JP2005501931A - ヘパリン類似物質で治療され得る疾患の治療および診断のためのヘパリン類似物質誘導体の使用 - Google Patents
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Abstract
本発明は、ヘパリン類似物質に共有結合するキレート剤、および遷移金属Ｓｃ、Ｔｉ、Ｖ、Ｃｒ、Ｍｎ、Ｆｅ、Ｃｏ、Ｎｉ、Ｃｕ、Ｍｏ、Ｒｕまたはランタニドの系列からの常磁性金属陽イオンを含有するヘパリン類似物質誘導体に関する。前述の誘導体は、治療上のそしてまた診断上の目的のための薬剤の製造、投与量の局在化、さらには疾患例えば血栓症および骨関節症の治療成果の観察に適する。
Description
【技術分野】
【０００１】
本発明はヘパリン類似物質誘導体（heparinoid derivatives）、その製造方法、治療におけるおよび診断上の目的の両方でのその使用、使用する用量の局在化ならびに疾患例えば血栓症および骨関節症の治療の結果の監視のための該誘導体の使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
ヘパリンは動物性器官から分離できる高度にスルホン化されたグリコサミノグリカンであり、肥満細胞において合成され、そしてＤ−グルコサミンおよびＤ−グルクロン酸から成り、約１７０００ダルトンの分子量を有する。
【０００３】
【化１】
【０００４】
これは、二糖類が作られるＤ−グルコサミンとＤ−グルクロン酸とのα−１,４−グリコシド結合を含み、そしてこのヘパリンサブユニットがさらにα−１,４−グリコシド結合により互いに結合してヘパリンが形成される。スルホ基の位置は変動し得るし、四糖類ユニットは４〜５の硫酸残基を含有する。ヘパラン硫酸（ヘパリチン硫酸）はより少数のＯ−およびＮ−結合スルホ基を含有するが、Ｎ−アセチル基もまた含有する。ヘパリンはアニオン性高分子電解質と考えることができる。ヘパリンはタンパク質と結合して特に肝臓（ギリシア語：hepar）に存在し、そして抗凝血物質として体内を循環する血液の凝固を阻止する。ヘパラン硫酸は細胞表面上および多くの組織の細胞外基質においてプロテオグリカン（パールカン）の構成成分として見出されている。ヘパリンはアンチトロンビンIIIのトロンビンに対する阻害作用を強化し、フィブリノーゲンのフィブリンへの変換におけるトロンビンによる触媒作用、および種々の他の凝固因子における触媒作用を阻害する；例えば、プロトロンビンのトロンビンへの変換も阻害し、そしてリポタンパク質リパーゼによるリポタンパク質の分解を活性化する。
【０００５】
ヘパリン類似物質は、ヘパリン様作用を有するあらゆる物質の集合名である。これらはペントサンポリサルフェート、キシランサルフェート、硫酸デキストランまたはキチンサルフェート、イズロン／ウロン酸および／またはグルコサミンの二量体、三量体またはオリゴマーおよび重合体、ランダムまたは規則的配列のペントースおよび／またはヘキソース単位および／またはマンニトールから成るオリゴ糖類または多糖類、ヘパランサルフェート、ヘパリチンサルフェート、ケラタンサルフェートまたはデルマタンサルフェート、ヒアルロン酸、コンドロイチン硫酸Ａ、ＢまたはＣ、非分画ヘパリンおよび分割ヘパリン、エノキサパリン、ナドロパリン（フラキシパリン）、ダルテパリン（フラグミン）、ベミパリン、チンザパリン、アルデパリン、低分子量ヘパリン（ＬＭＷＨ）、超低分子量ヘパリン（ＵＬＭＷＨ）またはそれらに類似する合成多糖類およびその塩、ならびに前述の化合物の連結されたおよび架橋された分子鎖のもの（二量体、三量体またはオリゴマー）、ならびにそれらに結合するペプチド、タンパク質、脂質または核酸を有するヘパリン類似物質を含む。
【０００６】
エノキサパリンは低分子量ヘパリン（ＬＭＷＨ）のクラスに属する活性成分で、アベンティス・ファーマ（Aventis Pharma）の特許（米国5,389,618）により国際的に保護されている。抗血栓性治療のためのエノキサパリンの使用は当業者において確立されている。エノキサパリン−Ｎａは、ブタ腸粘膜からのヘパリンのベンジルエステル誘導体のアルカリ解重合により得られる低分子量ヘパリンのナトリウム塩である。４−エノピラノースウロネート構造の大半量は、その分子鎖の非還元末端にある。
【０００７】
平均分子量は約４５００ダルトンである。
２０００ダルトン未満の分子の含有率は１２％と２０％との間である。２０００と８０００ダルトンとの間の大きさを有する分子鎖の質量含有率は、低分子量ヘパリンに関するヨーロッパ薬局方検定標準の規格に基づいて６８％と８８％との間である。硫酸化の率は、二糖類単位当たり平均で２残基である。
【０００８】
エノキサパリンの多糖の分子鎖は、ヘパリンにおけるのと同様に、グリコシド結合により結合する硫酸化されたグルコサミンおよびウロン酸の交互の単位体から成る。該構造は例えば、解重合の過程で分子鎖の非還元末端に二重結合が生じる点でヘパリンとは異なる。
エノキサパリンは、末端の環における二重結合を示す紫外分光法および13Ｃ核磁気共鳴スペクトルによって、ならびに高速サイズ排除クロマトグラフィーによってヘパリンと識別できる。
【０００９】
骨関節症の病態的状態において、関節軟骨の主要なプロテオグリカンであるアグリカンの分解は、ごく初期のかつ決定的な症状である。軟骨アグリカンの病態的減少は、球間ドメインにおけるタンパク質分解性開裂に起因する。関節損傷、骨関節症または炎症性関節疾患に罹患した患者の関節滑液から分離したプロテオグリカン代謝生成物のアミノ酸配列解析は、タンパク質分解性開裂がヒトアグリカンの球間ドメインにおいてアミノ酸Ｇｌｕ373とＡｌａ374との間で選択的に生じることを示している（Lohmander 他., Arthritis Rheum. 36, (1993), 1214-1222）。この開裂をつかさどるタンパク質分解作用は「アグリカネーゼ」と呼ばれ、そしてメタロプロテイナーゼ（ＭＰ）の上科に帰属させ得る。
【００１０】
亜鉛はメタロプロテイナーゼの触媒的活性部位において必須である。ＭＰはコラーゲン、ラミニン、プロテオグリカン、エラスチンまたはゼラチンを生理的条件下で開裂し、それゆえに骨および結合組織において重要な役割を果たす。
多数の異なるＭＰ阻害剤が既知である（J.S.Skotnicki 他., Ann. N.Y.Acad. Sci. 878, 61-72 [1999]; EP 0 606 046；WO94/28889）。
これらの阻害剤の一部はその特異性に関してあまり特徴付けられていないし、他のものは特にマトリックスメタロプロテイナーゼ（ＭＭＰｓ）に対してある程度選択的に作用する。
【００１１】
アグリカネーゼは別の特異性によりマトリックスメタロプロテイナーゼ（ＭＭＰｓ）とは異なり、アグリカンに生じる特定の開裂部位に対して作用し、そしてＭＭＰｓによって促進される。該開裂は、適当な抗体の使用により検出できる特有のフラグメントを結果として作る。
【００１２】
以前の研究で、エノキサパリンは関節滑液のアグリカネーゼ活性を用量依存的に阻害し、そしてその結果、関節内投与により骨関節症の治療に使用できることが見出された（DE 100 63 006.5）。
しかし、ヘパリン類似物質（多糖類）に固有の不利な点は、分析に利用できる発色団を化学構造中に含有しないことである。この結果、従来の分析法例えば高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）による、治療的に有効な濃度の分析的監視は相当な問題に遭遇する。
【００１３】
適切な感度を有するヘパリン類似物質による抗血栓性治療を監視することは、その生物学的作用、ヘパリン類似物質が触媒する、アンチトロンビンIIIによる第Ｘａ因子の阻害を通じてのみ通常可能である。
ヘパリン類似物質を用いた治療のこの不利な点は、ヘパリン類似物質の抗凝血作用以外の作用に関心が集中する場合に、または局所に限定した治療の症例において、例えば骨関節症の治療における関節内注射または脳卒中、狭心症、塞栓症のための使用または腫瘍療法のような作用部位のヘパリン類似物質の正確な濃度、滞留時間および分布行動を知らなくてはならない場合に、とりわけ不満足かつ不都合である。
【００１４】
一方で、骨関節症のあらゆる既知の治療に関する根本的な問題は、患部の軟骨および骨組織において治療の結果を診断するのが困難なことである。
本発明のヘパリン類似物質誘導体は前述の不利な点を除去できることが現在見出されている。
【００１５】
本発明のヘパリン類似物質誘導体は以下の特徴を有する。
・アグリカネーゼ、ｈＡＤＡＭＴＳ１およびゼラチナーゼＡ（ＭＭＰ−２）の作用に対して強力な阻害剤として作用し、そしてその結果、骨関節症の治療に適する、
・抗凝血性医療用物質としてヘパリンまたはエノキサパリンと同等の抗血栓性作用を示す、
・しかし同時にヘパリン類似物質とは対照的に、作用部位において磁気共鳴画像法（ＭＲＩ）によって直接的に観察可能であり、そのため投与後の局所濃度を監視でき、そして患者における該薬剤の分布行動を追跡できる。本発明のヘパリン類似物質誘導体はこの理由のために、脳卒中、狭心症、塞栓症の症例および腫瘍療法における使用にも特に適する。それらはまた、治療中の軟骨浸透挙動から患部結合組織の状態についての診断上の情報を得る点で骨関節症の症例に非常に適する。
【発明の開示】
【００１６】
したがって本発明は、ヘパリン類似物質に共有結合するキレート剤、および遷移金属Ｓｃ、Ｔｉ、Ｖ、Ｃｒ、Ｍｎ、Ｆｅ、Ｃｏ、Ｎｉ、Ｃｕ、Ｍｏ、ＲｕまたはランタニドＬａ、Ｃｅ、Ｐｒ、Ｎｄ、Ｐｍ、Ｓｍ、Ｅｕ、Ｇｄ、Ｔｂ、Ｄｙ、Ｈｏ、Ｅｒ、Ｔｍ、Ｙｂの系列からの常磁性金属陽イオンを含有するヘパリン類似物質誘導体に関する。
好ましいヘパリン類似物質は例えばエノキサパリンまたはヘパリンである。
【００１７】
キレート剤としてジエチレントリアミン−Ｎ,Ｎ,Ｎ′，Ｎ″，Ｎ″−五酢酸二無水物（ＤＴＰＡ無水物）、１,２−ビス（２−アミノエトキシエタン）−Ｎ,Ｎ,Ｎ′，Ｎ′−四酢酸（ＥＧＴＡ）、エチレンジアミン−Ｎ,Ｎ,Ｎ′，Ｎ′−四酢酸（ＥＤＴＡ）、１,４，７,１０−テトラアザシクロドデカン−１,４,７,１０−四酢酸（ＤＯＴＡ）、１,４,７,１０−テトラアザシクロドデカン−１,４,７−三酢酸（ＤＯ３Ａ）、ニトリロ三酢酸（ＮＴＡ）、トリエチレンテトラアミン六酢酸（ＴＴＨＡ）、４−カルボキシ−５,８,１１−トリス（カルボキシメチル）−１−フェニル−２−オキサ−５,８,１１−トリアザトリデカン−１３−オイック酸（ＢＯＰＴＡ）またはＮ,Ｎ′−ビス（ピリドキサル−５−リン酸）エチレンジアミン−Ｎ,Ｎ′−二酢酸（ＤＰＤＰ）を含有するヘパリン類似物質誘導体が好ましいものとして挙げられる。
該キレート剤の酸無水物は化学修飾に使用するのに好ましく用いられ、ジエチレントリアミン−Ｎ,Ｎ,Ｎ′，Ｎ″，Ｎ″−五酢酸二無水物（ＤＴＰＡ無水物）は特に好ましい。
【００１８】
特に好ましい常磁性金属陽イオンはＧｄ3+で、塩化ガドリニウム（III）六水和物または酢酸ガドリニウム（III）水和物というその塩の形態で使用される。
【００１９】
本発明はさらに、遷移元素またはランタニドの含有量が、ヘパリン類似物質のモル当たり１モルから該ヘパリン類似物質の誘導体化に可能な最大量までの範囲、好ましくはヘパリン類似物質のモル当たり１モル〜２０モルの範囲であり得るヘパリン類似物質誘導体に関する。
【００２０】
本発明はまた、本発明のヘパリン類似物質誘導体を製造する方法であって、該ヘパリン類似物質を活性キレート剤と反応させてヘパリン類似物質キレート化合物を得て、そして次に遷移元素またはランタニドを付加することを含む方法に関する。
【００２１】
本発明のヘパリン類似物質誘導体の製造方法は例えば、最初にヘパリン類似物質が緩衝液に溶解される。
適当な緩衝液はｐＨ６.０〜１０.０、好ましくはｐＨ８.８を有する。
緩衝液の濃度は０.０１〜０.５モル濃度、好ましくは０.１モル濃度である。適当な緩衝液の例は炭酸緩衝液、ホウ酸緩衝液またはスルホン酸をベースにした生物学的緩衝液、好ましくはＨＥＰＥＳ（Ｎ−(２−ヒドロキシエチル)ピペラジン−Ｎ′−（２−エタンスルホン酸））である。次いで活性キレート剤例えばＤＴＰＡ無水物を添加する。活性キレート剤は固体の形態で、または溶液として添加できる。
反応は８℃〜３７℃、好ましくは２４℃の温度で実施する。ｐＨは好ましくは反応中一定に維持される。
【００２２】
活性キレート剤対ヘパリン類似物質の割合は、分子量に基づいて１：１〜５０：１、好ましくは１.５：１〜１５：１である。
この後、好ましくはヘパリン類似物質キレート化合物のさらなる精製なしに、遷移元素またはランタニドを添加する。
錯体化は０℃〜３７℃、好ましくは４℃の温度で実施する。ｐＨは弱酸性値に変化し、そしてその後この値で一定に止めるのが好ましい。該ｐＨは６.８〜５、好ましくは６.５である。
【００２３】
ヘパリン類似物質キレート化合物対遷移元素またはランタニドの割合は、分子量に基づいて１：１〜１：５０、好ましくは１：１.５〜１：１５である。
生成した本発明のヘパリン類似物質誘導体は、意図する使用に応じてさらに精製できる。例えば、塩を透析またはゲル濾過により除去できる。生じた生成物は次いで凍結乾燥され得る。
【００２４】
エノキサパリンおよびエノキサパリンの生理学的に許容される塩は既知であり、そして例えば米国5,389,618に記載されているように製造できる。それらは、ヘパリンを形成する多糖類の基本構造を有する硫酸化多糖類の混合物であり、ヘパリンの平均分子量より低い約４５００ダルトンの平均分子量を有し、２０００ダルトン未満の分子量の分子鎖を９％〜２０％そして８０００ダルトンを超える分子量の分子鎖を５％〜２０％のみ含有し、さらにはそれらにおける数平均分子量に対する重量平均分子量の比率が１.３〜１.６であることを特徴とする。
【００２５】
本発明はまた、薬学的に適するそして生理学的に許容される担体、添加剤および／または他の有効成分および賦形剤と共に、少なくとも１つのヘパリン類似物質誘導体および／またはヘパリン類似物質誘導体の生理学的に許容される塩の有効量を有する薬剤に関する。
【００２６】
生理学的に許容される塩は、塩の形成が可能なヘパリン類似物質誘導体から、本質的に既知の方法で製造される。このカルボン酸は安定なアルカリ金属塩、アルカリ土類金属塩を形成し、あるいは妥当な場合には塩基性試薬例えば水酸化物、炭酸塩、炭酸水素塩、アルコラートおよびアンモニアまたは有機塩基例えばトリメチルアミンもしくはトリエチルアミン、エタノールアミンもしくはトリエタノールアミンもしくは他の塩基性アミノ酸例えばリシン、オルニチンもしくはアルギニンで置換されたアンモニウム塩を形成する。
ヘパリン類似物質誘導体が塩基性基を有する場合には、強酸を用いて酸付加塩を生成することも可能である。この目的に適当なのは無機酸および有機酸の両方であって、例えば塩酸、臭化水素酸または硫酸、リン酸、メタンスルホン酸、ベンゼンスルホン酸、ｐ−トルエンスルホン酸、４−ブロモベンゼンスルホン酸、シクロヘキシルスルファミン酸、トリフルオロメチルスルホン酸、酢酸、シュウ酸、酒石酸、コハク酸またはトリフルオロ酢酸である。
【００２７】
本発明はまた、薬剤を製造する方法であって、薬学的に適するそして生理学的に許容される担体および、妥当な場合には他の適当な有効成分、添加剤または賦形剤を用いて、本発明のヘパリン類似物質誘導体から適当な剤形を調製することを含む方法に関する。頻繁に使用されそして名称を挙げ得る賦形剤には乳糖、マンニトールおよび他の糖、炭酸マグネシウム、ラクトアルブミン、ゼラチン、デンプン、セルロースおよびその誘導体、動物油および植物油例えば魚肝油、ヒマワリ油、ラッカセイ油またはゴマ油、ポリエチレングリコールならびに溶媒例えば滅菌水、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）および一価または多価のアルコール例えばグリセリンがある。
【００２８】
その薬学的特性のために本発明のヘパリン類似物質誘導体は、タンパク質分解酵素例えばメタロプロテイナーゼの異化作用の増大が決定的な役割を果たすという経過のあらゆる疾患の予防および治療に適する。
これは例えば、変形性関節症、例えば骨関節症、脊椎症、関節外傷後あるいは半月板もしくは膝蓋骨の損傷または靱帯切断に続く関節の持続的固定化後の軟骨融解における、また結合組織の疾患例えば膠原病、歯周病、創傷治癒の障害および運動系の慢性疾患例えば炎症、免疫学または代謝の関連する急性および慢性関節炎、関節症、筋肉痛ならびに骨組織代謝の障害における症例である。
【００２９】
本発明のヘパリン類似物質誘導体はさらに抗血栓剤として有利に使用できる。それらは危険性のある状態における静脈血栓形成を予防するために特に使用できる。これはまた、危険性が慢性である状態にもあてはまる。本発明のヘパリン類似物質誘導体は一定用量を用いて、整形外科における血栓の症状の危険性を減らすことが特に可能である。
【００３０】
本発明のヘパリン類似物質誘導体の有利な治療的使用は動脈血栓症状の予防に基づくものであって、特に、不安定狭心症または再発性狭心症に関連する心筋梗塞の症状におけるものである。本発明のヘパリン類似物質誘導体のさらに興味深い使用は、手術後の外科患者における静脈血栓形成を予防するためにそれらを使用する可能性に基づくものである。この使用は、手術中の出血の危険を回避できるので格別に有利である。本発明のヘパリン類似物質誘導体を血管造影後ならびに狭窄および再狭窄の治療に使用することは同様に有利である。
【００３１】
本発明のヘパリン類似物質誘導体のさらに可能な適用は、腫瘍学における腫瘍および癌転移の治療（抗増殖性作用）、炎症性疾患の治療（抗炎症性作用）、中枢神経系（ＣＮＳ）の疾患および移植における有利な作用に関する。加えて、心筋および脳の梗塞に関連する虚血（梗塞の大きさの縮小）、喘息（トリプターゼに対する作用）または血管形成（ＦＧＦ媒介性細胞増殖を促進する作用）に投与が可能である。
【００３２】
本発明のヘパリン類似物質誘導体は一般的に非経口的に投与する。それは皮下、関節内、腹腔内または静脈内注射により実施できる。直腸的、経口的、吸入的または経皮的投与がさらに可能である。骨関節症には関節内注射が好ましい。
【００３３】
該医薬製剤は投薬単位で製造しそして投与するのが好ましく、各単位は有効成分として本発明のヘパリン類似物質誘導体の特定の用量を含有する。
この用量はアンプルの形態の注射液剤では約０.５μｇ〜約２００mg、全身投与では好ましくは約１０mg〜８０mg、そして局所投与では好ましくは１μｇ〜１０mgであり得る。
【００３４】
本発明はまた、経過にメタロプロテイナーゼの活性上昇を伴う疾患の進行の観察および診断のための、本発明のヘパリン類似物質誘導体の使用に関する。
本発明はまた、診断検査方式を作成するための本発明のヘパリン類似物質誘導体の使用に関する。
本発明はさらに、治療の結果および疾患の機能的特徴を観察するための診断検査方式の使用に関する。
【実施例】
【００３５】
〔実施例１〕
エノキサパリンの製造
１．エステル化
塩化メチレン７５ml中のベンゼトニウムヘパリネート１５ｇの溶液に塩化ベンジル１５mlを添加した。その溶液を３５℃の温度に加熱し、それを２５時間保持した。次いで、メタノール中の１０％強度の酢酸ナトリウム溶液９０mlを添加し、続いて濾過し、メタノールで洗浄しそして乾燥した。これによりナトリウム塩の形態でヘパリンベンジルエステル６.５ｇが得られ、そして前述のとおりに特定されるそのエステル化の程度は１３.３％であった。
２．解重合
前述で得られたナトリウム塩の形態のヘパリンベンジルエステル１０ｇを水２５０mlに溶解した。この溶液を６２℃に加熱し、そして水酸化ナトリウム０.９ｇの溶液を添加した。温度を６２℃で１時間３０分保持した。次いで反応混合物を２０℃に冷却し、希塩酸を添加して中和した。次いで、反応薬剤の濃度を塩化ナトリウム中で１０％に調節した。生成物を最終的にメタノール７５０ml中に沈殿させ、濾過した後乾燥した。これにより、以下の構造的特徴を有するある種のヘパリンが生じた。
平均分子量約４５００ダルトン
分子分布：
２０００ダルトン未満の分子量の分子鎖２０％
８０００ダルトンを超える分子量の分子鎖５.５％
分散：ｄ＝１.３９
【００３６】
〔実施例２〕
エノキサパリン誘導体（ＥＮ−１５）の製造
０.１モル濃度のｐＨ８.８のＨＥＰＥＳ緩衝液５mlにエノキサパリン（実施例１に記載したとおりに生成した固体）１００mgを溶解した。２４℃で攪拌しながら、投入したエノキサパリンの量に対して１５倍のモル過剰の試薬に相当する、ジエチレントリアミン−Ｎ,Ｎ,Ｎ′，Ｎ″，Ｎ″−五酢酸二無水物（ＤＴＰＡ無水物）１１９mgおよびジメチルスルホキシド０.３４mlから生成した調製懸濁液を滴下した。
その添加の間ｐＨを測定し、そして１モル濃度の水酸化ナトリウム溶液を計量して入れることによりｐＨ８.８で保持した。反応混合物を室温で３０分間激しく攪拌した。この間、必要であれば１モル濃度の水酸化ナトリウム溶液をさらに添加することにより、ｐＨを一定に保持した。次いで、同様に現時点のエノキサパリンに対して１５倍のモル過剰に相当する固体の塩化ガドリニウム（III）六水和物１２３.８mgを混合物に添加した。１Ｎ塩酸の滴定によりｐＨを６.５に調節した。反応混合物を４℃で２４時間さらに攪拌した。
修飾エノキサパリン分画を脱塩し、そしてセファデックス（Sephadex）Ｇ−２５(R)上のゲル濾過により未反応試薬から分離した。この目的のために、商業的に入手可能なファルマシア（Pharmacia）ＰＤ−１０(R)充填済みカラムを製造者の記載にしたがって使用することもできる。
該修飾エノキサパリンを凍結乾燥した。
修飾エノキサパリン９１mgを得た。第Ｘａ因子阻害試験は、本来のエノキサパリンの阻害力に相当する阻害力を示した。誘導結合プラズマ原子発光分光法によるガドリニウムの取り込みの分析によって、エノキサパリンのモル当たりガドリニウム２モルの平均含有量が明らかになった。
【００３７】
〔実施例３〕
エノキサパリン誘導体（ＥＮ−１５Ａ）の製造
エノキサパリン（固体）２ｇを０.１モル濃度のｐＨ８.８のＨＥＰＥＳ緩衝液１００mlに溶解した。２４℃で攪拌しながら、投入したエノキサパリンの量に対して１５倍のモル過剰の試薬に相当する、ビス（２−アミノエチル）アミン−Ｎ,Ｎ,Ｎ′，Ｎ″，Ｎ″−五酢酸二無水物（ＤＴＰＡ無水物）２.３８ｇおよびジメチルスルホキシド６.８mlから生成した調製懸濁液を滴下した。
その添加の間ｐＨを測定し、そして１モル濃度の水酸化ナトリウム溶液を計量して入れることによりｐＨ８.８で保持した。反応混合物を室温で３０分間激しく攪拌した。この間、必要であれば１モル濃度の水酸化ナトリウム溶液をさらに添加することにより、ｐＨを一定に保持した。次いで、同様に存在するエノキサパリンに対して１５倍のモル過剰に相当する固体の塩化ガドリニウム（III）六水和物２.４８ｇを混合物に装入し攪拌した。１モル濃度の塩酸の滴定によりｐＨを６.５に調節した。反応混合物を４℃で２４時間さらに攪拌した。修飾エノキサパリン分画を脱塩し、そして商業的に入手可能な透析チューブ（分子量分離限度１０００）における、合計４容量毎に対して水５Ｌの２４時間の透析により未反応試薬を除去した。この間、最初に投入した水を１時間後、３時間後および１６時間後に新しい水と交換した。次いで、管の内容物を凍結乾燥した。
修飾エノキサパリン１.７７ｇを得た。
生成物を、発熱性物質を含まない水を用いてセファデックス（Sephadex）Ｇ−２５(R)上のゲル濾過により好ましくは再度精製した。第Ｘａ因子阻害試験は、本来のエノキサパリンの阻害力に相当する阻害力を示した。誘導結合プラズマ原子発光分光法によるガドリニウムの取り込みの分析によって、エノキサパリンのモル当たりガドリニウム５モルの含有量が明らかになった。
【００３８】
〔実施例３ａ〕
エノキサパリン誘導体（ＥＮ−１５Ｂ）の製造
０.１モル濃度のｐＨ８.８のＨＥＰＥＳ緩衝液１００mlにエノキサパリン（固体）２ｇを溶解した。２４℃で攪拌しながら、投入したエノキサパリンの量に対して１５倍のモル過剰の試薬に相当する、ビス（２−アミノエチル）アミン−Ｎ,Ｎ,Ｎ′，Ｎ″，Ｎ″−五酢酸二無水物（ＤＴＰＡ無水物）２.３８ｇおよびジメチルスルホキシド６.８mlから生成した調製懸濁液を滴下した。
その添加の間ｐＨを測定し、そして１モル濃度の水酸化ナトリウム溶液を計量して入れることによりｐＨ８.８で保持した。反応混合物を室温で３０分間激しく攪拌した。この間、必要であれば１モル濃度の水酸化ナトリウム溶液をさらに添加することにより、ｐＨを一定に保持した。次いで、同様に存在するエノキサパリンに対して１５倍のモル過剰に相当する固体の塩化ガドリニウム（III）六水和物２.４８ｇを混合物に装入し攪拌した。
１Ｎ塩酸の滴定によりｐＨを６.５に調節した。反応混合物を４℃で２４時間さらに攪拌した。この段階の後、エタノールアミン０.４mlを添加し、そしてその混合物を室温でさらに３０分間攪拌した。最終的に、塩酸を添加してｐＨを７.０に調節した後、４倍の容量のメタノールで希釈することにより反応混合物を沈殿させた。沈殿物を吸引漏斗上に濾別し、そして純水３０ml中に高濃度で再度溶解した。
【００３９】
修飾エノキサパリンを脱塩し、そして商業的に入手可能な透析チューブ（分子量分離限度１０００）における、合計４容量毎に対して水０.５Ｌの２４時間の透析により未反応試薬を除去した。この間、最初に投入した水を１時間後、３時間後および１６時間後に新しい水と交換した。次いで、管の内容物を凍結乾燥した。
比較的少ない容量の脱塩では、商業的に入手可能なゲル濾過カラム（例えばPharmacia HiPrep(R) desalting）を用いて時間を短縮することが可能である。次いで、脱塩した分画を同じ方法で凍結乾燥する。
修飾エノキサパリン１.８６ｇを得た。第Ｘａ因子阻害試験は、本来のエノキサパリンに比較して阻害力が低下していないことを示した。誘導結合プラズマ原子発光分光法によるガドリニウムの取り込みの分析によって、エノキサパリンのモル当たりガドリニウム２.７モルの含有量が明らかになった。
【００４０】
〔実施例４〕
３倍、８倍および５０倍過剰のＤＴＰＡ無水物ならびに塩化ガドリニウム（III）六水和物を用いたエノキサパリン誘導体もまた、実施例２におけるのと同様に製造された。この化合物を以下においては略してＥＮ−３、ＥＮ−８およびＥＮ−５０と記載する。
５０倍過剰のＤＴＰＡ無水物と反応させたが、続いてガドリニウムイオンを加えられなかった生成物を、実施例２におけるのと同様に製造した。以下においてＥＮ−５０Ｚと記載するこの生成物は、増加した陰イオン性電荷およびそれに応じて変化した薬理学的特性を有するエノキサパリン誘導体に該当するが、他の例えばさらに反応性に富んだ陽イオンと一緒にしてキレート化前駆体として単純な方法で使用することもできるので、特に興味深い誘導体でもある。
【００４１】
〔実施例５〕
ヘパリン誘導体（ＨＥ−１５Ｂ）の製造
商業的に入手可能なヘパリンナトリウム（固体；シグマ（Sigma）H4784）２ｇを、０.１モル濃度のｐＨ８.８のＨＥＰＥＳ緩衝液１００mlに溶解した。２４℃で攪拌しながら、ビス（２−アミノエチル）アミン−Ｎ,Ｎ,Ｎ′，Ｎ″，Ｎ″−五酢酸二無水物（ＤＴＰＡ無水物）１.１９ｇおよびジメチルスルホキシド３.４mlから生成した調製懸濁液を滴下した。
その添加の間ｐＨを測定し、そして１モル濃度の水酸化ナトリウム溶液を計量して入れることによりｐＨ８.８で保持した。反応混合物を室温で３０分間激しく攪拌した。この間、必要であれば１モル濃度の水酸化ナトリウム溶液をさらに添加することにより、ｐＨを一定に保持した。次いで、固体の塩化ガドリニウム（III）六水和物１.２４ｇを混合物に装入して攪拌した。
１Ｎ塩酸の滴定によりｐＨを６.５に調節した。この段階の後、エタノールアミン０.２mlを添加し、そしてその混合物を室温でさらに３０分間攪拌した。最終的に、塩酸を添加してｐＨを７.０に調節した後、４倍の容量のメタノールで希釈することにより反応混合物を沈殿させた。沈殿物を吸引漏斗上に濾別し、そして純水３０ml中に高濃度で再度溶解した。
【００４２】
修飾ヘパリンを脱塩し、そして商業的に入手可能な透析チューブ（分子量分離限度１０００）における、合計４容量毎に水０.５Ｌの２４時間の透析により未反応試薬を除去した。この間、最初に投入した水を１時間後、３時間後および１６時間後に新しい水と交換した。次いで、管の内容物を凍結乾燥した。
比較的少ない容量の脱塩では、商業的に入手可能なゲル濾過カラム（例えばPharmacia HiPrep(R) desalting）を用いて時間を短縮することが可能である。次いで、脱塩した分画を同じ方法で凍結乾燥した。
修飾ヘパリン１.６５ｇを得た。第Ｘａ因子阻害試験は、本来のヘパリンに比較して阻害力が低下していないことを示した。誘導結合プラズマ原子発光分光法によるガドリニウムの取り込みの分析によって、ヘパリンのモル当たりガドリニウム１.９モルの含有量が明らかになった。
【００４３】
〔実施例６〕
第Ｘａ因子に対するヘパリン類似物質依存性阻害を調査するための試験方式
試験の原理
アンチトロンビンIIIおよび過剰量の第Ｘａ因子を、ヘパリン類似物質を含有する試験試料に添加すると、試験試料中のヘパリン類似物質がアンチトロンビンIIIと結合して錯体になり、第Ｘａ因子を不活性化する。第Ｘａ因子の残存活性は、合成色素生成基質を用いて測定できる。この場合には、パラ−ニトロアニリンが酵素による開裂により該基質から遊離し、そして単位時間当たりの４０５nmの波長における吸光度の変化の測定を通じて測光により検出できる。遊離したパラ−ニトロアニリンの量は、試験試料中のヘパリン類似物質の濃度に逆比例する（Teien M.L.他, Thromb. Res. 8(3), 413-6 [1976] ）。調査する薬剤のヘパリン類似物質の漸増的濃度によって、一連の検量線が作成される（濃度に対する相関関係としての、単位時間当たりの吸光度の変化）。ヘパリン類似物質の濃度を、単位時間当たりの試験試料の吸光度の変化から比較により見出すことができる。
【００４４】
試験方法
検量線は、０.５μｇ／ml〜３μｇ／mlの範囲のヘパリン類似物質の濃度を用いて作成するのが好ましい。
この濃度の一連の試料を、０.１５Ｍ ＮａＣｌ、０.００７Ｍ ＥＤＴＡ、０.１％ツイーン（Tween）８０およびヒトアンチトロンビンIII０.１２ＩＵを含有するｐＨ８.４の０.０４６Ｍ トリス（Tris）緩衝液を用いて１：１０に希釈する。希釈した試料の５０μｌの部分に、ウシ第Ｘａ因子（１３.６Ｕ／ml）５０μｌを加えて３７℃で８０秒間インキュベートする。次いで、１.１ｍＭ色素生成基質Ｓ−２７６５ ５０μｌを添加する。毎分の４０５nmの波長における吸光度の変化を光度計で測定する。
適当に事前に希釈した試験試料の５０μｌの部分を、同じ様式にしたがって処理する。
表１はその結果を示す。
【００４５】
【表１】
【００４６】
〔実施例７〕
アグリカネーゼ試験方式
該試験は９６穴マイクロタイタープレート仕様で実施する。
標識エノキサパリンの一連の希釈溶液は、調製用純水で調製する。
温浸：
該試験条件下で４０５ｎｍにおいて１.０〜１.４の吸光度を生じる、関節滑液またはアグリカネーゼ活性の事前に特定した量を、標識エノキサパリンの各希釈溶液３μｌと共に各ウェル中で混合し、ダルベッコ修飾イーグル培地（ＤＭＥＭ）を用いて最終容量３００μｌに調製して、そしてＣＯ2細胞培養インキュベーター中３７℃で１時間インキュベートする。
次いで、Agg1mut基質（Bartnik E. 他., EP 785274 (1997)に開示のとおり；ＤＭＥＭ中の基質）１μｇ／μｌの溶液５μｌを各ウェルに添加した後、その混合物をＣＯ2インキュベーター中３７℃で４時間消化する。
【００４７】
試験プレートの調製
最初の工程では、商業的に入手可能な抗マウス免疫グロブリンＧ（ヤギ由来；ｐＨ７.４の生理的リン酸緩衝液[ＰＢＳ緩衝液]中５μｇ／ml）の溶液１００μｌを用いて、室温で１時間各ウェルをコートする。０.１％ツイーン２０を添加したＰＢＳ緩衝液（以下において洗浄緩衝液と呼ぶ）で該プレートを洗浄した後、０.０５％ツイーン２０を添加したＰＢＳ緩衝液中の５％ウシ血清アルブミンの溶液１００μｌで各ウェルを室温で１時間ブロックする。
洗浄緩衝液で再度洗浄した後、０.０５％ツイーン２０および０.５％ウシ血清アルブミンを添加したＰＢＳ緩衝液中のＢＣ−３抗体の１：１０００の希釈溶液１００μｌを用いて、各ウェルを室温で１時間温置する；この抗体はアグリカネーゼ特有の開裂フラグメントを認識する（Hughes C.E.他, Biochem. J. (1995), 305 (3), 799-804）。
【００４８】
試験方法
該試験プレートを洗浄緩衝液で洗浄した後、前述の消化からの完全混合物をウェル毎にウェルから試験プレートへ移し、そして室温で１時間インキュベートする。プレートを洗浄緩衝液で洗浄した後、第二抗体（ヤギ抗ヒトＩｇＧ、ペルオキシダーゼ標識、０.５％ＢＳＡ／ＰＢＳ緩衝液／０.０５％ツイーン２０中１：１０００）１００μｌを添加し、そしてこれに対するインキュベートを室温で１時間再度実施する。
洗浄緩衝液で再度洗浄した後、ＡＢＴＳ基質溶液（６０ｍＭリン酸水素二ナトリウムを添加した４０ｍＭクエン酸ナトリウム中の２,２′−アジノビス（３−エチルベンゾチアゾリンスルホン酸２mg／mlで、酢酸でｐＨ４.４に調節したもの；ml当たり３５％過酸化水素０.２５mlを測定直前に添加）１００μｌの添加により着色が生じる。振とう様式で、５秒間隔の自動読み取りで対照フィルター（６２０nm）を対照に４０５nmでの測定を実施する。１.０〜１.４の範囲における最大吸光度（４０５nm）に達したら、直ちに試験を中止する。
【００４９】
【表２】
【００５０】
〔実施例８〕
磁気共鳴画像法実験
実施例３および４に記載した本発明のヘパリン類似物質誘導体ＥＮ−３、ＥＮ−８、ＥＮ−１５およびＥＮ−５０を、０.０１、０.１、１.０および１０.０ｍＭの濃度で蒸留水に溶解した後、０.５ミリリットルの容量のエッペンドルフ試験管に装入する。各試験管を、１.５ミリリットルの容量を有しそして蒸留水を満たした、より大きなエッペンドルフ試験管に挿入する。後者の試験管をプラスチック製の試験管立てに配列した後、ブルカー・メディカル有限責任会社（Bruker Medical GmbH, Ettlingen）製の磁気共鳴画像システムにおいて７テスラの磁場強度で画像化する。溶液中の水の水素イオンの緩和時間に対する本発明のヘパリン類似物質誘導体の作用を記載するために、ブルカー・メディカル有限責任会社により開発されたソフトウェア「パラヴィジョン（Paravision）(R)」を用いて、対照的な特徴が異なるＭＲ画像を測定する。すべての試験管を同時に画像で見るために、層厚２mmの冠状の（＝水平な）スライス面を選択する。
【００５１】
Ｔ１強調スピンエコー画像（エコー時間ＴＥ＝１３ミリ秒、緩和時間ＴＲ＝１００ミリ秒、１エコー、ＮＡ＝２、マトリックス２５６2）において、１０ｍＭの濃度におけるすべての誘導体に関して試験管はシグナルの減少を示し、そしてＥＮ−５０およびＥＮ−１５に関しては、エノキサパリンのモル当たりガドリニウムのより高い濃度による磁場の均一性の局所的障害のために画像の一様な変形が存在する。０.１ｍＭの濃度のＥＮ−５０およびＥＮ−１５を有する試験管ならびに１.０ｍＭの濃度の誘導体ＥＮ−８およびＥＮ−３を有する試験管の周囲の蒸留水のシグナルに関しては、約１０のファクターによるシグナルの増大が存在する。残りの試験管におけるシグナルの増大は、本発明のヘパリン類似物質誘導体のより低い濃度およびガドリニウムのより低い相応する濃度にしたがって減少する。
各溶液に対するＴ２緩和時間を、１６の個々のエコーを有するスピンエコー実験で測定した（ＴＥ＝１３ミリ秒、ＴＲ＝３０００ミリ秒、１６エコー、ＮＡ＝１、マトリックス２５６2）。結果を数値で表３に要約する。本発明のヘパリン類似物質誘導体のすべての１０ｍＭ溶液においてはＴ２時間が非常に短いために、Ｔ２時間を確実に測定することはもはやできない。これらの測定条件下で測定された純粋な蒸留水に対するＴ２時間（９０７ミリ秒）に基づいて、６０のファクターによる最大の短縮に達する。Ｔ２時間の短縮は、本発明のヘパリン類似物質誘導体の濃度および個々の相応するガドリニウムの濃度に比例する。
【００５２】
要約
本発明のヘパリン類似物質誘導体は、その濃度に応じてそしてエノキサパリンに対するガドリニウムのモル比に応じて、本発明のヘパリン類似物質誘導体を含有する溶液の水の水素イオンの緩和時間Ｔ１、Ｔ２およびＴ２*を短縮するので、Ｔ１強調ＭＲＩ画像においてシグナル強度の増大または部分的なもしくは全体的なシグナルの減少すら存在することをＭＲＩ測定は示す。
【００５３】
【表３】
【００５４】
規定のミリモル濃度における、本発明のヘパリン類似物質誘導体の溶液中の水の水素イオンのＴ２時間（ミリ秒）を測定。
該Ｔ２時間は、３２の個々のエコーを用いたスピンエコー画像の結果を用いて測定する。周囲の蒸留水におけるＴ２緩和の平均は９０７ミリ秒である（検出不可*＝非常に短いためにＴ２を確実に測定することはできない）。
【００５５】
〔実施例９〕
磁気共鳴画像法実験
ブタ（体重約４０kg、月齢４カ月）の摘出した膝関節を露出させた。１つの関節丘のみがＥＮ−１５Ａの溶液（生理食塩水中０.１ｍＭ、室温）に浸るように、プラスティック製容器中に関節を固定した。高度の空間分解能（３Ｄ画素サイズ約１４０×１８０μｍ、層の厚さ２ｍｍ）を有するＴ１強調スピンエコー画像を、１４時間の期間において３０分毎に記録した。画像スライスは関節丘および骨幹を通じておよそ矢状（sagittal）であり、そして最高７mmの厚さに達する、軟骨の薄い灰色の層に囲まれた海綿質の灰色から黒色の部分を示す。骨／骨および軟骨／周囲の溶液の界面は明確に明らかである。
【００５６】
ＥＮ−１５Ａ溶液中に浸漬後数時間で、軟骨の外側の層の外見に変化が存在した。新規な層状構造が形成され、そして軟骨の表面におよそ平行に走行する。すなわち、表面近くに第一の薄い（幅約１４０μｍ）過度に色の濃い層、続いてより幅広の（幅約５００μｍ）比較的色の薄い層である。シグナルの減少はこの第二の層において次第に生じるが、ＥＮ−１５Ａの濃度の増加とこの軟骨帯におけるＥＮ−１５Ａの移動度の著しい低下との両方によって説明することができる。なぜなら両方の影響は、シグナルをもはや測定できないほどのシグナルの急速な減少を誘発し得るからである。
後者の層に続いて、過度に色の濃い第三の層があり、この層は第一と同様の幅および明るさを有した。第二に比べて約２〜３倍幅広である、第四の非常に過度に色の濃い層が続いた。さらに第五の層がその次に見られるはずであり、そのシグナル強度は第一または第三の層のシグナル強度におよそ相当するが、第三より幾分幅広であった。
軟骨表面からＥＮ−１５Ａの最も深い面までの距離は約１.６〜１.７mmである。
【００５７】
要約
本発明のヘパリン類似物質誘導体は、ブタの摘出した大腿の関節丘の生来の無処置の軟骨へと浸透し、軟骨における水の水素イオンの緩和時間Ｔ１、Ｔ２およびＴ２*に対する影響のために、本発明のヘパリン類似物質誘導体はＭＲシグナル強度に変化をもたらし、水の水素イオンの緩和時間Ｔ１、Ｔ２およびＴ２*におけるこの変化は、軟骨内部の本発明のヘパリン類似物質誘導体の移動度の低下によって増大することをＭＲＩ測定は示す。
【０００１】
本発明はヘパリン類似物質誘導体（heparinoid derivatives）、その製造方法、治療におけるおよび診断上の目的の両方でのその使用、使用する用量の局在化ならびに疾患例えば血栓症および骨関節症の治療の結果の監視のための該誘導体の使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
ヘパリンは動物性器官から分離できる高度にスルホン化されたグリコサミノグリカンであり、肥満細胞において合成され、そしてＤ−グルコサミンおよびＤ−グルクロン酸から成り、約１７０００ダルトンの分子量を有する。
【０００３】
【化１】
これは、二糖類が作られるＤ−グルコサミンとＤ−グルクロン酸とのα−１,４−グリコシド結合を含み、そしてこのヘパリンサブユニットがさらにα−１,４−グリコシド結合により互いに結合してヘパリンが形成される。スルホ基の位置は変動し得るし、四糖類ユニットは４〜５の硫酸残基を含有する。ヘパラン硫酸（ヘパリチン硫酸）はより少数のＯ−およびＮ−結合スルホ基を含有するが、Ｎ−アセチル基もまた含有する。ヘパリンはアニオン性高分子電解質と考えることができる。ヘパリンはタンパク質と結合して特に肝臓（ギリシア語：hepar）に存在し、そして抗凝血物質として体内を循環する血液の凝固を阻止する。ヘパラン硫酸は細胞表面上および多くの組織の細胞外基質においてプロテオグリカン（パールカン）の構成成分として見出されている。ヘパリンはアンチトロンビンIIIのトロンビンに対する阻害作用を強化し、フィブリノーゲンのフィブリンへの変換におけるトロンビンによる触媒作用、および種々の他の凝固因子における触媒作用を阻害する；例えば、プロトロンビンのトロンビンへの変換も阻害し、そしてリポタンパク質リパーゼによるリポタンパク質の分解を活性化する。
【０００５】
ヘパリン類似物質は、ヘパリン様作用を有するあらゆる物質の集合名である。これらはペントサンポリサルフェート、キシランサルフェート、硫酸デキストランまたはキチンサルフェート、イズロン／ウロン酸および／またはグルコサミンの二量体、三量体またはオリゴマーおよび重合体、ランダムまたは規則的配列のペントースおよび／またはヘキソース単位および／またはマンニトールから成るオリゴ糖類または多糖類、ヘパランサルフェート、ヘパリチンサルフェート、ケラタンサルフェートまたはデルマタンサルフェート、ヒアルロン酸、コンドロイチン硫酸Ａ、ＢまたはＣ、非分画ヘパリンおよび分割ヘパリン、エノキサパリン、ナドロパリン（フラキシパリン）、ダルテパリン（フラグミン）、ベミパリン、チンザパリン、アルデパリン、低分子量ヘパリン（ＬＭＷＨ）、超低分子量ヘパリン（ＵＬＭＷＨ）またはそれらに類似する合成多糖類およびその塩、ならびに前述の化合物の連結されたおよび架橋された分子鎖のもの（二量体、三量体またはオリゴマー）、ならびにそれらに結合するペプチド、タンパク質、脂質または核酸を有するヘパリン類似物質を含む。
【０００６】
エノキサパリンは低分子量ヘパリン（ＬＭＷＨ）のクラスに属する活性成分で、アベンティス・ファーマ（Aventis Pharma）の特許（米国5,389,618）により国際的に保護されている。抗血栓性治療のためのエノキサパリンの使用は当業者において確立されている。エノキサパリン−Ｎａは、ブタ腸粘膜からのヘパリンのベンジルエステル誘導体のアルカリ解重合により得られる低分子量ヘパリンのナトリウム塩である。４−エノピラノースウロネート構造の大半量は、その分子鎖の非還元末端にある。
【０００７】
平均分子量は約４５００ダルトンである。
２０００ダルトン未満の分子の含有率は１２％と２０％との間である。２０００と８０００ダルトンとの間の大きさを有する分子鎖の質量含有率は、低分子量ヘパリンに関するヨーロッパ薬局方検定標準の規格に基づいて６８％と８８％との間である。硫酸化の率は、二糖類単位当たり平均で２残基である。
【０００８】
エノキサパリンの多糖の分子鎖は、ヘパリンにおけるのと同様に、グリコシド結合により結合する硫酸化されたグルコサミンおよびウロン酸の交互の単位体から成る。該構造は例えば、解重合の過程で分子鎖の非還元末端に二重結合が生じる点でヘパリンとは異なる。
エノキサパリンは、末端の環における二重結合を示す紫外分光法および13Ｃ核磁気共鳴スペクトルによって、ならびに高速サイズ排除クロマトグラフィーによってヘパリンと識別できる。
【０００９】
骨関節症の病態的状態において、関節軟骨の主要なプロテオグリカンであるアグリカンの分解は、ごく初期のかつ決定的な症状である。軟骨アグリカンの病態的減少は、球間ドメインにおけるタンパク質分解性開裂に起因する。関節損傷、骨関節症または炎症性関節疾患に罹患した患者の関節滑液から分離したプロテオグリカン代謝生成物のアミノ酸配列解析は、タンパク質分解性開裂がヒトアグリカンの球間ドメインにおいてアミノ酸Ｇｌｕ373とＡｌａ374との間で選択的に生じることを示している（Lohmander 他., Arthritis Rheum. 36, (1993), 1214-1222）。この開裂をつかさどるタンパク質分解作用は「アグリカネーゼ」と呼ばれ、そしてメタロプロテイナーゼ（ＭＰ）の上科に帰属させ得る。
【００１０】
亜鉛はメタロプロテイナーゼの触媒的活性部位において必須である。ＭＰはコラーゲン、ラミニン、プロテオグリカン、エラスチンまたはゼラチンを生理的条件下で開裂し、それゆえに骨および結合組織において重要な役割を果たす。
多数の異なるＭＰ阻害剤が既知である（J.S.Skotnicki 他., Ann. N.Y.Acad. Sci. 878, 61-72 [1999]; EP 0 606 046；WO94/28889）。
これらの阻害剤の一部はその特異性に関してあまり特徴付けられていないし、他のものは特にマトリックスメタロプロテイナーゼ（ＭＭＰｓ）に対してある程度選択的に作用する。
【００１１】
アグリカネーゼは別の特異性によりマトリックスメタロプロテイナーゼ（ＭＭＰｓ）とは異なり、アグリカンに生じる特定の開裂部位に対して作用し、そしてＭＭＰｓによって促進される。該開裂は、適当な抗体の使用により検出できる特有のフラグメントを結果として作る。
【００１２】
以前の研究で、エノキサパリンは関節滑液のアグリカネーゼ活性を用量依存的に阻害し、そしてその結果、関節内投与により骨関節症の治療に使用できることが見出された（DE 100 63 006.5）。
しかし、ヘパリン類似物質（多糖類）に固有の不利な点は、分析に利用できる発色団を化学構造中に含有しないことである。この結果、従来の分析法例えば高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）による、治療的に有効な濃度の分析的監視は相当な問題に遭遇する。
【００１３】
適切な感度を有するヘパリン類似物質による抗血栓性治療を監視することは、その生物学的作用、ヘパリン類似物質が触媒する、アンチトロンビンIIIによる第Ｘａ因子の阻害を通じてのみ通常可能である。
ヘパリン類似物質を用いた治療のこの不利な点は、ヘパリン類似物質の抗凝血作用以外の作用に関心が集中する場合に、または局所に限定した治療の症例において、例えば骨関節症の治療における関節内注射または脳卒中、狭心症、塞栓症のための使用または腫瘍療法のような作用部位のヘパリン類似物質の正確な濃度、滞留時間および分布行動を知らなくてはならない場合に、とりわけ不満足かつ不都合である。
【００１４】
一方で、骨関節症のあらゆる既知の治療に関する根本的な問題は、患部の軟骨および骨組織において治療の結果を診断するのが困難なことである。
本発明のヘパリン類似物質誘導体は前述の不利な点を除去できることが現在見出されている。
【００１５】
本発明のヘパリン類似物質誘導体は以下の特徴を有する。
・アグリカネーゼ、ｈＡＤＡＭＴＳ１およびゼラチナーゼＡ（ＭＭＰ−２）の作用に対して強力な阻害剤として作用し、そしてその結果、骨関節症の治療に適する、
・抗凝血性医療用物質としてヘパリンまたはエノキサパリンと同等の抗血栓性作用を示す、
・しかし同時にヘパリン類似物質とは対照的に、作用部位において磁気共鳴画像法（ＭＲＩ）によって直接的に観察可能であり、そのため投与後の局所濃度を監視でき、そして患者における該薬剤の分布行動を追跡できる。本発明のヘパリン類似物質誘導体はこの理由のために、脳卒中、狭心症、塞栓症の症例および腫瘍療法における使用にも特に適する。それらはまた、治療中の軟骨浸透挙動から患部結合組織の状態についての診断上の情報を得る点で骨関節症の症例に非常に適する。
【発明の開示】
【００１６】
したがって本発明は、ヘパリン類似物質に共有結合するキレート剤、および遷移金属Ｓｃ、Ｔｉ、Ｖ、Ｃｒ、Ｍｎ、Ｆｅ、Ｃｏ、Ｎｉ、Ｃｕ、Ｍｏ、ＲｕまたはランタニドＬａ、Ｃｅ、Ｐｒ、Ｎｄ、Ｐｍ、Ｓｍ、Ｅｕ、Ｇｄ、Ｔｂ、Ｄｙ、Ｈｏ、Ｅｒ、Ｔｍ、Ｙｂの系列からの常磁性金属陽イオンを含有するヘパリン類似物質誘導体に関する。
好ましいヘパリン類似物質は例えばエノキサパリンまたはヘパリンである。
【００１７】
キレート剤としてジエチレントリアミン−Ｎ,Ｎ,Ｎ′，Ｎ″，Ｎ″−五酢酸二無水物（ＤＴＰＡ無水物）、１,２−ビス（２−アミノエトキシエタン）−Ｎ,Ｎ,Ｎ′，Ｎ′−四酢酸（ＥＧＴＡ）、エチレンジアミン−Ｎ,Ｎ,Ｎ′，Ｎ′−四酢酸（ＥＤＴＡ）、１,４，７,１０−テトラアザシクロドデカン−１,４,７,１０−四酢酸（ＤＯＴＡ）、１,４,７,１０−テトラアザシクロドデカン−１,４,７−三酢酸（ＤＯ３Ａ）、ニトリロ三酢酸（ＮＴＡ）、トリエチレンテトラアミン六酢酸（ＴＴＨＡ）、４−カルボキシ−５,８,１１−トリス（カルボキシメチル）−１−フェニル−２−オキサ−５,８,１１−トリアザトリデカン−１３−オイック酸（ＢＯＰＴＡ）またはＮ,Ｎ′−ビス（ピリドキサル−５−リン酸）エチレンジアミン−Ｎ,Ｎ′−二酢酸（ＤＰＤＰ）を含有するヘパリン類似物質誘導体が好ましいものとして挙げられる。
該キレート剤の酸無水物は化学修飾に使用するのに好ましく用いられ、ジエチレントリアミン−Ｎ,Ｎ,Ｎ′，Ｎ″，Ｎ″−五酢酸二無水物（ＤＴＰＡ無水物）は特に好ましい。
【００１８】
特に好ましい常磁性金属陽イオンはＧｄ3+で、塩化ガドリニウム（III）六水和物または酢酸ガドリニウム（III）水和物というその塩の形態で使用される。
【００１９】
本発明はさらに、遷移元素またはランタニドの含有量が、ヘパリン類似物質のモル当たり１モルから該ヘパリン類似物質の誘導体化に可能な最大量までの範囲、好ましくはヘパリン類似物質のモル当たり１モル〜２０モルの範囲であり得るヘパリン類似物質誘導体に関する。
【００２０】
本発明はまた、本発明のヘパリン類似物質誘導体を製造する方法であって、該ヘパリン類似物質を活性キレート剤と反応させてヘパリン類似物質キレート化合物を得て、そして次に遷移元素またはランタニドを付加することを含む方法に関する。
【００２１】
本発明のヘパリン類似物質誘導体の製造方法は例えば、最初にヘパリン類似物質が緩衝液に溶解される。
適当な緩衝液はｐＨ６.０〜１０.０、好ましくはｐＨ８.８を有する。
緩衝液の濃度は０.０１〜０.５モル濃度、好ましくは０.１モル濃度である。適当な緩衝液の例は炭酸緩衝液、ホウ酸緩衝液またはスルホン酸をベースにした生物学的緩衝液、好ましくはＨＥＰＥＳ（Ｎ−(２−ヒドロキシエチル)ピペラジン−Ｎ′−（２−エタンスルホン酸））である。次いで活性キレート剤例えばＤＴＰＡ無水物を添加する。活性キレート剤は固体の形態で、または溶液として添加できる。
反応は８℃〜３７℃、好ましくは２４℃の温度で実施する。ｐＨは好ましくは反応中一定に維持される。
【００２２】
活性キレート剤対ヘパリン類似物質の割合は、分子量に基づいて１：１〜５０：１、好ましくは１.５：１〜１５：１である。
この後、好ましくはヘパリン類似物質キレート化合物のさらなる精製なしに、遷移元素またはランタニドを添加する。
錯体化は０℃〜３７℃、好ましくは４℃の温度で実施する。ｐＨは弱酸性値に変化し、そしてその後この値で一定に止めるのが好ましい。該ｐＨは６.８〜５、好ましくは６.５である。
【００２３】
ヘパリン類似物質キレート化合物対遷移元素またはランタニドの割合は、分子量に基づいて１：１〜１：５０、好ましくは１：１.５〜１：１５である。
生成した本発明のヘパリン類似物質誘導体は、意図する使用に応じてさらに精製できる。例えば、塩を透析またはゲル濾過により除去できる。生じた生成物は次いで凍結乾燥され得る。
【００２４】
エノキサパリンおよびエノキサパリンの生理学的に許容される塩は既知であり、そして例えば米国5,389,618に記載されているように製造できる。それらは、ヘパリンを形成する多糖類の基本構造を有する硫酸化多糖類の混合物であり、ヘパリンの平均分子量より低い約４５００ダルトンの平均分子量を有し、２０００ダルトン未満の分子量の分子鎖を９％〜２０％そして８０００ダルトンを超える分子量の分子鎖を５％〜２０％のみ含有し、さらにはそれらにおける数平均分子量に対する重量平均分子量の比率が１.３〜１.６であることを特徴とする。
【００２５】
本発明はまた、薬学的に適するそして生理学的に許容される担体、添加剤および／または他の有効成分および賦形剤と共に、少なくとも１つのヘパリン類似物質誘導体および／またはヘパリン類似物質誘導体の生理学的に許容される塩の有効量を有する薬剤に関する。
【００２６】
生理学的に許容される塩は、塩の形成が可能なヘパリン類似物質誘導体から、本質的に既知の方法で製造される。このカルボン酸は安定なアルカリ金属塩、アルカリ土類金属塩を形成し、あるいは妥当な場合には塩基性試薬例えば水酸化物、炭酸塩、炭酸水素塩、アルコラートおよびアンモニアまたは有機塩基例えばトリメチルアミンもしくはトリエチルアミン、エタノールアミンもしくはトリエタノールアミンもしくは他の塩基性アミノ酸例えばリシン、オルニチンもしくはアルギニンで置換されたアンモニウム塩を形成する。
ヘパリン類似物質誘導体が塩基性基を有する場合には、強酸を用いて酸付加塩を生成することも可能である。この目的に適当なのは無機酸および有機酸の両方であって、例えば塩酸、臭化水素酸または硫酸、リン酸、メタンスルホン酸、ベンゼンスルホン酸、ｐ−トルエンスルホン酸、４−ブロモベンゼンスルホン酸、シクロヘキシルスルファミン酸、トリフルオロメチルスルホン酸、酢酸、シュウ酸、酒石酸、コハク酸またはトリフルオロ酢酸である。
【００２７】
本発明はまた、薬剤を製造する方法であって、薬学的に適するそして生理学的に許容される担体および、妥当な場合には他の適当な有効成分、添加剤または賦形剤を用いて、本発明のヘパリン類似物質誘導体から適当な剤形を調製することを含む方法に関する。頻繁に使用されそして名称を挙げ得る賦形剤には乳糖、マンニトールおよび他の糖、炭酸マグネシウム、ラクトアルブミン、ゼラチン、デンプン、セルロースおよびその誘導体、動物油および植物油例えば魚肝油、ヒマワリ油、ラッカセイ油またはゴマ油、ポリエチレングリコールならびに溶媒例えば滅菌水、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）および一価または多価のアルコール例えばグリセリンがある。
【００２８】
その薬学的特性のために本発明のヘパリン類似物質誘導体は、タンパク質分解酵素例えばメタロプロテイナーゼの異化作用の増大が決定的な役割を果たすという経過のあらゆる疾患の予防および治療に適する。
これは例えば、変形性関節症、例えば骨関節症、脊椎症、関節外傷後あるいは半月板もしくは膝蓋骨の損傷または靱帯切断に続く関節の持続的固定化後の軟骨融解における、また結合組織の疾患例えば膠原病、歯周病、創傷治癒の障害および運動系の慢性疾患例えば炎症、免疫学または代謝の関連する急性および慢性関節炎、関節症、筋肉痛ならびに骨組織代謝の障害における症例である。
【００２９】
本発明のヘパリン類似物質誘導体はさらに抗血栓剤として有利に使用できる。それらは危険性のある状態における静脈血栓形成を予防するために特に使用できる。これはまた、危険性が慢性である状態にもあてはまる。本発明のヘパリン類似物質誘導体は一定用量を用いて、整形外科における血栓の症状の危険性を減らすことが特に可能である。
【００３０】
本発明のヘパリン類似物質誘導体の有利な治療的使用は動脈血栓症状の予防に基づくものであって、特に、不安定狭心症または再発性狭心症に関連する心筋梗塞の症状におけるものである。本発明のヘパリン類似物質誘導体のさらに興味深い使用は、手術後の外科患者における静脈血栓形成を予防するためにそれらを使用する可能性に基づくものである。この使用は、手術中の出血の危険を回避できるので格別に有利である。本発明のヘパリン類似物質誘導体を血管造影後ならびに狭窄および再狭窄の治療に使用することは同様に有利である。
【００３１】
本発明のヘパリン類似物質誘導体のさらに可能な適用は、腫瘍学における腫瘍および癌転移の治療（抗増殖性作用）、炎症性疾患の治療（抗炎症性作用）、中枢神経系（ＣＮＳ）の疾患および移植における有利な作用に関する。加えて、心筋および脳の梗塞に関連する虚血（梗塞の大きさの縮小）、喘息（トリプターゼに対する作用）または血管形成（ＦＧＦ媒介性細胞増殖を促進する作用）に投与が可能である。
【００３２】
本発明のヘパリン類似物質誘導体は一般的に非経口的に投与する。それは皮下、関節内、腹腔内または静脈内注射により実施できる。直腸的、経口的、吸入的または経皮的投与がさらに可能である。骨関節症には関節内注射が好ましい。
【００３３】
該医薬製剤は投薬単位で製造しそして投与するのが好ましく、各単位は有効成分として本発明のヘパリン類似物質誘導体の特定の用量を含有する。
この用量はアンプルの形態の注射液剤では約０.５μｇ〜約２００mg、全身投与では好ましくは約１０mg〜８０mg、そして局所投与では好ましくは１μｇ〜１０mgであり得る。
【００３４】
本発明はまた、経過にメタロプロテイナーゼの活性上昇を伴う疾患の進行の観察および診断のための、本発明のヘパリン類似物質誘導体の使用に関する。
本発明はまた、診断検査方式を作成するための本発明のヘパリン類似物質誘導体の使用に関する。
本発明はさらに、治療の結果および疾患の機能的特徴を観察するための診断検査方式の使用に関する。
【実施例】
【００３５】
〔実施例１〕
エノキサパリンの製造
１．エステル化
塩化メチレン７５ml中のベンゼトニウムヘパリネート１５ｇの溶液に塩化ベンジル１５mlを添加した。その溶液を３５℃の温度に加熱し、それを２５時間保持した。次いで、メタノール中の１０％強度の酢酸ナトリウム溶液９０mlを添加し、続いて濾過し、メタノールで洗浄しそして乾燥した。これによりナトリウム塩の形態でヘパリンベンジルエステル６.５ｇが得られ、そして前述のとおりに特定されるそのエステル化の程度は１３.３％であった。
２．解重合
前述で得られたナトリウム塩の形態のヘパリンベンジルエステル１０ｇを水２５０mlに溶解した。この溶液を６２℃に加熱し、そして水酸化ナトリウム０.９ｇの溶液を添加した。温度を６２℃で１時間３０分保持した。次いで反応混合物を２０℃に冷却し、希塩酸を添加して中和した。次いで、反応薬剤の濃度を塩化ナトリウム中で１０％に調節した。生成物を最終的にメタノール７５０ml中に沈殿させ、濾過した後乾燥した。これにより、以下の構造的特徴を有するある種のヘパリンが生じた。
平均分子量約４５００ダルトン
分子分布：
２０００ダルトン未満の分子量の分子鎖２０％
８０００ダルトンを超える分子量の分子鎖５.５％
分散：ｄ＝１.３９
【００３６】
〔実施例２〕
エノキサパリン誘導体（ＥＮ−１５）の製造
０.１モル濃度のｐＨ８.８のＨＥＰＥＳ緩衝液５mlにエノキサパリン（実施例１に記載したとおりに生成した固体）１００mgを溶解した。２４℃で攪拌しながら、投入したエノキサパリンの量に対して１５倍のモル過剰の試薬に相当する、ジエチレントリアミン−Ｎ,Ｎ,Ｎ′，Ｎ″，Ｎ″−五酢酸二無水物（ＤＴＰＡ無水物）１１９mgおよびジメチルスルホキシド０.３４mlから生成した調製懸濁液を滴下した。
その添加の間ｐＨを測定し、そして１モル濃度の水酸化ナトリウム溶液を計量して入れることによりｐＨ８.８で保持した。反応混合物を室温で３０分間激しく攪拌した。この間、必要であれば１モル濃度の水酸化ナトリウム溶液をさらに添加することにより、ｐＨを一定に保持した。次いで、同様に現時点のエノキサパリンに対して１５倍のモル過剰に相当する固体の塩化ガドリニウム（III）六水和物１２３.８mgを混合物に添加した。１Ｎ塩酸の滴定によりｐＨを６.５に調節した。反応混合物を４℃で２４時間さらに攪拌した。
修飾エノキサパリン分画を脱塩し、そしてセファデックス（Sephadex）Ｇ−２５(R)上のゲル濾過により未反応試薬から分離した。この目的のために、商業的に入手可能なファルマシア（Pharmacia）ＰＤ−１０(R)充填済みカラムを製造者の記載にしたがって使用することもできる。
該修飾エノキサパリンを凍結乾燥した。
修飾エノキサパリン９１mgを得た。第Ｘａ因子阻害試験は、本来のエノキサパリンの阻害力に相当する阻害力を示した。誘導結合プラズマ原子発光分光法によるガドリニウムの取り込みの分析によって、エノキサパリンのモル当たりガドリニウム２モルの平均含有量が明らかになった。
【００３７】
〔実施例３〕
エノキサパリン誘導体（ＥＮ−１５Ａ）の製造
エノキサパリン（固体）２ｇを０.１モル濃度のｐＨ８.８のＨＥＰＥＳ緩衝液１００mlに溶解した。２４℃で攪拌しながら、投入したエノキサパリンの量に対して１５倍のモル過剰の試薬に相当する、ビス（２−アミノエチル）アミン−Ｎ,Ｎ,Ｎ′，Ｎ″，Ｎ″−五酢酸二無水物（ＤＴＰＡ無水物）２.３８ｇおよびジメチルスルホキシド６.８mlから生成した調製懸濁液を滴下した。
その添加の間ｐＨを測定し、そして１モル濃度の水酸化ナトリウム溶液を計量して入れることによりｐＨ８.８で保持した。反応混合物を室温で３０分間激しく攪拌した。この間、必要であれば１モル濃度の水酸化ナトリウム溶液をさらに添加することにより、ｐＨを一定に保持した。次いで、同様に存在するエノキサパリンに対して１５倍のモル過剰に相当する固体の塩化ガドリニウム（III）六水和物２.４８ｇを混合物に装入し攪拌した。１モル濃度の塩酸の滴定によりｐＨを６.５に調節した。反応混合物を４℃で２４時間さらに攪拌した。修飾エノキサパリン分画を脱塩し、そして商業的に入手可能な透析チューブ（分子量分離限度１０００）における、合計４容量毎に対して水５Ｌの２４時間の透析により未反応試薬を除去した。この間、最初に投入した水を１時間後、３時間後および１６時間後に新しい水と交換した。次いで、管の内容物を凍結乾燥した。
修飾エノキサパリン１.７７ｇを得た。
生成物を、発熱性物質を含まない水を用いてセファデックス（Sephadex）Ｇ−２５(R)上のゲル濾過により好ましくは再度精製した。第Ｘａ因子阻害試験は、本来のエノキサパリンの阻害力に相当する阻害力を示した。誘導結合プラズマ原子発光分光法によるガドリニウムの取り込みの分析によって、エノキサパリンのモル当たりガドリニウム５モルの含有量が明らかになった。
【００３８】
〔実施例３ａ〕
エノキサパリン誘導体（ＥＮ−１５Ｂ）の製造
０.１モル濃度のｐＨ８.８のＨＥＰＥＳ緩衝液１００mlにエノキサパリン（固体）２ｇを溶解した。２４℃で攪拌しながら、投入したエノキサパリンの量に対して１５倍のモル過剰の試薬に相当する、ビス（２−アミノエチル）アミン−Ｎ,Ｎ,Ｎ′，Ｎ″，Ｎ″−五酢酸二無水物（ＤＴＰＡ無水物）２.３８ｇおよびジメチルスルホキシド６.８mlから生成した調製懸濁液を滴下した。
その添加の間ｐＨを測定し、そして１モル濃度の水酸化ナトリウム溶液を計量して入れることによりｐＨ８.８で保持した。反応混合物を室温で３０分間激しく攪拌した。この間、必要であれば１モル濃度の水酸化ナトリウム溶液をさらに添加することにより、ｐＨを一定に保持した。次いで、同様に存在するエノキサパリンに対して１５倍のモル過剰に相当する固体の塩化ガドリニウム（III）六水和物２.４８ｇを混合物に装入し攪拌した。
１Ｎ塩酸の滴定によりｐＨを６.５に調節した。反応混合物を４℃で２４時間さらに攪拌した。この段階の後、エタノールアミン０.４mlを添加し、そしてその混合物を室温でさらに３０分間攪拌した。最終的に、塩酸を添加してｐＨを７.０に調節した後、４倍の容量のメタノールで希釈することにより反応混合物を沈殿させた。沈殿物を吸引漏斗上に濾別し、そして純水３０ml中に高濃度で再度溶解した。
【００３９】
修飾エノキサパリンを脱塩し、そして商業的に入手可能な透析チューブ（分子量分離限度１０００）における、合計４容量毎に対して水０.５Ｌの２４時間の透析により未反応試薬を除去した。この間、最初に投入した水を１時間後、３時間後および１６時間後に新しい水と交換した。次いで、管の内容物を凍結乾燥した。
比較的少ない容量の脱塩では、商業的に入手可能なゲル濾過カラム（例えばPharmacia HiPrep(R) desalting）を用いて時間を短縮することが可能である。次いで、脱塩した分画を同じ方法で凍結乾燥する。
修飾エノキサパリン１.８６ｇを得た。第Ｘａ因子阻害試験は、本来のエノキサパリンに比較して阻害力が低下していないことを示した。誘導結合プラズマ原子発光分光法によるガドリニウムの取り込みの分析によって、エノキサパリンのモル当たりガドリニウム２.７モルの含有量が明らかになった。
【００４０】
〔実施例４〕
３倍、８倍および５０倍過剰のＤＴＰＡ無水物ならびに塩化ガドリニウム（III）六水和物を用いたエノキサパリン誘導体もまた、実施例２におけるのと同様に製造された。この化合物を以下においては略してＥＮ−３、ＥＮ−８およびＥＮ−５０と記載する。
５０倍過剰のＤＴＰＡ無水物と反応させたが、続いてガドリニウムイオンを加えられなかった生成物を、実施例２におけるのと同様に製造した。以下においてＥＮ−５０Ｚと記載するこの生成物は、増加した陰イオン性電荷およびそれに応じて変化した薬理学的特性を有するエノキサパリン誘導体に該当するが、他の例えばさらに反応性に富んだ陽イオンと一緒にしてキレート化前駆体として単純な方法で使用することもできるので、特に興味深い誘導体でもある。
【００４１】
〔実施例５〕
ヘパリン誘導体（ＨＥ−１５Ｂ）の製造
商業的に入手可能なヘパリンナトリウム（固体；シグマ（Sigma）H4784）２ｇを、０.１モル濃度のｐＨ８.８のＨＥＰＥＳ緩衝液１００mlに溶解した。２４℃で攪拌しながら、ビス（２−アミノエチル）アミン−Ｎ,Ｎ,Ｎ′，Ｎ″，Ｎ″−五酢酸二無水物（ＤＴＰＡ無水物）１.１９ｇおよびジメチルスルホキシド３.４mlから生成した調製懸濁液を滴下した。
その添加の間ｐＨを測定し、そして１モル濃度の水酸化ナトリウム溶液を計量して入れることによりｐＨ８.８で保持した。反応混合物を室温で３０分間激しく攪拌した。この間、必要であれば１モル濃度の水酸化ナトリウム溶液をさらに添加することにより、ｐＨを一定に保持した。次いで、固体の塩化ガドリニウム（III）六水和物１.２４ｇを混合物に装入して攪拌した。
１Ｎ塩酸の滴定によりｐＨを６.５に調節した。この段階の後、エタノールアミン０.２mlを添加し、そしてその混合物を室温でさらに３０分間攪拌した。最終的に、塩酸を添加してｐＨを７.０に調節した後、４倍の容量のメタノールで希釈することにより反応混合物を沈殿させた。沈殿物を吸引漏斗上に濾別し、そして純水３０ml中に高濃度で再度溶解した。
【００４２】
修飾ヘパリンを脱塩し、そして商業的に入手可能な透析チューブ（分子量分離限度１０００）における、合計４容量毎に水０.５Ｌの２４時間の透析により未反応試薬を除去した。この間、最初に投入した水を１時間後、３時間後および１６時間後に新しい水と交換した。次いで、管の内容物を凍結乾燥した。
比較的少ない容量の脱塩では、商業的に入手可能なゲル濾過カラム（例えばPharmacia HiPrep(R) desalting）を用いて時間を短縮することが可能である。次いで、脱塩した分画を同じ方法で凍結乾燥した。
修飾ヘパリン１.６５ｇを得た。第Ｘａ因子阻害試験は、本来のヘパリンに比較して阻害力が低下していないことを示した。誘導結合プラズマ原子発光分光法によるガドリニウムの取り込みの分析によって、ヘパリンのモル当たりガドリニウム１.９モルの含有量が明らかになった。
【００４３】
〔実施例６〕
第Ｘａ因子に対するヘパリン類似物質依存性阻害を調査するための試験方式
試験の原理
アンチトロンビンIIIおよび過剰量の第Ｘａ因子を、ヘパリン類似物質を含有する試験試料に添加すると、試験試料中のヘパリン類似物質がアンチトロンビンIIIと結合して錯体になり、第Ｘａ因子を不活性化する。第Ｘａ因子の残存活性は、合成色素生成基質を用いて測定できる。この場合には、パラ−ニトロアニリンが酵素による開裂により該基質から遊離し、そして単位時間当たりの４０５nmの波長における吸光度の変化の測定を通じて測光により検出できる。遊離したパラ−ニトロアニリンの量は、試験試料中のヘパリン類似物質の濃度に逆比例する（Teien M.L.他, Thromb. Res. 8(3), 413-6 [1976] ）。調査する薬剤のヘパリン類似物質の漸増的濃度によって、一連の検量線が作成される（濃度に対する相関関係としての、単位時間当たりの吸光度の変化）。ヘパリン類似物質の濃度を、単位時間当たりの試験試料の吸光度の変化から比較により見出すことができる。
【００４４】
試験方法
検量線は、０.５μｇ／ml〜３μｇ／mlの範囲のヘパリン類似物質の濃度を用いて作成するのが好ましい。
この濃度の一連の試料を、０.１５Ｍ ＮａＣｌ、０.００７Ｍ ＥＤＴＡ、０.１％ツイーン（Tween）８０およびヒトアンチトロンビンIII０.１２ＩＵを含有するｐＨ８.４の０.０４６Ｍ トリス（Tris）緩衝液を用いて１：１０に希釈する。希釈した試料の５０μｌの部分に、ウシ第Ｘａ因子（１３.６Ｕ／ml）５０μｌを加えて３７℃で８０秒間インキュベートする。次いで、１.１ｍＭ色素生成基質Ｓ−２７６５ ５０μｌを添加する。毎分の４０５nmの波長における吸光度の変化を光度計で測定する。
適当に事前に希釈した試験試料の５０μｌの部分を、同じ様式にしたがって処理する。
表１はその結果を示す。
【００４５】
【表１】
〔実施例７〕
アグリカネーゼ試験方式
該試験は９６穴マイクロタイタープレート仕様で実施する。
標識エノキサパリンの一連の希釈溶液は、調製用純水で調製する。
温浸：
該試験条件下で４０５ｎｍにおいて１.０〜１.４の吸光度を生じる、関節滑液またはアグリカネーゼ活性の事前に特定した量を、標識エノキサパリンの各希釈溶液３μｌと共に各ウェル中で混合し、ダルベッコ修飾イーグル培地（ＤＭＥＭ）を用いて最終容量３００μｌに調製して、そしてＣＯ2細胞培養インキュベーター中３７℃で１時間インキュベートする。
次いで、Agg1mut基質（Bartnik E. 他., EP 785274 (1997)に開示のとおり；ＤＭＥＭ中の基質）１μｇ／μｌの溶液５μｌを各ウェルに添加した後、その混合物をＣＯ2インキュベーター中３７℃で４時間消化する。
【００４７】
試験プレートの調製
最初の工程では、商業的に入手可能な抗マウス免疫グロブリンＧ（ヤギ由来；ｐＨ７.４の生理的リン酸緩衝液[ＰＢＳ緩衝液]中５μｇ／ml）の溶液１００μｌを用いて、室温で１時間各ウェルをコートする。０.１％ツイーン２０を添加したＰＢＳ緩衝液（以下において洗浄緩衝液と呼ぶ）で該プレートを洗浄した後、０.０５％ツイーン２０を添加したＰＢＳ緩衝液中の５％ウシ血清アルブミンの溶液１００μｌで各ウェルを室温で１時間ブロックする。
洗浄緩衝液で再度洗浄した後、０.０５％ツイーン２０および０.５％ウシ血清アルブミンを添加したＰＢＳ緩衝液中のＢＣ−３抗体の１：１０００の希釈溶液１００μｌを用いて、各ウェルを室温で１時間温置する；この抗体はアグリカネーゼ特有の開裂フラグメントを認識する（Hughes C.E.他, Biochem. J. (1995), 305 (3), 799-804）。
【００４８】
試験方法
該試験プレートを洗浄緩衝液で洗浄した後、前述の消化からの完全混合物をウェル毎にウェルから試験プレートへ移し、そして室温で１時間インキュベートする。プレートを洗浄緩衝液で洗浄した後、第二抗体（ヤギ抗ヒトＩｇＧ、ペルオキシダーゼ標識、０.５％ＢＳＡ／ＰＢＳ緩衝液／０.０５％ツイーン２０中１：１０００）１００μｌを添加し、そしてこれに対するインキュベートを室温で１時間再度実施する。
洗浄緩衝液で再度洗浄した後、ＡＢＴＳ基質溶液（６０ｍＭリン酸水素二ナトリウムを添加した４０ｍＭクエン酸ナトリウム中の２,２′−アジノビス（３−エチルベンゾチアゾリンスルホン酸２mg／mlで、酢酸でｐＨ４.４に調節したもの；ml当たり３５％過酸化水素０.２５mlを測定直前に添加）１００μｌの添加により着色が生じる。振とう様式で、５秒間隔の自動読み取りで対照フィルター（６２０nm）を対照に４０５nmでの測定を実施する。１.０〜１.４の範囲における最大吸光度（４０５nm）に達したら、直ちに試験を中止する。
【００４９】
【表２】
〔実施例８〕
磁気共鳴画像法実験
実施例３および４に記載した本発明のヘパリン類似物質誘導体ＥＮ−３、ＥＮ−８、ＥＮ−１５およびＥＮ−５０を、０.０１、０.１、１.０および１０.０ｍＭの濃度で蒸留水に溶解した後、０.５ミリリットルの容量のエッペンドルフ試験管に装入する。各試験管を、１.５ミリリットルの容量を有しそして蒸留水を満たした、より大きなエッペンドルフ試験管に挿入する。後者の試験管をプラスチック製の試験管立てに配列した後、ブルカー・メディカル有限責任会社（Bruker Medical GmbH, Ettlingen）製の磁気共鳴画像システムにおいて７テスラの磁場強度で画像化する。溶液中の水の水素イオンの緩和時間に対する本発明のヘパリン類似物質誘導体の作用を記載するために、ブルカー・メディカル有限責任会社により開発されたソフトウェア「パラヴィジョン（Paravision）(R)」を用いて、対照的な特徴が異なるＭＲ画像を測定する。すべての試験管を同時に画像で見るために、層厚２mmの冠状の（＝水平な）スライス面を選択する。
【００５１】
Ｔ１強調スピンエコー画像（エコー時間ＴＥ＝１３ミリ秒、緩和時間ＴＲ＝１００ミリ秒、１エコー、ＮＡ＝２、マトリックス２５６2）において、１０ｍＭの濃度におけるすべての誘導体に関して試験管はシグナルの減少を示し、そしてＥＮ−５０およびＥＮ−１５に関しては、エノキサパリンのモル当たりガドリニウムのより高い濃度による磁場の均一性の局所的障害のために画像の一様な変形が存在する。０.１ｍＭの濃度のＥＮ−５０およびＥＮ−１５を有する試験管ならびに１.０ｍＭの濃度の誘導体ＥＮ−８およびＥＮ−３を有する試験管の周囲の蒸留水のシグナルに関しては、約１０のファクターによるシグナルの増大が存在する。残りの試験管におけるシグナルの増大は、本発明のヘパリン類似物質誘導体のより低い濃度およびガドリニウムのより低い相応する濃度にしたがって減少する。
各溶液に対するＴ２緩和時間を、１６の個々のエコーを有するスピンエコー実験で測定した（ＴＥ＝１３ミリ秒、ＴＲ＝３０００ミリ秒、１６エコー、ＮＡ＝１、マトリックス２５６2）。結果を数値で表３に要約する。本発明のヘパリン類似物質誘導体のすべての１０ｍＭ溶液においてはＴ２時間が非常に短いために、Ｔ２時間を確実に測定することはもはやできない。これらの測定条件下で測定された純粋な蒸留水に対するＴ２時間（９０７ミリ秒）に基づいて、６０のファクターによる最大の短縮に達する。Ｔ２時間の短縮は、本発明のヘパリン類似物質誘導体の濃度および個々の相応するガドリニウムの濃度に比例する。
【００５２】
要約
本発明のヘパリン類似物質誘導体は、その濃度に応じてそしてエノキサパリンに対するガドリニウムのモル比に応じて、本発明のヘパリン類似物質誘導体を含有する溶液の水の水素イオンの緩和時間Ｔ１、Ｔ２およびＴ２*を短縮するので、Ｔ１強調ＭＲＩ画像においてシグナル強度の増大または部分的なもしくは全体的なシグナルの減少すら存在することをＭＲＩ測定は示す。
【００５３】
【表３】
規定のミリモル濃度における、本発明のヘパリン類似物質誘導体の溶液中の水の水素イオンのＴ２時間（ミリ秒）を測定。
該Ｔ２時間は、３２の個々のエコーを用いたスピンエコー画像の結果を用いて測定する。周囲の蒸留水におけるＴ２緩和の平均は９０７ミリ秒である（検出不可*＝非常に短いためにＴ２を確実に測定することはできない）。
【００５５】
〔実施例９〕
磁気共鳴画像法実験
ブタ（体重約４０kg、月齢４カ月）の摘出した膝関節を露出させた。１つの関節丘のみがＥＮ−１５Ａの溶液（生理食塩水中０.１ｍＭ、室温）に浸るように、プラスティック製容器中に関節を固定した。高度の空間分解能（３Ｄ画素サイズ約１４０×１８０μｍ、層の厚さ２ｍｍ）を有するＴ１強調スピンエコー画像を、１４時間の期間において３０分毎に記録した。画像スライスは関節丘および骨幹を通じておよそ矢状（sagittal）であり、そして最高７mmの厚さに達する、軟骨の薄い灰色の層に囲まれた海綿質の灰色から黒色の部分を示す。骨／骨および軟骨／周囲の溶液の界面は明確に明らかである。
【００５６】
ＥＮ−１５Ａ溶液中に浸漬後数時間で、軟骨の外側の層の外見に変化が存在した。新規な層状構造が形成され、そして軟骨の表面におよそ平行に走行する。すなわち、表面近くに第一の薄い（幅約１４０μｍ）過度に色の濃い層、続いてより幅広の（幅約５００μｍ）比較的色の薄い層である。シグナルの減少はこの第二の層において次第に生じるが、ＥＮ−１５Ａの濃度の増加とこの軟骨帯におけるＥＮ−１５Ａの移動度の著しい低下との両方によって説明することができる。なぜなら両方の影響は、シグナルをもはや測定できないほどのシグナルの急速な減少を誘発し得るからである。
後者の層に続いて、過度に色の濃い第三の層があり、この層は第一と同様の幅および明るさを有した。第二に比べて約２〜３倍幅広である、第四の非常に過度に色の濃い層が続いた。さらに第五の層がその次に見られるはずであり、そのシグナル強度は第一または第三の層のシグナル強度におよそ相当するが、第三より幾分幅広であった。
軟骨表面からＥＮ−１５Ａの最も深い面までの距離は約１.６〜１.７mmである。
【００５７】
要約
本発明のヘパリン類似物質誘導体は、ブタの摘出した大腿の関節丘の生来の無処置の軟骨へと浸透し、軟骨における水の水素イオンの緩和時間Ｔ１、Ｔ２およびＴ２*に対する影響のために、本発明のヘパリン類似物質誘導体はＭＲシグナル強度に変化をもたらし、水の水素イオンの緩和時間Ｔ１、Ｔ２およびＴ２*におけるこの変化は、軟骨内部の本発明のヘパリン類似物質誘導体の移動度の低下によって増大することをＭＲＩ測定は示す。
Claims (25)
- ヘパリン類似物質、このヘパリン類似物質に共有結合するキレート剤、および遷移金属Ｓｃ、Ｔｉ、Ｖ、Ｃｒ、Ｍｎ、Ｆｅ、Ｃｏ、Ｎｉ、Ｃｕ、Ｍｏ、ＲｕまたはランタニドＬａ、Ｃｅ、Ｐｒ、Ｎｄ、Ｐｍ、Ｓｍ、Ｅｕ、Ｇｄ、Ｔｂ、Ｄｙ、Ｈｏ、Ｅｒ、Ｔｍ、Ｙｂの系列からの常磁性金属陽イオンを含有するヘパリン類似物質の誘導体。
- 使用するヘパリン類似物質が、ペントサンポリサルフェート、キシランサルフェート、硫酸デキストランまたはキチンサルフェート、イズロン／ウロン酸および／またはグルコサミンの二量体、三量体またはオリゴマーおよび重合体、ランダムまたは規則的配列のペントースおよび／またはヘキソース単位および／またはマンニトールから成るオリゴ糖類または多糖類、ヘパランサルフェート、ヘパリチンサルフェート、ケラタンサルフェートまたはデルマタンサルフェート、ヒアルロン酸、コンドロイチン硫酸Ａ、ＢまたはＣ、非分画ヘパリンおよび分画ヘパリン例えばエノキサパリン、ナドロパリン、フラキシパリン、ダルテパリン、フラグミン、ベミパリン、チンザパリン、アルデパリン、低分子量ヘパリン、超低分子量ヘパリンまたはそれらに類似する合成多糖類およびその塩、または前述の化合物の連結されたおよび架橋された分子鎖のもの例えば二量体、三量体またはオリゴマー、ならびにそれらに結合するペプチド、タンパク質、脂質または核酸を含むヘパリン類似物質の系列からの少なくとも１つのヘパリン類似物質である請求項１記載のヘパリン類似物質誘導体。
- ヘパリンまたはエノキサパリンがヘパリン類似物質として使用される、請求項１または２記載のヘパリン類似物質誘導体。
- エノキサパリン、該エノキサパリンに共有結合するキレート剤、および遷移金属Ｓｃ、Ｔｉ、Ｖ、Ｃｒ、Ｍｎ、Ｆｅ、Ｃｏ、Ｎｉ、Ｃｕ、Ｍｏ、ＲｕまたはランタニドＬａ、Ｃｅ、Ｐｒ、Ｎｄ、Ｐｍ、Ｓｍ、Ｅｕ、Ｇｄ、Ｔｂ、Ｄｙ、Ｈｏ、Ｅｒ、Ｔｍ、Ｙｂの系列からの常磁性金属陽イオンを含有する、請求項１〜３のいずれかに記載のヘパリン類似物質誘導体。
- ヘパリン、該ヘパリンに共有結合するキレート剤、および遷移金属Ｓｃ、Ｔｉ、Ｖ、Ｃｒ、Ｍｎ、Ｆｅ、Ｃｏ、Ｎｉ、Ｃｕ、Ｍｏ、ＲｕまたはランタニドＬａ、Ｃｅ、Ｐｒ、Ｎｄ、Ｐｍ、Ｓｍ、Ｅｕ、Ｇｄ、Ｔｂ、Ｄｙ、Ｈｏ、Ｅｒ、Ｔｍ、Ｙｂの系列からの常磁性金属陽イオンを含有する、請求項１〜３のいずれかに記載のヘパリン類似物質誘導体。
- 使用される共有結合するキレート剤がジエチレントリアミン−Ｎ,Ｎ,Ｎ′，Ｎ″，Ｎ″−五酢酸二無水物、１,２−ビス（２−アミノエトキシエタン）−Ｎ,Ｎ,Ｎ′，Ｎ′−四酢酸、エチレンジアミン−Ｎ,Ｎ，Ｎ′，Ｎ′−四酢酸、１,４,７,１０−テトラアザシクロドデカン−１,４,７,１０−四酢酸、１,４,７,１０−テトラアザシクロドデカン−１,４,７−三酢酸、ニトリロ三酢酸、トリエチレンテトラアミン六酢酸、４−カルボキシ−５,８,１１−トリス（カルボキシメチル）−１−フェニル−２−オキサ−５,８,１１−トリアザトリデカン−１３−オイック酸もしくはＮ,Ｎ′−ビス（ピリドキサル−５−リン酸）−エチレンジアミン−Ｎ,Ｎ′−二酢酸、またはそれらに類似する錯生成剤であってそして結合する常磁性金属陽イオンを有する錯体の高度の安定性が顕著である錯生成剤である、請求項１〜５のいずれかに記載のヘパリン類似物質誘導体。
- キレート剤で置換されたヘパリン類似物質に、低度の錯体の解離を伴う強度に常磁性の金属陽イオンが結合する、請求項１〜６のいずれかに記載のヘパリン類似物質の誘導体。
- 常磁性金属陽イオンがＧｄ3+である請求項７記載のヘパリン類似物質の誘導体。
- 遷移元素またはランタニドの含有量が、モル当たり１モル〜使用するヘパリン類似物質の誘導体化に可能な最大量、好ましくはエノキサパリンのモル当たり１モル〜２０モルである、請求項１〜８のいずれかに記載のヘパリン類似物質誘導体。
- 請求項１〜９のいずれかに記載のヘパリン類似物質誘導体を製造する方法であって、該ヘパリン類似物質を活性キレート剤と反応させてヘパリン類似物質キレート化合物を得て、そして続いて遷移元素またはランタニドを付加することを含む方法。
- キレート剤の活性型が、分子量に基づいて当初のヘパリン類似物質に対して１：１〜５０：１、好ましくは１.５：１〜１５：１という過剰に使用される請求項１０記載の方法。
- キレート剤の活性型が酸無水物例えばジエチレントリアミン−Ｎ,Ｎ,Ｎ′，Ｎ″，Ｎ″−五酢酸二無水物である、請求項１０または１１記載の方法。
- Ｇｄ3+が塩化ガドリニウム（III）六水和物またはガドリニウム（III）酢酸水和物という塩の形態で使用される、請求項１０〜１２のいずれかに記載の方法。
- ヘパリン類似物質キレート化合物対添加する遷移元素またはランタニドの選択される割合が、分子量に基づいて１：１〜１：５０、好ましくは１：１.５〜１：１５である、請求項１０〜１３のいずれかに記載の方法。
- 得られたヘパリン類似物質誘導体をさらなる使用のために透析および／またはゲル濾過により精製および脱塩し、そして場合によって凍結乾燥に付する、請求項１０〜１３のいずれかに記載の方法。
- 薬学的に適するそして生理学的に許容される担体、添加剤および／または他の有効成分および賦形剤と共に、請求項１〜９のいずれかに記載の少なくとも１つのヘパリン類似物質誘導体の有効量を有する薬剤。
- タンパク質分解酵素の異化作用の増加を特徴とする疾患、例えば変形性関節症、骨関節症、脊椎症、関節外傷後あるいは半月板もしくは膝蓋骨の損傷または靱帯切断に続く関節の持続的固定化後の軟骨融解、結合組織の疾患例えば膠原病または歯周病、創傷治癒の障害または運動系の慢性疾患例えば炎症、免疫学または代謝の関連する急性および慢性関節炎、関節症、筋肉痛ならびに骨組織代謝の障害の予防および治療用薬剤を製造するための、請求項１〜９のいずれかに記載のヘパリン類似物質誘導体の使用。
- 抗血栓性治療および予防例えば静脈血栓形成の予防、術後期間の外科患者における静脈血栓形成の予防、特に心筋梗塞、不安定狭心症または再発性狭心症の症例における動脈血栓症状の予防、血管造影後ならびに狭窄および再狭窄の治療における使用、腫瘍および癌転移の治療、炎症性疾患の治療、心筋もしくは脳の梗塞に関連する虚血の治療、中枢神経系の疾患の治療、移植に関連する治療、喘息の治療または血管形成の治療用薬剤を製造するための、請求項１〜９のいずれかに記載のヘパリン類似物質誘導体の使用。
- ヘパリン類似物質誘導体を非経口的例えば皮下、関節内、腹腔内または静脈内注射により投与する、請求項１６〜１８のいずれかに記載の使用。
- ヘパリン類似物質誘導体の用量が全身投与では約１０mg〜８０mg、そして局所投与では１μｇ〜１０mgである請求項１９記載の使用。
- ヘパリン類似物質誘導体を直腸、経口、吸入または経皮で投与する、請求項１６〜１８のいずれかに記載の使用。
- 経過にメタロプロテイナーゼの活性上昇を伴う疾患の進行のモニターおよび診断のための、請求項１〜９のいずれかに記載のヘパリン類似物質誘導体の使用。
- 診断検査方式を作成するための、請求項１〜９のいずれかに記載のヘパリン類似物質誘導体の使用。
- 治療の結果および疾患の機能的特徴をモニターするための請求項２３記載の診断検査方式の使用。
- 薬学的に適するそして生理学的に許容される担体および、妥当な場合には他の適当な有効成分、添加剤または賦形剤を用いて、ヘパリン類似物質誘導体から適当な剤形を調製することを含む、請求項１６記載の薬剤を製造する方法。
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