JP2005274514A - 液体分画装置 - Google Patents

Abstract

【課題】
プローブ先端部に形成される液滴のサンプルプレート方向への高さを一定にして、確実にサンプルプレートに液滴を移動させることの可能な液体分画装置を提供する。
【解決手段】
Ｊ２は第２の移動相を送液する配管１７とプローブ１とを合流させる３方ジョイントである。配管１７は第２の移動相を供給する送液機構として、流路切換えバルブ５４、送液ポンプ５０、ミキサ５６、開閉バルブ５７を備えている。この送液機構は、流路切換えバルブ５４により流路を切り換えながら、Ａ液とＢ液を送液ポンプ５０により吸入してミキサ５６に送って混合し、それらの溶液を移動相として分析流路に供給するグラジエント方式の送液機構である。ミキサ５６で混合されるＡ液とＢ液の溶液の混合比は、ミキサ５２で混合されるＡ液とＢ液の溶液の混合比の逆となるように調整される。
【選択図】 図１

Description

本発明は、高速液体クロマトグラフなどの分析装置に関し、特にそれらの分析装置に用いる試料又は移動相などの液体をサンプルプレートに滴下させる装置に関する。

従来、液体クロマトグラフの分離カラムで分離した試料成分の溶出液を例えばＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ（マトリックス支援レーザ脱離イオン化法飛行時間型質量分析）用のサンプルプレートなどに自動的に滴下して分画捕集を行なう場合、分離カラムからの溶出液を配管の出口（プローブという）の先端部に送り、プローブ先端部で規定した液滴量が形成されるまで一定時間待ってからサンプルプレートにその液滴を移動させる。
液滴をサンプルプレートに移動させる手段として、サンプルプレートを固定したステージ、又はプローブ自体を上下動させて液滴とサンプルプレートを接触させて液滴をサンプルプレートに移動させる方法や、エアーをプローブ先端部から噴出させて液滴をサンプルプレートに吹き付ける方法などがある。

通常、高速液体クロマトグラフを用いてタンパク質の分析を行なう場合、移動相として水とアセトニトリルの溶液をグラジエント方式の送液機構により組成を変化させながら送液している。このグラジエント分析では、移動相の組成が水成分を多く含んだ水リッチな状態からアセトニトリルを多く含んだアセトニトリルリッチな状態へと遷移していく。
液滴をプローブ先端部に形成し、その液滴が一定の大きさになったときにプローブ又はサンプルプレートを上下動させて液滴とサンプルプレートを接触させて液滴を移動させる装置では、分画開始直後と分画終了直前では液滴中の成分が異なり、分画開始直後は水成分が多く含まれ、分画終了直前ではアセトニトリルが多く含まれるというように、プローブの先端部に形成される液滴の組成が変化する結果、均一な大きさの液滴が形成されない。

その原因の１つとして液滴の組成変化に伴なう表面張力の変化が挙げられる。
また、プローブ先端部において分離カラムからの溶出液にマトリックス液を添加して先端部より分画する場合、プローブ部のマトリックス添加管の材質として、液滴がマトリックス添加管を這い上がってこないようにテフロン（登録商標）などの疎水性物質を用いており、分画開始直後は液滴が水成分を多く含んでいるためにマトリックス添加管の内径側に液滴が形成されるが、分画終了直前の液滴にはアセトニトリルが多く含まれるためにマトリックス添加管の外径側にまで液滴が形成されることも挙げられる。液滴の体積が一定であれば、分画開始直後と分画終了直前とではプローブ先端部に形成される液滴の外形が異なったものとなる。その結果、プローブ先端部に形成される液滴のサンプルプレート方向への高さが異なるために、プローブ先端とサンプルプレートとの距離を一定に保つセンサを備えていても、特に液滴量が微量である場合には液滴がサンプルプレートと接触せず、液滴をサンプルプレートに移動させることができないことがある。

そこで本発明は、プローブ先端部に形成される液滴のサンプルプレート方向への高さを一定にして、確実にサンプルプレートに液滴を移動させることの可能な液体分画装置を提供することを目的とする。

本発明は、移動相をその組成を変化させながら送液する送液機構と、分離カラムからの溶出液を先端部より滴下するプローブとを備えた液体分画装置であって、プローブは送液機構により送液される移動相とは別の第２の移動相を先端部に送る流路を備え、第２の移動相は送液機構により送液される移動相の組成をプローブ先端部において一定の組成に近づける組成をもったものであることを特徴とするものである。

プローブは、２以上の流路が形成された多重管構造とすることができる。
その場合、プローブは３重菅構造であり、最内側を分離カラムからの溶出液が流れ、その外側をマトリックス支援レーザ脱離イオン化法による質量分析計で分析を行なうための試料作成用のマトリックス化合物の溶液であるマトリックス液が流れ、最外側を第２の移動相が流れるようになっているか、又は最内側を分離カラムからの溶出液が流れ、その外側を第２の移動相が流れ、最外側をマトリックス液が流れるようになっているのが好ましい。

プローブの先端部に形成される液滴中の移動相組成を一定にする第２の移動相をプローブ先端部に送る流路をプローブに備えたので、移動相の組成が変化してもプローブ先端では液滴の組成が一定に保たれるので、液滴の外形の変化を抑制することができ、安定した分画動作を行なうことが可能となる。

マトリックス液を添加する場合、通常、マトリックス液は水：アセトニトリル＝１：１を溶媒とし、それにマトリックス化合物を溶解させた飽和溶液である。プローブ先端部において、分離カラムからの溶出液にマトリックス液を添加して先端部より分画する場合、分画開始直後の移動相組成は水成分を多く含んだ状態であるため、マトリックス液と混合されることで飽和マトリックス溶液中のマトリックスがプローブ先端に析出し、安定な分画動作の阻害となり、また、マトリックス中への測定対象成分の浸入によるキャリーオーバーが問題となる。
しかし、本発明によれば、プローブ先端部に形成される液滴中の移動相組成が一定に保たれるので、プローブ先端部でのマトリックスの析出を防止する効果もある。

以下に一実施例を説明する。図１は本発明を適用した分画装置の構成を高速液体クロマトグラフとともに概略的に示す図である。
分析流路に移動相を供給する送液機構として、流路切換えバルブ５１、送液ポンプ４８、ミキサ５２、開閉バルブ５３を備えている。この送液機構は、流路切換えバルブ５１により流路を切り換えながら、Ａ液とＢ液を送液ポンプ４８により吸入してミキサ５２に送って混合し、それらの溶液を移動相として分析流路に供給するグラジエント方式の送液機構である。Ａ液、Ｂ液は例えば水とアセトニトリルであり、ミキサ５２で混合される溶液の組成は時間的に変化しながら分析流路に送液される。

分析流路としてはキャピラリ２を用いており、キャピラリ２に移動相の流れに沿って、インジェクションポート４６、分離カラム４４、検出器４２が設けられている。キャピラリ２はプローブ１の先端部まで接続されている。
試料はインジェクションポート４６に注入されると分離カラム４４で分離されて溶出し、その溶出液は検出器４２で検出された後、プローブ１の先端部までキャピラリ２を通って流れてサンプルプレートに滴下される。

この実施例において、プローブ１は上下方向と水平方向に移動が可能であり、図示していないが、側方にサンプルプレートとプローブ１の先端との距離を検出するセンサを備えている。サンプルプレートに液体を分画する際は、プローブ１の先端に形成された液滴が所定の大きさとなったときにプローブ１が移動してサンプルプレートの所定の位置に接近し、液滴とサンプルプレートを接触させて液滴をサンプルプレート上に移動させる。

Ｊ１はマトリックス液を送液する配管１６とプローブ１とを合流させる３方ジョイントである。配管１６はポンプ４９を備え、マトリックス液をプローブ１に供給する。

Ｊ２は第２の移動相を送液する配管１７とプローブ１とを合流させる３方ジョイントである。配管１７は第２の移動相を供給する送液機構として、流路切換えバルブ５４、送液ポンプ５０、ミキサ５６、開閉バルブ５７を備えている。この送液機構は、流路切換えバルブ５４により流路を切り換えながら、Ａ液とＢ液を送液ポンプ５０により吸入してミキサ５６に送って混合し、それらの溶液を移動相として分析流路に供給するグラジエント方式の送液機構である。ミキサ５６で混合されるＡ液とＢ液の溶液の混合比は、ミキサ５２で混合されるＡ液とＢ液の溶液の混合比の逆となるように調整される。

図示されていないが、プローブ１の先端部は３重菅構造となっており、分離カラム４４からの溶出液と、３方ジョイントＪ１で合流したマトリックス液、及び３方ジョイントＪ２で合流した第２の移動相はプローブ１の先端で混合されて液滴となり、サンプルプレートに滴下される。

図２にポンプ４８によって送液される移動相（第１の移動相）と第２の移動相の組成の時間的変化を示す。（Ａ）は第１の移動相の組成の時間的変化を示す図であり、（Ｂ）は第２の移動相の組成の時間的変化を示す図である。
図２（Ａ）に示されるように、第１の移動相は分画開始直後はＡ液（水）の溶液中に占める割合がほとんどであるが、Ｂ液の割合は時間とともに直線的に増加していく。それに対し、（Ｂ）に示されるように、第２の移動相は分画開始直後はＢ液（アセトニトリル）の溶液中に占める割合がほとんどであるが、Ａ液の割合は時間とともに直線的に増加していく。
第２の移動相は、第１の移動相と第２の移動相の混合液の組成が常時、Ａ液：Ｂ液＝１：１となるようにその組成が調節されている。
例えば、分画開始後ある時間が経過したときに第１の移動相の組成がＡ液９０％、Ｂ液１０％であったとすると、第２の移動相の組成はＡ液１０％、Ｂ液９０％となるように調節されている。したがって、プローブ１先端部において混合された溶出液と第２の移動相中の水とアセトニトリルの混合比は、水：アセトニトリル＝１：１となる。

以下にこの実施例のプローブ１を図３を参照してさらに詳細に説明する。図３はこの実施例のプローブ部の構造を詳細に示す断面図である。
上流側の第１のＴ型３方ジョイントＪ１の直交しないジョイントａ,ｂの２つを高速液体クロマトグラフからの溶出液が送液される一番細いキャピラリ２が横断する。上流側のジョイントａはメイルナットなどの配管部品１０ａを用いて密封するが、その際必要に応じてスリーブ１２などを用いる。

Ｔ型３方ジョイントＪ１の直交するジョイントｃにはマトリックス液が送液される配管１６が接続され、メイルナットなどの配管部品１０ｃで密封する。一番細いキャピラリ２が出ているジョイントｂには、キャピラリ４をかぶせてメイルナットなどの配管部品１０ｂを用いて密封するが、その際必要に応じてスリーブ２２などを用いる。

下流側のＴ型３方ジョイントＪ２には、上流側のジョイントａからキャピラリ２,４が挿入され、メイルナットなどの配管部品２０ａを用いて密封するが、その際必要に応じてスリーブ３２などを用いる。キャピラリ２,４と直交するジョイントｃには第２の移動相を供給する管１７が接続され、メイルナットなどの配管部品２０ｃで密封する。最も下流側のジョイントｂには、配管８をかぶせてメイルナットなどの配管部品２０ｂを用いて密封する。

プローブ１の先端部はキャピラリ２，４及び配管８により３重菅構造となっており、最内側の流路を液体クロマトグラフからの溶出液が流れ、その外側の流路をマトリックス液が流れ、最外側の流路を第２の移動相が流れる。これらの液体はプローブ１の先端で混合されて液滴となり、所定の液滴量となったところでサンプルプレートに滴下される。

図４、図５はプローブ１の先端部における液体分画時の様子を示した図であり、図４は第２の移動相を添加しない従来の場合を示し、図５は第２の移動相を添加した場合を示している。また、（Ａ）はそれぞれ分画開始直後を示しており、（Ｂ）はそれぞれ分画終了直前を示している。
図４に示されるように、溶出液中の移動相成分の組成を調整する第２の移動相を添加しない場合では、（Ａ）分画開始時と（Ｂ）分画終了時とでプローブ１先端部に形成される液滴の組成が変化し液滴の外形が変化してしまうため、サンプルプレート方向（垂直方向）への高さが変化してしまい、液滴を確実にサンプルプレートに移動させることができないことがある。また、マトリックス液が水：アセトニトリル＝１：１の飽和溶液である場合、分画開始直後の移動相組成は水成分を多く含んだ状態であるため、マトリックス液と混合されることで飽和マトリックス溶液中のマトリックスがプローブ先端に析出し、安定な分画動作の阻害となる。

図５に示されるように、溶出液中の移動相成分の組成を調整する第２の移動相を添加すると、プローブ１の先端に形成される液滴中の移動相成分の組成は常時一定となるので、（Ａ）分画開始時でも（Ｂ）分画終了時でもプローブ１先端に形成される液滴の外形は同様のものとなり、安定した分画動作を行なうことができるようになる。また、液滴中の移動相成分の組成が常時、水：アセトニトリル＝１：１となるので、プローブ１先端で溶出液がマトリックス液と混合されてもマトリックスが析出することがない。

ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ分析において、分画される液滴量は微量である上に一定であることが前提であるため、前述のように液滴内の移動相の組成が変化するとプローブ先端に形成される液滴の形状が変化してしまう。分画開始直後のプローブ先端と液滴先端との距離は大きくなり、分画終了直前にはその距離は小さくなってしまうので、特に分画の液滴設定量が小さい場合にはその距離の差は顕著になり、予め設定したプローブとプレートの間の距離では、液滴をプレートに移動させることができないことがある。
本発明は、プローブ先端に形成される液滴内の移動相組成を一定にするようにしたので、プローブ先端に形成される液滴の大きさ（高さ）を一定にすることができ、安定した分画動作を行なうことができる。

実施例では低圧グラジエント方式の移動相送液を例にしているが、高圧グラジエント方式でもよい。また、実施例の分画装置はプローブ１が垂直方向又は水平方向に移動して分画動作を行なう方式のものであるが、サンプルプレートを固定する台が移動して分画動作を行なう方式のものであってもよい。
本発明は、プローブが２重管又は４重管以上の構造を持つものに対しても適用させることができ、例えばアセトンなどの洗浄液が流れる流路を有したものであってもよい。また、この実施例では最内側の流路を液体クロマトグラフからの溶出液が流れ、その外側の流路をマトリックス液が流れ、最外側の流路を第２の移動相が流れる構造としたが、最内側を分離カラムからの溶出液が流れ、その外側を第２の移動相が流れ、最外側をマトリックス液が流れる構造であってもよい。

本発明を適用した分画装置の構成を高速液体クロマトグラフとともに概略的に示す図である。 第１の移動相と第２の移動相の組成の時間的変化を示し、（Ａ）は第１の移動相の組成の時間的変化を示す図であり、（Ｂ）は第２の移動相の組成の時間的変化を示す図である。 同実施例のプローブ部の構造を詳細に示す断面図である。 第２の移動相を送液しない場合の液体分画時のプローブ先端部の様子を示す図であり、（Ａ）は分画開始直後、（Ｂ）は分画終了直前の様子をそれぞれ示す図である。 第２の移動相を送液した場合の液体分画時のプローブ先端部の様子を示す図であり、（Ａ）は分画開始直後、（Ｂ）は分画終了直前の様子をそれぞれ示す図である。

符号の説明

１ プローブ
２,４ キャピラリ
８ 配管
１０ａ,１０ｂ,１０ｃ,２０ａ,２０ｂ,２０ｃ,３０ａ,３０ｂ,３０ｃ 配管部品
１２,２２,３２ スリーブ
１６ マトリックス供給管
１８ 第２の移動相供給管
４２ 検出器
４４ カラム
４６ インジェクションポート
４８,４９、５０ ポンプ
５１、５４ 流路切換えバルブ
５２、５６ ミキサ
５３、５７ ストップバルブ
Ｓ サンプルプレート
Ｊ１,Ｊ２ Ｔ型３方ジョイント

Claims (4)

1. 移動相をその組成を変化させながら送液する送液機構と、分離カラムからの溶出液を先端部より滴下するプローブとを備えた液体分画装置において、
   前記プローブは前記送液機構により送液される移動相とは別の第２の移動相を先端部に送る流路を備え、
   前記第２の移動相は前記送液機構により送液される移動相の組成を前記プローブ先端部において一定の組成に近づける組成をもったものであることを特徴とする液体分画装置。
2. 前記プローブは、２以上の流路が形成された多重管構造である請求項１に記載の液体分画装置。
3. 前記プローブは３重菅構造であり、最内側を分離カラムからの溶出液が流れ、その外側をマトリックス支援レーザ脱離イオン化法による質量分析計で分析を行なうための試料作成用のマトリックス化合物の溶液であるマトリックス液が流れ、最外側を第２の移動相が流れるようになっている請求項１又は２に記載の液体分画装置。
4. 前記プローブは３重菅構造であり、最内側を分離カラムからの溶出液が流れ、その外側を第２の移動相が流れ、最外側をマトリックス支援レーザ脱離イオン化法による質量分析計で分析を行なうための試料作成用のマトリックス化合物の溶液であるマトリックス液が流れるようになっている請求項１又は２に記載の液体分画装置。
   

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