JP2005214728A - 蛍光検出装置、濃淡情報補正方法、濃淡情報補正プログラムおよび走査型共焦点レーザ顕微鏡 - Google Patents

Abstract

【課題】 試料を染色している蛍光色素の褪色による濃淡情報（輝度情報）の劣化を補正することが可能な蛍光検出装置、濃淡情報補正方法、濃淡情報補正プログラムおよび走査型共焦点レーザ顕微鏡を提供すること。
【解決手段】 試料に対してレーザビームを２次元走査して任意の波長域の濃淡情報を取得する濃淡情報取得手段と、上記濃淡情報取得手段を用い第１の２次元走査によって取得した第１の濃淡情報と、上記濃淡情報取得手段を用い上記第１の２次元走査と同一波長域での第２の２次元走査によって取得した第２の濃淡情報と、波長域毎に予め定められた色素に固有の色素固有濃淡情報とに基づいて、褪色量を算出する褪色量算出手段と、上記褪色量算出手段によって算出した褪色量に基づいて、上記濃淡情報取得手段によって取得した濃淡情報を補正する濃淡情報補正手段とを備えたことを特徴とする。
【選択図】 図１

Description

本発明は、点光源であるレーザビームで試料を２次元走査して得られた輝度情報等の濃淡情報から試料画像を形成する走査型共焦点レーザ顕微鏡等の蛍光検出装置ならびに該蛍光検出装置を用いた濃淡情報補正方法および該蛍光検出装置上で動作する濃淡情報補正プログラムに関し、特に、試料を染色している蛍光色素の褪色による濃淡情報の劣化を補正する蛍光検出装置ならびに該蛍光検出装置を用いた濃淡情報補正方法および該蛍光検出装置上で動作する濃淡情報補正プログラムに関する。

従来、生物試料を蛍光観察する場合、一般的に以下のような手順で行われている。
まず、観察対象である試料を蛍光指示薬で染色する。次に、励起光（レーザビーム）を蛍光染色した試料に照射し、試料からの蛍光を走査型共焦点レーザ顕微鏡等の蛍光検出装置により検出する。そして、検出した蛍光の二次元の輝度情報を画像化し、ディスプレイ装置などに輝度の二次元分布として表示することにより試料の蛍光像を観察する。

このような観察において問題となるのは、レーザビームを試料に照射することによる蛍光指示薬の褪色である。
このような褪色は、レーザビームが試料に照射されていることにより起こるので、試料に照射するレーザビームの照射時間を短くすることにより、褪色を引き起こしにくくしている走査型共焦点レーザ顕微鏡の技術が開示されている（例えば、特許文献１参照。）。
特開平５−１７３０７７号公報

しかしながら、上述のような走査型共焦点レーザ顕微鏡を用いて照射される時間を短くしたとしても蛍光指示薬の褪色は発生するため、長時間に渡る試料の観察では、褪色の影響が発生してしまうという問題点がある。
本発明は、上記従来技術の欠点に鑑みてなされたもので、試料を染色している蛍光色素の褪色による濃淡情報（輝度情報）の劣化を補正することが可能な蛍光検出装置、濃淡情報補正方法、濃淡情報補正プログラムおよび走査型共焦点レーザ顕微鏡を提供することを目的とする。

本発明は、上記課題を解決するため、下記のような構成を採用した。
すなわち、本発明の一態様によれば、本発明の蛍光検出装置は、試料をレーザビームで２次元走査して得られる濃淡情報から試料画像を形成する蛍光検出装置であって、上記試料に対してレーザビームを２次元走査して任意の波長域の濃淡情報を取得する濃淡情報取得手段と、上記濃淡情報取得手段を用い第１の２次元走査によって取得した第１の濃淡情報と、上記濃淡情報取得手段を用い上記第１の２次元走査と同一波長域での第２の２次元走査によって取得した第２の濃淡情報と、波長域毎に予め定められた色素に固有の色素固有濃淡情報とに基づいて、褪色量を算出する褪色量算出手段と、上記褪色量算出手段によって算出した褪色量に基づいて、上記濃淡情報取得手段によって取得した濃淡情報を補正する濃淡情報補正手段とを備えたことを特徴とする。

また、本発明の蛍光検出装置は、上記濃淡情報補正手段によって補正する対象である濃淡情報が取得された試料が、上記第１の２次元走査および上記第２の２次元走査を行う試料と同一であることが望ましい。
また、本発明の蛍光検出装置は、上記褪色量算出手段が、上記第１の濃淡情報と上記第２の濃淡情報との差に、上記任意の波長域における色素固有濃淡情報に対する上記濃淡情報補正手段によって補正する対象である濃淡情報の比を乗じることにより、波長域毎の上記褪色量を算出し、上記濃淡情報補正手段が、上記濃淡情報補正手段によって補正する対象である濃淡情報に上記波長域毎の褪色量を加算することにより補正することが望ましい。

また、本発明の蛍光検出装置は、上記第１の２次元走査を行う試料と上記第２の２次元走査を行う試料とが同一であり、上記濃淡情報補正手段によって補正する対象である濃淡情報が取得された試料が、上記第１の２次元走査および上記第２の２次元走査を行う試料と異なることが望ましい。

また、本発明の蛍光検出装置は、上記第１の２次元走査と上記第２の２次元走査とが、所定の時間間隔で行うことが望ましい。
また、本発明の蛍光検出装置は、上記褪色量算出手段が、上記第１の濃淡情報と上記第２の濃淡情報との差に、上記任意の波長域における色素固有濃淡情報に対する上記濃淡情報補正手段によって補正する対象である濃淡情報の比を乗じることにより、波長域毎の上記褪色量を算出し、上記濃淡情報補正手段が、上記濃淡情報補正手段によって補正する対象である濃淡情報に上記波長域毎の褪色量を加算することにより補正することが望ましい。

また、本発明の一態様によれば、本発明の走査型共焦点レーザ顕微鏡は、蛍光染色した試料をレーザビームで２次元走査して得られる輝度情報から試料画像を形成する走査型共焦点レーザ顕微鏡であって、上記試料に対してレーザビームを２次元走査して任意の波長域の輝度情報を取得する輝度情報取得手段と、上記輝度情報取得手段を用い第１の２次元走査によって取得した第１の輝度情報と、上記輝度情報取得手段を用い上記第１の２次元走査と同一の試料に対して同一波長域での第２の２次元走査によって取得した第２の輝度情報との差に、上記任意の波長域における波長域毎に予め定められた色素に固有の色素固有輝度情報に対する上記輝度情報補正手段によって補正する対象である輝度情報の比を乗じることにより、波長域毎の褪色量を算出する褪色量算出手段と、上記輝度情報補正手段によって補正する対象である輝度情報に上記波長域毎の褪色量を加算することにより、上記輝度情報取得手段によって取得した輝度情報を補正する輝度情報補正手段とを備えたことを特徴とする。

また、本発明の一態様によれば、本発明の走査型共焦点レーザ顕微鏡は、蛍光染色した試料をレーザビームで２次元走査して得られる輝度情報から試料画像を形成する走査型共焦点レーザ顕微鏡であって、上記試料に対してレーザビームを２次元走査して任意の波長域の輝度情報を取得する輝度情報取得手段と、上記輝度情報取得手段を用い第１の２次元走査によって取得した第１の輝度情報と、上記輝度情報取得手段を用い上記第１の２次元走査と同一の試料に対して同一波長域で上記第１の２次元走査と所定の時間間隔で行われた第２の２次元走査によって取得した第２の輝度情報との差に、上記任意の波長域における波長域毎に予め定められた色素に固有の色素固有輝度情報に対する上記輝度情報補正手段によって補正する対象である輝度情報の比を乗じることにより、波長域毎の褪色量を算出する褪色量算出手段と、上記輝度情報補正手段によって補正する対象である輝度情報に上記波長域毎の褪色量を加算することにより、上記輝度情報取得手段によって取得した上記第１の２次元走査および上記第２の２次元走査を行う試料とは異なる試料の輝度情報を補正する輝度情報補正手段とを備えたことを特徴とする。

また、本発明の一態様によれば、本発明の濃淡情報補正方法は、試料をレーザビームで２次元走査して得られる濃淡情報から試料画像を形成するコンピュータが実行する濃淡情報補正方法であって、上記試料に対してレーザビームを２次元走査して任意の波長域の濃淡情報を取得し、第１の２次元走査によって取得した第１の濃淡情報と、上記第１の２次元走査と同一波長域での第２の２次元走査によって取得した第２の濃淡情報と、波長域毎に予め定められた色素に固有の色素固有濃淡情報とに基づいて、褪色量を算出し、上記算出した褪色量に基づいて、上記取得した濃淡情報を補正することを特徴とする。

また、本発明の一態様によれば、本発明の濃淡情報補正プログラムは、試料をレーザビームで２次元走査して得られる濃淡情報から試料画像を形成するコンピュータに対して、上記試料に対してレーザビームを２次元走査して任意の波長域の濃淡情報を取得する手順と、上記濃淡情報を取得する手順での第１の２次元走査によって取得した第１の濃淡情報と、上記濃淡情報を取得する手順での第１の２次元走査と同一波長域での第２の２次元走査によって取得した第２の濃淡情報と、波長域毎に予め定められた色素に固有の色素固有濃淡情報とに基づいて、褪色量を算出する手順と、上記褪色量を算出する手順によって算出した褪色量に基づいて、上記濃淡情報を取得する手順によって取得した濃淡情報を補正する手順とを実行させるための濃淡情報補正プログラムである。

本発明によれば、ハードウェア構成を変更する必要がないので、安価に、試料を染色している蛍光色素の褪色による濃淡情報の劣化を補正することができ、レーザビームの照射量に関係なく、観察した試料の画像を正確に形成することができる。

以下、図面を参照しながら本発明の実施の形態について述べる。
図１は、本発明を適用した蛍光検出装置の機能ブロック図である。
図１において、蛍光検出装置１００は、蛍光染色した試料をレーザビームで２次元走査することにより輝度情報等の濃淡情報を得て、その濃淡情報から試料画像を形成する走査型共焦点レーザ顕微鏡等であり、濃淡情報取得手段１０１、褪色量算出手段１０４および濃淡情報補正手段１０５を備える。

濃淡情報取得手段１０１は、試料に対してレーザビームを２次元走査して任意の波長域の濃淡情報を取得して、濃淡情報格納手段１０２に順次格納する。
褪色量算出手段１０４は、上記濃淡情報取得手段１０１を用い第１の２次元走査によって取得し濃淡情報格納手段１０２に格納した第１の濃淡情報と、上記濃淡情報取得手段１０１を用い上記第１の２次元走査と同一波長域での第２の２次元走査によって取得し濃淡情報格納手段１０２に格納した第２の濃淡情報と、色素固有濃淡情報格納手段１０３に格納され波長域毎に予め定められた色素に固有の色素固有濃淡情報とに基づいて、褪色量を算出する。

そして、濃淡情報補正手段１０５は、上記褪色量算出手段１０４によって算出した褪色量に基づいて、上記濃淡情報取得手段１０１によって取得し濃淡情報格納手段１０２に格納してある濃淡情報を補正する。この補正する対象である濃淡情報が取得された試料は、上記第１の２次元走査および上記第２の２次元走査を行う試料と同一であってもよいし、異なっていてもよい。ただし、同一の場合であっても異なる場合であっても、
上記第１の２次元走査を行う試料と上記第２の２次元走査を行う試料とは同一である。

補正する対象である濃淡情報が取得された試料が、上記第１の２次元走査および上記第２の２次元走査を行う試料と同一である場合は、上記褪色量算出手段１０４によって、上記第１の濃淡情報と上記第２の濃淡情報との差に、上記任意の波長域における色素固有濃淡情報に対応する補正対象の濃淡情報の比を乗じることにより、波長域毎の上記褪色量を算出する。そして、濃淡情報補正手段１０５によって、補正の対象である濃淡情報に上記波長域毎の褪色量を加算することにより補正する。

また、補正する対象である濃淡情報が取得された試料が、上記第１の２次元走査および上記第２の２次元走査を行う試料とで異なる場合は、上記第１の２次元走査と上記第２の２次元走査とが、所定の時間間隔で行われ、上記褪色量算出手段１０４によって、上記第１の濃淡情報と上記第２の濃淡情報との差に、上記任意の波長域における色素固有濃淡情報に対応する補正の対象である濃淡情報の比を乗じることにより、波長域毎の上記褪色量を算出する。そして、濃淡情報補正手段１０５によって、補正の対象である濃淡情報に上記波長域毎の褪色量を加算することにより補正する。

図２は、本発明を適用した濃淡情報補正処理の流れを示すフローチャートである。
まず、ステップＳ１００において、蛍光染色した試料をレーザビームで２次元走査することにより輝度情報等の濃淡情報を取得する。そして、ステップＳ１０１において、濃淡情報の取得が終了したか否かを判断する。例えば、予め定めた所定回数の２次元走査が終了したか否か、波長域を少しずつずらしながら２次元走査する場合に、予め定めた波長域の濃淡情報の取得が終了したか否か、予め定めた所定時間が終了したか否か等により、濃淡情報の取得が終了したか否かを判断する。

次に、ステップＳ１０２において、ステップＳ１００で取得した濃淡情報に基づいて、波長域毎に予め定められた色素に固有の色素固有濃淡情報とに基づいて、褪色量を算出する。
そして、ステップＳ１０３において、ステップＳ１０２で算出した褪色量に基づいて、濃淡情報を補正する。この補正対象である濃淡情報は、ステップＳ１００で取得し褪色量の算出のもととなった濃淡情報でもよいが、別に２次元走査することにより取得した濃淡情報であってもよい。

図３は、本発明の第１の実施の形態を適用した走査型共焦点レーザ顕微鏡の構成例を示す図である。
レーザ光源１から照射されるレーザ光は、共焦点用スキャナ２によってＸ−Ｙ平面方向に振られ、対物レンズ３を通り、ステージ４上の試料面を走査する。なお、共焦点用スキャナはＰＣ８が有するＣＰＵ８１により制御される。

試料面からの蛍光は分光光学系５により分光され、光検出器６によって電気信号に変換される。変換された電気信号は、Ａ／Ｄ変換器７によってデジタルデータに変換され一時的にＡ／Ｄ変換器７に蓄えられる。上記Ａ／Ｄ変換器７に一時的に蓄えられたデジタルデータは、ある一定のデータ量になるとＣＰＵ８１を介してフレームメモリ１０にデータが記録される。フレームメモリ１０に記録されたデータは、フレームメモリ１０に接続されている出力装置１１上に表示される。

またＰＣ８は、記録媒体８２、蛍光スペクトル記憶領域８３、代表輝度値記憶領域８４、褪色量記憶領域８５を有している。記録媒体８２には、褪色量補正プログラム９１が記録されている。この記録媒体８２としては、例えばフレキシブルディスク、ハードディスク、ＣＤ−ＲＯＭ、ＭＯ（ｍａｇｎｅｔｏ−ｏｐｔｉｃ）等を適用可能である。また、この記録媒体８２に記録されている各プログラムは、ネットワークを介して別のサーバーコンピュータ等からダウンロードされて実行されるものであっても良い。蛍光スペクトル記憶領域８３には、スキャン（２次元走査）する試料を染色した蛍光色素の蛍光スペクトル（波長域毎に予め定められた色素に固有の色素固有輝度情報）が保存されている。このデータは使用者がスキャンを開始する前に予め読み込んでおく。

またＰＣ８には入力装置１２が接続されており、使用者が画像を取得するための条件（以降画像取得条件と記載する。）であるスキャン画像領域、スキャン開始波長（λｓ）、スキャン終了波長（λｅ）、波長ステップ幅（λｓｔ）を入力するために用いる。
以上のように構成した走査型共焦点レーザ顕微鏡で、画像を取得するための条件を入力すると、スキャン画像を取得することができる。

次に、使用者が入力装置１２を用いて入力する入力値とスキャン後に得られる画像との関係を説明する。
図４は、試料とスキャン領域との関係を説明するための図である。
まず、試料に外接する長方形領域であるスキャン領域をレーザビームでスキャンし、得られる蛍光から波長域［λｓ，λｓ＋λｓｔ）の蛍光を分光光学系５により取り出し画像化する。次に、スキャン領域をレーザビームでスキャンし、波長域［λｓ＋λｓｔ，λｓ＋２λｓｔ）の蛍光を分光光学系５により取り出し画像化する。このようにスキャン領域をレーザビームで繰り返しスキャンし、得られる蛍光から画像化する波長域をλｓｔずつずらして画像化していく。すなわちｉ回目のスキャンが終了したときには、波長域［λｓ＋（ｉ−１）λｓｔ，λｓ＋ｉλｓｔ）の常光を画像化する。なお、すべてのスキャンが終了するのはλｓ＋ｉλｓｔ＞λｅとなるスキャン時である。ここで波長域［λｓ，λｓ＋λｓｔ）は、λｓ以上λｓ＋λｓｔ未満の波長域をあらわす。

例として図４に示した試料をスキャンするために、λｓ＝４００ｎｍ、λｅ＝６００ｎｍ、λｓｔ＝５０ｎｍと入力した場合を考える。
この条件で試料をスキャンすると、図５に示したように合計４枚の画像が取得できる。
次に、本発明の第１の実施の形態を適用した濃淡情報補正処理について詳細に説明する。

図６は、本発明の第１の実施の形態を適用した濃淡情報補正処理の流れを示すフローチャートである。
ステップＳ１において、入力装置１２を用いて画像取得条件を入力する。画像取得条件として、たとえばλｓ＝４００ｎｍ、λｅ＝６００ｎｍ、λｓｔ＝５０ｎｍと入力する。

ステップＳ２において、スキャン回数ｉに１を代入する。そして、ステップＳ３において、λｓ＋ｉλｓｔ＞λｅかどうかをチェックし、スキャンを終了するかどうかを判断する。もしλｓ＋ｉλｓｔ＞λｅが成立する場合は、ステップＳ６へ進む。成立しない場合は、ステップＳ４に進む。

ステップＳ４において、スキャン領域をスキャンし検出した蛍光から波長域［λｓ＋（ｉ−１）λｓｔ，λｓ＋ｉλｓｔ）の蛍光を画像化する。そして、ステップＳ５において、スキャン回数ｉをインクリメントしてステップＳ３に戻る。
ステップＳ３でスキャンが終了したらステップＳ６において、スキャン領域をスキャンし検出した蛍光から波長域［λｓ，λｓ+λｓｔ）の蛍光を画像化する。このステップＳ６で画像化した画像は、ステップＳ４のスキャン回数ｉ＝１の時に画像化した画像と同じ波長域の蛍光を含んだ画像である。

ステップＳ７において、ステップＳ４のスキャン回数ｉ＝１の時に画像化した画像とステップＳ６で画像化した画像とから褪色量を補正するためのデータを取得し、代表輝度値記憶領域８４に記憶する。データの取得方法は、両画像に共通した領域内の輝度値の代表値を取得するようにする（図７参照）。なお、代表値は、領域内の輝度値の平均値、積算値、最大値、最小値等を用いる。この時、ステップＳ４のｉ＝１時の画像から取得したデータをＩｓｔａｒｔ、ステップＳ６の画像から取得したデータをＩｅｎｄと表現する（図７参照）。

ステップＳ８において、ＰＣ８内の蛍光スペクトル記憶領域８３に予め保存されている蛍光スペクトルデータと、ステップＳ７で記憶したＩｓｔａｒｔおよびＩｅｎｄとを用いて求めた波長域［λｓ＋（ｉ−１）λｓｔ，λｓ＋ｉλｓｔ）におけるスキャン回数に対する褪色量とから、波長域［λｓ＋（ｉ−１）λｓｔ，λｓ＋ｉλｓｔ）における褪色量を求め褪色量記憶領域８５に保存する。ただし、ｉはスキャン回数を表す変数であり、ＮｓｔａｒｔはステップＳ４のｉ＝１時のスキャンの順序数（何回目のスキャンであるか）、ＮｅｎｄはステップＳ６のスキャンの順序数である。

具体的には、Ｉｓｔａｒｔ，Ｉｅｎｄ、スキャン回数（Ｎｅｎｄ−Ｎｓｔａｒｔ）を用いて、波長域［λｓ，λｓ＋λｓｔ）における褪色量α［λｓ，λｓ＋λｓｔ）（ｉ）を式（１）より求める。
α［λｓ，λｓ＋λｓｔ）（ｉ）＝｛（Ｉｓｔａｒｔ−Ｉｅｎｄ）／（Ｎｅｎｄ−Ｎｓｔａｒｔ）｝・（ｉ−１）・・・式（１）
ただし、式（１）は褪色量がスキャン回数に対して線形であるとしている。

次に式（１）および、ＰＣ８内の蛍光スペクトルデータ８３を用いて、波長域［λｓ＋（ｉ−１）λｓｔ，λｓ＋ｉλｓｔ）における褪色量を式（２）で求める。ここで式（２）で用いるＳ［ａ、ｂ）は波長域［ａ，ｂ）における蛍光スペクトルの総和である（図８参照）。
α［λｓ＋（ｉ−１）λｓｔ，λｓ＋ｉλｓｔ）（ｉ）＝α［λｓ，λｓ＋λｓ）（ｉ）・（Ｓ［λｓ＋（ｉ−１）λｓｔ，λｓ＋ｉλｓｔ）／Ｓ［λｓ，λｓ＋λｓｔ））・・・式（２）
この式（２）は、蛍光スペクトルデータを用いて式（１）を波長域［λｓ，λｓ＋λｓｔ）以外の波長域のスキャン回数と褪色量の関係に変換している式である。

そして、式（２）で求めた褪色量を褪色量記憶領域８５に保存する。
ステップＳ９において、ステップＳ８で記憶した値を用いてステップＳ４で画像化した画像の輝度値を式（３）で補正する。
ＣｏｎｐｅｎｓａｔｉｏｎＩ［λｓ＋（ｉ−１）λｓｔ，λｓ＋ｉλｓｔ）（ｐ，ｑ）＝Ｉ［λｓ＋（ｉ−１）λｓｔ，λｓ＋Ｉλｓｔ）（ｐ，ｑ）+α［λｓ＋（ｉ−１）λｓｔ，λｓ＋ｉλｓｔ）（ｉ）・・・式（３）
ここで式（３）で用いる記号は次のように定義する。
ｉ：スキャン回数（ステップＳ４で画像化した画像の枚数）。
ｐ：画像の横幅のインデックス。１≦ｐ≦画像の縦幅のピクセル数。
ｑ：画像の縦幅のインデックス。１≦ｑ≦画像の横幅のピクセル数。
Ｉ［λｓ＋（ｉ−ｌ）λｓｔ，λｓ−ｉλｓｔ）（ｐ，ｑ）：波長域［λｓ＋（ｉ−１）λｓｔ，λｓ＋ｉλｓｔ）の蛍光からなる画像の縦ｐ，横ｑピクセルの輝度値（図９参照）。
ＣｏｎｐｅｎｓａｔｉｏｎＩ［λｓ＋（ｉ−１）λｓｔ，λｓ＋ｉλｓｔ）（ｐ，ｑ）：Ｉ［λｓ＋（ｉ−１）λｓｔ，λｓ＋ｉλｓｔ）（ｐ，ｑ）に対して褪色量を補正した輝度値。

このようにして、ステップＳ４で画像化したすべての画像について上記補間を行うと、スキャンした画像から褪色の影響を補正した画像を得ることができる。
図１０は、本発明の第２の実施の形態を適用した走査型共焦点レーザ顕微鏡の構成例を示す図である。

基本的な構成は第１の実施の形態と同様であるので、以下異なる点を説明する。
ＰＣ８内の記録媒体８２は、褪色量補正プログラム９２を記憶している。またＰＣ８は、褪色量補正プログラム９２で使用する輝度値記憶領域８８、褪色量記憶領域８７を有する。これ以外は全て図３を用いて説明した第１の実施の形態と同様である。

図１１は、本発明の第２の実施の形態を適用した濃淡情報補正処理の流れを示すフローチャートである。
ステップＳ１１において、スキャン対象の試料（試料Ａ）と同じ試料（試料Ｂ：標準サンプル）を用意する（図１２参照）。

ステップＳ１２において、スキャン時間を表す変数をＴ＝０にする。
ステップＳ１３において、Ｔ＞ Ｔｌかどうかを判断する。ここでＴｌとは、試料Ａをスキャン開始波長λｓからスキャン終了波長λｅまでスキャンするのに要する時間である（図１３参照）。そして、もしＴ＞ＴｌならばステップＳ１５に進む。Ｔ≦Ｔ１ならばＳ１４に進む。

ステップＳ１４において、図１２の点Ｐｂにおける取り込み波長域を［λｓ，λｓ＋λｓｔ）に固定し、Δｔ間隔でスキャンし、時間Ｔと取得した画像の輝度値を輝度値記憶領域８６に保存し、ステップＳ１３に戻る。ここでｉ回目のスキャン時の時刻をＴｉとし、その時の輝度値をＦ（Ｔｉ）と表す。また、Δｔは試料Ａを一回スキャンするのに要する時間とする（図１３参照）。このステップＳ１４で、試料Ｂの点Ｐｂの蛍光がスキャン時間に対してどのように変化するのかを示すデータの組を取得することができる（図１３参照）。

そして、ステップＳ１５において、スキャン時間ＴをインクリメントしてステップＳ１３に戻る。
ステップＳ１３でスキャンが終了したら、ステップＳ１６において、 ＰＣ８内の蛍光スペクトル記録領域８３に保存されている蛍光スペクトルデータと、ステップＳ１４で取得したデータの組から波長域［λｓ＋（ｉ−１）λｓｔ，λｓ＋ｉλｓｔ）における褪色量を算出し、褪色量記憶領域８７に保存する。

まずＦ（Ｔｉ）を用いて、［λｓ，λｓ＋λｓｔ）における褪色量を求める。今それをβ［λｓ，λｓ＋λｓｔ）（ｉ）と記述すると褪色量は式（４）より求まる。
β［λｓ，λｓ＋λｓｔ）（ｉ）＝Ｆ（Ｔ１）−Ｆ（Ｔｉ）・・・式（４）
次に式（４）および、ＰＣ８内の蛍光スペクトル記憶領域８３に記憶されている蛍光スペクトルデータを用いて、波長域［λｓ＋（ｉ−１）λｓｔ，λｓ＋ｉλｓｔ）における褪色量を式（５）で求め、スキャン回数に対するβの値を褪色量記憶領域８７に記録する。
β［λｓ＋（ｉ−１）λｓｔ，λｓ＋ｉλｓｔ）（ｉ）＝β［λｓ，λｓ＋ｉλsｔ）（Ｔｉ）・｛Ｓ［λｓ＋（ｉ−１）λｓｔ，λｓ＋ｉλｓｔ）／Ｓ［λｓ，λｓ＋ｉλｓｔ）｝・・・式（５）
ステップＳ１７において、試料Ａに対する画像取得条件を入力する。

ステップＳ１８乃至ステップＳ２１において、図６を用いて説明した上述の第１の実施の形態のステップＳ２乃至ステップＳ５と同様の手順で試料Ａをスキャンする。
ステップＳ２２において、ステップＳ２０でスキャンした画像の輝度値を式（６）で補正する。
ＣｏｎｐｅｎｓａｔｉｏｎＩ［λＳ＋（ｉ−１）λｓｔ，λｓ＋ｉλｓｔ）（ｐ，ｑ）＝Ｉ［λｓ＋（ｉ−１）λｓｔ，λｓ＋Ｉλｓｔ）（ｐ，ｑ）＋β［λｓ＋（ｉ−１）λｓｔ，λｓ＋ｉλｓｔ）（ｉ）・・・式（６）
ステップＳ２０で画像化したすべての画像について上記補間を行うと、褪色を補正した画像が得られる。

上述のように、第１の実施形態では、線形的に褪色することを前提にしていたが、第２の実施の形態では、実際の褪色変化である非線形（対数的）に褪色するので、より正確に補正できる。ただし、同一試料を用いる第１の実施の形態と異なり、本第２の実施形態は、スキャンする試料とは異なるサンプルとしての別試料を用意しなければならず、試料間の誤差という要因が加わってしまう。しかし、実際の観察試料に余計なダメージを与えないという利点がある。

なお、第２の実施の形態における図１１のステップＳ１１乃至ステップＳ１６の処理は、ステップＳ２１の前に実行してもよい。また、ステップＳ２２の処理は、ステップＳ２０の後に行ってもよい。
また、ステップＳ１４で、Δｔは試料Ａを１回スキャンするのに要する時間としているが、Δｔを１回のスキャン時間とは無関係に任意に設定しデータを取り込んでもよい。ただし取り込むデータは二つ以上になるようにΔｔ設定する。取り込むデータの数が少ない場合、ステップＳ１６の式（４）で用いるＦ（Ｔｉ）は、取り込んだデータを補間（線形補間、スプライン補間等）した値を用いてもよい。

また、上述の各実施の形態は、蛍光検出装置の一例である走査型共焦点レーザ顕微鏡に適用した例を示したが、本発明は走査型共焦点レーザ顕微鏡に限定されず他の蛍光検出装置に適用しても良いことは言うまでもない。
すなわち、本発明が適用される蛍光検出装置は、その機能が実行されるのであれば、上述の実施の形態に限定されることはなく、本発明の要旨を逸脱しない範囲内で種々の構成または形状を取ることができる。

本発明を適用した蛍光検出装置の機能ブロック図である。 本発明を適用した濃淡情報補正処理の流れを示すフローチャートである。 本発明の第１の実施の形態を適用した走査型共焦点レーザ顕微鏡の構成例を示す図である。 試料とスキャン領域との関係を説明するための図である。 取り込む画像の例を説明するための図である。 本発明の第１の実施の形態を適用した濃淡情報補正処理の流れを示すフローチャートである。 本発明の第１の実施の形態において褪色量を算出する際の基になる濃淡情報を説明するための図である。 輝度値と波長域との関係を説明する他の図である。 補正する画像内のピクセル位置を説明するための図である。 本発明の第２の実施の形態を適用した走査型共焦点レーザ顕微鏡の構成例を示す図である。 本発明の第２の実施の形態を適用した濃淡情報補正処理の流れを示すフローチャートである。 標準試料を説明するための図である。 本発明の第２の実施の形態において褪色量を算出する際の基になる濃淡情報を説明するための図である。

符号の説明

１ レーザ光源
２ 共焦点用スキャナ
３ 対物レンズ
４ ステージ
５ 分光光学系
６ 光検出器
７ Ａ／Ｄ変換器
８ ＰＣ
１０ フレームメモリ
１１ 出力装置
１２ 入力装置
８１ ＣＰＵ
８２ 記録媒体
８３ 蛍光スペクトル記憶領域
８４ 代表輝度値記憶領域
８５、８７ 褪色量記憶領域
８６ 輝度値記憶領域
９１、９２ 褪色量補正プログラム
１００ 蛍光検出装置
１０１ 濃淡情報取得手段
１０２ 濃淡情報格納手段
１０３ 色素固有濃淡情報格納手段
１０４ 褪色量算出手段
１０５ 濃淡情報補正手段

Claims (10)

1. 試料をレーザビームで２次元走査して得られる濃淡情報から試料画像を形成する蛍光検出装置において、
   前記試料に対してレーザビームを２次元走査して任意の波長域の濃淡情報を取得する濃淡情報取得手段と、
   前記濃淡情報取得手段を用い第１の２次元走査によって取得した第１の濃淡情報と、前記濃淡情報取得手段を用い前記第１の２次元走査と同一波長域での第２の２次元走査によって取得した第２の濃淡情報と、波長域毎に予め定められた色素に固有の色素固有濃淡情報とに基づいて、褪色量を算出する褪色量算出手段と、
   前記褪色量算出手段によって算出した褪色量に基づいて、前記濃淡情報取得手段によって取得した濃淡情報を補正する濃淡情報補正手段と、
   を備えたことを特徴とする蛍光検出装置。
2. 前記濃淡情報補正手段によって補正する対象である濃淡情報が取得された試料は、前記第１の２次元走査および前記第２の２次元走査を行う試料と同一であることを特徴とする請求項１に記載の蛍光検出装置。
3. 前記褪色量算出手段は、前記第１の濃淡情報と前記第２の濃淡情報との差に、前記任意の波長域における色素固有濃淡情報に対する前記濃淡情報補正手段によって補正する対象である濃淡情報の比を乗じることにより、波長域毎の前記褪色量を算出し、
   前記濃淡情報補正手段は、前記濃淡情報補正手段によって補正する対象である濃淡情報に前記波長域毎の褪色量を加算することにより補正することを特徴とする請求項２に記載の蛍光検出装置。
4. 前記第１の２次元走査を行う試料と前記第２の２次元走査を行う試料とは同一であり、前記濃淡情報補正手段によって補正する対象である濃淡情報が取得された試料は、前記第１の２次元走査および前記第２の２次元走査を行う試料と異なることを特徴とする請求項１に記載の蛍光検出装置。
5. 前記第１の２次元走査と前記第２の２次元走査とは、所定の時間間隔で行うことを特徴とする請求項４に記載の蛍光検出装置。
6. 前記褪色量算出手段は、前記第１の濃淡情報と前記第２の濃淡情報との差に、前記任意の波長域における色素固有濃淡情報に対する前記濃淡情報補正手段によって補正する対象である濃淡情報の比を乗じることにより、波長域毎の前記褪色量を算出し、
   前記濃淡情報補正手段は、前記濃淡情報補正手段によって補正する対象である濃淡情報に前記波長域毎の褪色量を加算することにより補正することを特徴とする請求項５に記載の蛍光検出装置。
7. 蛍光染色した試料をレーザビームで２次元走査して得られる輝度情報から試料画像を形成する走査型共焦点レーザ顕微鏡において、
   前記試料に対してレーザビームを２次元走査して任意の波長域の輝度情報を取得する輝度情報取得手段と、
   前記輝度情報取得手段を用い第１の２次元走査によって取得した第１の輝度情報と、前記輝度情報取得手段を用い前記第１の２次元走査と同一の試料に対して同一波長域での第２の２次元走査によって取得した第２の輝度情報との差に、前記任意の波長域における波長域毎に予め定められた色素に固有の色素固有輝度情報に対する前記輝度情報補正手段によって補正する対象である輝度情報の比を乗じることにより、波長域毎の褪色量を算出する褪色量算出手段と、
   前記輝度情報補正手段によって補正する対象である輝度情報に前記波長域毎の褪色量を加算することにより、前記輝度情報取得手段によって取得した輝度情報を補正する輝度情報補正手段と、
   を備えたことを特徴とする走査型共焦点レーザ顕微鏡。
8. 蛍光染色した試料をレーザビームで２次元走査して得られる輝度情報から試料画像を形成する走査型共焦点レーザ顕微鏡において、
   前記試料に対してレーザビームを２次元走査して任意の波長域の輝度情報を取得する輝度情報取得手段と、
   前記輝度情報取得手段を用い第１の２次元走査によって取得した第１の輝度情報と、前記輝度情報取得手段を用い前記第１の２次元走査と同一の試料に対して同一波長域で前記第１の２次元走査と所定の時間間隔で行われた第２の２次元走査によって取得した第２の輝度情報との差に、前記任意の波長域における波長域毎に予め定められた色素に固有の色素固有輝度情報に対する前記輝度情報補正手段によって補正する対象である輝度情報の比を乗じることにより、波長域毎の褪色量を算出する褪色量算出手段と、
   前記輝度情報補正手段によって補正する対象である輝度情報に前記波長域毎の褪色量を加算することにより、前記輝度情報取得手段によって取得した前記第１の２次元走査および前記第２の２次元走査を行う試料とは異なる試料の輝度情報を補正する輝度情報補正手段と、
   を備えたことを特徴とする走査型共焦点レーザ顕微鏡。
9. 試料をレーザビームで２次元走査して得られる濃淡情報から試料画像を形成するコンピュータが実行する濃淡情報補正方法であって、
   前記試料に対してレーザビームを２次元走査して任意の波長域の濃淡情報を取得し、
   第１の２次元走査によって取得した第１の濃淡情報と、前記第１の２次元走査と同一波長域での第２の２次元走査によって取得した第２の濃淡情報と、波長域毎に予め定められた色素に固有の色素固有濃淡情報とに基づいて、褪色量を算出し、
   前記算出した褪色量に基づいて、前記取得した濃淡情報を補正することを特徴とする濃淡情報補正方法。
10. 試料をレーザビームで２次元走査して得られる濃淡情報から試料画像を形成するコンピュータに対して、
    前記試料に対してレーザビームを２次元走査して任意の波長域の濃淡情報を取得する手順と、
    前記濃淡情報を取得する手順での第１の２次元走査によって取得した第１の濃淡情報と、前記濃淡情報を取得する手順での第１の２次元走査と同一波長域での第２の２次元走査によって取得した第２の濃淡情報と、波長域毎に予め定められた色素に固有の色素固有濃淡情報とに基づいて、褪色量を算出する手順と、
    前記褪色量を算出する手順によって算出した褪色量に基づいて、前記濃淡情報を取得する手順によって取得した濃淡情報を補正する手順と、
    を実行させるための濃淡情報補正プログラム。
    
    
    

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