KR20160119369A - 뇌종양 줄기세포의 분화 및 전이 조절을 위한 ｒｏｒ１의 약제학적 용도 - Google Patents

Abstract

본 발명은 뇌종양 줄기세포의 분화 및 전이 조절을 위한 ROR1의 약제학적 용도에 관한 것으로, 보다 상세하게는, ROR1는 암세포 대비 뇌종양 줄기세포에서 발현양이 현저히 높고, ROR1 고갈 시 뇌종양 줄기세포의 암세포로의 분화를 유도하고, 전이를 억제하여 항암약물치료 또는 방사선 치료에 대한 내성 또는 재발을 억제하여 뇌종양을 예방 또는 치료할 수 있다.

Description

뇌종양 줄기세포의 분화 및 전이 조절을 위한 ＲＯＲ１의 약제학적 용도{Pharmaceutical use of ROR1 for controlling differentiation and EMT of glioblastoma stem cell}

본 발명은 뇌종양 줄기세포의 분화 및 전이 조절을 위한 ROR1의 약제학적 용도에 관한 것이다.

암줄기세포는 기본적으로 정상줄기세포의 두 가지 특성, 즉, 자가복제능력, 분화를 모두 가지고 있으나 자가조절 (self-regulation) 기능에 이상이 있다고 알려져 있다. 따라서 정상줄기세포는 비대칭적인 분열을 통해 줄기세포의 수를 엄격하게 유지하나, 암줄기세포는 이와 같은 조절능력에 장애가 생겨 암줄기세포의 수가 늘어나게 된다. 비록 암줄기세포는 암조직의 작은 부분을 차지하지만 항암내성, 다른 조직으로의 전이 등을 촉진시키면서 암조직을 유지하는 것으로 알려져 있다. 1997년 John E. Dick 박사에 의해 백혈병에서 암줄기세포의 존재가 밝혀진 이래로, 2000년대 초부터 유방암, 뇌종양, 대장암, 전립선암, 흑색종 순으로 고형암에서도 암줄기세포가 존재한다는 증거들이 제시되었다.

암줄기세포를 다른 암세포들과 구별하기 위해서는, 암줄기세포만의 표지자 (marker)가 필요하다. 교모세포종의 암줄기세포는 특이적으로 CD133을 발현한다고 알려졌으며 그 밖에 다른 각종 종양의 암줄기세포 표지자들이 밝혀졌다.

암줄기세포의 발견은 임상적으로 크게 2가지의 중요성을 지닌다. 첫째, 암줄기세포의 이론에 따라 다양한 암세포들 중에서 암줄기세포를 제거할 수 있다면 나머지 암세포들은 자가복제능력이 없어 자연히 사라지거나 사멸할 것이다. 둘째, 암줄기세포는 기존의 항암치료요법에 저항성이 높다는 것이다. 그러므로 방사선 및 항암화학치료 후 줄어든 암세포에서 내성을 가진 소수의 암줄기세포가 살아나서 재발을 일으킬 수 있다. 즉, 기존의 항암치료의 한계를 극복하기 위해서는 암줄기세포를 목표로 한 특이적 치료법 개발이 필요하다. 그러므로 암줄기세포 이론을 임상에 적용하기 위해서는 정확한 암줄기세포 표지자의 발굴 및 표적 (target) 단백질 치료제 개발 등의 연구가 이루어져야 한다.

ROR1(Receptor-tyrosine-kinase-like Orphan Receptor1)은 리셉터 타이로신 카이네이즈 패밀리 (receptor tyrosine kinase family)의 일종으로 줄여서 RTK는 세포막 수용체이며, 세포 성장, 분화, 증식, 전이, 혈관생성 등의 세포관련 프로세스에 관여한다고 알려져 있다. 지금까지 밝혀진 20가지 종류의 RTK 중, ROR1은 리간드와 신호경로가 명확히 밝혀지지 않아 orphan receptor로 부르고 있다. ROR1에 관한 연구에 따르면, ROR1은 배아형성기 동안 발현되었다가 현저히 감소하면서 정상조직에서 발현되지 않게 된다. 그러나 ROR1은 여러 암세포에서 과발현되며 암의 증식 및 다른 조직으로의 전이에 역할을 하며, 신경 전구세포 (neural progenitor cell)의 증식과 미분화 상태를 유지하는데 관여하는 것이 밝혀졌다. 이것을 토대로 ROR1은 암 분야뿐만 아니라 줄기세포분야 연구에서 중요한 가치가 있는 것으로 판단되어 암줄기세포에서의 ROR1의 역할을 확인하고자 하였다. ROR1은 뇌종양 줄기세포의 줄기세포성질유지에 관여하여 암줄기세포의 미분화를 유지시키며, EMT에 관련되어 암의 이동 및 전이에 관여할 것으로 가정하였다. 그러므로 뇌종양 줄기세포에서 ROR1의 발현을 억제시킴으로써 이와 같은 역할을 확인하였다.

EMT는 Epithelial Mesenchymal Transition의 약자로 상피 특징을 잃고, 간엽 특징을 얻는다는 뜻을 말한다. EMT는 정상적인 발생과정에서 일어나는 사건으로, 상피세포가 간엽세포의 운동성 (motile), 이동 특성 (migratory properties)을 획득하게 되는 과정이다 ( Nat . Rev . Mol . Cell . Biol ., 2006(7), pp. 131-142). 또한 EMT는 암줄기세포의 침윤능과 관계되어 암의 전이에 관련되어 있을 것이라고 생각되고 있다 (Cancer Gene Therapy, 2014, pp. 181-187).

미국공개특허 제2003-0318212호 미국공개특허 제2012-0282177호

Nat. Rev. Mol. Cell. Biol., 2006(7), pp. 131-142 Cancer Gene Therapy, 2014, pp. 181-187

본 발명의 목적은 ROR1의 뇌종양 줄기세포의 분화 및 EMT 조절에서의 역할을 규명하여 뇌종양 치료에 사용하기 위한 약제학적 용도를 제공하는 것이다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 분화 또는 전이 조절제로, ROR1 또는 이의 저해제를 포함하고, 상기의 ROR1 저해제는 ROR1 유전자에 상보적인 서열을 포함하는 안티센스-올리고뉴클레오티드, siRNA, shRNA, miRNA 또는 이를 포함하는 벡터; 또는, ROR1 단백질에 특이적인 항체 중 어느 하나인, 뇌종양 줄기세포의 분화 또는 전이 조절용 조성물을 제공한다.

본 발명은 또한 뇌종양 줄기세포를 가지는 뇌종양 진단에 필요한 정보를 제공하기 위하여, 인간의 암세포 시료에 있는 ROR1의 발현 수준을 측정하여 뇌종양 줄기세포를 가지는 뇌종양 진단 마커를 검출하는 방법을 제공한다.

본 발명은 또한 ROR1 유전자에 상보적인 서열을 포함하는 안티센스-올리고뉴클레오티드, siRNA, shRNA, miRNA 또는 이를 포함하는 벡터; 또는, ROR1 단백질에 특이적인 항체 중 어느 하나의 ROR1 저해제를 포함하는 뇌종양의 예방 또는 치료용 조성물을 제공한다.

본 발명은 또한 ROR1 유전자를 후보물질과 인체 외에서 접촉시키고, 상기 후보물질이 상기 유전자의 발현을 촉진하는지 또는 억제하는지를 측정하여 ROR1 유전자의 발현을 감소시키면 뇌종양의 예방 또는 치료제로 판정하는 것을 포함하는 뇌종양의 예방 또는 치료용 의약의 스크리닝 방법을 제공한다.

본 발명은 또한 ROR1 단백질을 후보물질과 인체 외에서 접촉시키고, 상기 후보물질이 상기 단백질의 기능 또는 활성을 증진하는지 또는 억제하는지를 측정하여, ROR1 단백질의 기능 또는 활성을 억제하면 뇌종양의 예방 또는 치료제로 판정하는 것을 포함하는 뇌종양의 예방 또는 치료용 의약의 스크리닝 방법을 제공한다.

본 발명에 따르면, ROR1는 뇌종양 줄기세포에서 고발현되며, ROR1 억제 시 뇌종양 줄기세포의 줄기세포능과 침윤능이 억제되어 암세포 분화 및 전이에 관여함을 규명하여, 암의 항암약물치료 또는 방사선 치료에 대한 내성, 전이 또는 재발을 억제하여 뇌종양을 근본적으로 예방 또는 치료할 수 있는 선도물질로서의 역할을 제공하는 효과가 있다.

도 1은 항 인간 CD133-PE 항체와 플로우 사이토메트리 (Flow Cytometry)를 이용하여 단층세포배양방식으로 키운 U87 MG, U373 MG에서 줄기세포 표지자인 CD133을 발현하는 세포의 비율을 관찰하여 뇌종양 줄기세포의 비율을 확인한 결과이다.
도 2는 삼차원 구 형성 세포배양방식을 이용한 뇌종양 줄기세포 배양 결과를 나타낸 것이다.
도 3은 단층세포배양방식과 구 형성 세포배양방식으로 배양한 세포에서 줄기세포 표지자 (CD133, Bmi-1, Sox2, Notch1, Nestin)의 발현양을 mRNA 수준 (RT-PCR)과 단백질 수준 (웨스턴 블랏)에서 관찰한 결과이다.
도 4는 단층세포배양방식과 구 형성 세포배양방식으로 배양한 세포에서 ROR1의 발현양을 mRNA 수준 (RT-PCR), 단백질 수준 (면역형광법)에서 관찰한 결과이다.
도 5는 구 형성 세포배양방식으로 배양한 뇌종양 줄기세포의 증식 정도를 줄기세포 표지자의 mRNA 수준 (RT-PCR)과 단백질 수준 (웨스턴 블랏)에서 확인한 결과이다.
도 6은 무작위적인 서열의 shRNA (Control shRNA) 또는 ROR1 shRNA 중 어느 하나로 트랜스펙션된 구 형성 배양세포에서 ROR1 고갈을 mRNA 수준 (RT-PCR)에서 확인한 결과와, ROR1 고갈된 세포에서 줄기세포 표지자 (Bmi-1, CD133)의 발현양을 확인한 결과이다.
도 7은 무작위적인 서열의 shRNA 또는 ROR1 shRNA 중 어느 하나로 트랜스펙션된 구 형성 배양세포에서 종양구 형성능을 관찰한 결과이다.
도 8은 단층세포배양방식과 구 형성 세포배양방식으로 배양한 세포에서 EMT 표지자 (N-cadherin, Snail, Twist, Zeb1)의 발현양을 mRNA 수준 (RT-PCR)에서 관찰한 결과이다.
도 9는 무작위적인 서열의 shRNA (Control shRNA) 또는 ROR1 shRNA 중 어느 하나로 트랜스펙션된 구 형성 배양세포에서 EMT 표지자 (N-cadherin, Snail, Twist, Zeb1)의 발현양을 mRNA 수준 (RT-PCR)에서 관찰한 결과이다.
도 10은 무작위적인 서열의 shRNA 또는 ROR1 shRNA 중 어느 하나로 트랜스펙션된 구 형성 배양세포에서 침윤능을 측정한 결과이다.
도 11은 도 3 내지 6, 도 8 및 도 9의 RT-PCR에 사용된 프라이머의 염기서열 리스트를 도시한 것이다.

이하, 본 발명의 구성을 구체적으로 설명한다.

일반적으로 암세포는 암줄기세포를 포함하고 있고 암줄기세포는 표준 항암치료, 예컨대, 항암약물치료 (화학요법) 또는 방사선치료 (방사선요법)에 대한 내성이 강하여 암세포의 사멸에도 불구하고 암줄기세포는 살아 남아 증식을 통해 암 재발의 원인이 된다. 따라서, 본 발명자들은 항암 치료 시 재발의 원인이 되는 암줄기세포를 대상으로 암줄기세포의 분화유도 및 전이억제를 위한 표적단백질로, ROR1을 선정하고, 상기 ROR1의 역할을 확인하고자 ROR1의 발현을 억제시켜 암줄기세포의 줄기세포능 및 침윤능의 변화를 조사함으로써 본 발명을 완성하였다.

따라서, 본 발명은 분화 또는 전이 조절제로, ROR1 또는 이의 저해제를 포함하는 뇌종양 줄기세포의 분화 또는 전이 조절용 조성물을 제공한다.

본 발명의 일 구체예에 따르면, 뇌종양 줄기세포는 단층세포배양방식으로 배양할 경우 표지자의 발현이 현저하게 감소되었고, 발현이 유지되지 않는 것으로 미루어 세포가 매우 불안정한 특징을 가짐을 알 수 있어, 뇌종양 줄기세포가 신경구체를 형성한다는 특성을 이용한 구 형성 배양방식을 적용하여 뇌종양 줄기세포를 배양하였다. 이렇게 얻은 뇌종양 줄기세포는 단일세포의 분리 및 재배양을 반복하는 경우 줄기세포 성질을 높이며, 줄기세포 표지자인 CD133, Bmi-1, Sox2, Notch1, Nestin, Msi-1의 상향 발현과, EMT 관련 유전자인 N-cadherin, Snail, Twist, Zeb-1의 상향 발현을 쉽게 확인할 수 있었다. 또한, 침윤능도 뇌종양 줄기세포에서 3배 정도 더 높았다. 이 결과들을 통해, 구 형성 세포배양방식으로 키운 뇌종양 세포가 뇌종양 줄기세포의 특징을 충분히 가진다고 결론을 내릴 수 있었다.

다음으로, 구 형성 세포배양방식으로 배양된 뇌종양 세포에서 표적단백질인 ROR1이 기존 암세포에서보다 뇌종양 줄기세포에서 상향 발현되는지 확인한 결과, ROR1은 mRNA 수준에서 기존 암세포 대비 7배 이상, 단백질 수준에서는 4배 이상 높이 발현됨을 확인하였다. 따라서, shRNA를 이용하여 ROR1의 발현양을 조절하여 줄기세포 성질 및 종양구 형성능, EMT 관련 유전자, 침윤능의 변화를 관찰한 결과, control shRNA를 트랜스펙션한 뇌종양 줄기세포 대비 Bmi-1, CD133이 하향 발현되었고, control shRNA를 트랜스펙션한 뇌종양 줄기세포에서는 종양구의 크기가 100㎛ 이상 되는 것이 평균 23개 임에 비해 ROR1을 고갈 뇌종양 줄기세포에는 100㎛ 이상 되는 세포가 만들어지지 않았다. 또한 ROR1 고갈에 의한 뇌종양 줄기세포의 다른 조직으로의 전이 조절을 확인하기 위해, EMT 관련 유전자 및 침윤능을 측정한 결과, control shRNA를 트랜스펙션한 뇌종양 줄기세포 대비 N-cadherin, Snail, Twist, Zeb-1이 하향 발현되었고, 침윤능 확인 실험에서 control shRNA를 트랜스펙션한 뇌종양 줄기세포 대비 3배 정도 줄어듦을 확인하여, ROR1이 뇌종양의 침윤능에 직접적으로 관여하며, 해당 기능을 촉진한다고 할 수 있다.

따라서, 뇌종양 줄기세포에서 ROR1 유전자 또는 단백질의 발현을 억제 (또는 고갈)시키면 줄기세포 관련 성질을 억제하고, 전이능력을 억제할 수 있어, ROR1은 뇌종양 줄기세포의 분화 또는 전이 조절인자임을 알 수 있다. 따라서, ROR1을 표적으로 하는 표적단백질 치료제는 뇌종양 줄기세포의 분화 또는 전이조절제로 사용할 수 있다.

본 발명의 뇌종양 줄기세포의 분화 또는 전이 조절용 조성물은 천연형 또는 재조합 ROR1, 이들과 실질적으로 동등한 생리 활성을 갖는 ROR1 단백질, 또는 ROR1 저해제를 포함할 수 있다. 상기 실질적으로 동등한 생리 활성을 갖는 단백질에는 천연형/재조합 ROR1와 그 기능적 동등물(functional equivalent) 및 기능적 유도체(functional derivative)가 포함된다.

상기 "기능적 동등물"에는 천연형 단백질의 아미노산 중 일부 또는 전부가 치환되거나, 아미노산의 일부가 결실 또는 부가된 아미노산 서열 변형체로서 천연형 ROR1과 실질적으로 동등한 생리활성을 갖는 것을 말한다.

"기능적 유도체"는 상기 ROR1 단백질의 물리 화학적 성질을 증가 또는 감소시키기 위한 변형을 가한 단백질로서 천연형 ROR1와 실질적으로 동등한 생리 활성을 갖는 것을 의미한다.

본 발명의 ROR1 단백질은 인간, 생쥐, 랫트, 금화조, 닭, 제브라다니오, 개구리, 큰가시고기 등으로부터 기원하는 단백질이며, 예컨대, GenBank accession no. NP_005003.2, NP_001102141.1, BAA75480.1, AJG06048.1, XP_003990261.1, XP_002686397.2, XP_009318100.1 등의 공지된 서열을 갖는 단백질을 말한다.

본 발명의 일 구체예에 따르면, 본 발명에 사용된 ROR1는 GenBank accession no. NP_005003.2 등으로부터 당업자에 공지된 유전공학적 방법으로 제조할 수 있다.

천연형의 ROR1는 유전자 재조합 방법에 의하여 단백질을 제조하는 경우 대장균(E. coli)이나 곤충 세포를 이용하는 것보다 포유동물 세포를 이용하는 경우가 단백질의 활성도나 용해성 측면에서 천연형의 것과 유사할 것으로 여겨진다.

상기 재조합 ROR1 단백질은 통상의 컬럼 크로마토그라피 방법 등을 이용하여 분리할 수 있다. 또한 단백질의 정제 정도는 소듐 도데실 설페이트-폴리아크릴아마이드 젤 전기영동 (SDS-polyacrylamide gel electrophoresis (PAGE))등으로 확인할 수 있다.

상기 ROR1의 저해제는 ROR1 유전자에 상보적인 서열을 포함하는 안티센스-올리고뉴클레오티드, siRNA, shRNA, miRNA 또는 이를 포함하는 벡터; 또는, ROR1 단백질에 특이적인 항체 중 어느 하나일 수 있다.

본 발명의 뇌종양 줄기세포의 분화 또는 전이 조절용 조성물은 시험관내(in vitro)에서 뇌종양 줄기세포 배양 시 분화 또는 전이 조절 인자로 첨가될 수 있다. 예컨대, 뇌종양 줄기세포의 분화 또는 전이 유도 배양 시 천연형 또는 재조합 ROR1 또는 이의 저해제를 부가하여 줄기세포의 분화를 유도하거나, 전이를 억제할 수 있다.

본 발명의 뇌종양 줄기세포의 분화 또는 전이 조절용 조성물은 상기 ROR1 외에 뇌종양 줄기세포의 분화를 유도하는 공지의 분화유도인자를 더 포함할 수 있다. 예컨대, ciliary neurotrophic factor (CNTF), bone morphogenetic proteins (BMPs), transforming growth factor (TGFα) 또는 neuregulin-1 (Nrg1)/glial growth factor-2 (GGF2) 등을 사용할 수 있다.

본 발명은 또한 뇌종양 줄기세포를 가지는 뇌종양 진단에 필요한 정보를 제공하기 위하여, 인간의 암세포 시료에 있는 ROR1의 발현 수준을 측정하여 뇌종양 줄기세포를 가지는 뇌종양 진단 마커를 검출하는 방법에 관한 것이다.

상기 용어, "뇌종양 줄기세포를 가지는 뇌종양"이란 암세포 내에 암줄기세포가 포함되어 있어 항암약물치료 또는 방사선치료 시 내성 및 재발 가능성이 있는 뇌종양을 말한다.

또한, 상기 용어, "뇌종양 줄기세포를 가지는 뇌종양 진단 마커"란 뇌종양 줄기세포를 암세포와 구분하여 진단할 수 있는 물질을 의미하며, 뇌종양 줄기세포는 암세포 대비 ROR1을 고발현하고 있어 ROR1의 mRNA 발현 수준 또는 ROR1 단백질의 양을 뇌종양 줄기세포를 가지는 뇌종양 진단 마커로 사용할 수 있다.

상기 발현 수준은 ROR1에 상보적인 서열을 갖는 올리고뉴클레오티드, 예컨대, ROR1 mRNA에 특이적으로 결합하는 프라이머 또는 핵산 프로브나, ROR1 단백질에 특이적인 항체를 사용하여 측정할 수 있다.

상기 프라이머는 적합한 온도 및 적합한 완충액 내에서 적합한 조건 (즉, 4종의 다른 뉴클레오시드 트리포스페이트 및 중합반응 효소) 하에서 주형-지시 DNA 합성의 개시점으로 작용할 수 있는 단일-가닥 올리고뉴클레오타이드를 의미한다. 프라이머의 적합한 길이는 다양한 요소, 예컨대, 온도와 프라이머의 용도에 따라 변화가 있을 수 있다. 또한, 프라이머의 서열은 주형의 일부 서열과 완전하게 상보적인 서열을 가질 필요는 없으며, 주형과 혼성화되어 프라이머 고유의 작용을 할 수 있는 범위 내에서의 충분한 상보성을 가지면 충분하다. 따라서 본 발명에서의 프라이머는 주형인 유전자의 뉴클레오타이드 서열에 완벽하게 상보적인 서열을 가질 필요는 없으며, 이 유전자 서열에 혼성화되어 프라이머 작용을 할 수 있는 범위 내에서 충분한 상보성을 가지면 충분하다. 또한, 본 발명에 따른 프라이머는 유전자 증폭 반응에 이용될 수 있는 것이 좋다. 상기 증폭 반응은 핵산 분자를 증폭하는 반응을 말하며, 이러한 유전자의 증폭 반응들에 대해서는 당업계에 잘 알려져 있고, 예컨대, 중합효소연쇄반응 (PCR), 역전사 중합효소연쇄반응 (RT-PCR), 리가아제 연쇄반응 (LCR), 전자 중재 증폭 (TMA), 핵산 염기서열 기판 증폭(NASBA) 등이 포함될 수 있다.

상기 핵산 프로브는 자연의 또는 변형된 모노머 또는 연쇄 (linkages)의 선형 올리고머를 의미하며, 디옥시리보뉴클레오타이드 및 리보뉴클레오타이드를 포함하고 타켓 뉴클레오타이드 서열에 특이적으로 혼성화할 수 있으며, 자연적으로 존재하거나 또는 인위적으로 합성된 것을 말한다. 본 발명에 따른 프로브는 단일쇄일 수 있으며, 바람직하게는 올리고디옥시리보뉴클레오티드일 수 있다. 본 발명의 프로브는 자연 dNMP (즉, dAMP, dGMP, dCMP 및 dTMP), 뉴클레오타이드 유사체 또는 유도체를 포함할 수 있다. 또한, 본 발명의 프로브는 리보뉴클레오타이드도 포함할 수 있다. 예컨대, 본 발명의 프로브는 골격 변형된 뉴클레오타이드, 예컨대, 펩타이드 핵산 (PNA) (M. Egholm et al ., Nature, vol. 365, pp. 566-568, 1993), 포스포로티오에이트 DNA, 포스포로디티오에이트 DNA, 포스포로아미데이트 DNA, 아마이드-연결된 DNA, MMI-연결된 DNA, 2'-O-메틸 RNA, 알파-DNA 및 메틸포스포네이트 DNA, 당 변형된 뉴클레오타이드 예컨대, 2'-O-메틸 RNA, 2'-플루오로 RNA, 2'-아미노 RNA, 2'-O- 알킬 DNA, 2'-O-알릴 DNA, 2'-O-알카이닐 DNA, 헥소스 DNA, 피라노실 RNA 및 안히드로헥시톨 DNA, 및 염기 변형을 갖는 뉴클레오타이드 예컨대, C-5 치환된 피리미딘 (치환기는 플루오로-, 브로모-, 클로로-, 아이오도-, 메틸-, 에틸-, 비닐-, 포르밀-, 에티틸-, 프로피닐-, 알카이닐-, 티아조릴-, 이미다조릴-, 피리딜- 포함), C-7 치환기를 갖는 7-데아자퓨린 (치환기는 플루오로-, 브로모-, 클로로-, 이오도-, 메틸-, 에틸-, 비닐-, 포르밀-, 알카이닐-, 알켄일-, 티아조릴-, 이미다조릴-, 피리딜-), 이노신 및 디아미노퓨린을 포함할 수 있다.

상기 ROR1에 특이적인 항체는 폴리클로날 항체, 모노클로날 항체, 인간항체 및 인간화 항체를 사용할 수 있다.

상기 항체 단편의 예로는 Fab, Fab', F(ab')2 및 Fv 단편; 디아바디(diabody); 선형 항체(Zapata et al ., Protein Eng. Vol. 8 (10), pp. 1057-1062, 1995); 단일쇄 항체 분자; 및 항체 단편으로부터 형성된 다중특이성 항체 등이 포함된다.

항체를 파파인 (papain)으로 분해하면 2개의 동일한 항원 결합 단편, 즉 단일 항원 결합 부위가 있는 각 "Fab" 단편, 및 그 나머지인 "Fc" 단편이 생성된다. 펩신을 처리하면, 2개의 항원 결합 부위가 있으며 여전히 항원에 교차결합할 수 있는 F(ab ')2 단편이 생성된다. Fv는 완전한 항원인식 및 결합 부위를 포함하는 최소한의 항체 단편이다. 이 부위는 하나의 중쇄 및 하나의 경쇄 가변 영역의 이합체로 구성되며 비공유결합으로 단단히 결합되어 있다.

폴리클로날 항체의 제조방법은 당업자에게 공지되어 있다. 폴리클로날 항체는 포유동물에 1회 이상 면역화제를 주입, 필요한 경우 면역보강제와 함께 주입하여 제조할 수 있다. 통상, 면역화제 및(또는) 면역보강제는 포유동물에 피하주사 또는 복강내 주사로 수 회 주입된다. 면역화제는 본 발명의 단백질 또는 이의 융합 단백질일 수 있다. 면역화되는 포유동물에 면역원성이 있는 것으로 공지된 단백질과 함께 면역화제를 주사하는 것이 효과적일 수 있다.

본 발명에 따른 모노클로날 항체는 문헌 (Kohler et al ., Nature, 256:495 (1975))에 기재된 하이브리도마 방법으로 제조할 수 있거나, 또는 재조합 DNA 방법 (예를 들어, 미국특허 제4,816,576호 참조)으로 제조할 수 있다. 모노클로날 항체는 또한 예를 들어, 문헌 (Clackson et al ., Nature, vol. 352, pp. 624-628, 1991; Marks et al ., J. Mol . Biol., vol. 222, pp. 581-597, 1991)에 기재된 기술을 이용하여 라이브러리로부터 단리할 수 있다.

본 발명에서의 모노클로날 항체는 구체적으로, 목적하는 활성을 발휘한다면 중쇄 및(또는) 경쇄의 일부분이 특정 종으로부터 유래된 항체 또는 특정 항체 클래스 또는 서브클래스에 속하는 항체의 상응하는 서열과 동일하거나 상동성이 있지만, 쇄(들)의 나머지는 다른 종으로부터 유래된 항체 또는 다른 항체 클래스 또는 서브클래스에 속하는 항체 또는 그러한 항체의 단편과 동일하거나 상동성이 있는 "키메라" 항체를 포함한다 (Morrison et al ., Proc . Natl . Acad . Sci. USA, vol. 81, pp. 6851-6855, 1984).

비-인간 (예를 들어, 쥐과 동물) 항체의 "인간화" 형태는 비-인간 면역글로불린으로부터 유도된 최소서열을 포함하는 키메라 면역글로불린, 면역글로불린 쇄 또는 그의 단편 (예를 들어, Fv, Fab, Fab', F(ab')2 또는 항체의 다른 항원 결합 서열) 이다. 대부분은 인간화 항체는 수용자의 상보성 결정 영역 (CDR)의 잔기를 원하는 특이성, 친화도 및 능력을 갖는 생쥐, 쥐 또는 토끼와 같은 인간 이외의 종 (공여자 항체)의 CDR 잔기로 치환시킨 인간 면역글로불린 (수용자 항체)을 포함한다. 몇몇 경우에, 인간 면역글로불린의 Fv 프레임워크 잔기는 상응하는 비-인간 잔기에 의해 치환된다. 또한, 인간화 항체는 수용 항체, 또는 도입되는 CDR 또는 프레임워크 서열에서 발견되지 않는 잔기를 포함할 수 있다. 일반적으로, 인간화 항체는 하나 이상, 일반적으로 둘 이상의 가변 도메인을 실질적으로 모두 포함하며, 여기서 모든 또는 실질적으로 모든 CDR 영역은 비-인간 면역글로불린의 영역에 대응하며, 모든 또는 실질적으로 모든 FR 영역은 인간 면역글로불린 서열의 영역에 해당한다. 또한, 인간화 항체는 면역글로불린 불변 영역 (Fc)의 적어도 일부, 일반적으로 인간면역글로불린 영역의 일부를 포함한다 (Presta, Curr . Op . Struct . Biol. Vol. 2, pp. 593-596, 1992).

상기 ROR1의 발현 수준을 측정하는 방법은 공지의 기술을 이용하여 생물학적 시료로부터 mRNA 또는 단백질을 분리하는 공지의 공정을 포함하여 수행될 수 있다.

상기 생물학적 시료는 뇌종양의 발생 또는 진행 정도에 따른 상기 유전자의 발현 수준 또는 단백질의 수준이 대조군과는 다른, 생체로부터 채취된 시료를 말하며, 상기 시료로는 예를 들면, 이에 제한되지는 않으나, 조직, 세포, 혈액, 혈청, 혈장, 타액 및 뇨 등이 포함될 수 있다.

상기 유전자의 발현 수준 측정은 바람직하게는 mRNA의 수준을 측정하는 것이며, mRNA의 수준을 측정하는 방법으로는 역전사 중합효소연쇄반응 (RT-PCR), 실시간 역전사 중합효소연쇄반응, RNase 보호 분석법, 노던 블랏 및 DNA 칩 등이 있으나, 이에 제한되지는 않는다.

상기 단백질 수준의 측정은 항체를 이용할 수 있는데, 이러한 경우, 생물학적 시료 내의 상기 ROR1 단백질과 이에 특이적인 항체는 결합물, 즉, 항원-항체 복합체를 형성하며, 항원-항체 복합체의 형성양은 검출 라벨 (detection label)의 시그널의 크기를 통해서 정량적으로 측정할 수 있다. 이러한 검출 라벨은 효소, 형광물질, 리간드, 발광물질, 미소입자 (microparticle), 레독스 분자 및 방사선 동위원소로 이루어진 그룹 중에서 선택할 수 있으며, 이에 제한되는 것은 아니다. 단백질 수준을 측정하기 위한 분석 방법으로는, 이에 제한되지는 않으나, 웨스턴 블랏, ELISA, 방사선면역분석, 방사선 면역 확산법, 오우크테로니 면역 확산법, 로케트 면역전기영동, 조직면역 염색, 면역침전 분석법, 보체 고정분석법, FACS, 단백질 칩 등이 있다.

따라서 본 발명은 상기와 같은 검출 방법들을 통하여, 대조군의 mRNA 발현 양 또는 단백질의 양과 뇌종양 의심환자에서의 mRNA 발현 양 또는 단백질의 양을 확인할 수 있고, 상기 발현 양의 정도를 대조군과 비교함으로써 뇌종양의 진단 마커를 검출할 수 있다. 즉, ROR1의 발현 수준이 증가한 경우 암줄기세포를 가지는 뇌종양임을 알 수 있는 것이다.

본 발명은 또한 ROR1 저해제를 포함하는 뇌종양의 예방 또는 치료용 조성물에 관한 것이다.

본 발명에 따르면, ROR1는 뇌종양 줄기세포에서 상향 조절되어 있고, ROR1 저해제를 사용할 경우 뇌종양 줄기세포에서 ROR1가 고갈되어 뇌종양 줄기세포의 증식이 억제되고, 암세포로의 분화가 촉진된다. 따라서, 본 발명의 뇌종양의 예방 또는 치료용 조성물은 뇌종양 줄기세포의 분화치료 (differentiation therapy)에 사용할 수 있다. 즉, ROR1 저해제 처리 시 뇌종양 줄기세포는 약물 내성 및 암 재발 등의 특정 뇌종양 줄기세포 특성을 상실하기 때문에 항암약물치료 또는 방사선치료와 병용 사용할 경우 암의 약물 내성 및 재발이 억제되어 치료적 효과를 높일 수 있다.

상기 ROR1 저해제는 ROR1 유전자의 mRNA 발현 또는 이의 단백질의 발현을 감소시키거나, 기능 또는 활성을 감소시키는 제제를 포함할 수 있다.

상기 ROR1 단백질 저해제는 ROR1 단백질과 결합하여 뇌종양 줄기세포 내 ROR1를 고갈하는 펩타이드 또는 화합물 등일 수 있다. 이러한 저해제는 단백질 구조 분석 등의 하기 예시된 스크리닝 방법을 통해 선정될 수 있으며, 당업계에 공지된 방법을 이용하여 설계될 수 있을 것이다.

또한, 상기 단백질 저해제는 ROR1 단백질에 대한 폴리클로날 항체, 모노클로날 항체, 인간항체 및 인간화 항체를 사용할 수 있고, 상기 항체의 정의는 상술한 바와 같다.

상기 항체를 이용하여 뇌종양 줄기세포 내 ROR1를 고갈시켜 암세포로의 분화를 촉진하고, 뇌종양 줄기세포의 증식을 억제함으로써 항암약물치료 또는 방사선치료와 병용 사용할 경우 약물 내성 및 재발을 방지할 수 있어 뇌종양을 예방 또는 치료할 수 있다.

본 발명의 ROR1 단백질의 기능 또는 활성 저해제는 리포좀, 바이러스, 유전자 건(gene gun), 폴리머(polymer), 초음파, 전기충격을 이용해 전달될 수 있으나, 이에 특별히 제한되는 것은 아니다.

상기 ROR1 유전자는 이들을 코딩하는 DNA 또는 이로부터 전사되는 mRNA일 수 있다. 따라서, 상기 유전자에 대한 저해제는 유전자 자체에 결합하여 전사를 방해하거나 유전자로부터 전사된 mRNA에 결합하여 mRNA의 해독을 방해하는 저해제일 수 있다.

따라서, 상기 ROR1 유전자의 저해제는 ROR1 유전자의 발현을 저해하는 저해제를 모두 포함한다. 예컨대, 이러한 저해제는 상기 유전자에 결합하는 펩타이드, 핵산 또는 화합물 등일 수 있다. 이러한 저해제는 세포 기반 스크리닝 등의 하기 예시된 스크리닝 방법을 통해 선정될 수 있으며, 당업계에 공지된 방법을 이용하여 설계될 수 있을 것이다.

한 구체예에서, 상기 저해제는 ROR1 유전자에 대한 상보적인 서열을 포함하는 안티센스-올리고뉴클레오티드, siRNA, shRNA, miRNA 또는 이들을 포함하는 벡터일 수 있다. 이러한 안티센스-올리고뉴클레오티드, siRNA, shRNA, miRNA 또는 이들을 포함하는 벡터는 당업계에 공지된 방법을 이용하여 제작할 수 있다.

본 명세서에서 "siRNA"는 표적 유전자의 mRNA의 절단을 통해 RNA 간섭현상을 유도하는 이중사슬 RNA를 의미하며, 표적 유전자의 mRNA와 같은 서열을 가지는 센스서열의 RNA 가닥과 이와 상보적인 서열을 가지는 안티센스 서열의 RNA 가닥으로 구성된다.

상기 siRNA는 시험관내에서 합성한 siRNA 자체 또는 siRNA를 코딩하는 염기서열을 발현벡터에 삽입하여 발현되는 형태를 포함할 수 있다.

본 발명에 있어서, 상기 "벡터"는 폴리펩타이드를 암호화하는 게놈 내로 삽입된 외부 DNA를 포함하는 유전자 작제물을 말한다.

본 발명과 관련된 벡터는 상기 유전자를 저해하는 핵산 서열이 게놈 내로 삽입된 벡터로서, 이들 벡터는 DNA 벡터, 플라스미드 벡터, 코즈미드 벡터, 박테리오파지 벡터, 효모 벡터, 또는 바이러스 벡터를 예로 들 수 있다.

또한, 상기 안티센스는 ROR1 유전자 또는 그의 단편으로부터 전사되는 mRNA 서열 전체 또는 일부와 상보적인 서열을 지니고, 상기 mRNA와 결합하여 상기 ROR1 유전자 또는 단편의 발현을 억제할 수 있다.

또한, 상기 shRNA (short hairpin RNA)는 인간 또는 생쥐상의 shRNA 공통 염기서열 부위를 표적으로 하여 통상의 방법에 따라 제작된 것을 사용할 수 있다.

또한, 본 발명의 의약 조성물은 약제학적으로 허용 가능한 담체를 더 포함할 수 있다.

상기 약제학적으로 허용 가능한 담체는 의약 분야에서 통상 사용되는 담체 및 비히클을 포함하며, 구체적으로 이온 교환 수지, 알루미나, 알루미늄 스테아레이트, 레시틴, 혈청 단백질 (예, 사람 혈청 알부민), 완충 물질 (예, 각종 인산염, 글리신, 소르브산, 칼륨 소르베이트, 포화 식물성 지방산의 부분적인 글리세라이드 혼합물), 물, 염 또는 전해질 (예, 프로타민 설페이트, 인산수소이나트륨, 인산수소캄륨, 염화나트륨 및 아연 염), 교질성 실리카, 마그네슘 트리실리케이트, 폴리비닐피롤리돈, 셀룰로즈계 기질, 폴리에틸렌 글리콜, 나트륨 카르복시메틸셀룰로즈, 폴리아릴레이트, 왁스, 폴리에틸렌 글리콜 또는 양모지 등을 포함하나 이에 제한되지 않는다.

또한, 본 발명의 조성물은 상기 성분들 이외에 윤활제, 습윤제, 유화제, 현탁제, 또는 보존제 등을 추가로 포함할 수 있다.

한 양태로서, 본 발명에 따른 조성물은 비경구 투여를 위한 수용성 용액으로 제조할 수 있으며, 바람직하게는 한스 용액 (Hank's solution), 링거 용액(Ringer's solution) 또는 물리적으로 완충된 염수와 같은 완충 용액을 사용할 수 있다. 수용성 주입(injection) 현탁액은 소디움 카르복시메틸셀룰로즈, 솔비톨 또는 덱스트란과 같이 현탁액의 점도를 증가시킬 수 있는 기질을 첨가할 수 있다.

본 발명의 조성물은 전신계 또는 국소적으로 투여될 수 있으며, 이러한 투여를 위해 공지의 기술로 적합한 제형으로 제제화될 수 있다. 예를 들어, 경구 투여 시에는 불활성 희석제 또는 식용 담체와 혼합하거나, 경질 또는 연질 젤라틴 캡슐에 밀봉되거나 또는 정제로 압형하여 투여할 수 있다. 경구 투여용의 경우, 활성 화합물은 부형제와 혼합되어 섭취형 정제, 협측 정제, 트로키, 캡슐, 엘릭시르, 서스펜션, 시럽, 웨이퍼 등의 형태로 사용될 수 있다.

주사용, 비경구 투여용 등의 각종 제형은 당해 기술 분야 공지된 기법 또는 통용되는 기법에 따라 제조할 수 있다. 또한, 유효량의 ROR1 저해제를 정맥내 주입, 피하 주입, 근육 주입, 복강 주입, 경피 투여 등에 적합한 형태로 식염수 또는 완충액에 투여 직전에 용액으로 제제화하여 투여할 수도 있다.

본 발명의 의약 조성물의 유효성분의 유효량은 질환의 예방, 억제 또는 경감 효과를 이루는데 요구되는 양을 의미한다.

따라서, 질환의 종류, 질환의 중증도, 조성물에 함유된 유효 성분 및 다른 성분의 종류 및 함량, 제형의 종류 및 환자의 연령, 체중, 일반 건강 상태, 성별 및 식이, 투여 시간, 투여 경로 및 조성물의 분비율, 치료 기간, 동시 사용되는 약물을 비롯한 다양한 인자에 따라 조절될 수 있다. 이에 제한되는 것은 아니나, 예컨대, 성인의 경우, 1일 1회 내지 수회 투여시, 본 발명의 저해제는 1일 1회 내지 수회 투여시, 화합물일 경우 0.1ng/kg~10g/kg, 폴리펩타이드, 단백질 또는 항체일 경우 0.1ng/kg~10g/kg, 안티센스-올리고뉴클레오타이드, siRNA, shRNA, miRNA일 경우 0.01ng/kg∼10g/kg의 용량으로 투여할 수 있다.

본 발명은 또한 ROR1 유전자를 후보물질과 인체 외에서 접촉시키고, 상기 후보물질이 상기 유전자의 발현을 촉진하는지 또는 억제하는지를 측정하여 ROR1 유전자의 발현을 감소시키면 뇌종양의 예방 또는 치료제로 판정하는 것을 포함하는 뇌종양의 예방 또는 치료용 의약의 스크리닝 방법에 관한 것이다.

또한, 본 발명은 ROR1 단백질을 후보물질과 인체 외에서 접촉시키고, 상기 후보물질이 상기 단백질의 기능 또는 활성을 증진하는지 또는 억제하는지를 측정하여, ROR1 단백질의 기능 또는 활성을 억제하면 뇌종양의 예방 또는 치료제로 판정하는 것을 포함하는 뇌종양의 예방 또는 치료용 의약의 스크리닝 방법을 제공한다.

본 발명의 스크리닝 방법에 따르면, 먼저 상기 유전자 또는 단백질을 포함하는 뇌종양 세포 또는 뇌종양 줄기세포에 분석하고자 하는 후보물질을 접촉시킬 수 있다.

상기 후보물질은 통상적인 선정방식에 따라 ROR1 유전자 염기서열에서 mRNA, 단백질로의 전사, 번역을 촉진하거나 억제하는 물질 또는 ROR1 단백질의 기능 또는 활성을 증진하거나 억제하는 의약으로서의 가능성을 지닌 것으로 추정되거나 또는 무작위적으로 선정된 개별적인 핵산, 단백질, 펩타이드, 기타 추출물 또는 천연물, 화합물 등이 될 수 있다.

이후, 후보물질이 처리된 세포에서 상기 유전자의 발현양, 단백질의 양 또는 단백질의 활성을 측정할 수 있으며, 측정 결과, 상기 유전자의 발현양, 단백질의 양 또는 단백질의 활성이 증가 또는 감소되는 것이 측정되면 상기 후보물질은 뇌종양을 치료 또는 예방할 수 있는 물질로 판단할 수 있다.

상기에서 유전자의 발현양, 단백질의 양 또는 단백질의 활성을 측정하는 방법은 당업계에 공지된 다양한 방법을 통해 수행될 수 있는데, 예를 들면, 이에 제한되지는 않으나, 역전사 중합효소 연쇄반응 (reverse transcriptase-polymerase chain reaction), 실시간 중합효소 연쇄반응 (real time-polymerase chain reaction), 웨스턴 블랏, 노던 블랏, ELISA(enzyme linked immunosorbent assay), 방사선면역분석(RIA: radioimmunoassay), 방사 면역 확산법(radioimmunodiffusion) 또는 면역침전분석법(immunoprecipitation assay) 등을 이용하여 수행할 수 있다.

본 발명의 스크리닝 방법을 통해 얻은, ROR1 유전자 발현을 억제시키거나 단백질의 기능을 억제시키는 활성을 나타내는 후보물질은, 뇌종양 치료제 후보물질이 될 수 있다. 또한, 상기 후보물질은 뇌종양 줄기세포 내 ROR1를 고갈시켜 뇌종양 줄기세포의 증식을 억제하고, 암세포로의 분화를 유도할 수 있다.

이와 같은 뇌종양 치료제 후보물질은 이후의 뇌종양 치료제 개발과정에서 선도물질 (leading compound)로서 작용하게 되며, 선도물질이 ROR1 유전자 또는 그로부터 발현되는 단백질의 기능을 촉진 또는 억제효과를 나타낼 수 있도록 그 구조를 변형시키고 최적화함으로써, 새로운 뇌종양 치료제를 개발할 수 있다.

본 발명에서 유전공학적 기술과 관련된 사항은 샘브룩 등의 문헌 (Sambrook, et al. Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor laboratory Press, Cold Spring Harbor, N. Y. (2001)) 및 프레드릭 등의 문헌(Frederick M. Ausubel et al., Current protocols in molecular biology volume 1, 2, 3, John Wiley & Sons, Inc. (1994))에 개시되어 있는 내용에 의해 보다 명확하게 된다.

이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.

<실시예 1> 시료준비

단층 세포배양 ( Monolayer cell culture )

사람 뇌종양 세포주 U87 MG, U373 MG는 한국 세포주 은행 (Korean cell bank (Seoul Korea)에서 구입하였다. 10% 우태아혈청 (fetal bovine serum (FBS) 및 1% 페니실린-스트렙토마이신을 포함하는 MEM (GIBCO, CA, USA)에서 세포를 배양하였다. 세포는 5% CO₂ 농도에서 37℃의 온도 조건에서 배양하였다. 세포가 80% 컨플루언시에 도달할 때, 0.05% 트립신 및 0.53mM EDTA 을 사용하여 세포를 탈착시키고, 새로운 플라스크에 배양하였다.

구 형성 세포배양 ( Sphere cell culture )

줄기세포 성질을 가지는 세포를 증식시키기 위한 세포배양 방식으로 구 형성을 촉진하도록 설계된 무혈청 DMEM/F-12 (GIBCO, CA, USA)에 세포를 배양하였다. 상기 배지에 신경세포 성장인자가 포함된 B27 과 10ng/mL 섬유아세포 성장인자, 10ng/mL 의 상피세포 성장인자를 보충하였다. 배양 5일마다 세포를 분리시키고 재 배양시켰다.

형광 유세포 분석법( Fluorescence cytometry assay )

U87 MG, U373 MG 세포는 TE (0.05% 트립신 및 0.53mM EDTA)로 탈착시키고, 제조업체의 설명서에 따라 BD FACS 를 위해 준비하였다. 세포를 1차 CD133/1PE 항체 (Miltenyi Biotic)로 표지하고, 대조군으로 표지되지 않은 세포를 이용하여 분석하였다. 데이터는 상기 시스템에서 제공된 BD FACS 아시아 소프트웨어에 따라 분석하였다.

중합효소 연쇄 반응 ( RT - PCR )

1mL의 TRIzol (Invitrogen, USA)을 사용하여 제조업체의 설명서에 따라 총 RNA를 분리하였다. cDNA는 제조업체의 설명서에 따라 ReverTraAce qPCR RT Master Mix (Toyobo, Japan)를 사용하여 합성하였다. PCR에 사용하는 프라이머는 Cosmogenetech (Seoul, Korea)에서 구입하였다 (도 11 참조). 표적 영역을 증폭하고, 2% 아가로오스 젤에서 전기영동하여 PCR 산물을 분리하고, BioRad Molecular Imager® GelDoc™ XR (BioRad, USA)을 사용하여 EtBr 시스템에서 검출하였다.

웨스턴 블랏 ( Western blot )

단층 배양 또는 구 형성 배양으로 키운 세포 또는 ROR1 고갈 세포로부터 분리된 총 단백질 중 30㎍ 단백질을 SDS-PAGE 젤에 전기영동하였다. 젤상의 단백질을 PVDF 막으로 옮기고, 1차 항체인, 항-인간 항체로 항원-항체 결합(immunoblot)을 시켰다. HRP (horseradish peroxidase)가 결합된 2차 항체를 결합시킨 후 ECL 용액으로 발색시켰다. 로딩 컨트롤로 GAPDH를 사용하였다. 웨스턴 블랏에 사용된 항체인 ROR1(Cell signaling, USA), Nestin (Abcam, UK), Sox2 (Santacruz, USA)에서 구입하였다.

면역형광법 ( Immunofluorescence analysis )

단층 배양 또는 구 형성 배양으로 키운 세포 또는 ROR1 고갈 세포를 커버글라스 위에 재배양하였다. 커버글라스 위에 배양된 세포를 3.7% 파라포름알데하이드를 이용하여 고정시킨 뒤, 0.2% 트리톤 X-100을 처리하여 세포내의 투과율을 높였다. 1차 항체인, 항-인간 항체로 항원-항체 결합(immunoblot)을 시킨 뒤, 형광이 붙어있는 2차 항체를 결합시켰다. 세포에 특이적으로 항체가 결합된 커버 글라스를 슬라이드 위로 옮겨 형광현미경 LSM 700 (Carl-Zeiss, Germany) 을 사용하여 단백질 발현양을 확인하였다.

ROR1 shRNA 트랜스펙션 및 선별

구 형성 세포배양으로 키운 세포를 단일 세포로 분리하여 shRNA 플라스미드 트랜스펙션 시약 (Santacruz, USA)을 사용하여 ROR1 shRNA 플라스미드로 트랜스펙션시켰다. 6-웰 플레이트에 항생제가 없는 배지를 넣고 세포를 플레이팅하였다. 세포를 70% 컨플루언시까지 배양하고, 1㎍/㎕ 의 농도를 사용하여 트랜스펙션시켰다. 트랜스펙션은 제조업체의 설명서에 따라 수행하였다. shRNA로 인큐베이션 하고 48시간 후, 항생제인 퓨로마이신 (puromycin, 1㎍/㎕)을 사용하여 5일 동안 선별하였다.

종양 구 형성 분석 ( Sphere formation assay )

ROR1이 고갈된 세포를 6웰 플레이트에 구 형성을 촉진하도록 설계된 무혈청 DMEM/F-12 (GIBCO, CA, USA)에 1mL 당 5×10³개의 세포를 접종하였다. 상기 배지에 신경세포 성장인자가 포함된 B27과 10ng/mL 섬유아세포 성장인자, 10ng/mL의 상피세포 성장인자를 보충하였다. 이틀마다 이들 세포의 구 형성 크기를 측정하였고, 대조군 세포의 구 형성 크기가 100㎛를 넘는 5일째에 대조군과 실험군의 100㎛ 이상의 구의 개수를 측정하였다.

침윤능 측정 ( Invasion assay )

ROR1이 고갈된 세포를 매트리젤(BD, USA)로 코팅된 24-웰 트랜스웰(8.0㎛, Corning, USA)에, 무혈청 MEM에 웰당 5×10³개의 세포의 밀도로 접종하였다. 모든 과정은 제조업체의 설명서에 따라 진행하였다. 접종 24시간 전, 해당 세포가 담긴 배지를 무혈청 MEM으로 교환해주었다. 무혈청 MEM 내의 세포를 상단 챔버 (upper chamber)에 접종하고, 하단 챔버 (lower chamber)에는 화학유인물질 (chemoattractant)로 10% FBS가 첨가된 MEM을 넣어주었다. 침윤능 측정은 5% CO₂ 농도에서 37℃의 온도 조건에서 48시간 동안 진행하였다. 48시간 후에 세포를 고정시키고, 김자용액 (Giemsa)으로 염색하였다. 침윤되지 않은 세포들은 면봉으로 닦아내었다. 현미경으로 무작위로 촬영한 세포 사진을 이용하여 침윤된 세포의 수를 Image J 프로그램을 사용하여 측정하였다.

<실험예 1> 뇌종양 세포주에서 뇌종양 줄기세포 확인 실험

인간 뇌종양조직으로부터 분리한 교모세포종에서 뇌종양 줄기세포의 표지자인 CD133을 발현하는 세포는 5%에서 30% 정도 차지하는 것으로 알려져 있다. 따라서, 항 인간 CD133-PE 항체와 플로우 사이토메트리 (Flow Cytometry)를 이용하여 단층세포배양방식으로 키운 U87 MG, U373 MG 에서의 줄기세포 표지자인 CD133을 발현하는 세포의 비율을 관찰하여 뇌종양 줄기세포의 비율을 확인하였다.

도 1에 나타난 바와 같이, 표지자로 분리해 낸 세포를 배양하게 되면 표지자의 발현이 현저하게 감소되었고, 발현이 유지되지 않는 것으로 미루어 세포가 매우 불안정한 특징을 가짐을 알 수 있었다.

<실험예 2> 뇌종양 줄기세포의 배양 조건 실험

뇌종양 줄기세포의 특성을 유지할 수 있는 배양 조건을 확립하기 위해, 뇌종양 줄기세포가 신경구체를 형성한다는 특성을 이용하여 삼차원 구 형성 배양방식을 적용하여 뇌종양 세포주를 배양하였다.

도 2에 나타난 바와 같이, 구 형성 세포가 형성됨을 확인하였다.

<실험예 3> 뇌종양 줄기세포 표지자의 발현 수준 측정 실험

단층세포배양방식과 구 형성 세포배양방식으로 키운 뇌종양 세포주에서 줄기세포 표지자인 CD133, Bmi-1, Sox2, Notch1 및 Nestin의 mRNA 및 단백질 발현 수준을 각각 RT-PCR과 웨스턴 블랏으로 측정하였다.

도 3에 나타난 바와 같이, 구 형성 세포배양방식으로 배양된 뇌종양 줄기세포는 기존 암세포에 비해 Bmi-1은 4배, CD133은 3배, Nestin은 6배, Sox2는 3배 정도 상향 발현됨을 확인하였다.

또한, ROR1은 mRNA 수준에서 기존 암세포 대비 7배 이상, 단백질 수준에서는 4배 이상 높이 발현되었다 (도 4 참조).

아울러, 구 형성 세포배양방식으로 키운 뇌종양 줄기세포의 분리, 배양을 반복하면 뇌종양 줄기세포의 줄기세포 성질이 강해졌고, 이러한 줄기세포 성질이 강해질수록 ROR1의 발현양은 더 높았다 (도 5 참조).

<실험예 4> ROR1 shRNA를 이용한 ROR1 고갈에 따른 줄기세포 성질 및 종양구 형성능, EMT 관련 유전자, 침윤능의 변화 관찰

구 형성 세포배양방식으로 얻은 뇌종양 줄기세포에서 ROR1을 고갈시킨 후 줄기세포 성질을 관찰하고자 ROR1 shRNA (SantaCruz, USA)를 이용하여 세포 내의 ROR1을 고갈시켰다. ROR1의 고갈은 RT-PCR을 통해 확인하였다.

도 6에 나타난 바와 같이, RT-PCR에서 무작위적인 서열의 control shRNA를 트랜스펙션한 뇌종양 줄기세포 대비 Bmi-1, CD133이 하향 발현되었다.

또한, control shRNA를 트랜스펙션한 뇌종양 줄기세포에서는 종양구의 크기가 100㎛ 이상 되는 것이 평균 23개 임에 비해 ROR1을 고갈 뇌종양 줄기세포에는 100㎛ 이상 되는 세포가 만들어지지 않았다 (도 7 참조).

다음으로, ROR1의 고갈이 뇌종양 줄기세포의 다른 조직으로의 전이를 조절하는지 확인하기 위해 EMT 관련 유전자의 측정 및 침윤능을 측정하였다.

이를 위해, 단층세포배양방식과 구 형성 세포배양방식으로 키운 세포에서 암줄기세포에서 더 높은 발현을 보인다고 알려진 EMT 관련 유전자인 N-cadherin, Snail, Twist, Zeb-1의 발현 정도를 측정한 결과, 도 8에 나타난 바와 같이, 3배까지 상향 발현되었으나, ROR1을 고갈 시킨 경우, control shRNA를 트랜스펙션한 뇌종양 줄기세포 대비 N-cadherin, Snail, Twist, Zeb-1이 하향 발현되었다 (도 9 참조).

또한, 침윤능 확인 실험에서 ROR1을 고갈시킨 뇌종양 줄기세포는 control shRNA를 트랜스펙션한 뇌종양 줄기세포 대비 3배 정도 줄어듦을 확인하였다. 즉, ROR1이 뇌종양의 침윤능에 직접적으로 관여하며, 해당 기능을 촉진한다고 할 수 있다 (도 10 참조).

요약하면, 뇌종양 줄기세포에서 ROR1 유전자 또는 단백질의 발현을 억제 (또는 고갈)시키면 줄기세포 관련 성질을 억제하고, 전이능력을 억제함을 알 수 있다.

Claims (7)

1. 분화 또는 전이 조절제로, ROR1 또는 이의 저해제를 포함하고, 상기의 ROR1 저해제는 ROR1 유전자에 상보적인 서열을 포함하는 안티센스-올리고뉴클레오티드, siRNA, shRNA, miRNA 또는 이를 포함하는 벡터; 또는, ROR1 단백질에 특이적인 항체 중 어느 하나인, 뇌종양 줄기세포의 분화 또는 전이 조절용 조성물.
   
2. 뇌종양 줄기세포를 가지는 뇌종양 진단에 필요한 정보를 제공하기 위하여, 인간의 암세포 시료에 있는 ROR1의 발현 수준을 측정하여 뇌종양 줄기세포를 가지는 뇌종양 진단 마커를 검출하는 방법.
   
3. ROR1 유전자에 상보적인 서열을 포함하는 안티센스-올리고뉴클레오티드, siRNA, shRNA, miRNA 또는 이를 포함하는 벡터; 또는, ROR1 단백질에 특이적인 항체 중 어느 하나의 ROR1 저해제를 포함하는 뇌종양의 예방 또는 치료용 조성물.
   
4. 제3항에 있어서,
   상기 뇌종양의 예방 또는 치료용 조성물은 뇌종양 줄기세포의 분화치료 (differentiation therapy) 또는 EMT 억제 치료에 사용하는 것인 뇌종양의 예방 또는 치료용 조성물.
   
5. 제3항에 있어서,
   상기 뇌종양의 예방 또는 치료용 조성물은 항암약물치료제 또는 방사선치료제의 병용투여제로 사용하는 것인 뇌종양의 예방 또는 치료용 조성물.
   
6. ROR1 유전자를 후보물질과 인체 외에서 접촉시키고, 상기 후보물질이 상기 유전자의 발현을 촉진하는지 또는 억제하는지를 측정하여 ROR1 유전자의 발현을 감소시키면 뇌종양의 예방 또는 치료제로 판정하는 것을 포함하는 뇌종양의 예방 또는 치료용 의약의 스크리닝 방법.
   
7. ROR1 단백질을 후보물질과 인체 외에서 접촉시키고, 상기 후보물질이 상기 단백질의 기능 또는 활성을 증진하는지 또는 억제하는지를 측정하여, ROR1 단백질의 기능 또는 활성을 억제하면 뇌종양의 예방 또는 치료제로 판정하는 것을 포함하는 뇌종양의 예방 또는 치료용 의약의 스크리닝 방법.
   

Images