記表２に示す。各時点は、１群につき６動物から得られたデータを表す。賦形剤対照：ＰＥＧ／メチルセルロース(０.５％)＋トウィーン８０(０.２５％)(２０：８０)、１ｍｌ(経口)。
【０１１５】
表２
慢性神経因性疼痛のＣＣＩモデルにおいて確立された機械的痛覚過敏に対する化合物Ｂの効果：単一１日経口用量
投与前痛覚過敏の除去％
【表４】
【０１１６】
本明細書に開示されているデータは、化合物Ｂが、投与後１時間で、３０〜１００ｍｇ／ｋｇの範囲におけるＤ５０で用量依存的に神経因性疼痛のＣＣＩモデルにおいて誘発された機械的痛覚過敏を除去し得、１００ｍｇ／ｋｇで７０％までの除去％を呈することを示す。追加試験によると、化合物Ｂはまた、痛覚過敏モデルの発現中終始１日２回、３０ｍｇ／ｋｇの経口投与でＣＣＩモデルにおける機械的痛覚過敏の除去に急速な有効性を呈することが示されている(表３)。１日２回試験では、術前、次いで毎日化合物Ｂによる第２経口投与の３時間後に、足の逃避閾値を測定した。最終用量は、１３日目に投与された。表３における各時点は、１群につき６動物からのデータを表す。賦形剤対照：ＰＥＧ／メチルセルロース(０.５％)＋トウィーン８０(０.２５％)(２０：８０)、１ｍｌ(経口)。
【０１１７】
興味深いことに、１５日目についてのデータは、このシステインカテプシン阻害剤による処置を終結後に痛覚過敏が再発することを示していることから、阻害剤は痛覚過敏の発現に影響しないことが示唆される。
【０１１８】
表３
慢性神経因性疼痛のＣＣＩモデルにおいて確立された機械的痛覚過敏に対する化合物Ｂの効果：１日２回経口投与
【表５】
【０１１９】
試験はまた、化合物Ｂが、慢性炎症性疼痛のＦＣＡ誘導モデルにおけるラットで誘発された機械的痛覚過敏を誘導の２４時間後に除去するが、慢性神経因性モデルで見られるよりは除去の度合が劣る(１００ｍｇ／ｋｇ経口で最大除去４６％、データは示さず)ことを示している。カテプシンＳ ｍＲＮＡレベルは、慢性炎症性疼痛モデルでは検定されていないが、慢性炎症性疼痛モデルにおけるカテプシンＳ阻害剤の効力は、カテプシンＳ阻害剤、例えば本明細書開示のものが、慢性炎症性疼痛の処置および／または改善に有効な治療剤であることを示している。
【０１２０】
化合物ＢがカテプシンＳ、ＫまたはＬの１種またはそれ以上に作用していることはあり得るが、カテプシンＫおよびＬ阻害剤による試験は、これらの特定タイプのカテプシン阻害剤が慢性疼痛の動物モデルで誘発された痛覚過敏の除去に有効ではないことを示しているため(我々の未公開データ)、慢性疼痛モデルにおいて痛覚過敏を低減化するその能力は、おそらくそのカテプシンＳ活性を阻害する能力によるものと思われる。すなわち、化合物Ｂを含む医薬組成物を使用することにより、慢性疼痛が処置され得る。
【０１２１】
実施例３
慢性疼痛の動物モデルにおけるカテプシンＳ阻害剤の治療効果：化合物Ａ
慢性疼痛モデルで誘発された病的作用の除去に対する別の混合カテプシン阻害剤、化合物Ａまたは[７−(２,２−ジメチル−プロピル)−６−チオフェン−２−イルメチル−７.Ｈ.−ピロロ[２,３−.ｄ.]ピリミジン−２−カルボニトリル]の能力についても試験した。慢性神経因性疼痛のSeltzerモデルから得られたデータは、この化合物が、３〜１０ｍｇ／ｋｇ間のＤ５０で痛覚過敏を除去し得ることを示している(表４)。
【０１２２】
表４
慢性神経因性疼痛のSeltzerモデルにおいて確立された機械的痛覚過敏に対する化合物Ａの効果：単一経口用量
【表６】
【０１２３】
上記と同様、この実験におけるラットを、ＣＣＩ慢性疼痛モデルにしたがって外科的処置にかける。術前、痛覚過敏が確立された14日後、次いで化合物Ａによる単一経口投与後に、足の逃避閾値を測定する。各時点は、１群につき６動物から得られたデータを表す。賦形剤対照：ＰＥＧ／メチルセルロース(０.５％)＋トウィーン８０(０.２５％)(２０：８０)、１ｍｌ(経口)。
【０１２４】
化合物Ａは、混合カテプシンＳ／Ｋ阻害活性を有する。データは、特異的カテプシンＫ阻害剤並びにカテプシンＫおよびＬに対する阻害作用をもつ化合物が両方とも神経因性疼痛モデルにおいて痛覚過敏を除去し得ないこと(我々の未公開データ)を示しているため、化合物Ａによる強力な痛覚過敏除去効果は、カテプシンＳの阻害によるものであり、すなわちこの酵素が慢性神経因性疼痛および慢性炎症性疼痛についての治療標的であることを証明している。
【０１２５】
実施例４
酵素活性のインビトロ検定法
上記で検討したところによると、慢性疼痛に対する潜在的治療有用性をもつ化合物を同定するため、カテプシンＳ活性に対する効果が未知である候補化合物をまず検定にかけることにより、この酵素の活性に対する効果が測定され得る。カテプシンＳ酵素活性については、慣用的方法、例えば蛍光および他の基質を用いた多くのスクリーニング方法がある。下記検定法は、クエンチングされた蛍光ペプチド基質を用いる均一プレート検定法である。酵素によるペプチドの開裂により、蛍光生成物が生じる。蛍光発生の阻害は、酵素の不活性、すなわち化合物の効力を示すものである。
【０１２６】
酵素は、慣用的方法にしたがってバクロウイルスまたは酵母で発現され、精製され、休眠形態(３.８μＭ)で冷凍貯蔵された組換えヒトカテプシンＳ(ノヴァリティス・ファーマシューティカルズ・コーポレーション、サミット、ニュージャージー)である。
【０１２７】
検定当日、酵素を検定緩衝液(８８ｍＭのＫＨ２ＰＯ４、１２ｍＭのＮａ２ＨＰＯ４、１.３３ｍＭのＥＤＴＡ、２.７ｍＭのＤＴＴ、０.０３％のブリージ、ｐＨ５.８)中での１：６００希釈により活性化し、次いで氷上で３０分インキュベーションする。活性化された酵素を１６００ｐＭで直接使用する。Ｚ−ｖａｌ−ｖａｌ−ａｒｇ−ＡＭＣ(５０ｍｇ、ベイケム、キングオブプルージア、ペンシルベニア、Ｉ−１５４０)、カテプシンＳ基質を、１２.６ｍｌのＤＭＳＯに溶かして、６ｍＭの最終濃度とする。次いで、これを検定緩衝液で希釈することにより、１５０μＭの最終濃度とする。検定プレートへ加える時点で基質は最終１：４希釈で存在する。使用される基質の濃度は、酵素についてのＫＭより２〜５倍高いことに基いている。
【０１２８】
試験化合物ストック、ＤＭＳＯ中の５０または１０ｍＭを、１ｍＭ作業溶液用にＤＭＳＯ中でそれぞれ１：５０または１：１０に希釈する(または試験すべき化合物によっては検定緩衝液で必要に応じて希釈することにより、作業溶液を生成する)。
【０１２９】
これらの成分を以下の順序で加えることにより検定を室温で実施する：
１)試験化合物：１００μｌの作業溶液
２)基質：５０μｌの作業溶液
３)酵素：５０μｌの作業溶液
内部対照基準化合物(すなわち、既知カテプシンＳ阻害剤)を各プレートで使用する。
【０１３０】
全試薬を検定プレートに加えた後、プレート(黒色９６ウェル、コスター(登録商標)、コーニング・インコーポレイテッド、コーニング、ニューヨーク)を、慣用的方法にしたがって、λｅｘ３４０およびλｅｍ４００で、蛍光プレート読取装置(フレックスステーション、モレキュラー・ディヴァイシーズ・コーポレーション、サニーベール、カリフォルニア)で読み取る。データを５分ごとに６０分間までの間集める。１セットのデータのみ、試験化合物の阻害パーセントまたはＩＣ５０の計算に使用する。これは、予測されるＩＣ５０に最も近い内部対照標準を含むデータセットに基いて選択される。これは、典型的には１５〜２０分の間である。内部対照基準が平均値の２ＳＤの上または下である場合、得られたデータは、化合物阻害受容力の計算には使用されない。
【０１３１】
このプレート方法は、高スループットスクリーニングに理想的に適している。この検定法はＤＭＳＯに対し感受性があることに注意すべきである。すなわち、基質および試験化合物の製造において、最終検定混合物中で使用されるＤＭＳＯは厳密に３％未満とすべきである。
【０１３２】
実施例５
カテプシンＳに対するアンチセンスオリゴヌクレオチド
カテプシンＳの発現を含む遺伝子発現の阻害に有用なアンチセンスオリゴヌクレオチド(ＡＳＯ)は、慣用的方法にしたがって調製され得る。さらに、例えば以下の追加的方法も使用され得る。
【０１３３】
ＡＳＯの合成：
カテプシンＳに対するＡＳＯは、ＭＯＥ(メトキシエトキシ)基で両端が修飾されたヌクレオチドによる完全チオリン酸化または完全ホスホジエステル１８量体であり得る。これらは、ホスホルアミダイト化学作用を用いて合成され、ＨＰＬＣ精製され、慣用的方法によるエレクトロスプレー質量分析法および毛管ゲル電気泳動法により特性検定され得る。各々ＧＣ含有率が３８と７２％の間であるＡＳＯを選択し、例えばラットまたはヒトカテプシンＳのコーディング領域の一部と相補的であるように合成し得る。誤対合含有対照オリゴヌクレオチドの場合、対合オリゴヌクレオチドの適切な塩基組成が維持され得る。さらに、２つの対照ＡＳＯ、例えばラットＧＡＰＤＨコーディング領域についてのＡＳＯおよび第２ランダム合成ＡＳＯが選択され得る。抗ラット−ＧＡＰＤＨオリゴヌクレオチドのフォーマットは、抗カテプシンＳオリゴヌクレオチドの場合と同じであり得る。合成オリゴヌクレオチドは、中間にチオリン酸またはホスホジエステルＤＮＡ残基をもつ配列の両端にそのＭＯＥリボヌクレオチド修飾を有し得る。
【０１３４】
トランスフェクションプロトコル
トランスフェクションの２４時間前、１ウェル当たり２ｍｌの量(Ｆ１２栄養素混合物(ＤＭＥＭ)、１００単位／ミリリットルのペニシリン、１ミリリットルにつき１００マイクログラムのストレプトマイシン、２ミリモルのＬ−グルタミン、１０％の胎児ウシ血清(ギブコ−ＢＲＬ、ロックビル、メリーランド))で２×１０５細胞、例えばチャイニーズ・ハムスター卵巣細胞(ＩＣＮファーマシューティカルズ・リミテッド、ベイシングストーク、ハンプシャー、英国)を、６ウェルプレートへ平板培養し、５％ＣＯ２中で培養して培養飽和密度の７０〜８０％に到達させ得る。トランスフェクション当日、リポフェクチン(登録商標)を血清不含有ＯｐｔｉＭＥＭ(ギブコ−ＢＲＬ、ロックビル、メリーランド)へ希釈し(１ｍｌのＯｐｔｉＭＥＭ中へ１００ｎＭの所望の最終オリゴヌクレオチド濃度につきリポフェクチン(登録商標)３マイクロリットル)、室温で１５分間インキュベーションすることにより、２倍ストックトランスフェクション溶液を調製する。次いで、この溶液を、ＯｐｔｉＭＥＭ中に所望の最終量のＡＳＯを２倍含む２倍ＡＳＯ溶液と１：１で合わせる。トランスフェクション混合物を室温で１５分間インキュベーションしてトランスフェクション複合体を形成させた後、細胞の予め吸引されたウェルの各々に２ｍｌを加える。リポフェクチン(登録商標)試薬のみの対照および正常細胞対照(未処理)もまた含まれ得る。３７℃で４時間インキュベーション後、ＭＥＭ(ギブコ−ＢＲＬ)中における５０％ＦＢＳ ５００マイクロリットルを各ウェルに加え、最終ＦＢＳ濃度を１０％にする。次いで、培養物を、ｍＲＮＡ採取の場合２４時間またはタンパク質採取および電気生理現象については４８時間５％ＣＯ２による加湿インキュベーター中３７℃でインキュベーションする。
【０１３５】
リアルタイム定量的ＰＣＲ ｍＲＮＡ分析：
全ＲＮＡをＲＮｅａｓｙ９６キット(キアゲン、ＧｍＢＨ、ドイツ国)により製造業者のプロトコルに従って単離し得る。ＲＮＡ試料を個々に１ｎｇ／Ｌに希釈する。次いで、各試料につき５ナノグラムのＲＮＡを、遺伝子特異的検出プライマー(当業者により容易に決定される)およびリアルタイム定量的ＰＣＲ反応キットＰＬＡＴＩＮＵＭ(登録商標)定量的ＲＴ−ＰＣＲ ＴＨＥＲＭＯＳＣＲＩＰＴ(登録商標)１段階システム(ギブコ−ＢＲＬ、ロックビル、メリーランド)からの適切な試薬と混合し、製造業者のプロトコルに従って実施する。適切な配列をもつラットカテプシンＳプライマーは、ＰＥバイオシステムズから購入され得る。ＧＡＰＤＨは、比較用の対照遺伝子として選択され得る。同じＲＮＡ試料を、ＴａｑＭａｎ(登録商標)げっ歯類ＧＡＰＤＨ対照試薬キット(ＰＥバイオシステムズ)からのラットＧＡＰＤＨプライマーにより実施し得る。配列特異的蛍光発生シグナルは、ＡＢＩ ＰＲＩＳＭ(登録商標)７７００配列検出装置(ＰＥアプライド・バイオシステムズ、フォスターシティー、カリフォルニア)を用いて検出され得る。試料と一緒に、純粋な鋳型ｍＲＮＡの希釈液からの標準について実施することにより、総ＲＮＡの挿入量に対する絶対濃度を得る。
【０１３６】
神経因性疼痛の動物モデルにおけるカテプシンＳアンチセンスの試験：
ラット(例、ウィスター)において、慣用的方法にしたがってミニポンプデリバリーシステムに取り付けられたカテーテルで脊髄の腰部または胸部領域にカニューレを鞘内挿入し得る。アンチセンス、ミスセンス、オリゴまたは賦形剤を所望の濃度で７日までの間送達することにより、脊髄および脊髄神経節内の細胞体にオリゴまたは賦形剤を取込ませ得る。神経損傷は、本明細書記載の疼痛モデルにしたがってカニューレ挿入の前または後に実施され得る。機械的痛覚過敏、異痛などを通常方法で測定することにより、痛覚過敏の除去におけるカテプシンＳアンチセンスオリゴヌクレオチドの効果が評価され得る。
発明の背景
疼痛は、一連の臨床状態を包含する語である。正常条件下における急な痛みは、潜在的組織損傷状況についての生理学的警告としてある一定の役割を果たし、有益なものである。また、通常炎症に伴うさらに持続的な疼痛は、軽い組織損傷に対する正常な防御応答としてみなされ得、創傷治癒時には消散する。しかしながら、刺激因子および疼痛に関連性が無く、疼痛がもはや防御機構でなくなったとき、慢性疼痛が起こる。これらのタイプの疼痛症候群(例、慣性関節リウマチ、癌性疼痛、神経因性疼痛)は、処置困難であることが知られている。成人集団の１０〜２０％が慢性疼痛に苦しんでいると推定される。現在までのところ、使用されている主たる鎮痛薬は、オピエートおよび非ステロイド系抗炎症剤(ＮＳＡＩＤＳ)に基くもので例えばアスピリンがある。両種類の薬剤とも深刻な副作用をもたらし得る。ＮＳＡＩＤＳは胃潰瘍および腎損傷を誘発し得、オピエートは、悪心、便秘、錯乱および依存症問題を誘発し得る。これらの不利な点にもかかわらず、最近になっても新たな種類の鎮痛薬は発見も開発もされていない。慢性疼痛につての追加的治療法が明らかに要望されている。
【０００２】
慢性疼痛状態は、若干の臨床的徴候を特徴とする。突発的疼痛の場合と同様、患者は、痛覚過敏(有害な機械的、高温または低温刺激因子に対する非常に誇張された応答)および異痛症(以前には非有害性であった刺激因子が現在は苦痛として感じられる)を呈し得る。これらの特徴は全て、末梢神経系における知覚神経の機能および脊髄および脳における知覚情報処理の変化を含む複雑な一連の事象から生じる。これらの変化は、直接ニューロン損傷に応じて、または組織損傷または炎症中に放出される伝達物質に応じて生じる。
【０００３】
概して、慢性疼痛症候群は、炎症性(侵害受容性としても知られている)または神経因性として定義され得る。慢性炎症性疼痛は、その名が示す通り、根元的炎症、例えば慢性関節リウマチ、火傷、筋肉損傷または外科的創傷が存在している状態の間に起こる。炎症性疼痛の根底にある機構に関する知識には近年かなり進歩が見られ、様々な伝達物質および知覚神経の末梢系末端のそれらの活性化および感作およびその結果として生じる脊髄ニューロンの反応性における長期変化を含むことが知られている。
【０００４】
慢性神経因性疼痛は、神経系の一次病変または機能不全が存在する場合に誘発され、例えば、三叉神経痛、糖尿病性神経障害、ヘルペス後神経痛、切断術または物理的神経損傷といった状態の間に起こる。慢性神経因性疼痛は、外傷、例えば糖尿病、帯状疱疹または末期癌(下記参照)といった病気または化学的損傷(例、ある種の抗ＨＩＶ薬剤)による神経への損傷から生じる。それはまた、切断術(乳房切断を含む)後に発生し得、腰痛に関与する場合もある。慢性神経因性疼痛の機構についてはあまり理解されていないが、ある種のイオンチャンネルの新規発現に起因する知覚神経の自然発火、脊髄の種々の層への知覚神経線維の発出、および知覚神経および脊髄における様々な神経伝達物質および受容体の発現の変化を含むと考えられている。伝統的な慢性神経因性疼痛は、頑性であることが判明しており、標準的な非ステロイド系およびオピエート鎮痛薬に耐性がある。したがって、このタイプの疼痛を処置するためのまだ検討されていない新規鎮痛薬が明らかに臨床的に要望されている。
【０００５】
癌性疼痛は、最も一般的な慢性疼痛症候群(おそらくは炎症性および神経因性成分を伴う)である。進行癌患者の３分の１は、特に胸部、前立腺および肺癌において骨格転移を発症することが推定される。一般的に転移性骨疾患は、通常離散した領域に位置する骨の疼痛をまねき、刺すような不快な症状の発現を伴い、疼き、焼けるようで、強い倦怠感を伴う感覚として報告される。骨癌疼痛に関与する機構は未知であるが、おそらくは構造上の損傷、骨膜刺激および神経絞扼を含むものと思われる。正常な骨代謝の破壊および炎症性プロスタグランジンおよびサイトカインの生成についての証拠が存在する。骨癌疼痛の現行処置は依然オピエートによるものであるが、必要とされる用量では許容できない副作用が誘発されるため、患者の少なくとも２０％は依然として疼痛が制御されていないままである。これらの患者の生活の質を最適にする、耐容性良好で有効な新規鎮痛薬が望まれる(Coleman RE(１９９７)Cancer ８０；１５８８−１５９４)。
【０００６】
変形性関節症の疼痛は、人々が一般開業医を受診することになる慢性神経因性疼痛の最もありふれた形態(おそらくは炎症性および神経因性成分を伴うと思われる)である。変形性関節症は、関節組織、主として軟骨、滑膜および肋軟骨下骨における進行性の構造変化を伴う慢性疾患である。典型的には、関節炎の関節は、軟骨浮腫およびびらん、肋軟骨下骨および滑膜肥厚、および骨増殖体の形成を呈し、全て関節表面変形の一因となる。変形性関節症の主たる臨床徴候は疼痛であるが、この状態において慢性神経因性疼痛の根元をなす機構は解明されていない。
【０００７】
伝統的に、疼痛シグナル伝達に関与する知覚神経線維、例えば「Ｃ線維」(Woolf C.J.et al.(１９９５)J.Comp.Neurol.３６０、１２１−１２４)または脊髄に沿って有害情報を伝達する知覚神経線維(Dickenson AH. & Sullivan A.(１９８７)Neuropharmacol.２６；１２３５−１２３８)に治療化合物を指向させることにより慢性神経因性疼痛を軽減する試みが為されてきた。また、化合物は、炎症中の組織からの伝達物質放出(例、サイトカインおよびブラジキニン)を遮断することにより、および／またはこれらの伝達物質についての受容体を遮断することにより、この疼痛を軽減し得ると仮定されている(Dray A. & Urban L.(１９９６)Annu.Rev.Pharmacol.Toxicol.３６；２５３−２８０)。
【０００８】
我々は、驚くべきことに、リソソームシステインプロテアーゼである、カテプシンＳについてのｍＲＮＡが、慢性疼痛動物モデルにおいてアップレギュレーションされること、およびカテプシンＳ阻害剤の投与により、これらの動物における機構的痛覚過敏が除去されることを発見した。すなわち、カテプシンＳは、慢性疼痛についての新規薬剤標的として使用され得る。本発明はまた、カテプシンＳ活性を阻害し、および／またはカテプシンＳ遺伝子発現を阻害するモジュレーターの同定方法およびヒトおよび獣医学的患者における慢性疼痛処置についての上記モジュレーターの使用を提供する。本発明はまた、上記モジュレーターを含む医薬組成物を提供する。
【０００９】
発明の要約
本出願は、カテプシンＳが、慢性疼痛を処置または改善するための新規治療薬の開発に適切な標的であるという発見に関するものである。すなわち、一態様において、本発明は、慢性神経因性疼痛を含む慢性疼痛を処置または改善するのに有用なモジュレーターの同定方法であって、ａ)候補モジュレーターがインビトロまたはインビボでカテプシンＳの活性を阻害、および／またはカテプシンＳ遺伝子発現を阻害する能力について検定することを含み、さらにｂ)同定された阻害性モジュレーターが、慢性疼痛動物モデルおよび／または慢性疼痛対象による臨床試験で観察される病的作用を除去する能力について検定することを含み得る方法に関するものである。
【００１０】
別の態様において、本発明は、慢性神経因性疼痛を含む慢性疼痛の処置または改善方法であって、カテプシンＳモジュレーターの有効量を処置または改善を必要とする対象に投与することを含む方法に関するものであり、この場合上記モジュレーターは、上記対象において例えばカテプシンＳの酵素活性を阻害および／またはカテプシンＳ遺伝子発現を阻害するものとする。一態様において、モジュレーターは、Ｎ−ヘテロアリール−カルボニトリルカテプシン阻害剤と称される化合物の種類に属する化合物である。別の態様において、モジュレーターは、化学的化合物[７−(２,２−ジメチル−プロピル)−６−チオフェン−２−イルメチル−７.Ｈ.−ピロロ[２,３−.ｄ.]ピリミジン−２−カルボニトリル]の遊離または医薬上許容される塩形態、すなわち本明細書で化合物Ａと称される物質である。さらに別の実施態様において、モジュレーターは、化学的化合物３−[(４−モルホリニルカルボニル)フェニルアラニルアミド]−１−フルオロ−５−フェニル−２−ペンタノン、すなわち本明細書で化合物Ｂと称される物質である。別の実施態様において、モジュレーターは、アンチセンスオリゴヌクレオチド、三重らせんＤＮＡ、リボザイム、ＲＮＡアプタマーおよび二本鎖ＲＮＡから成る群から選択される１種またはそれ以上の物質を含んでおり、この場合上記物質はカテプシンＳ遺伝子発現を阻害するように設計されている。さらに別の実施態様において、モジュレーターは、カテプシンＳに対する抗体またはそのフラグメントを含み、この場合上記抗体は、例えばカテプシンＳ酵素活性を阻害し得るものとする。
【００１１】
別の態様において、本発明は、慢性神経因性疼痛を含む慢性疼痛の処置または改善方法であって、有効量のカテプシンＳモジュレーターを含む医薬組成物を処置または改善を必要とする対象に投与することを含む方法に関するものである。様々な実施態様において、医薬組成物は、上記で検討したカテプシンＳモジュレーターのいずれかを含む。
【００１２】
別の態様において、本発明は、処置または改善を必要とする対象における慢性神経因性疼痛を含む慢性疼痛の処置または改善に有効な量でカテプシンＳモジュレーターを含む医薬組成物に関するものであり、上記モジュレーターは、例えばカテプシンＳの酵素活性を阻害および／またはカテプシンＳ遺伝子発現を阻害し得るものとする。一実施態様において、上記医薬組成物は、Ｎ−ヘテロアリール−カルボニトリルカテプシン阻害剤と称される化合物の種類に属する化合物を含む。一実施態様において、上記医薬組成物は、本明細書で化合物Ａと称される化学的化合物の遊離または医薬上許容される塩形態を含む。さらに別の実施態様において、上記医薬組成物は、本明細書で化合物Ｂと称される物質を含む。別の実施態様において、医薬組成物は、カテプシンＳの核酸配列に指向されたアンチセンスオリゴヌクレオチド、三重らせんＤＮＡ、リボザイム、ＲＮＡアプタマーまたは二本鎖ＲＮＡから成る群から選択される１種またはそれ以上の物質を含み、上記物質は、カテプシンＳ遺伝子発現を阻害するように設計されているものとする。さらに別の実施態様において、上記医薬組成物は、カテプシンＳに対する抗体またはそのフラグメントを含み、上記抗体は、例えばカテプシンＳ酵素活性を阻害し得るものとする。
【００１３】
別の態様において、本発明は、カテプシンＳモジュレーターによる処置に適切な候補であり得る慢性疼痛罹患対象の診断方法であって、上記対象からの生物学的試料においてこのタンパク質のレベルを検出することを含む方法に関するものであり、この場合、対照と比べてレベルが増加した対象は、カテプシンＳモジュレーター処置に適切な候補であるものとする。
【００１４】
さらに別の態様において、本発明は、カテプシンＳモジュレーターによる処置に適切な候補であり得る慢性疼痛罹患対象の診断方法であって、上記対象からの生物学的試料においてこのタンパク質のｍＲＮＡレベルを検定することを含む方法に関するものであり、この場合、対照と比べてレベルが増加した対象は、カテプシンＳモジュレーター処置に適切な候補であるものとする。
【００１５】
さらに別の態様において、慢性神経因性疼痛を含む慢性疼痛の処置または改善方法であって、(ａ)対象においてカテプシンＳｍＲＮＡおよび／またはタンパク質レベルについて検定し、そして(ｂ)対照と比べてカテプシンＳｍＲＮＡのレベルおよび／タンパク質レベルが増加した対象に、慢性疼痛の病的作用を処置または改善するのに十分な量でカテプシンＳモジュレーターを投与することを含む方法が提供される。
【００１６】
本発明のさらに別の態様において、患者から誘導された体組織試料から、カテプシンＳまたは関連調節性ポリペプチドをコード化するポリヌクレオチドの発現、またはカテプシンＳまたは関連調節性ポリペプチド、またはそのフラグメントのレベルを検出するのに必要な成分を含む検定方法およびキットが提供され、上記キットは、例えば、上記ポリペプチド、またはそのフラグメントに結合する抗体、または上記ポリヌクレオチドとハイブリダイズするオリゴヌクレオチドプローブを含むものとする。好ましい実施態様において、上記キットはまた、キット成分を使用する際の手順を詳述した使用説明書を含む。
【００１７】
本発明はまた、慢性神経因性疼痛を含む慢性疼痛の処置または改善用医薬の製造におけるカテプシンＳモジュレーターの使用に関するものである。一実施態様において、上記カテプシンＳモジュレーターは、化合物Ａの遊離または医薬上許容される塩形態である。別の実施態様において、上記カテプシンＳモジュレーターは化合物Ｂである。さらに別の実施態様において、カテプシンＳモジュレーターは、アンチセンスオリゴヌクレオチド、三重らせんＤＮＡ、リボザイム、ＲＮＡアプタマーおよび二本鎖ＲＮＡから成る群から選択される１種またはそれ以上の物質を含み、上記物質は、カテプシンＳ遺伝子発現を阻害するように設計されているものとする。さらに別の実施態様において、カテプシンＳモジュレーターは、カテプシンＳに対する１種またはそれ以上の抗体、またはそのフラグメントを含み、上記抗体またはそのフラグメントは例えばカテプシンＳ酵素活性を阻害し得るものとする。
【００１８】
本発明はまた、医薬として使用されるカテプシンＳモジュレーターに関するものである。一実施態様において、上記カテプシンＳモジュレーターは、化合物Ａの遊離または医薬上許容される塩形態である。別の実施態様において、上記カテプシンＳモジュレーターは化合物Ｂである。さらに別の実施態様において、カテプシンＳモジュレーターは、アンチセンスオリゴヌクレオチド、三重らせんＤＮＡ、リボザイム、ＲＮＡアプタマーおよび二本鎖ＲＮＡから成る群から選択される１種またはそれ以上の物質を含み、上記物質は、カテプシンＳ遺伝子発現を阻害するように設計されているものとする。さらに別の実施態様において、カテプシンＳモジュレーターは、カテプシンＳに対する１種またはそれ以上の抗体、またはそのフラグメントを含み、抗体またはそのフラグメントは、例えばカテプシンＳ酵素活性を阻害し得るものとする。
【００１９】
発明の詳細な説明
本明細書に記載されている本発明は、記載された特定の方法、プロトコルおよび試薬に限定されるわけではなく、これらは変わり得るものして考えるべきである。また、本明細書で使用されている用語は、特定実施態様の説明のみを目的とし、何らかの意味で本発明の範囲を制限する意図はないものと理解すべきである。
【００２０】
特記しない場合、本明細書で使用されている技術および科学用語は全て、この発明が属する分野において、当業者が通常理解しているのと同じ意味を有するものとする。本明細書に記載されたものと類似しているかまたは均等内容の方法および材料も本発明の実施または試験において使用され得るが、好ましい方法、装置および材料は本明細書に記載されているものである。本明細書で挙げられている出版物は全て、出版物に報告されているもので、本発明に関して使用され得る材料および方法を記載および開示することを目的として出典明示で援用する。
【００２１】
本発明を実施する場合、分子生物学における多くの慣用的技術が使用される。これらの技術は公知であり、例えばCurrent Protocols in Molecular Biology、第Ｉ、IIおよびIII巻、１９９７(F.M.Ausubel編)；Sambrook et al.、１９８９、Molecular Cloning: A Laboratory Manual、第２版、コールドスプリングハーバー・ラボラトリー・プレス、コールドスプリングハーバー、ニューヨーク；DNA Cloning：A Practical Approach、第ＩおよびII巻、１９８５(D,N,Glover編)；Oligonucleotide Synthesis、１９８４(M.L.Gait編)；Nucleic Acid Hybridization、１９８５(HamesおよびHiggins)；Transcription and Translation、１９８４(HamesおよびHiggins編)；Animal Cell Culture、１９８６(R.I.Freshney編)；Immobilized Cells and Enzymes、１９８６(ＩＲＬプレス)；Perbal、１９８４、A Practical Guide to Molecular Cloning；the series，Methods in Enzymology(アカデミック・プレス、インコーポレイテッド)；Gene Transfer Vectors for Mammalian Cells、１９８７(J.H.MillerおよびM.P.Calos編、コールドスプリングハーバー・ラボラトリー)；およびMethods in Enzymology、第１５４巻および第１５５巻(それぞれWuおよびGrossman、およびWu編)において説明されている。
【００２２】
英語原文の明細書および請求の範囲で使用されている、単数形「ａ」、「ａｎ」および「ｔｈｅ」は、文脈から明らかに特定されている場合を除き、その複数表示も包含するものとする。すなわち、例えば「抗体」と示されている語は、当業者に公知の１個またはそれ以上の抗体およびその均等内容物などを包含する。
【００２３】
「慢性疼痛の病的作用」は、限定されるわけではないが、痛覚過敏および異痛を含む。
【００２４】
ある物質(例、カテプシンＳモジュレーター)がカテプシンＳを「調節する」能力は、限定されるわけではないが、ある物質がカテプシンＳの酵素活性を阻害および／またはカテプシンＳ遺伝子発現を阻害する能力を包含する。上記調節はまた、カテプシンＳと相互作用する他のタンパク質、例えば関連調節性タンパク質またはカテプシンＳにより修飾されているタンパク質の能力に効果を及ぼすことも含み得る。
【００２５】
本明細書で使用されている「核酸配列」は、オリゴヌクレオチド、ヌクレオチドまたはポリヌクレオチド、およびそれらのフラグメントまたは一部分、および１本または２本鎖形態であり、センスまたはアンチセンス鎖を表し得るゲノムまたは合成起源のＤＮＡまたはＲＮＡを包含する。
【００２６】
本明細書で使用されている「アンチセンス」の語は、特異的ＤＮＡまたはＲＮＡ配列と相補的であるヌクレオチド配列をいう。「アンチセンス鎖」の語は、「センス」鎖に相補的である核酸鎖に関して使用される。アンチセンス分子は、相補鎖の合成を可能にするウイルスプロモーターに興味の対象である遺伝子(複数も可)を逆配向でライゲーションすることによる合成を含む、任意の方法により製造され得る。一旦細胞へ導入されると、この転写された鎖は、細胞により生産された天然配列を合わさって二重らせんを形成する。次いで、これらの二重らせんは、さらなる転写または翻訳を遮断する。「負」の表示はアンチセンス鎖をいうのに使用される場合もあり、「正」の表示はセンス鎖をいうのに使用される場合もある。
【００２７】
本明細書で意図するところによると、アンチセンスオリゴヌクレオチド、三重らせんＤＮＡ、ＲＮＡアプタマー、リボザイムおよび二本鎖ＲＮＡは、選択されたカテプシンＳのヌクレオチド配列が、カテプシンＳ遺伝子発現の遺伝子特異的阻害を生じさせるように「カテプシンＳの核酸配列に指向されて」いる。例えば、カテプシンＳヌクレオチド配列の知識を用いることにより、ｍＲＮＡとの非常に強いハイブリダイゼーションをもたらすアンチセンス分子が設計され得る。同様に、カテプシンＳの特異的ヌクレオチド配列を認識し、それを開裂するようにリボザイムは合成され得る(Cech．J.Amer.Med Assn.２６０：３０３０(１９８８))。遺伝子発現のターゲッティングされた阻害で使用される上記分子の設計技術は、当業者には熟知されている。
【００２８】
「カテプシンＳ」の語は、ヒトまたは他の種に由来する、限定されるわけではないが、カテプシンＳ配列を含む部分形態、イソ形態、前駆体形態、完全長ポリペプチド、融合タンパク質または上記のいずれかのフラグメントを含むこのポリペプチドのあらゆる形態を全て包含する。カテプシンＳの配列は、Ｇｅｎｂａｎｋにおいて、受入番号ＮＭ００４０７９で見出され得る。カテプシンＳの相同体は、当業者にとっては明白なことであるが、この定義に含まれるものとする。また、この語は、いずれかの種の天然に存する供給源、例えばゲノムＤＮＡライブラリーおよび遺伝子操作が加えられた発現系を含む宿主細胞から単離されるか、または例えば自動ペプチド合成装置を用いる化学合成または上記方法の組み合わせにより製造されるカテプシンＳをいうものとする。上記ポリペプチドの単離および調製手段は当業界では十分に理解されている。
【００２９】
本明細書で使用されている「試料」の語は、その最も広い意味で使用されている。対象からの生物学的試料は、血液、尿またはカテプシンＳ活性または遺伝子発現が検定され得る他の生物学的材料を含み得る。生物学的試料は脊髄神経節を含み得、そこから全ＲＮＡが、慣用的ガラスチップマイクロアレイ技術、例えばアフィメトリックスチップ、ＲＴ−ＰＣＲまたは他の慣用的方法を用いて遺伝子発現プロファイリング用に精製され得る。
【００３０】
本明細書で使用されている「抗体」の語は、エピトープ決定基と結合し得る、無傷の分子およびそのフラグメント、例えばＦａ、Ｆ(ａｂ')２およびＦｖをいう。カテプシンＳポリペプチドと結合する抗体は、免疫化抗原として興味の対象である小ペプチドを含む無傷のポリペプチドまたはフラグメントを用いて調製され得る。動物の免疫化に使用されるポリペプチドまたはペプチドは、ＲＮＡの翻訳から誘導されるか、または化学的に合成され得、所望の場合、担体タンパク質にコンジュゲートされ得る。ペプチドに化学的にカップリングする常用担体には、ウシ血清アルブミンおよびチログロブリンがある。次いで、カップリングしたペプチドを用いて、動物(例、マウス、ラットまたはウサギ)を免疫化する。
【００３１】
本明細書で使用されている「ヒト化抗体」の語は、アミノ酸が非抗原結合領域で置換されたことによりヒト抗体とより密接に類似していながら、もとの結合能力を依然保持している抗体分子をいう。
【００３２】
「治療有効量」は、限定されるわけではないが、痛覚過敏を含む慢性疼痛の病的作用の処置および／または改善に十分な薬剤量である。
【００３３】
本明細書で使用されている「関連調節性タンパク質」および「関連調節性ポリペプチド」は、慣用的方法、例えば本明細書記載の方法を用いて当業者により同定され得るカテプシンＳの調節に関与するポリペプチドをいう。
【００３４】
本明細書で定義されている疼痛は慢性疼痛を含む。「慢性疼痛」は、炎症性(侵害受容性)および神経因性疼痛を含む。
「対象」は、ヒトまたはヒト以外の生物体を包含する。
【００３５】
本発明は、カテプシンＳメッセンジャーＲＮＡが、慢性神経因性疼痛のラットモデルにおいてアップレギュレーションされるという驚くべき発見に基いている。この観察結果により、カテプシンＳ阻害剤は、慢性疼痛の実験モデルにかけられたラットで誘発された機械的痛覚過敏を除去するというさらなる発見が導かれている。すなわち、カテプシンＳは、以前にはカテプシンＳに係わることが知られていなかった病状である、慢性疼痛の処置用治療薬の開発についての有用な薬剤標的である。
【００３６】
すなわち、一態様において、本発明は、慢性神経因性疼痛を含む慢性疼痛の処置または改善に有用なモジュレーターの同定方法であって、ａ)候補モジュレーターがインビトロまたはインビボでカテプシンＳの活性を阻害、および／またはカテプシンＳ遺伝子発現を阻害する能力について検定することを含み、さらにｂ)同定された阻害性モジュレーターが、慢性疼痛動物モデルおよび／または慢性疼痛対象による臨床試験で観察される病的作用を除去する能力について検定することを含み得る方法に関するものである。
【００３７】
慣用的スクリーニング検定法(インビトロおよびインビボの両方)を用いることにより、カテプシンＳ酵素活性を阻害および／またはカテプシンＳ遺伝子発現を阻害するモジュレーターが同定され得る。カテプシンＳ活性レベルは、対象において慣用的酵素活性検定方法を用い、対象からの生物学的試料を用いて検定され得る。カテプシンＳ遺伝子発現(例、ｍＲＮＡレベル)はまた、当業者が熟知している方法、例えば慣用的ノーザン分析または市販のマイクロアレイを用いて測定され得る。さらに、カテプシンＳの試験化合物の阻害効果および／または関連調節性タンパク質レベルは、ＥＬＩＳＡ抗体に基く検定法または蛍光標識反応検定法により検出され得る。これらの技術は、高スループットスクリーニングについて容易に利用可能であり、当業者に熟知されたものである。
【００３８】
これらの試験から集められたデータを用いることにより、慢性疼痛の処置についての治療有用性をもつモジュレーターを同定し、次いで化合物がインビボで慢性疼痛の病的作用を改善する能力を評価する慣用的方法にしたがって、阻害性物質を、本明細書に記載された慢性疼痛の慣用的な生きた動物モデルおよび／または慢性疼痛を患うヒトによる臨床試験においてさらに検定し得る。
【００３９】
本明細書に開示された方法による分析用の候補モジュレーターには、カテプシン阻害活性を有することが知られている化学的化合物およびいかなるレベルにせよこのタンパク質に対するその効果がまだ特性確認されていない化合物がある。カテプシン阻害活性を有することが知られている化合物は、本明細書記載の動物疼痛モデルまたは臨床試験において直接検定され得る。
【００４０】
カテプシン阻害活性をもつ化合物、および必ずしも限定はされないがカテプシンＳのみを特異的に阻害する化合物は、有用な治療薬であることが判明し得る。例えば、混合カテプシン阻害剤(例、カテプシンＫまたはＬおよびＳを阻害し得る化合物)は、本発明において有用である。
【００４１】
本発明で有用な公知カテプシン阻害剤、例えばカテプシンＳ特異的阻害剤には、限定されるわけではないが、ノヴァーティス・コーポレーションの国際特許出願公開第ＷＯ９９／２４４６０号に記載されたジペプチドニトリル、α−アミノフルオロケトン、例えば米国特許第４５１８５２８号に記載されたもの、米国特許第５３７４６２３号に記載されたフルオリド遊離脱離基をもつペプチド、米国特許第５４８６６２３号に記載された複素環脱離基をもつ化合物、およびアルキルスルホニル含有化合物、例えば米国特許第６０３０９４６号に記載されたものがある。カテプシン阻害剤を開示している追加的参考文献には、国際公開第ＷＯ００／４９００７号、国際公開第ＷＯ００／４９００８号、国際公開第ＷＯ９７／４００６６号、国際公開第ＷＯ９６／４０７３７号、国際公開第ＷＯ０１／１９８１６号、国際公開第ＷＯ００／５５１２５号および国際公開第ＷＯ００／５１９９８号がある。システインプロテアーゼ阻害剤設計における進歩の治療的潜在性の概説については、Veber、Daniel F、Thompson、Scott K. Curr.Opin.Drug Discovery Dev.(２０００)、３(４)、３６２−３６９参照。
【００４２】
特に有用な種類の化合物は、より一般的にはＮ−ヘテロアリール−カルボニトリルカテプシン阻害剤として称され得る６−アリール−７Ｈ−ピロロ−(２,３−ｄ)−ピリミジン−２−カルボニトリルカテプシン阻害剤である。この種類に属する特に有用な一化合物は、式(Ｉ)の化合物、すなわち本明細書では化合物Ａと称される、[７−(２,２−ジメチル−プロピル)−６−チオフェン−２−イルメチル−７.Ｈ.−ピロロ[２,３−.ｄ.]ピリミジン−２−カルボニトリル]およびその医薬上許容される塩である(実施例３参照)。
式Ｉ：
【化１】
化合物Ａは、さらに英国特許出願第１２１０３３.５号および英国特許出願第１２８４８３.５号に開示されており、それらに記載された方法で合成され得る。簡単に述べると、１−プロパ−２−イニル−２Ｈ−チオフェン(１５ｍｍｏｌ)を室温で窒素雰囲気下ＤＭＦに溶かす。この溶液に、５−ブロモ−４−(２,２−ジメチルプロピルアミノ)−ピリミジン−２−カルボニトリル(８ｍｍｏｌ)、トリエチルアミン(２４ｍｍｏｌ)、よう化銅(Ｉ)(０.８ｍｍｏｌ)、およびジクロロビス(トリフェニルホスフィン)パラジウム(II)(０.４ｍｍｏｌ)を連続的に加える。混合物を窒素雰囲気下で３時間８０℃で加熱する。室温で冷却後、混合物をＨ２ＯおよびＡｃＯＥｔで希釈し、セライトで濾過する。有機層を取り、ＭｇＳＯ４で乾燥し、真空下濃縮する。残さをシリカゲルカラムクロマトグラフィー(ＡｃＯＥｔ：ＭｅＯＨ＝２０：１)により精製して、７−(２,２−ジメチル−プロピル)−６−チオフェン−２−イルメチル−７Ｈ−ピロロ[２,３−ｄ]ピリミジン−２−カルボニトリルを６４％収率で得る。Rf = 0.50 (n-ヘキサン:AcOEt =5:1); NMR: (CDCl3):1.04(s, 9H) 4.10(s, 2H), 4.43(s, 2H), 6.44(s, 1H), 6.85-6.86(m, 1H), 6.97-6.99(m, 1H), 7.23-7.25(m, 1H), 8.87(s, 1H)。
【００４４】
さらに、別の特に有用な化合物は、式(II)の化合物、３−[(４−モルホリニルカルボニル)−フェニルアラニルアミド]−１−フルオロ−５−フェニル−２−ペンタノン(J.Clin.Invest １９９３年３月、９１(３)：１０５２−６および米国特許第４５１８５２８号に開示されている)である。
式II：
【化２】
この化合物は、混合カテプシン阻害剤であり、本明細書では化合物Ｂ(実施例２参照)と称され、下記スキームにしたがって製造され得る。
【化３】
別の態様において、本発明は、慢性疼痛の処置または改善方法であって、処置または改善を必要とする対象にカテプシンＳモジュレーターの有効量を含む医薬組成物を投与することを含む方法に関するものである。上記モジュレーターは、カテプシンＳポリペプチドまたはそのフラグメントに指向した抗体を含む。ある種の特に好ましい実施態様において、医薬組成物は、ヒトカテプシンＳポリペプチドまたはヒトカテプシンＳポリペプチドの一部分に高選択的である抗体を含む。カテプシンＳに対する抗体は、対象においてタンパク質の凝集を誘発するため、酵素の活性を阻害または低減化し得る。上記抗体はまた、例えば、活性部位と直接相互作用することにより、または活性部位への基質の接近を遮断することにより、カテプシンＳ活性を阻害または低減化し得る。カテプシンＳ抗体はまた、カテプシンＳの調節に関与し、酵素活性に必要であり得るタンパク質−タンパク質相互作用を阻止することによるカテプシンＳ活性の阻害に使用され得る。阻害活性をもつ抗体、例えば本明細書記載のものは、当業者に熟知されている標準的検定法にしたがって製造され、同定され得る。
【００４７】
カテプシンＳ抗体はまた、診断に使用され得る。例えば、これらの抗体は、対象においてカテプシンＳのレベルを定量する慣用的方法にしたがって使用され得る。レベル増加は、慢性疼痛およびこの状態の重症度を示す。すなわち、異なるカテプシンＳレベルは、慢性疼痛の様々な臨床形態および重症度を示す。上記情報はまた、カテプシンＳ阻害剤による処置に応答する場合もしない場合もあり得る疼痛経験患者の部分集合を同定するのに有用である。同様に、対象においてカテプシンＳのメッセージレベルを定量することは、診断および適切な疼痛治療の決定に有用であると考えられる。適切な対照個体と比べてこのタンパク質のｍＲＮＡレベルが高い対象は、カテプシンＳ阻害剤による処置についての適切な候補であるとみなされる。
【００４８】
すなわち、別の態様において、本発明は、
(ａ)カテプシンＳのポリヌクレオチドまたはそのフラグメント、
(ｂ)(ａ)の配列と相補的なヌクレオチド配列、
(ｃ)カテプシンＳポリペプチド、またはそのフラグメント、または
(ｄ)カテプシンＳポリペプチドに対する抗体
を含む診断キットに関するものである。
【００４９】
上記キットにおいて、(ａ)、(ｂ)、(ｃ)または(ｄ)は、実質的な成分を構成し得るものとする。また、上記キットは、本明細書で検討されているカテプシンＳ関連調節性タンパク質またはカテプシンＳにより修飾されたタンパク質のレベルを検出するように設計された成分(ａ)〜(ｄ)を含み得ると考えられる。
【００５０】
同様に、カテプシンＳタンパク質レベルまたは酵素活性のモニタリングおよび／またはカテプシンＳ遺伝子発現(ｍＲＮＡレベル)の検出は、例えば、所定の疼痛処置プログラムの効力を測定するための臨床試験手順の一部として使用され得ると考えられる。例えば、疼痛用薬剤が投与された患者が評価され、臨床医は、カテプシンＳレベル、活性および／または遺伝子発現レベルが望ましいレベルよりも高い(すなわち疼痛を経験していない対照患者または疼痛が臨床的介入により十分に軽減された患者におけるレベルよりも高いレベル)患者を同定できる。これらのデータに基づいて、臨床医は、処方される疼痛薬剤の用量、投与プログラムまたはタイプを調節し得る。臨床医は、患者に対し個別に経験している疼痛の程度を尋ねることにより、特定疼痛薬剤の有効性を把握できることから、上記によるカテプシンＳの患者レベルのモニタリングは、患者の疼痛レベルの定量的評価を提供すると考えられる。さらに、かかる方法での対象におけるカテプシンＳレベルのモニタリングを用いることにより、非応答性患者(例、幼児、昏睡状態、火傷患者)が経験している疼痛レベルが評価され得る。次いで、臨床医は、上記データを用いることにより、上記患者についての疼痛薬剤の適切な用量、投与プログラムまたはタイプを決定することができる。
【００５１】
患者に対する治療を最適化するのに考慮すべき因子には、処置されている特定状態、処置されている特定哺乳類、個々の患者の臨床状態、活性化合物の送達部位、活性化合物の特定タイプ、投与方法、投与スケジュール、および開業医に知られている他の因子が含まれる。投与される活性化合物の治療有効量は、上記考察により決定されるもので、慢性疼痛、好ましくは慢性神経因性疼痛の処置に必要な最少量である。
【００５２】
カテプシンＳまたは関連調節性タンパク質に対する適切な抗体は、市販供給源から入手されるか、または慣用的方法にしたがって製造され得る。例えば、１つまたはそれ以上の差次的発現された遺伝子エピトープを特異的に認識し得る抗体の製造方法が、本明細書には記載されている。上記抗体には、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体(ｍＡｂ)、ヒト化またはキメラ抗体、１本鎖抗体、Ｆａｂフラグメント、Ｆ(ａｂ')２フラグメント、Ｆａｂ発現ライブラリーにより製造されるフラグメント、抗イディオタイプ(抗Ｉｄ)抗体、およびエピトープ結合性フラグメントが含まれ得るが、これらに限定されるわけではない。
【００５３】
本明細書で検討されているカテプシンＳポリペプチドに対する抗体を製造するため、様々な宿主動物がポリペプチドまたはその一部の注射により免疫化され得る。上記宿主動物には、ウサギ、マウスおよびラットが含まれ得るが、限定はされない。宿主の種によって、免疫応答を高めるために様々なアジュバントが使用され得、例としては、フロイントアジュバント(完全および不完全)、無機ゲル、例えば水酸化アルミニウム、表面活性物質、例えばリソレシチン、プルロニックポリオール、ポリアニオン、ペプチド、油性エマルジョン、キーホールリンペット・ヘモシアニン、ジニトロフェノールおよび潜在的に有用なヒトアジュバント、例えばＢＣＧ(カルメット−ゲラン杆菌、bacille Calmette-Guerin)およびコリネバクテリウム・パルブム(Corynebacterium parvum)があるが、これらに限定はされない。
【００５４】
ポリクローナル抗体は、抗原、例えば標的遺伝子産物、またはその抗原機能性誘導体により免疫化された動物の血清から誘導された抗体分子の異種集団である。ポリクローナル抗体を製造するためには、宿主動物、例えば上記の動物が、同じく上記のアジュバントを補ったポリペプチドまたはその一部分の注射により免疫化され得る。
【００５５】
特定抗原に対する抗体の均一集団であるモノクローナル抗体は、培養中の連続セルラインにより抗体分子を製造させる技術により得られる。これらの技術には、KohlerおよびMilstein(１９７５、Nature ２５６：４９５−４９７、および米国特許第４３７６１１０号)のハイブリドーマ技術、ヒトＢ細胞ハイブリドーマ技術(Kosbor et al.、１９８３、Immunology Today ４：７２；Cole et al.、１９８３、Proc.Natl.Acad.Sci.USA ８０：２０２６−２０３０)、およびＥＢＶ−ハイブリドーマ技術(Cole et al.、１９８５、Monoclonal Antibodies And Cancer Therapy、アラン・R.リス、インコーポレイテッド７７−９６頁)があるが、限定はされない。上記抗体は、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＥ、ＩｇＡ、ＩｇＤおよびそのサブクラスを含む免疫グロブリンのクラスに属し得る。この発明のｍＡｂを生産するハイブリドーマは、インビトロまたはインビボで培養され得る。この方法は、インビボで高力価のｍＡｂを生じることから、現時点では好ましい製造方法となっている。
【００５６】
さらに、適切な生物活性を有するヒト抗体分子からの遺伝子と一緒に適切な抗原特異性を有するマウス抗体分子からの遺伝子をスプライシングすることによる「キメラ抗体」の製造用に開発された技術(Morrison et al.、１９８４、Proc.Natl.Acad.Sci.、８１：６８５１−６８５５；Neuberger et al.、１９８４、Nature、３１２：６０４−６０８；Takeda et al.、１９８５、Nature、３１４：４５２−４５４)も使用され得る。キメラ抗体は、種々の部分が異なる動物種から誘導された分子、例えばネズミｍＡｂから誘導された可変または超可変域およびヒト免疫グロブリン定常域を有するものである。
【００５７】
別法として、１本鎖抗体の製造について報告された技術(米国特許第４９４６７７８号、Bird、１９８８、Science ２４２：４２３−４２６；Huston et al.、１９８８、Proc.Natl.Acad.Sci.USA ８５：５８７９−５８８３；およびWard et al.、１９８９、Nature３３４：５４４−５４６)は、差次的発現遺伝子−１本鎖抗体の製造に適合化され得る。１本鎖抗体は、アミノ酸架橋を介してＦｖ領域の重鎖および軽鎖フラグメントを結合して、１本鎖ポリペプチドを生じさせることにより形成される。
【００５８】
最も好ましくは、「ヒト化抗体」の製造に有用な技術を適合化させることにより、本明細書に開示されているポリペプチド、フラグメント、誘導体および機能的均等内容物に対する抗体を製造し得る。上記技術は、米国特許第５９３２４４８、５６９３７６２、５６９３７６１、５５８５０８９、５５３０１０１、５９１０７７１、５５６９８２５、５６２５１２６、５６３３４２５、５７８９６５０、５５４５５８０、５６６１０１６および５７７０４２９号に開示されており、これらの開示は全て、出典明示で援用する。
【００５９】
特異的エピトープを認識する抗体フラグメントは、公知技術により生成され得る。例えば、上記フラグメントには、抗体分子のペプシン消化により製造され得るＦ(ａｂ')２フラグメントおよびＦ(ａｂ')２フラグメントのジスルフィド架橋を還元することにより製造され得るＦａｂフラグメントがあるが、これらに限定はされない。別法として、Ｆａｂ発現ライブラリーを構築することにより(Huse et al.、１９８９、Science、２４６：１２７５−１２８１)、所望の特異性をもつモノクローナルＦａｂフラグメントが迅速かつ容易に同定され得る。
【００６０】
本明細書に記載されている抗体の検出は、標準ＥＬＩＳＡ、ＦＡＣＳ分析、およびインビトロまたはインビボで使用される標準イメージング技術を用いて達成され得る。抗体を検出可能物質にカップリング(すなわち、物理的結合)させることにより、検出は簡易化され得る。検出可能物質の例には、様々な酵素、補欠分子族、蛍光材料、発光材料、生物発光材料および放射性材料が含まれる。適切な酵素の例には、西洋ワサビペルオキシダーゼ、アルカリ性ホスファターゼ、(３−ガラクトシダーゼ、またはアセチルコリンエステラーゼがある。適切な補欠分子族複合体の例には、ストレプトアビジン／ビオチンおよびアビジン／ビオチンがある。適切な蛍光材料の例には、ウンベリフェロン、フルオレセイン、フルオレセインイソチオシアネート、ローダミン、ジクロロトリアジニルアミンフルオレセイン、ダンシルクロリドまたはフィコエリトリンがある。ルミネセンス材料の一例にはルミノールがある。生物発光材料の例には、ルシフェラーゼ、ルシフェリンおよびエクオリンがあり、適切な放射性材料の例には125Ｉ、131Ｉ、35Ｓまたは３Ｈがある。
【００６１】
検出の容易さについて、特に好ましいのはサンドイッチ検定法であり、その若干の変形も存在するが、それらは全て本発明に包含されるものとする。例えば、典型的前進検定法では、非標識抗体を固体基質に固定し、試験すべき試料を結合分子と接触させる。適切なインキュベーション期間後、抗体−抗原二元複合体を形成させるのに十分な期間、検出可能なシグナルを誘導し得るリポーター分子で標識した二次抗体を加え、インキュベーションし、抗体−抗原−標識抗体の三元複合体を形成させるのに十分な時間をおく。次いで、未反応物質があれば全て洗い流し、抗原の存在を、シグナルの観察により測定するか、または既知量の抗原を含む対照試料と比較することにより定量し得る。前進検定法に対する変形には、試料および抗体の両方を同時に結合抗体に加える同時検定法、または標識抗体および試験すべき試料を最初に合わせ、インキュベーションし、非標識表面結合抗体に加える逆検定法がある。これらの技術は、当業者には熟知されており、小さな変形についての可能性も容易に理解されるはずである。本明細書で使用されている「サンドイッチ検定法」は、基本的２サイト技術に対する変形も全て包含するものとする。本発明のイムノアッセイの場合、唯一の制限因子は、標識抗体が、カテプシンＳポリペプチドまたは関連調節タンパク質、またはそのフラグメントに特異的な抗体であることである。
【００６２】
最も一般的に使用されるリポーター分子は、酵素、発蛍光団−または放射性核種−含有分子である。酵素免疫検定法の場合、通常、グルタルアルデヒドまたは過ヨウ素酸手段により酵素を第２抗体にコンジュゲートする。しかしながら、容易に認められるように、広く多様な種々のライゲーション技術が存在しており、それらは当業者には熟知されている。一般的に使用される酵素としては、中でも西洋ワサビペルオキシダーゼ、グルコースオキシダーゼ、ベータ−ガラクトシダーゼおよびアルカリ性ホスファターゼがある。特異酵素により使用される基質は、対応する酵素の加水分解時に、検出可能な色の変化を生じるように一般的に選択される。例えば、ｐ−ニトロフェニルホスフェートは、アルカリ性ホスファターゼコンジュゲートを伴う使用に適切である。ペルオキシダーゼコンジュゲートについては、１,2−フェニレンジアミンまたはトルイジンが常用される。また、上記の色素原基質ではなく蛍光生成物を生じる、蛍光性基質の使用も可能である。次いで、適切な基質を含む溶液を三次複合体に加える。基質は、第２抗体に結合された酵素と反応して定性的視覚シグナルを与え、これを通常は分光光度計によってさらに定量することにより、血清試料中に存在する興味の対象であるポリペプチドまたはポリペプチドフラグメントの量の評価が得られる。
【００６３】
別法として、蛍光化合物、例えばフルオレセインおよびローダミンは、結合受容力を改変することなく抗体に化学的にカップリングされ得る。特定波長の光線照射により活性化されると、蛍光色素標識抗体は、光エネルギーを吸収し、分子における励起状態を誘導し、特徴的なより長い波長の光を放出する。放出は、光学顕微鏡により視覚的に検出され得る特徴的な色として現れる。免疫蛍光およびＥＩＡ技術は、両方とも当業界では十分に確立されており、本方法には特に好ましい。しかしながら、他のリポーター分子、例えば放射性同位元素、化学発光または生物発光分子もまた使用され得る。要求された用途に合うよういかに手順を変更するべきかは、当業者であれば容易に想到できるはずである。
【００６４】
本発明医薬組成物はまた、核酸レベルでカテプシンＳの発現を阻害する物質を含み得る。上記分子には、カテプシンＳ核酸の適切なヌクレオチド配列に指向されたリボザイム、アンチセンスオリゴヌクレオチド、三重らせんＤＮＡ、ＲＮＡアプタマーおよび／または二本鎖ＲＮＡがある。これらの阻害性分子は、過度の負担または実験を課することなく当業者により慣用技術を用いて生成され得る。例えば、遺伝子発現の修飾(例、阻害)は、本明細書で検討されているポリペプチドをコードする遺伝子の制御領域に対し、すなわちプロモーター、エンハンサーおよびイントロンに対し、アンチセンス分子、ＤＮＡまたはＲＮＡを設計することにより達成される。例として、例えば開始部位から−１０と＋１０位の間における、転写開始部位から誘導されたオリゴヌクレオチドが使用され得る。にもかかわらず、遺伝子の全領域を用いてアンチセンス分子を設計することにより、ｍＲＮＡとの非常に強いハイブリダイゼーションをもたらすものが生成され得、そして上記の適切なアンチセンスオリゴヌクレオチドは、当業者に熟知された標準的検定手順により調製および同定され得る。
【００６５】
同様に、遺伝子発現の発現阻害は、「三重らせん」塩基対合方法を用いて達成され得る。三重らせん対合は、二重らせんがポリメラーゼ、転写因子または調節分子の結合について十分に開裂できる能力の阻害を誘発することから、有用である。三重らせんＤＮＡを用いた最近の治療上の進歩については文献に記載されている(Gee,J.E.et al.(１９９４)Huber,B.E.およびB.I.Carr、Molecular and Immunologic Approaches、フツーラ・パブリッシング・カンパニー、マウントキスコ、ニューヨーク)。これらの分子はまた、転写物がリボソームと結合するのを阻止することによりｍＲＮＡの翻訳を遮断するように設計され得る。
【００６６】
リボザイム、すなわち酵素的ＲＮＡ分子はまた、ＲＮＡの特異的開裂を触媒することにより、遺伝子発現を阻害するのに使用され得る。リボザイムの作用機序は、相補的標的ＲＮＡとのリボザイム分子の配列特異的ハイブリダイゼーション、次いでエンドヌクレアーゼ加水分解的開裂を含む。使用され得る例としては、遺伝子操作を加えた「ハンマーヘッド」または「ヘアピン」モチーフリボザイム分子があり、それらは遺伝子配列、例えばカテプシンＳ遺伝子のエンドヌクレアーゼ加水分解的開裂を特異的かつ有効に触媒するよう設計され得る。
【００６７】
可能性のあるＲＮＡ標的内における特異的リボザイム開裂部位は、まず、以下の配列：ＧＵＡ、ＧＵＵおよびＧＵＣを含むリボザイム開裂部位について標的分子を走査することにより同定される。一旦同定されると、開裂部位を含む標的遺伝子の領域に対応する１５および２０間のリボヌクレオチドの短いＲＮＡ配列が、オリゴヌクレオチドを機能できなくさせ得る二次構造的特徴について評価され得る。候補標的の適合性はまた、リボヌクレアーゼ保護検定法を用いて相補的オリゴヌクレオチドとのハイブリダイゼーションへの接近性を試験することにより評価され得る。
【００６８】
リボザイム方法では、細胞をリボザイムに暴露するかまたは上記小ＲＮＡリボザイム分子の細胞において発現を誘導する(GrassiおよびMarini、１９９６、Annals of Medicine ２８：４９９−５１０；Gibson、１９９６、Cancer and Metastasis Reviews １５：２８７−２９９)。本明細書で検討されている遺伝子の少なくとも１つに対応するｍＲＮＡにターゲッティングされたハンマーヘッドおよびヘアピンリボザイムの細胞内発現は、遺伝子によりコード化されるタンパク質の阻害に利用され得る。
【００６９】
リボザイムは、リボザイム配列を組込んだＲＮＡオリゴヌクレオチドの形態で細胞に直接送達されるか、または所望のリボザイムＲＮＡをコードする発現ベクターとして細胞へ導入され得る。リボザイムは、常用の手順で、ｍＲＮＡを開裂し、それによって細胞におけるｍＲＮＡ存在量を修飾する上で触媒的に有効である十分な数でインビボ発現され得る(Cotten et al.、１９８９、EMBO J.８：３８６１−３８６６)。特に、慣用的な公知規則に従って設計され、例えば標準的ホスホルアミダイト化学作用により合成されたリボザイムコーディングＤＮＡ配列は、ｔＲＮＡをコードする遺伝子のアンチコドンステムおよびループにおける制限酵素部位へライゲーションされ得、次いで当業界の常用方法により興味の対象である細胞へ形質転換され、そこで発現され得る。また、好ましくは、誘導性プロモーター(例、グルココルチコイドまたはテトラサイクリン応答エレメント)をこの構築物に導入することにより、リボザイム発現は選択的に制御され得る。飽和的使用については、高度の構成的活性プロモーターが使用され得る。ｔＤＮＡ遺伝子(すなわち、ｔＲＮＡをコード化する遺伝子)は、それらのサイズが小さく、転写速度が速く、異なる種類の組織において遍在的に発現されることから、この出願では有用である。
【００７０】
したがって、リボザイムは、事実上いかなるｍＲＮＡ配列でも開裂するように常用手順で設計され得、細胞は、制御可能で触媒的に有効な量のリボザイムが発現されるように、上記リボザイム配列をコードするＤＮＡにより常用手順で形質転換され得る。したがって、細胞における事実上いずれのＲＮＡ種の存在量でも、修飾または摂動され得る。
【００７１】
リボザイム配列は、アンチセンスヌクレオチドについて記載した方法と本質的に同様にして修飾され得、例えばリボザイム配列は修飾塩基部分を含み得る。
【００７２】
ＲＮＡアプタマーもまた、細胞へ導入されるかまたは細胞で発現されることにより、ＲＮＡ存在量または活性を修飾し得る。ＲＮＡアプタマーは、タンパク質に特異的なＲＮＡリガンド、例えばそれらの翻訳を特異的に阻害し得るＴａｔおよびＲｅｖ ＲＮＡ(Good et al.、１９９７、Gene Therapy ４：４５−５４)である。
【００７３】
遺伝子発現の遺伝子特異的阻害はまた、慣用的二本鎖ＲＮＡ技術を用いて達成され得る。上記技術に関する記載は国際公開第ＷＯ９９／３２６１９号に見出され得、これを出典明示で援用する。
【００７４】
本発明のアンチセンス分子、三重らせんＤＮＡ、ＲＮＡアプタマーおよびリボザイムは、核酸分子合成についての当業界で公知の方法により調製され得る。これらの例としては、オリゴヌクレオチドを化学合成する技術、例えば固相ホスホルアミダイト化学合成技術がある。別法として、ＲＮＡ分子は、本明細書で検討されているポリペプチドの遺伝子をコード化するＤＮＡ配列のインビトロおよびインビボ転写により生成され得る。上記ＤＮＡ配列は、適切なＲＮＡポリメラーゼプロモーター、例えばＴ７またはＳＰ６を伴う広く多様なベクターへ組込まれ得る。別法として、アンチセンスＲＮＡを構成的または誘導的に合成するｃＤＮＡ構築物が、セルライン、細胞または組織へ導入され得る。
【００７５】
ベクターは、多くの利用可能な手段により細胞または組織へ導入され得、インビボ、インビトロまたはエクスビボで使用され得る。エクスビボ治療については、ベクターを、患者から採取した幹細胞へ導入し、同じ患者へ戻されるオートロガス移植体用にクローン増殖させ得る。トランスフェクションおよびリポソーム注射による送達は、当業界で熟知されている方法を用いて達成され得る。
【００７６】
カテプシンＳの遺伝子発現の上記阻害方法に加えて、小分子または他の天然生成物を同定および使用することにより、限定されるわけではないが、カテプシンＳを含め本明細書で検討されているポリペプチドのインビボ転写を阻害し得ることが本発明では考えられる。例えば、当業者であれば、慣用的方法を用いてセルラインの培養培地からの試料に容易に適用され得るカテプシンＳについての検定法を確立し得るはずである。この検定法を用いて、セルラインをスクリーニングにかけることにより、カテプシンＳを発現するものが見出される。これらのセルラインは、ニューロンに由来すると思われ、例えば９６ウェルプレートで培養される。セルラインにおけるカテプシンＳの調節が脊髄神経節(ＤＲＧ)における発現に接近すると、セルラインにおけるカテプシンＳ発現の小分子修飾因子は同じくインビボＤＲＧにおいてもカテプシンＳを修飾するという可能性が高くなる。一次組織ＤＲＧ外植体およびセルラインに対する遺伝子発現の既知修飾因子、例えばデキサメタゾン、ホルボールエステル、熱ショックの影響を比較することにより、最も使用に適切なセルラインが選択され得る。その場合、スクリーンは、単に、各ウェルに加えられた異なる化合物と共に設定された長さの時間細胞を培養し、次いでカテプシンＳ活性／ｍＲＮＡレベルについて検定することにより構成される。
【００７７】
上記検定法においてカテプシンＳの検出を容易にするために、ルシフェラーゼまたは他の市販の蛍光タンパク質を、カテプシンＳのプロモーターへ適切なマーカータンパク質として遺伝子融合させ得る。カテプシンＳのＡＴＧの上流配列、すなわちカテプシンＳのプロモーターは、ＮＣＢＩゲノム配列に対するＢＬＡＳＴへＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＮＭ＿００４０７９からの配列を用いることによりゲノム配列データから同定され得る。これによって、未知塩基を全く含まないカテプシンＳのＡＴＧの少なくとも５ｋｂ上流が与えられる。ヒトゲノムＤＮＡからの２ｋｂまたはそれより長いフラグメントを増幅するための２対の内側ＰＣＲプライマーは、容易に設計および試験され得る。プロモーターフラグメントは、ヒト細胞での発現用に設計されたプロモーター非随伴リポーター遺伝子ベクター(例、クロンテックのプロモーター非随伴強化蛍光タンパク質ベクターｐＥＣＦＰ−１、ｐＥＧＦＰ−１またはｐＥＹＦＰ)へ容易に挿入され得る。その場合、スクリーンは、各ウェルに加えられた異なる化合物と共に適切な長さの時間細胞を培養し、次いでリポーター遺伝子活性について検定することにより構成される。次いで、以前に記載した慢性疼痛のインビボモデルを用いて、インビボカテプシンＳ活性および／またはｍＲＮＡレベルに対する影響について、有望な化合物を検定する。追加的方法の詳細、例えば適切な培養時間、培養条件、リポーター検定法およびカテプシンＳのインビボ転写の阻害に有用な小分子または他の天然生成物の同定に使用され得る他の方法は、当業者に熟知されている。
【００７８】
さらに、カテプシンＳのｃＤＮＡおよび／またはタンパク質を用いることにより、ＤＲＧまたは神経系における他の組織からのニューロンでカテプシンＳにより修飾される他のタンパク質、例えば受容体が同定され得る。かくして同定されたタンパク質は、慢性疼痛を処置するための薬剤のスクリーニングに使用され得る。カテプシンＳの下流であるこれらの遺伝子を同定するため、例えば、慣用的方法を用い、慢性疼痛モデルにおける動物を特異的カテプシン阻害剤で処置し、動物を殺し、ＤＲＧを摘出し、全ＲＮＡをこれらの細胞から単離し、標準マイクロアレイ検定技術を用いて対照動物(薬剤が全く投与されていない動物)に対して改変されているメッセージレベルを同定し得ることが考えられる。
【００７９】
カテプシンが慢性疼痛状態でアップレギュレーションされるという知識に基づき、慣用的インビトロまたはインビボ検定法を用いることにより、カテプシンＳの過剰発現に至る可能性のある遺伝子が同定され得る。かくして同定された遺伝子によりコード化されるこれらの関連調節性タンパク質を用いることにより、慢性疼痛処置についての強力な治療剤であり得る薬剤がスクリーニングされ得る。例えば、カテプシンＳのプロモーター領域をリポーター遺伝子の上流に置き、構築物を適切なニューロン細胞(例えば、神経芽細胞腫セルライン)へトランスフェクションし、慣用的技術を用い、リポーター遺伝子発現の検出によりカテプシンＳプロモーターの活性化を誘発する上流遺伝子について細胞を検定するという慣用的リポーター遺伝子検定法が使用され得る。
【００８０】
本発明では、慢性疼痛を処置する方法として、慣用的方法にしたがって、例えば、関連調節性タンパク質またはカテプシンＳにより修飾されるタンパク質に対する抗体を設計し、および／または上記タンパク質についての遺伝子にターゲッティングされた阻害性アンチセンスオリゴヌクレオチド、三重らせんＤＮＡ、リボザイムおよびＲＮＡアプタマーを設計することによりこれらのタンパク質についての遺伝子の機能および／または発現を阻害し得ることが考えられる。慢性疼痛処置用の上記阻害性物質を含む医薬組成物もまた考えられる。
【００８１】
慢性神経因性疼痛を含む慢性疼痛の処置および／または改善に有用な本明細書で開示されている医薬組成物は、上記疾患の徴候を処置または改善するために治療有効量で患者に投与されるべきである。治療有効量とは、例えば、McGill疼痛スコア(Melzack,R.Pain(１９７５)９月号、１(３)：２７７−２９９)の使用に基いた慢性疼痛の疼痛徴候の改善をもたらすのに十分な化合物の量をいう。
【００８２】
本発明の阻害性物質は、医薬組成物として投与され得る。本発明にしたがって使用される上記医薬組成物は、１種またはそれ以上の生理学的に許容される担体または賦形剤を用いる慣用的方法で処方され得る。
【００８３】
すなわち、化合物およびそれらの生理学的に許容される塩類および溶媒和物は、吸入法または注入法(口または鼻を通して)による投与または局所、経口、頬側(バッカル)、非経口または直腸投与用に処方され得る。
【００８４】
経口投与用の場合、医薬組成物は、例えば、医薬上許容される賦形剤、例えば結合剤(例、ゼラチン化前トウモロコシ澱粉、ポリビニルピロリドンまたはヒドロキシプロピルメチルセルロース)、充填剤(例、乳糖、微晶性セルロースまたはリン酸水素カルシウム)、滑沢剤(例、ステアリン酸マグネシウム、タルクまたはシリカ)、崩壊剤(例、ジャガイモ澱粉または澱粉グリコール酸ナトリウム)、または湿潤剤(例、ラウリル硫酸ナトリウム)を用いた慣用的手段により製造される錠剤またはカプセル剤の形態を取り得る。錠剤は、当業界で公知の方法によりコーティングされ得る。経口投与用液体調製物は、例えば、溶液、シロップまたは懸濁液の形態を取り得るか、またはそれらは水または他の適切な賦形剤による使用前構成用の乾燥調製物としての形態を取り得る。上記液体調製物は、医薬上許容される添加物、例えば懸濁剤(例、ソルビトールシロップ、セルロース誘導体または硬化食用油脂)、乳化剤(例、レシチンまたはアラビアゴム)、非水性賦形剤(例、落花生油、油性エステル、エチルアルコールまたは分画植物油)、および保存剤(例、メチルまたはプロピル−ｐ−ヒドロキシベンゾエートまたはソルビン酸)を用いた慣用的手段により製造され得る。調製物はまた、適切ならば緩衝塩類、風味改良、着色および甘味剤を含み得る。
【００８５】
経口投与用調製物は、適切には活性化合物の放出制御がなされるように処方され得る。
頬側投与の場合、組成物は、慣用的方法で処方される錠剤またはトローチ剤の形態を取り得る。
【００８６】
吸入による投与の場合、本発明にしたがって使用される化合物は、好都合には、適切な高圧ガス、例えばジクロロジフルオロメタン、トリクロロフルオロメタン、ジクロロテトラフルオロエタン、二酸化炭素または他の適切なガスの使用により、加圧パックまたはネブライザーから放出されるエアゾール噴霧形態で送達される。加圧エアゾールの場合、単位用量は、バルブを取り付けて計量された量を送達することにより決定され得る。吸入器または注入器で使用される例えばゼラチンでできたカプセルおよびカートリッジは、化合物および適切な粉末基剤、例えば乳糖または澱粉の粉末混合物を含むものとして処方され得る。
【００８７】
化合物は、注射による、例えばボーラス注射または連続注入による非経口投与用に処方され得る。注射用処方物は、単位用量形態、例えばアンプルまたは多用量容器形態を呈し得、保存剤が加えられ得る。組成物は、油性または水性賦形剤中の懸濁液、溶液またはエマルジョンといった形態を取り得、処方用薬剤、例えば懸濁、安定および／または分散剤を含み得る。別法として、有効成分は、使用前に適切な賦形剤、例えば滅菌発熱物質不含有水により構成される粉末形態であり得る。
【００８８】
化合物はまた、直腸組成物、例えば慣用的坐剤基剤、例えばカカオバターまたは他のグリセリドを含有する例えば坐剤または停留浣腸として処方され得る。
【００８９】
前記処方物に加えて、化合物はまた、デポー形調製物として処方され得る。かかる長時間作用処方物は、植込み(例えば皮下または筋肉内)により、または筋肉内注射により投与され得る。すなわち、例えば、化合物は、適切なポリマー性または疎水性材料(例えば許容される油中のエマルジョンとして)またはイオン交換樹脂により、または難溶解性誘導体、例えば難溶解性塩として処方され得る。
【００９０】
組成物は、所望ならば、有効成分を含有する１個またはそれ以上の単位用量形態を含み得るパックまたはディスペンサー装置で提供され得る。パックは、例えば金属またはプラスチックホイル、例えばブリスターパックを含み得る。パックまたはディスペンサー装置には、投与に関する使用説明書が添付され得る。
【００９１】
本発明での使用に適切な医薬組成物には、有効成分が意図された目的の達成に有効な量で含有されている組成物が含まれる。有効量の決定は、当業者であれば十分行えることである。
【００９２】
いずれの化合物についても、治療有効量は、例えば新生物細胞の細胞培養検定法、または動物モデル、通常はマウス、ウサギ、イヌまたはブタにおいて最初に評価され得る。動物モデルはまた、適切な濃度範囲および投与経路を決定するのにも使用され得る。ＩＣ５０(すなわち、徴候の半最大阻害を達成する試験化合物の濃度)を含む循環血漿濃度範囲を達成する用量が、動物モデルにおいて処方され得る。次いで、上記情報を用いることにより、ヒトにおける有用な用量および投与経路が決定され得る。
【００９３】
治療有効量とは、慢性疼痛の病的作用を処置および／または改善するのに有用な、有効成分、例えばカテプシンＳ遺伝子発現を阻害するように設計された化合物Ａまたは化合物Ｂ、アンチセンスヌクレオチド、三重らせんＤＮＡ、リボザイム、ＲＮＡアプタマーおよび二本鎖ＲＮＡ、カテプシンＳまたは関連調節性タンパク質に対する抗体またはそのフラグメントの量をいう。治療有効性および毒性は、細胞培養物または実験動物において標準的医薬手順により測定され得、例えばＥＤ５０(集団の５０％で治療上有効な用量)およびＬＤ５０(集団の５０％についての致死用量)がある。毒性作用および治療効果間の用量比は治療指数であり、それはＬＤ５０／ＥＤ５０比として表され得る。大きな治療指数を呈する医薬組成物が好ましい。細胞培養検定法および動物試験から得られたデータは、ヒトで使用する場合の用量範囲を処方するのに使用される。上記組成物に含まれる用量は、好ましくは毒性をほとんどまたは全く伴わず、ＥＤ５０を含む循環濃度の範囲内である。用量は、使用される用量形態、患者の感受性、および投与経路によりこの範囲内で変化する。
【００９４】
正確な用量は、処置を必要とする対象に関する因子を考慮して開業医により決定される。十分なレベルの活性部分を提供するかまたは所望の効果を維持できるように、用量および投与を調節する。考慮され得る因子としては、病状の重さ、対象の全般的健康状態、対象の年齢、体重および性別、食餌療法、投与時間および頻度、薬剤の組み合わせ(複数も可)、反応感受性、および治療に対する耐容性／応答性がある。長時間作用医薬組成物は、特定処方物の半減期およびクリアランス速度により３〜４日ごと、１週間ごと、または２週間ごとに１回投与され得る。
【００９５】
通常の投与量は、投与経路によって、総量約１ｇ以下、０.１〜１０００００マイクログラムの範囲で変わり得る。特定用量および送達方法に関するガイダンスは、文献に提供されており、一般的に当業者に入手できるものである。当業者は、タンパク質またはそれらの阻害剤の場合とは異なるヌクレオチドについての処方物を採用する。同様に、ポリヌクレオチドまたはポリペプチドの送達は、特定細胞、条件、場所などに対して特異的である。タンパク質の経口投与に適切な医薬処方物は、例えば米国特許第５００８１１４、５５０５９６２、５６４１５１５、５６８１８１１、５７００４８６、５７６６６３３、５７９２４５１、５８５３７４８、５９７２３８７、５９７６５６９および６０５１５６１号に記載されている。
【００９６】
以下、実施例により本発明についてさらに説明するが、本発明を限定する意図はないものする。
【実施例】
【００９７】
実施例１
慢性疼痛の動物モデルにおけるカテプシンＳのＲＮＡ単離および発現プロファイリング
慢性疼痛のインビボ動物モデルには、以下のものが含まれる：
慢性炎症性疼痛モデル：
完全フロイントアジュバント誘発機械的痛覚過敏を、慢性炎症性疼痛のモデルとして使用し得る(Stein,C.et al. Pharmacol.Biochem.Behav.(１９８８)３１：４４５−４５１)。このモデルにおいて、典型的には雄スプラーグ‐ドーリーまたはウィスターラット(２００〜２５０ｇ)に対し、一方の後肢に２５μｌ完全フロイントアジュバントの足底内注射をする。著しい炎症がこの後肢で起こる。炎症性障害の２４時間後、機械的痛覚過敏が十分に確立されたと考えられる時点で、効力を評価するため薬剤を全身投与する。
【００９８】
慢性神経因性疼痛モデル：
何らかの形態の末梢神経損傷を伴う慢性神経因性疼痛の２動物モデルが使用され得る。Seltzerモデル(Seltzer et al.(１９９０)Pain ４３：２０５−２１８)では、ラットに麻酔をかけ、片方の大腿部(通常左)までの中ほどを小さく切開して、坐骨神経を露出させる。後方二頭筋半腱様神経が総坐骨神経から枝分かれする地点に対しちょうど遠位にある転子付近の部位における周囲結合組織から注意深く神経を取り除く。３／８曲線状逆切断(reversed-cutting)小針で７−０絹縫糸を神経に挿入し、神経の厚みの背側１／３〜１／２が結紮糸内で保持されるように堅く結紮する。筋肉および皮膚を縫合糸およびクリップで閉じ、創傷に抗生物質粉末を振り掛ける。シャム(sham、偽手術)動物では、坐骨神経を暴露させるが、結紮はせず、非シャム動物の場合と同様に創傷を閉じる。
【００９９】
慢性緊縛(ＣＣＩ)モデル(Bennett,G.J.およびXie,Y.K. Pain(１９８８)３３：８７−１０７)では、ラットに麻酔をかけ、片方の大腿部(通常左)までの中ほどを小さく切開して、坐骨神経を露出させる。周囲結合組織から神経を取り除き、４／０クロムガットの４本の結紮糸を各々約１ｍｍあけて神経の周囲を緩く縛ることにより、結紮糸が辛うじて神経表面を圧迫するようにする。上記と同様に創傷を縫合糸およびクリップで閉じる。シャム動物では、坐骨神経を暴露させるが、結紮はせず、非シャム動物の場合と同様に創傷を閉じる。
【０１００】
SeltzerおよびＣＣＩモデルとは対照的に、Chungモデルは脊髄神経の結紮を含む(Kim,S.O.およびChung,J.M. Pain(１９９２)：５０：３５５−３６３)。このモデルでは、ラットに麻酔をかけ、うつ伏せにして置き、Ｌ４−Ｓ２レベルで脊椎の左を切開する。傍脊椎筋肉を通して深い切れ込みを入れ、Ｌ４−Ｓ２レベルで棘状突起から筋肉を分離すると、坐骨神経の一部が現れ、それは枝分かれしてＬ４、Ｌ５またはＬ６脊髄神経を形成している。Ｌ６横突起を注意深く小骨鉗子で取り出し、これらの脊髄神経が見えるようにする。Ｌ５神経を単離し、７−０絹糸で固く結紮する。創傷を単一筋肉結紮(６−０絹)および１または２個の皮膚閉鎖クリップで閉じ、抗生物質粉末を振り掛ける。シャム動物では、Ｌ５神経を暴露させるが、結紮はせず、前記と同様に創傷を閉じる。
【０１０１】
行動指数
全慢性疼痛モデル(炎症性および神経因性)において、無痛覚計(ウゴ−バシーレ、ミラノ)を用いて増圧的刺激に対する両後肢の逃避閾値を測定することにより機械的痛覚過敏を評価する。両後肢の足底表面にフライ毛で適用した非有害性機械的刺激に対する逃避閾値を測定することにより、機械的異痛を評価する。各後肢の下側に適用した非有害性熱刺激に対する逃避潜伏期間を測定することにより、熱痛覚過敏を評価する。全モデルとも、機械的痛覚過敏および異痛および熱痛覚過敏は、術後１〜３日以内に現れ、少なくとも５０日間持続する。本明細書記載の検定法においては、薬剤を術前および術後に適用することにより痛覚過敏の発現に対するそれらの効果を評価し、特に手術の約１４日後、確立された痛覚過敏を除去するそれらの能力が測定され得る。
【０１０２】
痛覚過敏の除去パーセントは、以下の要領で計算される：
除去％＝{(投与後閾値−投与前閾値)／(無経験閾値−投与前閾値)}×１００
【０１０３】
本明細書に開示されている実験では、ウィスターラット(雄)を上記疼痛モデルで使用する。ラットは手術時点で約１２０〜１４０グラムの重さである。エンフルラン／Ｏ２吸入麻酔下で全手術を遂行する。全ての場合において、術後に創傷を閉じ、動物を回復させる。使用された全疼痛モデルにおいて、数日後偽手術動物以外は全て、著しい機械的および熱痛覚過敏および異痛を発現し、その結果、疼痛閾値の低下が生じ、接触、加圧または熱刺激に対する後肢の反射逃避応答の高まりが見られる。術後、動物はまた罹患した足に特徴的な変化を呈する。動物の大多数において、罹患した後肢のつま先は縮こまり、足は一方へ僅かにそれている。中には、つま先が下へねじ曲げられているラットもいる。結紮されたラットの歩き方は変化しているが、びっこは稀である。中には、罹患した後肢をケージの床から上げ、支えたとき後肢の異常な硬直伸展を示すラットも見られる。ラットは接触に対し非常に敏感になる傾向があり、声を出し得る。他の点では、ラットの全般的健康状態は良好である。
【０１０４】
慢性神経因性疼痛モデルにされたラットから摘出したＤＲＧからのＲＮＡ抽出(Selzer、ＣＣＩおよびChung)：
神経損傷と同側のＬ４およびＬ５ ＤＲＧを、標準的方法にしたがって神経因性疼痛のラットモデルから手術の１４、２１および５０日後に切開する。次いで、酸性グアニジニウムチオシアネート−フェノール−クロロホルム抽出方法(ChomczynskiおよびSacchi Anal.Biochem.、(１９８７)１６２：１５６−１５９；Chomczynski,P.、Biotechniques、１５：５３２−５３７(１９９３))にしたがって、全ＲＮＡ試料を切開したＤＲＧ組織から調製する。収率は、１ＤＲＧにつき約１μｇの総ＲＮＡである。逆転写(プライマー：T7prFB 5'-aaacgacggcacttcgaaattaatacgactcactatagggagacc.t30-3')および総ＲＮＡ試料からのビオチン標識プローブの調製は、慣用的方法にしたがって実施される(Lockhart DJ et al. Nat Biotechnol.１４：１６７５−８０(１９９６)；Mahadevappa M、Warrington JA.、Nat Biotechnol. １７：１１３４−６(１９９９))。５μｇの総ＲＮＡは、おおよその収率１５〜３５μｇの標識ビオチンＲＮＡである。各標識ＲＮＡを、標準方法を用いて２つのアフィメトリックス・ラットＵ３４Ａジーンチップにハイブリダイズさせる。次いで、アフィメトリックス・ジーンチップソフトウェアを用いて画像を分析することにより、ＲＮＡ発現レベルの測定値として正規化平均差異数値が得られる(アフィメトリックス、サンタクララ、カリフォルニア)。テキストファイルとしてデータをエクスポート後、データを分析する。
【０１０５】
表１は、アフィメトリックスＲＮＡプロファイリング実験から任意単位で(()内に標準偏差を付す)測定されたカテプシンＳの相対ｍＲＮＡレベルを要約している(Ｎ.Ｄ.：測定されず)。データは、カテプシンＳメッセンジャーＲＮＡが、ＣＣＩモデルでは１４および２１日目およびSeltzerモデルでは１４、２１および５０日目にシャム均等物に対してアップレギュレーションされることを示す。これらの時点は、神経因性痛覚過敏が十分に確率さえ、永続的であるときの条件を反映している。
【０１０６】
表１
カテプシンＳ ｍＲＮＡは、慢性神経因性疼痛の動物モデルにおいてアップレギュレーションされる。
【表１】
カテプシンＳは、ヒトＤＲＧで発現される：
ヒトカテプシンＳ配列(Ｇｅｎｂａｎｋ受入番号ＮＭ００４０７９)を用いて、正規化ヒトＤＲＧ ｃＤＮＡライブラリー(ギブコＢＲＬ、ロックビル、メリーランド、米国)からの６００００クローンを配列決定することにより構築された専有配列データベースを検索した。２つのクローン、fga0000208999 および fga00000206288は、ＮＭ００４０７９と同一の配列を有する。したがって、カテプシンＳはまたヒトＤＲＧで発現されるという結論に達し得る。しかしながら、カテプシンＳがヒトＤＲＧで発現されることを確認するため、リアルタイムＰＣＲを以下の手順にしたがって遂行する。
【０１０８】
ＧｅｎｂａｎｋからのヒトカテプシンＳ遺伝子の配列(受入番号ＮＭ００４０７９)に基いて、リアルタイムＰＣＲ用の２対のプライマーを設計する。
【表２】
オリゴヌクレオチドをシグマ−ジェノシス(ザ・ウッドランズ、テキサス)により製造する。正常ヒトＤＲＧからの総ＲＮＡを、ジーンウィズ・インコーポレイテッド(ニューヨーク、ニューヨーク)から入手する。総ＲＮＡからのｃＤＮＡの合成は、ＰＥアプライド・バイオシステムズ(フォスターシティー、カリフォルニア)からのＴａｑＭａｎ逆転写試薬キット(パート番号Ｎ８０８−０２３４)を用いて製造業者のプロトコルに従って遂行される。各１００μｌ反応物は、２μｇの総ＲＮＡ、１×ＴａｑＭａｎＲＴ緩衝液、５.５ｍＭのＭｇＣｌ２、５００μＭの各ｄＮＴＰ、２.５μＭのランダム６量体、０.４Ｕ／μＬのリボヌクレアーゼ阻害剤、および１.２５Ｕ／μＬのＭｕｌｔｉＳｃｒｉｂｅ逆転写酵素を含む。反応物を２５℃で１０分間、４８℃で４５分間、次いで７５℃で５分間インキュベーションする。
【０１１０】
ＰＥアプライド・バイオシステムズ(フォスターシティー、カリフォルニア)からのＳＹＢＲグリーンＰＣＲコア試薬キット(パート番号４３０４８８６)を用い、製造業者のプロトコルに従って定量的ＰＣＲを遂行する。ＰＥアプライド・バイオシステムズからのＡＢＩ Ｐｒｉｓｍ７７００配列検出システムを用いて、インキュベーションおよび検出を行う。各５０μＬ反応物は、上記逆転写反応からの鋳型ｃＤＮＡ５μＬ、１×ＳＹＢＲグリーンＰＣＲ緩衝液、３ｍＭのＭｇＣｌ２、２００μＭのｄＡＴＰ、２００μＭのｄＣＴＰ、２００μＭのｄＧＴＰ、４００μＭのｄＵＴＰ、０.０２５Ｕ／μＬのＡｍｐｌｉＴａｑ Ｇｏｌｄ、０.０１Ｕ／μＬのＡｍｐＥｒａｓｅ ＵＮＧ、および５０ｎＭの各前進および逆プライマーを含む。反応物を５０℃で２分間、９５℃で１０分間、次いで４０サイクルの９５℃で１５秒間および６０℃で１分間によりインキュベーションする。
【０１１１】
転写物を両プライマー対により少なくとも７.８サイクル検出できるように増幅した後、転写物は「逆転写酵素無し」対照で検出される。
【表３】
ＰＣＲ増幅生成物を、慣用的方法にしたがってアクリルアミドゲルで分析する。両「＋逆転写酵素」反応により、予想通り１０１ｂｐ長である単一バンドが生じた。これらのデータは、カテプシンＳがヒトＤＲＧで検出できるように発現されることを確認している。
【０１１３】
実施例２
慢性疼痛の動物モデルにおけるカテプシン阻害剤の治療効果：化合物Ｂ
カテプシンＳが慢性神経因性疼痛の動物モデルでアップレギュレーションされることを示すデータに基づき、インビトロでカテプシンＳを含むシステインおよびセリンプロテアーゼを阻害することが知られている(米国特許第４５１８５２８号)、上記要領で製造された３−[(４−モルホリニルカルボニル)−フェニルアラニルアミド]−１−フルオロ−５−フェニル−２−ペンタノン(化合物Ｂ)の能力を、慢性疼痛モデルにおいて誘発された病的作用を除去するその能力について試験した。
【０１１４】
上記ＣＣＩ慢性疼痛モデルにしたがって、ラットを外科的処理にかけた。手術前、痛覚過敏が確立された１４日後、次いで化合物Ｂの単一経口胃管栄養量投与の１、３および６時間後に足の逃避閾値を測定する。結果を下記表２に示す。各時点は、１群につき６動物から得られたデータを表す。賦形剤対照：ＰＥＧ／メチルセルロース(０.５％)＋トウィーン８０(０.２５％)(２０：８０)、１ｍｌ(経口)。
【０１１５】
表２
慢性神経因性疼痛のＣＣＩモデルにおいて確立された機械的痛覚過敏に対する化合物Ｂの効果：単一１日経口用量
投与前痛覚過敏の除去％
【表４】
本明細書に開示されているデータは、化合物Ｂが、投与後１時間で、３０〜１００ｍｇ／ｋｇの範囲におけるＤ５０で用量依存的に神経因性疼痛のＣＣＩモデルにおいて誘発された機械的痛覚過敏を除去し得、１００ｍｇ／ｋｇで７０％までの除去％を呈することを示す。追加試験によると、化合物Ｂはまた、痛覚過敏モデルの発現中終始１日２回、３０ｍｇ／ｋｇの経口投与でＣＣＩモデルにおける機械的痛覚過敏の除去に急速な有効性を呈することが示されている(表３)。１日２回試験では、術前、次いで毎日化合物Ｂによる第２経口投与の３時間後に、足の逃避閾値を測定した。最終用量は、１３日目に投与された。表３における各時点は、１群につき６動物からのデータを表す。賦形剤対照：ＰＥＧ／メチルセルロース(０.５％)＋トウィーン８０(０.２５％)(２０：８０)、１ｍｌ(経口)。
【０１１７】
興味深いことに、１５日目についてのデータは、このシステインカテプシン阻害剤による処置を終結後に痛覚過敏が再発することを示していることから、阻害剤は痛覚過敏の発現に影響しないことが示唆される。
【０１１８】
表３
慢性神経因性疼痛のＣＣＩモデルにおいて確立された機械的痛覚過敏に対する化合物Ｂの効果：１日２回経口投与
【表５】
試験はまた、化合物Ｂが、慢性炎症性疼痛のＦＣＡ誘導モデルにおけるラットで誘発された機械的痛覚過敏を誘導の２４時間後に除去するが、慢性神経因性モデルで見られるよりは除去の度合が劣る(１００ｍｇ／ｋｇ経口で最大除去４６％、データは示さず)ことを示している。カテプシンＳ ｍＲＮＡレベルは、慢性炎症性疼痛モデルでは検定されていないが、慢性炎症性疼痛モデルにおけるカテプシンＳ阻害剤の効力は、カテプシンＳ阻害剤、例えば本明細書開示のものが、慢性炎症性疼痛の処置および／または改善に有効な治療剤であることを示している。
【０１２０】
化合物ＢがカテプシンＳ、ＫまたはＬの１種またはそれ以上に作用していることはあり得るが、カテプシンＫおよびＬ阻害剤による試験は、これらの特定タイプのカテプシン阻害剤が慢性疼痛の動物モデルで誘発された痛覚過敏の除去に有効ではないことを示しているため(我々の未公開データ)、慢性疼痛モデルにおいて痛覚過敏を低減化するその能力は、おそらくそのカテプシンＳ活性を阻害する能力によるものと思われる。すなわち、化合物Ｂを含む医薬組成物を使用することにより、慢性疼痛が処置され得る。
【０１２１】
実施例３
慢性疼痛の動物モデルにおけるカテプシンＳ阻害剤の治療効果：化合物Ａ
慢性疼痛モデルで誘発された病的作用の除去に対する別の混合カテプシン阻害剤、化合物Ａまたは[７−(２,２−ジメチル−プロピル)−６−チオフェン−２−イルメチル−７.Ｈ.−ピロロ[２,３−.ｄ.]ピリミジン−２−カルボニトリル]の能力についても試験した。慢性神経因性疼痛のSeltzerモデルから得られたデータは、この化合物が、３〜１０ｍｇ／ｋｇ間のＤ５０で痛覚過敏を除去し得ることを示している(表４)。
【０１２２】
表４
慢性神経因性疼痛のSeltzerモデルにおいて確立された機械的痛覚過敏に対する化合物Ａの効果：単一経口用量
【表６】
上記と同様、この実験におけるラットを、ＣＣＩ慢性疼痛モデルにしたがって外科的処置にかける。術前、痛覚過敏が確立された14日後、次いで化合物Ａによる単一経口投与後に、足の逃避閾値を測定する。各時点は、１群につき６動物から得られたデータを表す。賦形剤対照：ＰＥＧ／メチルセルロース(０.５％)＋トウィーン８０(０.２５％)(２０：８０)、１ｍｌ(経口)。
【０１２４】
化合物Ａは、混合カテプシンＳ／Ｋ阻害活性を有する。データは、特異的カテプシンＫ阻害剤並びにカテプシンＫおよびＬに対する阻害作用をもつ化合物が両方とも神経因性疼痛モデルにおいて痛覚過敏を除去し得ないこと(我々の未公開データ)を示しているため、化合物Ａによる強力な痛覚過敏除去効果は、カテプシンＳの阻害によるものであり、すなわちこの酵素が慢性神経因性疼痛および慢性炎症性疼痛についての治療標的であることを証明している。
【０１２５】
実施例４
酵素活性のインビトロ検定法
上記で検討したところによると、慢性疼痛に対する潜在的治療有用性をもつ化合物を同定するため、カテプシンＳ活性に対する効果が未知である候補化合物をまず検定にかけることにより、この酵素の活性に対する効果が測定され得る。カテプシンＳ酵素活性については、慣用的方法、例えば蛍光および他の基質を用いた多くのスクリーニング方法がある。下記検定法は、クエンチングされた蛍光ペプチド基質を用いる均一プレート検定法である。酵素によるペプチドの開裂により、蛍光生成物が生じる。蛍光発生の阻害は、酵素の不活性、すなわち化合物の効力を示すものである。
【０１２６】
酵素は、慣用的方法にしたがってバクロウイルスまたは酵母で発現され、精製され、休眠形態(３.８μＭ)で冷凍貯蔵された組換えヒトカテプシンＳ(ノヴァリティス・ファーマシューティカルズ・コーポレーション、サミット、ニュージャージー)である。
【０１２７】
検定当日、酵素を検定緩衝液(８８ｍＭのＫＨ２ＰＯ４、１２ｍＭのＮａ２ＨＰＯ４、１.３３ｍＭのＥＤＴＡ、２.７ｍＭのＤＴＴ、０.０３％のブリージ、ｐＨ５.８)中での１：６００希釈により活性化し、次いで氷上で３０分インキュベーションする。活性化された酵素を１６００ｐＭで直接使用する。Ｚ−ｖａｌ−ｖａｌ−ａｒｇ−ＡＭＣ(５０ｍｇ、ベイケム、キングオブプルージア、ペンシルベニア、Ｉ−１５４０)、カテプシンＳ基質を、１２.６ｍｌのＤＭＳＯに溶かして、６ｍＭの最終濃度とする。次いで、これを検定緩衝液で希釈することにより、１５０μＭの最終濃度とする。検定プレートへ加える時点で基質は最終１：４希釈で存在する。使用される基質の濃度は、酵素についてのＫＭより２〜５倍高いことに基いている。
【０１２８】
試験化合物ストック、ＤＭＳＯ中の５０または１０ｍＭを、１ｍＭ作業溶液用にＤＭＳＯ中でそれぞれ１：５０または１：１０に希釈する(または試験すべき化合物によっては検定緩衝液で必要に応じて希釈することにより、作業溶液を生成する)。
【０１２９】
これらの成分を以下の順序で加えることにより検定を室温で実施する：
１)試験化合物：１００μｌの作業溶液
２)基質：５０μｌの作業溶液
３)酵素：５０μｌの作業溶液
内部対照基準化合物(すなわち、既知カテプシンＳ阻害剤)を各プレートで使用する。
【０１３０】
全試薬を検定プレートに加えた後、プレート(黒色９６ウェル、コスター(登録商標)、コーニング・インコーポレイテッド、コーニング、ニューヨーク)を、慣用的方法にしたがって、λｅｘ３４０およびλｅｍ４００で、蛍光プレート読取装置(フレックスステーション、モレキュラー・ディヴァイシーズ・コーポレーション、サニーベール、カリフォルニア)で読み取る。データを５分ごとに６０分間までの間集める。１セットのデータのみ、試験化合物の阻害パーセントまたはＩＣ５０の計算に使用する。これは、予測されるＩＣ５０に最も近い内部対照標準を含むデータセットに基いて選択される。これは、典型的には１５〜２０分の間である。内部対照基準が平均値の２ＳＤの上または下である場合、得られたデータは、化合物阻害受容力の計算には使用されない。
【０１３１】
このプレート方法は、高スループットスクリーニングに理想的に適している。この検定法はＤＭＳＯに対し感受性があることに注意すべきである。すなわち、基質および試験化合物の製造において、最終検定混合物中で使用されるＤＭＳＯは厳密に３％未満とすべきである。
【０１３２】
実施例５
カテプシンＳに対するアンチセンスオリゴヌクレオチド
カテプシンＳの発現を含む遺伝子発現の阻害に有用なアンチセンスオリゴヌクレオチド(ＡＳＯ)は、慣用的方法にしたがって調製され得る。さらに、例えば以下の追加的方法も使用され得る。
【０１３３】
ＡＳＯの合成：
カテプシンＳに対するＡＳＯは、ＭＯＥ(メトキシエトキシ)基で両端が修飾されたヌクレオチドによる完全チオリン酸化または完全ホスホジエステル１８量体であり得る。これらは、ホスホルアミダイト化学作用を用いて合成され、ＨＰＬＣ精製され、慣用的方法によるエレクトロスプレー質量分析法および毛管ゲル電気泳動法により特性検定され得る。各々ＧＣ含有率が３８と７２％の間であるＡＳＯを選択し、例えばラットまたはヒトカテプシンＳのコーディング領域の一部と相補的であるように合成し得る。誤対合含有対照オリゴヌクレオチドの場合、対合オリゴヌクレオチドの適切な塩基組成が維持され得る。さらに、２つの対照ＡＳＯ、例えばラットＧＡＰＤＨコーディング領域についてのＡＳＯおよび第２ランダム合成ＡＳＯが選択され得る。抗ラット−ＧＡＰＤＨオリゴヌクレオチドのフォーマットは、抗カテプシンＳオリゴヌクレオチドの場合と同じであり得る。合成オリゴヌクレオチドは、中間にチオリン酸またはホスホジエステルＤＮＡ残基をもつ配列の両端にそのＭＯＥリボヌクレオチド修飾を有し得る。
【０１３４】
トランスフェクションプロトコル
トランスフェクションの２４時間前、１ウェル当たり２ｍｌの量(Ｆ１２栄養素混合物(ＤＭＥＭ)、１００単位／ミリリットルのペニシリン、１ミリリットルにつき１００マイクログラムのストレプトマイシン、２ミリモルのＬ−グルタミン、１０％の胎児ウシ血清(ギブコ−ＢＲＬ、ロックビル、メリーランド))で２×１０５細胞、例えばチャイニーズ・ハムスター卵巣細胞(ＩＣＮファーマシューティカルズ・リミテッド、ベイシングストーク、ハンプシャー、英国)を、６ウェルプレートへ平板培養し、５％ＣＯ２中で培養して培養飽和密度の７０〜８０％に到達させ得る。トランスフェクション当日、リポフェクチン(登録商標)を血清不含有ＯｐｔｉＭＥＭ(ギブコ−ＢＲＬ、ロックビル、メリーランド)へ希釈し(１ｍｌのＯｐｔｉＭＥＭ中へ１００ｎＭの所望の最終オリゴヌクレオチド濃度につきリポフェクチン(登録商標)３マイクロリットル)、室温で１５分間インキュベーションすることにより、２倍ストックトランスフェクション溶液を調製する。次いで、この溶液を、ＯｐｔｉＭＥＭ中に所望の最終量のＡＳＯを２倍含む２倍ＡＳＯ溶液と１：１で合わせる。トランスフェクション混合物を室温で１５分間インキュベーションしてトランスフェクション複合体を形成させた後、細胞の予め吸引されたウェルの各々に２ｍｌを加える。リポフェクチン(登録商標)試薬のみの対照および正常細胞対照(未処理)もまた含まれ得る。３７℃で４時間インキュベーション後、ＭＥＭ(ギブコ−ＢＲＬ)中における５０％ＦＢＳ ５００マイクロリットルを各ウェルに加え、最終ＦＢＳ濃度を１０％にする。次いで、培養物を、ｍＲＮＡ採取の場合２４時間またはタンパク質採取および電気生理現象については４８時間５％ＣＯ２による加湿インキュベーター中３７℃でインキュベーションする。
【０１３５】
リアルタイム定量的ＰＣＲ ｍＲＮＡ分析：
全ＲＮＡをＲＮｅａｓｙ９６キット(キアゲン、ＧｍＢＨ、ドイツ国)により製造業者のプロトコルに従って単離し得る。ＲＮＡ試料を個々に１ｎｇ／Ｌに希釈する。次いで、各試料につき５ナノグラムのＲＮＡを、遺伝子特異的検出プライマー(当業者により容易に決定される)およびリアルタイム定量的ＰＣＲ反応キットＰＬＡＴＩＮＵＭ(登録商標)定量的ＲＴ−ＰＣＲ ＴＨＥＲＭＯＳＣＲＩＰＴ(登録商標)１段階システム(ギブコ−ＢＲＬ、ロックビル、メリーランド)からの適切な試薬と混合し、製造業者のプロトコルに従って実施する。適切な配列をもつラットカテプシンＳプライマーは、ＰＥバイオシステムズから購入され得る。ＧＡＰＤＨは、比較用の対照遺伝子として選択され得る。同じＲＮＡ試料を、ＴａｑＭａｎ(登録商標)げっ歯類ＧＡＰＤＨ対照試薬キット(ＰＥバイオシステムズ)からのラットＧＡＰＤＨプライマーにより実施し得る。配列特異的蛍光発生シグナルは、ＡＢＩ ＰＲＩＳＭ(登録商標)７７００配列検出装置(ＰＥアプライド・バイオシステムズ、フォスターシティー、カリフォルニア)を用いて検出され得る。試料と一緒に、純粋な鋳型ｍＲＮＡの希釈液からの標準について実施することにより、総ＲＮＡの挿入量に対する絶対濃度を得る。
【０１３６】
神経因性疼痛の動物モデルにおけるカテプシンＳアンチセンスの試験：
ラット(例、ウィスター)において、慣用的方法にしたがってミニポンプデリバリーシステムに取り付けられたカテーテルで脊髄の腰部または胸部領域にカニューレを鞘内挿入し得る。アンチセンス、ミスセンス、オリゴまたは賦形剤を所望の濃度で７日までの間送達することにより、脊髄および脊髄神経節内の細胞体にオリゴまたは賦形剤を取込ませ得る。神経損傷は、本明細書記載の疼痛モデルにしたがってカニューレ挿入の前または後に実施され得る。機械的痛覚過敏、異痛などを通常方法で測定することにより、痛覚過敏の除去におけるカテプシンＳアンチセンスオリゴヌクレオチドの効果が評価され得る。
Claims (44)
- 慢性疼痛の処置または改善方法であって、処置または改善を必要とする対象にカテプシンＳモジュレーターの有効量を投与することを含む方法。
- 慢性疼痛が慢性神経因性疼痛である、請求項１記載の方法。
- カテプシンＳモジュレーターが、対象においてカテプシンＳの酵素活性を阻害する、請求項１記載の方法。
- カテプシンＳモジュレーターが、対象においてカテプシンＳ遺伝子発現を阻害する、請求項１記載の方法。
- カテプシンＳモジュレーターが、Ｎ−ヘテロアリール−カルボニトリルカテプシン阻害剤と称される化合物の種類に属する化合物である、請求項１記載の方法。
- モジュレーターが、[７−(２,２−ジメチル−プロピル)−６−チオフェン−２−イルメチル−７.Ｈ.−ピロロ[２,３−.ｄ.]ピリミジン−２−カルボニトリル]の遊離または医薬上許容される塩形態である、請求項１記載の方法。
- モジュレーターが、３−[(４−モルホリニルカルボニル)フェニルアラニルアミド]−１−フルオロ−５−フェニル−２−ペンタノンである、請求項１記載の方法。
- モジュレーターが、アンチセンスオリゴヌクレオチド、三重らせんＤＮＡ、リボザイム、ＲＮＡアプタマーおよび二本鎖ＲＮＡから成る群から選択される１種またはそれ以上の物質を含み、物質がカテプシンＳ遺伝子発現を阻害するように設計されている、請求項１記載の方法。
- モジュレーターが、カテプシンＳに対する１種またはそれ以上の抗体またはそのフラグメントを含み、抗体またはそのフラグメントがカテプシンＳ酵素活性を阻害し得る、請求項１記載の方法。
- 慢性疼痛の処置または改善方法であって、処置または改善を必要とする対象にカテプシンＳモジュレーターの有効量を含む医薬組成物を投与することを含む方法。
- 慢性疼痛が慢性神経因性疼痛である、請求項１０記載の方法。
- カテプシンＳモジュレーターが、対象においてカテプシンＳの酵素活性を阻害する、請求項１０記載の方法。
- カテプシンＳモジュレーターが、対象においてカテプシンＳ遺伝子発現を阻害する、請求項１０記載の方法。
- カテプシンＳモジュレーターが、Ｎ−ヘテロアリール−カルボニトリルカテプシン阻害剤と称される化合物の種類に属する化合物である、請求項１０記載の方法。
- モジュレーターが、[７−(２,２−ジメチル−プロピル)−６−チオフェン−２−イルメチル−７.Ｈ.−ピロロ[２,３−.ｄ.]ピリミジン−２−カルボニトリル]の遊離または医薬上許容される塩形態である、請求項１０記載の方法。
- モジュレーターが、３−[(４−モルホリニルカルボニル)フェニルアラニルアミド]−１−フルオロ−５−フェニル−２−ペンタノンである、請求項１０記載の方法。
- モジュレーターが、アンチセンスオリゴヌクレオチド、三重らせんＤＮＡ、リボザイム、ＲＮＡアプタマーおよび二本鎖ＲＮＡから成る群から選択される１種またはそれ以上の物質を含み、物質がカテプシンＳ遺伝子発現を阻害するように設計されている、請求項１０記載の方法。
- モジュレーターが、カテプシンＳに対する１種またはそれ以上の抗体またはそのフラグメントを含み、抗体またはそのフラグメントがカテプシンＳ酵素活性を阻害し得る、請求項１０記載の方法。
- 慢性疼痛の処置または改善に有用なモジュレーターの同定方法であって、候補モジュレーターがカテプシンＳ活性を阻害する能力について検定することを含む方法。
- さらに、同定されたカテプシンＳ阻害性モジュレーターが、慢性疼痛の動物モデルにおいて、および／または慢性疼痛を伴う対象による臨床試験において観察される病的作用を除去する能力について検定することを含む、請求項１９記載の方法。
- 慢性疼痛が慢性神経因性疼痛である、請求項１９記載の方法。
- 慢性疼痛の処置または改善に有用なモジュレーターの同定方法であって、候補モジュレーターがカテプシンＳ遺伝子発現を阻害する能力について検定することを含む方法。
- さらに、同定された阻害性モジュレーターが、慢性疼痛の動物モデルにおいて、および／または慢性疼痛を伴う対象による臨床試験において観察される病的作用を除去する能力について検定することを含む、請求項２２記載の方法。
- 慢性疼痛が慢性神経因性疼痛である、請求項２２記載の方法。
- 処置または改善を必要とする対象において慢性疼痛を処置または改善するのに有効な量でカテプシンＳモジュレーターを含む医薬組成物。
- 慢性疼痛が慢性神経因性疼痛である、請求項２５記載の医薬組成物。
- モジュレーターがカテプシンＳの酵素活性を阻害する、請求項２５記載の医薬組成物。
- モジュレーターがカテプシンＳ遺伝子発現を阻害する、請求項２５記載の医薬組成物。
- モジュレーターが、Ｎ−ヘテロアリール−カルボニトリルカテプシン阻害剤と称される化合物の種類に属する化合物である、請求項２５記載の医薬組成物。
- モジュレーターが、[７−(２,２−ジメチル−プロピル)−６−チオフェン−２−イルメチル−７.Ｈ.−ピロロ[２,３−.ｄ.]ピリミジン−２−カルボニトリル]の遊離または医薬上許容される塩形態である、請求項２５記載の医薬組成物。
- モジュレーターが、３−[(４−モルホリニルカルボニル)−フェニルアラニルアミド]−１−フルオロ−５−フェニル−２−ペンタノンである、請求項２５記載の医薬組成物。
- モジュレーターが、アンチセンスオリゴヌクレオチド、三重らせんＤＮＡ、リボザイム、ＲＮＡアプタマーおよび二本鎖ＲＮＡから成る群から選択される１種またはそれ以上の物質を含み、物質がカテプシンＳ遺伝子発現を阻害するように設計されている、請求項２５記載の医薬組成物。
- モジュレーターが、カテプシンＳに対する１種またはそれ以上の抗体またはそのフラグメントを含み、抗体またはそのフラグメントがカテプシンＳ酵素活性を阻害し得る、請求項２５記載の医薬組成物。
- カテプシンＳモジュレーターによる処置についての適切な候補であり得る慢性疼痛罹患対象の診断方法であって、上記対象からの生物学的試料においてこのタンパク質のｍＲＮＡレベルを検定することを含み、対照と比べてレベルが増加した対象がカテプシンＳモジュレーター処置についての適切な候補である方法。
- カテプシンＳモジュレーターによる処置についての適切な候補であり得る慢性疼痛罹患対象の診断方法であって、上記対象からの生物学的試料においてこのタンパク質のレベルを検出することを含み、対照と比べてレベルが増加した対象がカテプシンＳモジュレーター処置についての適切な候補である方法。
- 慢性疼痛の処置または改善方法であって、
(ａ)対象においてカテプシンＳｍＲＮＡおよび／またはタンパク質レベルについて検定し、そして
(ｂ)対照と比べてカテプシンＳｍＲＮＡレベルおよび／またはタンパク質レベルが増加した対象に、慢性疼痛の病的作用を処置または改善するのに十分な量でカテプシンＳモジュレーターを投与する
ことを含む方法。 - 慢性疼痛が慢性神経因性疼痛である、請求項３６記載の方法。
- 生物学的試料におけるカテプシンＳのｍＲＮＡレベルおよび／またはタンパク質レベル検出用診断キットであって、
(ａ)カテプシンＳのポリヌクレオチドまたはそのフラグメント、
(ｂ)(ａ)の配列に相補的なヌクレオチド配列、
(ｃ)カテプシンＳポリペプチド、またはそのフラグメント、または
(ｄ)カテプシンＳポリペプチドに対する抗体
を含み、成分(ａ)、(ｂ)、(ｃ)または(ｄ)が実質的成分を構成し得るキット。 - 慢性疼痛処置用医薬の製造についてのカテプシンＳモジュレーターの使用。
- 請求項３９記載の使用に供されるカテプシンＳモジュレーターあって、抗カテプシンＳ抗体であるモジュレーター。
- モジュレーターが、アンチセンスオリゴヌクレオチド、三重らせんＤＮＡ、リボザイム、ＲＮＡアプタマーおよび二本鎖ＲＮＡから成る群から選択される物質であり、物質がカテプシンＳ遺伝子発現を阻害するように設計されている、請求項３９記載の使用に供されるカテプシンＳモジュレーター。
- モジュレーターが、Ｎ−ヘテロアリール−カルボニトリルカテプシン阻害剤である、請求項３９記載の使用に供されるカテプシンＳモジュレーター。
- モジュレーターが、７−(２,２−ジメチル−プロピル)−６−チオフェン−２−イルメチル−７.Ｈ.−ピロロ[２,３−.ｄ.]ピリミジン−２−カルボニトリルである、請求項３９記載の使用に供されるカテプシンＳモジュレーター。
- モジュレーターが、３−[(４−モルホリニルカルボニル)−フェニルアラニルアミド]−１−フルオロ−５−フェニル−２−ペンタノンである、請求項３９記載の使用に供されるカテプシンＳモジュレーター。
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Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2013224307A (ja) * | 2006-04-10 | 2013-10-31 | Fusion Antibodies Ltd | 治療法 |
| JP2011526143A (ja) * | 2008-03-26 | 2011-10-06 | サノフィ−アベンティス | カテプシンｃの使用 |
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