JP2005312445A - 人工ポリクローナル免疫グロブリンの製造方法 - Google Patents

Abstract

【課題】 免疫グロブリン製剤の製造に適応可能な組換えＤＮＡ技術によるポリクローナル免疫グロブリンの製造方法を提供する。
【解決手段】 互いに異なる免疫グロブリン可変領域を含むポリペプチドをコードする複数種の遺伝子を単離する。次に、その遺伝子混合物をベクターに接触させて組込み、多様な免疫グロブリン可変領域に対応する複数種の組換えベクターを調製し、組換えベクター混合物を調製する。次に、その組換えベクター混合物を適宜の宿主細胞に接触させて導入し、多様な免疫グロブリン可変領域に対応する複数種の組換え体を調製し、組換え体混合物を調製する。最後に、その組換え体混合物を混合培養し、多様な免疫グロブリン可変領域に対応する複数種のポリペプチドを組換え体内で発現させ、それらのポリペプチド混合物を調製し、人工ポリクローナル免疫グロブリンを製造する。
【選択図】 図１０

Description

本発明は人工ポリクローナル免疫グロブリンの製造方法に関し、さらに詳細には、免疫グロブリン遺伝子を含有する複数種の組換え体を培養してポリクローナルな免疫グロブリンを得る、人工ポリクローナル免疫グロブリンの製造方法に関する。本発明によれば、感染リスクが極めて低くかつ安定供給が可能な免疫グロブリン製剤を提供することができる。

免疫グロブリン製剤は、ヒトの血液から抽出した免疫グロブリンを濃縮した血液製剤であり、細菌などの侵入異物と抗原−抗体反応を起こし、生体を守る作用を有する。近年、免疫グロブリン製剤は、重症感染症の他に、特発性血小板減少性紫斑病、無ガンマグロブリン血症、川崎病急性期、ギラン・バレー症候群等にも使用されるようになってきている。そして、これらの治療には、静脈を経由して大量に免疫グロブリンを投与する「ＩＶＩｇ治療」がよく用いられている。このＩＶＩｇ治療は、最近では難治性血管炎などの治療法としても注目されており、その他、国際的にも種々の疾患の治療法として重要視されている。さらに、最近、ギラン・バレー症候群などの自己免疫疾患にＩＶＩｇ治療が認可され、これにともない膠原病や筋無力症を対象としてつぎつぎとＩＶＩｇ治療が始まっている。また、ＩＶＩｇ治療は川崎病では２０年にわたる治療実績があり、最近では２ｇ／ｋｇ体重の単回投与がより有効であることで認可されている。以上のように、ＩＶＩｇ治療は重症度の高い疾患や原因不明の難治性疾患にきわめて有効である。また、ＩＶＩｇ治療は副作用がほとんどない点でも有用な治療法である。

免疫グロブリン製剤の作用機序については、いくつかの仮説がある。一つの仮説は、免疫グロブリン製剤に含まれている、未知の抗原に対する抗体を含めた多種類の抗体が薬理効果を発揮しているという説である。また別の仮説は、多種類の抗体のうちのミエロペルオキシダーゼ（ＭＰＯ）に対する抗体（抗ＭＰＯ抗体）にその効果があり、特にＭＰＯの広範なエピトープに対する多種類の抗ＭＰＯ抗体が薬理効果を発揮しているという説である。両説において共通していることは、免疫グロブリン製剤が多様な免疫グロブリンの混合物であること、すなわちポリクローナルなものであることが治療効果に大きく寄与しているということである。その他にも仮説があるが、例示した２つの仮説はいずれも有力なものである。

免疫グロブリンは、抗体及びこれと構造上・機能上の関連性のあるタンパク質の総称である。つまり、結合する抗原が明らかになっている免疫グロブリンを、その特定抗原に対応させて抗体と呼んでいる。免疫グロブリンの基本的な分子構造は、軽鎖（Ｌ鎖、ｌｉｇｈｔ ｃｈａｉｎともいう）と重鎖（Ｈ鎖、ｈｅａｖｙ ｃｈａｉｎともいう）の大小２種類のポリペプチド２本ずつがジスルフィド結合により連結したものである。重鎖は３つの領域（ＣＨ１、ＣＨ２、ＣＨ３）からなる定常領域（Ｃ領域、ｃｏｎｓｔａｎｔ ｒｅａｇｉｏｎともいう）とＶＨ領域からなる可変領域（Ｖ領域、ｖａｒｉａｂｌｅ ｒｅａｇｉｏｎともいう）が連結された構造である。軽鎖は、ＣＬ領域からなる定常領域とＶＬ領域からなる可変領域が連結された構造である。可変領域のアミノ酸配列には多様性があり、これによって多様な抗原に対する多様な抗体が生体内で作られている。

現在の免疫グロブリン製剤は血液製剤であるため、原料に由来するウイルス等の未知の病原体が混入するリスクが常に存在する。事実、病原ウイルスに汚染された血液製剤によって薬害が起こり、大きな社会問題となっている、さらに、対応疾患の増大とともに原料となる血液が不足することも予想されており、血液製剤の免疫グロブリン製剤は安定供給にも不安がある。以上より、患者の感染リスクを減少させ、かつ免疫グロブリン製剤の治癒機転を明らかにする上でも、人工合成品の免疫グロブリン製剤が求められている。そのためには、免疫グロブリンの遺伝子を取得し、組換えＤＮＡ技術を用いて該遺伝子を発現させ、純化した免疫グロブリンを取得する方法が考えられる。

免疫グロブリンを組換えＤＮＡ技術を用いて製造した例はすで知られている。例えば、可変領域のみをマウス由来のものに置き換えたキメラ型抗体（特許文献１）や、可変領域の中のＣＤＲ領域のみをマウス由来のものに置き換えたヒト化抗体（特許文献２）が、組換えＤＮＡ技術によって製造可能である。キメラ型抗体やヒト化抗体は抗体医薬としてすでに実用化されている。また、免疫グロブリン遺伝子を宿主細胞内で可溶状態の正常型タンパク質として発現させる技術として、免疫グロブリンをシャペロニンとの融合タンパク質として発現させる例も知られている（特許文献３）。ただし、これらはすべて単一分子の免疫グロブリン、すなわちモノクローナルの免疫グロブリンである。

特開平５−３０４９８９号公報 特開２０００−１４３８３号公報 特開２００４−８１１９９号公報

上記の通り、血液製剤である免疫グロブリン製剤は多様の免疫グロブリンの混合物、すなわちポリクローナルなものであり、それが治療効果に寄与していると考えられる。したがって、組換えＤＮＡ技術を用いて免疫グロブリン製剤を製造する場合も、ポリクローナルな免疫グロブリンを含んだものでなければならない。しかし、組換えＤＮＡ技術を用いて多様な免疫グロブリンの混合物であるポリクローナルな免疫グロブリンはこれまでに得られていない。

本発明の目的は、感染リスクが極めて低くかつ安定供給が可能な免疫グロブリン製剤の提供を可能にする、組換えＤＮＡ技術を用いた人工ポリクローナル免疫グロブリンの製造方法を提供することにある。

上記した課題を解決するための請求項１に記載の発明は、下記工程、
（１）免疫グロブリンを発現している組織又は細胞に由来するｃＤＮＡから、互いに異なる免疫グロブリン可変領域を含むポリペプチドをコードする複数種の遺伝子を単離し、該遺伝子の混合物を調製する工程、
（２）該遺伝子の混合物をベクターに接触させ、互いに異なる遺伝子が挿入された複数種の組換えベクターを調製し、該組換えベクターの混合物を調製する工程、
（３）該組換えベクターの混合物を宿主細胞に接触させ、互いに異なる組換えベクターが導入された複数種の組換え体を調製し、該組換え体の混合物を調製する工程、
（４）該組換え体の混合物を混合培養し、該培養物から、互いに異なる複数種の免疫グロブリン可変領域を含むポリペプチドの混合物を採取する工程、
を含むことを特徴とする人工ポリクローナル免疫グロブリンの製造方法である。

本発明の人工ポリクローナル免疫グロブリンの製造方法においては、まず、互いに異なる免疫グロブリン可変領域を含むポリペプチドをコードする複数種の遺伝子を単離する。すなわち、多様な免疫グロブリン可変領域に対応する複数種の遺伝子を単離し、それらの混合物を調製する。換言すれば、遺伝子のライブラリーを調製する。次に、その遺伝子混合物をベクターに接触させて組込み、多様な免疫グロブリン可変領域に対応する複数種の組換えベクターを調製し、組換えベクター混合物を調製する。換言すれば、組換えベクターのライブラリーを調製する。次に、その組換えベクター混合物を適宜の宿主細胞に接触させて導入し、多様な免疫グロブリン可変領域に対応する複数種の組換え体を調製し、組換え体混合物を調製する。換言すれば、組換え体のライブラリーを調製する。最後に、その組換え体混合物を混合培養し、多様な免疫グロブリン可変領域に対応する複数種のポリペプチドを組換え体内で発現させ、該培養物からそれらのポリペプチド混合物を採取する。これらのポリペプチドは互いに異なる免疫グロブリン可変領域を有しており、その混合物は人工ポリクローナル免疫グロブリンとなる。

ここで、免疫グロブリンには、免疫グロブリン基本構造を有する天然型の免疫グロブリンに加えて、その可変領域を含む部分断片、さらにその部分断片同士の融合タンパク質等の可変領域を含む人工の同機能タンパク質も含む。すなわち、免疫グロブリンには、その重鎖（ＶＨ−ＣＨ１−ＣＨ２−ＣＨ３）、軽鎖（ＣＬ−ＶＬ）、Ｆａｂ断片、Ｆ（ａｂ'）₂断片、ＣＨ１−ＶＨ断片、ＣＬ−ＶＬ断片、ＶＨ断片、ＶＬ断片等の完全型免疫グロブリンの可変領域を含む部分断片を含む。さらに免疫グロブリンには、人工的に作られた可変領域を含む同機能タンパク質、例えば、ｓｃＦＶ（ｓｉｎｇｌｅ ｃｈａｉｎ Ｆｖ、ＶＬ−ＶＨの融合タンパク質）、ｓｃＦＶと定常領域の融合タンパク質（ｓｃＦｖ−ＣＨ１−ＣＨ２−ＣＨ３の融合タンパク質、ｓｃＦｖ−ＣＨ２−ＣＨ３の融合タンパク質等）を含む。

ここで、ｃＤＮＡから単離される遺伝子には、ｃＤＮＡ上で連続して存在している遺伝子を直接単離する場合の他に、ｃＤＮＡ上で分散して存在している複数の遺伝子を適宜の方法で結合した後に、融合遺伝子として単離する場合も含む。すなわち、免疫グロブリン基本構造の全部又は部分配列をコードする遺伝子、例えば、抗体重鎖（ＶＨ−ＣＨ１−ＣＨ２−ＣＨ３）、抗体軽鎖（ＣＬ−ＶＬ）といった全部配列、又はＣＨ１−ＶＨ、ＶＨのみ若しくはＶＬのみといった部分配列の場合は、ｃＤＮＡ上にそれらの遺伝子が連続して存在しているので、ｃＤＮＡからそれらの遺伝子を１ステップで直接単離することができる。一方、ｓｃＦｖのように免疫グロブリン基本構造にはない人工の抗体をコードする遺伝子は、ｃＤＮＡ上では連続して存在しない。この場合は、ｃＤＮＡからＶＬ領域をコードする遺伝子とＶＨ領域をコードする遺伝子とを適宜の方法で結合した状態で単離する。なお、これらの遺伝子を結合した状態で単離する方法として、オーバーラップＰＣＲ法が挙げられる。

本発明の方法で製造された人工ポリクローナル免疫グロブリンは、血液由来の免疫グロブリン製剤と同様に多様の免疫グロブリンを含んでいる。したがって、本発明の人工ポリクローナル免疫グロブリンの製造方法によれば、従来の免疫グロブリン製剤と同様の効果を有し、かつ感染リスクが極めて少なく非常に安全性の高い免疫グロブリン製剤を提供することができる。

請求項２に記載の発明は、前記ポリペプチドが、ｓｃＦｖであることを特徴とする請求項１に記載の人工ポリクローナル免疫グロブリンの製造方法である。

ｓｃＦｖは一本鎖抗体、短鎖可変部抗体と呼ばれるＶＬ−ＶＨの融合タンパク質からなる人工抗体である。ｓｃＦｖは、抗体が抗原を認識するために必要な最小単位であるＶＬ領域とＶＨ領域のみからなり、そのサイズがコンパクトである。ｓｃＦｖは大腸菌等の微生物での発現が容易であることが知られている。したがって、本発明の人工ポリクローナル免疫グロブリンの製造方法においては、宿主細胞に大腸菌等の微生物を好適に用いることができ、より簡便に人工ポリクローナル免疫グロブリンを製造することができる。

請求項３に記載の発明は、前記ポリペプチドが、ｓｃＦｖとＣＨ１−ＣＨ２−ＣＨ３領域の全部又は一部との融合タンパク質であることを特徴とする請求項１に記載の人工ポリクローナル免疫グロブリンの製造方法である。

また請求項４に記載の発明は、前記ポリペプチドが、ｓｃＦｖとＣＨ２−ＣＨ３領域との融合タンパク質であることを特徴とする請求項１に記載の人工ポリクローナル免疫グロブリンの製造方法である。

本発明の人工ポリクローナル免疫グロブリンの製造方法においては、その免疫グロブリンが抗体重鎖定常領域（ＣＨ１−ＣＨ２−ＣＨ３）の全部又は一部とｓｃＦｖの融合タンパク質である。抗体重鎖定常領域はその抗体の安定性に寄与し、ｓｃＦｖはその融合タンパク質として発現されることにより単独のｓｃＦｖよりも安定性が高くなる。したがって。本発明の人工ポリクローナル免疫グロブリンの製造方法においては、より血中半減期が長い免疫グロブリン製剤を提供することができる。

請求項５に記載の発明は、前記組換え体が大腸菌であることを特徴とする請求項１乃至４のいずれかに記載の人工ポリクローナル免疫グロブリンの製造方法である。

本発明の人工ポリクローナル免疫グロブリンの製造方法においては、宿主細胞に大腸菌を用いるので大量培養が容易である。したがって、より簡便に大量の人工ポリクローナル免疫グロブリンを製造することができ、より安定的に免疫グロブリン製剤を提供することができる。

請求項６に記載の発明は、前記組織又は細胞が哺乳動物由来のものであることを特徴とする請求項１乃至５のいずれかに記載の人工ポリクローナル免疫グロブリンの製造方法である。

本発明の人工ポリクローナル免疫グロブリンの製造方法においては、哺乳動物の組織又は細胞に由来するｃＤＮＡから、互いに異なる免疫グロブリン可変領域を含むポリペプチドをコードする複数種の遺伝子を単離し、該遺伝子の混合物を調製する。哺乳動物がヒトの場合は、完全ヒト型の人工ポリクローナル免疫グロブリンを製造することができ、免疫グロブリン製剤の製造に有用である。哺乳動物がヒト以外の動物、例えばマウスの場合は、途中の工程でマウス型の可変領域を含むポリペプチドの混合物が得られるので、これらのポリペプチドをヒトの重鎖又は軽鎖の定常領域と組み合わせることにより、キメラ型の人工ポリクローナル免疫グロブリンを製造することができる。該キメラ型人工ポリクローナル免疫グロブリンも免疫グロブリン製剤の製造に使用することができる。

請求項７に記載の発明は、前記ポリペプチドが、折り畳み因子と該ポリペプチドとの融合タンパク質の一部として発現され、該融合タンパク質から単離されることを特徴とする請求項１乃至６のいずれかに記載の人工ポリクローナル免疫グロブリンの製造方法である。

組換えＤＮＡ技術によって異種タンパク質を製造する場合は、そのタンパク質が正しい立体構造を有する正常型タンパク質として合成される必要がある。合成されたタンパク質が正しい立体構造をとることを助ける働きをするタンパク質として、折り畳み因子と呼ばれるタンパク質がある。本発明の人工ポリクローナル免疫グロブリンの製造方法においては、まず、免疫グロブリン可変領域を含むポリペプチドを、折り畳み因子との融合タンパク質として発現させる。次に、該融合タンパク質から免疫グロブリン可変領域を含むポリペプチドを単離する。かかる構成により、免疫グロブリン可変領域を含むポリペプチドをより確実に正常型タンパク質として発現させることができる。その結果、当該ポリペプチドを高収率で製造することができ、より安定的に免疫グロブリン製剤を提供することができる。

請求項８に記載の発明は、前記哺乳動物が、ミエロペルオキシダーゼ欠損マウスであることを特徴とする請求項６に記載の人工ポリクローナル免疫グロブリンの製造方法である。

本発明の人工ポリクローナル免疫グロブリンの製造方法においては、ＭＰＯ欠損マウスの組織又は細胞に由来するｃＤＮＡから、互いに異なる免疫グロブリン可変領域を含むポリペプチドをコードする複数種の遺伝子を単離し、該遺伝子の混合物を調製する。ＭＰＯ欠損マウスは抗ＭＰＯ抗体を産生しており、該遺伝子の混合物は抗ＭＰＯ抗体に由来する遺伝子を多く含む。したがって、本発明の人工ポリクローナル免疫グロブリンの製造方法によれば、免疫グロブリン製剤の作用が抗ＭＰＯ抗体の効果であるという仮説の下、より高活性のキメラ型の免疫グロブリン製剤を提供することができる。

請求項９に記載の発明は、前記折り畳み因子が、ペプチジルプロリルシストランスイソメラーゼであることを特徴とする請求項７に記載の人工ポリクローナル免疫グロブリンの製造方法である。

また請求項１０に記載の発明は、前記ペプチジルプロリルシストランスイソメラーゼが、ＦＫ５０６結合性タンパク質であることを特徴とする請求項９に記載の人工ポリクローナル免疫グロブリンの製造方法である。

さらに請求項１１に記載の発明は、前記ＦＫ５０６結合性タンパク質が古細菌由来のものであることを特徴とする請求項１０に記載の人工ポリクローナル免疫グロブリンの製造方法である。

折り畳み因子の一つであるペプチジルプロリルシストランスイソメラーゼ（Ｐｅｐｔｉｄｙｌ−ｐｒｏｌｙｌ ｃｉｓ−ｔｒａｎｓ ｉｓｏｍｅｒａｓｅ。以下、「ＰＰＩａｓｅ」と称する。）は、標的タンパク質のプロリン残基のＮ末端側ペプチド結合のシス−トランス異性化反応を触媒する活性（ＰＰＩａｓｅ活性）を有する酵素である。ところが、古細菌由来のＰＰＩａｓｅはＦＫ５０６結合性タンパク質であり、かつＰＰＩａｓｅ活性の他に分子シャペロン活性も有することが知られている。ここで分子シャペロン活性とは、変性したタンパク質を元の正常型にリフォールディングさせる活性、又は変性したタンパク質の不可逆的な凝集を抑制する活性と定義される。すなわち、古細菌由来のＰＰＩａｓｅは分子シャペロン活性を有しない通常のＰＰＩａｓｅと比較して、目的タンパク質をより確実に正しく折り畳むことができる。そして、本発明の人工ポリクローナル免疫グロブリンの製造方法においては、免疫グロブリン可変領域を含むポリペプチドを、ＰＰＩａｓｅ、より好ましくは古細菌由来のＰＰＩａｓｅとの融合タンパク質として発現させる。かかる構成により、免疫グロブリン可変領域を含むポリペプチドを、さらに確実に正常型タンパク質として発現させることができる。その結果、当該ポリペプチドをさらに高収率で製造することができ、より安定的に免疫グロブリン製剤を提供することができる。

請求項１２に記載の発明は、請求項１乃至１１のいずれかに記載の人工ポリクローナル免疫グロブリンの製造方法によって製造された人工ポリクローナル免疫グロブリンと、ＣＨ１−ＣＨ２−ＣＨ３領域の全部又は一部を含むポリペプチドとを混合することを特徴とする人工ポリクローナル免疫グロブリンの製造方法である。

本発明の人工ポリクローナル免疫グロブリンの製造方法においては、人工ポリクローナル免疫グロブリンに抗体重鎖定常領域（ＣＨ１−ＣＨ２−ＣＨ３領域）の全部又は一部を含むポリペプチドを混合する。抗体重鎖定常領域は免疫グロブリンの安定化に寄与するので、本発明の人工ポリクローナル免疫グロブリンの製造方法によって、より安定化された免疫グロブリン製剤を提供することができる。なお、ＣＨ１−ＣＨ２−ＣＨ３領域の全部又は一部は組換えＤＮＡ技術で作製することができ、その取得が容易である。

請求項１３に記載の発明は、前記ＣＨ１−ＣＨ２−ＣＨ３領域の全部又は一部を含むポリペプチドが、該ポリペプチドをコードする遺伝子を含有する組換え体の培養物から採取されたものであることを特徴とする請求項１２に記載の人工ポリクローナル免疫グロブリンの製造方法である。

本発明の人工ポリクローナル免疫グロブリンの製造方法においては、ＣＨ１−ＣＨ２−ＣＨ３領域の全部又は一部を含むポリペプチドを組換え体によって製造する。かかる構成により、ＣＨ１−ＣＨ２−ＣＨ３領域の全部又は一部を含むポリペプチドを簡便かつ大量に製造することができ、より安定的に免疫グロブリン製剤を提供することができる。

請求項１４に記載の発明は、前記ＣＨ１−ＣＨ２−ＣＨ３領域の全部又は一部を含むポリペプチドが、折り畳み因子と該ポリペプチドとの融合タンパク質の一部として発現され、該融合タンパク質から単離されることを特徴とする請求項１２又は１３に記載の人工ポリクローナル免疫グロブリンの製造方法である。

かかる構成により、ＣＨ１−ＣＨ２−ＣＨ３領域の全部又は一部を含むポリペプチドをより確実に正常型タンパク質として得ることができる。その結果、当該ポリペプチドを高収率で製造することができ、より安定的に免疫グロブリン製剤を提供することができる。

請求項１５に記載の発明は、前記組換え体が大腸菌であることを特徴とする請求項１３に記載の人工ポリクローナル免疫グロブリンの製造方法である。

かかる構成により、ＣＨ１−ＣＨ２−ＣＨ３領域の全部又は一部を含むポリペプチドをさらに簡便かつ大量に製造することができ、さらに安定的に免疫グロブリン製剤を提供することができる。

請求項１６に記載の発明は、折り畳み因子が、ペプチジルプロリルシストランスイソメラーゼであることを特徴とする請求項１４に記載の人工ポリクローナル免疫グロブリンの製造方法である。

また請求項１７に記載の発明は、前記ペプチジルプロリルシストランスイソメラーゼが、ＦＫ５０６結合性タンパク質であることを特徴とする請求項１６に記載の人工ポリクローナル免疫グロブリンの製造方法である。

さらに請求項１８に記載の発明は、前記ＦＫ５０６結合性タンパク質が古細菌由来のものであることを特徴とする請求項１７に記載の人工ポリクローナル免疫グロブリンの製造方法である。

かかる構成により、ＣＨ１−ＣＨ２−ＣＨ３領域の全部又は一部を含むポリペプチドをさらに確実に正常型タンパク質として得ることができる。その結果、当該ポリペプチドをさらに高収率で製造することができ、より安定的に免疫グロブリン製剤を提供することができる。

本発明によれば、感染リスクが極めて低くかつ安定供給が可能な免疫グロブリン製剤を提供することができ、ＩＶＩｇ治療に有用である。

以下に、本発明を実施するための最良の形態について詳しく説明する。

本発明の人工ポリクローナル免疫グロブリンの製造方法の１つの様相は、４つの工程を含む。これらの工程について、順次説明する。まず、本様相の人工ポリクローナル免疫グロブリンの製造方法の第１の工程は、免疫グロブリンを発現している組織又は細胞に由来するｃＤＮＡから、互いに異なる免疫グロブリン可変領域を含むポリペプチドをコードする複数種の遺伝子を単離し、該遺伝子の混合物を調製する工程、である。第１の工程は、換言すれば、遺伝子のライブラリーを調製する工程である。

まず、免疫グロブリンを発現している組織としては、Ｂ細胞やプラズマ細胞といった抗体産生細胞を有している脾臓やリンパ節が該当するが、取り扱いの容易さから脾臓が好ましい。また、免疫グロブリンを発現している細胞としては、Ｂ細胞やプラズマ細胞といった天然の抗体産生細胞の他に、ハイブリドーマも使用可能である。ハイブリドーマを使用する場合は、ポリクローナルな免疫グロブリンを得るために、複数種のハイブリドーマを混合して用いる必要がある。複数種のハイブリドーマの例としては、ＭＰＯ欠損マウスの脾臓から採取したＢ細胞とミエローマを細胞融合して作製される複数種のハイブリドーマが挙げられる。該複数種のハイブリドーマはＭＰＯの互いに異なるエピトープを認識する抗体を産生するものであれば、それらの抗体を含んだポリクローナルな免疫グロブリンを得ることができる。この方法によれば、反応する抗原が限定されたポリクローナル免疫グロブリンを得ることができる。換言すれば、ハイブリドーマを自由に組み合わせることで所望の組成（集団）をもつ人工ポリクローナル免疫グロブリンを製造することができる。また組織又は細胞の由来としては、哺乳動物が好ましい。例えば、ヒト由来の組織又は細胞であれば、現在の血液製剤と同様の完全ヒト型免疫グロブリンを得ることができる。一方、他の哺乳動物、例えばマウスを選択する場合は、途中工程でマウスの可変領域を含むポリペプチドが得られるので、ヒト定常領域と組み合わせてキメラ型免疫グロブリンを得ることができる。

組織又は細胞に由来するｃＤＮＡを調製する方法としては、一般に用いられている方法を適用することができ、例えば、組織又は細胞の破砕物からｍＲＮＡを抽出・精製し、逆転写反応によって１本鎖ｃＤＮＡ、さらにＤＮＡ合成反応によって２本鎖ｃＤＮＡを得ることができる。得られたｃＤＮＡから互いに異なる免疫グロブリン可変領域を含むポリペプチドをコードする複数種の遺伝子を単離する方法としては、目的の遺伝子をＰＣＲ等の特異的増幅反応によって増幅して単離する方法が代表的である。この際、プライマー配列を適宜選ぶことにより、所望の領域をコードする遺伝子を得ることができる。マウスの遺伝子の場合を例に挙げると、マウス脾臓に由来するｃＤＮＡを鋳型とし、配列番号１〜１８に示されるオリゴヌクレオチドの混合物をフォワードプライマー、配列番号１９〜２２で示されるオリゴヌクレオチドの混合物をリバースプライマーとしてＰＣＲを行うことにより、マウス由来の複数種のＶＬ遺伝子を単離することができる。同様に、配列番号２３〜４１に示されるオリゴヌクレオチドの混合物をフォワードプライマー、配列番号４２〜４４で示されるオリゴヌクレオチドの混合物をリバースプライマーとしてＰＣＲを行うことにより、マウス由来の複数種のＶＨ遺伝子を単離することができる。なお、いずれの場合も、複数種の遺伝子を得るためには複数の可変領域に適応した単一配列でない混合されたプライマー（ミックスプライマー）を使用することが必要である。

さらに、オーバーラップＰＣＲ等の方法を用いれば、分散して不連続に存在する遺伝子を結合した形で単離することもできる。この方法によれば、ｓｃＦｖのような天然には存在しない人工の抗体をコードする遺伝子でも簡単に単離することができる。マウスの遺伝子の場合を例に挙げると、上記のようにして得られたマウス由来の複数種のＶＬ遺伝子及び複数種のＶＨ遺伝子を鋳型とし、配列番号４５及び４６で示されるオリゴヌクレオチドをプライマーとしてＰＣＲを行うことにより、複数種のＶＬ遺伝子と複数種のＶＨ遺伝子がＶＬ−ＶＨのごとく連結された複数種のｓｃＦｖ遺伝子を得ることができる。なお、いずれの場合もプライマーに制限酵素サイトをあらかじめ含めておくことにより、各種発現ベクターへの挿入を容易に行うことができる。以上のようにして得られた遺伝子は、可変領域の多様性に対応した複数種の遺伝子の集団として得られる。

互いに異なる免疫グロブリン可変領域を含むポリペプチドの好ましい例として、ｓｃＦｖ、ＣＨ１−ＶＨ領域からなるポリペプチド、ＣＬ−ＶＬ領域からなるポリペプチド、ＶＨ領域からなるポリペプチド、ＣＨ１−ＣＨ２−ＣＨ３領域の全部又は一部とＶＨ領域との融合タンパク質、が挙げられる。

ｓｃＦｖは、抗体が抗原を認識するために必要な最小単位であるＶＬ領域とＶＨ領域のみからなり、そのサイズがコンパクトである。ｓｃＦｖは大腸菌等の微生物での発現が容易であることが知られている。

ＣＨ１−ＶＨ領域は抗体重鎖の部分配列であり、抗体が抗原を認識するために必要な最小単位の一つであるＶＨ領域を含んでいる。また、ＣＬ−ＶＬ領域は抗体軽鎖の全体配列であり、抗体が抗原を認識するために必要な最小単位の一つであるＶＬ領域を含んでいる。これらのポリペプチドは、天然の抗体重鎖に比べてそのサイズがコンパクトである。したがって、これらの実施形態においては、組換え体における遺伝子発現が容易であり、より簡便に人工ポリクローナル免疫グロブリンを製造することができる。

ＶＨ領域は抗体重鎖の可変領域であり、抗体が抗原を認識するために必要な最小単位の一つである。そして、ＶＨ領域からなるポリペプチドは天然の抗体重鎖に比べてそのサイズが非常にコンパクトである。したがって、本実施形態の人工免疫グロブリンの製造方法においては、組換え体における遺伝子発現がきわめて容易であり、より簡便に人工ポリクローナル免疫グロブリンを製造することができる。

ＣＨ１−ＣＨ２−ＣＨ３領域の全部又は一部とＶＨ領域との融合タンパク質は、換言すれば、可変領域を含む抗体重鎖の全部又は一部である。ＣＨ１−ＣＨ２−ＣＨ３領域はその抗体の安定性に寄与し、ＶＨ領域はその融合タンパク質として発現されることにより単独のＶＨ断片よりも安定性が高い。したがって、より血中半減期が長い免疫グロブリン製剤を提供される。

次に、本様相の人工ポリクローナル免疫グロブリンの製造方法の第２の工程の工程について説明する。第２の工程は、該遺伝子の混合物をベクターに接触させ、互いに異なる遺伝子が挿入された複数種の組換えベクターを調製し、該組換えベクターの混合物を調製する工程、である。第２の工程は、換言すれば、組換えベクターのライブラリーを調製する工程である。ここで使用するベクターは、使用する宿主細胞に対応して選択することになる。例えば、大腸菌を宿主細胞とするときに使用できるベクターとしては、適当なプロモーター、ＳＤ配列、ターミネーター等を含むものであれば特に制限はない。プロモーターの種類としては、ｌａｃ、ｔａｃ、ｔｒｃ、ｔｒｐ、λｐＬ、Ｔ７、Ｔ３等が挙げられる。また、ベクターは生産性の点で多コピープラスミドであることが好ましく、例えば、ＣｏｌＥＩ系、ｐＢＲ系、ｐＡＣＹＣ系のプラスミドが好適である。これらに属する発現ベクターは各社から市販されており、簡単に入手することができる。なお、Ｔ７プロモーターを有するベクターを使用する場合は、一般には宿主大腸菌はＤＥ３株を使用する必要があるが、ＤＥ３株以外の大腸菌であっても対数増殖期にＣＥ６ファージを添加することで使用可能となる。

ベクターに遺伝子を組込む方法としては、ライゲーション反応による方法が代表的である。すなわち、ベクターを適宜の制限酵素等で開裂し、目的の遺伝子をリガーゼの作用によってベクターに連結する。リガーゼの種類としてはＴ４ＤＮＡリガーゼ等を用いることができる。ＰＣＲ産物をベクターに導入するときは、ＴＡクローニング法によって制限酵素を使わずにライゲーション反応を行うことができる。またライゲーション反応によらない方法として、相同組換えを利用する方法もある。例えば、ｃｒｅ−リコンビナーゼ（クロンテック社）やラムダインテグラーゼ（インビトロジェン社）を用いることにより、リガーゼを用いることなく相同組換えによって目的の遺伝子をベクターに導入することができる。

好ましい実施形態では、折り畳み因子の遺伝子を含み、目的タンパク質の遺伝子を導入することで、折り畳み因子と目的タンパク質との融合タンパク質を発現することができるベクターを用いる。本ベクターを用いることにより、抗体断片と折り畳み因子との融合タンパク質が発現され、該抗体断片は折り畳み因子の作用によってより正しく折り畳まれる。

次に、本様相の人工ポリクローナル免疫グロブリンの製造方法の第３の工程の工程について説明する。第３の工程は、該組換えベクターの混合物を宿主細胞に接触させ、互いに異なる組換えベクターが導入された複数種の組換え体を調製し、該組換え体の混合物を調製する工程、である。第３の工程は、換言すれば、組換え体のライブラリーを調製する工程である。ここで使用する宿主細胞としては、例えば、バクテリア、酵母、植物細胞、昆虫細胞、動物細胞が挙げられるが、培養の容易性と生産性の点でバクテリアが好ましい。特に大腸菌を宿主細胞とする系は宿主−ベクター系が確立されており、本発明の人工ポリクローナル免疫グロブリンの製造方法に好適である。宿主細胞にベクターを導入する方法としては、宿主細胞の種類によって適宜の方法を使い分けることができる。例えば、大腸菌の場合は、塩化カルシウム処理、エレクトロポレーション等が使用可能である。

その他の宿主細胞として、Ｂａｃｉｌｌｕｓ属バクテリアを宿主細胞に用いる場合は、菌体外への分泌発現が可能である。さらに、グラム陽性バクテリアであるのでエンドトキシンの混入が少なく、精製の負担が少ない。また酵母を宿主細胞に用いる場合は、真核生物であるので糖鎖付加などの翻訳後修飾が可能である。さらに分泌発現が可能である。その他、植物細胞、昆虫細胞、動物細胞も使用可能である。例えば、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞を用いる方法は、組換え医薬品の製造において実績がある。

次に、本様相の人工ポリクローナル免疫グロブリンの製造方法の第４の工程を説明する。第４の工程は、該組換え体の混合物を混合培養し、該組換え体の混合物から互いに異なる複数種の免疫グロブリン可変領域を含むポリペプチドを調製し、該免疫グロブリン可変領域を含むポリペプチドの混合物を調製する工程、である。混合培養の方法に特に制限はないが、大腸菌の場合は適宜の培地に組換え体混合物を接種し、通気・攪拌しながら培養すればよい。組換えベクターが薬剤耐性遺伝子を有するものであれば、対応する抗生物質を培地中に添加することによって、宿主細胞から組換えベクターが脱落することを防ぐことができる。また、組換えベクターのプロモーターが誘導型プロモーターである場合は、培地中に誘導物質を加えることによって免疫グロブリン遺伝子の発現を誘導し、コントロールすることができる。λｐＬプロモーターのように温度感受性のプロモーターの場合は、培養温度を上げることによって免疫グロブリン遺伝子の発現を誘導・コントロールすることができる。

培養した組換え体混合物から複数種の免疫グロブリン可変領域を含むポリペプチドを調製する方法としては、例えば、遠心分離等の操作によって組換え体混合物を集め、適宜の細胞破砕処理を行って細胞抽出液を取得し、該細胞抽出液から複数種の免疫グロブリン可変領域を含むポリペプチドを得ることができる。このようにして得られた該ポリペプチドの混合物は、まさに人工のポリクローナルな免疫グロブリンである。なお細胞破砕方法は公知の方法を使用することができ、例えば機械的破砕法を使用することができる。機械的破砕法の例としては、ホモジナイザーによる破砕、圧力変化による破砕、超音波による破砕等が挙げられる。また、機械的破砕法以外の方法、例えば低張処理や酵素処理も使用可能である。

好ましい実施形態では、分子シャペロン等の折り畳み因子の作用を利用して、免疫グロブリン可変領域を含むポリペプチドを正しく折り畳む。例えば、折り畳み因子を免疫グロブリン可変領域を含むポリペプチドとの融合タンパク質として発現させて該ポリペプチドを正常型タンパク質として合成し、その後に適宜の方法で折り畳み因子と該ポリペプチドを切断することにより、人工ポリクローナル免疫グロブリンを製造することができる。この場合は、例えば、第２の工程で折り畳み因子との融合用ベクターを使用する。使用する折り畳み因子の例としては、ＰＰＩａｓｅ、ＨＳＰ７０、ＨＳＰ９０、スモールヒートショックタンパク質、シャペロニンが挙げられる。この中でも、古細菌由来のＦＫ５０６結合型ＰＰＩａｓｅはＰＰＩａｓｅ活性に加えて分子シャペロン活性も有するので、折り畳み反応には特に好適である。本実施形態は、宿主細胞が大腸菌である場合に特に有効である。

ＦＫＢＰ型ＰＰＩａｓｅの由来となる古細菌の例としては、Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ属、Ｍｅｔｈａｎｏｃｏｃｃｕｓ属、Ｍｅｔｈａｎｏｓａｒｃｉｎａ属、Ｈａｌｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ属、Ａｒｃｈａｅｏｇｌｏｂｕｓ属、Ａｅｒｏｐｕｒｕｍ属、Ｐｕｒｏｂａｃｕｌｕｍ属、Ｓｕｌｆｏｌｏｂｕｓ属、Ｆｅｒｒｏｐｌａｓｍａ属、Ｔｈｅｒｍｏｐｌａｓｍａ属、Ｍｅｔｈａｎｏｐｙｒｕｓ属、Ｍｅｔｈａｎｏｔｈｅｒｍｏｂａｃｔｅｒ属、Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ属に属する古細菌が挙げられる。

ＰＰＩａｓｅ以外の折り畳み因子としては、例えば、シャペロニンが使用できる。シャペロニンは非酵素的に働く折り畳み因子である分子シャペロンの一種である。シャペロニンは内部に空洞を有するリング状のサブユニット複合体であり、その空洞内に標的タンパク質を格納し、ＡＴＰ依存的に折り畳み反応を行う。このうち大腸菌由来のシャペロニンはＧｒｏＥＬと呼ばれ、その物理化学的性質がよく知られており、入手も容易である。

一方、古細菌由来のシャペロニンは耐熱性であり、目的タンパク質の折り畳みの他に、内部に格納した目的タンパク質を熱による変性から守る作用を有する。したがって、内部に格納された目的タンパク質を精製する際に、あらかじめ熱処理を行って夾雑タンパク質を沈殿させて除去することができ、精製が容易になる。

特に好ましい実施形態では、免疫グロブリン可変領域を含むポリペプチドと折り畳み因子との間に、プロテアーゼ切断配列（プロテアーゼ認識配列）を入れる。その結果、融合タンパク質に対応のプロテアーゼを作用させることにより、免疫グロブリン可変領域を含むポリペプチドを切り出すことができる。プロテアーゼの例としては、トロンビン、ファクターＸａ、プレシジョンプロテアーゼ、エンテロキナーゼ等が挙げられる。

その他の例として、免疫グロブリン可変領域を含むポリペプチド遺伝子を含む組換えベクターとは別の共存可能なベクターに折り畳み因子の遺伝子を組み込んで発現させ、該ポリペプチドに作用させてもよい。

本様相の人工ポリクローナル免疫グロブリンの製造方法は、上記した４工程を含む方法によって製造された２種以上の人工ポリクローナル免疫グロブリンを混合することによって新たなポリクローナル免疫グロブリンを製造する方法も含む。この方法によれば、複数種類のポリペプチドからなるポリクローナル免疫グロブリンを製造することができる。なおこの方法によってポリクローナル免疫グロブリンを製造する場合は、それぞれのポリペプチドが混合後にジスルフィド結合によって結合されるように、酸化条件で混合することが好ましい。具体例を挙げると、ＣＨ１領域とＣＬ領域はそれぞれシステイン残基を有しており、これらのシステイン残基はジスルフィド結合により結合することができる。したがって、ＣＨ１−ＶＨ領域からなるポリペプチドとＣＬ−ＶＬ領域からなるポリペプチドとを混合すると、混合された両ポリペプチドはヘテロダイマーであるＦａｂ断片を形成することができる。また、ＣＨ１領域とＣＬ領域は各１個、ＣＨ２領域は２個システイン残基を有しており、ＣＨ１領域とＣＬ領域あるいはＣＨ２領域同士のシステイン残基はジスルフィド結合により結合することができる。したがって、ＣＬ−ＶＬ領域からなるポリペプチドと、ＶＨ領域と抗体重鎖定常領域であるＣＨ１−ＣＨ２−ＣＨ３領域の全部又は一部との融合タンパク質を混合することにより、混合された両ポリペプチドは、天然型の免疫グロブリン基本構造やＦ（ａｂ'）₂断片等を形成することができる。

本発明の人工ポリクローナル免疫グロブリンの製造方法の他の様相では、上記した様相の方法で製造された人工ポリクローナル免疫グロブリンと、ＣＨ１−ＣＨ２−ＣＨ３領域の全部又は一部を含むポリペプチドとを混合する。抗体重鎖定常領域は免疫グロブリンの安定化に寄与するので、本様相の人工ポリクローナル免疫グロブリンの製造方法によって、より安定化された免疫グロブリン製剤を提供することができる。なお、ＣＨ１−ＣＨ２−ＣＨ３領域の全部又は一部は組換えＤＮＡ技術で作製することができ、その取得が容易である。

また、上記した第１の様相と同様に、本様相の好ましい実施形態においても、分子シャペロン等の折り畳み因子の作用を利用して、ＣＨ１−ＣＨ２−ＣＨ３領域の全部又は一部を含むポリペプチドを正しく折り畳む。例えば、当該ポリペプチドと折り畳み因子との融合タンパク質から、正しく折り畳まれた当該ポリペプチドを単離する。折り畳み因子としては、特に、古細菌由来のＦＫＢＰ型ＰＰＩａｓｅを用いることが好ましい。

組換え体から調製された人工ポリクローナル免疫グロブリンは、クロマトグラフィー等の操作によって高度に精製されることにより、免疫グロブリン製剤に適した原薬とすることができる。精製の方法はタンパク質の精製に一般的に使用されている方法を適用することができ、各種クロマトグラフィー、塩析、膜分離等の操作を組み合わせることにより精製品を得ることができる。得られた人工ポリクローナル免疫グロブリン標品については、電気泳動等の分析手法によってタンパク質純度等を調べることができる。

なお、ポリペプチドが封入体として得られる場合は、回収した封入体を界面活性剤等で可溶化した後に、折り畳み直すことができる。

精製された人工ポリクローナル免疫グロブリンは、適宜の安定化剤や賦形剤を添加することにより免疫グロブリン製剤として製剤化することができる。免疫グロブリン製剤の剤型としては、凍結乾燥注射剤、溶液注射剤、輸液等が挙げられる。添加される安定化剤・賦形剤の例としては、タンパク製剤に一般に用いられているものが使用可能であり、アルブミン、糖類、アミノ酸、ポリオール類、各種緩衝液等が使用可能である。

本発明の人工ポリクローナル免疫グロブリンの製造方法で製造される免疫グロブリンとしては、まず抗体重鎖と抗体軽鎖を各２本ずつ有する天然型の免疫グロブリンが挙げられる。さらに、可変領域を含む部分断片、例えば、重鎖（ＶＨ−ＣＨ１−ＣＨ２−ＣＨ３）、軽鎖（ＣＬ−ＶＬ）、Ｆａｂ断片、Ｆ（ａｂ'）₂断片、ＣＨ１−ＶＨ断片、ＣＬ−ＶＬ断片、ＶＨ断片、ＶＬ断片等が挙げられる。さらに、ｓｃＦＶ、ｓｃＦｖ−ＣＨ１−ＣＨ２−ＣＨ３融合タンパク質、ｓｃＦｖ−ＣＨ２−ＣＨ３融合タンパク質等の可変領域を含む同機能の人工の融合タンパク質が挙げられる。

以下に、実施例をもって本発明を具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。

（実施例１）マウスｓｃＦｖ遺伝子の調製と各発現ベクターの構築
１．マウスｓｃＦｖ遺伝子の調製
マウス由来ＭＰＯを免疫したＭＰＯ−ＫＯマウス（アラタニら（Ｙ． Ａｒａｔａｎｉ ｅｔ ａｌ．）、インフェクション アンド イミュニティ（Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ ａｎｄ Ｉｍｍｕｎｉｔｙ）、第６７巻、第１８２８−１８３６頁、１９９９年）の脾臓より、ＲＮＡ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ（アマシャムバイオサイエンス社）、及びｍＲＮＡ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（アマシャムバイオサイエンス社）を用いてｍＲＮＡを抽出・精製し、さらに、Ｆｉｒｓｔ−Ｓｔｒａｎｄ ｃＤＮＡ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ Ｋｉｔ（アマシャムバイオサイエンス社）によってオリゴｄＴプライマー法を用いて、それぞれのｃＤＮＡを合成した。ＰＣＲ反応溶液１００μＬ（ｍｍ³）中、１００μｇのｃＤＮＡを鋳型とし、フォワードプライマーとして配列番号１〜１８に示されるオリゴヌクレオチドの当量混合物１００ｐｍｏｌｅ、リバースプライマーとして配列番号１９〜２２で示されるオリゴヌクレオチドの当量混合物１００ｐｍｏｌｅを用い、９４℃で３０秒、６３℃で３０秒、５６℃で３０秒、及び７２℃で６０秒の４ステップを３０サイクル行うＰＣＲを行い、各マウス由来ＶＬ遺伝子を増幅させた。ホットスタートＰＣＲを行うため、ＤＮＡポリメラーゼはＴａＫａＲａ Ｅｘ Ｔａｑ Ｈｏｔ Ｓｔａｒｔ Ｖｅｒｓｉｏｎ（タカラバイオ社）用いた。本１００μＬの反応を並列で１０本行った。同様に、ＰＣＲ反応溶液１００μＬ中、１００μｇのｃＤＮＡを鋳型とし、配列番号２３〜４１に示されるオリゴヌクレオチドの当量混合物１００ｐｍｏｌｅ、配列番号４２〜４４に示されるオリゴヌクレオチドの当量混合物１００ｐｍｏｌｅを用い、ＶＬ遺伝子と同様の条件でＰＣＲを行い、各マウス由来ＶＨ遺伝子を増幅した。増幅されたＶＬ遺伝子及びＶＨ遺伝子は２．０％アガロースゲル電気泳動によって分離し、回収した。

上記方法によって得られた各マウス由来ＶＬ遺伝子及びＶＨ遺伝子のそれぞれ１００μｇを鋳型とし、配列番号４５及び４６に示されるオリゴヌクレオチド各６０ｐｍｏｌｅをプライマーとし、ＴａＫａＲａ Ｅｘ Ｔａｑ Ｈｏｔ Ｓｔａｒｔ Ｖｅｒｓｉｏｎを用いてＯｖｅｒ−Ｌａｐｐｉｎｇ−Ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ−ＰＣＲ（１００μＬ）を行い、ｓｃＦｖ遺伝子を増幅させた。ＰＣＲの条件は、９４℃で３０秒、６３℃で３０秒、５８℃で３０秒、及び７２℃で９０秒の４ステップを７サイクル行った後、９４℃で３０秒、６３℃で６０秒、７２℃で９０秒の３ステップを２３サイクルで行った。本１００μＬのＰＣＲ反応を並列で１０本行った。増幅された野生マウス及びＭＰＯ−ＫＯマウス由来ｓｃＦｖ遺伝子を１．５％アガロース電気泳動によって分離し、それぞれ約１０μｇを回収した。なお、本実施例で増幅・単離されたｓｃＦｖ遺伝子は、プライマーに由来して５'末端域にはＳｆｉＩサイトが、３'末端域にはＮｏｔＩサイトが導入されている。

２．発現ベクターｐＴｍＦＫＰＩの構築
古細菌の一種であるメタン細菌Ｍｅｔｈａｎｏｓａｒｃｉｎａ ａｃｅｔｉｖｏｒａｎｓ Ｃ２Ａ （ＤＳＭ２８３４）からゲノムＤＮＡを抽出し、本ゲノムＤＮＡを鋳型とし、配列番号４７及び４８に示されるプライマーを用いてＰＣＲを行い、ＦＫＢＰ型ＰＰＩａｓｅ（以下、ｍＦＫと称する）遺伝子（配列番号４９、ＧｅｎＢａｎｋ Ｎｏ．ＮＣ００３５５２）を増幅・単離した。なお、本増幅ＤＮＡ断片はプライマーに由来して、５'末端にＮｃｏＩサイト、３'末端にＳｐｅＩサイトが導入されている。一方、プラスミドｐＥＴ２１ｄ（ノバジェン社）のＮｃｏＩ−ＸｈｏＩサイト間に配列番号５０で示される合成ＤＮＡを導入し、改変ｐＥＴ２１ｄを作製した。なお配列番号５０で示される合成ＤＮＡは、５'末端にＮｃｏＩサイト（５'−ＣＣＡＴＧＧ−３'）、３'末端にＸｈｏＩサイト（５'−ＣＴＣＧＡＧ−３'）を有し、さらに内部にＳｐｅＩサイト（１１〜１６番目の５'−ＡＣＴＡＧＴ−３'）、ＳｆｉＩサイト（４４〜５６番目の５'−ＧＧＣＣＣＡＧＡＣＧＧＣＣ−３'）及びＮｏｔＩサイト（６１〜６８番目の５'−ＧＣＧＧＣＣＧＣ−３'）を有する。さらに、プレシジョンプロテアーゼの認識アミノ酸配列をコードする塩基配列を２箇所含む（１８〜４１、６９〜９１番目の５'−ＣＴＧＧＡＡＧＴＴＣＴＧＴＴＣＣＡＧＧＧＧＣＣＧ−３'）。さらに、６個の連続したヒスチジン残基（Ｈｉｓタグ）をコードする塩基配列（９６〜１１３番目の５'−ＣＡＴＣＧＣＣＡＴＣＧＣＣＡＴＣＧＣ−３）とタンデムの終始コドン（１１４〜１１９番目の５'−ＴＡＡＴＡＧ−３'）を含む。

改変ｐＥＴ２１ｄのＮｃｏＩ−ＳｐｅＩサイトに上記ｍＦＫ遺伝子のＰＣＲ増幅ＤＮＡ断片を導入し、発現ベクターｐＴｍＦＫＰＩを構築した。図１に発現ベクターｐＴｍＦＫＰＩの構成を示す。すなわち、発現ベクターｐＴｍＦＫＰＩはｐＥＴ２１ｄに由来するＴ７プロモーターとＴ７ターミネーターを含んでいる。さらに、発現ベクターｐＴｍＦＫＰＩは、そのＳｆｉＩ−ＮｏｔＩサイトに目的タンパク質の遺伝子を挿入することにより、ｍＦＫと目的タンパク質の融合タンパク質を合成することができる。さらに、ｍＦＫは分子シャペロン活性も有することから、該融合タンパク質は大腸菌の細胞質可溶性画分へ大量合成することが可能である。さらに、発現ベクターｐＴｍＦＫＰＩはＮｏｔＩサイトの下流に６個のヒスチジン残基（Ｈｉｓタグ）をコードする塩基配列を含んでいるので、融合タンパク質のＣ末端には６個のヒスチジン残基が導入され、キレートカラムを用いることによって発現した融合タンパク質を容易に精製することができる。さらに、目的タンパク質を挟むようにプレシジョンプロテアーゼの認識配列を２箇所含んでいるので、融合タンパク質から目的タンパク質を簡単に切り出すことができる。

３．発現ベクターｐＴｍＦＫＰＣ１２３の構築
ヒト脾臓ｃＤＮＡライブラリー（Ｃｏｄｅ Ｎｏ. ９５０９、タカラバイオ社）を鋳型として、配列番号５１及び５２で示されるオリゴヌクレオチドをプライマーとしてＰＣＲを行い、配列番号５３で示されるヒト抗体重鎖定常領域遺伝子の全長（停止コドンを含む）を単離した。配列の決定は、ＰＣＲ産物をｐＴ７Ｂｌｕｅ-Ｔベクター（ノバジェン社）にクローニングし、Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｅｑｕｅｎａｓｅ Ｄｙｅ Ｔｅｒｍｉｏｎａｔｏｒ Ｃｙｃｌｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ Ｋｉｔ（アマシャムバイオサイエンス社）によって行った。次に、図１に示される発現ベクターｐＴｍＦＫＰＩのＮｏｔＩ−ＸｈｏＩサイトに配列番号５４で示される合成ＤＮＡを挿入してＢａｍＨＩ−ＥｃｏＲＩサイトを設けた。なお配列番号５４で示される合成ＤＮＡは、ＮｃｏＩサイト（５'−ＣＣＡＴＧＧ−３'）、３'末端にＸｈｏＩサイト（５'−ＣＴＣＧＡＧ−３'）を有し、内部にＢａｍＨＩサイト（９〜１４番目の５'−ＧＧＡＴＣＣ−３'）とＥｃｏＲＩサイト（２１〜２６番目の５'−ＧＡＡＴＴＣ−３'）とを有する。

次に、ベクターに設けられたＢａｍＨＩ−ＥｃｏＲＩサイトに単離したヒト抗体重鎖定常領域遺伝子の全長（停止コドンを含む）を導入し、発現ベクターｐＴｍＦＫＰＣ１２３を構築した。図２にｐＴｍＦＫＰＣ１２３の構成を示す。すなわち、発現ベクターｐＴｍＦＫＰＣ１２３はｐＥＴ２１ｄに由来するＴ７プロモーターとＴ７ターミネーターを含んでいる。さらに、発現ベクターｐＴｍＦＫＰＣ１２３は、そのＳｆｉＩ−ＮｏｔＩサイトに目的タンパク質の遺伝子を挿入することにより、ｍＦＫ−目的タンパク質−ＣＨ１−ＣＨ２−ＣＨ３融合タンパク質を合成することができる。さらに、ｍＦＫは分子シャペロン活性も有することから、該融合タンパク質は大腸菌の細胞質可溶性画分へ大量合成することが可能である。さらに、目的タンパク質遺伝子の挿入部位の上流にプレシジョンプロテアーゼの認識配列を１箇所含んでいるので、ｍＦＫ−目的タンパク質−ＣＨ１−ＣＨ２−ＣＨ３融合タンパク質から、目的タンパク質−ＣＨ１−ＣＨ２−ＣＨ３融合タンパク質を簡単に切り出すことができる。

４．発現ベクターｐＴｍＦＫＰＣ２３の構築
上記３で単離されたヒト抗体重鎖定常領域遺伝子の全長（停止コドンを含む）を鋳型とし、配列番号５５及び５６に示されるプライマーを用いてＰＣＲを行い、配列番号５７に示される抗体Ｆｃドメイン（ＣＨ２−ＣＨ３）のみをコードする遺伝子（停止コドン含む）を増幅した。本増幅ＤＮＡ断片をＢａｍＨＩ及びＥｃｏＲＩで末端を切断し、ｐＴｍＦＫＰＣ１２３のＢａｍＨＩ−ＥｃｏＲＩサイトに挿入し、ｐＴｍＦＫＰＣ２３を構築した。図３にｐＴｍＦＫＰＣ２３の構成を示す。すなわち、発現ベクターｐＴｍＦＫＰＣ２３は、ｐＥＴ２１ｄに由来するＴ７プロモーターとＴ７ターミネーターを含んでいる。さらに、発現ベクターｐＴｍＦＫＰＣ２３は、そのＳｆｉＩ−ＮｏｔＩサイトに目的タンパク質の遺伝子を挿入することにより、ｍＦＫ−目的タンパク質−ＣＨ２−ＣＨ３融合タンパク質を合成することができる。さらに、ｍＦＫは分子シャペロン活性も有することから、該融合タンパク質は大腸菌の細胞質可溶性画分へ大量合成することが可能である。さらに、目的タンパク質遺伝子の挿入部位の上流にプレシジョンプロテアーゼの認識配列を１箇所含んでいるので、ｍＦＫ−目的タンパク質−ＣＨ２−ＣＨ３融合タンパク質から、目的タンパク質−ＣＨ２−ＣＨ３融合タンパク質を簡単に切り出すことができる。

５．発現ベクターｐＴｍＦＫＰＨＣの構築
ｐＴｍＦＫＰＣ１２３のＳｐｅＩ−ＢａｍＨＩサイトに配列番号５８で示される合成ＤＮＡを導入することによって、発現ベクターｐＴｍＦＫＰＨＣを構築した。なお配列番号５８で示される合成ＤＮＡは、５'末端にＳｐｅＩサイト（５'−ＡＣＴＡＧＴ−３'）、３'末端にＢａｍＨＩサイト（５'−ＧＧＡＴＣＣ−３'）、内部にプレシジョンプロテアーゼの認識アミノ酸配列をコードする塩基配列（７〜３０番目の５'−ＣＴＧＧＡＡＧＴＴＣＴＧＴＴＣＣＡＧＧＧＧＣＣＧ−３'）を有する。図４にｐＴｍＦＫＰＨＣの構成を示す。すなわち、発現ベクターｐＴｍＦＫＰＨＣはｐＥＴ２１ｄに由来するＴ７プロモーターとＴ７ターミネーターを含んでいる。さらに、発現ベクターｐＴｍＦＫＰＨＣは、ｍＦＫ遺伝子の下流にＣＨ１−ＣＨ２−ＣＨ３領域をコードする遺伝子が配置されており、ｍＦＫ−ＣＨ１−ＣＨ２−ＣＨ３融合タンパク質を合成することができる。さらに、ｍＦＫは分子シャペロン活性も有することから、該融合タンパク質は大腸菌の細胞質可溶性画分へ大量合成することが可能である。さらに、ｍＦＫとＣＨ１−ＣＨ２−ＣＨ３の間にプレシジョンプロテアーゼの認識配列を１箇所含んでいるので、ｍＦＫ−ＣＨ１−ＣＨ２−ＣＨ３融合タンパク質からＣＨ１−ＣＨ２−ＣＨ３を簡単に切り出すことができる。

（実施例２）人工ポリクローナルｓｃＦｖの製造
実施例１で得られたＭＰＯ−ＫＯマウス由来ｓｃＦｖ遺伝子をＳｆｉＩ及びＮｏｔＩで切断した。次に、その２００ｎｇを同制限酵素処理及びＢＡＰ（バクテリア由来アルカリフォスファターゼ）処理が施された発現ベクターｐＴｍＦＫＰＩ（１μｇ）へＴ４ＤＮＡリガーゼによって導入した。このライゲーション反応ミックスのＤＮＡ５００μｇ相当分を３００μＬのＪＭ１０９（ＤＥ３）（クロンテック社）にエレクトロポレーション法（２．５ｋＶ，２５μＦ，２００ル，４．６８ｍｓｅｃ）によって導入した。エレクトロポレーション後、１０ｍＬのＳＯＣ培地を添加した後、１２５ｒｐｍ（往復）、３７℃にて３時間インキューベートした。本菌体懸濁液の５ｍＬを８００ｍＬの２・ＹＴ培地にて１４０ｒｐｍ（回転）、３５℃で２４時間培養した。培養終了後、遠心分離によって菌体を回収し、菌体を５０ｍＬの１・ＰＢＳ中で超音波処理によって破砕し、遠心分離によって上清を得た。

得られた上清を０．５Ｍ ＮａＣｌ−５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−塩酸緩衝液（ｐＨ７．５）で平衡化されたＨｉ−Ｔｒａｐ Ｎｉキレートカラム（アマシャムバイオサイエンス社）にアプライし、１−３００ｍＭのイミダゾールの濃度勾配によってｍＦＫ−ｓｃＦｖ融合タンパク質が含まれる画分を回収した。本画分を１ｍＭ ＥＤＴＡ、１ｍＭ ＤＴＴ、及び１５０ｍＭ ＮａＣｌを含有する５０ｍＭ トリス−塩酸緩衝液（ｐＨ７．０）へ透析した後、透析内液にプレシジョンプロテアーゼ（アマシャムバイオサイエンス社）２０μＬを加えて５℃で１６時間作用させ、ｍＦＫ−ｓｃＦｖ融合タンパク質からｓｃＦｖを切り出し、遊離させた。本切断反応液を１ｍＭ ＥＤＴＡ、１ｍＭ 酸化型グルタチオン（ＧＳＳＧ）及び、０．３ｍＭ 還元型グルタチオン（ＧＳＨ）を含むＰＢＳに透析した後、透析内液をＰｒｏｔｅｉｎＬカラム（ピアス社）にアプライし、ｓｃＦｖを結合させた後、１００ｍＭ グリシン−塩酸緩衝液（ｐＨ２．８）によってｓｃＦｖを溶出した。回収したｓｃＦｖ画分を１ｍＭ ＥＤＴＡを含むＰＢＳに透析し、４℃で保存した。

本実施例によって精製標品としてポリクローナルｓｃＦｖが２０ｍｇ／Ｌ培養液の収率で得られた。また、ｓｃＦｖ遺伝子が挿入されたｐＴｍＦＫＰＩで形質転換された大腸菌懸濁液の一部を１００μｇ／ｍＬのアンピシリンを含有するＬＢ寒天プレ−トにまき、形質転換コロニーの調べたところ、本培養に含まれるクローン数は約２．７・１０⁶であった。すなわち、本実施例で得られるｓｃＦｖの多様性レパートリーはこれに匹敵するものと考えられる。

（実施例３）人工ポリクローナルｓｃＦｖ−ＣＨ１−ＣＨ２−ＣＨ３の製造
図２に示す発現ベクターｐＴｍＦＫＰＣ１２３（１μｇ）に、実施例１で得られたＭＰＯ−ＫＯマウス由来ｓｃＦｖ遺伝子（２００ｎｇ）をＴ４ＤＮＡリガーゼによって導入し、実施例２と同様の条件でライゲーション反応ミックスの５００μｇＤＮＡ相当分をエレクトロポレーション法によって３００μＬの大腸菌ＪＭ１０９（ＤＥ３）へ導入した。エレクトロポレーション後、１０ｍＬのＳＯＣ培地を添加した後、１２５ｒｐｍ（往復）、３７℃で３時間インキューベートした。本菌体懸濁液の５ｍＬを８００ｍＬの２・ＹＴ培地にて１４０ｒｐｍ（回転）、３５℃で２４時間培養した。培養終了後、遠心分離によって菌体を回収し、菌体を５０ｍＬの１・ＰＢＳ中で超音波処理によって破砕し、遠心分離によって上清を得た。

得られた上清をＰｒｏｔｅｉｎＡカラム（アマシャムバイオサイエンス）へアプライし、ｍＦＫ−ｓｃＦｖ−ｈＦＣ１２３（ｈＦＣ１２３はＣＨ１−ＣＨ２−ＣＨ３を表す。）の融合タンパク質を結合させ、１ｍＭ ＥＤＴＡを含む５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−塩酸緩衝液（ｐＨ７．５）（緩衝液Ａ）にて充分に洗浄した後、０．１Ｍ グリシン−塩酸緩衝液（ｐＨ２．８）にて融合タンパク質を溶出した。溶出された融合タンパク質を１ｍＭ ＥＤＴＡ、１ｍＭ ＤＴＴ、及び１５０ｍＭ ＮａＣｌを含有する５０ｍＭ トリス−塩酸緩衝液（ｐＨ７．０）へ透析した後、透析内液にプレシジョンプロテアーゼ２０μＬを加えて５℃で１６時間作用させ、ｍＦＫ−ｓｃＦｖ−ｈＦＣ１２３融合タンパク質からｓｃＦｖ−ｈＦＣ１２３融合タンパク質を切り出し、遊離させた。反応終了後、反応液を１ｍＭ ＥＤＴＡ、１ｍＭ ＧＳＳＧ及び、０．３ｍＭ ＧＳＨを含むＰＢＳに透析した後、透析内液を再度ＰｒｏｔｅｉｎＡカラムにアプライし、ｓｃＦｖ−ｈＦＣ１２３を結合させた後、１００ｍＭ グリシン−塩酸緩衝液（ｐＨ２．８）によってｓｃＦｖ−ｈＦＣ１２３を溶出した。回収されたｓｃＦｖ−ｈＦＣ１２３融合タンパク質画分を１ｍＭ ＥＤＴＡを含むＰＢＳに透析し、４℃下で保存した。得られたタンパク質の構造を図５に示す。すなわち、得られたタンパク質は免疫グロブリンの軽鎖定常領域以外の全ての領域を含むヒト・マウスキメラ人工免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）である。

本実施例によって精製標品としてポリクローナルｓｃＦｖ−ｈＦＣ１２３融合タンパク質が５ｍｇ/Ｌ培養液の収率で得られた。またｓｃＦｖ遺伝子が挿入されたｐＴｍＦＫＰＣ１２３で形質転換された大腸菌懸濁液の一部を１００μｇ／ｍＬのアンピシリンを含有するＬＢ寒天プレ−トにまき、形質転換コロニーの数を調べたところ、本培養に含まれるクローン数は約１．１・１０⁶であった。すなわち、本実施例で得られるｓｃＦｖッｈＦＣ１２３タンパク質の多様性レパートリーはこれに匹敵するものと考えられる。

（実施例４）人工ポリクローナルｓｃＦｖ−ＣＨ２−ＣＨ３の製造
図３に示す発現ベクターｐＴｍＦＫＰＣ２３（１μｇ）に、実施例１で得られたＭＰＯ−ＫＯマウス由来ｓｃＦｖ遺伝子（２００ｎｇ）をＴ４ＤＮＡリガーゼによって導入し、実施例２と同様の条件でライゲーション反応ミックスの５００μｇＤＮＡ相当分をエレクトロポレーション法によって３００μＬの大腸菌ＪＭ１０９（ＤＥ３）へ導入した。本発現ベクターによる発現タンパク質の構造を図６に示す。エレクトロポレーション後、１０ｍＬのＳＯＣ培地を添加した後、１２５ｒｐｍ（往復）、３７℃で３時間インキューベートした。本菌体懸濁液の５ｍＬを８００ｍＬの２・ＹＴ培地にて１４０ｒｐｍ（回転）、３５℃で２６時間培養した。培養終了後、遠心分離によって菌体を回収し、菌体を５０ｍＬの１・ＰＢＳ中で超音波処理によって破砕し、遠心分離によって上清を得た。

得られた上清をＰｒｏｔｅｉｎＡカラムへアプライし、ｍＦＫッｓｃＦｖ−ｈＦＣ（ｈＦＣはＣＨ２−ＣＨ３を表す。）の融合タンパク質を結合させ、緩衝液Ａにて充分に洗浄した後、０．１Ｍ グリシン−塩酸緩衝液（ｐＨ２．８）にて融合タンパク質を溶出した。溶出された融合タンパク質を１ｍＭ ＥＤＴＡ、１ｍＭ ＤＴＴ、及び１５０ｍＭ ＮａＣｌを含有する５０ｍＭ トリス−塩酸緩衝液（ｐＨ７．０）へ透析した後、透析内液にプレシジョンプロテアーゼ２０μＬを加えて５℃下で１６時間作用させ、ｍＦＫッｓｃＦｖ−ｈＦＣ融合タンパク質からｓｃＦｖ−ｈＦＣ融合タンパク質を切り出し、遊離させた。反応終了後、反応液を１ｍＭ ＥＤＴＡ、１ｍＭ ＧＳＳＧ、及び０．３ｍＭ ＧＳＨを含むＰＢＳに透析した後、透析内液を再度ＰｒｏｔｅｉｎＡカラムにアプライし、ｓｃＦｖ−ｈＦＣを結合させた後、１００ｍＭ グリシン−塩酸緩衝液（ｐＨ２．８）によってｓｃＦｖ−ｈＦＣを溶出した。回収されたｓｃＦｖ−ｈＦＣ画分を１ｍＭ ＥＤＴＡを含むＰＢＳに透析し、４℃で保存した。

本実施例によって精製標品としてポリクローナルｓｃＦｖッｈＦＣが８ｍｇ/Ｌ培養液の収率で得られた。またｓｃＦｖ遺伝子が挿入されたｐＴｍＦＫＰＣ２３で形質転換された大腸菌懸濁液の一部を１００μｇ／ｍＬのアンピシリンを含有するＬＢ寒天プレ−トにまき、形質転換コロニーの数を調べたところ、本培養に含まれるクローン数は約１．６・１０⁶であった。すなわち、本実施例で得られるｓｃＦｖッｈＦＣタンパク質の多様性レパートリーはこれに匹敵するものと考えられる。

（実施例５）人工ヒト抗体重鎖定常領域ｈＦＣ１２３の製造
実施例１で作製された発現ベクターｐＴｍＦＫＰＨＣ（図４）を大腸菌ＢＬ２１ｓｔａｒ（ＤＥ３）（インビトロジェン社）へ形質転換した後、生育した１０クローンを２・ＹＴ培地８００ｍＬに接種し、３５℃、１４０ｒｐｍ（回転）で２０時間培養した。培養終了後、遠心分離によって菌体を回収し、５０ｍＬの緩衝液Ａに懸濁し、超音波処理によって菌体を破砕した。遠心分離によって上清を得、これをＰｒｏｔｅｉｎＡカラムへアプライし、ｍＦＫとｈＦＣ１２３の融合タンパク質を結合させ、緩衝液Ａにて充分に洗浄した後、０．１Ｍ グリシン−塩酸緩衝液（ｐＨ２．８）にて融合タンパク質を溶出した。溶出された融合タンパク質を１ｍＭ ＥＤＴＡ、１ｍＭ ＤＴＴ、及び１５０ｍＭ ＮａＣｌを含有する５０ｍＭ トリス−塩酸緩衝液（ｐＨ７．０）へ透析した後、透析内液にプレシジョンプロテアーゼ２０μＬを加えて５℃で１６時間作用させ、ｍＦＫ−ｈＦＣ１２３融合タンパク質からｈＦＣ１２３を切り出し、遊離させた。反応終了後、反応液を１ｍＭ ＥＤＴＡ、１ｍＭ ＧＳＳＧ、及び０．３ｍＭ ＧＳＨを含むＰＢＳに透析した後、透析内液を再度ＰｒｏｔｅｉｎＡカラムにアプライし、ｈＦＣ１２３を結合させた後、１００ｍＭ グリシン−塩酸緩衝液（ｐＨ２．８）によってｈＦＣ１２３を溶出した。回収されたｈＦＣ１２３画分は１ｍＭ ＥＤＴＡを含む５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−塩酸緩衝液（ｐＨ８．８）に透析し、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−塩酸緩衝液（ｐＨ８．８）で平衡化されたＳｕｐｅｒＱ ５ＰＷ−ＸＬカラム（東ソー社）にアプライし、ＮａＣｌ濃度勾配０−０．５Ｍで溶出した。回収されたｈＦＣ１２３画分を１ｍＭ ＥＤＴＡを含むＰＢＳに透析した。本実施例によって精製標品としてｈＦＣ１２３が２０ｍｇ/Ｌ培養液の収率で得られることがわかった。上記ｈＦＣ１２３精製標品を非還元状態でのＳＤＳ−ＰＡＧＥ、及びＴｓｋｇｅｌ Ｇ３０００カラム（東ソー社）によるゲルろ過によって、大部分が正しくダイマー形成されていることが確認できた。

（実施例６）ｓｃＦｖとｈＦＣ１２３の混合物からなる人工ポリクローナル免疫グロブリンの製造
実施例２で得られたポリクローナルｓｃＦｖと実施例５で得られたｈＦＣ１２３を等モルずつ混合し、図７に示される構成を有する人工ポリクローナル免疫グロブリンを製造した。本実施例で得られた人工ポリクローナル免疫グロブリンは、天然の免疫グロブリン、実施例３又は４で得られる人工ポリクローナル免疫グロブリンと同様の機能を有する。また本実施例ではｓｃＦｖを融合タンパク質としてではなく分子量が小さい単独のポリペプチドとして発現させるので、実施例３又は４で製造した融合タンパク質よりも大腸菌で発現させるのに好適である。

なお、上記した実施例においては免疫グロブリン可変領域の提供動物としてＭＰＯを免疫したＭＰＯ−ＫＯマウスを使用した。しかし、免疫グロブリン製剤作用機序の別の仮説、すなわち、抗ＭＰＯ抗体に限らず未知の抗原に対する抗体を含めた多種類の抗体が薬理効果を発揮しているという説に立てば、野生型のマウスを使用することにより上記した実施例と全く同様にして、人工ポリクローナル免疫グロブリンを製造することができる。

（実施例７）マウスｓｃＦｖ遺伝子の調製（ＩＩ）
マウス抗体Ｆｖ領域（ＶＬ及びＶＨ）ｃＤＮＡを、実施例１で調製されたマウス脾臓ＲＮＡより、配列番号５９〜６１に示された抗体遺伝子特異的プライマーを用いて、ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔＩＩＩ Ｆｉｒｓｔ Ｓｔｒａｎｄ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ Ｓｙｓｔｅｍ Ｋｉｔ（インビトロジェン社）によって合成した。ＶＬ遺伝子は、１００μｇのｃＤＮＡを鋳型として、１００ｐｍｏｌｅの配列番号６２〜７９で示されるフォワードプライマー、及び１００ｐｍｏｌｅの配列番号１９〜２２で示されるリバースプライマーを用いて、ＴａＫａＲａ Ｅｘ Ｔａｑ Ｈｏｔ Ｓｔａｒｔ Ｖｅｒｓｉｏｎ（タカラバイオ社）によって、９４℃で１５秒、 ５６℃で１５秒及び７２℃で９０秒の３ステップを３０回行った後、７２℃で１０分間の反応によるＨｏｔ−Ｓｔａｒｔ−ＰＣＲによって増幅した。１００μＬ容量の上記ＰＣＲを１０本行った。ＶＨ遺伝子は、配列番号２３〜４１で示されるフォワードプライマー、及び、配列番号４２〜４４で示されるリバースプライマーを用いて、ＶＬ遺伝子の場合と同様に増幅した。増幅されたＶＬ及びＶＨ遺伝子はそれぞれ、２．０％アガロースゲル電気泳動によって分離回収した。

ｓｃＦｖ遺伝子はそれぞれ１００μｇのＶＬあるいはＶＨ遺伝子を鋳型として、配列番号８０及び８１のプライマーセットを用いて、ＴａＫａＲａ Ｅｘ Ｔａｑ Ｈｏｔ Ｓｔａｒｔ Ｖｅｒｓｉｏｎ（タカラバイオ社）によるオーバーラップＰＣＲ法によって合成した。ＰＣＲ反応は、９４℃で１５秒、５６℃で３０秒及び７２℃で２分の３スッテプを２３サイクル行った後、７２℃で１０分間反応させる条件で行った。合成されたｓｃＦｖ遺伝子は１．５％アガロースゲル電気泳動によって分離回収した。１０μｇのｓｃＦｖ遺伝子を得た。得られたｓｃＦｖ遺伝子は５’末端にＡｓｉＳＩサイトを３’末端にＮｏｔＩサイトを有する。

（実施例８）封入体形成による、ポリクローナルｓｃＦｖの製造
ｐＥＴ３ｄ（ノバジェン社）のＮｃｏＩ−ＢａｍＨＩサイトに配列番号８２に示された合成遺伝子を導入し、発現ベクターｐＴ３ＤＥを作製した。ｐＴ３ＤＥの構成を図８に示す。実施例７で調製されたｓｃＦｖ遺伝子をＡｓｉＳＩ及びＮｏｔＩで切断し、その５００ｎｇをｐＴ３ＤＥ（２μｇ）のＡｓｉＳＩ−ＰｓｐＯＭＩサイトにＴ４ＤＮＡリガーゼによって導入した。リガーゼ反応ミックスの５００ｎｇＤＮＡ相当分を大腸菌ＪＭ１０９（ＤＥ３）３００μＬにエレクトロポレーション（２．５Ｋｖ，２５μＦ，２００Ω）によって導入した。形質転換された大腸菌を６ｍＬのＳＯＣにて懸濁した後、３７℃で３時間インキュベートし、その１．５ｍＬを１Ｌの、１００μｇ／ｍＬのカルベニシリンを含有する２×Ｙ．Ｔ．培地に植菌した。培養は３７℃、１２５ｒｐｍで２４時間行った。培養終了後、遠心分離によって菌体を回収した。一方、ＳＯＣに懸濁した、形質転換大腸菌の一部を１００００倍まで希釈して１００μｇ／ｍＬのアンピシリンが含有されたＬＢプレートにて生育させ、培養に投入された細胞数を計算した。この値は、発現するｓｃＦｖ遺伝子の多様性に相当する。その結果、本実施例の培養で生産されるポリクローナルｓｃＦＶの多様性は３．５×１０⁷であると見積もられた。この多様性は実施例２，３及び４のＰＰＩａｓｅ融合発現の場合より１０倍以上高いものであった。

回収された菌体を、１ｍＭ ＥＤＴＡ及び２００μＬの卵白リゾチーム（３０ｍｇ／ｍＬ）を含む５０ｍＭ トリス−塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）３０ｍＬに懸濁した後、３０℃で１時間インキュベートした。次に、超音波破砕によって細胞を破砕した。上清は遠心分離によって除去し、封入体を２％ トリトン−Ｘ１００及び２５０ｍＭ ＮａＣｌを含む５０ｍＭ トリス塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）３０ｍＬによって２回洗浄した。洗浄された封入体はｐＨ８．０の８Ｍ 尿素、１０ｍＭ β―メルカプトエタノール（β―ＭＥ）、１０ｍＭイミダゾールおよび、０．５Ｍ ＮａＣｌを含有した５０ｍＭ トリス−塩酸緩衝液（緩衝液Ａ）３０ｍＬに４℃で一昼夜インキュベートすることで溶解させた。遠心分離によって、上清を得た。このステップでのＳＤＳ−ＰＡＧＥによる分析結果を図９のレーン１に示す。レーン１の試料は可溶化した封入体画分である。すなわち、可溶化したポリクローナルｓｃＦｖに相当するバンドが約２７〜３２ｋＤａの範囲で広く検出され、製造されたポリクローナルｓｃＦｖが多様性を有していることが示された。

得られた上清は緩衝液Ａで平衡化されたニッケルキレートカラム（アマシャムバイオサイエンス社）にアプライし、アプライ終了後、緩衝液Ｂ（５０ｍＭ トリス−塩酸、８Ｍ 尿素、１０ｍＭ β−ＭＥ、及び０．５Ｍ ＮａＣｌ、ｐＨ８．０）でカラムを洗浄した。カラムに結合したＨｉｓタグを有するｓｃＦｖを、緩衝液Ｃ（５０ｍＭ トリス−塩酸、３Ｍ 尿素、５ｍＭ β―ＭＥ、及び０．５Ｍ ＮａＣｌ、ｐＨ８．０）までのグラディエントによってリフォールディングさせた。リフォールディング終了後、緩衝液Ｄ（５０ｍＭトリス−塩酸、３Ｍ 尿素、１ｍＭ ＧＳＳＧ／ＧＳＨ、０．０５％ ポリエチレングリコール４０００（ＰＥＧ４０００）、０．５Ｍ ＮａＣｌ、ｐＨ８．０）でカラムを平衡化した。さらに、緩衝液Ｅ（５０ｍＭ トリス−塩酸、０．５ｍＭ ＧＳＨ、０．０５％ ＰＥＧ４０００、０．５Ｍ ＮａＣｌ、ｐＨ８．０）までのグラディエントによってリフォールディングをさらに行った。リフォールディング終了後、緩衝液Ｆ（５０ｍＭ トリス−塩酸、５００ｍＭ イミダゾール、０．０５％ ＰＥＧ４０００、０．５Ｍ ＮａＣｌ、ｐＨ８．０）によって再構成されたポリクローナルｓｃＦｖを溶出した。このステップでのＳＤＳ−ＰＡＧＥによる分析結果を図９のレーン２及び３に示す。レーン２の試料はニッケルキレートカラムの非吸着画分、レーン３の試料はイミダゾールによる溶出画分である。すなわち、可溶性のポリクローナルｓｃＦｖが尿素の非存在下で得られた。以上より、本実施例の精製方法によって、変性したポリクローナルｓｃＦｖを正しく折り畳み直すことができた。

溶出されたポリクローナルｓｃＦｖを、０．０５％のＰＥＧ４０００、１ｍＭ ＤＴＴ、０．１５Ｍ ＮａＣｌを含むトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ７．０）に対して透析した。透析内液にプレシジョンプロテアーゼ２０μＬを添加し、ｓｃＦｖより、Ｈｉｓタグを遊離させた。反応液は１ｍＭ イミダゾール及び０．５Ｍ ＮａＣｌを含有する５０ｍＭ トリス−塩酸緩衝液（ｐＨ７．５）に対して透析された。透析内液をＧＳＴ（グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ）−ｔｒａｐ（アマシャムバイオサイエンス社）及びＨｉｓ−ｔｒａｐ（アマシャムバイオサイエンス社）の連結カラムを通過させ、通過画分を回収した。これによって、プレシジョンプロテアーゼ（ＧＳＴ融合型）、未切断のヒスタグ付きのｓｃＦｖ、及び大腸菌由来のキレート性タンパク質が除去された。回収された精製ポリクローナルｓｃＦｖを、２．５％ グルコース、０．９％ ＮａＣｌ及び０．０５％ ＰＥＧ４０００を含む生理食塩水に透析した。透析物はヒト血管炎モデルマウスへの投与まで４℃で保存された。本実施例によって１Ｌ培養当り約３０ｍｇの精製ポリクローナルｓｃＦｖが得られた。

（実施例９）ヒト血管炎モデルマウスの作出
ヒト血管炎モデルマウスを作出するために、マウスにカンジダ アルビンカンスの水溶性画分（Ｃａｎｄｉｄａ ａｌｂｉｃａｎｓ ｗａｔｅｒ−ｓｏｌｕｂｌｅ ｆｒａｃｔｉｏｎ。以下、「ＣＡＷＳ」と称する。）（Ｎ．Ｏｈｎｏ Ｊｐｎ． J． Ｉｎｆｅｃｔ． Ｄｉｓ． ５７：Ｓ９-１０， ２００４)を接種した。
日本チャールスリバー社から購入したＣ５７ＢＬ／６Ｎ系雄性マウス（３．５週齢）を、試験開始まで６日間ケージ内で予備飼育し（４週齢）、試験に供した。当該マウスを室温２１〜２６℃、湿度３０〜７０％、照明時間１２時間（７時〜１９時）の条件下、無菌区で飼育した。飼育匹数は１ケージあたり５匹とした。飼料は、固形飼料ＦＲ２（フナハシ社、１０ｋＧｙのγ線滅菌済み。）を自由摂取させた。飲水は、滅菌水道水に次亜塩素酸ソーダ液を終濃度０．１％添加したものを自由摂取させた。一方、ＣＡＷＳ（カンジダ標準株ＩＦＯ１３８５由来糖分子）をＤ−ＰＢＳ（−）（ダルベッコＰＢＳ、シグマ社。）に溶解し、２４０ｍｇ／１２ｍＬを５本（合計１２００ｍｇ）調製した。これらの試料を高圧蒸気滅菌（１２１℃、で２０分間）に供した。なお、これらの試料中にＬＰＳ（リポ多糖）は検出されなかった。次に、ＣＡＷＳ（４ｍｇ／０．２ｍＬ／マウス）をマウスの腹腔内に５日間連続で接種し、人工ポリクローナル免疫グロブリン製剤の効果確認に用いた。

（実施例１０）マウス血管炎モデルを用いた人工ポリクローナル免疫グロブリン製剤の効果
実施例５で製造したＣＨ１−ＣＨ２−ＣＨ３（ｈＦＣ１２３）を注射用生理食塩水（０．９％ ＮａＣｌ、２．５％グルコース）に対して透析した。また、実施例８で製造したポリクローナルｓｃＦｖ（ポリＦｖ）をＰＥＧ４０００を含有する注射用生理食塩水（０．９％ ＮａＣｌ、２．５％グルコース、０．０５％ ＰＥＧ４０００）に対して透析した。それぞれの透析内液を回収し、０．２２μｍメンブレンフィルターにて無菌ろ過した。

試験は、１０匹ずつの７群に分けて行った。すなわち、第１群はＣＡＷＳ接種のみ、第２群はＣＡＷＳ接種＋生理食塩水治療群、第３群はＣＡＷＳ接種＋ポリＦｖ（１７０ ｍｇ ｐｒｏｔｅｉｎ／Ｋｇ)治療群、第４群はＣＡＷＳ接種＋ｈＦＣ１２３（２５０ ｍｇ ｐｒｏｔｅｉｎ／Ｋｇ)治療群、第５群はＣＡＷＳ接種＋ポリＦｖ（１７０ ｍｇ ｐｒｏｔｅｉｎ／Ｋｇ)＋ｈＦＣ１２３（２５０ ｍｇ ｐｒｏｔｅｉｎ／Ｋｇ)治療群、第６群は生理食塩水接種＋ポリＦｖ（１７０ ｍｇ ｐｒｏｔｅｉｎ／Ｋｇ)＋ｈＦＣ１２３（２５０ ｍｇ ｐｒｏｔｅｉｎ／Ｋｇ)治療群（陰性コントロール）、第７群はＣＡＷＳ接種＋市販の免疫グロブリン製剤（献血グロベニン−Ｉ−ニチヤク）（１７０ ｍｇ ｐｒｏｔｅｉｎ／Ｋｇ)治療群（陽性コントロール）、とした。なお、治療は接種３日目から行い、静注により５日間投与した。組換えグロブリン製剤、及び、コントロールサンプルについては、ＣＡＷＳ投与６時間後にも静脈注射した。なお、投与量は接種初日におけるマウスの体重を基準として算出した。また、静注はシリンジポンプ（ハーバード社。ＭＯＤＥＬ１１）を用い、８分／マウスの速度で尾静脈内に注入した。免疫グロブリンの注射量は、上記のとおり１７０〜５００ｍｇ ｐｒｏｔｅｉｎ／Ｋｇに揃えた。マウスの観察は、接種初日から７日間、生死の確認及び臨床症状について行った。

接種終了後２７日目に、炭酸ガス麻酔下（ドライアイス２ｋｇ程度）でマウスの心臓から全採血（ヘパリン処理）を行った。次に、マウスを開腹し、脾臓を摘出した後、身体ごと（心臓に割りを入れる）１０％中性緩衝ホルマリン液（和光純薬社、品番：０６０−０１６６７）に入れ、固定化した。脾臓は、重量測定後、別にホルマリン固定した。固定化した試料について、Ｈｅｍａｔｏｘｙｌｉｎ−Ｅｏｓｉｎ染色による組織化学的観察を行った。

各群の血管炎治療効果を、組織化学的観察により評価した。結果を図１０に示す。図１０の横軸は左から順に第1群〜第7群で、縦軸は治療効果が認められた割合（％）である。まず、第１群（ＣＡＷＳ単独投与）では、約９０％のマウスで血管炎を発症した。また、第２群（ＣＡＷＳ接種＋生理食塩水治療群）では全く血管炎抑制効果が見られず、生理食塩水では治療効果がないことが確認された。これに対し、第３群（ＣＡＷＳ接種＋ポリＦｖ）では血管炎の抑制効果がかなり認められ、ポリＦｖが血管炎の治療効果を有することが確認された。

第４群（ＣＡＷＳ接種＋ｈＦＣ１２３）では、血管炎の抑制効果はごく僅かしか認められず、ｈＦＣ１２３では血管炎の治療効果はほとんど確認されなかった。これに対し、第５群（ＣＡＷＳ接種＋ポリＦｖ＋ｈＦＣ１２３）では血管炎の抑制効果がかなり認められ、ポリＦｖが血管炎の治療効果を有することが確認された。

なお、陰性コントロールである第６群（生理食塩水接種＋ポリＦｖ＋ｈＦＣ１２３）では、ポリＦｖ＋ｈＦＣ１２３の投与の影響はなかった。さらに、陽性コントロールである第７群（ＣＡＷＳ接種＋市販の免疫グロブリン製剤）では、血管炎の抑制効果が認められた。以上より、ポリＦｖ、及び、（ポリＦｖ＋ｈＦＣ１２３）からなる人工ポリクローナル免疫グロブリンは、血液製剤の免疫グロブリン製剤と同様の作用を有していた。これにより、高い安全性を有する免疫グロブリン製剤が提供された。

発現ベクターｐＴｍＦＫＰＩの構成を表す図である。 発現ベクターｐＴｍＦＫＰＣ１２３の構成を表す図である。 発現ベクターｐＴｍＦＫＰＣ２３の構成を表す図である。 発現ベクターｐＴｍＦＫＰＣの構成を表す図である。 実施例３で製造されたポリクローナル免疫グロブリンｓｃＦｖ−ＣＨ１−ＣＨ２−ＣＨ３の分子構造を表す図である。 実施例４で製造されたポリクローナル免疫グロブリンｓｃＦｖ−ＣＨ２−ＣＨ３の分子構造を表す図である。 実施例５で製造されたポリクローナル免疫グロブリンの構成物であるｓｃＦｖとＣＨ１−ＣＨ２−ＣＨ３の分子構造を表す図である。 発現ベクターｐＴ３ＤＥの構成を表す図である。 実施例８で行なったＳＤＳ−ＰＡＧＥの結果を表すゲルの写真である。 実施例１０で人工ポリクローナル免疫グロブリン製剤の治療効果を確認した結果を表すグラフである。

Claims (18)

1. 下記工程、
   （１）免疫グロブリンを発現している組織又は細胞に由来するｃＤＮＡから、互いに異なる免疫グロブリン可変領域を含むポリペプチドをコードする複数種の遺伝子を単離し、該遺伝子の混合物を調製する工程、
   （２）該遺伝子の混合物をベクターに接触させ、互いに異なる遺伝子が挿入された複数種の組換えベクターを調製し、該組換えベクターの混合物を調製する工程、
   （３）該組換えベクターの混合物を宿主細胞に接触させ、互いに異なる組換えベクターが導入された複数種の組換え体を調製し、該組換え体の混合物を調製する工程、
   （４）該組換え体の混合物を混合培養し、該培養物から、互いに異なる複数種の免疫グロブリン可変領域を含むポリペプチドの混合物を採取する工程、
   を含むことを特徴とする人工ポリクローナル免疫グロブリンの製造方法。
2. 前記ポリペプチドが、ｓｃＦｖであることを特徴とする請求項１に記載の人工ポリクローナル免疫グロブリンの製造方法。
3. 前記ポリペプチドが、ｓｃＦｖとＣＨ１−ＣＨ２−ＣＨ３領域の全部又は一部との融合タンパク質であることを特徴とする請求項１に記載の人工ポリクローナル免疫グロブリンの製造方法。
4. 前記ポリペプチドが、ｓｃＦｖとＣＨ２−ＣＨ３領域との融合タンパク質であることを特徴とする請求項１に記載の人工ポリクローナル免疫グロブリンの製造方法。
5. 前記組換え体が大腸菌であることを特徴とする請求項１乃至４のいずれかに記載の人工ポリクローナル免疫グロブリンの製造方法。
6. 前記組織又は細胞が哺乳動物由来のものであることを特徴とする請求項１乃至５のいずれかに記載の人工ポリクローナル免疫グロブリンの製造方法。
7. 前記ポリペプチドが、折り畳み因子と該ポリペプチドとの融合タンパク質の一部として発現され、該融合タンパク質から単離されることを特徴とする請求項１乃至６のいずれかに記載の人工ポリクローナル免疫グロブリンの製造方法。
8. 前記哺乳動物が、ミエロペルオキシダーゼ欠損マウスであることを特徴とする請求項６に記載の人工ポリクローナル免疫グロブリンの製造方法。
9. 前記折り畳み因子が、ペプチジルプロリルシストランスイソメラーゼであることを特徴とする請求項７に記載の人工ポリクローナル免疫グロブリンの製造方法。
10. 前記ペプチジルプロリルシストランスイソメラーゼが、ＦＫ５０６結合性タンパク質であることを特徴とする請求項９に記載の人工ポリクローナル免疫グロブリンの製造方法。
11. 前記ＦＫ５０６結合性タンパク質が古細菌由来のものであることを特徴とする請求項１０に記載の人工ポリクローナル免疫グロブリンの製造方法。
12. 請求項１乃至１１のいずれかに記載の人工ポリクローナル免疫グロブリンの製造方法によって製造された人工ポリクローナル免疫グロブリンと、ＣＨ１−ＣＨ２−ＣＨ３領域の全部又は一部を含むポリペプチドとを混合することを特徴とする人工ポリクローナル免疫グロブリンの製造方法。
13. 前記ＣＨ１−ＣＨ２−ＣＨ３領域の全部又は一部を含むポリペプチドが、該ポリペプチドをコードする遺伝子を含有する組換え体の培養物から採取されたものであることを特徴とする請求項１２に記載の人工ポリクローナル免疫グロブリンの製造方法。
14. 前記ＣＨ１−ＣＨ２−ＣＨ３領域の全部又は一部を含むポリペプチドが、折り畳み因子と該ポリペプチドとの融合タンパク質の一部として発現され、該融合タンパク質から単離されることを特徴とする請求項１２又は１３に記載の人工ポリクローナル免疫グロブリンの製造方法。
15. 前記組換え体が大腸菌であることを特徴とする請求項１３に記載の人工ポリクローナル免疫グロブリンの製造方法。
16. 前記折り畳み因子が、ペプチジルプロリルシストランスイソメラーゼであることを特徴とする請求項１４に記載の人工ポリクローナル免疫グロブリンの製造方法。
17. 前記ペプチジルプロリルシストランスイソメラーゼが、ＦＫ５０６結合性タンパク質であることを特徴とする請求項１６に記載の人工ポリクローナル免疫グロブリンの製造方法。
18. 前記ＦＫ５０６結合性タンパク質が古細菌由来のものであることを特徴とする請求項１７に記載の人工ポリクローナル免疫グロブリンの製造方法。